Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические основы накопления продуктов вторичного метаболизма - салидрозида и розавина в растениях Rhodiola rosea L.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические основы накопления продуктов вторичного метаболизма - салидрозида и розавина в растениях Rhodiola rosea L."

На правах рукописи

ЗАХОЖИЙ Илья Григорьевич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ НАКОПЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА -САЛИДРОЗИДА И РОЗАВИНА В РАСТЕНИЯХ RHODIOLA ROSEA L.

03.00.12 - «Физиология и биохимия растений»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в Лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Головко Тамара Константиновна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Николаева Любовь Алексеевна

кандидат биологических наук Паутова Ирина Анатольевна

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный

университет

Защита состоится 26 апреля 2006 г в 1на заседании диссертационного совета К 002 211 01 при Ботаническом институте им В.Л. Комарова РАН по адресу:

197376, г. Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 2. Факс: (812) 234-45-12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ботанического института им. В Л. Комарова РАН.

Автореферат разослан 24 марта 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ■

кандидат биологических наук 1/СХлД Юдина О.С.

/

аоо£А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Способность синтезировать разнообразные продукты вторичного метаболизма является уникальным свойством растений (Лункер, 1979). Вторичные метаболиты могут выполнять ряд важных функций в растениях и широко применяются человеком. Изучение влияния различных факторов внешней и внутренней природы на накопление и локализацию веществ вторичного обмена остается одной из актуальных проблем современной фитофизиологии. Важность исследований связана с необходимостью выявить механизмы регуляции и роль специализированных биосинтезов в растении.

Rhodiola rosea L. (родиола розовая) широко известна как лекарственное растение. Терапевтический эффект ее препаратов связан с гликозидами ти-розола и коричного спирта. Поэтому значительная часть работ имеет прикладной характер. Мало исследованы физиолого-биохимические факторы регуляции накопления биологически активных веществ, связь первичных и вторичных биосинтезов, их цена и роль в жизнедеятельности растений.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - изучить физиоло-го-биохимические основы накопления продуктов вторичного метаболизма в растениях родиолы розовой (Rhodiola rosea L.), выявить связь первичного и специализированного обмена веществ.

В задачи исследования входило:

1. Провести сравнительное изучение содержания гликозидов коричного спирта и тирозола в органах растений для выявления их локализа-

2. Исследовать динамику накопления салидрозида и розавина в годичном цикле растений.

3. Выявить влияние минерального питания и световых условий на накопление гликозидов коричного спирта и тирозола.

4. Проанализировать связь накопления гликозидов с содержанием в растениях неструктурных углеводов и азота.

5. Провести сравнительный анализ содержания розавина и салидрозида в культивируемых и дикорастущих растениях.

6. Усовершенствовать методику ВЭЖХ анализа гликозидов коричного спирта и тирозола в биомассе родиолы розовой.

Научная новизна. Впервые рассмотрены физиолого-биохимические основы накопления продуктов вторичного метаболизма - гликозидов коричного спирта и тирозола в растениях родиолы розовой (Rhodiola rosea L.). Предложены схемы путей биосинтеза и дана теоретическая оценка минимальных затрат органического субстрата (в эквивалентах глюкозы), необходимого для обеспечения синтеза салидрозида и розавина С-ске-летами и энергией. Доказано, что салидрозид и розавин локализуются в подземной части растений, причем концентрация гликозидов в каудексе в 1.5-2.0 раза выше, чем в корнях. Выявлена связь накопления продуктов вторичного метаболизма с ростом и развитием растений. Впервые показана корреляция накопления салидрозида в корнях и каудексе с содер-

ции.

РОС. НАЦИОНАЛЬНА,

(UCilUnTFVi

09

жанием неструктурных углеводов. Выявлено влияние внешних факторов (освещенность, минеральное питание) на накопление салидрозида и ро-завина Обоснована идея о полифункциональной роли гликозидов коричного спирта и тирозола в растениях р. розовой.

Теоретическая ценность и практическая значимость результатов Получена физиолого-биохимическая характеристика культивируемых и дикорастущих растений р. розовой. Дана количественная оценка накопления биологически активных веществ - салидрозида и розавина. Показана роль донорно-акцепторной системы в регуляции специализированных биосинтезов на уровне целостного растения. Доказана способность культивируемых растений к накоплению высоких концентраций салидрозида и роза-вина на фоне усиления ростовых процессов. Показана возможность повышения активности вторичного обмена путем применения микроэлементов Усовершенствована методика количественного анализа салидрозида и розавина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Полученные результаты могут быть использованы в селекции и интродукции р розовой, а также при разработке программ по восстановлению и рациональному использованию ресурсов этого ценного лекарственного растения Результаты исследований использованы при чтении курса «Физиология растений» и спецкурса «Экологическая физиология растений» для студентов-биологов, а также в спецкурсе «Газовая и жидкостная хроматография» для студентов- химиков Сыктывкарского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании секции физиологии и биохимии растений Русского Ботанического общества (Санкт-Петербург, 2006); IX-XII молодежных научных конференциях «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2002-2005); Международной научной конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004); II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань, 2002); II Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2005); VI Симпозиуме по фе-нольным веществам (Москва, 2004), VII Всероссийском популяционном семинаре «Методы популяционной биологии» (Сыктывкар, 2004), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005).

Работа выполнена в Лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Коми НЦ УрО РАН в период прохождения курса аспирантуры (2002-2005 гг.) и является частью плановых тем: «Физиология многолетних травянистых растений на Севере» (№ Гр 01.9.6003715) и «Физиолого-биохимические основы адаптации и репродукции растений в холодном климате» (№ Гр 01.00107254).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 15 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы и приложений, изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 24 рисунка. Список исполь-

зованной литературы включает 202 работы, из них 120 отечественных и 82 зарубежных авторов.

Благодарности. Научному руководителю д.б.н , профессору Т.К Головко. В В. Пунегову, В В. Володину и всем сотрудникам Лаборатории экологической физиологии растений ИБ Коми НЦ УрО РАН за консультации, Е И. Шубнициной, М М. Ишмуратовой, Л.В. Бугловой, Г.М.Воскобойникову за помощь в организации экспедиционных выездов Признателен Ю.М. Фролову и ИИ, Полетаевой за предоставленный растительный материал, д.фарм.н. В.А. Куркину за предоставленные стандарты салидрозида и ро-завина.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Вторичный метаболизм растений. Основные продукты вторичного метаболизма (обзор литературы)

В главе изложены и проанализированы данные литературы об основных классах веществ специализированного обмена (терпены, алкалоиды, фенольные соединения) их роли в растениях. Рассмотрены вопросы качественного и количественного состава вторичных метаболитов в растениях рода Rhodiola L. Обоснована необходимость изучения физиолого-биохи-мических основ накопления продуктов вторичного метаболизма - салидрозида и розавина в растениях Rhodiola rosea L.

Глава 2. Районы, объекты и методы исследований

Объектами служили Rhodiola rosea L., Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch, et C.A. Mey, Rhodiola iremelica Borris. Основная часть работы выполнена на дикорастущих и культивируемых растениях Rhodiola rosea L. (Craasulaseae).

Растения отбирали на Приполярном Урале в бассейне р. Кожим на высоте 200-900 м над у.м., в северной части Горного Алтая (Курайский хр.) на высоте 2500-2800 м над у м , в северо-восточной части Малоземельс-кой тундры (о. Чаячий, оз. Кузнецкое), на Кольском п-ове (о-ва Жилой и Немецкий, вблизи поселка Дальние Зеленцы) и Норвегии (морское побережье залива Varanger Fjorden). Растения р. иремельской были собраны на территории Южного Урала на горах Большой Иремель и Арвякрязь Родиолу четырехчленную собирали на Алтае (Курайский хр.).

Культивируемые растения из уральских ценопопуляций длительное время (4-10 лет) произрастали на опытных делянках вблизи г Сыктывкара (подзона средней тайги) со средне окультуренной подзолистой почвой Подкормку минеральными удобрениями проводили в дозе N90P45K45 кг д.в./га, минеральные соли (ZnSO,,, MgCI2, CuCI2, МпС12,Са(МОз)2) вносили в растворе (0.2 л/растение) с концентрациями ионов цинка, магния, меди и марганца 2 ммоль/л и 4 ммоль/л кальция. В опытах с затенением использовали марлевый полог, что не влияло на спектральный состав света.

