Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦИТОХРОМ Р - 450 БАКТЕРОИДОВ ЛЮПИНА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ЦИТОХРОМ Р - 450 БАКТЕРОИДОВ ЛЮПИНА"

V-

Академия наук СССР Ораена Ленина Институт биохимии имена А.Н.Баха

■ На правах рукописи

РАЙХИНШТЕЙН Михаил Вениаминович

1ШТОХРОМ Р-450 БАКТЕРОИДОВ ЛЮПИНА (Специальность 03.00,04, биологическая химия)

Автореферат диссертации, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1875

С г , / f. к G„r:

CtU. , L i;-- ¿ic (v 4 ^

" шдавя наук соср

Орлова Л«нжв» Иясмтут Оюквммш птш>А.Н.£ш

■ . ' " fia про« {фкоаяса

; РАЙХИШГЕЙН ■/ .

. Михэял Ввниеиивоввч ■ ■ ■

ШТОХГСМ Р-450 ШТНКЭДЮВЯШИНА. - (Сивдаааьвооть 03.00.04, бюлогжчвская гвнвя)

•ч ■' л, 1 '

■ АВТО РЕФЕРИ

диссертации, представленной на соеокав*в ученой степени канлвдата бвологетвоюис ваук

Мооква, 1975

Lio снохой 1-fi.i. Сег.ьхоз.

Г.г-л1 Л.

I M.JLS&VS'

РаОот» вшюдшена в .»аборетор»ш внвжыологми Ордена Ленив Инотжтута етохашл аиенл А.Н.Баха ДНСОСР

Научшвиководатвл*: \

<Лвш-норр^опонден» АНСССР, профеооор В,Л. КИЯОЕИЧ, кандвдат Свологачвскшс наук С.С, МШЖ-САНОДСЯН

Офадоидедо оппоненты: доктор бвологвчвскжх ваук Г.Я.ЩЗНЕВСКАЯ, жавдадат ваолоиивогаи наук М.А. ДУКОЯНОВА

На офчимгьны» отзив работа направлена аа кафедру фивмалогм рботенш! НГУименж Ы,В. ЛОИОНОООВА ^

■( У;--.- V' ¡(" ■

Автореферат разослан 1975 г*

Защита джссерташи состоится 1975 г»

ва васедвшш Ученого Совета Озлена Ленжиа Инстжтута бяохяшш тега А.И. £а» АН СССР ( Москва, В-71, Денвяекя* вроопех«, 33 ).

СдЕСОвртацивЙ можно овнажошться р йиблдотеке

. Ивстатута. < ."-.'* ■ ' : г/\'". '■" '.

■' : Учввш1секрвгарь :.

хандадат йвологачвскжх наук , /И. В. ДЬЯЧКОВ/

• '■•У-'-1 :]■■'-^г^., ■ -v i;

л .; Биологическое связывание мале^ляряо#о аэота.привлекав* ■■ .>>'..-• к себе пристальное впимание ученцх,!поскольку выяснение ме-• . ; ханиэма азотфиксацай могло бы дать ключ к увеличению коли- • . • ;. честна лицевых продуктов. • Особое внимание уделяется симбио-. ' тическим азотфиксирущим системам,"'играпцвм важную роль в . • , V-:.. повышения плодородия'почв. ', ..; '' v,^' -

... . За последние года достигнут существенный прогресс в яэу- '..• ; -v' -ченви механизма связывания азота клубеньками бобошх. расте- •',••, : ний; № бактероидов, сямбиотическоЯ $of«u клубеньковых бак- / ,-: ■•;. * териЛ рода Rhitobium , выделен активный.полисе |кентннй ком-' : . . * . '' плекс "нитрогепаэа?," осуцествляпявй восстановление н2 'до ; • ': • '-' '. * • nh3v Дм работы »того комплекса необходимы АХР, обраэупца- /' •

ясяпри дыхании бактероидов^4 и поток электронов. '•"'•'. .' V . ;

. ' ' ' Дыхательная система бактероидов.обладает рядом особен- '

' ностей|: связанных, по всей вероятности, с вязкам рО> внутри^ ?;• v ;:■':■', клубенька. Для'бактероидов характерге отсутствие обычных , • ..' ;• -' термшальннх оксидаз: цитохромов a d о Appleby,I969i' Кре- .

• ■ товпч с.соавт* ,1272/.' Вместе о тем у бактв|дакдов есть не- '• •';. ' .

' \'. сколько аутооксидабелышх ОО-реактивтк пнгкентов, из кото- 1 ■ ■ ■

: ри наибольший интерес представляет'цатохром P-450Rh /App- . ' ' . ■ ' leby,1967,I960/, так как его'содериаяке тесно коррелирует с ;'

4 оэотфиксирутацей активностью /Кретович с соавт;, Х972 j .Матус ¡ v

, с соавт.,1973/. ;. ■ :,

Vj.'iСвойства шпохроыа.Р-^бО^ исследованы недостаточно, и' V-" ; его роль в метаболизме бактероидов остается неизвестной. I ''.h-'"-Г;Джнад работа.посвятена изучению цитохрома P-450Rh бак- v .

тероядов лшина. В задачи!исследований.входили: получение г,7 . ' препарата цвтохх»«а Р-450рл, свободного от ирвкесей других . > . ' цитохромов, изучение'-его спектральных свойств по' сравнению v-:^ Г-; Г со свойствами цитохромов Р-450 других, объектов и изучение / Л;,"' возможности участия цятохрома-Г-450П}1' в днханхи я азотфкк- '. .

сацги бактероидов: ."S-^.-;

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

л"- Опыт проводшш с бактероидами, выделенными аэробно в присутствии полигинилгарролядона из клубеньков полевых рао~ тений желтого лшааа(1'ир1п\1э гигвиа ь.у Семена инокули-ровали эффективным (359а) штаммом ни. Шр1п1. - ■ >, ■ ;. ;

'"Суспензию Сактероддов.в 0,01 К-фосфатноибуфере,,. • ' г рН 7,0,"замораживали до'-40° и .разрушала в. прессе ■тала Игог 'на-/Любимов', Львов, 196В/. После)удаления крупных обломков . суспензию центрифугировали 30 мин -.при 23000^," в осадок дс-У пользовали в качестве "дама тел ьныхтастиц"; Надосадочкую , ■ азщкость центрифугировали 60 мин при 144000к, и полученную растворшу:» фракшв бактероидов использовали для выделения-питохрсма Р-ЗЗО^. *; *..

, Интенсивность; дыхания определяла амперонетриадским методе« в, полярографической ячейке. в эакритым шатиновын влектг родом конструкции Шсльца и Островского /1965/, а манометра-.: чкеквм методом в аппарате Варбурга. Азотфиксирущуе актив- 1 яоеть определяя» по ацетиленовому методу / Нагйу •••/

1968/ ¿.использованием газового хроматографе Хром-Э.-, . ; « Макросомальнув фракцию яечени^крмс получали от А.И.Арча-кова из ЦНЙй Второго Московского медицинского института. ; " Все спектральные, измерения прово ддлина дифференциал!.- ', вон спектрофотометре Н11всЫ-Э5б - по двулучевой а двуволно-вой схемам.' В опытах поанаэробному восстановлению исдалъ-' вовелв спедаально' изготовленные кюветы; о: резиновыми - пробка-Анаэробные условия создавала, продувая раствор в кг®е-* те - в течение ! 10-15 мин окисью углерода, полярографически у -: ' чистой от 02• ч . . '•' ' ■ "■-*'."'''■ .

■ Белок определяли во Л сура в модификации Мосолова и • Скарлат /1265/. -У / '."..У-л

■ .-л

f .'-Л ! ■

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫЙ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ : "

г-. ■ ■ V;

V

" J, ус''

I;

.Выделение и;очистка цатохрома Р-450^ '

ч, ' После центрифугирования суспензии * разрушенных бактероя- л 1 : дов весь' ци.тохром1Р-450Е^1' оказывался в растворимой фракции, ;-.'где его содержаще достигало 0,03 имоля/мг белка. ' 'О';:' Первой мадией очистка цитохрома Р-4Б0Е^ было вдсалива- -Ч нее сульфатом;аммония (рисЛ). Как показали наши опыта, ; цитохром Р-450^ практически полностью осаждался в пределах : 33-50^-насыщения (нн^зОдЛ При »том достигалась 4-кратная; ■

очистка от датохромов о (табл.1). „ 4 ■ г ,

- ■ ■ :<Габлида1 ... ••

■ Очистка датохрома В-450^

"V

V

' Л."

'; Фракция * 1 Концентрация, -v • ниоль/мг белка - Отношение; • ттохгома о- <

цито— цитохром ЦАТОХрОМ: Р-4501Ш .

хрома о H50Rh ,'■"■ ■ - _ ■

Супернатант 144000g ■ ■ 0,140 ■ 0,007 5,20 V

. 33-50^ насыщения 1 -; .Г ; 0,189 0,107 1,77 '.vy.V

После, биогеля Р-30 ■ 0,006 0,229 . .0,37 v.. л

. Посла, ББ-52 • - - следа 0,410 - — - 1 ".■■■' ■

5 Яэхроматографвя на'Ьв-5г 0 0,445 . 0

\ -Г--..

