Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства и роль бактероидов в этологии острых парапроктитов и других хирургических инфекций

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства и роль бактероидов в этологии острых парапроктитов и других хирургических инфекций"

государственное ведущее высшее учебное учреждение «белорусский государственный медицинский университет»

УДК К'16.352 -007.253 - 036.11 + 617-022] - 02:576.851.234

СЛИЗЕНЬ ВЕРОНИКА ВЯЧЕСЛАВОВНА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РОЛЬ БАКТЕРОИДОВ В ЭТНОЛОГИИ ОСТРЫХ ПАРАПРОКТИТОВ И ДРУГИХ ХИРУРГИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.07 -микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

М и н е к 2004

Работа выполнена в Государственном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь и в Государственном ведущем высшем учебном учреждении «Белорусский государственный медицинский университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, член-корр. НАНБ Титов Л. П., директор Государственного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии»

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Адарчеико А. А., главный научный сотрудник лаборатории внутрибольничных инфекций Центральной научно-исследовательской лаборатории Белорусского государственного медицинского университета

кандидат медицинских наук, доцент Жмакин А. И., заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии Гродненского государственного медицинского университета

Оппонирующая организация:

Витебский государственный медицинский университет

Зашита состоится « 26 » мая 2004 г. в 15 ч на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18.05 при Белорусском государственном медицинском университете по адресу: 220116, г. Минск, пр. Дзержинского, 83. тел. 272 - 55 - 98

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан « 2Н» апреля 2004 г.

Ученый секретарь совета .

по защите диссертаций,

кандидат медицинских наук, доцент А. ¡VI. Близи кж

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации

Инфекции, вызываемые бактероидами, являются важной проблемой практической медицины, что связано с высоким удельным весом бактероидов в патологии человека, тяжелым течением вызываемых ими заболеваний, трудностями их диагностики и низкой эффективностью терапии [Титов Л. П., 1998; Finegold S. М„ 1995].

Парапроктит - одно из самых распространенных проктологиче-ских заболеваний, частота которого не имеет тенденции к снижению. Его удельный вес в структуре проктологической патологии составляет 10 - 30% [Альф И. М. и др., 1994; Коплатадзе А. М. и др., 1994; Brook I. е.а., 1997]. Традиционные представления о решающей роли аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в этиологии острых парапрокти-тов сформировались в связи со сложностью бактериологической диагностики облигатных анаэробов. Неоднозначность оценки участия анаэробных бактерий при смешанной аэробно-анаэробной инфекции оставили открытым вопрос о значении анаэробов в генезе этог о заболевания. Единичные исследования не дают четкого представления о частоте выделения и доминирующих видах грамотрицательных облигатно анаэробных бактерий в этиологии острых парапроктитов [Альф И. М. и др.. 1994; Коплатадзе А. М. и др., 1994; Brook I. et al„ 1997].

Стремительность и тяжесть развития анаэробных хирургических инфекций и необходимость срочного определения тактики лечения диктуют необходимость внедрения и разработки методов ускоренной диагностики анаэробных инфекций [Истратов В. Г., 1991; Egerer К. е.а., 1983; Krausse R. е.а.. 1991].

Распространение резистентности Bacteroides spp., особенно В. fragilis, к пенициллину, ампициллину, цефокситину, эритромицину, тетрациклину, имипенему, клиндамицину и метронидазолу представляет серьезную проблему [Wexler Н. М. е.а., 1997; Falagas М. е.а., 2000; Shnvdman D. R. е.а.. 1999]. Уровни, спектр и частота резистентности анаэробных микроорганизмов могут варьируют в различных клиниках и регионах, в связи с этим неоспоримо значение территориального мониторинга резистентности в Республике Беларусь [Wexler Н. М„ 1997; Slinydman D. R. е.а, 1999, 2000; Falagas М„ 2000].

Таким образом, проблема заболеваний, ассоциированных с гра-мотрицательными неспорообразующими анаэробными бактериями, требует пристального внимания медицинской науки и практического здравоохранения.

Связь работы с крупными научнымн программами

Диссертационная работа выполнялась в течение 1998 - 2003 гг. на базах лаборатории клинической и экспериментальной микробиологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии БГМУ; анаэробной референс-лаборато-рии отделения клинической микробиологии госпиталя Уэльского университета (г. Кардифф, Великобритания). Отдельные этапы работы являлись частью государственной научно-технической программы «Инфекции и медицинские технологии»:

1. «Разработать газогенераторные системы для культивирования анаэробных микроорганизмов», (№ госрегистрации 19983418,1998 -2000 гг.);

2. «Разработать питательные среды для культивирования строгих анаэробов и капнофилов, среду для определения чувствительности к антибактериальным препаратам» (№ госрегистрации 20012330. 2001 -2002 гг.).

Цель и задачи исследования

Цель исследования: изучить биологические свойства бактероидов и разработать научные основы эмпирической антибиотикогерапии и лабораторной диагностики вызываемых ими острых парапрокппов и других хирургических инфекций.

В связи с поставленной целью исследовании были сформулированы следующие задачи:

1. Установить частоту выделения и видовой состав грамотрица-тельных анаэробных микроорганизмов рода ВаМегоМез при прокто-логической и хирургической патологии.

2. Изучить биохимические свойства бактероидов и спектр продуцируемых ими летучих жирных кислот (ЛЖК), разработать тест-систему для биохимической идентификации анаэробов и метод экспресс-диагностики анаэробных инфекций, основанный на ПКХ анализе ЛЖК.

3. Провести молекулярно-биологическую идентификацию выделенных от больных с проктологической и хирургической патологией культур грамотрицательных облпгатно анаэробных микроорганизмов на основании различий в структуре 16 Б рРНК оперонов и оценить эффективность метода в идентификации бактероидов.

4. Определить частоту, спектр и уровни атибиотикорезпстентно-сти бактероидов, выделенных от больных с острым парапроктитом. и установить группы эффективных в эмпирической терапии парапрок-тигов антибиотиков; провести анализ молекулярных детерминант ре-

зистентности к имипенему и метронидазолу у изолятов бактероидов.

Объект и предмет исследования

Объектами исследования являлись 178 пациентов проктологиче-ских и хирургических отделений лечебно-профилактических учреждений г. Минска, и выделенные у обследованных пациентов 266 культур грамотрицательных облигатно анаэробных микроорганизмов. Предметом исследования являлись биологические и молекулярные свойства, обусловливающие инициацию и поддержание патологического процесса, позволяющие проводить эффективную диагностику анаэробных неклостридиальных инфекций.