Морфологические характеристики. Морфологическое описание проводили в период цветения-начало плодоношения растений Определяли общее количество побегов, их высоту, массу надземных и подземных органов. Учитывая статус р. розовой, как охраняемого вида, в природных цено-популяциях отбирали по 5-10 типичных особей Растения выкапывали, отмывали от почвы подземную часть и разделяли по органам. Каждое растение считали биологической повторностью. У подземных органов отделяли отмершие и сильно опробковевшие участки. Для составления проб надземной массы использовали среднюю часть стеблей и расположенных на них активно функционирующих, физиологически зрелых листьев. Отобранные растения использовали для биохимического анализа Для этого брали пробы в 2-кратной повторности из каждого растения

Биохимические характеристики. Фиксацию проб для последующего определения неструктурных углеводов и гликозидов проводили кипящим этиловым спиртом При фиксации биологического материала для определения аминокислотного состава, количества нитрат-ионов, общего азота и углерода измельченные органы в течение 10 мин. выдерживали при температуре 105°С, а затем высушивали при 80°С.

Определения гликозидов проводили на жидкостном хроматографе «Милихром-5-3» (ООО «Медикант», Россия), оснащенном спектрофотомет-рическим детектором и аналитической колонкой «Диасфер-110-С16», 2x80 мм, 6 мкм (ЗАО «БиоХимМак CT», Россия). Содержание углерода и общего азота в сухом измельченном материале измеряли на автоматическом анализаторе ANA-1500 (фирма «Cario Erba», Италия). Качественный состав и количественное содержание белковых аминокислот определяли на автоматическом анализаторе аминокислот ААА-339М («Микротех-на», Чехословакия). Растворимые углеводы определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ с модификациями (Гляд, 1999) Содержание нитрат-иона определяли калориметрическим методом (Губачек и др., 1981).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов анализов проводили с помощью приложения «Statistica 6.0» (StatSoft, Inc, USA) Обработку данных проводили методом описательной статистики. Для сравнения средних величин использовали t-критерий Стьюдента. В таблицах приведены среднеарифметические значения измеряемых величин со средней квадратической ошибкой.

Результаты и их обсуждение Глава 3. Количественное определение салидрозида и розавина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Для определения салидрозида и розавина в экстрактивных веществах подземных органов растений рода РГюс1ю1а предложен целый ряд аналитических методик (Краснов и др., 1979; Куркин и др., 1985, 1991; Кирьянов

и др., 1991; Ап а1„ 1998; Капд а1., 1998; Сш е! а1., 2003; То1опеп, 2003). Многие из них не лишены существенных недостатков.

Нами усовершенствована методика количественного хроматографичес-кого определения гликозидов. Новизна заключается в применении метода твердофазной экстракции при подготовке проб экстрактивных веществ для ВЭЖХ анализа, детектировании салидрозида по поглощению излучения с длиной волны 220 нм, использовании метода внутреннего стандарта для количественного расчета содержания гликозидов в образцах.

Образцы растительного материала (листья, стебли, корни, каудекс) фиксировали кипящим этанолом. Перед анализом фиксирующий раствор, содержащий часть гликозидов, декантировали Образцы растирали и исчерпывающе экстрагировали 70% этанолом Экстракты, объединенные с фиксирующим раствором упаривали в вакууме досуха. Аликвотную часть водного раствора экстрактивных веществ подвергали твердофазной экстракции на концентрирующих патронах. Сумму гликозидов селективно элюиро-вали с сорбента 35 % метанолом. Элюат собирали в мерную колбу и вносили раствор внутреннего стандарта ВЭЖХ анализ каждого образца проводили в 3-кратной повторности в условиях- подвижная фаза - вода-ацето-нитрил-метанол (78:11:11), скорость потока элюента 100 мкл/мин, объем вводимой пробы 3 мкл, детектирование по двум длинам волн (220 и 254 нм). Типичная хроматограмма экстрактивных веществ каудекса р. розовой приведена на рис. 1. Градуировку хроматографа проводили по серии растворов стандартных образцов гликозидов и фенола (внутренний стандарт). Градуировочные растворы с концентрациями в диапазоне 4-100 мкг/см3

Рис. 1. Хроматограмма экстрактивных веществ каудекса Rhodiola rosea. По оси абсцисс - время ВЭЖХ анализа, мин; по оси ординат - интенсивность интегрального сигнала (AU) при 220 нм (а) и при 254 нм (б) 1 - салидрозид, 2 - фенол (внутренний стандарт), 3 - розарин, 4 - розавин, 5 - розин.

готовили методом последовательного разбавления. Расчет содержания определяемых гликозидов проводили с привлечением метода внутреннего стандарта.

Глава 4.

Накопление биомассы, азотный и углеводный статус растений родиолы розовой в культуре и в природе

Сравнительные исследования показали, что культивируемые растения формировали в среднем 60±7 побегов, дикорастущие - в 5-8 раз меньше. Наибольшая высота побега (37±1 см) отмечена для растений прируслового экотопа на Приполярном Урале, наименьшая (12±1 см) у растений островного экотопа на Кольском п-ове Сырая масса генеративно зрелых растений из природных местообитаний варьировала в пределах 70-100 г. Культивируемые растения на порядок превосходили дикорастущие по общей массе Большая доля сухой биомассы растений (70-80 %) сосредоточена в подземной части, в основном в каудексе. Распределение биомассы по органам отражает донорно-акцепторные связи. У р. розовой мощной акцептирующей частью является каудекс, где происходит запасание веществ, необходимых для формирования почек возобновления и отрастания побегов Важно отметить, что величина соотношения подземные органы/надземные органы у культивируемых и дикорастущих растений одинаковая, что отражает экологическую стратегию вида. Р. розовая относится к стресс-толерантам, для которых характерен медленный рост, образование запасающих органов. Формирование мощного каудекса позволяет виду выживать в суровых условиях, характерных для современного ареала.

Условия азотного питания играют важную роль для роста и развития растений. Азотный статус существенно влияет на вторичный метаболизм (Маргна, 1990; Запрометов, 1993). По нашим данным (табл. 1) содержание азота в листья выше в 5-7 раз, чем в каудексе, и в 2.0-2.5 раза меньше, чем в стеблях. Корни мало отличались от каудекса по концентрации азота. Большая часть общего азота представлена азотом белковых аминокислот. Сравнение растений из различных частей ареала показывает, что наибольшие концентрации этого элемента были в органах р. розовой на Алтае, наименьшие - на Кольском п-ове. Промежуточное положение занимали культивируемые растения.

Опыты с внесением минеральных удобрений в дозе И^К^Р^ кг д.в./га показали, что р. розовая способна к поглощению значительных количеств азота. При этом содержание нитратного азота в стеблях и листьях возрастало в 3-5 раз, тогда как в корнях и каудексе его содержание достоверно не увеличивалось.

