Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические особенности близнецов крупного рогатого скота, полученных методом трансплантации эмбрионов

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности близнецов крупного рогатого скота, полученных методом трансплантации эмбрионов"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМ!« ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ им. К.И.СКРЯБИНА

РГ6 он

2 ' ; Яа правах рукописи

Ш И X О В Яков Игоревич

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БЛИЗНЕЦОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ

06.02.01 - разведение, генетики, селекция и

воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена академии ветеринарной

им.К.И.Скрябина

в Московской медицины и

государственной биотехнологии,

Научный руководитель

член-корреспондент ' РАСХН, Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор сельскохозяйственных наук,профессор КРАСОТА В.Ф.

Официальные оппоненты -

1. Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор СЕРГЕЕВ Н.И.

2. Кандидат сельскохозяйственных наук БАРДЮКОВ Л.М.

Ведущее учреждение -

в ¿¿/часов на заседании диссертационного совета Д 120.36.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина (109472, Москва, ул. Академика Скрябина,23, тел. 377-9383).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии

Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Защита диссертации состоится:

1996

г

Автореферат разослан

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Курилова Н.М.

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

В настоящее время биотехнология занимает одно из ведущих мест в ряду научных направлений, коренным образом меняющих образ мышления и характер трудовой деятельности человека. В сельскохозяйственном производстве и, в частности, животноводстве происходят революционизирующие преобразования по совершенствованию основных средств производства, а именно, по улучшению пород и типов животных. Генетика и селекция, используя современные технологии, - гормональную регуляцию воспроизводительной функции, трансплантацию эмбрионов , цитогенётический мониторинг, клонирование и генную инженерию, - ускоряют процесс создания желательных типов скота и освобождения популяций от вредных мутаций и лишнего генетического груза. Селекционный прогресс значительно ускоряется за счёт внедрения программ МОЭТ (Множественная овуляция и эмбрио трансплантация).

Развитие биотехнологии в животноводстве связано с расширением исследований в области трансплантации эмбрионов и манипуляций с зародышевыми клетками. Новые перспективы открываются также в связи с внедрением технологии рекомбинантных ДНК. Кроме обычной пересадки эмбрионов от донора реципиенту с целью улучшения генофонда стада, специалисты прибегают к дополнительным технологиям. Так испытывается возможность подсадки эмбрионов уже осеменённым реципиентам. В этом случае добиваются увеличения выхода телят на 100 маток, или же, Наряду с обычным, получают приплод другого направления продуктивности. По разным данным наибольший % двойнёвости получается при трансплантации двух эмбрионов в оба рога матки, или при подсадке эмбриона в коллатеральный рог, где не выявляется жёлтого тела (НуЬа, Ро1аХек, 1987; Сергеев с соавт.1991; Гавриков, 1995).

В настоящей работе проводилась подсадка эмбрионов осеменённым реципиентам. Получение двоен направлено было на решение вопроса увеличения выхода телят в'стаде. Вместе с этим решались научные задачи вынашивамости двоен коровами-первотёлками, а также теоретические вопросы степени влияния реципиента на качество потомства. В связи с этим была сформулирована цель исследований.

Цель и задачи исследований. Целью исследований было изучить приживляемость двойнйвых эмбрионов и характер становления наследственно обусловленных признаков у телят - близнецов, полученных методом трансплантации эмбрионов.

В задачи работы входило:

- Определить эффективность метода трансплантации эмбрионов посредством подсадки 7-дневных зародышей осеменённым реципиентам;

- определить изменчивость и наследуемость признаков животных в 3-х уровнях структурной организации: на уровне ткани - диаметр волосяных фолликулов, на уровне клетки - содержание ДНК в ядрах соматических клеток, и на молекулярном уровне - структура ДНК по данным ПЦР- анализа.

■ - охарактеризовать вариабильность признаков у телят близнецов, используя данные их происхождения и условия эмбриогенеза.

Научная новизна работы.

В работе использовался новый, малоразработанный метод получения двоен крупного рогатого скота посредством подсадки эмбрионов осеменённым рецципиентам.

Впервые были определены наследственные характеристики размеров генома у телят - близнецов, полученных методом трансплантации эмбрионов. В качестве показателей размеров генома использовался показатель содержания ДНК на 1 ядро соматической клетки.