, Полученную'spa высаливания фракцию очищала1от солей , и ' белков с вебольагой молекулярной массой (.в том числен :от~" :цятохровд с550) на колонке, заполненной'бяогелем Р-30 (150200 меи, Bio-Rad). '' . '-у-■■".■./, ; ... ' . , , ■:-..■ ■-.■ /.Для дальнейшей очйстки иоподьзовали иовооСменную хромата- : грофию на ДЭАЭ-целлшоэе Ш~5г (Whatman)Элииию белков ; проводила градиентом 200 мл 0,01 М фосфатного буфера pH 7,0 / 200 «л буфера + 0,5 М NaCl).у--' \ '■/ ;

^Использованный метод"позволил отделать цатохром от цатохрома Cgg^« Первая фракция элтадая с вв-52.'' (рис.2), выходившая яри концентрация Waci до O.II М, содержала цато- " . 'хрон 6553, вторая (0,11-0,29 М Uaci) - датохрш Р^бО^,

V- •' ! ' '. ' ■ V ■ '■:'■ -Ч ■ ' '■ . ■ ' i

■■ - -: -а ..:..■ -..л . ■ /

■ ■ ■ -■' - ■■ ■■

• Л'.'

; ■ 'Л-.-- ' ' . > ■•■■ ..... ^ .>->■ . 1 ц1... ч- ■ . ; .. . ■-. .

-^■■^л^л-;;^-; 7« -.'-■..'■"■Г

-../■Для удаления следов штохрсма вдщ-вторую фракпш^после два-. ЛК'-Т у ;; лиэа против рвх^атогр^ ке"условиях. .' • >. '.. • ; • .

ч. '., В результате проведенной очистки Лма получена фракция, '' • \ :'обогащенная ивтохромом Р^ЗД^о 16,5 раза а ив еодвряадая ."'••- ' ;'' М других цвтохронов. • ОО-диффере»' -■■■■-.- ■.- - -- :л-

......" Ч

-' приведен па 'рис.3.' -''й:-?.--'*'^'^ ■ ■/•^■'Ч.' Л'*.^;'

' |л п - о.о5 ; > •

... . ЗЙ . , 50 • Т' 4Й0 -......4&0 . > ч,5°0

,' . - Вю.2. -К^явая'вдюпин гемопро-^ Рис.3.' Дифференяиалымй • • ; , У- ,' теидов'о №-52 : -"V у\ *.. спектр Д, 9 ыяМ. цито- > Л-*<■

V*:-' А' '■ 1 ■ V' - ■ ЧХромаР-450^ (восс- К"-;"^ ;-1-,;

^^ '; . '/ .и: ■ ••:•••'''тановленвна 4 СО м«- г >' ' -■'■.'' уД/! , . : . нуо восстановленный) > • '

Полученная вам фракция оказалась довольно-устойчивой к . • • .• . л -л различают воздействиям." Если при' эаморамвании целнх'Сажте-':. ч; -;/ % роидов «ли растворимой фракам цитохром Р-^бО,^ почта пол- , г'.- * _ костью разрушался, то при •заморахиванш очищенного цитохро- • .. -ма Р-^бО^ и хранении при '-20° 'в течение двух касяпев рае-; .; •... . • • 'рушалось ве более 105? катохрома Рт-ДБО^. • .;. . V ';-

. Л ' !

•

: I 'Л 1 V

'Vi' v

/ "

• V v После диализа & концентрирования прм'пшощи полаэтилен-,1 • , •;. "гликоля эта фракция использовалась для.изучения свойств;,../ -. - цитохрома Р-^бО^, .■': /.',.

'=■■.. .;,''-."■'2.. Спектральные свойства цитох рома - Р-4 50д h.' ''. i; .;

- 1 Цитохром P-450^h бнл идентифицирован ¿о СО-спектиг, nö ;': спектру щелочного шридшц-емохрома, во древращеншов цито-'. хром Р-420, по спектральным изменениям при связывании гид- ; ■ ,рофоАных соединений и до спектралышм свойствам этилазо-'■'v'7 /Цианидаого комплекса. ■■■'4 '.■'.""..'. VS '■■";' '/ \г:'-

' ^ ; IIa рас.4 праведен дифференциальный спектр щелочного•, ■'.г- . пиридингеиохрома цитохрома Р-450^. Максимум поглощения ! .. / ври 555 нм характерен для протогеыа,'как и ожидалось по ■']■■{

. ' • аналогии о другими .• л- ^ аффициент миллямолярной окстишащилЕ^ бш! рпвеи 65,3 дая •,

«I-полосы (555 нм) в 19,6 'для ß-полосы (522 нм), а ах от-V ' .VI ношение - 3,33. • Последняя величина йлизка к таковой для , .

'' протогема /Раис,1Э64 /( что доказивает целостность^гема'; v ';- >" : полученного вами цвтоэсроыа P^iß^,. 1 ' ' '

I -г...

■.---. Лг-1!

i

^ > ?

Bio.4. Дк^ференциальный' -A1, спектр" щелочного парпдиягемохрома -,'т..Г >1,1 мкМ'цитохрома ;.' ■ Р-450hh (ьоостаяов- .

'лекныА минус оквс-. . ленный! -.'■. ■'

БОО -

650;

НМ;

. Восстановленный цитохром Р-ЧбОщ,- в присутствии СО мед- • •.

. • ленно:превращался.в цитохром Р-420 {рис.5), подобно другим ' . цитохромаы. P-4G0. Мерсалил, связывающий сульфгадрилыше '"..•• группы, ускорял это превращение в б раз,, что доказывает .V''-^ ;,■'■;■* важное, значение сульфгидрильных групп" в сохраненииотдгктут > - ри цитохрома P-450„h. ^ • • •' • .'"V "

■ ~ Btc.5. IIpeBfaiaeHae'I,5 мкМ восстановленного цитохрома ■.;■

1 ■ . в цитохром Р-420: ; - '„-V ^;'/ ■ "

." ■V I) 3 мвн после пропускания СО ■ ■ - /.-■ • :'i-.-

.v^X^: а) 30 \ - г -.*: ■

..:■ з) бо , • • ; ■■■'■

' i. Абсолютные спекг{ы цитохрома Р-450^, представленные на ' \'.\У-'.'.'■'.' • рве.6, оказались близкими к спектрам цитохрома Р—45Qih вэ " • бактероидов СОИ /Appleby, 1967,1960/, но отличалась отсут- ^ ;

; " ■ : ' " ствием максимума поглощения около 650 нм< Это различие' пока ' _, , ; " Ч не может быть объяснено, поскольку неизвестна причина^иогло-. . \. шеиия в этой области на спектрах штохромов P-450« Г , _ . , \ Спектри восстановленного и окисленного цитохрома Р-^бО^ , - ¿г ■ бактероидов лмшна мало отличались друг от друга, как и у \ штохромов Р-450-других объектов. Полслениа максимумов по-; =

глощенм (552 я 410 им) на спектре восстановленного цвто- л'; ; . . хрома P-450JUJ было (йсаэко к описанному для цитсхромов Р-450 ■ . ' макросом печена /lro«i, Seto,i97</ в митохондрий коры надпо-чечняков /Schleyer et л1.,197Э /, тогда как у: цитохрома

• •. ч".'. • максимумы были значительно сдвинута в коротко- . • .

: 1 ; волновую область-'/ эдтоп •

:г/^ ; V-у / -г--.:---. у.

у,-""-У":.1. ■ .,'■ ^ .-,'"".-"у. :...ууу. | у-'■ у -1- У- - )'", '■ /' \ --¡-^^/г.';?'^ . '•' V•':*.'

-.""■- ".--.г :.:-«\ ■' V у.,\. г.. ■лу,'^:.- ...< > <*- .--"у- :■:,/-■;:.

-г-

2 " 'у

V: > •: ч ■ Ч-7-: я;;.V.;- ГЧ V:> я'»,у.Ч - 7

•. ..--¿у- ■ :-'у- 'V

-..--.'.'■ : . -:.,-." -■■■:.- V. „. - ■ ., ■,■■.-.'■ • • • •. ' ■•'ч;--;-- \ <. ! - ч ■

■-у - 450';/ :500 ; 550./;: , :. .

>Лт¿эвестяо,-характернейшим>С5вЬ55ством 'цитохрома^V'.

Ыжк^сом пе^еш является; его споообность образовывать - СЕй1С--1-. - У траяьно регистрируешв .комплексы с огромным множеством гид-* ; -. ''.'. рофобпых соединений ^«иавг «<а1.,196б,,ЗсЬвпкп1ап • ••.".

,V$967/.;Цвтохроми.р-450 друга*;ёбгектов'специфичны.по отно-~. • *./ ,'с - ^ шьевя и ■ связываешм: вещеотвам.', ^ак; : штохром; Р-450 митохов- -V-, V*1 ДРИЙ кори надпочечников иэ всех соединений; вызнваюади; . . ^ ''КЛ -'Г.- ';'.' V. ^ впектрмьные;' изменения г цитохрома; р-450щ',' : связива-'.' ,;'.'' .

; л' , ет в гидроксалярует- только стероида;/ сашавг,Ез ыъгоок,',-= ; ,.' ., ;; ;'

% /';/у',.у Д967/,^ а ДИТОХрОМ'Р-450-' только камфору;' /0«пва1ивХ..-

•■-Ь'А"

1 ,■"••

.;'С■> ^

„• / • г,

т '"Л/» - • ^ .