Углеводный статус растений имеет большое значение для процессов первичного и специализированного метаболизма. Углеводы являются источником необходимых для биосинтезов С-скелетов и энергии Наши определения показали, что у р. розовой среди неструктурных углеводов пре-

Таблица 1

Содержание общего азота (N1) и углерода (С) в растениях родиолы розовой в фазе цветения-плодоношения, мг/г сухой массы

Части растения N С С/Ы Азот аминокислот, % от общего азота

Приполярный Урал

Листья 38 9 ± 2 2 455 ±6 11 7 73

Стебли 14 3 ± 1 2 402 ± 2 28 1 62

Каудекс 5 1 ± 04 458 ±7 89 9 59

Корни 6 0 ± 0 7 471 ±5 78 3 62

Кольский п-ов

Листья 17 8 ±3 413 ±6 23 2 62

Стебли 7 4 ± 1 6 409 ±1 55 3 53

Каудекс 3 9 ± 0 3 451 ± 1 1156 55

Корни 4 5 ± 0 9 466 ± 3 101 3 53

Алтай

Листья 43 2 ±1.7 414 ±2 96 69

Стебли 25 5 ± 0 8 393 ±4 154 52

Каудекс 8 1 ±04 434 ± 2 53 6 62

Корни 8 4 ± 0 6 445 ±5 53 58

__ Норвегия____

Каудекс | 46±0 1 [ 436 ±3 | 94 7 | 43

Листья 26 ±11 440 ±7 169 71

Стебли 11 ± 1 409 ± 1 37 2 59

Каудекс 4 7 ± 0 4 442 ± 14 94 0 57

Корни 4 7 ± 0 5 467 ± 5 99 4 56

обладают моносахариды, в основном глюкоза. Так, у растений на Приполярном Урале величина соотношения моносахариды/дисахариды варьировала от 4 (корни) до 28 (стебли). У культивируемых растений органы меньше отличались по этому показателю: от 1.2 (листья) до 5.4 (стебли). Среди дисахаридов преобладает сахароза. Олигосахариды представлены только одним углеводом - раффинозой. Дикорастущие растения мало отличались от культивируемых по накоплению фонда растворимых углеводов в подземных органах, но уступали по содержание Сахаров в надземных органах. Величина общего пула Сахаров в корнях и каудексе сильно изменялась в годичном цикле растений, максимальные значения отмечены после завершения вегетационного периода, минимальные - в фазе цветения-плодоношения (табл. 2).

Таблица 2

Содержание растворимых углеводов в подземных органах культивируемых растений родиолы розовой в зависимости от фазы развития, мг/г сухой массы (п=6)

Фаза Моносахариды Дисахариды Олигосахариды Сумма Сахаров

(дата отбора) каудекс корни каудекс корни каудекс корни каудекс корни

1 (17 05 04) 90±9 75±22 15±3 16 ±5 - - 106 ±11 92±24

2(11 06.04) 64±8 47±9 14±5 9±2 - - 78±12 56±11

3 (03 08 04) 19±2 16±2 14±1 10+1 0 4 ±0 2 0 5±0 1 33±3 26 ±3

4(1511 04) 125±7 107±6 20±2 20 ±2 1 5±0 9 1 5±0 4 147±10 128±5

Примечание 1 - отрастание побегов, 2 - цветение-начало плодоношения, 3 -созревание семян, 4 - переход растений в состояние покоя, прочерк - отсутствие вещества.

Таким образом, нами показано, что основная часть биомассы генеративно зрелых растений локализуется в подземных органах, преимущественно каудексе В течение вегетации роль подземной части в донорно-акцеп-торной системе р. розовой изменялась. Весной при возобновлении роста подземные органы служат донором углеводов для формирования побегов В период репродукции каудекс и корни уступают генеративным органам по акцептирующей способности Интенсивный отток и запасание углеводов в подземной части начинается лишь после созревания семян. Эти изменения отражают экологическую стратегию данного вида

Глава 5.

Содержание гликозидов в растениях родиолы розовой

Сведения о содержании салидрозида и розавина в р. розовой многочисленны и противоречивы (Ким, 1976, 1998; Казаринова и др., 1975; Суров и др., 1981; Кирьянов и др., 1989; Куркин и др., 1989; Ким, Некратова и др., 1992; Саратиков, Краснов, 2004). Исследователи до сих пор не пришли к единому мнению о локализации и активности специализированных биосинтезов, характере сезонных изменений содержания гликозидов, изменчивости накопления этих веществ у дикорастущих и культивируемых растений.

Нами проведены детальные сравнительные исследования содержания салидрозида и розавина в органах дикорастущих и культивируемых растений. Выполненные с использованием единой методики определения показали наличие гликозидов только в корнях и каудексе. Присутствия розавина и салидрозида в надземных органах (стебли, листья, соцветия, семена) не было выявлено ни в одном случае.

В период цветение - начало плодоношения у всех исследованных образцов каудекс превосходил корни по накоплению гликозидов (табл. 3). В

Таблица 3

Содержание салидрозида и розавина в подземных органах дикорастущих и культивируемых растений родиолы розовой в фазе цветение-плодоношение, мг/г сухой массы

Образец Сап и/] розид Розавин Сумма гликозидов

каудекс корни каудекс корни каудекс корни

1 15 6±3 6 5 9±2 3 31 7±1 3 14 8±4 9 47 3 20 7

2 15 4±1 4 4 7±1 2 22 5±3 4 17 3±3 7 37 9 22 0

3 19 7±1 6 9 5±0 5 18 4±1 8 8 6±0 2 38 1 18 1

4 8 9±1 5 7.1±2 5 17.6±3 0 8.1±1.8 26 5 152

5 10 5±1 7 9 9±0.3 25 0±1 9 14 9±0 9 35 5 24 8

6 13 5±2 2 7 6±0 6 12 8±1 2 7 4±0 8 26 3 150

7 13 3±2 1 - 14 8±2 - 281 -

8 19 9±1 5 - 9.8±0 7 - 29 7 -

9 11 9±4 1 2 2±2 2 24 0±5 4 16 5±3 9 35 9 18 7

Примечание: 1, 2, 3 - растения Приполярного Урала с субальпийского, прируслового и наскального экотопов соответственно, 4 и 5 - алтайские растения из горной тундры и альпийского луга; 6 - растения Кольского п-ова из островного экотопа; 7 - растения Малоземельной тундры из островного экотопа; 8 - растения наскального экотопа из Норвегии; 9 - растения, культивируемые на опытных делянках (Сыктывкар) Прочерк означает, что измерения не проводились

большинстве случаев в каудексе содержалось в 1.5-2 3 раза больше роза-вина, чем салидрозида. В корнях прослеживается эта же закономерность Содержание суммы гликозидов варьировало в зависимости от образца в каудексе от 26 до 47 мг/г сухой массы, в корнях от 15 до 25 мг/г сухой массы.

Растения из различных мест произрастания существенно отличались по накоплению индивидуальных гликозидов Содержание салидрозида в каудексе растений изменялось от 9 до 20 мг/г сухой массы Наибольшим накоплением этого гликозида характеризовались растения, произрастающие на скалах на побережье Баренцева моря (Норвегия), а также уральские растения, произрастающие на обнажениях коренных пород с незначительным почвенным слоем. Минимальное содержание салидрозида выявлено в алтайских растениях. Наибольшее содержание розавина (32 мг/г) было выявлено в каудексе растений субальпийского экотопа на Приполярном Урале, наименьшее (10-12 мг/г) - в растениях, произрастающих на островах и побережье Баренцева моря. Культивируемые растения не уступали по накоплению розавина дикорастущим растениям.

Нами выявлены отличия в накоплении гликозидов растениями разных экотопов. Так, на Приполярном Урале в каудексе растений, произрастающих в разломах и на уступах скал, накапливается больше салидрозида, но эти растения характеризовались низким содержанием розавина, в 1.5-2 раза меньше, чем в растениях прируслового и субальпийского экотопов. Имеет место существенная вариабельность в накоплении гликозидов и в растениях из одного экотопа. Ранжирование растений Приполярного Урала из различных местообитаний показало, что наиболее многочисленной (около 50% от общего количества) оказалась группа с содержанием салидрозида в каудексе 10-20 мг/г. Доля растений с содержанием салидрозида в пределах 20 - 30 мг/г была вдвое меньше. Количество растений с более высокой продуктивностью салидрозида в общей выборке оказалось небольшим (5%). Растения с высоким содержанием розавина (25-35 мг/г) составляли около 50%, со средним (15-25 мг/г) - 35%, с очень низким (меньше 10 мг/г) - 5% от объема выборки (п=42).

Считается, что гликозиды коричного спирта, и в частности розавин, являются отличительным хемотаксономическим признаком р. розовой (Кур-кин и др., 1986). Однако в последнее время в литературе появились сведения о присутствии данного гликозида и в других видах рода Rhodiola L. Наши результаты подтвердили данные (Сацыперова, Ишмуратова, Авдеева и др., 1995) о наличии розавина в каудексе Rhodiola iremelica Boriss. Концентрация салидрозида и розавина в каудексе растений составляла 7.1 ± 2.4 и 15.3±2.9 мг/г соответственно. В подземной части Rhodiola quadrifida (Pall.) Fisch, et C.A. Mey. розавин нами не обнаружен, а содержание салидрозида было около 10 мг/г сухой массы.