Новым в работе явилось определение ''структуры геномной ДНК в группах близнецов и их матерей, истинных и приёмных, с помощью методов ПЦР-анализа. '" '

Практическая значимость. Работа проводилась в условиях производства в колхозе <Советская Белоруссия) Брестской области и на базе хозяйств Племцентра Переславлъ-Хмельницкий Киевской области. В результате работы была установлена возможность получения двойневых стельностей за счет подсадки эмбрионов осемененным реципиентам. На основе моле-кулярно-генетических анализов была показана сравнительно высокая наследуемость основных биологических признаков по происхождению, независимо от генотипа реципиента. '''Это послужило основой для практического вывода о решающем'' значении донора в формировании генотипа трансплантантов'. Однако, не исключается модифицирующее влияние реципиента на

развитие таких признаков у телят, как густота волосяного покрова, диаметр волосяных фолликулов.

Результаты исследования могут быть применены в разведении желательных типов скота с заданными параметрами продуктивности, а также при оценке генетических связей в парах мать-потомок при составлении алгоритмов селекционных программ в молочных стадах крупного рогатого скота.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены:

1. На второй международной конференции сЛктуальные проблемы биологии в животноводстве), Боровск, 1995 г. *>

2. На производственном совещании специалистов колхоза ■¡Советская Белоруссия) (Брестская обл'.'," пос. Расна, 1994 г.).

Публикации.

Изменчивость структуры генома у коров и телят, полученных при эмбриопересадках.-Актуальные проблемы биологии в животноводстве. Вторая международная конференция./Тезисы докладов/. Боровск 1995 (232)

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов исследований, выводов, предложений производству и списка литературы. Список литературы включает 142 источника . В диссертации 87 страниц машинописного текста, 9 таблиц, 1 график и 11 фото.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Первая часть работы проводилась в отделе трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных в колхозе < Советская Белорусия> Брестской области. В опытах (1993-1994 гг) было использовано четыре племенных коровы - донора, с продуктивностью от 7 до 10 тысяч кг. молока с законченным продуктивным периодом. Суперовуляцию у коров вызывали препаратом ФСГ-п (США) в дозе 50 мг на голову. Коров-доноров осеменяли замороженно-оттаяной спермой быка Дестинг Британо-фризской породы. Извлечение, поиск, морфологическую оценку качества эмбрионов осуществляли по методике ВИЖа.

Для эмбрио-пересадок использовали тёлок-реципиентов в возрасте 18 месяцев черно-пёстрой породы. Живая масса тёлок была в преде- 3 -

лах 350-360 кг. Эмбрионы были подсажены на 6-ой день предварительно осеменённым реципиентам. Пересадку осуществляли прибором <1МВ> Франция. Приживляемость эмбрионов устанавливали по 90-днев. стельности и по результатам отелов. При отёлах телят взвешивали и регистрировали в книге отёлов.

Вторая часть работы выполнялась на базе хозяйств, обслуживамых Головным селекционным центром Переславль-Хмельницкий Киевской области. В опыте было 2 донора Голштинской породы с продуктивностью 10-12 тыс.кг молока с жирностью 3.4-3.7%. Реципиентами были коровы закончившие 2 лактацию.

Схема эксперимента

1 опыт 1 | 2 ОПЫТ |

п = 20 эмбрионов/14 телят П = 8 телят

получение двоен путем ■ ■. сравнительный анализ

подсадки эмбрионов в "•' групп близнецов полу-

коллатеральный рог матки ченных от разных доноров

20 реципиентов 8 реципиентов

4 донора 2 донора

- ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ( Учетные -данные по новорожденным телятам, п биопсия кожи в области ушной раковины, п взятие образцов крови из ярёмной вены ) п

= 26 = 57 = 18

АНАЛИЗЫ * ж * * ж жжжжжжжжжжжж * ж * ж ж ж ж Гистоструктурный анализ волосяного покрова ж Определение содержаия ДНК в ядрах соматических клеток ж Изучение структуры ДНК методом ПЦР-анализа

* Статистическое исследование цифрового материала

У животных были взяты образцы кожи для морфологического и ци-

- 4 -

тохимического исследования, и образцы крови для анализа ДНК.

Метод.определениялолщину.волосяных.Фолликуло?