--1 -Л" ^ 7 ' * '

; i \ / AV. ,

V;;'» v-^ У. - : ■ ' V'/.;; ■/ - Л ■ J .; ■ < ■Табдяпа ' Ы". i: L- ' у У ' ^ I,'-'/

' ■ : \ . ' ,. ' . .• . • ' Съязаваие гздрофобных веществ щтмргаааки Р-450- ••,'<' ••'" ' :- V ; . - . бактероидов лшаяа ж шсрссом печвна'яраш

-. д Вещество

Дифферетддальвай спектр автохрома Р-450( связанный мааус свободный),

спектра

максимум поглф-щеная.-вы -' штщи яохтао-; щеная, им ' *• Viâl i.

.бнктеро-' от • никро-; сода багтеро-аи ' шхро-;"сша бяктеро-вда У:. ыагро-ссш багтеро-ада СОЙ'- ■

Ддматялаяидия ¿.I- ' - 328 . Гекссбарбатад > I 334

Г(+}-адкфора I. - "385 : Í'332

АнйЛЗЕ : ; • :. II V ' . 427

Эотшзощанад • ■ ".y¿: 425

Мета^аяоа- • II -Н/^429,"

•335 ' . 422 • ;заэ430\. •390 - • 425 \ 388 • 428 430 402/. ■ 434- /404 : 425: '- : 400 V

' 425 - . 5,68' ; 0,443 -.19,5 , ' 12,1 ' • '423 . :1,Н '- 0,039', 53,7 XV: 11,4 «О :' 420 1,61?:' О,Otó 'X 25,6. -. 17,60\

420/' 0,31 ; 0,001'V -38,6 -'.'26,7. ~.

!' 3S5-- 18,00 "1,000 : 55,I.W .21,9 •. ' ' .395 " 4',00 1SI.I/.; ','—*/

395 ' 3,70 0,079 196,6 ':■ # 40,8" •••

¡-■i . ' M • А

I if . <"L~ f г

. ''-I

v-'Примечание. В гшеш помещала 6,62, адсдя датохрош Р-45^ ; ила 5,43 вмоля дмЬтДп1': ■ хрош РЧЗОтм s 3 мл ОД U фосфатного, öy$epa,iß 7,0. В случае кшмеясоз, вмепда дае К^праводятся мтяк^^счзшш^.^^ -да датсхрсад íMSOg^a 10~5-10~-;.Мдая щтохрсма Р-450щ*.

% s ■

■ . Ввиду-того, что способность связывать вещества опреде- ; леввов природа может служить косвенный указанием на функ- . циа'адтохрома Р-^К^, нам представлялось интересным проверить, будет ли.цитохром Р-45С^ вступать в спектрально регистрируемые комплексно' ра эличиыми веще с твами связы- -веемыми иатохромаыи 14150 других объектов, ' * . \. ., 'Как видно из' таблЛХ; но способности связывать раздач— ные вещества дитохром Р-45(^- близок к цитохрому Р-460^1 , Спектральные'изменения вызывались, различными веществами: :. . субстратами (диметвладалин, гексобарбмтал, анилин) и ингибиторами I ЗКР-525А, метиранов) микросомального гидро~'-' коалировакяя, в(+)-каифор9й в э тилиз о цианидом. Приме ры,-ьпектральных изменений 1,и II типа у окисленного цатохро-.!? ма Р-^бС^ дани на рис.7 й 8 соответственно. Г ■г"

Чтобы сравнять спектральные свойства.датохромов--; ' ; Р-46^ и Р-450^ , мн изучали,такяе связывание цитохроыа;'/ Р-450^ со всеми перечисленными-выше.веществами, Получен-;-дае результаты (табл.IX) бляэки к данншлдругих исследо- с вателей / ЗсЬепкт&ц ^ а1;,1967, Оггвп1ив а!.,1970/. ;

В таблЛГ ггриведены 'спектральные константы диссоциации К 'в (кондентращш .'субстратов,^ при которых спектральные' из-, менешш достигает половины максимально возможных) и вели- ' чины л А (наибольшие суммы высот максимумов и минимумов-на спектрах I »ЗД цитохромов Р-450), рассчитанные, по' , способу Лайнуьвера-Еерка. , .■/... ■'

Как видно иэ таблЛ!,, значения Кв комплексов датохрома Рт450н11 со всеми изученными изученными су бс тратами были . 7 ; выше, чем Кд соответствующих комплексов цитохрскма Р-450щ, Это означа)вт,;Что датЬхрс»| Р-450[Й1 имеет меньшее сродство -к,данным субстратам. Привтом спектральные изменения в.';; случае щтохромд .Р^бОд}, ; были выражены', сильнее,; что 'видно из величин максимальных амшштуд спе-ктралькыхизменеиий :

■../ Изученные вами, вещества вызывали'Спектральные изменения - не только у окисленного,' но и у восстановленного цитохрома Р-450йЬ.: Характер изменений спектра восстановленного,цито-

• ^ • • • .4 ^ -

13

; Ы-0.01

550 В»"'-

Рис.7. Дифференциальный спектр (1,1 мкМ штохроы Р-450 № ; +10 мМ дЬметиланилвн минус цитохром Р-45^ )1 -

г л.' I) окисленный, 2) восстановленный

400

450 СОО • 550,' нм

Рис.8.

Дифференциальный спектр (2,3 мкМ цитохрсм Р-45^ + 0,33 мМ метирапов минус питохром Р-45^ ): .1) окисленный, 2) воостановленный

/ Д -'Я .-' л' хрома P-450jjh не зависел - от природа вызывавшего шс cyOcTjpa- -• .•;•' -• ta," âa исключением метирапова., На да|ференциалькнх спектра*'.: >V

■ . :вал с восстаноалешшм цитохроыом P-45C^h' комплекс со мно- v ; '.■ у ; •• - жеством полос поглощения (рис.0). Такие хе_спектральные из-^ ':У' 1

г' 1ляи&ия er ttugimü в tin mit г*дттлп а Т7 вп^^тйппиирптгпгп I [

нашим расчетам, ^ » 50),;0и имеет, .вероятно, общее ;'•:•."..-•/... происхождение с полосой поглощения при-450 им на СО-диф$е-; ренгвальном спектре да'тохрома'Р-^бС^ ,'.у которой aê^ = 87: ;'. . /• С '.í:-Г, ;:, по данным /Appleby, 1%э/. Считается, .что необычное'положе—'. у •'".. '.• : иве полосы Соре в ©тих случаях обусловлено присоединением ; '. : ? некоторых лигандов к восстановленному гему патохрема Р-450 ',

. . ;д ^иеинсшчгма, ■ при ; чзд- и нм л*РР1»ву,1ЭЬЭ/ ."■ -'.; >-■' г,-г i.

/ •'.<-. •; На рис. 9 приведен дифференциальный спектр комплекса од-' \ '*•. vi'i »охрома Рт4^^ > бактероидов люпина о атвлизоцванядои. Ио^ у-РУ-■ • * гдобно соответст^упцим комплексам нитохромов Р-450^ и^;';.*^-/'^-/-. ''■> • У'/- P-460ji¿ бактероидов сои,'.ou имел два максимума в области , - ."•- : ..<'••' ..." ."••< полосы Copeî характерный "для гемопротеидов максимум 427 нм' > * ' : -' . . ' ? необычный максимум 456 нм. При повышении pi! поглощение .' ; ; .'•••

• л 1

0,01

Гио.9. Еиффереишадышй > j ' ;• . спсктр 2,2 мкМ Б0ССТ8-v-Vаовяенного цитохрома ; ; 1 Р-45С^), (связанный о

. ; ■ 6,24 мкМ втилнзоидани-. J'"'■ дом минус свободный): " I) рЦ 7,0

' 2) рй 8,0 . • 3) рП 8,4 '

400 . 450 • vJ:HM'-v"У.

.при 456 нм увеличивалось, а яре 427 гад уменьшалось. ' . './ Вполне очевидно,"что растворимый датохром,P-iSO^ до характеру етилизоцианидногб,комплекса,,как-и по способио-: сти связывать гидрофобные вещества, близок к связанному.о' мембранами штохроиу,Р-450щ(,но не к растворимому бакте-, .'реальному; датохрому■■Рг450еав.' Это доказывает, что ваблю- -■ давшееся.ранее различие в спектрах вталиэоцианвдного^,комплекса" цитохромов Р-450ш и Р-450саи связано ив с растворимостью последнего; а обусловлеао, по'всёй вероятности; ■ разным способом присоединения гама к аяоферыенту.' ■

Способность цитохрома P-45Cfejj спязывать тдрофобные соединения и сходство спектральных,свойств этядязодианидянх комплексов цитохромов Р-450я^и.Р-450^ позвшшлн сделать, предположение, что'цитохроы Р-450^.занимает такое же место в электрон-транспорт11ой системе бактероидов, какое за-' ,'нймает датохром Р-450^ в'транспорте алектронов в микросо-

'* •• •• А -

• . мах. Чтобы проверить это предцолокение, ш предприняли по-г , ' •„. • пытки найти место цитохрома Р-450^ в системе переноса ■■ влектронов в бактероидах и выяснить,"принимает ла.ок учас^

; ' - тие в поглощении 0»>, в реакциях восстановления азосоедиве- ' >;.-." ', <■'.■■' '■> т& л гидроксилйрования различных субстратовподобно цато—* . л 'V з г.хроыу• Р-450ш. " л''Л \/ЧуЛ

.7 Э. 1 Во^тано^ёние ^тохрома^Р^БОд^' ■ .:7-.;. ■■■.