Детальный анализ сезонных изменений содержания салидрозида и розавина был выполнен нами на культивируемых растениях Для проведения биохимических анализов растения отбирали четыре раза: от ранневе-сеннего отрастания побегов (начало мая) до перехода в покой поздней осенью (середина ноября). Как видно из данных (рис. 2), каудекс превы-

12 12 12 12 □ саледрозцд ■ розавин

Рис. 2. Сезонная динамика накопления гликозидов в подземных органах культивируемых растений родиолы розовой. А - весеннее отрастание побегов, Б - цветение-начало плодоношения, В - созревание семян, Г -переход растений в состояние покоя; 1 - каудекс, 2 - корни.

шал корни по содержанию отдельных гликозидов и их сумме. В целом, подземные органы накапливали больше розавина, чем салидрозида. Содержание салидрозида в каудексе и корнях было значительно выше в начале и после завершения вегетации растений. Во время цветения и плодоношения концентрация салидрозида снижалась в каудексе в 1.7 раза, а в корнях - в 2.5 раза. Содержание розавина в каудексе и корнях в течение вегетационного периода варьировало существенно меньше.

Опыты по влиянию минерального питания и затенения были выполнены на более молодых (4-летних), вегетативно размноженных растениях. Внесение минеральных удобрений (№К) не вызвало достоверных изменений накопления гликозидов в каудексе растений (табл. 4). Добавка макро- и микроэлементов приводила к повышению содержания розавина почти в 1 5 раза. Выявлен положительный эффект затенения на содержание гликозидов. Снижение освещенности на 40 % приводило к существенному, более чем в 2 раза, увеличению содержания салидрозида в каудексе растений. Суммарное содержание гликозидов при затенении увеличилось в 1.7 раза.

Таблица 4

Влияние минеральных удобрений, микроэлементов и затенения на содержание салидрозида и розавина в каудексе культивируемых растений родиолы розовой, мг/г сухой массы

Варианты Салидрозид Розавин Сумма гликозидов Розавин/Салидрозид

Контроль 10 1 ±07 13 8 ± 1 1 23 9 14

Добавка макроэлементов 8 0 ± 1 1 19 2 ± 2 4 27 2 24

Добавка микроэлементов 9 0 ± 2 1 19 7 ± 2 1* 28 7 22

Притенение 22 2 ± 3.4* 18 1 ±27 40.3 08

* - различия между контролем и опытом достоверны на уровне р 5 0 05.

Итак, гликозиды содержали только подземные органы растений, кау-декс превышал корни по их накоплению. Показано наличие сезонных изменений содержания суммы гликозидов, обусловленных значительным уменьшением содержания салидрозида в период репродуктивного развития растений. Положительный эффект на накопление гликозидов оказывали дополнительное внесение макро- и микроэлементов и затенение.

Глава 6.

Физиолого-биохимические аспекты регуляции специализированного метаболизма в растениях родиолы розовой (обсуждение результатов)

Связь первичного и специализированного обмена веществ. Углеводы находятся в основании метаболических цепей, ведущих к образованию всего богатства синтезируемых растениями соединений. Они являются источником углеродных скелетов биомолекул и поставщиком энергии, необходимой для биосинтетических процессов Анализ данных, представленных в главах 4 и 5, указывает на сходство динамики изменения содержания неструктурных углеводов и салидрозида в культивируемых растениях р. розовой. Ранней весной, в начале периода отрастания побегов в подземных органах выявлено относительно высокое содержание углеводов; их уровень заметно уменьшается в период активной вегетации и достигает минимума к созреванию семян. В конце вегетационного периода, когда растения переходят в состояние покоя, содержание Сахаров резко возрастало, достигая максимальных величин. Динамика содержания салидрозида носила такой же характер: с минимумом в период созревания семян и максимумом при переходе растений в состояние покоя. Регрессионный анализ (рис. 3) свидетельствует о высокой корреляции между содержани-

30

I25

0

§. 20 ч

1 15 10

5 0

Я2 = 0,73

■ каудекс а корни 2 -- 0,85

150 200

углеводы, мг/г

Рис. 3. Взаимосвязь содержания неструктурных углеводов и салидрозида в подземных органах культивируемых растений родиолы розовой.

ем Сахаров и салидрозида в каудексе и корнях растений. Тот факт, что минимум накопления салидрозида совпадал по времени с уменьшением фонда растворимых углеводов, и оба события отмечались в период цветения-плодоношения, по нашему мнению свидетельствует о роли донорно-акцепторных отношений в регуляции вторичных биосинтезов на уровне целостного растения. В период репродуктивного развития формирующиеся семена занимают ведущее положение в иерархии акцепторов углерода, что подтверждают ранее полученные данные (Далькэ, 2002; Далькэ, Головко, 2005).

На фоне выраженных изменений фонда растворимых Сахаров содержание розавина - гликозида коричного спирта, в корнях и каудексе колебалось незначительно. По-видимому, синтез розавина контролируется другими факторами.

Наряду с углеводами, на интенсивность первичного и специализированного метаболизма растений, а также распределение пула углерода существенное влияние оказывает азотный статус растений. Показано, что общий поток синтезированных по шикиматному пути ароматических аминокислот распределяется между белками и вторичными метаболитами (Маргна, 1990) В литературе имеется множество сведений о влиянии обеспеченности растений азотом на накопление фенольных соединений (Wilson, Marron, 1978; Маргна, 1990; Tom et al., 1991; Hakulinen, 1998; Bensaddek et al., 2001; Keski-Saari, Julkunen-Tiitto, 2003). Как правило, интенсивность образования фенолов в клетках и тканях растения легко модифицируется условиями азотного питания: недостаток азота активирует, а повышенные дозы азота снижает их биосинтез.

Исследования азотного статуса растений р. розовой показали, что в поземных органах концентрация общего азота сравнительно невысокая -от 4 до 9 мг/г сухой массы, больше половины азота входит в состав аминокислот белковой фракции. Анализ данных не выявил значимой связи между накоплением суммы гликозидов (R2 = 0.16), салидрозида (R2 = 0.25), розавина (R2 = 0.35) и содержанием азота в дикорастущих и культивируемых растениях.

Согласно (Porsild, 1957; Бреслина, 1979) р. розовая относится к нитро-филам. Полученные нами данные указывают на способность культивируемых растений реагировать увеличением содержания общего азота в биомассе на внесение сравнительно высоких доз азотных удобрений. Корни и каудекс более успешно включали поглощенный азот в состав белков и не накапливали его в виде нитрата, тогда как в листьях содержание нитрата существенно повышалось. Возможно, это связано с осмотической функцией нитрат-иона.

Внесение дополнительного азота в наших опытах не оказало существенного эффекта на накопление гликозидов, отмечали тенденцию к увеличению содержания розавина. При добавке растворов солей Си, Mn, Zn и Mg и Ca в почву у опытных растений достоверно увеличивалось содержание розавина, а содержание салидрозида несколько снижалось. По-видимому, подкормка микроэлементами вызывает активацию ферментных сис-

тем, ответственных за синтез коричной кислоты и ее производных, не изменяя существенно количество тирозина, расходуемое на синтез тирозо-ла Происходит перераспределение ароматических аминокислот между двумя возможными путями их включения в продукты специализированного обмена (коричная кислота и тирозол) Об этом свидетельствует соотношение количества розавина и салидрозида: в опыте оно равно 2 4, а в контроле - 1.3 Подкормка минеральными удобрениями может оказаться полезным приемом при культивировании р. розовой, так как приводит к интенсификации роста и развития, накоплению большей биомассы, а следовательно, повышает выход лекарственного сырья с единицы площади. Это согласуется с данными (Yan et al, 2004) по применению минеральных удобрений для увеличения выхода лекарственного сырья при культивировании р. сахалинской.

