Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические и химические особенности, культура тканей RHODIOLA ROSEA L. и RHODIOLA IREMELICA BORISS. и возможность их интродукции в Башкортостан

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Биологические и химические особенности, культура тканей RHODIOLA ROSEA L. и RHODIOLA IREMELICA BORISS. и возможность их интродукции в Башкортостан"

На правах рукописи УДК Б82.716.085:581.522.4

БИОЛОГИЧЕСКИЙ N ХИМИЧЕСКИЙ ОСОБЕННОСТИ, КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ

вншои яотва л одшои гшкша асжьзз, и возмокшсть их интродукций 8 вашортостан (па прймврэ г. У<1ы)

от.00.05. - Ботаника

АВТОРЕФЕРАТ данзсертации на соясканиэ ученой степени. кандидата биологических наук

Уфа - 1996

. Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Ботанического сада-институте Уфимского научного центра Российской академии наук

научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущей учреждение:

доктор биологических наук, профессор,

И.ф.Сацшторова,

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник,

Р.К.Байбуршт.

доктор биологических наук, профессор, • члэн-корреспандент академии наук Республики Башкортостан, заслушанный деятель науки Республики Башкортостан и Российской Федерации Е.В.Кучеров.

кандидат биологических наук, А.Г.Ыардампшн.

Институт биологии Коми Щ РАН. ■

Защита состоится ^СШ^си*^ 1996 г. в "¿Г" часов в 332 ауд. на заседании специализированного Совета К064130Э по за, щите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Башкирском государственном университете по адресу: 450025 г. Уфа, ул. Фрунзе 32, биологический факультет Башкирского государственного университета.

С диссертацией можно Ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан "г1996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, к. б. н. Г.Г.Кузяхмзтов

Актуальность теин. Радиола розовая {Rhodiola говеа 1.) - многолетнее равянистое растение из сем. толстянковых (Crassulaoeae DO.), арктически-мсокогорный вид, встречающийся в гора* Западной Европа, Сибири и Дальне-'о Востока. Благодаря стимулирующим и адаптогенным свойствам последние [вадцать лет используется в медицине.

В нестоящее время хищническое истребление этого вида привело к источник) растительных ресурсов в природных местообитаниях, а в ряде случаев [ к их полному исчезновению.

В последние года потребность в сырье н.rosea ежегодно возрастает, ютя использование этого вида ограничено, это связано с медленным Еэссга-ювлением подвергшихся заготовкам зарослей, которое длится 10-15 лет.

В связи с 9тим остро встал вопрос о принятии мер по охране, восста-ювлению генофонда R.rosea путем интродукция, использования методов культуры тканей и поиска близких видов, являющихся »фиктивными аналогами )того вида.

Одним из близких видов к й.говеа по химическому составу является зодаола иремэльская (Rhodiola iremelioa Borles.), которая пользуется больной популярностью в Уральском регионе в качестве лекарственного растения Í8K адаптоген. R.iremelioa истребляется в результате заготовок и так же нуждается в охране. Сведения о R.iremelioa малочисленны и отрывочны.

Цель и задачи исследования. Цель работы - разностороннее изучение R.говеа и R.iremelioa, интродуцированных в Уфу, для выяснения возможности увеличения их сырьевой базы.

Для осуществления этой цели наш были поставлены следующие задачи: I. Обобщить сведения, имеющиеся в литературе по теме диссертации. 2. Изу-' чить основные возрастные состояния и антэкологив интродуцированных растений и регенерантов, полученных методом культуры тканей. 3. Выяснить биологию развития интродуцированных растений и регенерантов я.rosea и R. ire-' melioa. 4. Выяснить возможность интродукции перечисленных видов в Башкортостан (на примере г.Уф!). 5. Разработать схему регламента клонального микроразмножения видов. 6. Провести первичную химическую и фармакологическую оценку сырья дикорастущих растений и регенерантов, полученных методом культуры тканей. 7; Выявить морфологические и химические признаки видов, ценные в таксономическом отношении.

Материалы и метода исследования. Работа выполнялась с 1990 по 1995 гг. в экспедиционных и стационарных условиях, в' лаборатории • биотехнологии Ботанического сада-института УНЦ РАН. ООьектвми исследования служили

два вида: роднила розовая (R.rosea ь.) и родиода ирамвльская (R.iremeii-оа Borles.). Самана ana видов былц собраны нами с растений в пестах естественного произрастания о 14 географических точек в районах Горного Алтая и 3 географических точек в районах Юиного Урала.

G работе использованы следующие метода: онтогенетический, анатомо-морфологический, химический, ишуда-фарментный, карнологический, культур тканей, фармакологический и статистический.

Научная новизну результатов исследования. Впервые разработан метод клонального микроразмнокения р.гоееа и R.iremelioa способом активации пазувдш меристем ростовых побегов; определено содержание эндогенных rof монов в процессе внутршрчечного развития обоих видов; использовг результаты иммуно-ферментного анализа содержания эндогенных гормонов в процессе внутрипочечного развитая для определения времени изоляции эксш та и введения его в культуру тканей, а также для подбора питательных срс на разных этапах культивирования! дана химическая характеристика сырья (корневища с корнями) и первичная фармакологическая сценка препаратов, приготовленных из сырья дикорастущих растений R.rosea и R.iremelioa и ш регенерантов, полученных методом культура тканей; установлено наличие Г биологически активных веществ в корневищах с корнями R.iremelioa; проведено сравнительное изучение развития R.rosea И R.iremelioa при их интро дукции в Башкортостан (г. Уфа).