^ , •' • Согласно литературным дангей«, цатохром Р-450аь" медленно ' '' восстанавливался ; в растворимой.фракции-бактероидов сои за' ЧУЛЧ : *; счет эндогенных субстратов, и не восстанавливался в суслен— , 1

.' эии частиц /Арр1еЬу,19б9/. Чтобы наити природный восстало--Ч .. .{'.■' "У'')у7 витель, необходимо было подоброть условия, в которых вое-.\ Ч';- 4,7

до минимума

.■■;■ '.; Для этого к раствору,датохрома Р-АЕО^ добавляли раэбав-'УI,,леннзп» растворимую фракцию бактероидов люпина, содержащую 7

1 V-всего 4 мг белка.'Содержание цитохрома Р-450Щ, в'кювете (, V составляя^ 2 нмоля. Анааробные условия создавай путем про;; ^ . цускания через кювету СО.■'47 )[_ V■'■:7;.".Ч;-Ч

'. ;становление за счет эндогенных,субстратов было бы.сведено 77\*7Л-У-' до минимума. Ч^'У ЧУ 7' •'"- '.у - *-7'У

ЧЧ<УУ

■' --Ч У'Ч'-■■'.."■ v'. - ■ Таблица III V"' Восстановление цитохрома P-450Rh в при-; оутствии растворимой фракции бактероидов

■ >г j-'■ г ' ■

Субстрат V Скорость восстановления,: -нмоль/час

V. Без добавок ; 0,08 -.-v ...-,

Сукцинат ■ '' ' "л 0,09 -• ' . V-

. ИАВН ' ■..';: , .. v 1,42 :■.

. KADPH ■■■ ¡ - ■ '-,■■■■■■;-.'" 1,13:' -jV:

: яагрн + 10 мг/мл ротенона х- 1.04 -У

t í

■уу-'У-

' \г. '.' г ( Данные табл.Щ показывают; что в условиях наших опытов. ч - С-;■ , скорость восстановления цитохрома Р-400нь эндогенными суб- -7 Ч-Ч" : . стратами была незначительной; Сукцинат, как оказалось; не ; ; 7. 7 ' V ч . мог служить субстратом для восстановления, • поскольку сукцш- Лш

Л •

■17

i

'•'У,-.-/. ^ .натде гидрогеназная'активность бактероидов бана связана о-" >'; мембранными структурами. Последнее било установлено в опы- -. ■;' '.; '., тах с .дыхательными частицами, которле поглощали,02 в'при- : '' -

:сутствия сукцината (растворимая" фракция бактероидов не по- ■ ;V--'." < ; . глотала 02) и у котори добавление сукцината вызывало. быст-. ' ; - ;■ ■ ; рое, за 1-2 мин, восстановление пвтохромов Ъяо. ••

í У'.-'■-..Основываясь ná приведенных в табч.НГ результатах, мы - .■'''"' ~'' полагаем, что каърн (пли каш ) может быть естественным .'*".' ^

.. восстановителем цатохрома F-450nh в бактероидах. Из табм-. * ш видно, что восстановление датохрома Р-450 Rb осуществля-' , ( . лось с одинаковой скоростью за счет nadpk и наш. Естест- . _'•....'.->' \ " венным объяснением »того.факта является.трансгидрог^аазвая-' -V -1'; 1 г; аямдаюсть, найденная нами совместно с А.А.Мутускиным а ; ■'

К.В.Шпеновой в растворимой фракций бактероидов лшика. ■■ , .-л

',. V V ; Сходство'спектральных свойств пвтохромов Р-^бС^ и Ч ••'.•• Р~450ш побудило нас проверить возможность восстановления , ■ 'г ; \

.. цитохрома P-450Rh в присутствии макросом печеви. Длт «того 1 /' ','.. . 'к фракции макросом печени.добавляли цитохром £-450^ и, до-, • еле4насыщения 00 - had(p)H в качестве восстановителя. :.,' '■' ; ;"'■ : а ■■ jtaK видно из рис.10, восстановление'вдтохрша Р-450ш в . ч„ ■ "

■ ; *.'■'■■' ■ ■ анаэробных условиях за счет badfh происходило в основном за; у \ ySV. 'i'- мпн, а за счет.кавн - несколько медленнее, очевидно, при! \ ', -Ч..'

■ . ' участии МАЮ -зависимой ЦПЭ, вклгчалцей автохром & /Артаков :>;-

: с соавт.,1274/^ Кинетика восстановления соответствовала ли- ^ ■ 1 • ;■ '-к'.:'■■■ тературпым данным /вгаиевг et' el. ,1969, lchitc*m, Loehr,. ■ " / . 1972/, .. " О''''''-/'''' ■' '■-""■■ ■■ /Ч

' .", На рис. 10 показано, что в присутствии макросом печени . ■ , " -

щтохром P-45CL. также-восстанавливался:.воелв 3-4 мин,'ко-. >-vV ^ ■■'■>■,';.-."•.'гда цитохром F-450UÍ переставал восстанавливаться, поглоце- .;';_

• f ; mse при"450 нм продолжало возрастать в варианте, с добавлен- :

, V' : ним к микросомам цатохромом Р-450^. Однако, цитохром' - - , .'.■■■. ,P-^-SCL/' восвтакаьлявался во много рва медленнее' цктохрома ■-'

. • . 'Нозмохность'восстановления цато1рома Р-45^, кикросо- ,■* '' у-/,'• - мальвой системой транспорту электронов еще раз подтвервда- ' ; ; ' ' •.''"-гет:наличие определенного структурного сходства цитохрамов ! ' -

х • ' yP-^soRh и р-45(^м« . ' t V":v- ■

v... v4':-7>V-; :.- 0,025t

. jXT. • *■ 'vi1-'■■-í-' í.'iv ■ .-.■ ..• - : ^ •. - • • ч д - - - ■__^__JiBlr'.'v V

/.■■ —' • ---- . ~ 'vAЛл:

/ IJ/'I'V'Ci": .i: ....-.-.-к -> №.. îj..-. >( --¡..' Г í .■■,■......

/ / • • • •• • ~ .■ ■■V---1: <■■■■. ¿ \ 1 -л ''* Г,'." - V'-'-r ■-,-■

. ' -. 'l: ' ■ - ■ .7 У V- - '. . - ■ ■ . -- - r ' - - A1 ' "■

- - ■ -, - '' ■ \ ."...■ ¡ :'.■■■;. Jv ; .y. ' .'■" . '-.<■" ■-■:'.'-;,-■';■■"■

.•• í> 4 V . ;•: -.'Í . - •/- -V,' ■ * • .f.-

; ! v.'../v: v-'"--V^."

■ ^ v.- I ; <• • 3 : 5 ;; 6 ман

'/. РиоЛО.^ BoccTaHoiaHeHue-iwTexpwiioB- • ' . , •. :

'v';'.. я вечени; • > :^ .• • •'

' • • : \ " ■ : • I)-; uaToxí«*í.P-450j¿",'восстановитель - Лжин," , ; :.. ,'v. '• ; 2)^ ' штохром Р-450Ц5 ; восстановитель - н,4®™. ' . :. ".

.У 'У-'- ■ • ; • /3)* питохром Р-450ц|> хщтохрсм P-45q¿' ^ ;'.

- Hâ»H,\ v. 'г: Г';-' : ; ■■.

- •*. , '•' ' ' Y - /'' / • . '4)' 'цитохром.Р-450^ цитохром Р-ЧбО^, v - ' ; '-УУ; ' * /.//.'^^восстановитель -'»APPïb'' ''ï л . v' '¡ / I,

V ■'.■'; ^ : "X-s;.??.)?'-;

'-^v • Как иавестно из литературных данных, ответствешше за'. •

i - Я : / эосстановаеыдв цитохромов Р-450 ' во всех изученных органиэ- ' : ,

построены оо одному плану м состоят из sai)(p)h, :- .' v. ' V\ iÙD( р )н !4врредаксЦ-оксидоредуктазы-и^нег«мои0го"^

; •.* ' теида. líomiio было предполагать, что и си стека переиоса эле- ' ; ' ' . ;; ; ••..' мронов вбактероидах ые составляет.исключения." • " ■ -, '•: ' \ . ;'. Чтобц'проверить вто предположегше,.ми провела модельнив • . ;

' ч.* опыта по восстановлении' вдтохрсма¿Р-450Н11;цепью,!составлен-'-V.V. ;,1 , Hott аэ 1исги:$ерредоксин-окоидоре,пуктаэн и феррёдоксина; иа , ' '

-y.. V

У У -У'уУ;У- '• ■■';.. ' •• Таблицаiv ^.УУУУ:.'^'-^"П.-- -У

Í Л'.."\\ :: - í V4V-" >• \,. ' '- ч:. \ ' , ; У

У- уУУУУУЙ'; Восстановление автохрома. Р^450 снстемо®, '•' у 4:- --У'Н'1 '/У !1 УУ ; ' ; ; состоящей os nadíh Í jjadhí гферредоксвв- ¡ y У^'^ЧУ^/У^Ч^' • . У :'.• . оксидоредуктазы и ферредоксвна гороха ' У•*•'Ч' ;

— г. Скорость восстановления- У .' ' . ~ ■ : UBTÓxpoító Р-^бО^'.'нмоль/чав-' У-: .