Гипотеза

Бактероиды играют значимую роль в этиологии острых парапрок-титов и других хирургических инфекций, обладая факторами пато-генности и резистентностью к антимикробным агентам, а также генетическими детерминантами их определяющими.

Методология и методы проведенного исследования

Методологическую основу работы составили эмпирические (наблюдение. измерение, практический эксперимент, моделирование и др.) и логические (доказательство, объяснение, выведение следствий и др.) методы научного познания.

В ходе выполнения работы использованы микроскопический, бактериологический, молекулярно-биологические. физико-химические методы исследования: метод светооптической микроскопии; методы создания и поддержания анаэробиоза; методы выделения чистых культур микроорганизмов с использованием механического разобщения и селективных сред; методы биохимической идентификации микроорганизмов и методы компьютерного биоанализа; методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикам (диско-днффузионный и микроразведений), метод ГЖХ анализа ЛЖК (усовершенствованный нами); молекулярно-генетические методы (ПЦР, ПДРФ, секвенирование генома); методы биоинформатики и вариационного статистического анализа.

Научная новизна и значимость полученных результатов

Получены новые данные о частоте выделения ВаМегоккя хрр. и их отдельных видов при острых парапроктитах и хирургической патоло-

гни и доказана их этиологическая роль в развитии этих заболеваний.

Установлены различия в структуре 16 Б рРНК оперонов у различных видов Вас1его1с1е$ $рр., которые использованы в видовой идентификация бактероидов.

Усовершенствован метод ГЖХ анализа ЛЖК, используемый в экспресс-диагностике анаэробных инфекций, определены хромато-графические критерии присутствия анаэробных микроорганизмов в биологическом материале; проведена оценка ЛЖК как факторов па-тогенности анаэробных микроорганизмов.

Получены новые данные о спектре, частоте и уровнях резистентности бактероидов к современным антибиотикам и определены группы антимикробных препаратов эффективных для эмпирической терапии парапроктитов.

Изучена частота встречаемости сП А и шт А, В, С, Э, Е генов -генетических детерминант резистентности к наиболее эффективным в отношении бактероидов препаратам: имипенему и метронидазолу.

Практическая значимость полученных результатов

Доказана этиологическая роль бактероидов в развитии острых парапроктитов.

Установлены наиболее активные антибактериальные препараты в отношении грамотрицательных анаэробных микроорганизмов рода Вас1его1с1ез. Результаты изучения лекарственной устойчивости являются основой для разработки научно-обоснованной политики применения антибиотиков.

Разработана инструкция по применению метода газо-жидкостной хроматографии летучих жирных кислот в экспресс-диагностике анаэробных инфекций.

Разработан лабораторный регламент тест-системы для биохимической идентификации анаэробных микроорганизмов.

Создана коллекция грамотрицательных анаэробных микроорганизмов, играющих роль в проктологической и хирургической патологии человека.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В развитии острых парапроктитов значимую роль играют бактероиды, доминирующими среди которых являются В. В. 1ке1аю1аописгоп, В. сИ$1азотз.

2. Различия в структуре 16 5 рРНК оперонов, выявляемые методами ПЦР-ПДРФ анализа и секвенированием, позволяют проводить

точную видовую идентификацию Bacteroides spp..

3. Летучие жирные кислоты являются маркерами анаэробных микроорганизмов и их присутствие в материале от больных является критерием для постановки предварительного диагноза анаэробных инфекций. ЛЖК являются фактором патогенности бактероидов: ЛЖК присутствуют в материате от больных и продуцируются чистыми культурами Bacteroides spp. в патогенетически значимом количестве.

4. Частота и уровень резистентности бактероидов зависят от вида антимикробного препарата и подвержены динамическим изменениям, что требует определения эффективных антибиотиков для эмпирической терапии инфекций, обусловленных бактероидами. Приобретенная резистентность к метронидазолу и имипенему, используемых в терапии неклостридиальных анаэробных инфекций, связана с nim А. В, С, D, Е и cil А генами.

Личный вклад соискателя

Диссертантом лично осуществлена разработка подходов к решению поставленных задач, получен, обобщен, проанализирован и опубликован экспериментальный материал работы. Соавторами научных работ диссертанта являются сотрудники анаэробной референс-лаборатории отделения клинической микробиологии госпиталя Уэльского университета (г. Кардифф, Великобритания), осуществлявшие методические консультации при проведении молекулярно-бпологических исследований, а также сотрудники проктологического отделения З-ей городской клинической больницы г. Минска, и хирургических отделений 10-й городской клинической больницы и больницы скорой медицинской помощи г. Минска, осуществлявших клиническое наблюдение больных и забор материала для исследований.

Апробация результатов диссертации

Основные положения диссертационной работы доложены на:

1) Заседании Минского городского научного медицинского общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, г. Минск. 4 ноября 1999 г.; 2) VIII международном симпозиуме «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии», г. Минск, 2000; 3) Научно-практическом семинаре «Современные методы лабораторной диагностики вирусных и бактериальных инфекций», г. Минск, 2000; 4) Республиканской научно-практической конференции с международным участием по проктологии: "Функциональные и воспалительные забо-

левания толстой кишки: хирургические и терапевтические аспекты. Новое в колопроктологии", г. Минск, 2001; 5) Юбилейной научной конференции БГМУ «Актуальные проблемы современной медицины», г. Минск, 2001; 6) Конференции факультета повышения квалификации, БелМАПО «Биологические свойства бактероидов», г. Минск, 2001; 7) Международной конференции «Микробиология и биотехнология XXI столетия», г. Минск, 2002; 8) 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», г. Пущино, Россия, 2002; 9) Xth International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology "The world of microbes", Paris, France, 2002; 10) Заседании кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии БГМУ, г. Минск, 2002; 11) Республиканском семинаре «Организация системы мониторинга антибиотикорезистентности микроорганизмов», г. Минск, 2002; 12) Ежегодной научно-практическая конференции БГМУ, г. Минск, 2003; 13) Обучающем семинаре «Современные методы диагностики вирусных и бактериальных инфекций и детекции возбудителей в объектах окружающей среды», г. Минск, 2003; 14) 6th International Meeting on Microbial Epidemiological Markers, Les Diablerets, Switzerland, 2003.

О п убл нко ва и н ость р езул ьтато в Основные положения диссертационной работы опубликованы в 25 научных работах, из которых 5 статей - в рецензируемых журналах, 2 статьи - в сборниках, 6 статей - в материалах конференций. 4 тезиса - в рецензируемых журналах, 8 тезисов - в докладах конференций. Общий объем публикаций составил 74 страницы.