Практическая значимость работы.Разработанный нами способ клонально •го микрор.азмножения R.rosea и R.iremelioa рекомендуем для создания при шшленных технологий. Преимущества данного метода заключаются в получек массового посадочного материала в течение короткого промежутка времеи Используя данный способ, от одного экспланта (почка,семя) в течение го, можно получить около ста особей. Морфологические и биологические особе, ности видов, представляющие таксономическую значимость, могут быть и пользованы при написании региональных флор. Предлагаем -.-спользовать сыр R.iremelioa, а также рвстений-регенерантов й.говеа и R.iremelioa, пол ченных методом культуры тканей для приготовления лечебных препаратов ст мулирущего действия.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались конференции молодых ученых (Уфа, июнь,1991), на международном симпозиу "Лесная генетика: охрана, воспроизводство и рациональное использование генетических ресурсов" (Уфа, август,1991), на научной конференции "Осо-счпшост!! акклиматизации многолетних интродуценгов, накапливают« биолог

ки активные вещества" (Краснодар, сентябрь,1995), на научной конферен-

"Биологичэеков разнообразие. Интродукция растений" (Санкт-ШтерОург, абрь,1995). Работа экспонировалась на выставках: Биотехнология "Тех

- 90" (Пловдив, Болгария,1990), "Ярмарка идей" (Уфа,1996).

Публикации. По теш диссертации опубликовано 14 робот.

Объем работы. Диссертации состоит из евздэяия, двух частей: вводной кспериментальной, выводов, списка литература и приложения. Первая часть 1ержиг 2 главы, вторая - 7. Диссертационная работа изложена но /ЙРотра-iax машинописного теиста. В списке литературы находится 292 работы, из l 27 иностранных. ■ В приложении помещено 27 таблиц и 50 рисунков.

ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

В первой части приведены краткие сведения таксономического изучения íhodiola L., которые свидетельствуют, что несмотря на то, что данный род гчался на протяжении более двух столетий, единого мнения о его самостоя-шюсти не существует. А.Г.Борисова (1939), работавшая с европейскими нами данного рода, впервые доказала самостоятельность p.Khodiola L. и целила в нем 2 секции и 5 рядов, нуда поместила и новые, описаннне ею цы, в том числе и R.irenslioa.

Ряд исследователей (Игоиина, 1966; Краснов и др., 1978; Шарафутдшюв 33; Кургаш и др., Г986; Кучеров и др., 1967; Фатхиев, 1989; и др.) сог-скы с. самостоятельностью такого вида как Hhodiola ireraelloa Boriss. Дру-я группа исследователей (¡Yebb, 1964; Горчаковский IS66, 1982; Шурова, 83; Петровский, 1984; и др.) рассматривают R.lremelioa Borles, в составе rosea ь., считают его подвидом или экологической формой.

В этой главе рассмотрены вопросы распространения, экологии, фитоценот, гйи Н.rosea и R.lrenelioa, морфологические, анатомические я химические 'иэнани данных видов. Сведения об использовании в медицине, культуре :аней, особенностях роста и развития R.lremelioa в литературе вообще от-тствуют.Кроме того, сведения о распространений R.rosea и R.iremalioa в (альском регионе, их .экологии, биологических особенностях роста и 13ВИТИЯ, а также интродукции и химическом составе носят отрывочный фвктер.

Мы считаем, что система p. Hhodiola L., предложенная А.Г. Борисовой [939, 1970), является наиболее разработанной и естественной, поэтому в зльнейшей своей работе будем ее придерживаться.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ПЕРВЫЕ ЭТАПЫ ОНТОГЕНЕЗА R.ROSEA И R.IREMELICA

В течение первых трех дет жизни исследованные вида проходят два i риода развития: латентный и прегенеративный, и вступают в третий - reí ративный. В течение этого периода времени нам удалось проследить у i шесть возрастных состояний: семена, проростки," ювенильное, имматурм виргинильное и молодое генеративное.

Латентный период. Семена мелкие, поверхность их продольно-реОрисti Вдоль всего семени тянется крыло. Масса 1000 шт. семян варьирует s лре, лах каждого вида и зависит от экологических условий произрастания, у R.rosea - от 185 до 203, у R.iremelica - от 102 до 175 мг. Форма семян меняется в пределах вида от овальной Л> яйцевидной. Окраска их варьиру< от келто-бурой (R.rosea) до темно-коричнопой (R.iremelioa). Грунтовая всхожесть семян довольно низкая: у R.rosea - 11-23 %, у R.iremelioa -2.5-27 %. Стратификация семян увеличивает их всхожесть в 2.5-6 раз, эк! генная обработка стимуляторами роста (гибберелловой кислотой и В- БДП - в концентрациях I мг/л) в 5-42 раза.

. Прегенеративный период. У обоих видов этот период длится от одно) двух и более лет. В течение первого года вегетации все особи изученш видов проходят состояние проростка и ювенильное. Проростки. Тип прорастания семян у видов - надземный. Для проростков • R.rosea и R.iremelioa характерно наличие двух'семядолей, одного укороч( юго осевого побега, несущего 1-4 зародышевых листа, голого, слегка ут< ценного гщюкотиля, стержневого корешка. Семядоли у исследованных вщ цельнокрайние, сизо-зёленого (R.rosea) и сизого (R.iremelioa) цвета, 1 решки отстоящие. Отношение длины пластинки семядолей к длине черешка R.rosea - 1.5-2, У R.iremelica - 1.2-1.4. Первые листья цельнокрайние, окраска меняется от сизо-зеленой (R.rosea) до сизой (R.iremelioa).' Bi различаются по форме пластинки первого листа: у R.rosea - округло-яй видной формы с заостренной верхушкой и оттянутым основанием, у R.ireme: - округлой формы с округлой верхушкой и округло-клиновидным основанием, Длина черешка у R.rosea превышает длину пластинки листа в I.5-I.8 раз, R.iremelica равна таковой пластинки листа.