Для определения толщины волосяных фолликулов использовали гистосрезы кожи окрашенные галлоцианином по Эйнарсену. Толщину фолликулов измеряли на горизонтальных срезах на уровне залегания сальных желёз.

V

Для этого фотографировали срезы на пленку при увеличении 25 . Затем плёнку с изображением волосяных структур помещали в фотоувеличитель и кадры проектировали на белый лист бумаги, помещённый на экран дигитайзера компьютерной установки К0№ГО(Ж. Окончательное увеличение объекта было 131-кратное. Анализ толщины волосяных фолликулов проводили с помощью компьютера КОГЛЖДО по программе МОР-УЮЕОРЬАЛ.

С каждого образца исследовали по 50 фолликулов. Статистическая обработка материала была заложена в той же программе.

Цитддпектрофдтометрическое.определение.содержания.ДНК Измерение количества ДНК в клетках проводили на компьютерезированном автоматическом микроскопе ЦМБР фирмы ОРТШ.

Условия фотометрии были следующие.

Спектральная характеристика светового зонда была выбрана с учётом кривой поглощения света красителями Фельгена и галлоцианина по Эйнарсену - область зелёного света. Для выделения монохроматического луча был использован интерференционный светофильтр с пропусканием в зоне л= 546 нм.

Объектив микроскопа - 40х, диаметр зонда 0,08 мм, метод цитофотометрии - сканирование по объекту лучом света. Частота шага 0.2, скорость - 20 шагов/сек. 'Подсчет результатов сканирования объекта проводился с помощью программы АРАМОЭ 65.

Для определения среднего содержания ДНК в ядрах клеток промеряли 20 ядер с хорошо выраженной округлой или овальной формой. Нулевую плотность выставляли' на неокрашенном фоне вблизи измеряемого объекта.

Полученные цифры содержания ДНК в одном ядре клетки потовой железы использовали для характеристики размера генома исследуемой ткани.

Молекулярнуй.ан&луз. полиморфизма.ДНК Анализ структуры генома проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Суть реакции заключается в том, что определённые праймеры или другими словами концевые последовательности нуклеотидов добавленные в раствор ДНК провоцируют в^ определённых условиях (pH,температурный режим плюс термоустойчивая ДНК - поли-мераза ) множественный синтез последовательностей, фланкированных этими праймерами.

Для амплификации использовали 10-членные олигонуклеотидные праймеры 5'-CCGGCCTTAC-3', 5■-GCCGTCCGAG-3', patsee

апробированные в работах Гречко с соавт.(1991).

Маркером молекулярных масс являлась ДНК плазмиды pBR322, обработанная эндонуклеазой Mval. В1Качестве контроля использовали пробу, содержащую полную' амплификац'ионную смесь, но без добавления ДНК. Злектрофор>еграммы ДНК окрашивали этидиум-бромидом и анализировали под ультрафиолетом.

Статистическую обработку данных проводили на компьютере с помощью программы BASIC ; STAT GRAF ; HARWARD GRAF.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1^Исоользоеануе.уетода.трансо^антациу.дмбриоиое ДЛ5.пдвучени5.бли?веиое.крупцдГ9.РОСаТОСО.скота Первый опыт был проведён' в колхозе «Советская Белоруссия) Брестской области. В опыте было 4 донора и 20 реципиетов.

Донор N10: черно-пестрой породы, возраст 10 лет, продуктивность 10 тыс.кг молока за 305 дней наивысшей лактации. Масть - чено-пестрая с преобладанием белых пятен.

Донор N543: немецкой черно-пестрой породы, возраст 7 лет, продуктивность 10400 кг молока за 305 дней наивысшей лактации. Масть - черная. Комолая.

Донор N304: черно-.пестрой породы, возраст 7 лет, продуктивность 7600 кг молока за 305 дней наивысшей лактации. Масть черно пестрая.

Донор N2563: черно-пестрой породы, возраст 9 лет,

продуктивность 10500 кг молока за 3Ö5' дней наивысшей лактации. Масть черно-пестрая с преобладанием (90%) белых пятен.

От доноров были получены эмбрионы с целью подсадки осеменённым

- 6 -

реципиентам (Табл.1).

Как видно из таблицы процент вымывания в среднем у доноров составил 80,5%.