Цена биосинтезов гликозидов коричного спирта и тирозопа. По нашим данным концентрация гликозидов - салидрозида и розавина в подземных органах р. розовой варьирует в широких пределах и может достигать 5% сухой массы (табл. 3). Накопление гликозидов сопряжено с затратами энергии и субстрата на их биосинтез. Опираясь на предложенные ранее (Penning de Vries et al, 1974) принципы оценки субстратной и энергетической стоимости компонентов растительной биомассы, мы определили теоретическую величину затрат на биосинтез гликозидов коричного спирта и тирозола. Для этого нам пришлось сначала разработать возможные схемы биосинтеза данных веществ (рис 4).

Основываясь на данных схемах и принципах теоретического расчета цены биосинтеза (Penning de Vries et al., 1974; Lambers, Rychter, 1989), мы получили величины, характеризующие минимальные затраты на образо-

А

Глюкоза

| Салидвотд н^-|"тирозол

S

Гидроксифенилпируват

Гидроксифенилацетальдегид | Рис. 4. Схемы биосинтеза розавина (А) и салидрозида (Б).

вание продуктов специализированного метаболизма. Подробно расчеты приведены в диссертационной работе. Согласно нашим данным минимальные затраты субстрата (глюкозы) на биосинтез розавина и салидро-зида составляют 1.69 и 1.85 г глюкозы/г продукта соответственно. Среди продуктов специализированного обмена наиболее дорогостоящими (3.53.7 г глюкозы/г продукта) являются терпены и монотерпены (Merino et al., 1984; Lambers, Rychter, 1989). Гликозиды коричного спирта и тирозола занимают положение, близкое к цианогенным гликозидам (1.98 г глюкозы/г продукта, по Merino et al., 1984). Следует особо отметить, что данные по субстратной стоимости гликозидов и указанных выше продуктов специализированного обмена не учитывают затрат на формирование и содержание соответствующих ферментных комплексов, необходимых для их синтеза, а также затраты на транспортировку исходного субстрата и конечных продуктов и поэтому характеризуют минимальные затраты. По нашим данным минимальное количество глюкозы, необходимое для синтеза суммы гликозидов, составляет 4-8 % сухой массы подземных органов. Следовательно, специализированный метаболизм является достаточно значительным биохимическим акцептором углерода, ассимилированного растениями в процессе фотосинтеза.

Локализация и возможная биологическая роль гликозидов коричного спирта и тирозола. Локализация вторичных метаболитов в органах и тканях тесно связана с их ролью для растений. Фенольные соединения защищают растения от фитофагов (Harborne, Mabry, 1982; Запрометов, 1993; Konga et al., 2003), участвуют в защите фотосинтетического аппарата и наследственного аппарата от повреждающего воздействия УФ-радиации (Murphy et al., 1979; Teramura, 1983; Liansen, White, 1998; Marcel et al., 2001; Tegelberg et al., 2001; Загоскина, 2003; Dennis et al., 2003; Teklemariam, Blake, 2004; Ебрахим, 2005). Наши исследования показали, что салидро-зид и розавин локализуются в подземной части р. розовой - корнях и кау-дексе Одной из возможных функций данных веществ может являться их участие в образовании лигнина и суберина. Салирозид и его агликон тиро-зол могут вступать в процессы конденсации с другими фенольными соединениями, молекулами целлюлозных и гемицеллюлозных волокон. При нарушении целостности клеточной стенки розавин быстро гидролизуется (Куркин, 1996) с образованием углеводного остатка и коричного спирта -активного предшественника п-кумарового, кониферилового, синапового спиртов и соответстующих им фенолокислот. Указанные продукты могут активно вовлекаться в синтез лигнина в реакциях окислительной полимеризации Коричный спирт и продукты его окисления участвуют в процессе создания трехмерной структуры лигнина (Запрометов, 1993) Это имеет важное значение при вегетативном размножении р. розовой путем разламывания или партикуляции корневища, что часто наблюдается в природных условиях (Фролов, Полетаева, 1998).

Природные условия в местах произрастания р. розовой отличаются суровым климатом. В течение вегетационного периода растения претерпевают значительные сезонные и суточные перепады температуры, в усло-

виях высокогорий испытывают воздействие жесткого УФ-излучения Показано, что салидрозид и производные коричного спирта проявляют антиок-сидантные свойства (Ишмуратова, 2005) Это означает, что гликозиды коричного спирта и тирозола могут участвовать в процессах детоксикации активных форм кислорода, образующихся при действии биотических и абиотических стрессоров, а следовательно, играют важную роль в адаптации растений к неблагоприятным условиям произрастания. Другой функцией этих веществ может являться защита растения от патогенов и фитофагов. За время проведения исследований культивируемых и дикорастущих растений р. розовой нами не были отмечены повреждения подземных органов насекомыми или животными.

К возможным функциям гликозидов коричного спирта и тирозола следует отнести и экорегуляторную Согласно нашим наблюдениям и данным (Фролов, Полетаева, 1998; Ишмуратова, 2005) в местах естественного произрастания возобновление р розовой и р иремельской не происходит на почвенных субстратах, содержащих отмершие остатки корней и каудекса, в которых сохраняется довольно высокое содержание салидрозида (Некратова и др., 1992) Вероятно, эти вещества определяют фитогенное поле растений. Однако данный вопрос требует дальнейших исследований.

Суммируя сказанное, логично заключить, что гликозиды коричного спирта и тирозола выполняют в растениях не какую-либо одну, строго определенную функцию, а являются полифункциональными соединениями.

Выводы

1. На большом материале из географически удаленных точек природного ареала и культивируемых растениях установлено, что продукты специализированного метаболизма - салидрозид и розавин накапливаются в подземной части родиолы розовой, при этом концентрация гликозидов в кау-дексе в 1.5-2 раза выше, чем в корнях. Ни в одном случае не обнаружили присутствия этих веществ в надземных органах - листьях, стеблях, семенах.

2. Выявлена высокая вариабельность содержания гликозидов коричного спирта и тирозола в дикорастущих и культивируемых растениях В фазе цветения концентрация салидрозида и розавина в каудексе растений, обитающих на Приполярном Урале, колебалась от 5 до 37 мг/г и от 9 до 35 мг/г сухой массы соответственно. Подземные органы родиолы розовой уральского происхождения, культивируемой в подзоне средней тайги, содержали гликозиды в сопоставимых с дикорастущими растениями концентрациях

3 Выявлена связь накопления продуктов вторичного метаболизма с ростом и развитием растений. Наибольшие концентрации суммы гликозидов в каудексе отмечены в период завершения вегетации растений осенью и в начале весеннего возобновления роста, наименьшие - в период цветения-плодоношения. Накопление салидрозида в корнях и каудексе тесно коррелировало с содержанием неструктурных углеводов. Минимум накопления салидрозида совпадал по времени с уменьшением фонда

растворимых углеводов и оба события наблюдались в период репродуктивного развития, что свидетельствует о роли донорно-акцепторных отношений в регуляции вторичных биосинтезов на уровне целого растения.

4. Выявлено влияние затенения и обеспеченности растений минеральными элементами на накопление продуктов специализированных биосинтезов - гликозидов коричного спирта и тирозола. При 40% затенении отмечали двукратное увеличение содержания салидрозида в каудексе растений. Подкормка солями Zn, Си, Mn, Mg и Ca стимулировала накопление розавина, но не оказала существенного влияние на содержание салидрозида.

5 Разработаны схемы биосинтеза и дана теоретическая оценка минимальных затрат органического субстрата, необходимого для продуцирования гликозидов. Затраты на синтез 1 г розавина и 1 г салидрозида эквивалентны 1.69 и 1.85 г глюкозы соответственно. Минимальное количество глюкозы, необходимое для синтеза суммы гликозидов, достигает 8% сухой массы подземных органов.

6. Усовершенствована методика количественного определения гликозидов коричного спирта и тирозола в растительных образцах родиолы розовой. Новизна методики заключается в оптимизации спектрального режима анализа, применении твердофазной экстракции при подготовке проб экстрактивных веществ для ВЭЖХ анализа и использовании фенола в качестве внутреннего стандарта.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Патов С.А, Захожий И.Г., Пунвгов В.В., Кучин A.B., Кодесс М.И. Выделение гликозидов Rhodiola rosea L. с помощью обращеннофазовой хроматографии и встречный синтез салидрозида // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения, 2002. N87. - С. 85-87.