С развертыванием листьев происходит утолщение гипокотиля и втяги-

нив его в почву. Длительность данного возрастною состояния у R.rosea 40-90 дней, у R.iremelioa - 90-120. Первый год вегетации 10 % особей iremelioa заканчивают в данном возрастном состоянии. •

Ювенильное состояние. Для данного возрастного состояния характерно разование ассимиляционных побегов. Особи этого состояния имеют один ороченный побег, несущий 1-4 зародышевых листа, 1-4 ассимиляционных по-гов, имеющих листья двух (низовой и срединной формаций1, корневища и ержневого корня. Листья газовой формации чешуевидные, треугольной формы, :стья срединной формации сидячие, цельнокрайние, у R.rosea - ланцетовид-18 с заостренной верхушкой, у R.iremelioa - округло-яйцевидно^ формы с фоким клиновидным основанием с округлой или иногда заостренной верхушкоЦ.

Длительность ювенильного состояния у обоих видов колеблется от БО юй до двух лет. Первый год вегетации в данном возрастном состоянии за-шчивают 100% особей R.rosea и 90S особей R.iremelioa, второй год ввге- . 1ЦИИ 7.4% особей R.rosea, и 3% R.iremelioa.

Ииматурчое состояние. Для особей этого возрастного состояния характер-з появление зубчатости по краям листьев срединной формации, наличие асси-шшионных побегов в количестве 1-8, корневища, стержневого корня и при- ■' аточных корней. Форма -листовой пластинки ассимиляционных побегов иссла-эванных видов различна: у R.rosea - от ланцетной до продолговатой, почти эльнокрайняя, на верхушке отклоненно-пильчатая, с несколькими зубцами, ерхушка листовой пластинки заостренная. Форма пластинки листа R.iremelioa т продолговато-яйцевидной до эллиптической с широким клиновидным основа-нем, от цельвокрайней до крупно зубчатой. Верхушка листа заостренная.

Длительность данного возрастного состояния от 90 дней до I года, торой год вегетации в этом возрастном состоянии заканчивают 26 % особей • ;.rosea И 27 % - R. iremelioa.

Виргинилъное состояние. Для'особей R,rosea и R.iremelioa, вступивших i это возрастное состояние, характерно появление наряду с ассимиляционными, истовых боковых побегов о числе 2-7 шт.

В это возрастное состояние вступают особи во второй год вегетации: >6.6 % R.rosea и 70 ж R.iremelioa. Третий год вегетации в данном состоянии оканчивают 99 % особей Г..rosea и 95 % - R.iremelioa.

Экзогенная обработка семян R.rosea и П.iremelioa стимуляторами рос ".я (гиббереллоЕой кислотой и 6-бензиламинопурином в концентрации. I мг/л) сокращает длительность прохождения возрастных состояний этими видами, уье- ■ пичивает число почек возобновления и ассимиляционных побегов в 2-3 раза,

ростовых, побегов - в 3-4 раза.

Гвцеративин® период. Молодое генеративное состояние характеризует! появлением репродуктивных побегов. У репродуктивных побегов три форма! листьев: низовые-чешуевидные, срединные - ассимилирующие, верховые - mi кие ассимилирующие, расположенные в основании соцветий.

Третий год вегетации в данном возрастном состоянии заканчивают I : особей. В.говеа и Б % - R.iremalioa.

Растения R.i-овеа и R.iremalioa, выращенные из семян, обработанных экзогенно гибберелловой. кислотой и 6-бензиламинопурином в концентращ I мг/л,вступают в генеративный период на втором году жизни: 6 % ocoi R.roeea и 7 % - R.iremelioa. К третьему году вегетации число генерати] особей увеличивается до 10 % у R,rosea И 13 % - R.iremelioa.

шэкология

В предшествующий вегетации год в почках смешанного типа закладыва; ся зачатки генеративных органов. Каждая особь имеет побеги с однотипны! половом отношении цветками. Каждый репродуктивный побег несет одно соц тие. ■

Соцветие R.rosea и R.iremelioa однотипное, монотелическое, многоц ковое, плейохазий. Щшйохазий состоит из центрального цветка и парциал соцветий. Соцветия образованы мою-, дихазием, двойным дихазием. По гу те и размерам соцветия не "однородны.

. Соцветия обоих видов различаются по подовому типу цветков и их ч лу. У н.rosea и R.iremelioa установлено наличие функционально мужски: собственно женских цветков, у R.iremelioa еще и обоеполых.

Функционально мужские цветки характеризуются хорошо развитыми тыч ками с фертильной пыльцой И пестиками с недоразвитыми семяпочками. У R.rosea цветки меньше цветоносов, у R.iremelioa они равны.

Для обоеполых цветков характерно наличие хорошо развитых тычшо] пестиков. Число пестиков чаще 4, тычинок в 2 раза больше.

В собственно ¡венских цветках отсутствуют тычинки, имеются хорошо развитие пестики. Число частей цветка кратно 4, реже 5. У основания пв тиков имеется по одному хорошо развитому нектарнику. Лепестки лгашйшэ li.rosea - туповатые в пэрхней части, R.iremelioa - с острой верхушкой Иоктаршит у R.rosea су.кгшие кверху, верхушка несколько выпуклая, у R.ireir.nlica - расширят1,.'вся кверху, с выемчатой верхушкой.

У исследованных видов цветение происходит в мае, иногда в апреле. :пускание цветков в плейохазии происходит по центробежному типу. Для »их видов характерен дневной тип распускания цветков. Всем типам свой-шнно однократное распускание венчика, относятся от к хазмогатшм иве-' ¡м.