Для пересадки использовали в основном эмбрионы - поздние морулы и ранние бластоцисты - отличного и удовлетворительного качества.

У всех доноров встречались различные по качеству зародыши.

Самое низкое качество эмбрионов следовало отметить у донора N543. Однако приживляемость, вернее, стельность реципиентов была наивысшей. В то же время от донора N304 стельность реципиентов оказалась невысокой, хотя качество эмбрионов было наилучшим.

Эмбрионы были пересажены 20 реципиентам черно-пестрой породы, предварительно осемененным ""б'ритано-фризским быком <Дестинг> 122/529551, продуктивность матери 11993 кг молока за 305 дней лактации.

Табл.1

Результаты суперовуляции доноров и получения эмбрионов

ИДонора

Жёлтых тел п.я./л.я.

Вымыто эмбрионов

отличного качества

удовлетв. качества

неоплодотв. и-дегенери-рованных яйцеклеток

% вымывания

пересажено эмбрионов

2563 10 304 543

10/10 10/ 8 7/ 5 10/ 7

5 9 3 10

65 94 75

8 2 6 5

5.2

В среднем 9.2/7.

4.5

2.2

6.8

80.5

Результаты ректальной диагностики стельности реципиентов на 3-м месяце после осеменения и пересадки эмбрионов показали следующее (Табл. 2): -• 7 -

Табл.2

РЕЗУЛЬТАТЫ ОТЕЛОВ ПОСЛЕ ПОДСАДКИ ЭМБРИОНОВ ОСЕМЕНЁННЫМ РЕЦИПИЕНТАМ

NN R Дата осемене НИЯ R Дата транс плантации Номер донора Качество эмбрионов Стельность 90 дн. Пол телят Возраст при рождении

2720 27.03.93 02.04.93 2563 Мо2++ + + 0" 0я 261

2724 " Мо2++- + + £ о" аборт

2723 Мо2++- + + 9 9 261

2725 >1 Мо2++- -

2721 •• Мо2++ + + -

2722 и Мо2++- + -

2715 н 11 - Мо2+- - -

2513 it 10 В1а1++ + + ? 9 258

2712 11 II " В1а1++ +

2843 15.05.93 22.05.93 304 В1а2++ + + -

2737 " В1а2++ +

2741 «1 В1а2++ - -

2736 м В1а1++ + + 9 276

2740 (| Мо2++ + + 9 283

2747 не осем. Мо2+- -

2743 15.05.93 21.05.93 543 Мо2++- + + ол 282

2746 и Мо2++ + + 0* 280

2744 " •• •• В1а2++ + + 0" 280

2749 и fi " Мо2++- + 9 275

2789 1« и Мо2+- + + о" 279

Из 20 реципиентов отелились 11, при этом у трех были двойни, т.е. 14 телят на 20 коров или 70% приплода, и один аборт двойнёвой стельностью.

Живая масса при рождении у одинцов составила в среднем 29,7 кг., а у двоен 21,3 кг.

Результаты отелов после подсадки эмбрионов осеменённым реципиентам представлены в таблице 2.

Общая стельность в 90 дней составила 80 процентов от числа пересаженных эмбрионов. Тогда как число двойневых стельностей было шестьдесят процентов от количества пересадок.

При отелах процент двоен составил 20%, причем из них одна нетель абортировала. Общее "же количество отелов составило 55% из которых 20% были двойни. Общее количество телят на одну голову составило 0,7 гол.

Возраст бычков при рождении - 280дней, телочек - 278 дней и двоен - 260 дней.

3-2.Изменчивость.и.наследуемость.признаков.у.телят, полученных.методом лранд гзлантации.эмбрионов.

Во второй части опыта, продолженного в Головном селекционном центре Переславль-Хмельницкий Киевской области, были использованы в качестве доноров высокопродуктивные коровы-доноры голштино-фризской породы, полученные методом трансплантации эмбрионов, ввезенных из Канады. Донор N201 <Надине> с продуктивностью 10200 кг. молока за 305 дней лактации. Масть черно-пестрая. Донор N1063 <Эвелина> с продуктивностью 11400 кг. молока за 305 дней лактации. Уровень кормления соответствовал нормам ВИВа. Выдерживались необходимые нормы минерального и

витаминного питания коров-доноров и стельных реципиентов. Коровы-реципиенты содержались на глубокой подстилке, что благотворно влияло на состояние здоровья стельных животных и способствовало лучшему сохранению эмбрионов в период плодоношения.