Структура н объем диссертации Диссертационная работа в своей структуре содержит следующие части: введение, общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, 3 главы собственных исследовании, заключение, список использованных источников и приложение.

Работа изложена на 146 страницах, содержит 19 таблиц, 34 рисунка. Список использованных источников включает 350 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования Материал н объекты исследования. Исследованы гнойное, гнойно-геморрагическое отделяемое, полученное при хирургическом

вскрытии острого парапроктита (п=90), гнойный экссудат и биоптаты от больных с флегмоной конечности, раневой инфекцией (п=21), острым и хроническим остеомиелитом (п=14), биоптаты аппендикса и перитонеальная жидкость (п=31), соскобы слизистой матки при послеродовом эндометрите (п=13), гнойное содержимое при остром мастите и бартолините (п=4). Исследованы морфологические, куль-турапьные, биохимические свойства 266 культур грам отри нательных облигатно анаэробных микроорганизмов. Спектр и концентрацию ЛЖК определяли в 53 пробах от больных и у 72 культур грамотрица-тельных облигатно анаэробных микрооргашгзмов.

Бактериологическое исследование. Чистые культуры грамот-рицательных облигатно анаэробных микроорганизмов выделяли посевом материала от больных на неселективный п селективный кровяной агар с канамицином (100 мг/л) и ванкомицином (2,5 мг/л) с последующей инкубацией посевов в анаэробных условиях (анаэростаты ЫоМе пегас, Франция; газогенерирующие системы «Анаэропак Н2+С02», ГУНИИЭМ и НИИ ФХП). Идентификацию чистых культ\р осуществляли на основании изучения морфологических, кульгураль-ных, биохимических и молекулярно-генетических признаков.

Генетическую идентификацию 40 культур грамотрицательных облигатно анаэробных микроорганизмов проводили с использованием анализа различий в структуре 16 Б рРНК комбинированным методом ПЦР - ПДРФ анализа [БшЫк Б. I.. I е1 а!., 2000].

Определение летучих жирных кислот с целью экспресс-диагностики присутствия анаэробных микроорганизмов проводили методом ГЖХ на хроматографе ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором. Каждой ЛЖК в анализируемом образце соответствует определенный пик на хроматограмме (рис. 1).

Определение чувствительности к 23 антибиотикам осуществляли методом серийных двукратных микроразведениП в сердечно-мозговом бульоне, обогащенном витамином К| (1 мкг/мл), гемином (5 мкг/мл). Суспензию 24-часовой культуры тест-микроорганизмов вносили из расчета 105 КОЕ/мл.

Скрининг генетических детерминант резистентности к метро-нидязолу (т'т А, В, С, В, Е генов) проводили для 40 культур Вас(его1~ зрр. с использованием ПЦР-ПДРФ анализа. Амплификация гит-генов обеспечивалась шт-специфическими праймерами. дифференцирование тт А, В. С, Е генов осуществляли на основании различий их ИраНАас] I рестрикционных профилей [БшЬЬб 5. 1, е1 а!.. 2000].

1 - пропионовая, 2 - масляная, 3 - изовалериановая, 4 - валериановая кислоты

Скрининг генетических детерминант резистентности к кар-бапенемам (cfiA гена) осуществляли для 40 культур Bacteroide.s spp. путем амплификации ДНК с использованием сПА-специфпческнх праймеров. Идентификацию образуемых продуктов амплификации проводили с помощью секвенирования.

Полученные данные анализировали с использованием общепринятых методов вариационной статистики и компьютерных программ Statistica v. 5,5 A, Microsoft Excel 95.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ

Значение грамотрнцательных неспорообразующнх анаэробных бактерий в этиологии прокгологнческнх и других хирургических заболеваний. Грамотрицательные облигатно анаэробные микроорганизмы выделяли у 77.78 ± 4.38 % пациентов с диагнозом острый пара-проктит, что подтверждает значимость грамотрнцательных анаэробных микроорганизмов в этиологии острых парапроктитов. Доминирующим и видами (исследовано 236 культур) в развитии острого парапроктита являлись В. fragilis, В. thetaiotaomicron и В. distasonis, выделяемые в 43.33±5.22. 26.67±4.66 и 17.78±4.03% случаев соответственно. Значимую роль в генезе острого парапроктита также играют Р. melaninogenica и В. viilgatiis, с которыми связано 15.56±3.82 н 11.11±3.31% случаев соответственно. В связи с низкой частой выделения В. сассае (4.44±2.17%), P. intermedia (4.44±2.17%), В. ovalus

(3.33±1.89 %), эти патогены не могут рассматриваться в качестве значимых возбудителей острого парапроктита. Частота выделения В. игеоЫкш, В. тегс1ае, В. ип^/огтгя, Р. gingivalis, Р. Ьта при остром па-рапроктите была еще меньшей и не превышала 1.11+1.1- 2.22±1.55%.

В 53.52 ± 5.91% случаев грамотрицательные облигатно анаэробные микроорганизмы выделялись в ассоциациях, представленных преимущественно 2 видами (39.44+ 5.8%), реже 3 (11.27±3.75%) и 4 видами (4.23±2.1%). Один вид анаэробов изолировали в 46.48% случаев. Доминирующими видами анаэробных грамотрицательных микроорганизмов, выделяемых от пациентов с раневой инфекцией и осложненным аппендицитом, являлись В. /^Шя (46.66±9.1% культур) и В. 1ке1аШаотгсгоп (26.66+8.07% культур).

Молекулярно-биологнческая идентификация грамотрица-тельиых облигатно анаэробных микроорганизмов. Различия в структуре 16 Б рРНК оперонов, выявляемые комбинированным методом ПЦР - ПДРФ анализа, позволяют проводить видовую идентификацию анаэробных микроорганизмов. В процессе амплификации 40 культур грамотрицательных анаэробов с использованием специфичных для Вас1егоМез ярр. праймеров образовывались одноразмерные продукты амплификации в 1500 и.о., что подтверждало принадлежность культур к роду бактероидов (рис. 2).

Рис. 2 Результаты ПЦР-ПДРФ анализа 16 S рРНК оперонов для идентификации Bacteroides spp. а - продукты амплификации 16 S рРНК Bacteroides spp. 3, 4, 254, 255, 243; b и с - hpa II и taq I рестрнкционные профили изолятов Bacteroides spp.: треки 1, 2, 5 - В. thetaiotaomicron 3, 4, 243 треки 3,4-5. fragilis 254, 255

Для видовой идентификации культур получаемые мономорфпые фрагменты подвергали рестрикции с использованием hpa II и taq I ре-стриктаз, что обуславливало образование видоспецифичных полиморфных рестрикционных фрагментов. Метод позволил с высокой точностью определить видовую принадлежность 95.0±3.4% изолятов Bacteroides spp., которые относились к В. fragilis, В. thetaiotaomicron, В. ovatus (14,23, 3 культуры соответственно).

