Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ ЦИТОХРОНА Р-450 БАКТЕРОИДОВ RHIZOBIIIM BUPENI

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ ЦИТОХРОНА Р-450 БАКТЕРОИДОВ RHIZOBIIIM BUPENI"

АКАДЭИЯ ник СССР 0РДЙ1А ЖШ ИНСИОТ ЕНСШММ им. А.Н.ЕОА

инозащвш

Ирина Александровна

СВОЙСТВА И «УНКЦКК ДОТОХРОЫА Р-450 БШЕРОВДОВ Шхо&ит е«р*Ы 03.00.04 - биологическая хишя

Автореферат диссертация на ооискаше ученой степени кандидата биологических наук

Иосква - 1979

¿<L C-. c,cc~ cJ¡>

Рабата выполнена в лаборатории энзимологии Ордена Ленина-Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Научные руководители: член-корреспондент АН СССР, профессор В.Л.Кретович; кандидат.биологических нале С .С. Ыелик-Саркиеян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор A.B.Котельникова; кандидат биологических наук Т.А.Калининская

Ведущая организация - Ордена Трудового Красного Знамен. Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР

Защита диссертации состоится " {¿f " 1979 г.

в " * час. на заседании специализированного совета (К 002.96.01) по присукденио ученой степени кандидата наук, в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (II707I, Москва, B-7I, Ленинский проспект, 33, корп.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1).

Автореферат разослан." " ^^¿¿¿Li 1979 г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат биологически наук

// /X..

„ М. И.Молчанов

0Щ1Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность про&пеш. ЦдтохрсмР-450 широко распространен в прдроде к играет важную роль в адгиедеятедъяости различных оргашсыоо. Сушоди, шподняе>,'.;е етим геыопротеидом, чрез- ' вычаЗно разнообразны. Так в микродомах • печени с участи ей цито-Хрош Р-450 осудаетгляется псдрокоялзрсваше широкого круга гидрофобных соединений, вое становление азосоедине!1иИ, разложение органических перекисеЗ и, вогиохно, переписное^окисление дневдов (Арчаков,1ЭТ5).

Показано, что питохрои Р—150 присутствует в бактероидах Я/ихс&шл¿арогисшп {сЯрр£с£у ,1967);« Й&1х£&шп йунМ. . (Кретович в соавт., 19726) к связан с процессами» обеспечиваю-' адии $Ексашго атмосферного азота (Кретошп с соавт. ,1972в; Матус о ссавт.,1973; «ехак-Саркисян ссоавт. ,1974 1975 6 ). Но фунхщокальная роль втого гемопротеида до с юс пор не выявлена. Недостаточно изучена и его свойства..

Какое место заюшает цитохрои Р-450 в процессе азот^икса-дкк, какова егокошфетнаяфункциональная роль» какие реакция осутествдяЕТСя о поаошы) этого гемопротеида в Сактеровдно! метке - вопроси, необходимость реяекия которых очевидна для полной рааыфровяи механизмов еимбиотэтеской азотфлксадаи. Всестороннее исследование £изжко-химическ;и, спектральных к функциональных свойств цатохрома Р-450 бактзроидов и их сравнение со свойствами аналогичных гемопротеидов из других объектов может дать кдш к решена» »тих1 вопросов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение свойств и функций цитоэфома Р-450 бактероидов АЛ- Сир£п1 (Р—150^ ). Шли поставледа следуйте задача: изучение структурных особеаяостей цитохрома Р-4Б0^ на основания его взаанодсйотвая с радой веществ с использование» спектральных методов исследования; сравнение спектральных свойств Этого гемопротеида со свойствами цитохрома Р-450 макросом сечена (Р-^Ь^у); исследовав способности цитохрома,Р-^50^ оксигешроваться кислородом, связанным с легогдоблком; игуче-ние процесса перекисного окисления ненасыщенных жирных клелот.

■ ' - нищ |

Г-ЧЕввегаЯ ед. Лсптоа Ожд.;.-. ■

(!(Ж) в бактероидах в плане возможного участия в нем датохро-ма Р-450дд ; исследование гетерогенности цитохроыа Р-4 50 бак- ' тероздов НЛ.

- Научная новизна. Шервые спектрально обнаружены структурные рааяичзд штохромов Р—150^ я Р-450^,,. Разработано -оптимальные условля азотфиксавди бактероидов ЯА ■ в

присутствен оксигешгрованных гекопротевдов. Показано» что ца--' тохром Р-450^ не способен оксигенироваться кислородом^ сая-эаитш с легоглоСанок: Бперше. в бактероидах .обнаружен /ро-\ цесс перскисного окисления ШЕК. 11нги<?::торннм анализом установлена связь этого процзсса о цвтохрэком ^-450^ . Впервде обнаружена гетерогенности «гтохрома Р-450 бактероидовRA.fi<р*Ы,

Практическая ценность. Изучение свойств и функций дато-хрока Р-450дд - одно из направлений комплексного исследования ыолекуляр;^ж ие;: лндзмов симбиотэтесксЛ фиксации, атмосферного азота.' Расшифровка этого процесса имеет огромное значение *ля .. увеличения содержала в почве усвааг-демых растениями азотистых соединений; а, следовательно,. Е'дашавяя урожайности сзль-скохо эяНс твгннцх культур. Таким образом, выяснение механизмов симблстической азотф«ксацш1нсойхЬддао для решения, одной из ваажейяих проблем*; современности -дефицита-белка на нашей планете! * ... -

Алсобанип заботы. Материалы диссертации были долояеш на. ко11ферен)цки мододых^ученнх МП5Ш'1978 г., а также на совмест- .. них коллоквиумах лаборатории энзиыологии Института биохишш . ■ им. А.Н.Баха и кафедры биохимии и зерно'ведения МПШП.

