Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦИТОХРОМЫ БАКТЕРОИДОВ ЛЮПИНА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ЦИТОХРОМЫ БАКТЕРОИДОВ ЛЮПИНА"



. v

Не правах рукописи

АКАДЕМИЯ НАУК СССР Ордена Ленина Институт биохимии им, А. Н. Баха

МАТУС Виль Константинович

ЦИТОХРОМЫ БАКТЕРОИДОВ ЛЮПИНА

(Специальность 03.00.04—биологическая химии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1973

АКАДЕМИЯ ІЮК СССР . .. Ордена Ленина Институт биохимии им. А.Н. Баха

На правах рукописи

В.К. МІУС

ШІОХКШ БАКТЕРОИДОВ ЛЮПДОА (Специальность 03.00.04.- биологическая химия)

Автореферат диссертации, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1073

Аднкрант Есесоюзного научно-исследовательского Института продуктов брожения

Райота выполнена в лаборатории энзшлологии Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н.Еаха АН СССР

Научные руководители; член-корреспондент ЛН СССР, профессор Б.Л.Кретович кандидат биологических наук С.С.Мелик-Саркисян

Официальные оппоненты: доктор биологических науії Н.С.Гельман каидадат биологических наук Т.А.Калининская

На официальный отзыв работа направлена в Институт физиологии растений им. К.Л.Тимирязева АН СССР.

Автореферат разослан 1973 г.

Заднта диссертации состоится 1573 г.

на заседании Ученого Совета Ордена Ленина Института биохимии им. А.Н.Бахь, АН СССР (Москва, Е-71, Ленинский проспект,33)

*

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Учений секретарь кандидат биологических наук

(Н.Н.Дьячков)

Долгое время механизм биологической фиксации азота микроорганизмами оставался загадочным. Азот фиксировали лииь ;

интвктные клетка бактерии - азотфнксаторов, и не удавалось не только выделить ферленты, катализиружцие этот процесс, но и осуществить оиксацшо азота после разрушения клеток. За послед- . ние года, после многолетних поисков, били найдены условия воспроизводимой фиксации азота бесклеточними экстрактами, полученными как из свободноживущих микроорганизмов {Co.ina.cha. г/ еі сИ, 1$60; Любимов и др., 1968; Любимов, 1^69), так и аз сішбнотп-ческих СХосН е.(а£% 186? а,б; Ти?л<г>г, і&ез;

Кретович и др., 1570). Эти успехи способствовали быстрому прогрессу в понимании механизмов процесса азотфиксацаа.

В настоящее время мы знаем, что биологическая фиксация азота осуществляется в результате многоступенчатых окислительно - восстановительных реакций, с потреблением энергии в виде АТФ и при наличии потока электронов.

Среди различных микроорганизмов, способных фиксировать азот, весьма активными азотфаксаторами являются клубеньковые, бактерии рода $кІ20&іиаі, которые осуществляют этот процесс в симбаозз с высшими растениями. В результате симбиоза с бобовыми растениями клубеньковые бактерии претерпевают ряд важных 1^113 иол ого - био^шшческих изменений, что приводит к их превращению в бактероиды - симбиотическую форму клубеньковых бактерий. При зтом у клубеньковых бактерий наряду с другими изменениями наблюдается значительная перестройка 'в системе энергетического метаболизма, в частности, в составе цепи переноса электронов ( ШЭ )..

Исходя из представлений о том, что продукты фотоскнге-

за, постацдяеше растением-хозяином, окисляются бактероидами с образованием энергии (АТФ) и электронов, необходимых для фиксации азота, представляет интерес изучение их дыхания, которое к настоящему времени изучено недостаточно. Основной задачей настоящей работы являлось изучение штохромной системы бактероидов.

Для д:.-явления особенностей цитохромной система бактероидов, активно фиксирующих азот, в работе был использован ср;шнитагьно - биохшшческий подход в двух аспектах: в плане сравнения бактероидов эффективного (фиксирующего азот) и неэффективного (не фиксирующего азот) штшжов, а такле путем изучения бактероидов в процессе развития растений в течение вегетационного периода, так как известно, что интенсивность азотфикеацни в значительной мере связана с фазой развития растении.