Несмотря на диагностическую эффективность и объективный характер оценки результатов, метод 16 S рРНК ПЦР - ПДРФ требует выделения чистых культур микроорганизмов, что позволяет получить результаты только на 3 - 5 сутки исследований.

Летучие жирные кислоты - маркеры анаэробных инфекций и факторы патогенностн бактероидов. С целью оценки эффективности метода ГЖХ анализа ЛЖК в эксперсс-диагностике острого парапроктита исследованы 53 образца клинического материала. ЛЖК выявлялись в 43 пробах (81.1 ±5.5 % случаев), из которых в 39 пробах (90.7±4.4%) присутствие анаэробных микроорганизмов подтверждено бактериологически. Таким образом, использованный нами метод ГЖХ анализа ЛЖК позволяет эффективно и быстро (в течение 40±5 минут) диагностировать случаи острого парапроктита. вызванного облигатно анаэробными микроорганизмами. Сопоставимость результатов ГЖХ и бактериологических исследований составляет 90.7±4.4 %. В качестве диагностического критерия присутствия анаэробных микроорганизмов в материале может выступать одна из ЛЖК (Cj — Cr,): масляная, изомасляная, валериановая, изовалериапо-вая. которые определяются в 95.0±3.5% проб. С наибольшей частотой в материале от больных встречается масляная и изомасляная кислоты (в 78.0±6.6 и 67.0±7.5% проб соответственно), в то время как изовалериановая и валериановая кислоты обнаруживались относительно редко (в 26.0±7.0 и 18.0±6.2% проб соответственно) (табл.).

В качестве хроматографического критерия анаэробных процессов может выступать определение сразу 2-х и более ЛЖК (С4 - Cr,), что увеличивает достоверность диагностики. Одновременно две или три ЛЖК выявлялись в материале в 77.0±8.1 и 18.0±6.2% случаев соответственно. Установлено, что присутствие только пропионовоп и/или уксусной кислоты в образцах клинического материала встречается достаточно редко (в 5% случаев) и не может выступать в качестве маркера анаэробов. Данные кислоты могут продуцировать также факультативные анаэробы - S. aureus, Е. coli, Р. mirabilis, Klebsiella spp.

Т а б л н ц а

Сравнительная характеристика спектра н уровнен ЛЖК в клиническом

материале и среди метаболитов чистых культур Вас(егои1е5 .чрр.

Летучие жирные кислоты Клинический материал (11 = 39) Чистые культуры В. /год;/к (п=43)

положит, пробы,% (Р+Эр) концентрация ЛЖК. ммоль/мл (Ху1 (Бх.,) положит, пробы, % (ИЗр) концентрация ЛЖК, ммоль/мл (Хё± (Бх,)

Уксусная 85.0+5.7 1.5021 0.567 77.0+6.4 1.01510.427

Пропионовая 79.0±6.5 0.8741 0.275 98.0+2.1 1.25010.463

Изомасляная 67.0+7.5 0.82710.279 50.0+7.6 0.7011 0.263

Масляная 78.016.6 3.5561 1.217 24.0+6.5 0.715+0.263

Изовалериановая 26.017.0 1.90110.267 16.0+5.6 3.7981 1.260

Валериановая 18.0+6.2 1.099+0.530 7.013.9 [0 048 -0.444]

ГЖХ анализ ЛЖК может использоваться для родовой идентификации чистых культур грамотрицательных анаэробных микроорганизмов. Критерием принадлежности к Вас1его1с{ез 5рр. является продукция пропионовой, уксусной, изомаслянои кислот, которые выявляли у 97.0±2.2, 82.0±4.9, 50.0+6.4 % культур (п=6!)соответственно.

ЛЖК рассматриваются как факторы патогенности анаэробных микроорганизмов. Масляная, пропионовая, изомасляная кислоты присутствовали в клиническом материале в 78.0+6.6. 79.0+6.5. 67.0+7.5 % проб в этиологически значимой концентрации (сравнимой с 1 ммоль/мл) - 3.556±1.217, 0.874±0.275, 0.827±0.279 ммоль/мл соответственно. В высокой концентрации в материале от больных определяется изовалериановая кислота - 1.901+0.267 ммоль/мл. В 77.0±8.1 % проб клинического материала определяется 2 ЛЖК С4 -С(„ в 18.0±6.2% проб - 3 ЛЖК С4 -Сг,

Анализ вирулентных свойств 43 культур В. выделенных

от больных с острым парапроктитом и раневой инфекцией, показал, что 24.0±6.5, 50.0±7.6, 98.0±2.1 % культур продуцируют масляную, изомасляную, пропионовую кислоты в патогенетически значимом количестве: 0.715±0.263, 0.701±0.263, 1.250+0.463 ммоль/мл соответственно. Изовалериановая кислота образуется культурами В./гсщШэ в высокой концентрации - 3.798±1.26 ммоль/мл. 16.0+5.6% культур В. /га&Пз образуют две ЛЖК, 7.0±3.9% - три ЛЖК.

В клиническом материале чаще и в большем количестве, по

сравнению с продукцией ЛЖК чистыми культурами анаэробных микроорганизмов, присутствует масляная кислота (78.0 и 24.0% проб; 3.556±1.217 и 0.715±0.263 ммоль/мл соответственно). Как материал, так и чистые культуры исследованных анаэробных микроорганизмов сравнимы по частоте и уровням определения пропионовой, изомасля-ной, валериановой, изовалериановой кислот.