Первыми начинают распускаться функционально мужские и обоеполые цве-I. Длительность цветения функционально мужских цветков - 2-6 дней, обое« ШХ цветков - у R.rosea 6-14 дней, у R.ireraelica - 15-24.

Собственно женские цветки распускаются на несколько дней позже функ-зна.льно мужских и обоеполых.. Продоляятвльность их цветения самая льшяя И составляет у R.rosea 15-28 дней, у R.lremelioa - 12-25.

Конец цветения сопровождается разрастанием завязи. Образуются плоди-(листовки). У R.rosea плодики 6-8 мм дл., прямостоячие,-с коротким, зло I мм дл., тонким носяком, линейно-ланцетной формы. У R.lremelioa эдаки размером 6-8 мм дл.,. ланцетные, слегка толстоватые с коротким, оло 0.5 ш дл., носиком. ' .

По способу, опыления оба вида относятся к энтомофильным растениям, новгшми опылителями являются мухи (отряд Díptera).

ОСОБЕННОСТИ РОСТА И РАЗВИТИЯ. ВИДОВ ПРИ ИХ. ИНТРОДУКЦИИ

R.rosea и R.iremslica являются видами, устойчивыми к воздействию [зких.температур почвы и воздуха. Выпада растений после перезимовки за ¡рнод наблюдений не отмечалось. Для R.rosea и' R.lremelioa характерно-1личие почек возобновления двух типов: вегетативных и смешанных, послед-ге состоят из спящих и функционирующих. Смешанные почки крупнее вегета--шных и имеют куполообразную форму. Вегетативные почки имеют конусовид-, да .(R.rosea) или округлую (R.iremelioa) форму. Все почки закрытые. Число зчечных чешуй видов различно: у R.rosea - 10, у R.lremelioa - 6 шт. Оба ада являются гемикриптофитами.

Виды обладают длительным внутрипочечним развитием (более 10 месяцев) коротким промежутком .покоя. С июня по декабрь в 'почках R.rosea и . iremelioa содержание эндогетлх гормонов (ауксинов и цитокининов) асокое, что свидетельствует о интенсивных процессах роста- и развития, роисходяиих в почках. В этот период времени в вегетативных почках проис-одиг формирование мернстематического бугорка, зачатка побега и листовых (зимордиев, а в почках смешанного типа - дифференциация соцветий. С.де-

- ю-

кабря по iзвраль почки R.rosea и R.iremelioa находятся в состоянии покоя. Содержание абсцизовой кислоты в данный период достигает своего мини мума, а вуксийов и цитокининов - максимума. В феврале в почках происходи-постепенное снижение содержания абсцизовой кислоты и стремительное накоп ленив ауксинов и цитокининов, которое к апрелю, в период таяния снега и начала надземного роста побега, достигает своего максимума.

В условиях г.Уфы R.rosea и R.iremelioa проходят полный цикл развита - к третьему году вегетации растения начинают цвести и плодоносить.,0рок наступления отдельных фенофаз у обоих видов довольно близки. Первым трогаются В рост особи R.rosea, на три-четыре дня позже - R.iremelioa Длительность вегетации у R.rosea 90-169 Дней, у R.iremelioa - 156-174 да На сроки наступления и°'прохождения отдельных фенофаз влияет не возраст растений, а погодные условия. Каркое й сухое лето (1995 г.) привело к раннему окончанию вегетации R.rosea, в аналогичных условиях особи R.iremelioa имели вторую вегетацию побегей, цвели и плодоносили.По срок распускания цветков оба вида относятся к групп® поздневесенних или ранн летних растений.

Ассимилирующие побеги обоих видов ортотропные, для них не характеры ветвление. Все побеги несут одну весенне-летнюю генерацию листьев. Кривы роста побегов у исследованных видов однотипны.

В первый год цветения реальная семенная продуктивность у R.rosea R.iremelioa на 41-537» ниже потенциальной.

У обоих видов в первые два года жизни отмечается преобладание масс надземных органов над подземными в 3-8 раз. К третьему году вегетации происходит постепенное увеличение массы подземных органов, которая у обо их видов почти одинакова и составляет 20.6-38.9 г. Наибольшим увеличени сырьевой продуктивности подземных органов характеризуются растения R.ros я R.iremelioa, выращенные из семян, обработанных экзогенно стимуляторами роста (гибборелловой кислотой и 6-бензиламинопурином в концентрациях I иг/л). Отдельные особи обоих видов данного варианта опыта к третьему год вегетации достигают 75-81 г.

КЛОНАЛЬНОЕ МИКР0РАЗМН0ШИЕ IN VITRO

Клональкое мшероразмножение представлено следующими этапами: эксп-лантирование исходной ткани ^растений. собственно микроразмножение, укор пение размноженных побогов, подготовка растений-регеизрантов к высадке

гочвешшй субстрат.

Эксплантироваще исходной ткани растений.

В данном разделе обсуждается использование трех стерилизующих раст-зоров различных концентраций и комбинаций для обработки семян и почек i.rosea и R.iremeiioa. Последовательное выдерживание эксплантов в 70 % растворе этанола, в течение I мин, в 3 % перекиси водорода в течете 5 мин и O.I % растворе диацида в течение 7 мин позволили достичь макси-лального числа жизнеспособных и неинфицированных эксплантов (94-97 % для семян, 66-68 % для почек R.rosea и R.iremeiioa) и минимального (3-5 % для семян и 25-30 % для почек R.rosea И R.iremeiioa) инфицированных. Изучение внутрипочечного развития обоих видов, анатомического и морфологического строения почек и их гормонального статуса, позволило выделить оптимальный период времени года для введения их в культуру ткани: июнь-июль и сентябрь-октябрь. Рекомендовано для эксплантирования использовать почки смешанного типа и семена.