Параллельно с исследованием цатохромов определяли интенсивность дыхания бактероидов, которое является основным показателем функционального состояния дыхательной цепи, а т.-иже соде^яие дегоглобина о клубеньках, которое является показателем активности азотфиксирушей системы ( ТШапйгс, ЛШйпсп, 1963; ScJiuring harne?г/<7/, ib?o) .

маршалы и методу йсслед0вл15хи

Материалом для исследования слу-шли клубенька желтого люпина tS'-ilpinus , сорт Быстрорастущий .4, Выращивание растений, инокулировашшх эффективным штампом ЯН.

iilpini 359 а и веBjjpeктиваш - ■ ¿Upint 4С0, прово- .

) \ диен в вегетационных сосудах в тщательно промытом кварцевом

леске ( 6 кг im сосуд ), на питательной среде Прянишникова

(Соколов и др., 1938). Стартовая доза азота была уменьшена в 30 раз и составляла 3 мг на I кг песка. Б питательную смесь в виде солей добавляли следующие микроэлементы- (мкколь/кг) ;

8- 40,2; Но- 20,8; 2п - 7,6; Мл-.27,2; Ы - 1,8; Со - 0,01.

Ьыравдвзние растений проводили в течение 6-7 недель, до фазы бутонизации.

Для изучения дщнаиики содерханил питохромов и интенсивности дыхания бактероидов, а такке содергглния легоглобина в клубеньках в процессе вегетации растений, использовали растения, выращенные в полевых условиях.

Бактероида выделяли методом даф!;ереп ¡шалького центрифугирования по методу Бергерсена , Тизпез, 1567). Проматае бактероиды суспендировали в 0,01 М К-йосфатноы буфере, содержащем11 ,ШК-азу, и разрушали в прессе типа Хьюза (Любимов, Львов, 1268). Гог.-.огемат бактероидов предварительно центрифугировали при 10 ОООхс^ 30 кие для удаления неразрушенных бактероидов и затем при 144 ОООхс? в течение 60 мин луш получения растворимой фракции бактероидов и фзакщи частиц, Франции частиц использссали для изучения штохро^ов, связанных со структура:®. Растьориьше цитохрош исследовали во фракциях белков после выделения и часвичноп очистки последних из супернатанта 144 С00х£?. Икае приведена разработанная наки схема фракционирования растворимых белков сактероидов.

Идентпй цкацаю цитохроков проводили по соответствукким полосам дифференциальных спектров (восстановленные ¡линус окисленные), снятых при комнатной температуре и температуре -196°, а также по спектрам щелочных пиридипгеглохромов и по даффе ренциальным слекгром СО-комплексов.

Диффере нци альны е спектры регистрировали на спектсо--

фотометрах «ДСД-2" и „НI ¿ас/г I-35&".

Схет/.з фракционирования растворимых белков бактероидов ГОМОГЕКАТ БАКТЕРОИДОВ

1 целтрифуглрова ние, 10 ССОх^ ЗОмйн

£

ОСАДОК

(неразруиенше бактероиды и крупные частица)

т

СУ1ШШАТАНТ

це I ;трмфу гиро вакие, 144 ОООх^ 60 мин

т

ОСАДОК

СУПЗН1ЛТА11Т

стрепто?.; яцин су л ьфа т 1,5%, рН 7,4

Г~

ОСАДОК

1

СУПЕШЛТЛИТ

80/^ный сульфат аммония рН 7,4

СУМГААЙШ БЕЙКИ

а) гелъ-филътрация на Оиогеле Р-2

б)хроматографированне ма ДЕ-52

т

Элюеити: Л/аСё, М буфер 0,1

в 0,01 -М фосф. буфере

е 260/':;зс о,бб 0,77

Франц;! л. I II

0,3

1,33 III

0,5

1,68 1У

Расчет количества цатохромов проводили по метолу Дисек::о:.зсл и Моховой (Лисенкова, Мохова, 1Ь64). Изменение оптической плотности (д[> мМ), которая входит а качестве расчет;величины в формулу Еера, находим из трех точек

- ? _

спектра: максимума поглощения и двух длпха&цпх киникуасов* Б нашем случае минимумы дня цитохромов £ и С совпадали и соответствовали 540 и 576 нм. В случае определения оптической плотности щтохрома Р45о использовала две точки - максимум его поглощения и минимум при длине волны 490 нм.