Состояние чувствительности/резистентности ВасХеШйеъ зрр. к антимикробным препаратам. Оценка частоты выделения резистентных форм бактероидов (исследовано 30 культур) позволяет определить антимикробные препараты для терапии острого парапроктита. Установлено, что ампицидлин/сульбактам (частота выделения резистентных вариантов - 37.50±18.11% (Х^Бх,,)), цефокситин (25.0±16.14%), левомицетин (33.3±17.6%), цефоперазон (35.29±17.87%), цефазолин (16.77±13.90%) проявляют высокую активность в отношении бактероидов, в связи с чем эти антибиотики могут использоваться в эмпирической терапии парапроктита. Тикарциллин (частота выделения резистентных вариантов - 44.55± 18.56%), карбе-нициллин (41.18± 18.34%), цефалексин (41.67±18.45%), цефтриаксон (50.0± 18.68%), цефотаксим (50.0± 18.68%), тетрациклин (44.4±18.6%), доксициклин (50.0±18.7%) оказались умеренно активными в отношении грамотрицательных анаэробов. Определены препараты с низкой в отношении бактероидов активностью: пенициллин (частота выделения резистентных вариантов - 85.0±13.29%), ампициллин (84.71 ± 13.44%), амоксициллин (92.86±9.62%), азтреонам (84.2±13.6%), рифампицин (84.2±13.6%), цефтазидим (73.68±16.4%), цефепим (66.67±17.63%), цефуроксим (66.67±17.63%), эритромицин (69.80±17.2%), офлоксацин (66.7±17.6%). Установлено, что большинство грамотрицательных анаэробных микроорганизмов (40.0%) проявляют резистентность одновременно к 11 - 16 препаратам, у 23.33% культур выявлена резистентность одновременно к 17-22 препаратам.

Генетическая резистентность грамотрицательных анаэробных микроорганизмов к метронидазолу и имипенему. В настоящее время отмечается увеличение устойчивости к препаратам нитро-имидазола у анаэробов до 1.9- 7.0% [БшЬЬб Б. Ь. }. е.а., 2000], поэтому большое значение приобретает изучение молекулярных механизмов резистентности. Нами проведено определение частоты встречаемости и экспрессии шт А, В, С, Э, Е и ей А генов, обуславливающих

резистентность анаэробов к метронидазолу и имипенему соответственно.

Амплификация гит генов с использованием специфических праймеров приводит к образованию ДНК продуктов амплификации размером 500 и.о. независимо от типа шт гена (рис. 3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 121314151617181920

Рнс. 3 Результаты амплификации ДНК Bacteroides spp. с целью выявления nim генов: треки 1, 7, 20 - стандарт молекулярного веса, 2 т.п.о. треки 2 - 6 - положительные контроли по nim А, В треки 8 -19 - отрицательные по nim генам изоляты Bacteroides spp.

ПЦР исследование 40 клинических изолятов В. fragilis, В. theiahaomicron, В. ovatus на наличие 5 типов nim генов показало, что продукты амплификации в 500 п.о. не образовывались ни у одного из тестируемых изолятов, что подтверждает отсутствие носительства nim гена. Все исследованные культуры проявляли чувствительность к метронидазолу, выявленную с помощью диско-диффузионного метода (диск 5 мкг).

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что метрони-дазол остается высоко эффективным препаратом в Республике Беларусь в отношении грамотрицательных анаэробных микроорганизмов в связи с отсутствием резистентных форм и носительства генетических детерминант резистентности - nim генов - у исследованных культур.

В последнее время в результате применения карбапенемов частота встречаемости устойчивых к имипенему анаэробов в некоторых регионах увеличилась с 0.5 - 0.8 % до 2.0 - 5.9% для В. fragilis и 2.5 -6.1% для В. thetaiotaomicron [Fang Н. et al., 1999; Yamazoe К. et al., 1999, Edwards R. et al., 2000].

Для выявления носительства cfiA-гена, обуславливающего синтез ß-лактамазы, проведен скрининг гена ПЦР методом у 40 культур В.

fragilis, В. ¡¡ШаШаоткгоп, В. оуа1т. Данные культуры не проявляют резистентности к имипенему при использовании диско-диффузионного метода (диск 10 мкг). Использованный метод ПЦР позволяет идентифицировать сйА ген, о чем свидетельствует образование специфических фрагментов амплификации размером 750 п.о. у контрольных штаммов. Большинство тестированных культур были отрицательны по сПА-гену, что подтверждается отсутствием видимых продуктов амплификации (рис. 4).

Л 1 II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 В

Рис. 4 Результаты амплификации cfi А гена Bacteroides spp. треки А, В - стандарт молекулярного веса, 2 т.п.о. треки I, II - положительные контроли по cfi А гену треки 1-10 исследуемые культуры

У части исследованных культур определены продукты амплификации cfiA-гена, но в отличие от контроля, фрагменты имели больший (между 750-1000 п.о.) или меньший (500 - 750 п.о.) размер. С целью подтверждения специфичности образуемых при амплификации ДНК-фрагментов было проведено секвенирование 3 типов фрагментов и определена их нуклео-тидная последовательность. Результаты секвенирования корректировали на присутствие ошибок интерпретации в полученных последовательностях нуклеотидов. Полученные последовательности нуклеотидов идентифицировали и оценивали с помощью базы данных программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Программа позволяет идентифицировать геном или его фрагмент путем сравнения с виртуальным банком данных последовательностей нуклеотидов ДНК или аминокислот белков (доступ через сервер http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ или http://www.ncbi.nlni.nih.gov/ sutils/genom_table.cgi). Исследуемые последовательности в 480 п.о. и 357 п.о. не были идентифицированы программой как cfiA-ген или плазмиды, несущие этот ген.

Проведенный с использованием ПЦР и cfiA-специфических

тельства cfi А гена y исследованных культур Bacteroides spp., что коррелирует с чувствительностью к имипенему. Таким образом, в РБ пмипенем сохраняет свою высокую активность в отношении Bacteroides spp.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. В этиологии острого парапроктита высокую значимость имеют грамотрицательные анаэробные микроорганизмы (77.78%). доминирующими среди которых являются В. fragilis (43.33%), В. thetaiotaomicron (26.67%), В. distasonis (17.78%), P. melaninogenica (15.56%) и В. vulgatus (11.11%). В 53.52% случаев острый парапрок-тнт обусловлен ассоциациями анаэробных микроорганизмов. При раневой инфекции и осложненных аппендицитах преимущественно выделяются В. fragilis (46.66%) и В. thetaiotaomicron (26.66%). Видоспе-цифпческие различия в структуре 16 S рРНК оперонов генома бактероидов. выявляемые методом ПЦР - ПДРФ анализа, позволили идентифицировать 95.0±3.4% культур бактероидов [I О, 11. 15. 16, 17.21].

2. Метод ГЖХ анализа спектра ЛЖК, продуцируемых бактероидами, в биологическом материале позволяет быстро (в течение 3040 минут) диагностировать случаи острого парапроктита и раневой инфекции, вызываемые облигатно анаэробными микроорганизмами. Сопоставимость результатов ГЖХ и бактериологических исследований составляет 90.7%. Обнаружение одной из ЛЖК: масляной, изо-масляной, валериановой, изовалериановой - служит надежным (в 95.0% случаев) индикатором анаэробных микроорганизмов в образце. Определение одновременно двух и более ЛЖК имеет подтверждающее значение [2,9, 14, 15, 25].