Собственно «икрорвзышяеше.

Влитие трофических факторов питательной среда и ее консистенции. Изучено влияние минеральных солей по прописям Мурасиге и Скуга (МС), Лит— вейя с соавт., Уайта в безгормональных питательных средах и на фоне константного содержания биологически активных веществ БАЛ и ИУК ца рост пре-генеративных растетШ R.rosea и R.iremeiioa. В качестве фона использовали: I) ВАЛ (0.2 мг/л), 2) БАЛ (0.2 мг/Л) + ПУК (0.1 мг/л), 3) БАП (0.1 мг/л) + ИУК (0.05 мг/л). Для культивирования обоих видов оптимальной является питательная среда, содержащая минеральные соли по МС. Для культивирования использовали жидкие и твердыо питательные среды, содержащие разные концентрации агара. Зксплануы R.rosea, изолированные с растения^ переувлажненных мест обитания, интенсивно растут на жидкой питательной среде. Экспланты R.rosea и R.iremeiioa, изолированные с растений умеренно увлажненных мест обитатш, предпочитают питательные среда, содержащие 0,45 % агара, недостаточно увлажненных мест обитания - питательные сродц, содержащие 0.65 % агара.

Изучение морфогенетаческих потенций различных органов ювешмышх растений и изолированных почек обоих видов Н влияния гормональных факторов питательной среда. Для изучения влияния гормональных факторов исиолъ-зовали 64 варианта питательных сред, содержащих различные концентрации и комбинации стимулируилис веществ. Схема мор^югенетических потенций рпз-лич1шх органов ювепильннх растений и изолированных почек обоих видов

каллус

изолированные ^ почки

семена *>','—

ювенильньи растения

регенерация ассимиляционных

побегов

укоренившиеся ассими ционше побеги

/

формирование асс миляционных побе гов в пазухах ас симиляционных листьев

формирование чЗ-т?/! ^ с' / УК0Р81ШБШИЭСЯ микроче-ростовых побегов ---ренки ростовых побегов

Рис. Схема морфогенетических потенций изолированных почек и различных органов ювенильных растений R.rosea Ь. и R.lremellca Borlsa. в условиях культуры in.vitro.

представленц на рис.

Ювенильные растения обоих видов, выращенные из семян в культуре in vitro и изолированные почки формируют по 3 - 7 ассимиляционных побега на бёзгормональной питательной среде МС. Сегменты вегетативных побегов, содержащих 1-2 ассимиляционных листа, на среде МС, дополненной 0.2 мг/л БАЛ и 0.3 мг/л кинетина, формируют в пазухах листьев побеги.

Культивирование семядолей, черешков первых листьев, ассимиляциош листьев на среде МС, дополненной 2,4-Д и БАЛ, в концентрациях 2 мг/л, приводит к формированию плотного каллуса. Культивирование перечислены аксплангов на среде МС, содержащей НУК в концентрации I мг/л и БАП - О мг/л, способствует формированию морфогенного каллуса, последующое пассирс ванне которого на среде МС, дополненной БАП в концентрации 0.5 мг/л и Ю - О Л мг/л, приводит к регенерации мнокес.твешшх ассимиляционных побегов, Ассимиляционные листья и побеги на среде, содержащей 0.03-0.05 мг/л ИЗ или ИМК укореняются, однако корневищ не формируют.

Почки обоих видов, изолированные с растете в осенний период, характеризуются , по данным иммуно-ферментного анализа, высоким содерианш Фитогормонов, причем цитокишшн в 15-25 раз превышают содержание ауксшкн При экеллантировашш в культуру in vitro, очевидно почки нуждаются в низ-

í концентрациях гормональных факторов питательной среды. Тгк, культиви-зание почек, изолированных с растений в осенний период на среде МО, обеденной 0.1-0.2 мг/л ИУК в 86 Ж случаев приводит к формированию рыхлого, зтро пролиферирующего каллуса серого цвета. При субкультивировании ¡шый каллус легко рассыпается и благодаря этому удобен для получения спензионной культуры. г

Для индукции ростовых побегов на эксплантах, оптимальными являются зкие концентрации БАЛ 0.2 мг/л и ИУК 0.1 мг/л для R.rosea и БАП в кон-нтрации 0.1 мг/л И ИУК - 0.05 мг/л для R.iremelioa. На этих питательных едах одновременно закладываются от 3 до 5 меристечатических участков, из торых, при последующих пересадках, развиваются ростовые побеги. Отмечены зличия в формировании ростовых побегов, связанные с возрастом экспланта. ело эксплантов прегеноративиых растений обоих видов, показавших индукцию ютовых побегов в I.5-1.3 раз больше,чем эксплантов генеративных особей, ¡пользование високих концентраций БАП (0.4-1.0 мг/л) приводит к формиро-1нию измененных по габитусу ассимиляционных побегов и листьев.'

Для элонгации ассимиляционных и ростовых побегов используется без -' >рмональная питательная среда МО. В течение года культивирования от од->го экспланта можно получить около ста растений-регенерантов.

Таким образом, для обоих видов в культуре In vitro характерно: I) эолиферация рыхлого каллуса для клеточной суспензии и морфогонного нал-fса с последующей регенерацией из него ассимиляционных побегов;.2) акти-зция пазушных меристем ассимиляционных побегов; 3) активация пазушных зристем ростовых побегов. Наиболее эффективным способом клональпого мик-азмнокения обоих видов является активация пазушных меристем ростовых поэтов.

Укоренение разынояенных ростовых побегов.