Содержание цитохромов рассчитывал;! по формуле

.где

ДО - изменение оптической плотности цнтохрслюв при определенной длине волны; л £ - дифференциальный коэффициент молярной экстшкцаи; Е- - длина оптического пути; *

С - концентрация цитокрома.

Использовала следующие дифференциальные коэффициенты МЕЛлимолярной зкстинкщш: для датохромов с к о 552

ыМ = 23,2; для цитохромов £559 и 6-557 ~ Я^я

цдтохрома Р^ - 87.

Количество легоглобина в клубеньках рассчитывали по содержошш протогема во фракции, осаждаемой в пределах насвдепия сульфатом аммония, на основании спектров поглощения целочних пкрщшнгемохрошв, которые получали по кетоду Пауля и Теорелля ( РаиР е1 ав,, 1953) Молекулярную кассу легоглобина принимали равной 17 ООО.

Интенсивность дихания бактероидов определяли амлеро-КетрИЧеСКИМ методом по поглощвнию кислорода (Островский и др., 1£62) -

Определение белка в суспензии бактероидов а во фракции частиц приводили После целочного- гидролиза образцов в 0,5 и ЛоОН при Ю0°С в течение 13 по модифицированное методу Лоури (Мосолов, Скарлат, 1£С5К

-8-

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ О БОУЖЖЕНИЕ

Состав шт ох ромов бактероидов люпина и распре деле! те кх tro Фракциям.

На ]шс.1 представлены дифференциальные спектра суспензии интактиых бактероидов, фракции ысиброн и супернатанта. Представлен аыз спектры свидетельствуют о том,что качественный состав щт о хренов фракции мембран не отличается от цитохрошого состава целых бактероидов. 06á спектра представлены с£-полоса-ми поглощения с максимумами при 550 и 555 нм, которые свидетельствуют о присутствии в указанных фракциях цатохромов В и с. Как и чреддологалось в суспензии целых бактероидов а во фракции мембран tu не смогла обнаружить полосы поглощения в об-ластз 600-605 нм, характерной для цатохромов а+егд, что хорошо согласуется с данными других авторов <3í?.,1958) Мелак-Саркксян и др.,1969).

При исследовании супернатанта во всех опытах выявлялась .12шь одна полоса поглощения coi-макс ильмом при 550 нм. Полосы поглощения, характерной для цатохромов группы &t обнаружить 1:3 удавалось.

Как мо^лго видеть из рис Л, положения максимумов полос поглощения цитохроыов группы с во всех исследованных фракциях несколько различались и соответствовали для супернатанта 550, и суспензии глтадстних бактероидов-551 нм.

Поэтому моаш было предположить, что бактероида люпина, так же, как это было показано ранее для бактероидов сои (fippteéy, I96S), содержат два штохрома группы с .

131 1

Рис.1. Дифференачальные спектры (восст. дитионитом минус окися. феррицианидом) '

I-суспензия илтактных бактероидов (2,5мг белка/кл); 2-фракция мембран (2,0 мг белка/мл); 3 —супернатант 144 ОООх^ (3,6 мг белка/кл) .

Для выяснения вопроса о том, хакпе цатохрош солюбмлизк-ровалнсъ при наших условиях разрушения бактероидов мы провели дальнейшее фракционирование супернатанта, полученного при 144 ОООх^ , по схеме, представленной в разделе "Материалы и метода исследований" ^

3 результате, как это показано на крлвоЗ элюции, рис. 2, было получено разделение слоеной смеси растворимкх белков бак-

тероидов на 4- фракции. В условиях наших опытов не все бедки адсорбировались на колонке. Первую фракции, как правило, элее-ровали стартовым буфером. Остальные белки элшровалд ступенчато, указанными в схеме градиентами ЛЬСЄ.