ПуАликгагли. Опубликовано 3 работа» отражающие основное содержите диссертации.,. I находится в печати.

' Объем работа. Диссертация состоят из введения, обзора литература описания методов исследования л использовашшх материалов, обсу^деняя полученных результатов, выводов а списка цитируемой литера'гури (159.ссылок). В обзора литературы дается сравнительный анализ (|дэико-хииячаских и спектральных свойств и функция цнтохромов Р-450 различных биолотаческих объектов. Рассмотрен вопрос гетерогенности цктохрома Р-450.

зжперишнШнЦя чАсть

Натекай Ü иетодй ясследоваЫя

В р-яботе 05í>feKfór.< Исследования являлся ¿ито*т>ом?-450 бактероидов кдубенькой длина желтого t ¿¿ufti/ius Culctis ¿f* ) сорта Шстрорастущай 4¡ Семена лгг-дна била ииоцглироваш перед посевов эффективным штапмои Rfi.iï'pini (359a)¿ Клубенька собирали в стадаи бутонизация - начала цветв юя ра стенлЗ t поскольку било показано i что эта фаза вегетакш соответствует максимально;^ накоплении цитокроги. Р-450 в бактероидах &рето£ич с со-авт;¿1972b). V

Выделение бактзговдов проводили, как описано (Райхинптейн с соадт. ,1974). Бактероида промывали 2 раза 20-хратши объемов К-фосфаткого буфера pli 7;4 о 0,3 Á сахарозой, осаддая юс прй 6000^. .

Разрушение бактероллов проьодалй.ó помощью ультразвука ло разработанной нами методике. Бактеролдй суспендировали до разведения 1:5 в G;I tí К-фос<$атнаи буфере рН 7,4, содержащем Iда II ЭДТА й ДОС-азу Í6,M от/йл), Суспензий бактероидов порциями по 100 ил подвергали действию ультразвука на установке Ы5Е-500 Вт, частота 20 кГц^ в течение 5 шк; яра. 0°. Суспензию разрушении: бактероидов Ьставляли на 1чао для действий ДНК-азы, затем центрифугировали 30 мши при 23000^ . Центрифуга?, содержащий ' растворише белкя^ использовали как "раствораяую фрикдав бактероидов" дда выделения цзтохроиа .

. Йщеление и очистку легоглобина ( ) проводили по мето- " дике ;Мел:т-Саркасяа с соавт.,1975).

( MS ) получали нз спктш. шшц капалота ¿о методу l^asnaxaAt ¿¿сД-1964).

Оксиген:грокшме гемоггротеядоа проводили в колонке с био~ геле» Р-2 (2x35см), уравновешенной 0,01 M К-фосфатшм буфером рН 7,2.На колонку наносили 2 ид свежеприготовленного раствора дитионита, а затеи 2-2,5 мл раствора геио протеида. За время гедь-фальтравди гемопротеид восстанавливался, освобождался.от . дитионита и оксагенкровался.кислородом, присутствующий в буфере. Концентрацию гекопротеада рассчитывалл по величине дггло-^

щения при длине волнн 525 ям, которая соответствует изосбео-ткческой точке (Мелик-Саркисли с соавт.,1375), используя ЕтМ*9,25 1968). - ;

ОлектроДореэ ¿злкошх фракций проводили в 7,5^ полиакрил-амидном геле в Трис-НС1-глицановом бу^>ере рН 8,6 ( ТЬтВз, - ЛЯ чоуЫ, 1967). 11а одну трубку наносили 50-100 мкг белка. Напряжение тока во время опита 300 V" , сила тока 4/т?А на трубку, время опита 1,5 часа при 6°. После электрофореза гели , окршквала (5сн5Идинобш реактивом для проявления геыопрот»-идов < Л/с$з, 1968) и параллельные пробы - Кумасси голуйиы.

Спектральные измерения проводили на дифференциальных спектрофотометрах " -356 г (Япония) и "Лтелео-

2)1^2 " (США) при комнатной температуре су двулучевой схеме. -В1Д1 использовали стандартные Знал кварцевые кювета о длиной оптического п^ги X см.

Дифференциальные спектры восстановленных цитохромов против окисленных регистрировали, добавляя а кюветы кристаллические днгиошт *д феррицианид. Для получения СО-спектров чорои оштную кювету пропускали окЖа ут^ерода в течение I шн. в виде потока небольших пузырьков* Зьтем содержимое контрольной и опытной юовет восстанавливали дитаэнятш и эадисивали СО—; дифференциальный спектр. Из спектра по разности поглощения, прд 450 и 490 нм рассчитывала коицентрацяю вдтохрома Р-450, используя £>т СУтсм~*для Р-450^ ( 19641) И

91^гг1см'"1 ДЛЯ Ч-ЬЪЪд-^КЖМс&съпМ,

Для изучения способности цитохрош Р-450 связываться с различными веществами гидрофобной природа последам вносили в кювету ьмкрсашрлцем порциями по 1-10 мкл, .что давало возмоя-иость построить график зависимости спектральных изменений от концентраций вещества. Интенсивность обнаруживаемых спектральных изменений выражали с помоць» величины. максимальной амплитуда спектралыих иэмелггщй £ Л 01^<а1(С <) в расчете на I моль цатохрома Р-450. Способность цдтохрома Р-450 отзывать субстрата характеризовали величиной Кд - спектральной константой дисаоцлацаи комплекса, - которая численно равна концентрации . субстрата, необходимой для подучешщ амплитуда спектральных /

изменений, равной половине максимальной* Рассчитывали величина Л О^якд. я К3 по спосову Лайнуавера-Берка (Арчаков,19?5).

Азотйаксирптарур активность бактероидов одреяелялга по ■:. скорости восстановления ацетилена в этилен 1973).