3. Выявление в биологическом материале масляной, пропионо-вой, изомасляной кислоты (78.0, 79.0, 67.0% проб соответственно) в патогенетически значимом количестве (3.556±1.217, 0.874±0.275, 0.827±0.279 ммоль/мл соответственно) свидетельствует о роли ЛЖК в патогенезе анаэробных инфекций [2, 6, 9, 14].

4. Наибольшую активность в отношение грамотрицательных анаэробных микроорганизмов, выделенных от больных с паранроктитом. проявляли ампициллинУсульбактам. цефокситин. цефазолин. цефонера-зон. левомицетин, что обусловливает целесообразность использования их в эмпирической терапии острых парапроктитов [3,4, 7. 15. 16. 17].

5. Метронидазол является высоко эффективным препаратом в отношении Вас(его1с1е5 зрр., выделенных в Республике Беларусь, в связи с отсутствием фенотипически резистентных форм и носитель-ства генетических детерминант резистентности (тт-генов) у исследованных изолятов Вас1его1с1е5 ¿рр.. Увеличение уровней устойчивости к метронидазолу и носительства тт-генов в других регионах свидетельствуют о том, что резистентность к метронидазолу у анаэробов находится в стадии формирования и требует внедрения системы мониторинга в практику здравоохранения [5, 10, 19, 20, 21].

6. Молекулярно-генетические исследования сП А гена, контролирующего резистентность к имипенему и имеющего сложный механизм экспрессии, выявили отсутствие носительства данного гена у исследованных культур Вааего1с1ез зрр.. Имипенем продолжает оставаться высокоактивным препаратом в отношении анаэробных микроорганизмов [11, 18, 19, 20, 22].

Практические рекомендации

1.С целью ускоренной диагностики анаэробных инфекции рекомендуется использовать метод ГЖХ анализа ЛЖК. Присутствие в биологическом материале масляной, изомасляной, валериановой, изовалериановой кислоты может служить основанием для предварительной диагностики анаэробной этиологии заболевания и назначения шпибио-тикотсрапии препаратами ампициллин/сульбактам, цефокситин. цефа-золин, цефоперазон, левомицетин, метронидазол, имипенем, проявляющими активность в отношении анаэробов.

2. Для видовой идентификации Ваыегохйеь эрр. рекомендуется использовать 3 стадийный подход, заключающийся в последовательном проведении: а) морфологической, культуральной, биохимической идентификации; б) ПЦР-ПДРФ анализа 165 рРНК оперонов; в) секвениро-вания последовательности нуклеотидов ДНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Слизень В. В., Лемишевский А. И., Титов Л. П. Спектр антимикробной активности мази линкоцел и ее компоне!ггов // Медицина. - 2001. -N3.-P. 40-41.

2. Слизень В. В., TirroB Л. П. Спектр летучих жирных кислот обли-гатно анаэробных бактерий в диагностике хирургических инфекций // Bccui акад. навук Беларусь Сер. мед.-б1ял. навук. - 2002. - N 1. - С. 83 - 90.

3. Слизень В. В., Титов Л. П., Русинович В. М. Чувешггельность Неотрицательных облигатно анаэробных микроорганизмов к ß-лактамцым шгпшикробным препаратам // Мед. новости. - 2002. - N 6. - С. 50-53.

4. Слизень В. В.. Титов Л. П., Русинович В. М. Чувсшгтелыюсть к штгимикробным препаратам анаэробных микроорганизмов, выделенных при парапроктитах // Мед. новости. - 2003. - N 8. - С. 85 - 88.

5. Слизень В., Титов Л. П., Бразиер Д. С., Hui М. Изучение резистентности к метронндазолу изолятов бактероидов, выделенных от больных с острым парапроктитом // Becui HAH Беларусь Сер. мед.-б1ял. iuibvk. -2003,-N2.-С. 80-85.

6. Титов Л. П., Слизень В. В. Метод экспресс индикации грамогрица-тельных анаэробных бактерий в клиническом материале // Достижения детской онкологни и гематологии: Материалы VIII между! ир. симпоз.. Минск. - 27-30 апр.2000г. / Мин-во здравоохр. РБ. Республ. науч.- практич. центр детск. онкол. и гематол,-Минск, 2000. - С. 114-116.

7. Титов Л. П., Слизень В. В. Русинович В. М. Антибиотикоустоичи-вость анаэробных микроорганизмов: предварительные результаты и проблемы: Информационный бюллетень для практического здравоохранения/ БелНИИЭМ. - Минск, 2000. - Том 4 (5). - С. 55 - 62.

8. Слизень В. В., Лемишевский А. И., Титов Л. П. Сиекгр антимикробной активности мази линкоцел и ее компонешхэв// Актуальные проблемы современной медицины: Материалы юбилейной науч. конф., Минск: БГМУ, 2001. - Часть II. - С. 156 -159.

9. Слизень В. В. Образование летучих жирных кислот грамогрица-тельными облигатно анаэробными микроорганизмами, изолированными при остром парапроктите/Микробиология и биотехнология XXI столетия: Материалы междунар. конф.. 22-24 мая 2002 г. Минск/ HAH Беларуси. Отделение биол. наук. Науч. совет по пробл. биотехнол. Инспггут микробиол. Концерн «Белбиофарм». - Минск. 2002. -С. 91 - 92.

10. Слизень В., Титов Л. П., Бразиер Д. С., Гал М. Изучение частоты встречаемости и экспрессии nim-генов у грамотрицательных анаэробов // Резисгеншость микроорганизмов к антимикробным препаратам: Материалы междунар. науч. - пракгич. конф. / Мин-во здравоохр. РБ. ГУ НИИ эпи-дем. и микробиол., Калифорнийский ун-т, США Общ. объединение «Белорус. научн. медицинское об-во эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Минск, 2003. - С. 80 - 82.

11. Слизень В., Титов Л. П., Бразиер Д. С., Гал М. Молекулярно-биологический мониторинг резистентности к имипенему грамотрицательных анаэробов // Резистентность микроорганизмов к антимикробным препаратам: Материалы междунар. науч. - практич. конф. / Мин-во здравоохр. РБ, ГУ НИИ эпидем. и микробиол.. Калифорнийский ун-т, США. Общ. объединение «Белорус, научн. медицин, об-во эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Минск, 2003. - С. 83 - 85.