У доноров, реципиентов и родившихся .телят-трансплантантов

были взяты образцы кожи для цитоспектрофотометрического анализа ДНК и для общей морфологии. 'У тех же животных были взяты образцы крови в количестве 50 мл. для выделения ДНК и её ПЦР- анализа. Известно, что такие признаки, как диаметр волосяных

- 9 -

фолликулов, толщина коллагеновых воЛокон и густота волос в поле зрения микроскопа, характеризуются высокой степенью наследуемости.

Особое значение имеет содержание нуклеиновых кислот, поскольку с этими соединениями связан механизм передачи наследственных свойств от родителей потомкам. Ранее была показана высокая корреляция по содержанию ДНК в клетках между отдельными тканями организма, а также между сибсами по одному и тому, же виду тканей, что свидетельствовало о глубокой зависимости формируемых признаков от количества ДНК в ядре клетки ( Шихов,1986).

"в нашей работе эти признаки были использованы для изучения биологических особенностей близнецов крупного рогатого скота по^.у'ченных методом трансплантации эмбрионов.

' Структура волосяного покрова исследуемых животных характеризовалась следующими основными показателями ( Табл. 3).

^Размер фолликулов соответствует литературным даннымо волосяных структурах кожи крупного рогатого ско'та::при рождении и во взрослом состоянии. Коэффициент корреляции свидетельствует о несвязанности толщины волосяных фолликулов у реципиентов с аналогичными показателями их потомков , что заставляет предполагать, что изменчивость этого признака обуславливается слабой наследуемостью по линии матери,. а также тем, что характер связи нарушается трансплантантами, которые генетически с реципиентами не обязаны. Несколько по другому обстоит дело с густотой волос. Корреляция положительная и •'несколько ■ больше, нежели по диаметру волосяных фолликулов. При этом, если рассматривать отдельно группу донора 543, то корреляция по густоте волос выражается коэффициентом г = 0.32, что может характеризоваться, как определенное влияние реципиента на признак, формирующийся у потомков. Более наглядно удалось рассмотреть эти связи в другом опыте,., проведённом в Переславле-Хмельницком(табл.4).

Подтверждаются результаты первого опыта. Так в группе телят, родившихся от донора 201 диаметр волосяных фолликулов равнялся 66.9.Д, что было больше, чем в группе 'донора 1063- (57.6 д), у которого самого волосяные фолликулы были тоньше ', чем у сравниваемого-с ним животного, Т.е. здесь проявлялось отчётливое влияние матери- донора на формирование признака потомства, полученного методом трансплантации эмбрионов.

"■"- 10 -

Таблица 3

Диаметр (ц) и густота волосяных фолликулов в коже животных

Группа донора Диаметр волосяных фолликулов ( N0 ) телят

Густота волос //^у £

реципиентов | доноров

телят

|реципиентов¡донор.

543

В среднем Ошибка ср.ар. Ср. квадр.откл. Коэфф. вариац...

(а I 62,3*4 58,2^3 59,1*2 51,2x2 76,5x3 61,4-3 4.17 9.33 15.18

304

В среднем Ошибка ср.ар. Ср. квадр.откл. Коэфф.вариац.

73,7x3 66,6x4 70.1-3, ■3.55 5.02 7.15

10

2563

В среднем Ошибка ср.ар. Ср. квадр.откл. Коэфф.вариац.

72,1*2

64,7*2 67,6*3 63,2x2 65,1*2 1.29 2.23 3.43

(б), 97,8x6 72,6x2 89,1x2 82,4:3 83,9*2 85,1*3 4.13 9.25 10.86

84,0*2 86,8x3 85,4-2,5 1.39 1.97 2.31

84,2*3

93,7*11

,5*3

(а-) (б')