Рвдуктаэа,. ферредоксвн,

•. V.MT-.: v-.\ • ныоль \У

о.оз у: У 0,51 .; •í "0,51' Г.

. *; 0,06 УС - ' '0,51 ••

-•. 0.23-; • о.«' у:

— ;; у, 0,23 -V у у 0,23 !■'■■"", . .; .:• • 0,23 , ; У . 3,0В " •

' 6,13 у у

;>; < В аназробиых условиях указанная цепь медаекно : восставав- ; УуУ у*- ■■' ■■.уУ/Г; лив&да" штохром д ( та йд. iv )Ее э ' какого-либо нз иере-У': s 'У ;'У ^

у "УУуУ,- численных компонентов восстановление не ; наблвдадооь.' Форре- . • .'у : ¿'У : . ' ;У ' доксии гороха можно бияо с успехом заменить негеыовш У/.* • ; У:

леэопротеидом из азотобактера,' полеченным от Львову Н.Ш' '..•; ' У;У У-

На основания иыещяхоя данных невозмодаоодаоавачво £>»-

' 'У У/- .вовительаым - свойствам. ' Можно предположи гь У что : цатохрои ; ^ У '

у " Vp-iso^B штактных клетках связан о мембранами,,во не оче»; ,у:' ; : > • ^ ; • прочио.и при -раарушениа переходит в раствор, ! ьследстетв чего ' У .

• нарушается его 'способясють 'бнстро восстанавливаться. Это У ' • • У" : уУ>''УУ -подтввр«даетоя;:ошташ ЭпплбиУв'которых оосяе'раэюгвеши : г ' . ~ У.'.- V - бактероидов сои без предварительного замораживания чает» Г ... Г. -

•:' ' .y *RftDPK;ферредоксин-оксйдорадуктазы и ферредок^ииа*свидетель-* У

■V-,; , . ... - -ч .-. _ . .....,

•'. ".'У; - i

с«;иг в пользу-высказанного выше предположения о том, что цитохром Р-45й,ь является компонентом ЩЭ, -аналогичной гид-роксялярущии ИЦЭ других объектов. Однако.;такое же строение;/, / имеет, возможно, цепь транспорта электронов на ыитрогенаэу;:' /копе «г ,1971 /. в таком случае цитохром Р^БО^ц, "должен . бить теснейшим образом связан о процессом азотфиксации, по^ ■ лучая електроны.из одного источника с нитрогеназой^ Это об- • стоятельство вместе с известным фактом корреляции азотфлк-,; сиругщей активности^с содержанием цатохрома' Р-ДЕЮ^ в, бак- 4 тероидах /Кретовяч с соавт.,1972/ привело вас в необходи- -мооти исследования' возможного участия пвтохрома Р-^К^в :/.; поглощении 02 и в оэотфзксадаи., 1 ■'- " ^ „ : '

4. Изучение дыхательной .системы бактероидов., %а) йнгибитошый анализ дыхания бактероидов. "'■■ - -

■ Ингпбиторный анализ даханля бактероидов лхшна проводили -в течение,трех:вегетационных сезонов..Полученные.результаты .-. совпадают, поэтому .мы приводим данные опытов 1973' года.' V ' Дыхание бактвроидов сильно ингибировалось цианидом,в >7' у • низких концентрациях. Как видно.из рис.ИД, в присутствии 10 мкМ ксн поглощение О^ уменьшалось;бодее чем наполовину. Ч .Дыхание бактероидов за'счет эндогенных субстратов я в присутствии сукцината одинаково подавлялось цианидом. Такаяже/ ; картина наблюдалась-и в',случае ингибированая дыхания■ ¿акте-"-роидов азидом (рис.НЕ). Использование в качестве. субстратов малата, аскорбата,- о? -петбглютарата ¿ МАШ не меняло \\ характера ингибированил* Очевидно, -пути окисления различных У1-. субстратов объединяются в единый поток,,снабжающий электро--»-, вами цитохромцую систему, еще на уровне пиридиновых кофер-ментов и флавопротеидов.1 ■' - ■ - ■ • - '

, ,. Действие ингибиторов на дыхание.бактероидов;изучали,на*/ резных этапах развития растений.' Оказалось/что степень подавления дыхания всеми изученными ингибиторами мало измекя-лась в процессе развития клубеньков.'Со всей вероятности ререстройка дыхательной системы происходит на^очень ранних*'

21

■. -■.;'"■■". ':,"■ V; -

' ■ стачшк формирования бактероидов, одновременно о синтезом: •л - '■■■■';". всех компонентов азотфиксируюцей системы. Это предположение опирается на полученные Цату сом У1973/, данныечто даже у/'. ' ^ '.-"■ 1-недедышх бактероидов полностью отсутствует цитохрсмокся- V

'■.'■..■':■ V . да за... ■.;■; ";:■■'■' ■ \ ' -л' ■'.'■■.■ '*■, V ■

• • тН- тг>о-1 • • . •..

.^•80

60 иЫ

Рис\П.-1 Влияние цааняда-(А) и азида (Б) на1 дыхание'' !■'■■":г' ■■[■ ' бактероидов г I). за счет эндогенных субстратов

■-..'.'- 2) в присутствии сукцината. . V. ■■".';■'■'-

Как видно из рис.II,- ни цианид,; ниазид полностью дыхание -V. бактероидов не подавляли.в присутствии I мМ ксн сохранялось, около 10^. поглощения 02, - ~ г■": ■; ; , '. йщ■ определении природы дыхаиая бактероидов, нечувства-; тельного к'цйаниду, оказалось, что .в присутствия; I 1Й1 саля- -цилгидроксамсвой. - кислота, ингибитора: цианид-резистентного .; дыхания растительных митохондрий и некоторых, микроорганизмов /. ЗсЬопЬвцл ^ »1. .1971, 1евЪо*11а,31вумп,1971/ь Нв вабШ-далосьингибирование дыхания целых'или раэрувенних бактероидов , а также 'того поглощения 02, которое не подавдавос* . I мм'.ксн.4 ' ;.; ;■;■■ ". ^ ■■■.■;./:.■. "".V, . ■

1 ,;

."■. V

■ с

'л •

• ':.• V' и . с-

I У"-.!

У :: :"V-' 'V Тайлада?

: I- - Пврокеидазвая ятвность' бактероидов лшша в.;. штогрошероксадаэная активность их растворимой фравдеи ^

Вариант ' '■>': Пероксздвзная активность бактероидав' ■ (мг пураурогаллина/ иг белка / 5 ша ) ■.-. Окдсленае: прюхрвдов с. в- присутствии ■ растворимой фравдш (шалей - окислен— ;,: ного штохрома с /ющ/мг белка)

Г.-.", *'.>,'■■ '■'.<'■ : "цятоарсм с " '' сердца бша - '.-'чдатохрсм с550. бакт8роадав'.лапина -

Полная' смесь ' •' . ' ' 65,1 • 59Д- ;

ЁвЗ Й^О^ п > , ■ -.0,123, - ...-3,0: 5,9 . -

Прогретый белюх ■ ■■>-; .0,003 - ■"-; ' ' . АЗ ; , : ■ .-V

Без белка ■ . 0,001 :'.'.'■■ ■ 3,9 ' ,

Полная'смесь с 0,5 ыМ,КС5 0,096 . г->,.к- ;'<:,. . .;4,3 V --

В '

У4 . Можно tituo предположить'./что■ нечувствительное.'в цианидух У:-'- УуУ дыхание бактероидов осуществляется за счет аутооксйдабель-Ч-; ' , ч. • ... • них флавопротеидов/ котодах иного в бактероидах по х|»виеЧУ У У УУ'У Ч/УУ'аию с клетками культурна кото^'е - играют; ■по . аденш .:: гралайских. ученых, важную -роль в аэотфйнсации /runkhuret «t

jWyyyy .- ■■ 'ч.У;уу.уЧ;.;: Ууу^уУу.у^

- В ходе флавилового дыхания, как известно,' вырабатывается у' vy4-vV'

.:ЧуУ Н/^. .Избыток ее щшадвт к угнатепвю ныюыит, ¿-чем свя- : '¡-Ч •• ; у ваны,. возиожно,4высокие кеталазная илероксидазная активно-. . .

.'-' . сти клубеньков и бактероидовхЛг»псво', А1мапаег,';1972/У;УЧУд- •;.' V •'..' 'V• Согласно полученным наш данным, бактероиды люпина такие . . . -:

УуУ" обладали чпёроксидазной активностью ^ ( табл.т), определявшейся У .4. ' : ;'•' ЧуЧпо окислению пирогаллола до пурпурогаллшш; в присутствии '.УУ-.-' У.;

• . I^Og'/sunm«r^ Qj«eeine, ¿ЭОЛ Скорость окисления иирогал-/-': - • У УЧ У-лола без H2Ü2 б"ла приблизительно в менхле, чем • . ' • . и- . Ч

:У" пероксидазное окисление. Наличие пероксИдазной активности Ч/7ууу.у_Ч У У ■ У косвенно; свидетельствует в .'пользу предполагаемого участия у V. 'У \ УЧ~"'У аутооксидабельных флавопротеидов в дыхании бактероидов, у-.: УУ , ^

обнаружили также пероксидазное' окисление восстанов- ¡iУ-У''■'■/■ У '"ленных цзтохромов р в присутствии растворимой фикции бактв- :>Л-У / ' /роадов (тдйл.тг). Цитохромоксндазная активность, определяв- .-' .. .'