Условия ивкубацга бактероидов били разработаш нами сошестно о Н.б.Ешфовой. Гьисуспеизяа саптероидов помещали в стеклянные сосудики объемом 24^2 цл, ;?ермет1гско закрывающиеся ре аивошни пробками, Все Пробы содержали 50 кг бактероидов, . 50тМ сукданатМз , 1тЦ72/^2+,0,3 и сахарозу в растворе ■ 0,1 Ы К-^осфатного буфера рН 7,4. В опытную серию проб добавляли раствор оке ягекировшшого геодпротеида до конечной концентрации 0,5тМ. Сосудики заполняла газовой смесью состава (в шЯа): 02 -15, ацетилена-152 и аргона до 760. Иш^ба-цкв проводили при 28° и встряхивают при 200'об/шн. в течение 60 мая. Реакции прекращали добавлением Л^У до конечной . концентрации в опытной сусиензяи 2,5%.

■ Количество образовавшегося втилена измеряла на газовом хроматографе Хром-3 (ЧССР) в I ил газовой сыеси из реакдаон-ного сосудака. Сиещфаческую активность шракала в нмолях С^- иин'Ъя-^сухого Ьеса бактероидов. Влияние на аэотфикса-цмю веществ, блокирующих цитохром Р-450, изучали, доба&зяя в серию проб ьшкропдрицем раствори указанных веществ возрастающей кощгентрации.. Параллельные пробы контрольной серии с такими же концентрациями веществ не содержали гемопротевда. Из графика зависимости ингибирования азотфиксацаи от конденгра-1ия использованных веществ рассчитывал« константы иигибиро-вашя (К^) как для контрольной серии проб Сбез гемопротеэда), так и для оштиой ;(в присутствии 0,Ъ/этМ гемопротеэда).

■ Интенсивность лихаггля бактероидов определяли амперо-¿•етрическаы методом в полярографической ячейке с закрашм .. платиновым электродом конструкции Шольца и Островского (1975). В ячейку объемом X мл помещали около 10 кг. бактероидов в 0,1 М К-^осфатнои буфере рЛ 7,4 и 12тМ сукцплат На в'качестве субстрата. Интенсивность дахн!мя измеряли при 28° и заражали в нмолях поглощённого Од в чао на мг сухого веса бактероидов.

Дзя изучения деЗствкя на дахакле в пробу вв. жда раствор

белка а 0,1 К К-фосфатном буфере рЦ 7,4 до концеитрашн 0,5/яМ. Действие ингибиторов на дихалие изучали, добавляя в ячейку ма-кроапррцем раствор« штибиторов сордаякя по 2-10 мкл, что давало возможность построить графики зависимости интенсивности дыхания от коадянтрадо! ингибиторов.

Для иэтчекуя перекисяого окисления лшшдов в бактарогднх в сосудики'объемом '¿А~ 2 из помещали 50 мг бактероидов и~1 m иккубадасчой смеси сдедушего состава: Трис-HCI буфер рН 7,4 -- 50/гШ; KCI - SQm'U; - 5mll¡ НАЛ.СИ - ДДФ - 0,2/»Ы;

Ге^ - 0,012 n> II. Контролем служила проба со всеми добавкам, но без бакт'роядоз, йшсубащии проводили пр-1 30° н встряхивании при 200 об/ыия. в течение 60 млн. Реакцию ос :аи-'_уивали доОаале'-ием 25- ыкл I0QS 'Ш1. Осадок удаляли центряс^тировакиеи в течение 10 иан. при 7000 об/мин.

Об интенсивности реакции переписного окисления судили по количеству образовавшегося малонового jy альдегида (MÍA) -оо- -H0B8QI0 продукта перегвсного окисление. Определение ИДА пр'~- ■ дали по его спешмстеской реакции o ti'обарбитуровой кислотой (ТЫ), Реакция при высокой температур* и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного трклегиноього комплекса, со-дерхрцего X молекулу ИМ и 2 молекулы ТЕК. Максимум поглощения. комплекса - 635 км, -

К центрифугату-добавляли 0,2.мл 0,6 н HCI, 0,8 «я 0,.Г2 М ' ТШ п нагревали на кипящей водяной баио 10 мин. Количество образовавшегося ИДА .определяли по величине оггпгчео-кой плотности при 535 им с использованием коэффициента молярной екстинкдяи IkSG-IOtí^cm™1 (Вдадамиров, Арчяков,1Э72).

'- Штохром с-редуктазятю активность определяли в "растворимой фракции бактероидов". В I см оптическую кювету помещали оштну» cj»cb объемом 2 «л, которая содержала 0,05/»?Ц окислен-шЯ цатохрэи с и соответствующее количество "растворимой фрак-иаи бактероидов". Реакции начинаси добавлением HAÍH или НАДОН " npü цепочной концентрации 3,6-10~^Н. Контрольная кювета содержала все ко*шонеиш, кроме НАД(4)Н. После перемесивашя авто-»латаческ* в вписывали скорость восстановления штохрома с по - -

изменения опгяческо* плотности при 550 им аа спектрофотометре "¿peccrtd". Sa единицу адтявяостя днтохрсм о-редуктааы срана-мада.жаиененне оптической пготноств в 0,01 за I ш. Удсльку» активность шрахали в ежждал ьлткгноста ка1 vc белла.

Шкрог-оиаяьнтр фракцяд самзов белых Kftfc получали

от А.И.Арчакова из ШУЛ.г.ЦОЛШ^

Белок определяла ш метсду ^оури Щоигг^1951).