2 Патов СЛ., Захожий И.Г., Пунегов В.В. Кучин A.B., Кодесс М.И. Выделение гликозидов Rhodiola rosea L. с помощью обращеннофазовой хроматографии и встречный синтез салидрозида // Химия и технология растительных веществ: Матер II Всерос. конф Казань, 2002. - С. 3-4.

3. Захожий И.Г. Гликозиды корней Rhodiola rosea L. как объекты аналитического определения методом ВЭЖХ // Актуальные проблемы биологии и экологии: Тез. докл. IX молодежи, науч. конф. Сыктывкар, 2002. - С. 52.

4. Захожий И.Г. Обращенно-фазовая хроматография как метод препаративного выделения и количественного определения гликозидов Rhodiola rosea L. II Исследования студентов - экономике, производству, образованию: Тез. докл. межвуз. студ. науч.-практ. конф Сыктывкар, 2002. - С. 63.

5. Захожий И.Г., Пунегов В.В., Куликова Н.П. Об эффективности метода твердофазной экстракции при подготовке проб препаратов Rhodiola rosea L. для ВЭЖХ анализа гликозидов //Аналитические приборы: Тез. докл. I Всерос. конф., СПб., 2002. - С. 177.

6. Далькэ И.В., Захожий И.Г. Морфофизиологическая и биохимическая характеристика Rhodiola rosea L. в местах естественного произрастания

на Приполярном Урале // Актуальные проблемы биологии и экологии- Матер. X молодежи, науч конф Сыктывкар, 2003. - С. 67-69.

7. Захожий И.Г., Чупрова Ю.В. Сравнительное изучение содержания и состава неструктурных углеводов в растениях Rhodiola rosea L. из мест естественного произрастания и культивируемых в условиях средней тайги // Актуальные проблемы биологии и экологии' Матер. XI молодежи, науч. конф. Сыктывкар, 2004. - С. 100-101.

8. Гоповко Т.К., Дапькэ И.В., Захожий И.Г., Табапенкова Г.Н. Морфофи-"* зиологические и биохимические характеристики растений Rhodiola rosea L

из разных ценопопуляций на Европейском Севере // Методы популяцион-ной биологии: Матер. VII Всероссийского популяционного семинара. Сык-<■ тывкар, 2004. Ч. 1.-С.47.

9 Захожий И.Г. Новая методика количественного определения глико-зидов тирозола и коричного спирта в растениях рода Rhodiola L. // Актуальные проблемы биологии и экологиии: Матер. XI молодежи, науч. конф. Сыктывкар, 2004. - С. 98.

10 Захожий И.Г. Метод внутреннего стандарта для количественного определения фенилпропаноидных гликозидов Rhodiola rosea L. с помощью ВЭЖХ // Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений: Матер. Междунар. науч. конф. Саранск, 2004. - С. 102-103.

11 Захожий ИГ Твердофазная экстракция как этап подготовки проб экстрактивных веществ Rhodiola L. для ВЭЖХ анализа циннамилгликози-дов и салидрозида: Тез. докл.\/1 симпозиума по фенольным соединениям. М., 2004.-С 97.

12. Головко Т.К., Дальке И.В., Бачаров Д.С., Бабак Т.В., Захожий И.Г.

' Экофизиология представителей сем. толстянковых (Crassulaceae DC.) на

Севере. Сыктывкар, 2005 - 40 с. (Научные доклады/ Коми научный центр УрО РАН, Вып. 474)

13. Захожий И.Г. Содержание салидрозида и розавина в растениях Rhodiola rosea L при культивировании в условиях подзоны средней тайги // Актуальные проблемы биологии и экологиии: Матер XII молодежи, науч. конф. Сыктывкар, 2005. - С. 50-51.

14. Захожий И Г, Головко Т.К. Состав и содержание биологически активных веществ Rhodiola rosea L. в природе и культуре на Европейском

' Севере // Новые достижения в химии и технологии растительного сырья:

Матер. II Всероссийской конф. Барнаул, 2005. Кн. 2. С. -401-405. ■J 15. Головко Т.К., Дальке И.В., Бачаров Д.С., Дымова О.В., Захожий И.Г.

1 Эколого-физиологические исследования растений на Севере и сохране-

ние биоразнообразия // Физиологические и молекулярно-генетические к аспекты сохранения биоразнообразия: Тез. докл. межд. конф. Вологда,

2005 - С. 47.

»2- 60 44

Тираж 110 Заказ 15(06)

Информационно-издательская группа Института биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28

<

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захожий, Илья Григорьевич

Введение

Глава 1. Вторичный метаболизм растений. Основные продукты вторичного метаболизма (обзор литературы)

1.1. Общие представления о вторичном метаболизме растений. Биологическая и экологическая роль

1.2. Основные группы вторичных метаболитов - терпеноиды, фенольные и азотсодержащие соединения

1.3. Связь первичного и вторичного метаболизма. Основные пути биосинтеза продуктов вторичного метаболизма, их локализация в 21 растениях

1.4. Родиола розовая (Rhodiola rosea L., Crassulaceae DC.) как продуцент биологически активных соединений

Глава 2. Районы, объекты и методы исследований

2.1. Объекты исследований

2.2. Районы исследований и условия произрастания растений

2.3. Методы исследований

Глава 3. Количественное определение салидрозида и розавина методом выскоэффективной жидкостной хроматографии

Глава 4. Накопление биомассы, азотный и углеводный статус растений ^ родиолы розовой в культуре и в природе

4.1. Накопление и распределение биомассы по органам растений

4.2. Содержание азота и углерода в надземных и подземных органах ^ растений

4.3. Содержание неструктурных углеводов в органах растений

Глава 5. Содержание гликозидов в растениях родиолы розовой

5.1. Сравнительный анализ содержания салидрозида и розавина в g4 дикорастущих и культивируемых растениях

5.2. Сезонная динамика содержания салидрозида и розавина в подземных органах культивируемых растений

5.3. Влияние минерального питания и световых условий на накопление гликозидов

Глава 6. Физиолого-биохимические аспекты регуляции специализированного метаболизма в растениях родиолы розовой обсуждение результатов)

6.1. Связь первичного и специализированного обмена веществ

6.2. Цена биосинтезов гликозидов коричного спирта и тирозола

6.3. Локализация и возможная биологическая роль гликозидов ^ коричного спирта и тирозола в растениях родиолы розовой

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиолого-биохимические основы накопления продуктов вторичного метаболизма - салидрозида и розавина в растениях Rhodiola rosea L."

Актуальность темы

Способность синтезировать и накапливать разнообразные продукты вторичного метаболизма является уникальным свойством растений, отличающим их от микроорганизмов и животных. Продукты специализированного обмена веществ выполняют ряд важных функций, связанных с защитой растений от различных неблагоприятных факторов окружающей среды, участвуют в размножении растений, вовлекаются во взаимоотношения растений между собой и с окружающей средой. Многие вторичные метаболиты нашли широкое применение в хозяйственной деятельности человека. Изучение влияния различных факторов внешней и внутренней природы на накопление и локализацию веществ вторичного обмена остается одной из актуальных проблем современной фитофизиологии. Важность таких исследований обусловлена необходимостью выявить механизмы регуляции специализированных биосинтезов, роль вторичных метаболитов в растении и их экологическое значение.

Rhodiola rosea L. (родиола розовая) - ценное лекарственное растение, широко используется в медицине. Терапевтический эффект препаратов родиолы розовой обуславливают гликозиды тирозола и коричного спирта (вещества специализированного обмена веществ по шикиматному пути). Значительная часть работ, выполненных на данном растении, носит прикладной характер. Мало исследованы физиолого-биохимические факторы регуляции накопления биологически активных веществ, связь первичных и вторичных биосинтезов, их цена и роль в жизнедеятельности растений.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - изучить физиолого-биохимические основы накопления продуктов вторичного метаболизма в растениях родиолы розовой {Rhodiola rosea L.), выявить связь первичного и специализированного обмена веществ.