64 25

64 58

86,5 53,5

65 53,5

83 52,5

72,5 48,5

5.03 5.95

11.25 11.3

15.52 .27.44

92 52

84 48

88 50

4 2

5.6 2.8

6.4 5.6

81 > '69

58,2

78 -

95 43,7

77

10.6

18.41

23.89

40

Коэфф.корреляции "а/б": - 0,05

"а'/б'": 0,15

Таблица 4

Диаметр (ц) и густота волосяных фолликулов в коже животных

Группа донора Диаметр волосяных фолликулов | | Густота волос / ЫН V

( N0 ) телят реципиентов доноров| телят реципиентов доноров

201 67,3*3 61,1*2 65,5*2 73,8*2 82,3*4 83,6*3 81,4*2 83,8*2 97,0*4 92,0 89,0 93 92 43,9 49,0 53,5 58 36

В среднем 66,9*2, 25 82,7*3 91,5 51,1

Ошибка ср.ар. 2.63 0.56 0.86 3.0

Ср. квадр.откл 5.27 1.13 1.73 . 6.0

Коэфф.вариац. 7.87 1.36 1.89 :1 1 .8

Коэфф.кор. 0,22 0,27

106-3"' ' 55,8*2 58,1+2 58,9+2 91,3*2 82,0*2 65 60 60 49 48

В среднем 57,6*2 91,3*2 61,6

Ошибка ср.ар. 0.929 1.66 9 ЯЯ

Ср. квадр.откл. Коэфф.вариац. 1.60 2.79 4.68

По густоте волос и диаметру волосяных фолликулов корреляции между реципиентами и их приёмными потомками выражались коэффициентами в пределах 0,2-0,3, что, в частности по густоте волос, согласуется с предыдущим опытом. Следовательно, проведённые исследвания давали основание считать, что какое-то влияние матери- реципиента на формирование такого признака, как густота волос не могло полностью исключаться. Вместе с тем очень ясно выражено влияние донора на рассматриваемые признаки. По отношению дисперсий признаков можно было судить, насколько доля генотипической вариансы обуславливает изменчивость признака в общей его дисперсии по данной выборке животных. Для этого была взята разница между общей дисперсией~"и~ дисперсией в среднем по

отдельным родственным группам ( по группам происходящим от определенного донора) и эта величина была отнесена к общей дисперсии (По Инге-Вечтомову, 1939). Получен показатель наследуемости по диаметру волосяных фолликулов 0.657, а по густоте волос 0.900, "р" соответственно <0.05 и <0.01.

Из сказанного можно заключить, что выбранные для исследования признаки отражали генетические связи в группах трансплантантов и их родителей. Причём, основное и неоспоримое влияние обнаруживалось по линии мать-донор - потомок. Но некоторая связь была выявлена и по линии мать-реципиент - потомок, в частности по густоте волос она была на уровне г=б".3,. что явно недостаточно, чтобы расчитывать на влияние реципиента в селекции, но полностью игнорировать качество реципиента также' нельзя.

Таким образом, исследованные' морфологические признаки развития кожно-волосяного покрова телят показали, что определяющим является влияние матери -донора, хотя некоторая тенденция изменчивости такого признака, как густота волосяного покрова, может обуславливаться воздействием матери-реципиента.

Чтобы удостовериться в наблюдаемых отношениях матери донора и реципиента и качества трансплантантов, провели подробное изучение состава ДНК ядер клеток у животных.

3,3,.Изуче1П1? д^азмера.геуома.по.одказателям.содержзния.днк

в.сокоящихся.ядрах.соматических.клеток Изучались покоящиеся ядра клеток потовых желёз, которые несут

' - 13 -

постоянный набор ДНК (Таблицы 5 и 6).

Таблица 5

Содержание ДНК в ядрах покоящихся соматических клеток (опыт I)

N Донора Содержание ДНК в ядрах клеток (услов.ед.)

телят реципиент. доноров

543

9,55-0,091 9,25-0,246

9,85*0,036 9,20-0,125

Э.^О.Ш 9,75*0,129

9,62*0,037 9,32*0,225

9,99-0,058

В среднем Ср.квадр.откл. Коэфф.вариац.

304

В среднем 10

9,64т0,099

9.55*0.110

0.244

2.55

9 , 74т0,194

Э^О. 121 0.270 2.86

9.96 0.209 9.18-0.023

Э.Пб^.ОВб 9.72*0.055

9.71±0.147 9.45-0.039

10. 87*0. 063 9.64*0.'132

2563

10.91 0.060 10.21*0.280

10.81*0.060 9.33*0.238

10.92-0.035

В среднем Ср.квадр.откл. Коэфф.вариац.