Р£ЗТ2ЬХ1ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ 0БСУЖД2ШЕ Г. Выделение и ■ очистка штахрпка

Цитохрсм Р-450д„ РМдедяля из "растворимой фраяцая бакте-роддов*t подученноЗ после разрушения клеток ультразвуком. По-сшы. в дзтерату! i не имелось даннаг о применения ультразвука для разрушения бактероидов с цельв выделения цнтохро^а Р—150^, вами была, опреаехеа*, оптимальные условия раэрукегая бактероидов с аомоцьв ультразвуковой установки. Шло показано, что наксднадьшЯ - выход цигохроиа Р—450 достигается при пятиминутной обработке:(табх;I).

ТаАсша I'

Вотосю длительности ультразвуковой обработка бактерождов навиход пятохрома ?-450^

Дхатехьность обработка ультразвуком, шв. Конц*я?расая . .пнтагрома Р-45С, ююль/мл ОбягЛ белок, иг/ил Удельная ков-аентрашя да— тохрома Р-450, емодь/мг бедка

2 0.06 2,00 С,030

5 0,10 3.32 С, 030

7 0,09 ¿¡,60 0,0&5

1С 0,07 4,04 , 0,017

Очистку квтахрсиа проводили по схеме, прелусмг.-

тряваипе! дробное дасйдававяе'сульфат«* твм, гвль-фгдьт-

рацкю.череэ бяогель Р-30 (в колонке 22x60см, уравновешенной 0,01 М К-фосфатным буфером pli 7,4) и хроматографию на целлюлозе ДЕ-52 (в коленка 1,5хТ8см^ уравновешенной 0,01 Ы К-фос-фатным буфером pH 7,4) о иоводьэоваше« ступенчатой влщии белков К-фосфатныи буфером pH 7,4 возрастающей концентрация {0,03 и 0,15 Ы) (табл.2). Штохром Р-450 алшровался при ■ :; концентрадаи буфера 0,15 Ы. Полученный таким образом препарат цитохрома Р-450д/, был свободен от примессй других геыо-протеидов и содержал ляиь следовые количества цитохрома Р-420 - каталитически неактивной цитохрома Р-450 (рисЛ)

4СО ; 450 500 ; 550 вы

: РдоЛ. СО-дафферекцлальные спектри: . I - фракция гемопротекдов поело биогеля Р-30; : 2 - цитохром Р-450/^ после целлюлозы ДБ-52. '

Все операции по выделению и очистке цитохрома Р-450^, прободали при 0-4° о использованием буферных растворов,лря-готовленных на биднетидлироваккой воде с 1/пУ1 ЭДТА, Препарат цятохрома Р-450^ , полученный при хроматографии на Д&-52, свободный от других гешшротеидов, .испольшвали.в дальнейшей работе.

• Таблица 2 -

Очистка датохрома Р-150ЛЛ

Этапы Общий Общее Удельное Степень Шход,

очистки белок, количество содержание очистки %

• иг ■ ' Р-450, ■ ; Р—450,

кмоль ныоль/мг белка

"Растворимая

фракция ■

бактероидов* 1774 55 .0,031 • I 100

Шсадивание

: 33-60* ; . * .

.насыщения 288 49 / 0,170 5,5 8Э

Биогель^

Р-30 77 ; 31 0,403 13,0 56

Целлюлоза. '■■"

дв-52 10 - 7.6 0,760. 24.5 13,В

2. Стртктурние особенности цхтохоома Р-450.«, по дающм спектральных исследований

Важным'свойством цитохрома Р-450 является его способность образовывать спектро^отометраческл регистрируешс комплексы о широким кругом соединен^ гидрофобной природа. При атом наблодаются два типа спектральных изменений. Комплекс«-руицайся с цятохроиом субстрат'или ингибитор ыохет быть связан в области юсстого гидрофобного лягаидагема, при этом возникает I тип спектральных изменений. При связывании вещества с железом геыа образуется феррагемохрои с характерным спектром II типа (Арчаков,1Э?5). В литературе имеются д&кшо, указывающие на возможность вззикодейств^ш некоторых соединений как с железом гема цитохрома Р-450, так а с гидрофобным участком белка, что приводят к появлению спектральных изменений смешанного тала {ЗсЯспАтап, 7^ссл1? 1969; -¡¡оттоль. Ох ?£писз, 1573). а

- ю -

, Поскольку вдтохром Р-450 бактероидов а этс*л отношения ие бь1л исследован, важно было пошотреть-, как связываются с .

■'Р-450Д/1 (0,8 мкМ) с метирадонсм (1-0,32/яЦ;

1,еО/г»М; 3 - 4,32/пМ)

■ .■ Спектры, подучешые при титровании шиохрома Р-450^ иетирашнои, шест 2 максимума (рис.2). Ник при 421 нм ха- .. рактерен длс комплексов цитохрома Р-450, образованных по II ' -

■ типу связывания, а щк при 396 ни - по I типу. Близкие значения К^ и К^д говорят о приблизительно одинаковом срод-

■ ствв мвтирслона к хелззу гсиа и шдрофобноыу участку белка.

; ^ При связывании цитохрома Р-^бО^д с шдал концентра-: - хуяыи октиламина наблюдался спектр I типа (рио.З). По мере -пош IIе 1кл конпентрацяя окталадша спектр приобретал смешан. . характер и появлялась полоса поглощения в области 430 нм.

400

420

440

460 км

Рис. 3. Дифференциальный спектр сзнзаваккя цатохрома Р-450д^ (0Д2 мкМ) с октдламином (I О.бтМ;

2 - 2,0/яМ; 3 - 3,5/иН)-

Появление.спектров-сметанного типа, а такго несимметричность пиков в области 430 ш может Шть шзвано кал!пием нескольких форм датохроыа Р-450ду, по-разному взакмодеК-ствуисос с октиламином. *

Интересно, что при титровании октиламином некоторых препаратов цатохрома Р-450^ проявлялась яркопаражеише спектральные изменения I типа (нм, А ьмн"418 нм) без наложения на них спектров II тиса. Ь'юоно думать, что в данных препаратах железо гида цатохрогл Р-450^ било прочно связано с эндогенным субстратом, которнХ не штескялся из комплекса даже шсокима концентрациям;: октила^тна. Можно также предпо-долить, что щтохром Р—550 в таких препаратах бал представлен компонентом, способным связываться с октилачинем только в области шестого гидрофобного лаганда гема.