Образовавшиеся в результате механического деления микрочеронки росто-ого побега, тлеющие 1-2 ассимиляционных побега быстро укореняются на итательной среде элонгации побегов. Растения-рогонеранты идентифицировали ; дикорастущими растениями R.rosea и n.iremelioa по числу хромосом. Рего-¡еранты сохраняют свойствешше виду структуру кариотипа и число хромосом.

Особенности онтогенеза видов а культуре in vitro. Ход онтогенеза в 'словиях in vitro и in vivo аналогичен, однако культивирование in vitro [риводит к исчезновению некоторих онтогенетических признаков. Различия юявляются в ювенильном состоянии. Низовые листья ассимиляционных побегов юследованных видов не отличаются от листьев сродшшой формации и из чо-

шуеввднвд превращаются щ ассимиляционные, у особей обоих видов идаатур» го состояния in vitro край листовой пластинки цельный, а в культуре' in vivo - зубчатый. В условиях культуры in vitro возрастные состояния воз можно определять по числу ассимиляционных и ростовых побегов. Прегенера тивный период in vitro сокращается до 4 - б месяцев. При высоких концен рациях гормональных факторов появляются розеточные формы растений.

Подготовка растений-регенерантов к высадке в почвенный субстрат.

Для перевода растений-регенерантов R.rosea и R.iremaiioa в почвекн условия, использовано Б вариантов почвенных смесей, состоящих из вармик: лита, дерновой почвы, песка, торфа и перегноя. Подобрана схема перевода растений-регенерацтов обоих видов из асептических .в почвенные условия культивирования, при которой уменьшается возникшее при этом стрессовое состояние. В течение двух недель регенеранты, высаженные в вермикулит,bi держиваются в камерах с повышенной влажностью воздуха (85-90 %), затем акклиматезированные растения пересаживаются в почвенный субстрат, coctoi щий из дерновой почвы, перегноя и вермикулита в соотношении 1:1:1. Благ< даря подобранной схеме нам удалось достичь 9Ь% приживаемости регенерант<

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СЫРЬЯ ДИКОРАСТУЩИХ, ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИИ И РЕГЕНЕРАНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ

Сырье (корневища с корнями), полученное от многолетних, среднево: рнстных генеративных, дикорастущих особей R.rosea И R.iremelica по морф логическим признакам однотипно. Сырье R.rosea обладает запахом розы, у сырья R.iremelioa данный запах отсутствует. Трехлетние растения-perenepi ты обоих видов по массе подземных органов равны одновозрастным растения) выращенным из семян в открытом грунте. В сырье, полученном от интродуци ровашшх растений и регенератов находится значительное количество (45-í %) придаточных корней, В сырье дикорастущих особей обоих видов - 4-10 %

Химический состав сырья дикорастущих растений обоих видов и их реп нерантов'(протеин, клетчатка, зола, кальций, фосфор), представлэн в та< Сырье дикорастущих R.rosea отличается от такового R.iremelioa повыше! шм содержанием протеина, клетчатки, золы, фосфора и пониженным содержа! ем кальция. При интродукции уменьшается содержание протеина и клетчатки но увеличивается содержите золы, кальция и фосфора. Сырье интродуциров! них особей R.rosea значительно отличается по всем компонентам от сырья > корастущих особей. Корневища и корю: регенерантов R.iremelioa по

Таблица

мический состав сырья-дикорастущих растений Н,rosea Ь. и R.lremelica Boriss. л их рэгенерантов, вырешенных в открытом- грунте

арианты опыта Протеин, % Клетчатка, % Зола, -гЛ Са, г.екв Р, г.екв

R.rosea 16.61 23.23 5.9 0 ■ 0.07 . 2.30

Регенерант

Н.rosea 9.78 14.94 7.28 4.32 2.32

Н. iremelica 1 4.54 19.49 5.Т5 0.30 . 2.07

Регенерант

R.lremelica 14.30 19.34 6.31 0.91 2.34

»держанию протеина и клетчатки равны сырью дикорастущих особей, но превн->«ю таковое то. содержанию золы, кальция й фосфора.

Исследование антиоксидантной активности сырья дикорастущих растений рэгенерантов r.rosea и R.iremelioa свидетельствует, что все образцы обдают таковой. Наибольшим значением ионольного эквивалента (325.0 мкг/ч) !ладает сырье дикорастущей R.rosea, которое в 1.47 раз превосходит сырье псорасгуцей R.iremelioa, в Э.54 раза - рэгвнэрвцта Я.rosea, в 1.40 раза -эгенеранто R.iremelioa.

Данные спектрального анализа свидетельствуют, что наибольшим ордер--анием суммы фвнолышх соединений и флэвоноидов обладает сырье дикорас-ущей R.rosea, наименьшим - ее регенерант. По данным показателям сырье лкорастущих особей и рэгенерантов R.iremelioa очэнь близки и занимают * ромекуточное положение между сырьём дикорастущих растений R.rosea и их эгенерантами.

Первичное фармакологическое изучение настоек из сырья дикорастущих .iremelica и регенерантов R.'rosea и R.iremelioa, полученных В культуре каш, показало, что они обладают аналогичным действием с препаратом, поученным из сырья дикорастущей й.rosea (Алтай, Катунский хребет). Для ис-ледовашя стимулируКщих свойств кастоек использован тест "плавание мышей о полного утомления". Длительность плавания мышей по сравнению с контро-.ем увеличилась в 2.33 раза на фоне настойки R.rosea, в 2.23 раза на фоне астоПки регенеранта R.rosea, в 1.49 раз .на фоне настойки R.lremelica, в

1.26 раз на фоне настойки регенеранта R.lremelioa, причем для трех пос ледних она показана впервые. Выявлено гонадотропное действие препаратов из сырья дикорастущих й.rosea и R.lremelioa и их регенерантов. Длительно введение (10 дней) препаратов из сырья перечисленных выше растений, непс ловозрелым мышам, приводило к раннему их половому созреванию. Число поле возрелых животных в экспериментальных группах составило от 45 до 60 %, при отсутствии их в контрольной группе.