;:у- паяся по окислению цитохромов с без HgOg» во иного"раз..'.'. '•'.г Г '-' • • 'ниже• цитох'рошероксадазной активности. - 0,5(Ш KCN:nojmo-• '. .. . ■■ . . у . •. стью подавлял пероксидазное окисление'датохромов с. П{» У. Ч У ,/' '

фракционировании растворимых-Щелков; цитохромпероксидавная - У^Ч/Уу-'"У'

.. хроыов е е присутствии. растворимой фракции' протекало 'о оди-/ наковой; скоро.стью, как' а в случае цитохромпероксидазы * пе- .-у

> фам: обнаружения штохрошерокоддазноЭ активности ь бак-4 - ' " тероидах подставляет,-на нам взглад,. большой иятерер; Как' У уу.., известно,/.цитохромпероксидаза и'цитохром;Р-4Б0 появляются ';

■I'.'-- v-y-v-

у гзкарских дрожжей, в.полуанаэробных условиях ДаИ1<1а1в »1; ,1969/. Можно'предполагать, ;что,и у бактероидов, находящихся внутри клубеньков в условиях очень" низкого р02, при-^ сутстБие штохромяероксидазн и яитохроиа Р-^ЕО^ связано . 'именно с особетюстями/хлслородяого реквма. / ; \

Окись углерода является специфическим ингибитором' тер- : мяналышх оксидаз. В наших опытах изучалось действие СО на: I). дахание бактероидов, выделенных из аффективных клубеньков на разных втапах: развития растений^; 2) дахание бактероидов из неэффективных клубеньков и 3) дахание аэробно ; выращенной культур« дн, 1ир1п1, любезно предоставленной г. В.И.ЕЬмановым» Литературные данные по СО-ингабаровакию да- : хаяия бактероидов весьма противоречивы. ч . : .

Возраст растений, недели , -

.1Н0.12. Влияние СО-на дахание эффективных бактероидов, выделенных на разных атаках развития растений; газовая среда состояла из: I) 95% аргона г 02, 2) 95^ СО и Ъ% 02 (в темноте), 3) Э5& СО и 5% 0г (на свету). ..." V

■ ; г,

Согласно данным, представленным на рай. 12, дыхание бак-; . • тероидов иэ молодых вффективных клубеньков (б-б-нвдельных'*"" >. ' расгеннй) при рСО * 0,95 и р02 « 0,05 атм не ингиби'рова- '• 4 лось. Оно становилось чувствительным'» СО ъ период бутона- ; задай, когда скорость азотфаксацви резко возрастала».До-Ч: ; ■ давление дыхания бактероидов СО яри'.освещении частично .'■; " ' снималось во время активной - азотфиксадаи а полностью сни-

. малось на поздних этапах развития.' Под действие» СО инги-,-; ■ '' биройлось не более ./4 поглощения 02-бактероидами. .

ЧЧ4' Ч:,4- '■■■'.'■-: -' Ч'-Ч' '-ТаблицаVI ''■■': V Ч Ч ./' 1.4.-.;'■ ■ Ч'Ч-- ЧЧ" ■..■'■■" Влияние 00 на дакание .'Ч' ■ '■/■;''.-Ч

Поглощение 02, шш/час/мг белка .. . % . ■ ИНГИ- ' бВрО— '■■>' вания

аргон-02 ": 00-02, темнота ; С0-02» ' , свет

-'',"■; Бактероиды ■ . . . ■ ■■* ^ ■■'■.. ■ : -г

. эффективные 74,6 . 55,6 - 67,6 25,6 •

■■'неэффективные .32,3 ;■" 32,7 , " .ЧОЧ.Ц.

■Ч1 Бактерии "■ \ , ''' Ч \ • ' ; >

ЧЧ-Ч- эффективные . 69,4./-: 24.1 ":■ 38,4 : " ■■■■■ 58,5"

• ■; неэффективные 76.4 ... чзг.э 44,4 " 57,0

••..л.1»

■' • -.4 "V Ч''

V)'

'Ч" Как показано в табл. VI,- дыхание выращенных в культуре Ч„ : ' . клеток эффективного (35Эа) и ■ неэффективного (400) ятаммов1 : , 1«р±п1 в тех хе условиях'подавлялось значительно силь-^ нее, ; что'связано, по-видимому," о;наличием у них цитохромов '''" ■ а-а3 и "о, участие которих в СО-чувствительном дагякии нь> ^ "

ЗвропАстйдоказано Дрр!»Ъу, 1963/." В,аффективных>.Оактерош— . дах этих цитохромов нет, но есть другие СО-реактивные_ пиг- > V. ' . менты, в том числе цитохром Р-45С^Ь'Арр1въ* ,1969; Кретович . с соавт. ,1972/, кото|ые могут быть ответственными аа,чувст--вительное к СО дыхание бактероидов; В вальзу. вредяолоиеиия.;.,Ч об участии.цитохрома Р-45С^ь'в СО-ингибир/емом дыхании го-,_. 1 ворят отсутствие подавления 00 дыхания неэффективных бактв- ' Ч

ин,

-Л;->

рсвдов (lafts-Ti} a бактероидов иЭ'молодая клубеньков' (рто.Л:' 12) о низким содержанием иитохрома Р-45<^,./Матус,1973/.

' > Несомненно . что если цитохром IMS^ ; и $ункизони'рует в качестве терминальной оксидазн, то он не может быть един- , ствекной:оксвдазой Сактеровдот. 'Штохроин Р-450 ¡имеют виб-ма редокс-потенцаая s участвуютв свободном окяслении.ае, /связанномс запасанием ввергяя. Верояхно. 'в цитохром v

: Р-^ЬО^не составляет исключения.

/л ■

V/ Хотя в ;прямых' опытах образование АТР.эа счет: окяслвтбАь- ■ яого фосфорялирования в бактероидах пока не было показано, .'• V- считается,/что бактероида. сами шрабатыва1гт*:адергив вJ виде ; ; . АТР, необходимую для различных, биосинте зоввтоычисл9Я ; • • для.реакции связывания атмосферного азота. . : • .'; : ..

Кая видно из табл.тгх, присутствие разобщителя. дыхания ;•' ■ ■ а фосфорилироваяия г,4-дошатрофенола вызывало ингибирова~

нве йэотфиксирувдей активности, не изменяя при втом скорос- ; "'/ти поГлщеная Р^^; Видимо, гири этом нарушалось образование:, ' необходимой для азотфяксаоди ATP..

Таблшиуц

•■■ ' Влияние ингибиторов на восстановление бактероидами и поглощение Og бак-тероидзмя с дахательниыи частивама • "

; ; \. V. ■

" ч' ;- -

Л-Л-

■■ ■■: Вещество : ; • '•- > Кнгибироваиио

Коапен-тракия; МКМ :;,- Восстановление CgKg бак-дами ■ " Поглощение Og

бактероидами частицами.;.

Дднитрофенол ' 100 . СО . • ■ _

Риенон . . 57 50 ' • • ; 21 ; • 24

Антикицин А-. .. • ч .33 ■:■:■■ 50 34 ' • • 37 •

Дввоя&трафторацетон " 420 ■V 50' • . . 57 " " 45 i :: у"

■■■ Подученные нами данные позволяют выдвинуть вредаолояепае ; */' : - ло наличии у бактероидов ЩЮ; сопряженной с фосфорилированй-■ 7

;/ Vв«.": V--X;/Ь:; ■ :;;^■

'-'' ' \ ', ;при разных.концентрациях ингибиторов;' что давало воэмс«- V. !; V:. • ; ..ность настроить'по способу Дайнуиве'ра-^рка. графики зава-1. ' ^ ^ ''.л. ; снмости дыхания и азотфаксацки от концентрации ингибиторов.'.4 V Оказалось',-?«» высоких концентрациях ротенон и анткмицин •; ' ' ? полностью подавляли восстановление СЛЛ0,хотя поглощение" У У

: ' „^ Поглощение 0<> дохателышгди частиками ингибировалось ро-.\ '•'.' теноном и актшлнсданом в тех же концентрациях,! что , и даха- -- ' '-,. ■ ■

нае целых бактероидов (табл.ти). Полученные дашше дают^ " ' '■■:*

; > основание считатьчто " в бактероидах-фу 1шщиширует ьстро- .V; ; '.{. V . енная в мембрану дыхательная цепь, близкая по-строению ' '

'.•■ -'М за исклхмением цитохрома настолько прочно связаны о ;':•••'•• •';•.' ' ""

.:. .'•• . мембранными структу рамачто нагл'не удалось их солюбилвзй- ;; . . ■ ■■. ./" У у.'ропать', применив 2? Твин-00,'1? Тритон Х-100 и дезокси-.' .'.',:' ' -

у В указ ангшх в тайл.7и; кондантрацаяхротенонв антныицан ; . у--; Я"' сильнее подавляли восстановление С^К^"' чем поглощение Оз»' ",; • :'. V-'. •.•''••' V уд'ч''.;-] Причина;втого" заключается,-на наш взгляд; в следуп^м.':. ;• •

У ', Снижение скорости азотфиксации на• 50%'свидетельствовало об : -, уменьшения в 2_ раза скорости:обраэования-АТР вследствие по-4»г-,'>'; - 'давления указанными концентгашшми-ингнбитооов той'ШЭ. ко-* V • •

■ Сопряженные с фосфорилярованием ЦПЭ содержат в качестве "переносчиков влехтронов негемовые келезопротеиды'/Котельни-кова,1Э69; Гельман с соавт .'',1972/. В наших опытах те но ил- -. трнфторацетон, образующий комплексы с негемовымя желез¿протеидами, подавлял дыхание и авотфикенрупаую активность бактероидов , ( табл.ти).'; Поглощзнве:Од дыхательными частицами также ингйбировалось под действием теновлтрифтсрацетона,. : V что доказывает участие негемовых желеэопротеидов в работе фосфоридпрушвй ЦПЭ, связанной с мембранами. Кегемовай хе-^ лезопротеид, возможно;, функционирует также-в растворимой ''-ЦПЭ, окаячиващейся цитохромсм Р-450ЙЬ. >

"■ 'Изучение чувствительной к ротенону, и антшидану ЩТЭ, свя занной с мембранами,:представляет особый:интерес, постольку работа этой цени является, по-видимому, одним• аз факторов, определяющих скорость аэотфжксаиди в бактероидах. . :'-'. ■/" ^ .