Для сравнения балл получены спектры связывает с октил-ашшом датохрома Р-450^у, которые оказались характерными дня II типа связывания. ( Л цаксТ430 нм* ^ шгнГ396 ^ =0.12л»М.

При титроваиии фенобарбиталом наблюдались спектральные изменении! I типа как для цитохрома Р-450/у, , так и для Р-450^

Рис.4. Дифференциальные еаектрц связывания с 1тМ фенобарбиталом: Д - цятохрот Р-450д/, (1,30 мкМ);

2 - цитохрома Р-450^( 1,35 мкУ).

Тадим образом, проведенные наш спектральные исследования показали, что цитохром Р-450^ способен взаимодействовать с ъ.ет^ог.оис-н» октидаынном и ¿[«нобарб^талсм. По характеру вза-'шодеЗстшл с фенобарбиталом вдтохром Р-450^А сходен с цито-хротм Р-450^. В то же.гремя по типу спектральных изменений, 1"аблшаем1х при его взаимодействии с октиломином, он существенно отличается от цитохрома Р-450^, что может служить доказательством структурного различия гсгаэого окружения этих цатохромов.

3. Исследование взаимодействия цитохрома

с кгзлородом. связанным с легоглобикоы.

Известно, что здтохром Р-450ял связан о сиыбиотической азотфидсгдаеЗ, но конкретная роль его, в это» процессе не ясна. С Цчдаю изучения функций цктохрош Р-450дл наш были проведены опыты по,аэотфиксании « присутствии-оксигенировац-шх гс(.*ояротелдов в условиях блокирования датохроыа Р-450. Предварительно ми разработали оптимальные условия азотфикса-ции и суспензии бактероидов НЯМ^Ыпг, выделенных аэробно, поскольку имеющиеся в литературе данные были получена для бактероидов Мх.]ароги£сст , выделенных в анаэробных условиях

■ Надсамалыща уровень азотфкксадшг наблвдала при объеме пробы I мл, количестве бактероидов в пробе 50 мг и концек-траца.ч гемопротеада 0,5тМ. При этой стимуляция азотфиксации ^состашмла бб^дуи и_125С$ для (рио. 5).

£ я о А

> I

Л

О <о

п

Бактероида, мг

Гемопротеад^Ц : ; .0 0.5 .0 0,3 Д5 0 0.3Ц5 Объем пробы,мл • 1 з 1 ■

0 05, .0 В£Ц5_.0 ЦЗ^З. I г 1

Рис. 5. Влияние н условий яккубащв,

па азотфиксирущу» активность бактероидов ЯА &^ойъг. -.

v -14- •

Дальнейшие ошм по азотфяксащш проводили в найденных наш овтимальных уодовиях. ЗаддчеП этщс оштов являлось тиснение вопроса о том, имеет ли место передача кислорода наци-тохром Р-450ДЛ, непосредственно отДш решения этого вопроса мы лрож>дшы опыты по азотфлксацет в' присутствии окссте-няровшшых геморротеэдов в условиях блокирования цитохрома Р-450дл радой соединений гидрофобной природа. Из шбраниых наш соединений фенобарбитал н даиетиланклин связывались с цято-хромом F-150^: в. области б-го гидро^об'ного лигаяда гема, ши- ; лии - непосредствен!» о железом гема (РаЯхикг2тейи,1975),.а ок. тплашн н метвразен бшщ способш к "двойному" взал^-одеПстш. Уамибылопоказаж>;ч?о ни одно нз'габраинмх соединений не взаимодействовало о геы-группой JU& в физиологических условиях. образовывал геиохрем пра pH 7,4 ливь с метиразоном: Поэтому- метнралон в опыта* по азот^иксацаи и дцхашш в прасутсг-вих ¿CCCix не использовали. ' .. ' л

" Скорость восстановления ацетглена сусаензшш бактероидов в контрольных оштах составляла (в ныолах С^Н^ • . в.

бахтероадов); 0,2-0,3 беэ гамопроте:ща; 1,8-2,1 ; 2,3-

2,в Все выбранные нами вещества а значительной степени

ингиблровала процесс восстановления как в присутствии X&0Jtv. Jli£C3% так'и без геыопротеидов. ' Результата оштов сведены в табдицеЗ в виде констант ццгаблровандя Kj.

■ *• Ч ■ Таблица 3

Влияние я на процесс восстановления в условиях блокирования цитохрома Р-450^

Вещество Кг

. — _ — _

■безгеио- • ^ +альбушн,

протеида О.ЬпУ 0,5вМ 0,&->М

Фенобарбитал .1,50 '"■; 1>0 2,00 2,30

ДшетЕланилцк МО. 1,70 1,80 1,95

Кеткрааоп 0,44 1,10 0,96

Октидгкен '■' • ■ ■ 0,26 0,26. 0,65 . ' 0,58

Аншлаг . ' 3,20 1 3,90' 9,00 . 9,50

1идно,чтс присутствие в суспензии бактероидов .