На дифференциальных спектрах, полученных белковцх фракций, ряс. ЗА, во всех опытах выявлялась только одна аі-полоса поглощения с максимумами при 550 , 552 и 555-557 км для фракції 1, II и III соответственно. Положение максимумов фракций I и II позволяло считать, что они обусловлены цитохромами группи с - Однако, полоса поглощения фракции III с максимумом при 555-557 км могла быть связана с присутствием штохромов как группы £ , так и С . Для выяснения отого вопроса были сняты дифференциальные спектры щелочных пиридингемохрогйов изучаемых фракций.

t Ніс. 2. Кривая элзоцаи растворимых белков бактероидов с ДЕ-52.

Рас. З, Дифференциальные спектры (восст. датконптом . мінус окисл. ферряцианидоы). А-белковых фракций 3,11 и III: I-фракция I (3,6 мг белка/ли); 2-фракция II (6,5 мг белка/мл); 3-фракция III (10,0 мг белкаД-л

Б-щелочных пиридангеиохромов белковых фракций І, II и III.

»

При этом на дифференциальных спектрах щелочных пиридингёмохро-шв фракций ІиІІ были обнаружены ©(-полосы поглощения с максимумами при 549 и 550 нм, что соответствовало присутствию в этих фракциях цитохромов группы с, рис. ЗБ. Полоса поглощения пиридингемохрома фракции III с максимумом при 555-556 км характерна только для протогека, что являлось указанием ка присутствие в данной фракции гемопротевда, имеющего в качест'ье

прсстегической группы.протогем. Поскольку аа дифференциальном спектре (восстановленный минус окисленный) фракции ИХ выявлялась только одна оС-полоса поглощения с максимумом при 557 нм, рис. ЗА, модно было считать, что в данной фракции находится растворимый, цатохрок ^557*

Таким образом, на основании полученных данных мы з щелочила, -что в бактероидах люпина содержатся два растворшпгх хш-тохроыа группы С : и С^^и растворимый штохром S^ СО-дилере ндиальние спектры, представленные на рис. 4 , свидетельствуют о том, что в бактероидах лишша содержится ряд гешдрозкидов, способных взажодеаствовать с окисью углерода. Так, на спектре фракции IX можно видеть широкие полосы поглощения в области 567, 538, 415 нм и "впадину" при 552 юл. Указанное ма;К£»щуг,аг характерны для СО- реактивного цятохрома ^552,

iv.c . 4 , ii'i Jt; :0 рг. нцис'л : лше спектра СО - коштлике о в (. дйти0нкт+ (X) лг.;н;/с дзтиокет) белковых фракций I, II и III. Обозна-

чс1гл;;.. ш5.1-: h"j pi'-c. 3. крутая 1~ линия 7-pilöqpa.

На спектре этой же фракции наблюдается хорошо выраженная полоса поглощения с максимумом при 421 нм, что свидетельствует о присутствии растворимого гемопротеида Р420*

На спектре фракции XII можно видеть сильно выраЕенную ■ полосу поглощения с максимумом при 452 ш,обусловленную присутствием цатохрсмЗ Р450> а такие поглощение в области 425 ш, что, видимо» связано с присутствием в этой фракции небольцщх количеств гемопротеида Р^од- Следует отметить, что цктохром ^450 Р01166 0ыл обнаружен в азотфиксирующих бактероидах сои, тогда как в чистой культуре НИ .^арогисит он обнаруживался лшь в виде следов только после очистки супериатанта на сефадек-се -75.

Таким образом, мошю заключать, что ЦПЭ лЛ^-фиксируащих бактероидов по сравнению с культурой клубеньковых бактерий отличается тем, что они утратили цитохрсмы группы сс. Вместе с тем у бактероидов к периоду активной азотфиксацяи появляются новые переносчики электронов^ такие, как цитохром си питохром

р450*

Цитохромы и интенсивность дыхания бактероидов

люпина в процессе вегетации растений.

»1

Как следует из данных по цитохромноглу ссставу, рассмотренных в предыдущем разделе, процесс превращения клубеньковых бактерии в бактероиды сопровождается значительной перестройкой Щ1Э.