В задачи исследования входило: 1. Провести сравнительное изучение содержания гликозидов коричного спирта и тирозола в органах растений для выявления их локализации.

2. Исследовать динамику накопления салидрозида и розавина в годичном цикле растений.

3. Выявить влияние минерального питания и световых условий на накопление гликозидов коричного спирта и тирозола.

4. Проанализировать связь накопления гликозидов с содержанием в растениях неструктурных углеводов и азота.

5. Провести сравнительный анализ содержания розавина и салидрозида в культивируемых и дикорастущих растениях.

6. Усовершенствовать методику ВЭЖХ анализа гликозидов коричного спирта и тирозола в биомассе родиолы розовой.

Научная новизна

Впервые рассмотрены физиолого-биохимические основы накопления продуктов вторичного метаболизма - гликозидов коричного спирта и тирозола в растениях родиолы розовой (Rhodiola rosea L.). Предложены схемы путей биосинтеза и дана теоретическая оценка минимальных затрат органического субстрата (в эквивалентах глюкозы), необходимого для обеспечения синтеза салидрозида и розавина С-скелетами и энергией.

Доказано, что салидрозид и розавин локализуются в подземной части растений, причем концентрация гликозидов в каудексе в 1.5-2.0 раза выше, чем в корнях. Выявлена связь накопления продуктов вторичного метаболизма с ростом и развитием растений. Впервые показана корреляция накопления салидрозида в корнях и каудексе с содержанием неструктурных углеводов. Выявлено влияние внешних факторов (освещенность, минеральное питание) на накопление салидрозида и розавина. Обоснована идея о полифункциональной роли гликозидов коричного спирта и тирозола в растениях р. розовой.

Теоретическая ценность и практическа значимость

Получена физиолого-биохимическая характеристика культивируемых и дикорастущих растений р. розовой из различных частей ареала. Дана количественная оценка накопления биологически активных веществ - салидрозида и розавина. Показана роль донорно-акцепторной системы в регуляции специализированных биосинтезов на уровне целостного растения. Доказана способность культивируемых растений к накоплению высоких концентраций салидрозида и розавина на фоне усиления ростовых процессов. Показана возможность повышения активности вторичного обмена путем применения микроэлементов. Усовершенствована методика количественного анализа салидрозида и розавина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Полученные результаты могут быть использованы в селекции и интродукции р. розовой, а также при разработке программ по восстановлению и рациональному использованию ресурсов этого ценного лекарственного растения. Результаты исследований использованы при чтении курса «Физиология растений» и спецкурса «Экологическая физиология растений» для студентов-биологов, а также в спецкурсе «Газовая и жидкостная хроматография» для студентов-химиков Сыктывкарского государственного университета.

Работа выполнена в Лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Коми НЦ УрО РАН в период прохождения курса аспирантуры (2002-2005 гг.) и является частью плановых тем: «Физиология многолетних травянистых растений на Севере» (№ Гр 01.9.6003715) и «Физиолого-биохимические основы адаптации и репродукции растений в холодном клммате» (№ Гр 01.00107254).

Благодарности. Выражаю глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору Т.К. Головко. Благодарен к.х.н. В.В. Пунегову за консультации, предоставление материально-технической базы и поддержку работы. Признателен коллегам Лаборатории экологической физиологии растений и дирекции Института биологии за помощь в работе. Благодарен Е.И Шубнициной, М.М. Ишмуратовой, Л.В. Бугловой, Г.М.Воскобойникову за помощь в организации экспедиционных выездов. Признателен [Ю.М. Фролову |и И.И. Полетаевой за предоставленный растительный материал, д.фарм.н. В.А. Куркину за предоставленные стандарты салидрозида и розавина, а также В.В. Володину за консультации и помощь в сборе литературы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Захожий, Илья Григорьевич

выводы

1. На большом материале из географически удаленных точек природного ареала и культивируемых растениях установлено, что продукты специализированного метаболизма - салидрозид и розавин накапливаются в подземной части родиолы розовой, при этом концентрация гликозидов в каудексе в 1.5-2 раза выше, чем в корнях. Ни в одном случае не обнаружили присутствия этих веществ в надземных органах - листьях, стеблях, семенах.

2. Выявлена высокая вариабельность содержания гликозидов коричного спирта и тирозола в дикорастущих и культивируемых растениях. В фазе цветения концентрация салидрозида и розавина в каудексе растений, обитающих на Приполярном Урале, колебалась от 5 до 37 мг/г и от 9 до 35 мг/г сухой массы соответственно. У 70% растений содержание салидрозида было в пределах 10-25 мг/г, розавина 15-30 мг/г. Особи с очень низким или высоким содержанием гликозидов составляли 10 - 15 % от объема выборки. Подземные органы родиолы розовой уральского происхождения, культивируемой в подзоне средней тайги, содержали гликозиды в сопоставимых с дикорастущими растениями концентрациях.

3. Выявлена связь накопления продуктов вторичного метаболизма с ростом и развитием растений. Наибольшие концентрации суммы гликозидов в каудексе (41-47 мг/г сухой массы) отмечены в период завершения вегетации растений осенью и в начале весеннего возобновления роста, наименьшие (33-36 мг/г сухой массы) - в период цветения-плодоношения. Накопление салидрозида в корнях и каудексе тесно коррелировало с содержанием неструктурных углеводов. Минимум накопления салидрозида совпадал по времени с уменьшением фонда растворимых углеводов и оба события наблюдались в период репродуктивного развития, что свидетельствует о роли донорно-акцепторных отношений в регуляции вторичных биосинтезов на уровне целого растения.

4. Выявлено влияние затенения и обеспеченности растений минеральными элементами на накопление продуктов специализированных биосинтезов - гликозидов коричного спирта и тирозола. При 40 % затенении отмечали двукратное увеличение содержания салидрозида в каудексе растений. Подкормка микроэлементами (Zn, Си,

Мп) стимулировала накопление розавина, но не оказала существенного влияние на содержание салидрозида.

5. Разработаны схемы биосинтеза и дана теоретическая оценка минимальных затрат органического субстрата, необходимого для продуцирования гликозидов. Затраты на синтез 1 г розавина и 1 г салидрозида эквивалентны 1.69 и 1.85 г глюкозы соответственно. Минимальное количество глюкозы, необходимое для синтеза суммы гликозидов, достигает 8 % сухой массы подземных органов.

6. Усовершенствована методика количественного определения гликозидов коричного спирта и тирозола в растительных образцах родиолы розовой. Новизна методики заключается в оптимизации спектрального режима анализа, применении твердофазной экстракции при подготовке проб экстрактивных веществ для ВЭЖХ анализа и использовании фенола в качестве внутреннего стандарта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захожий, Илья Григорьевич, Сыктывкар

1. Андреева В.Н., Похилько А.А., Царева В.Т. Сем. Crassulaceae толстянковые // Биологическая флора Мурманской области. Апатиты, 1987. С. 21-39.

2. Арктическая флора СССР. Критический обзор сосудистых растений, встречающихся в арктических районах СССР / Под ред. Б.А. Юрцева Д.: Наука, 1984. Вып. IX, ч. 1.С. 9-18.

3. Атлас Коми АССР. М., 1964. 112 с.

4. Атлас Республики Коми по климату и гидрологии. М., 1997. 116 с.

5. Бандюкова В.А., Череватый B.C., Озимина И.И., Андреева О.А. Антибактериальная активность флавоноидов некоторых видов цветковых растений // Растительные ресурсы, 1987. Т. 24, вып. 4. С. 607-612.

6. Баньковский А.И., Зарубина М.П., Сергеева JI.JI. Исследование растений применяемых в народной медицине на содержание алкалоидов // Труды Всесоюзного НИИ лекарственных и ароматических растений М., 1947. Вып. 9. С. 119-179.

7. Барабой В.А. Биологическое действие растительных фенольных соединений. Киев, 1976. 260 с.

8. Барбье М. Введение в химическую экологию. М.: Мир, 1978. 229 с.

9. Борисова А.Г. Семейство толстянковые Crassulaceae DC. // Флора СССР. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1939. Т. 9. С. 8-134.