практически на изгоняло Kj для всех выбранных ингибиторов, что говорит об отсутствии конкуренцшг моцду ингибитором;к кислородом, связанным с ,. присутствовавший в суспензии бактероидов» несколько завита значения Kj, Ш предполокилн, что s то явление бал о связано с неспецифичноЗ адсорбцией ингибиторов на JUS, Дня проверка дтпшго предположения били проведены опыты по ингабнрованшэ азот^кксагдо в присутствии сывороточного альбумина (фр.У), который, как известно, является хорошим адсорбентом гидрофобных соединения. Кок видно, альбумин в приблизительно равной ъ Л/6 степени завышал Kj, что подтверждает папе предположение. .

Поскольку в присутствии:aft&t"естественного геыопротегда клубенька, не наблэдалось повышений значений Кj, можно думать, что конкуренция ыевду ингибитора! и-кислородом, связанным с KS, не имела места. Отсутствие конкуренции мевду ингибитором;, бло-киружк;п1 цитохроы P-4S0, и кислородом, полученным ототрицает существование врямо.Ч передачи кислорода от v ци-тохроцу P-t50^ . ; ^ ■ • ■ ."

Нами были проведены тагае опыта по влияния атих же' вещест* на дыхание бактероидов в присутствии и без гемопротеад*.

■' ' ■ ' . ■ . ■ Таблигд 4

. Влияние Н4 дыхание бактероидов в : -

условиях блокирования датохрома Р-450^-

Вещество . ■ без гемопро-'--теида - ;+jfiиь,... 0,5/»М •

фенобарбитал йвлетияакилан Октиламин Анилин 9.9 . . 6,i ■■ 4,4 . - 29,0 ' . .11,0 . •• С • ■ -5,5 " ' ' • " . '4,4 '' "■':'' 29,0 -'"л

В отсутствии ингибиторов скорость поглощения 02 оусяензиякя бактероидов составляла (в. нмоллх бактероидов);

0,13-0,13 без гемопрогеида; 0^5-0^3 с ■

-к - ;

Присутствие я суспензии бактероидов веществ, блокирующих цатохром Р-450, снижало, интенсивность дохания. Из таблицы 4 видно, что в опытах по дыханию, как н в опытах по аэотфикса-ции, присутствие всусйензяи бактероидов практически '

не шшяло на ^, что также свидетельотвует об отсутствии конкуренции между ингибитором и кислородом, связанным

Тагаш образом, наш' результаты, подученные о серией ингибиторов как в оштах по азотфиксации, так и по дыханию,1 не подтвервдшт гипотезы, выдвинутой в свое время Эпплба {ßppft&j.

) р существования: прямой передачи:кислорода от -У&О* к цитохрому Р-450*/,'

4, реоекисное окисление и бактероида^ и его свяэь г : " " 9'питохрокоц Р-450^. ''■■.-Показано, ; что одним «э факторов, влияших н^ интенсивность скмбиоткческоЯ азот^мксацни, является i¿стояние.бахтероидноД мембраны {¿Oxaneetai^V^}в). Известно,: что проницаемость .--' "О мембраны мо*ет регулироваться продуктами пзрёкасного окисления лшшдов,;входящих в ее состав.Лдеются также основания полагать, что процесс ферментативного перекисного оклслендя 1ШС в. микросомах протекает е, участием :дитохрома P-iSQj^ (Арчаков с ■ ооавт.,1969; Владимиров, Арчаков,1972). Укаэанные факты позволили нам высказать предположение; чтов бактероидах тоже имеет место ферментативное перекисное окисление НЖ, связанное с цк-

тохроиои. ' -'Ч/--;:''"vV-'

Надажним тестсы ва процасо перекисного окисления является определение одного из основных его продуктов - малонового да-альдегида. Давние таблицы 5 показывают, что в суспензии бак-теровдов при добавлении соединений,необходимых для активами перекисаого окисления липидов в макросоиах, имело место образование МД1. В контрольных'опктах без реактивов, без бактероидов, а также о кипячению бактероидами выход ЫМ был очень не значительны», при инкубации бактероидов в атмосфере кислорода, необходимого для перехисного окисления, имело место сти-мулароиание'цроцесса. Добавление к системе этанола также заметно увеличивало выход 1Ш.; ■

: . ; : - х? - .■

, ■ Таблица 5 - Влияние некоторых факторов на образование ЫДА в суспеазаи бактероидов АЯ.€ир£л*'

я " ~ ~ " 17 " ~ " , : . 3> к-ж иа 50 иг

Состав пробы . ггоЗо

■., * , ■ бактероидов

« « »» » » ™ " » » ■

Полная система 0,42

Без реактивов ; 0,08

Без бактероидов - 0,10

Кипяченые бактершда, 10 иш. 100° 0,09

В атмосфере кислорода 0,52

Добавлен этанол» 6% 0,58

г.' 10Й ; 0,73

С НАДФ+ 0,10 ■

. Без НАДЭН . • 0,28

Без Ре3* - 0,27

Добавлен ЭДТА, 0,06тМ . . 0,04 .

- " - ПЗСМБ, 0,1"»М 0,34

" - менедков, 0,1/т»М : ^ . 0,25

НАДШ заменен на НАЛН ' 0,71

Исключение иэ решшжжно! смесяНА?ФН, донора электронов в системе перекисного окисления, а также при замене НАД4Н на НАДФ+ имело место существенное ингибирование процесса. В отсутствии Ре3*^ а также при добавлении в пробу ЭДТА, связывающего ионы жилеза, необходимые для процесса перекисного окис- * ления, наблвдалось заметное свяжение ■ выхода

Ингибирование перекисного окисления ларахдормеркурибен- -:' зоатом указывает на участие в процессе ферментов с функцио-" нальныкл сульфгилрильньши группами. Такими ферментами могли - ■„ бить НАДФН- и НАД!-пдтохром с-редуктазы {Ж"*усау, Участие КАДЗН-цитохром с-редуктазы подтверждается также ивги-~-~~ ~ бированием менадаонои и.НАДФ+.