Но;шяениа в бактероидах новых пероносчиков электронов и исчезновение цитох ромокспдаэи может бить связано как с изменением условий обитания клубекьковцх бактерий в клубенька* вис-

ших ¡астений, так и с появлением у них футшии фиксации азота.

Выяснить этот вопрос мы пытались путем изучения как да-тохрот.тного состава, так а функционального состоящая дыхательной цгси бактероидов в процессе вегетации растений. При отогл подходе мл исходно ¡13 данных о том, что, азотфиксярутщая активность бактероидов в процессе развития растений значительно из-^1 меняется- В ранний период формирования клубеньков она находится г.а уровне, затем1 постепенно повышается, достигая 4 своего казссимуьга в период конец бутонпзации-начало цзетешш, пос;.о чего резко снижается ^киПпуквтвз ,1970; Шоп?} , &ггс:7.-; 1571). ^гвязи с этим большой интерес представляло ВЫЯСНИ

j. Ь какой период формирования клубенька происходит пере-стрсЛка ЦПЭ бактероидов

2. Что характерно для перестройки ЦПЭ бактероидов при их фор:. :л родамин в процессе вегетации растений: какие компоненты появляйся заново и какие количественные измеиения претерпевают )штохрош.

3. Как изменяется интенсивность дыхания бактеродов в про-цессо вегетации растений.

В табл. I представлены результаты, характеризующее со-дергл::пе цитохромов в процессе вегетации растений как в сус-ленг?;и: лптактных бактероидов, так и в полученных из них фракциях: оулернатонте и фракции частиц, полученной в интервале 10 000-144 СООх^ . Данные таблицы свидетельствуют о том, что

/ содсрлние цитохромов групп С и в в бактероидах на протяяе-

<

ник ^ехго периода развития растений изменялось незначительно. И л,. у бактероидов одноасдёлького и одиннадцатая о дел ь пого возг-лота оно сш:о несколько пике. В первом случае это могло

быть связано с тем, что еще не закончился процесс формирования бактероидов, а во втором-с изменением обмена бактероидов в деградирующих клубеньках. Аналогичная закономерноеть наблюдалась и в содержании цитохромов групп & п с , связанных со структурными образованиями бактероидов.

Более заметный было изменение суммарного содержания цитохромов С и С 552 в растворимой фракции бактероидов. К периоду активной азотфиксацш оно увеличивалось, примерно, на 100$, что могло быть связано с синтезом в бактероидах нового цнтохрома с-

Особенно заметно изменялось содержание цитохрома Как видно из таблицы I, этот цитохром можно было обнаружить на всех фазах развития растений. Однако, на ранних фазах его содержание было низким. По мере развития растений содержанке датохрема увеличивалось, достигая максимума к началу цветения, а затем по мере старения растений резко уменьшалось.

Цитохромы группы а. в бактероидах не были нами найдены ни на одной из исследованных (¡аз развития растений. Это -подтверждает данные, согласно которым азотфиксирукшие бактероиды как сои ( , 1£Ь8; ХЙ69) так и люпина лишены цитохромов группы О, (№елик-Саркисян и др., 1569).

Ка рис. 5 приведены кривые*,' характеризующие динамику интенсивности дыхания бактероидов, содержания в них цито-хрома ^4501 а также содержание легоглобина в растворимой фракции клубеньков в процессе вегетации растений. Из характера кривых следует, что изучаемые показатели в процессе' развития растении изменялись параллельно, достигая ыакевму-ма к периоду„конец бутонизации - начало цветения!"

Ваяно отметить, что интенсивность дыхания бактерсидог> мододах клубеньков (одна педеля} бала низко» - 36 мклй>/нг

белка в час. В дальнейшем, по мере развития растений, интенсивность д:шн:2я возрастала параллельно накоплению цитохрома Р450 а состапгяла 83 ккл02/мг белка в час.