10.66Т0.133

0.424

4.00

На таблице N5 показано содержание ДНК в ядрах клеток у телят и реципиентов.При этом связи между указанными признаками по парам <реципиент-потомок>•- не обнаружено. Коэффициент корреляции составил: г =-0.18 (недостоверно). Однако, если из числа исследуемых пар взять лишь истинные пары мать-потомок и исключить трансплантантов, то г = 0.89 (р < 0.01), т.е. связь чётко выявляется. Отдельно взятые телята-трансплантанты (Ш 2/2723; 23/2720; 21/2513; 32/2749; 24/2746; 5/2789) не выявили связи по

содержанию ДНК с реципиентами, даже, напротив, связь оказалась отрицательной г=-0.66 (недостов.) Эта тенденция отрицательной связи требует дальнейшего изучения.

Таблица 6

Содержание ДНК в ядрах покоящихся соматических клеток (опыт II)

N Донора Содержание ДНК в ядрах клеток (условн.ед.)

у телят у реципиент. у доноров

201

В среднем Ср.квадр.откл. Коэфф.вариац.

1063

В среднем Ср.квадр.откл. Коэфф.вариац.

8 . 38*0. 165 8 .38*0 . 175

8 .БЭ^О. 1 10 8 .594. • Ш

8 .бв^О. 248 8 .554 .251'

8 .бО^О. 273 8 . 104

8 .б^О. 102 8 . 47*0 .09

0 .20 0 . 168

2 .38 1 .99

8 .8410. 144

8 ,97±1. 304: .8*0.:

8 ^О. 210 7 370

8 124.

0 .215

2 .44

9.69 0.156

10.01-0.189

Наибольшее содержание ДНК в ядрах- клеток было у животных, происходящих от донора 2563. Этот донор имел высокие показатели продуктивности 10500 кг молока, с коэффициентом молочности 1700, ни у какого другого донора' таких высоких показателей не отмечали. Далее - группа телят донора 543 - 10400 кг молока за лактацию, коэффициент молочности 1600.Затем по убывающей степени: донор 1063 (Табл.6)', коэффициент молочности 1530, и,наконец, донор 201,коэффициент молочности 1400. Содержание ДНК у телят соответственно распределялось: .10.66; 9.55; 8.78; 8.61 усл.единиц. Высокая степень наследуемости показателя содержания ДНК

подтверждается настоящей работой. Вышеприведенная методика р

вычисления Ь по Инге-Вечтомову позволяет определить уровень

? ?

соотношения генотипическои и фенотипическои варианс как сг^/а-р, что выражается в числах (0".574-0.058)/0/574' = 0.89, что при п=21

дает уровень зхначимости р<0.01. Т.е. внутри группы телят, происходящих от одного донора, варианса столь мала, что будучи вычтенной из общей вариансы, она дает такую долю генотипической дисперсии, которая вполне сравнима с обще'й дисперсией по данному признаку, т.е. по содержанию ДНК в ядре клетки. Это указывает на высокий показатель наследуемости признака, и вместе с тем указывает на то, что такие основные признаки развития организма, каким является размер генома, выраженный показателем содержания ДНК в ядре клетки, остаётся на уровне, соответствующем своим генетическим предкам, т.е. донору. Приведенные материалы позволяют расчитывать на то, что метод эмбриопересадок не внесёт'никаких помех"в селекционно-генетический прогресс, нарабатываемый животноводами всего мира. Также заслуживает особого внимания метод подсадки эмбрионов осеменённым реципиентам. При этом можно будет получать желательные формы и типы приплода, отличающегося по гено'тйпу от своего близнеца, вынашиваемого матерью. Это позволит расширить возможности биотехнологии МОЭТ, использовать банк эмбрионов специфического направления продуктивности - мясных пород, аборигенов, устойчивых к заболеваниям или других экзотических животных, затребованных потребителем.

3,4=.Полиморфизм.длины.^модифицированных._фрагментов.ДНК У исследуемых животных была выделена ДНК для структурного анализа. Интерес представлял полиморфизм длин амплифицирован-ных со случайными праймерами фрагментов ДНК (Random Amplified Polymorphic DNAs - RAPDs) •

В настоящее время начинают широко 'использовать полиморфизм фрагментов ДНК, образующихся при много - копийном синтезе последовательностей, за счёт помещения в раствор ДНК коротких случайных праймеров и создания условий'циклической амплификации. В термоциклере происходит -наработка 'фрагментов, которые после разгонки на электофорезе -дают полиморфную структуру геном а . Изменчивость RAPD-маркеров выявляется на фотографиях электрофоретических полос', окрашенных'-'этидиум-бромидом и снятых в ультрафиолете .