Известно, что перекисное-окисление липидов г микросомах строго специфично к НАДОИ (Арчаков,1375). Ш обнаружили, что в бактероидах, в отличие от макросом, в качестве источника 'У>

электронов др* перекисном олиолекиж мивт Онп яспольэоваа нв ' ^только ШДаа. яо я НАДЯ, пржчемс помедгшмянтенсявноотъ процесса в& '¿0-70$ шве. В растворимой фракции бактероидов нами обнаружены ОДШ- ж'1ЩК-цжтохроы с-редуктааы о удельнойад-тквностыэ 2,12 я2,71едшшц соответственно. Поскольку процесс перекасвдго окг.слеши стхмудяровался хах ШССУ, так « НАЖ, мохао думать, что об« редуктазк фуцкдаонЕруггг з пепле переноса , электронов, связаявых с переяюшм окхеленнем НХК.

. Такт образом,, полученные ваш- результаты- свадетельствухгг о надггаг процесса перехисного окисления хпядов'в бактероидах.. Процесс является ^ермзнтатишшм, зависят отярисутстния ионов желе»« к связан с цепями:переноса ьдектронсв/отаслиюдах как

НАЕЭН, так в нш.

Дальнейшей задачей ксследоваЕи* являлось шяснеэже учас-тая в атш процессе пктохроиа Р-450/у,.' Для «того ш гаучалз идглииэ ЯЛТ-^ЗАя метхрапэна, специфически свяшваедс,- да-тохром Р-450» на выход МДА пра инкубация бахтероидов в полнов системе, ках с НАДИ^ так ж-с Н1Ж. .

■ Твбддца Б

Вжжянже йЯЛ-бгбА я метарапона н» процесс /

первкаояогоокиедення'лнпждоввбактзровдвх.

Ооедквевжа Концентрация, X ' т)1 Нпг»3«рсшан»в,? НАЛОГ НАЛЕ:

БКР^вгг!'' ^ 67 43

Иетжредон. - » ■ Ю -. -

* - - г,о 20 Iь

Кпд. видно яа табляда 6, при книубашв бактероидов в системе как о НАДЗЙ, так к о КАЮ в присутствен 5/СР-525А 2 ме-гирайона имело место существенное яигиЗированзе процесса. По-сдола-куг ЛДГ-525А и матнрапон спедафичеои связавши цзтокром Р-450 к ь'в явюяяся антяоЕсядаатгш (Арчадла,1975;

j978), иягийиртвдсе действие этих веществ, очевидно, вызвано блокированием цит'трот Р-450д^. Следовательно, место думать, . что цптохром Р-450^ участвует в процессах перекзеного отделения НИК в бектерохдах. Поскольку кыгиЗирупаее действие SKF-525A и метжрапона наблюдалось как в системе с ИЩИ, так к с НАД3., ш полагаем, что в бактероидах при перехиспсм-окисления восстановление гитохроиа Р—150^ осуществляется в цепях, овисляида как ИЩИ, тал: = НАДИ» через HAJSH- и HAJH-., цитохром с-редуктаза соответственно.

Таким образом, ва оезовакии наззх опытов можно предооло-хать, что одной хз функций цхтохроыа Р-450^д является его участие в процессе перекисного окисления дипидрв.Каа известно, продукты верекисЕого окисления участвуют в регуляции пронг- :-■'. цаемости мембран. Постольку было' показано, что состояние бах-тероидвой мембраны непосредственно влияет на аэотфиксацав {¿¿basic c/W.,l978), иохно сделать вывод о связи оттохрома Р-450^л о зтям процессом.

Результаты хашх оштов, безусловно, ые исключает других . возмоепых функций фгсехрома Г-450^. йголве вероятно, что . этот геэюцротеяд приюовет участие н в других протекахдах в бактероидах процессах, связанных, с азотфиксадаей,

5. Исследование гетерогенности татохрема Р-450 Ф бактероидов ДЛix&£ium

Из литературы известно, что цатохром Р-450 тагах объектов, как шяросомы печени, митохондрии вадпочечшгаоз, дооххи и бактероида RR.Jopcnicurrt представлен несколькими Еоипонен-' хаки. Проведенные нами спектральные исследования возводили', "■ высказать предположение о наличия нескольких фори' цитохроаа Р-4о0 также и в бактероидах В связи с атямдаль- ;-

нейаей задачей работы являлось нэучоклэ готерогенностк_щтб-^— хрома Р-450 бактероидов/?//. Са/эйг1. ■ v

Франца» гемопротеидов,' оолученвуи на биогела Р-ЭО, хро-иатограф!ровали на цедлшозе ДЕ-52 (в колонке 1,5x18'см) с использованием линейного градиента К-фосфатного,буфера (£00 (**■-' 0,01 U К-фосфата + 200 мл 0,2 И K-фосфата) pH. 7,4.3 результат с

Рис.6. Профиль шшции геыопротеидов с ДЕ-52 о ' исполь зовокаем линейного градиента К- фосфатного буфера.

было получено 5 белкошх фракций,'содержадяос геыопротеида (рас.6). В составе першх двух фракцгЙ элшровался штоосром cSC2 с небольшой примесью щтохродо c55q. Штохром Р-450^/, элхирсвался во фракциях III, 17 и У при концентрации буфера в пределах 0,05 - 0,15 Н. Другие геиопротеидн в этих фракциях обнаружены не были. Аналогичные результата бшш получеш при ступепчатой элюшш белков с ДЕ-52 буфером возрастающей концентрации. Цатохром Р-450^ аягаровался во фракциях, пышна еьих при концентрациях буфера 0,05, 0,10 и~0,15 М.

Так»1: образом," хроматография показала, что цитохром ~ Р-450 бактероидов flh.ÙÀpùU "гегерогекен и при <фракдаоиирова-. ■ шел на дедлмозе Ж-52 разделяется на З компонента.