Таблица I

Шттохромнцй состав бактероидов люпина в процессе вегетации растений, в мкмолях гема / г белка

чВозраст расте-^циЦ, не дела Фраяц:::.:^^ 1 и пит и х 3 4 6 8 9 11

Интактние бактероиду 6 0,21 -£552 0,29 0,26 0,37 0,20 0,24 0,30 0,34 0,34 0,39 0,30 0,33 0,21 0,22

Частицы 144 ОООх £ е. .у.; С -^552 - 0,34 0,37 0,32 0,33 0,41 0,43 0,36 0,36 0,39 0,43 0,29 0,30

Суперпатант 144 01 л к с 55'.:+^552 0,0? следа 0,13 0,016 0,11 0,020 0,12 0,035 0,14 0,033 0,13 6,036 0,05 0,011

Низкую интенсивность дыхания бактероидов, выделенных из молодо клубеньков, видаю, можно объяснить отсутствием в их дыхате-о-нол цо'лл цнтохромсксаддзы. Последующее резкое нарастав с, могло бить обусловлено появлением иоеих компонентов ЦП^- ил тохроков Р^^ КС552, которые, как известно,

оба являются аутоксидабелышми.

: I

■ <* |

ь.

3

¿75

I

3 55

--о и 1«

3

10.06 Щ

I

0.01! 3

0,02 | а*

X

а«-

Л Ц О 0 10 12 н<гЪал и.

Рис. 5. Изменение интенсивности дыхания бактероидов (I), содержания в них цктохрсма Р^зд (2) и легог.юбика (3) в растворимой франции, клубенька' в процессе вегетации растений

Б настоящее время известно, что содержание легоглобина в 1слубекьках хорошо коррелирует с их азотфиксируицей активностью {ЗсА^яуАате? ., 1970). Поэтому найденная корреляция содержания легоглобина в клубеньках с содержанием цитохрома Р450 и интенсивностью дыхания бактероидов свидетельствует о том, что перестройка ЩЭ (исчезновение датохрзмов группу О, и появление цитохрома Р450) и общая интенсификация дыхания бактероидов связаны с приобретением бактероидами новой функции - аз о иксиругц сй активности.

1.'тлтохро?м ^ интенсивность дыхания „эффективных -и неэффективных бактероидов

Стелькое определение iraто>; сомов проводили в суспензии целых клеток и во фракциях гомогената эффективных (ЭФ) и неэффективных (НЭФ) бактероидов. В последнем случае изучали супернатапт 144 ОООх^ и фракцию частиц, осавдажуюся в интервале J0 ООО - 144 ОООхр . Согласно дифференциальным спектрам, предстадуюныгл «а рис. 6, можно видеть, что на спектрах суспензии целых клеток и фракции частиц как ЭФ { А, I и 2 ), так

и КЭФ (¡л, 1 и 2 ) бактероидов имеются с<.-полосы поглощения

f¡

цитох|о-,:а С с как с иглу ком при 551 mi и цвтохрома tr в виде плеча при 5С0 ш. lia спектрах поглощения указанных фракций НЭФ бактероидов выявлялось такде слабое поглощение в области ООО - €05 im, связанное с присутствием в этих фракциях што-хрококевдази ( Б, 1 и 2 }. Б соответствующих фракциях ЭФ бактероидов поглощение б этой области. отсутствовало.

Дифференциальные спектры растворимой фракции как ЭФ, так и II;« бактероидов, характеризовались об- полосой гюглоще-ния с при 550 нм ( А , 3 ; Б, 3 ), что свидетель-

ствовало о иалпчии в бактероидах различной эффективности растворимого цатохрома группы с.

Ка оно. 7 представлена дифференциальные спектры ЗФ Cï) и ПУФ (!■ ) бактероидов, снятые при температуре ш:дкого азота. Как moitüo видеть, оС-лолоса поглощения цитохроков группы é , которая па спектре, снятом при комнатной температуре, выявлялась 'в аяде к области £60 им, в этих условиях расякплялась на

две Этот ()окт свидетельствовал о ток, что liait в ЭФ, так

и в ШФ бактероидах содержатся два цитохрома группы

РИС. 6. Дифференциальше спектры (босст. дитионитом минус окислен, феррицианидом). ■■

А - эффективные бактероиды; Б - неэффективные бактероиды-I. - фракция частиц (белок: ЭФ - 4,25; НЭФ - 7,0 мгД'л)