По мнению Бергереена с сотрудниками, терминальная окси-" даза фосфоршшрующей ЦЦЭ расположена на поверхности бактероидов и реагирует специфически о оксигенированннмлегогло-бином (ьърг), в.то время как другие оксадазн - используют .V-,' только свободный 02 /»1и«пЪ*ге в* «1.,1974/.

ЦОО 600

РОТЕНОН. мкМ • АнТИМИЦ|гШ,тМ V Т1 Г А, мкМ -.;,

Рис.13. Влияние^ротенона (А), антимшвша (Б) и.теноилтри- ; ■ #торапетона _(Б) на азотфиксящпцув активность : бактероидов: I) - без ьъо2 -, 2) в присутствия ььо2

• Чтобы проверить это. предположение, ' ш изучала влияние' ' ' некоторых ингибиторов дыхания на скорость во со тановления .. Сг^ бактероидами в присутствия' выделенного нами в» - ' клубеньков желтого люпина и оксигенвровапного по методу Шаронова с соавт»/1Э73/.' Степень подавления азот^йксашш -не зависела от присутствия; (рас.13). / Сдедовательно,. V доля фосфорилируюо(ей ЩЭ в общем поглощения в присутствия 1ьо2°а без него Шла одинаковой. • • ■ ■ ■■ "УЧУ-

Кроме того, выяснилось, что ььЬ2 в одинаковой море сти-мулнровал азотфиксацию у бактероидов,' изолированных аз / клубеньков на разных этапах развития растений. Наконец, ; другие'.связывашще гемопротеиды,.гемоглобин и миоглойия, оказывалиТна азотфиксацию такое же'действиё, как и ьъо2. Все эти данные шзывают сомнениевсуществовании особой^ ; терминальной .оксидазц,; специфической, к >ьог« По-видиыочу, ,/ роль' 1Ь0г* в бактероидах заключается в" облегчении диффузии/--

к поверхности бактероидов, внутри. кото$их Од,используется различными оксидазаки, неспецифическиш к ью,-. • гI. ■ .■ ..*;■. - - ■ ;... . - ■ ■_ г. -"■ ..-и

' /б) ^ Изучение роли цитохромэ В-^БОд^'в дыхании-'-':

.■ ''::'■ ■,'.;" " * а азоуЬиксзщщ бактероидов.-, ■< Ул.'..' -'. ".^

Как.было показано выше (^айл.П),'Цатохром Р-450^'спосо чбен связывать ряд;субстратов и.ингибиторов микросомального > гидроксилирования. .Можно было ожидать, что связывание.этих: веществ отразится на выполняемых им.функциях. *••'..:-. ".',• В наших опытах вещества,-вызываниие спектральные измене- Ю1Я' 1 и XI .'типов . . подавляли - дыхание■ вазотфиксиру щую; актв-- вность »({фиктивных бактероидов люпина. Проведенные в; таблж-/це ЛГ1XIвеличины ^ в случае шгибированил азотфаксацал 'У. , очень близки К величинам К0 для каждого из исследованных ■ соединений (см.табл.II). Наряду с показанным здесь отсутствием кнгибнрования дыханий неэ^фективних бактеровдов.',этот' -/служит доказательством того, - что - изученные .'веществ' подав-1 ляли дыхание и азотфиксиДОмчую активность бактероидов ииен-но вследствие связывания шецитохромом Р-Лыз^.: Е1де.однны -.доказательством может служить также отсутствие подавления '/

•'•' г г'---,:.-'// л'. : • : . ; '. Ута^даУт У'л: •••'.'

■;//;/; Влияние веществ, связываемых цптохромом Р-450^, :'на дыхание в азот^лксашю бактероидов , л;

V.." Вещество У1:/ у ^ ;'. Концентрация, - /'-"-,/-- . />/'' Ингибаровакие,- %

восстановление /с2% поглощение 0. гбактероидами ^

, неэффек-/тивныки' У

Диметнланилнн .;■ 7,00 • /.-, 50" ;:'. -22 ••..<?/• '• , 0. ' '' Гексобарбитал * 1,88 50 УУ-'.': 20 . " '"• •'•'•«. 0 ■ '.■ | Какфора. • ■ • ' 2,55; 50 . .//.Ч 34-,'О V

........50, ,, -. 66: 22;

•Анилин ; 10,10 :< у 50 . ■ *■ ''■ йа --.А'-''-/■<■.■;.■■.п-л

зкр-эгзА■■ '■''Анилин /-.: Иетарапон

0,35

годе;

: 3,45 ;» '. 50 ',

; 26.

• ,0.: : ; О . .

.». -»

■ указанными.в табл.VIII^концентрациямивеществ дыхания и/ л;/ азотфиксагши культур! А , т1пв х»п(111;' любе зно предоставлен-// но!ЦЫ1.Лы)овым; и; дыхания аэробно выращенной культур! иь, .

^ * 1ир1л1. '«'- /У-у.у,-;У:';«У-:: УлУгЯУ-:'?/'■¿У'УТ^^^?''-", Более того, между ингибирупцими азотфинсагаш веществами1;: наблюдались конкурентные отношения,: подобно тому;;яак"суб- .-• ; стратн микросомального гидроксилированая конкурировали мех-;' ДУ. еобоО при образования комплексов с штохроыом Р-450^ . /хпю1,з««о, 1§66/. Эта конкуренция выражалась в повышении;// • К^ для какого-либо ингибитора ига ее определении на фоне У '/ /- /частичного^, подавления азотфиксации другим .веществом,, таете \;

/связываемым цатохромом Р-450^.: Такого рода конкурентные-.-.' ,у/:о^оивния,имели:местО;В случаях веществ, вызывавднх спект- ! / рольные;изменения как одного, .так'и различных типов. > Таким образом,'лолучен ряд фактов, указывайте: на то,'что ./' • подавление авотфаксации. изученными веществами происходило 1,1

• "именно вследствие связывания ах штохромом ^-450^;. у/Ул . /• / *. Возникает.вопрос:"каков механизм участия штохрома • / 'Р^450ю, в фиксадаи азота ? • • / . " . ,/ '. 7 / - .'. .

Предположение Эшрпби об участия штохрома ^-450^ в вое-. ; -<;втановлеиии вэособдвнений /Аррг^ъу; 1967/, высказанное по ! ; у аналогии о азоредуктазноЭ активностью цатохромй

: 'у -

ч";'. ■;;,*. /^в2»1,нвгпвиавг,4 1967/, ■ представляется маловероятным,'по- •••'.' 7 ' ■".-' • >- у скольку в'последнее время убедительно доказано большое схо- 17- I • -.г/.--'

л"! А -Л? фиксаторов» • По'тем же соображениям соилительпо участие ци~'-Ч*

. ; тохрома Р^бО^' в гидроксилвровании каких-то промежуточных;• У Г ., " У.У; продуктов; усвоения аммония, несмотри на. способность цит»-1 • 'Ц Л.'--■ ,■'* . ■ хрома Р-ЛбО^ связывать субстраты кпкросомального гидрокси-. \ ;

зил,.так как после'60 яак инкубации нам не удалось обнару-..У

•••.;• " • лась способность бактероидов гидроксклировать субстраты .. >- .- . . . • Л одтохрома Р-^ООщ. Пользуясь- разработанным для макросом ое-> у." •'•: * чени методом ЛгсНако* »4 «1.,1973/,.мы.не обнаружили гид- .' '' ';'• ."' .

.. . .. : добавление цитохрома. Р-460^ не увеличивало скорости изу- - . ;

' .' чавшихся реаквдЯ в'микросомах'печею».\/Ч .. . ; ' . •"•'

>, . . ; '.'Таким образом г результаты наших опытов говорят о том, что.' 'л-/ '•;..

' * '/цитохром участвует в процессах, лимитируппих ско- » • :

• . рость яэотфиксащй в. бактероидах, и что определенная часть '- '.:'• V--■>. .-'■.