Таким образом, сырье регенерантов п.rosea и R.iremelioa отличачтея сырья дикорастущих особей попиленным содержанием протеина, клетчатки, су мы фенолышх соединений, и повышенным содержанием золы и кальция. Сырье регенерантов обоих видов обладает аналогичными дикорастущим растениям R.rosea,но более слабыми антиоксидантными и фармакологическими свойствам Это объясняется сменой почвенно-климатических условий произрастания, воз ншших при интродукции, и разницей в возрасте интродуцированных и дикора тущих растений, использованных для полупения сырья в наших опытах.

ЗНАЧИМОСТЬ НЕКОТОРЫХ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И ДОИЧЕСКИХ

(БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА) ПРИЗНАКОВ ДЛЯ ТАКСОНОМИИ ВИДОВ

Некоторые морфологические особенности вегетативного побега и листовой пластинки. Статистической обработке подвергнуты 7 признаков, характе ризу ища. длину побега, число листьев на нем, соотношение длины побега к числу листьев на нем, длину, ширину, площадь, индекс листа. У обоих видо лист простой, с цельной пластинкой. Край листовой пластинки может менять ся от гладкого до зубчатого. Окраска листьев у R.rosea от светло-зеленой до сизой, у R.lremelioa - сизая. Форма листовой пластинки у R.rosta от ланцетовидной до продолговатой , у R.iremelioa - заостренно-эллиптическа с широким клиновидным основанием. Согласно классификации c.Raunkier (193 лист очень мелкий. Площадь листовой пластинки в среднем составляет: для R.rosea - 1.3 см2, для R.iremelioa - 2.4 см2. Длина листа превышает шири ну. По классификации И.А.Паутовой (1993), R.'rosea относится ко второй группе (индекс листа 2.7), R.iremelioa - к первой группе (индекс-листа 1.8). Побег R.rosea в среднем•длиной 24.5 см и несет 82 листа, R.íremel оа - 18.8 см, на нем насчитывается 47 листьев. Соотношение данных параме ров составляет у R.rosea 0.29-0.35, у R.iremelioa - 0.40-0.44.

Выделено две однотипных корреляционных плеяды (г>0.6) обоих видов. Одна мощностью в три признака, характеризующих площадь, длину и ширину

¡товой пластинки, другая - в два признака, характеризующих длину побега тело листьев на нем. Для плеяды листа наибольшей по значению является шмосвязь длины и площади листовой пластинки (0.907 ун.rosea, 0.891 у Lremeiioa), наименьшей - взаимосвязь длины и ширины листовой пластинки .688 у R.rosea, 0.759 у R.iremelioa). Многофакторный дисперсионный ана з по комплексу количественных признаков показывает, что обобщенное рас-эяние Ма>аледобиса между видами велико (Д=3.481), что свидетельствует о состоятельности видов.

Таким образом, дополнительными морфологическими признаками, имеющими ксономическое значение, могут быть параметры листовой пластинки и ве-тативного побега.

Биологически активные вещества, содержащиеся в корневищах. Из корне-щ с корнями R.iremelioa выделено 17 индивидуальных соединений, относим«., ; к флавоноидам, флаволиганам, фенилпропаноидам, простым фенолам, простые рпенам и стеринам. 15 соединений обнаружат в R.rosea и.R.iremelioa: >диолин, родионин, родиозин, кемферол, коричный спирт, розавин, розарин. )зин, салидрозид, .тирозол, розиридин, розиридол, р-ситостерин, даукосте-ш, галловая кислота. Для R.iremelioa присуще наличиа кофейной и п-гид-жсибензойной кислот, а также отсутствие тримина и его глюкозидов, ош-анных ранее для И.гозеа (Куркин и др., 1982). Содержание циннамилгликозп эв: розавина, розина, розарина (ведущей группы биологически активных ве-эств R.rosea) сравнительно невысокое в корневищах R.iremelioa. Ранее в эрневицах R.iremelioa данная группа фенилпропаноидов не была обнаружена Куркин и др., 1986).

ВЫВОДЫ •

1. R.rosea и R.iremelioa являются гемикриптофитами, имеют два типа ючек возобновления: смешанные и вегетативные, обладают зимостойкостью л 'словиях г.Уфа, коротким промежутком покоя и длительным внутршочечным зазвитием (около 10 месяцев), что согласуется с результатами иммуно-фер-.юнтного анализа, который показывает наличие в их почках высокого содер кания эндогэгашх гормонов (ауксинов и цигошпяшов).

2. Оба вида, интродуцировагашх в Уфу, проходят в течегаш 3-х лет кизни два периода развития: латентнгЛ и прегенеративный.и покупают в третий - генеративный.

3. ¡{.rosea начинает отличаться от й.lremeiioa с состояния ггроросткс.

форме семядолей и первых листьевj с изменением возрастных состояний, чис морфологических отличительных признаков между видами увеличивается.

4. Для й.говев характерно наличие функционально мужских а собствен женских цветков, для R.irernelioa - функционально мужских, собственно же ких и обоеполых цветков; для каждой особи характерно наличие одного тип в половом отношении цветков,

б. Цветки исследованных видов хазмогамные, характеризующиеся дневк типом распускания) продолжительность цветения цветков, относящихся к р£ ным функциональным грушам, различна; максимальная длительность цветет наблюдается у собственно женских цветков.