2 - интактные бактероиды (белок: ЭФ - 4,1; НЭФ - $,0 мг/мл)

3 - супернатант 144 00Ох (белок; ЭФ - 5,3; НЭФ - 4,25 мг/ул)

На низкотемпературном спектре суспензии ЭФ бактероидов, так же как и ка спектрах, снятых при комнатной температуре, поглощения в области 600 нм не наблюдалось, тогда как на спектрах НЭФ бактероидов была выявлена полоса с максимумом при 557 км, характерная для цитохромов группы Си. Таким образом, НЭФ бактероиды, в отличие от эффективных, содержали в ЦПЭ цитохромы группы сь.

5« i

Flic. ?. Дифференциальные спектры (воссг. дитионитом минус ок^сл. геррицианидомj» снятые при температуре -IS6°C ; цдина оптического пути света 0,3 см).

1 - ОС i актером si ; (3,85 кг белкаДш);

2 - НЗд бактероиды; (3,22 кг белка/m).

Un р/с, 8 представлены дифференциальные спектра С0-кот-плекепо (;:лтионмт + СО минус датиоиит) суспензии ЗФ и ЫЭ& бактерс;: юв. На СО - спектре УФ бактероидов , рис.З (1), можно бидсугь интенсивную полосу поглощения с максимумом при 452 ш, обусловленную наличием цитохрома P45Q* Полосы поглощения с глаксплумамн при 4IG, 537 и 5GÍ¡ нм и провал при 551нм указшмят на наличие СО-комплекса цатохрока (^552* Наблюдаемые слабые полосы поглощения в области 430 и 422 им, видимо, OtíyuHOiVi- ::>и пр::с-'тст2ие;,1 г емоп 1ч; т ей доз ( Itso)

На СО-слектре НЭФ бактероидов, рис. 8 (2), такке могно видеть полосы поглощения,. указывающие на наличие у них што-хрома Следует, однако, отметить, что они были значительно

менее выражены по сравнению с аналогичными полосами на спектрах ЭФ бактероидов, а провал при 551 нм был несколько сдвинут в длинноволновую част£ спектра.

Еаяно отметить, что на спектре НЭФ бактероидов полосы поглощения в области 450 ка; не были обнаружены, что свидетельствует об отсутствии цитохрома P45Q в бактероидах при неэффективном симбиозе.

Рис. 8. СО-дифференциальные спектры (длтаонит + СО минус датаоннт).

1 - ЭФ бактероиды; 4,4 мг белка/гдл;

2 - НЭФ бактероиды; 8,0 мг белка/мл;

На рис. 9 предета.глена диаграмма, составленная нз основании данных по интенсивности дыхания и содержанию цитохроыов

в ЭФ ЗФ бактероидах, а татае по содержанию легоглобана в клубеньках.

Как можно видеть из данных диаграммы, наибольшие различия кег;ду ОФ и НЭФ симбиозом выявляются в содержании легогло-бина, цдтохрока Р4К) и интенсивности дыхания бактероидов. То еоть, по тем ке самым показателям, между которыми наблюдалась наиболее выраженная корреляция при изучении клубеньков в про ;оссс вегетации растений.

С.. ¿Ц — э.1<1октипвие

ке^фсктишше в ^ от эг; сктг.ш::х

6-

"ф,

ш

РЧ50

ЛСГОГ.-ОСИЯ

дыхание

питон г^*""

Рис. 5. Цитохромы и интенсивность дыхания ОФ а НЭФ бактероидов; содержание легоглобина в растворимой фракции улубен псов. ^ ' 4

Таким образом, полученные в настоящей работе данные позволяют заключить, что характерной особенностью ЦПЭ азот-сг-лксат: гг^щ:-: бактероидов люпина является отсутствие датохроме в гр,/;;гш си, которые содержатся в культуре клубеньковых

бактерий и в небольших количествах найдены в НЭФ бактероидах. Кроме того, для азотфиксирующих бактероидов, в отлил/, а от клубеньковых бактерий и НЭФ бактероидов, характерно наличие , цитохрома Р450.

Цитохром с 2* как следует из данных настоящее работы, присутствует как в ЭФ, так и в НЗФ бактероидах.