12. Русинович В. М., Слизень В. В. Анаэробная инфекция в проктологии. Антибиотикозависимость анаэробных микроорганизмов: состояние проблемы и пути ее решения / Болезни толстого кишечника Вопросы орга-низацш проктолопнеской помощи: Тез. докл. IV Республиканской науч-но-практ. конф. с междунар. участием по проктологии "Функциональные и воспалительные заболевания толстой кишки: хирургические и терапевтические аспекты. Новое в проктологии", Минск, 6-7 сент., 2001 / Мин-во здра-воох. РБ. Бел. гос. мед. ин - т. Комитет по здравоох. Мингорисполкома -Минск, 2001.-С 280-288.

13. Слизень В. Роль облипгтно анаэробных микроорганизмов в генезе парапроктитов/ Биология - наука 21 века: Тез. докл. бой Пущинской шко-лы-конф. молодых ученых. Пушимо, 20 - 24 мая 2002 г./ РАН Путинским науч. центр РАН. Ин - т физ.-хим и биол. проблем почвоведения РАН. -2002.-Т. 1.-С. 140-141.

14. Слизень В. В., Титов Л. П. Летучие жирные кислоты как фактор патогенности облигатных анаэробов/ Материалы респуб. Научно-практической конф. инфекционистов и эпидемиологов «Эпидемиология, диагностика, патогенез, лечение и профилактика инфекционных заболеваний». - Гомель, 13 - 14декабря 2001 г. -Мозырь, 2001. -С. 285-288.

15. Slizen V. V., Titov L. P. Incidence, spectrum, antibiotic susceptibility of anaerobic bacteria from perirectal abscesses // Anaerobe olympiad 2002: Abstract book of the 6th biennial congress of the anaerobe society of the Americas, Park City, Utah USA, June 29- July 2, 2002 /Anaerobe society of the Americas. - Park City, 2002,-P. 79.

16. Slizen V. V., Titov L. P. Incidence, spectrum, antibiotic susceptibility of anaerobic bacteria from perirectal abscesses //Anaerobe. - 2002. - N 8. - P. 139 — 140.

17. Slizen V., Titov L. P. Incidence and antibiotic susceptibility of gramnegative anaerobes from perirectal abscesses // The world of microbes: Abstracts of Xth International Congress of Bacterid, and Applied Microbiol., Paris. 27th July - I st August 2002 / IUMS. - Paris. France. 2002. - P. 343.

18. Slizen V., Titov L.P., Brazier J.S.. Gal M. Cfi A gene as a marker of imipenem resistance in Bacteroides spp. // Final Programm 6 tli International Meeting on Microbial Epidemiol.I Markers. Les Diablerets. Switzerland, August 27 - 30, 2003/ European Study group on Epidemiol. Markers. - Les Diablerets, Switzerland, 2003.-P. 92.

19. Slizen V., Titov L.P., Brazier J.S., Gal M. Distribution of nim and cfi A genes in Bacteroides spp. in Belarus // Abstract book 1 st FEMS Congress of European Microbiologysts , Ljubljana. June 29 - July 3, 2003 / FEMS. -Ljubljana. 2003.-P. 302.

20. Slizen V., Titov L.P.. Brazier J.S.. Gal M. Screening for nim and cfi A genes in Bacteroides spp. isolated in Belarus // Anaerobe. - 2003. - Vol. 9. - P.

21. Слизень В., Титов Л. П., Бразиер Д. С., Гал М. Скрининг генов резистентности к метронидазолу у Вас1егс^е5 ярр., изолированных от больных с острым парапроктитом // Клин, микробпол. и антимикроб, хпмиотер. - 2003. - Том 5, Приложение I.- С. 34.

22. Слизень В., Титов Л. П., Бразиер Д. С., Гал М. Скрининг с(1 А ге-ноз, обуславливающих резистентность к имипенему у Вас1гго\с1в5 spp.ll Клин, микробиол. и антимикроб, хпмиотер. -2003. - Том 5, Приложение 1. -

23. Завада Н. В., Напбалдян Т. Л., Слизень В. В. Новый способ дезинфекции культи червеобразного отростка при лапароскопическом аппендэк-гомии// Тез. докл. 6-го Всероссийского съезда эндоскоп, хирургии, Москва, 22 - 25 февр. 2003/Ассоциация эндоскопических хирургов,- Москва, 2003. -Эндоскопич. хир. — 2003. - Приложение. - С. 60.

24. Завада Н. В., Налбапдян Т. Л.. Слизень В. В. К вопросу о дезинфекции культи червеобразного отростка при лапароскопической аппендэк-томин / Неотложная медицина: материалы междунар. науч.-практ. конф. -Гомель. 2003.-С. 64.

25. Слизень В.В. Неспорообразующие грамотрицательные анаэробы в этиологии парапрокпгга// Труды молодых ученых 2003: Сб.

Под общ. ред. С.Л. Кабака - Мп.: БГМУ. 2003. - С. 177 - 181.

268.

С. 34-35.

РЭЗЮМЕ Сшзень Верашка Вячаславауна

Б1ЯЛАГ1ЧНЫЯ УЛАСЩВАСЩ I РОЛЯ БАКТЭРОЩАУ У ЭТЫЯЛОГ11 ВОСТРЫХ ПАРАПАКТЫТАУI 1НШЫХ Х1РУРГ1ЧНЫХ ШФЕКЦЫЙ

Ключавыя словы: парапрактыт, бактэрогды, молекулярная ¡дэнтыфтацыя, антыбгётыкарэзыстэнтнасць, cji А ген, nim гены.

Аб'ект i прадмет даследавапня: 178 пацыентау практалапчных i xipypriHHbix адзяленняу лячэбна-прафшактычных устаноу г. Мшска, 266 культур грамнегатыуных абл1гатна анаэробных бактэрый.

Мэта даследавапня: даследаваць б1ялапчныя уласщвасш бактэрощау i распрацаваць навуковыя асновы лабараторнай дыягностыю i эмтрычнай анты-б1ётыкатэрапи абумоуленых ¡Mi парапрактытау i шшых xipypri4Hbix ¡нфекцый.

Метады: мшраскатчны, бактэрыялапчны, малекулярна-генетычныя, ф!з1ка-хш1чныя i статыстычныя.