ПЦР-маркеры свидетельствуют о том, что все образцы однородного происхождения, за исключением одной пары - это реципиент N2835 и

- 16 -

его собственный теленок 1854. По двум праймерам подтвердились данные ошибочного учета, и пример телёнка показывает, что часто мы принимаем за трансплантанта обычно рождённого потомка данного реципиента. Другие телята очевидно были одного происхождения - у них один отец и одна мать, поэтому фрагменты в основном совпадали по всем образцам.

Этот метод позволил нам описывать корреляционные ряды с учётом действительного происхождения телят - трансплантантов. Следует считать,что приводимая фореграмма выявляет сравнительно небольшое число фрагментов и не является достаточной для подробного индивидуального учёта происхождения телят. При соответствующем подборе праймеров можно увеличить число""фрагментов до нескольких десятков, и тогда можно будет с уверенностью констатировать родственность животных, используя ПЦР-фореграмму, как молекулярный фингерпринтинг.

4. ВЫВОДЫ '•'

1.Метод трансплантации эмбрионов осеменённым телкам-реципиентам позволяет увеличить воспроизводит е льные потенции самок по результатам их стельности - до 145%, Уи"даёт возможность получать потомство нераспространённых в данном хозяйстве типов скота.

2.По срокам вынашивания плодов крупного рогатого скота, полученных при трансплантации эмбрионов, наибольшее время у бычков-одинцов - 280 дней, затем'- у тёлочек - 278 дней, и наименьшее время вынашивания двоен - 260 дней . '

3.Исследование структурных признаков развития волосяного покрова коров- доноров, реципиентов'и их телят выявило существенноевлия-

ние матери-донора на потомство: по диаметру волосяных фолликулов

? ?

1\= 0.657 ( р < 0.05), по густоте волосяных фолликулов на 1 мм

о

1\ = 0.900 ( р < 0.01). Отмечена некоторая степень влияния реципиента на густоту волосяного покрова телят-трансплантантов, коэффициент корреляции г = 0.15 - 0.30 (р - 0.1).

4.Отмечена высокодостоверная наследуемость содержания ДНК в ядрах клеток потовых желез в потомстве при трансплантации эмбрионов =0,89 (р<0,01)

5.В парах реципиент - теленок-трансплантант не выявлено положительной корреляционной связи между признаками содержания ДНК в

ядрах клеток потовых желёз ( г= - 0,6; р > 0,05 ), что указывает на неизменяемость изученных характеристик генома в процессе пересадки зародышей и их развития внутри утробы реципиента.

6.Использование ПЦР-анализа ДНК позволяет идентифицировать происхождение телят, полученных методом подсадки ' эмбрионов осеменённым реципиентам.

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ '

1. В хозяйствах, в зоне деятельности станций по трансплантации эмбрионов, рекомендуется применять метод подсадки свежевымытых эмбрионов 6-7 дневного возраста осемененным реципиентам на седьмой день после осеменения. Подсадку осуществлять в коллатеральный рог, противоположный тому, в котором' имеется желтое тело.

2. Использовать метод ПЦР-анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК для подтверждения истинного происхождения телят-трансплантантов.

По материалам диссертации опубликованы работы X. Шихов Я.И. Изменчивость структуры генома у коров и телят, полученных при эмбриопересадках //Актуальные проблемы биологии в животноводстве: Тез.докл.Второй Международной конф., Боровск, 5-8 сент. 1995 г. - С.232.

2;.'И1ихов Я.И. Изменчивость и наследуемое*^ признаков у телят, полеченных методам трансплантации эмбрионов./Мое¡гос.акад.вет. медицины и биотехнологии им.К:.И.Скрябина - Москва 1996. — 9 стр. -Деп. 5.3 в ВНИИТгИагропрома 13.05.1996 № 16615.

Размножено на ротапринте в Типографии "РОТЭКС", гЛясницкая, 35. Заказ 166. тир. 100 экз.