Можно предположить, что отмеченная положительная корреляция между активностью азотфиксации и интенсивностью дыхания бактероидов моает служить подтверждением того, что необходимая для азотфиксации энергия образуется в бактероидах.

Выводы и

1. Методом дифференциальной спектрофотометрам исследовали нитохромыый состав бактероидов, выделенных из корковых клубеньков люпина. Показано, что бактероиды содержат структурированные в мембранах цитохромы С552 и ¿550»

В растворимой фракции бактероидов обнаружен и илтохро-

ми С 552' $557 (?)• Р450 И геыопротеид Р^^ Цитохром ,,

£г в растворимой фракции показан впервые.

2, Ъ азотфикслрующих бактероидах люпина отсутствует цитохромоксидаза, содержащаяся,в чистой культуре . Показано, что цитохромоксидаза в бактероидах исчезает уже на самых ранних ¿азах развития клубенька. Одновременно в бактероидах наблюдалось появление новых компонентов ЦГГЭ - пнтохромов

^552 11 р450*

3* Показано, что при НЭФ симбиозе перестройка 1313

бактероидов носит менее выраженный характер: так, у КЭФ

бактероидов цптохромоксмдаза полностью не исчезала, хотя

содержание ее резко снижалось.

[штохром Р^д} в бактероидах ара ИЭФ симбиозе обнаружен памп не был.

4. Интенсивность дыхания ЭФ бактероидов в период

акт::;игзл (.{дксацни азота, по сравнению с НЭФ, была в 3,5 раза

/

вике.

5. Установлена положительная корреляция между содер-кдшк!-^. цктохрогла Р^^ и интенсивностью дыхания бактероидов с легоглобипа в клубеньках. Эта показатели на ранних ¡¡азах развития растений были на низком уровне и в процессе вегетации растений параллельно нарастали, достигая

к периоду наиболее активной азотфиксацки.

поскольку содержание легоглобина в клубеньках служит критерием азот^ыкспрукдей активности, мокно полагать, что кайденн'гя корреляция подтверждает связь цитохрома Р^с^ п повш:;::йо]'о уровня дыхания с процессом азотфиксации.

С. Разработана методика частичной очистки и францаонц-ропяпга! растворимых белков бактероидов. В результате была получена белковая фракция, содержащая только штохром &550» а тек;.*-; била определена локализация цитохрома Р^ ^. Последнее гея }!3:шш; для дальнейших работ по выделению и изучения этих цитохромов.

СПИСОК РАБОТ,ОШ"БЛЖОВАНРЖ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ. :...'

1. Кретович Б .Л., Мелик-Сараисян С.С., Матус Б.К., 1972.-

Состав цитохроиов клубеньков люпина келтого. Биохимия, 37, 4, 711.

2. Кретович В.Л., Матус В.К., Мелик-Саркисян С.С., 1972.

Цитохрош и интенсивность дыхания бактероидов из клубеньков .гюпина в процессе вегетации'растений. Физиол. растений, IS, 5, 1060.

3. Матус В.К., Мелик-Саркисян С.С., Кретович В.Л., 1973.

Цитохрдаы и интенсишость дахания бактероидов из клубеньков люпина, инокуляроБаниого "эффективным" и "неэффективным" штаммами Hb. iupint. Микробиология, 42, I, 112,

4. Матус В.К., Мелик-Саркисян С.С., Кретович Б.Л.,

Характеристика щтохрсмного состава бактеродов люпина в процессе развития растений.

В сб. докладов Всесоюзной конференции "Механизм биологической фиксации молекулярного азота". Черноголовка, 1973.

ИАТЕЕИАЛЫ S-ЮСЕРТАЛКИ ДОЛОЕЕНЫ:

X. На 3-ем Ваковском коллоквиуме по биохимии азотфиксацки, Москва, IS70.

2. На Всесоюзной конференции по механизму биологической фикса-дай молекулярного азота (4-ый Еаховскай коллоквиум). Москва, 1971.

Подп. к печати 14,03.73 г. Зак. 576, тир. 200

Типография ХОЗО "Госплана СССР :