BbiiiiKi: даказана этыялапчная роля грамнегатыуных анаэробных мжрааргашзмау у развшш вострых парапрактытау. Палепшаны метад экспрэс-дыягностыю анаэробных ¡нфекцый, заснаваны на газа-вадкаснай храматаграфн лятучых тлустых юслотау. Утварэнне адной з ЛТК: маслянай, ¡замаслянай, ва-лерыянавай, ¡завалерыянавай - з'яуляецца пэуным ¡ндыкатарам наяунасш анаэробных мкрааргашзмау у пробе. Выяулена, што ЛТК знаходзяцца у патагене-тычна ¡стотнай колькасш у б1ялапчным матэрыяле i сярод метабал^тау чыстых культур бактэрощау. Вызначана, што адрозненн1 у структуры 16 S рРНК апе-ронау Bacteroides spp., выяуляемыя метадам ПЛР-ПДРФ аналЬу, дазваляюць пра водзщь ¡дэнтыфжацыю 95.0±3.4% культур бактэрощау. Выяулены анты-б1ётык1 эфектыуныя для эмтрычнай тэрапи парапрактытау, да яюх належаць ампщылш/сульбактам, цэфаксщын, метранщазол, левам1цэтын, цэфаперазон, цэфазалш. Установлена, што метранщазол i ¡мшенем працягваюць дэманстра-ваць высокую актыунасць у адносшах Bacteroides spp., выдзеленых у Рэспуб-лщы Беларусь, што абумоулена адсутнасцю рэзыстэнтных варыянтау i адсут-насцю здатнасц1 быць носьбтам1 генау рэзыстэнтнасщ nim А, В, С, D, Е i cfiA.

Рэкамендацьп па выкарыстанню: для паскоранай дыягностьш анаэробных ¡нфекцый неабходна выкарыстоуваць метад ГВХ анал1зу ЛТК у б1ялапчным матэрыяле, для вщавой ¡дэнтыфшацьи Bacteroides spp. - метад ПЛР-ПДРФ анализу 16 S рРНК аперонау.

Галша выкарыстання: М1краб1ялогтя, ¡нфекцыйныя хваробы, практалопя, хфурпчныя жфекцьп.

РЕЗЮМЕ Слизень Вероника Вячеславовна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РОЛЬ БАКТЕРОИДОВ В ЭТИОЛОГИИ ОСТРЫХ ПАРАПРОКТИТОВ II ДРУГИХ ХИРУРГИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ

Ключевые слова: парапроктит, бактероиды, молекулярная идентификация, антаСтотикорезистеитнпсть. ср А ген, тт гены.

Объект п предмет исследования: 178 пациентов проктологических и хирургических отделений лечебно-профилактических учреждений г. Минска, 266 культур грамотрицательных облигатно анаэробных бактерий.

Цель исследования: изучить биологические свойства бактероидов и разработать научные основы эмпирической антибиотикотерапии и лабораторной диагностики вызываемых ими острых парапроктитов и других хирургических инфекций.

Методы: микроскопический, бактериологический, молекулярио-биологические, физико-химические, статистические.

Результаты: доказана этиологическая роль грамотрицательных анаэробных микроорганизмов в развитии острого парапроктита. Усовершенствован метод экспресс-диагностики анаэробных инфекций, основанный на газожидкостной хроматографии летучих жирных кислот в биологическом материале. Образование одной из ЛЖК: масляной, изомасляной, валериановой, изовалериано-вой - служит надежным индикатором начичия анаэробных микроорганизмов в образце. Установлено, что ЛЖК присутствуют в патогенетически значимом количестве как в биологическом материале от больных, так и среди метаболитов чистых культур бактероидов. Показано, что отличия в структуре 165 рРНК оперонов, выявляемые методом ПЦР-ПДРФ анализа, позволяют идентифицировать 95.0±3.4% культур бактероидов. Определены антибиотики, рекомендуемые для эмпирической терапии острого парапроктита: ампициллин/сульбактам, цефокситин, цефоперазон, цефазолин, левомицетин. Установлено, что метро-нидазол и имипенем сохраняют высокую активность в отношении Вааигопкх хрр., выделенных в Республике Беларусь, в связи с отсутствием резистентных форм и носительства генов резистентности - гит А, В, С, Э, Е и сП А.

Рекомендации по использованию: для ускоренной диагностики анаэробных инфекций необходимо использовать метод ГЖХ анализа ЛЖК в биологическом материале, для видовой идентификации Вааего1с!ех хрр. - метод ПЦР- ПДРФ анализа!6 Б рРНК оперонов.

Область применения: микробиология, инфекционные болезни, проктология, хирургические инфекции.

SUMMARY

Slizen Veronika Vyacheslavovna

BIOLOGICAL PROPERTIES AND ROLE OF BACTEROIDES IN ETIOLOGY OF ACUTE PERIRECTAL ABSCESSES AND OTHER SURGICAL INFECTIONS

Key words: acute perirectal abscesses, bacteroides, molecular identification, antibiotic resistance, cfi A gene, nim genes.

Objects and subjects of investigations: 178 patients of proctology and surgery departments in Minsk hospitals, 266 isolates of gram-negative strictly anaerobic bacteria.

The aim: to investigate biological properties of bacteroides and to develop scientific basis for laboratory diagnosis and empirical antibiotic therapy caused by them acute perirectal abscesses and other surgical infections.

Methods: microscopic, bacteriological, molecular, physical-chemical, statistical.

Results. The study proves etiological role of gram-negative anaerobic microorganisms in perirectal abscesses formation. The method of express-diagnosis of anaerobic infections was developed based on gas-liquid chromatography of volatile fatty acids in biological specimens. Detection of at least one of the following VFA: isobutyric, butyric, isovaleric, valeric acid served as a reliable indicator of anaerobic microorganisms in samples. VFA were revealed in pathogenically significant amount in clinical specimens and among metabolites of pure cultures of Bacteroides spp. Distinctions in structure of 16S rRNA operones in Bacteroides species established via PCR-RFLP analysis allow to identify 95.0+3.4% cultures of Bacteroides spp. Antibiotics recommended for empirical treatment of acute perirectal abscesses were determined to be following: ampicillin/sulbactam, cefoxitin, metronidazole, chloramphenicol, cefoperazone, cefazolin. Metronidazole and imipenem were found to display high activity against Bacteroides spp. isolated in Republic of Belarus. Tested isolates of Bacteroides spp. did not demonstrate phenotypic resistance to these antibiotics and did not harbour nim A, B, C, D, E and cfi A resistance genes.

Recommendations on usage: it is necessary to use GLS analysis of VFA in clinical specimens for express-diagnosis of anaerobic infections and PCR-RFLP analysis of 16S rRNA operones for Bacteroides spp. identification.

Area of application: microbiology, infectious diseases, proctology, surgical infections.