Изучение гетерогекноота цатохроиа Р-450^ проводили также методом электрофореза в НАГ. Для,электрофореза использовали смесь фраятй П1,1У,У, подученныхна ДБ-52., как "сушарнкй очицекный препарат* датсхрша Р-450, "неочищенный суммарный

препарат" цитохрома Р-450ял, содержащий кроме того цитохрсш группы о (фракция белковпосле шсоливакид сульфатом аммония а обессолкваная на колонке о биогелем Р—4) и, для сравнения, фракции I с ЛЕ-52, содержащую только датохроьм с^и 0550«'

А Б ". ; В .

Рис.7. Злектрофоретическое разделение датокрсма Р-450^л: А - неочищенный препарат цитохрома Р-450^; Б - очищенный на]ДБ-52 препарат Р-^бО^г . В - фракция I о ДЕ-52 (цигохромы С552 и

: Из рисунка 7 видно, что при электрофорезе как неочищенного, так и "очищенного" препаратов цитохрома Р-450 и окрашивания гелей бензиднношм реактивом ш анодном конце гелей проявлялись 3 полосы геыопротеидов. Сопоставление данных электрофореза и спектрального анализа исследуемых препаратов показывает, что эта полосы обусловлены присутствием цитохро-■ ка Р-450^.

Таким образом, хроматографическое и злектрофоретическое разделение датохрома р-450 бактероидов дало совпа-

. дающие результаты и покаэадо|--что этот гемопротевд гетероге-нен и состоит из трех отдельных хсыпонентоз.

• В предилуцеи раздел« работы «1 показа.«, что цитохром Р-450^, по-вцдаюму( принимает участие в процессе перекасно-го оююденая КХК;: Поскольку в бшетероадах в^н об-

наружено несколько форм вдтохроиа МЙ^ » мсяшо думать, что разные формы ответственны .за различные процесса, протекагляе в бактероидах и в разное степени связаны с серекисным окислением. • ... ■

Изучеше конкрётныя функций отдельных кокпонентов вдто-хрома Р-450^1 а тажжё вх структурных осойеаностей должно отать предке той дальнейших исследования цитедкааа Р-450^; Ы-ясвеиие этих вопросов попадает установить роль штохрбма Р-450^ в симбяотической аэотфиксации.

-в и во д,ы ;

V- I. Разработаны условия разрушения бактероидов МХирсп! ультразвуком о ~елью выделения штохрома Р-450^. Получен препарат патохрама Р-450^; обеденный в 24 раза и освобожденный от датохромав других групп;

2. Спектрально установлена способность цитохрома Р-450^ взаимодействовать о ыетдралоиои, охтнлашшом и фенобарбиталом. Показано, что при образованна комплексов дитоярош Р-450ЛА с фенобарбиталом возникает спектральные изменения I типа, ас метирадоиои и октилаыином набладается смешанный тип спектраяь-. вых изменений. Шявдены структурные различия меэщу датохрогака Р—450^ в Р-450^ва основания спектральных исследований комплексов вдтохромов о указанными веществами. . '

3. Разработаны оптимальные режимы аэотфшеацаи а суспен-; &32 изолированных бактероидов Обнаружен высокий

уровень стимулирования аэотфексации легоглобнном и шоглобином.

4. В опытах по азотфиксацни бактероидов в присутствии " к в условиях блокирования цитохрома Р-450^ показано, что прямая передача кислорода от окспгекзрсванных геио-протеидов к датохреку Р-450^ не имеет мест^. Полученные данные подтверждены в оштах по дахашзз бактероидов в присутствия

ингибиторов датахрома Р-450^. :

-235. В бактероидах Й.В.СарЫ обнаружен ферментативный процесс перекисного окисления липидоа. Методом ингабкторного анализа показана связь этого процесса с цатахромои Р-450^. Предполагается, что одной из функций ютохрсма Р-450ДА является участие, в реагадох перекисного огасленяя липндов.

6. Разработан ме.од хроматографеского разделения цато-хрома Р-450д^ на отдельные компоненты. В результате получено 3 компонента цктохрока Р-450^, идеитлфяцированшх методом дифференциальной спектрофотоиетряи. Проведено электрофореги-чеекое разделение цитохрома Р-450^, в результате которого таксе подучено 3 фракции цатохрсма. Таким образом, памп показано, что цитохром Р-450 бактероидов ЯЛ£ир</и. гетерогенен и состоит :13 3-х кокпогзнтов. _ *

СПИСОК :

работ, опубликованных-но материалам диссертации.

1. И.А.Иноземцева, С.С.Целяк-Саркцсян, .В.Л.Кретович, 1378. Гетерогенность цятохрома Р-450 бактероидов !Шхр£Олт&<рй*1. Доклады АН СССР, 240, 6, 1468-1471. " ■ , ,

2. Н.О.Батирова, Л.А.Иноземцева, С.С.Нолик-Саркисян, В.Л.Кретовнч, 1973. Влияние геиопротеидов на азотфшссируюпух) активность бактероидов Я/У,хс$шт физиология растений 25; I', 18-24. • _ ■ ■

3. И.А.Чкоземцева, С.С.иелик-Саркисян, Е.Л.Кретович, 1979. Иолет л£ лего.-лобин передавать кислород цитохрому р-450/»? До1:дада АН СССР, 246.3. -

4. И.А.Иноземцева, С.С.Мелж-Саркдсян, 1Э7Э. Выделение и фрак тонирование вдтохрома Р-450 из бактероидов клубеньков лшива В сб."Метода современной биохимик" вып-2 (в печати).

ЗАХ.1442 TUP. ISO BU ВНШКС*. T- OeMT ОТ 55. CH. 1970.