6. О увеличением роста растений сырьевая продуктивность (корневище корнями) интродуцированных. видов увеличивается, достигая к третьему гс жизни у R.roseai 20.6-38.9 г, у R.iremeUoa! 21,0-36.9 г. Стимуляторы роста (растворы гиббаралловой кислоты и 6-банзидаминопурина в концентра! ях I мг/л) способствуют повышению всхожести семян, изменению темпов pas вития и увеличению сырьевой продуктивности R.rosea и R.irernelioa.

7. Из корней с корневищами R.irejnelioa впервые выделено 12 индивид .альшх соединений, из которых кофейная и п-гидроксибензойная.кислоты сс катся только в данном виде; трицин и его глюкозиды, описанные ранее для R.rosea, в R.iremalioa отсутствуют.

8. Полученные нами данные по изучению морфологических (форма семя; лей, первых листьев, пластинки листа срединной формации репродуктивногс побега, особенности строения функционально мужских и собственно женсюи цветков) и химических (биологически активные вещества) признаков, а таь биологических особенностей развития, подтверждают правомерность мнения А.Г.Борисовой (19ЭЭ, 1970) р видовой самостоятельности R.irernelioa.

9. Оба вида размножаются в культуре тканей с использованием спосос активации пазушных меристем ростовых побегов; для клонирования обоих видов необходимо использовать семена и почки смешанного типа.

10. Разработанный способ клонального микроразмножения R.ronea и R. malloa позволяет получить от одного экспланта в течение года культивирс вания около ста регенерантов и может быть основой для промышлешшх тех! логий выращивания посадочного материала обоих видов.

11. Сырье R.irernelioa и регенерантов R.rosëa и R.irernelioa, получе них методом культуры тканей, можно использовать в качестве дополш1телы го источшша сырья для приготовления лечебных препаратов стимулирующе гс действия.

- iI9 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТКМВ ДИССЕРТАЦИИ:

I. Baiburlna R.K., Pficr.o »ova М.М, Biotsohnology' and re Introduction pi luoble gene pool of rare and endangered plants // Tp.4 Меящунар. коигр. ро-Срвдиземномор. отд. Меящунар. ассоц. ботан. садов."Роль ботан. садов соврем, урбаниз. мире":Тез.докл. - Тбилиси, 1991.- С.6.

г. Бикметова М.М. Размножение родиолы розовой в культуре изолирован^ х тканей // Изучение и рациональное использование природных ресурсов: З.Д0КЛ. - Уфа, 1991.- С. 70.

3. Бикметова М.М., Байбурина Р.К. Размножение in vitro родиолы розой //Генетика, селекция и биотехнология лесньи древесных и травянистых стений. Уфа, 1993.- С. 97-100.

4. Бикметова М.М., Байбурина Р.К. Воспроизводство генофонда родиолы |3овой различных популяций //Лесная генетика: охрана, воспроизводство и [циональноэ использование генетических ресурсов, в}а, 1994.- 0. 187-192.

5. Ишмуратова М.М. Особенности первых этапов онтогенеза Rhodiola »sea l.b условиях культуры in vitro и in vivo //изучение онтогенеза рас-!ний природных и культурных флор в ботанических садах Евразии: Тез. докл. Киев, 1994.- С.68-69.

6. Ишмуратова М.М., Клональное микроразмножениэ Rhodiola iremelioa >rias. in vitro //Вопросы биотехнологии. Уфа, 1995.- С. 95-99.

7. Ишмуратова М.М. Изучение первых этапов онтогенеза Ehodiola ireme-Loa Boriss. при интродукции // Экологические проблема Республики Башкор-эстан. Уфа, 1995.- С.84-85.

8. Ишмуратова М.М., Лихонос Т.А., Вахмянина Н.В. Перевод растений-, згенерантов Rhodiola irenelioa Boriss. В почвенные условия культивирова-яя и их генетическая оценка // Механизмы поддержания биологического раэ-эобразия: Тез.докл.- Екатеринбург, 1995.- С.63-64.

9. Ишмуратова М.М., Лихонос Т.А. Нэкоторые■особенности адаптации вдов р. Родиола к условиям высокогорий //Экология и охрана окружающей реды: Тез.докл. - Пермь, 1995. - С. 56-57.

10. Ишмуратова М.М. О некоторых особенностях культивирования почек hodiola rosea L. in vitro //Изучение онтогенеза- растений природных и ультурных флор в ботанических садах Евразии : Тез.докл. - Киев, 1995.. 58-59.

11. Ишмуратова М.М. Особенности некоторых этапов онтогенеза Rhodii iremelioa Boris's. в условиях культуры In vitro // Изучение онтогенеза растений природных и культурных флор в ботанических садах Евразии: Тез докл.- Киев, 1996. - С. 60-61.

12. Ишмуратова М.М. Особенности развития Rhodioia rosea L. и R.ir< melioa Boriss. при интродукции в Уфу // Биологическое разнообразие. Шг дукция растений: Тез.докл.- Санкт-Петербург, 1995.- С. I80-I8I.

13. Сацыперова И.Ф., Ишмуратова М.М., Авдеева Е.В., Куркин В.4., ! песочная Г.Г. Химический состав корневищ Rhodiol» iremelioa Boriss., т тродуцированной в Башкирии // Биологическое разнообразие. Интродукция ] тений: Тез.докл.- Сашт-Петёрбург, 1995. - С. 166-167.

14. Ишмуратова MtM.t Герчиков А.Я., Гарифуллина Г.Г., Баширова Р.1 Ишмуратов Ф.Ф. Опыт интродукции родиолы розовой и родиолы иремельской i ботаническом саду г.Уфы и первичная фармакологическая оценка их сырья //Особенности акклиматизации многолетних интродуцентой, накапливающих биологически активные вещества:Тез.докл.- Краснодар, 1995.