'поглои;аемого "бактероидами 02 приходится на долю этих процео-. ":' У : • . • ' "сов. Несмотря на общность.спектральных свойств одтохрс»юв г У'ч; •

: Р~4£Л1д' и Р-450нь','' последний не обладает гидроксилазной ■ Г ;,'. ; 'Уу-''^ ч азоредуктазноа - активностями.' По'воей вероятности,-функции- "

У^У.У ■ У--.--.Л.-V • .''»!" л"

... ^ч ° ^ . . У .

("'■'Л.

.:/'.; • • /'• -г-^'.уН,■ У-. ''у.У 'Мч*' ¿■/■-•У, ■г';:.--"^'---

"'■ -■''■/-■'-' цитохрока Р-450д^ связаны с тема условиями низкого {£>2, в '

v. ^ которых. находятся бактероида » клубеньках. . ■- ■ , ; ■ ; ; ■ '-I,- '" " Учитывая литературные данные и полученные наш резуль- ■ . , Л ; тага, мы считаем возможным выдвинуть'гипотезу о механизме '■;

. V ".':' .■ ■ участия датохромо Р-450^ в дыхании бактероидов, основыва- • ' • -

1 ' ! ,. пцуюся па недавно обнаруженной способности цатохрома :'' ; ■ Р-450ш функционировать в качеств® переносчика 02 от кле- ; ^ .„.-^:

> - ■ точной стенкв к митохондриям печена /Longmuir et ,1973/*.

■-./-¡■''.у' "■*' ■ Предполагается,"что штохром P-450Rh может переносить" •

' .. О2 от клеточных стенок к внутренним мембранам бактероидов, .. "V.''„."■■ на которых происходит синтез АТР.'Перенос 02 путем свобод--у..-.; V.-,/-v.1 - ' ной диффузии по градиенту концентраций 02 в бактероидах, •

¿-1 ■ ■ по всей вероятности, затруднен ввиду чрезвычайно низкого ,' '.'"V ■.,'■■'"'' • р02 на поверхности бактероидов /TJepkema,Yocun,I974/. :. В 'А

• этих условиях оксигенированный цитохром P-450Rh может вы- • ; ■■ поднять внутри бактероидов такую же роль?, какую выполняет . ■ ' 1ъ02 внутри клубеньков, то есть переносить og, поддерживая ■;' ; v 4' его концентрацию на низком уровне. Последнее очень суще с т-. ч• ; . веюга в плане предохранения натрогеяазы'от раэрушащего

■ 'V '. действия Ogt согласно нашей гипотезе, в бактероидах нет . - ,. 1.

свободного Og, весь поступающий в бактероиды 02 связан с./. ' '-. '.;'■'китохромом P-450Rh. ...■■-.■ ■ . '" "."■ ! ■.■'■■'■...'"'-''V;-"■'i . В рамках предложенной гипотезы-легко объяснить влияние ' 1 ■ ■-.

■ "ч . ■,"< : ' субстратов я ингибиторов микросоиального гидрожсшшрованля - ■

на-дакание и аэотфнксжруюцую активность бактероидов. Свя- ; ; '• • - эыванае изученных веществ цитохромомР—450{щ нарушает, ви- >

" димо, его способность оксигенироваться.'Вследствзе этого ■ - уменьшается снабжение кислородом ЦЦЭ, ответственной за ,".-v

. синтез АТР, что ведет к снижению интенсивности поглощения ?'

02 и скорости восстановления CgHg, бактероидами. -" : \ ....■ ■:';■■ Предположение о том, что встроенная в мембраны Щ1Э при-

1 v пикает 02 от детохрока £-450^', может.объяснять'отсутствие , .

";.'."( ■ в а той цепи обычных терминальных оксидаз} их роль выдолня- . ".'•• -■V Л у ■ ют, возможно,, гемовротеикы Р-420 или Р-428, ила датохром ...f./jV'-;

„ с552* о ■ V У

шведа

" . I. " Разработана методика выделения и очистки цатохрома Р-450кь на . бактероидов люпина^ В результате полувека фрак-; ция цатохрома Р-450^, свободная от прям всей других одто-хромов. . "Л ■'. ■■■, у у ]

-42,-;,ЦвтЬхром Р-450^ идентифицирован по спектру' шелоч- , ногошаридингемохрогла и СО-дафференцаадъному спектру, по превращению в цитохром Р-420, по способности связывать' . Г субстраты и антабитори микрЬсмйалшного'гидроксилированив а. по спектральной характеристике этшщзоцаанидвдго комплекса. .-"л 3,'ЦИзучены спектральные свойства цатохрома '■'<

Показано, что по ряду'свойств цитохром Р-45С^] бактероидов люпина отличается от цитохрома. Р-ЧБО^1'' бактероидов* сои. *,;:.'■■:

- Изучена ■ способность вдтохрома Р-450кь связывать.1 ■ субстраты и ингибиторы микросомального гидроксилирования.г■■ ¡По субстратной спедафичнооти.и'спектру втилдзоцианидного, ' -комщткеа штохром р-^бС^' более близок-к связанного ; мембранами цитохрому Р-450^, макросом печена, чем к раст-; веримому бактериальному цитохрому Р-450оМ). ' • • • ' *

'5.' Цитохром Р-450^ .не; монет осуществлять' гидроксили-рованне:субстратов цатохрома Р-^бОц^я анаэробное восста-> - новлвиие'аэосоеданений. - *.."' . . Ч- ■;;У '

6. Показана возможность восстановления цатохрома • Р-4БС^Ь' за счет иао(р)Н в присутствии растворимой фракции ч бактероидов или микросомальной фракиии печени. Цитохром ; восстанавливался такхе искусственной цепью,совто-; ящей из наюрн ¡ферредоксин-оксидоредуктазы и фарредвксина. -из хлорошшетов гороха. .' . ." V'■;,'■ ■.-.

Ыошю полагать, что иаогн и (ипп) иаси ; являются естественными восстановителями' штохрома, РЦбС^.' в бактероидах^ ■■■ . '57.':' Ери связывании цитохрома Р-45С^Н с■ различными;гид-рофобными ,веществами в опытах с изолированными"бактероидами: наблюдалось ингабирование азотфиксиру щей, активности, ' что указивает на: связь штохрома Р-4Киь .с: аэотфиксацвей.

;■' 8.; Показано, что цитохром Р-^бС^ принимает участие в поглощении 02 бактероидами. , Ч', "- ■-'■"■ '.'■

9. Путем ингибиторного анализа дыхания бактероидов v ,. установлено ; .что ихцитохрсмная система имеет реэветвлен- ■' вна характер;:: В бактероидах имеется связанная с мембранами ■ цепь,": осущестшяпдая синтез АТР. на; долг которой при-., холятся большая часть поглощаемого 02. • i Л v>V ■ '-". 10.Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу,-"-":, согласно;которой эд"тохрсм'1^5С^-.фувквдонирг^т в качестве ; переносчика 0.J от поверхности бактероидов к ах.внутренним, г; мембранам.:.-,;:*'•

- СПИСОК РАЮТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ • ГО МАТЕШАЙАМ Д1ССЕРТА1Ш :

It г Г&йхинштейл М, ВMe лик-Саркисян С.САрчаков;А.И.; -Кретовйч Б.Л.; 1974. Спектральные свойства питохрома -.'V. РЦ50 из бактероидов 'Лшина.- ДАН СССР 316, .1185.

2, Мелик-Са ркисяи СС. .РаЗиитггеЙк К.В;,, Арчаков А.И/,'

- Кретотяч В.Л,, 1S74.'Шияние-субстратов к ингябито-

Sb удкросомального гидроксилированид на азотфакеи-г иную активность.бактероидов люпина. ДАН СССР 216,■

¿■■■.■■л УУ}')

Э»'' Kritovich ff;L.',' Helik-3arkleeibn S.S ►, Raiitchinstein i • Н.1Г., ArchakovA.I1974. -The binding of, microsomal hydroKjrJationiBubatratee "to cytochrome P-i^O^w and ,-v; ■ Its effect on the nitrogen fixation.by lupin ,bacte-. . ■ roida..- PSB3Lettsre 44, 305. .

4» Р^ДхшштеЙН M.B.',-Мелик-Саркясяп С.С., Закграева Г.Г.,

. /„■■ Кретович^В.Л., 1975.• Ипгибаторкый анализ днхакия . ■.•■.'. • бактероидов-из клубеньков желтого лшвяа." Макробио-. / >' .. логия (в печати). • •;' - , • • ■ - -

5. Мелпк-Сармряи С.С.; Рьйхинятёйн М.В., • Владзкевская

. • • • Л.П., Ьшшрова Н.Ф», кретсвкч п.д., 1УУЬ. Шляние.; -легоглобпна на дыхание и азотЗ-иксигтпдую активность; ;; бактероидов лшияа.в процессе развития растений.-

•• йаэиоя. растепий (в печати). - -¡v• V--,: ■--.■;';■.'-■■

6.", Welik-Sarkisaian 3,S., Raikchinetein'М.V.вязЫгога -•'., - .4 Я.Р., .Vladsi evekaye Ь.Т., 1975. The influence of - V '

-: ligogloMn on-the respiration and nitrogen fixation-.

- by lupin nodule tact его ids during the development

■. of plant a .Aba tracts of the XIX. International»Bote-' nical Congress, Leningrad, CJS3H. - .- -v у ■ '

л --.-.■_, .. . . * - 1 -"--3 1

' >3.7I8p. Т:гсо.;Типогро1'ия В/о "Знаике" " .;••