10. Брассиностероиды / Под ред. Ф.А. Лахвич. Минск: Наука и техника, 1993. 217 с.

11. Бреслина И.П. Орнитофильная флора островов Кандалакшского залива Белого моря // Экология, 1979. № 2. С. 45-52.

12. Букштынов А.Д. Гуттоносы СССР. М.-Л., 1957. 89 с.

13. Быков В.А., Запесочная Г.Г., Куркин В.А. Родиола розова (Rhodiola rosea L.): традиционные и биотехнологические аспекты получения лекарственных средств (обзор)//Хим.-фарм. журн., 1999. № 1. С. 29-39.

14. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения (растения-целители). М.: Высшая школа, 1990. 544 с.

15. Гарафуллина Г.Г., Ишмуратова М.М., Фахрутдинова Е.И., Герчиков А.Я. Антиокислительная активность экстрактов из корневищ Rhodiola rosea L. и R. iiremelica Boriss. // Растительные ресурсы, 1998. Т. 34, вып. 3. С. 69-74.

16. Гляд В.М. Определение моно-, ди- и олигосахаридов в одной растительной пробе методом ВЭЖХ // Физиология растений, 2002. Т. 49, № 2. С. 311-316.

17. Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова И.А., Шретер А.И. Биологически активные вещества растительного происхождения. В 3-х томах. М.: Наука, 2001.

18. Головко Т.К. Дыхание растений (физиологические аспекты). СПб.: Наука, 1999.204с.

19. Горчаковский П.Л. Флора и растительность высокогорий Урала // Труды Института биологии УФ АН СССР. Свердловск, 1966. Вып. 48. С. 78-140.

20. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. М.: Медицина, 1989. С. 364-366.

21. Гришина Е.Н. Некоторые вопросы водного режима родиолы розовой {Rhodiola rosea L.) в условиях интродукции // Материалы международной научно-практической конференции. Горно-Алтайск, 1998. С 95-97.

22. Губачек Й., Рихтер Р., Каплан Т., Бернацик К. Калориметрическое определение N03~ в растительных тканях с салициловой кислотой // Агрохимия, 1981. № 7. С. 131138.

23. Далькэ И.В. Эколого-физиологические и морфологические характеристики Rhodiola rosea L. из арктической и уральской частей ареала: Автореф. дис. .канд. биол. наук. СПб., 2002. 23 с.

24. Далькэ И.В., Головко Т.К. Морфофизиологическая характеристика уральских и арктических растений Rhodiola rosea L. (Crassulaceae) при выращивании в подзоне средней тайги // Растительные ресурсы, 2005. Т. 41, вып. 4. С. 1-11.

25. Деева В.П., Шелег З.И., Санько Н.В. Избирательное действие химических регуляторов роста на растение. Минск: Наука и техника. 1988. 255 с.

26. Делова Г.В., Гуськова И.Н. Антибактериальные и антифунгальные свойства эфирных масел некоторых видов Губоцветных // Комплексное изучение полезных растений Сибири. Новосибирск: Наука, 1974. С. 131-146.

27. Ебрахим М.К.Х. Проявление устойчивости двух сортов хлопчатника к облучению ультрафиолетом-А: фотосинтез и некоторые химические компоненты клеток// Физиология растений, 2005. Т. 52, № 5. С. 726-733.

28. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. СПб., 1972. 456с.

29. Загоскина Н.В., Дубравина Г.А., Алявина А.К., Гончарук Е.А. Влияние ультрафиолетовой (УФ-Б) радиации на образование и локализацию фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения // Физиология растений, 2003. Т. 50, №2. С. 302-308.

30. Запесочная Г.Г., Куркин В.А. Гликозиды коричного спирта из корневищ Rhodiola rosea II Химия природных соединений, 1982. № 6. С. 723-727.

31. Запесочная Г.Г., Куркин В.А., Бойко В.П., Колхир В.К., Фенилпропаноиды -перспективные биологически активные вещества лекарственных растений // Хим.-фарм. журн., 1995. Т. 29, № 4. С. 47-50.

32. Запесочная Г.Г., Куркин В.А., Щавлинский А.Н. Флавоноиды надземной части Rhodiola rosea. Строение новых гликозидов гербацетина и госсипетина // Химия природных соединений, 1985. № 4. С. 496-507.

33. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.

34. Зауралов О.А. О физиологическом значении эфирных масел в растении // Растительные ресурсы, 1975. Т. 11, вып. 2. С. 289-304.

35. Игошина К.Н. Флора горных и равнинных тундр и редколесий Урала // Растения Севера Сибири и Дальнего Востока. M.-JL, 1966. С. 135-223.

36. Ильин М. М., Якимов П. А. Каучуконосы и гуттаперченосы СССР // Растительное сырье СССР / Под ред. М.М. Ильина. M.-JL: Изд-во АН СССР, 1950. Т. 1. Технические растения. 661 с.

37. Исламов А.Э., Кулиев З.А., Вдовин А.Д. Олигомерные проантоцианидингликозиды Rhodiola pamiroalica II Химия природных соединений, 1999. № 1.С. 42-49.

38. Ишмуратова М.И., Сацыперова И.Ф. Начальные этапы онтогенеза и некоторые биологические особенности развития Rhodiola rosea L. и R. iremelica Boriss., интродуцированных в Башкирию // Растительные ресурсы, 1998. Т. 34, вып. 4. С. 3-11.

39. Ишмуратова М.М. Биологические и химические особенности, культура тканей Rhodiola rosea L. и Rhodiola iremelica Boriss., возможность их интродукции в Башкортостане (на примере г. Уфы): Автореф. дис. . канд. биол. наук. Уфа, 1996. 18 с.

40. Кабата-Пендиас А, Пендиас X. Микроэлементы в почвах и растениях. М.: Мир. 1989.439 с.

41. Казаринова Н.В. Экологические особенности интродуцируемой родиолы розовой // Проблемы освоения лекарственных ресурсов Сибири и Дальнего Востока: Тез. докл. Всесоюз. конф. Новосибирск, 1983. С. 32-33.

42. Кефели В.И. Физиологические основы конструирования габитуса растений. М.: Наука, 1994.269 с.

43. Ким Е.Ф. Биологические основы интродукции родиолы розовой // Динамика растительного покрова Алтая: Матер, междунар. науч.-практ. конф. Горно-Алтайск, 1998. С. 87-94.

44. Ким Е.Ф. Опыт выращивания родиолы розовой в низкогорьях Алтая // Растительные ресурсы, 1976. Т. 12, вып. 4. С. 583-590.

45. Ким Е.Ф. Содержание и возрастная динамика накопления салидрозида в надземных органах родиолы розовой в связи с ее интродукцией на разных высотных поясах Алтая // Флора и растительность Сибири и Дальнего Востока. Красноярск, 1996. С. 255-257.

46. Ким Е.Ф. Физиологические и биохимические аспекты интродукции родиолы розовой (золотого корня) в предгорье и низкогорье Алтая // Материалымеждународной конференции, посвященной 60-летию ГБС им. Н.В. Цицина РАН. М., 2005. С. 210-212.

47. Кирьянов А.А., Бондаренко JI.T., Куркин В.А., Запесочная Г.Г. Динамика накопления розавидина и салидрозида в сырье родиолы розовой, культивируемой в Подмосковье // Хим.-фарм. журн., 1989. № 4. С. 449-452.

48. Кирьянов А.А., Бондаренко JI.T., Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Дубичев А.Г., Воронцов Е.Д. Определение биологически активных компонентов корневищ Rhodiola rosea II Химия природных соединений, 1991. № 3. 320-323.

49. Климат Сыктывкара / Под ред. Ц.А. Швер. Д.: Гидрометеоиздат, 1986.190 с.

50. Климаты Западной Европы / Под ред. А.Н. Лебедева, АЛО. Егоровой Л.: Гидрометеоиздат, 1983. 446 с.

51. Клыков А.Г., Моисеенко Л.М, Горовой П.Г. Сезонная динамика содержания рутина и продуктивность надземной фитомассы у трех видов Fagopyrum Mill., выращиваемых в Приморском крае // Растительные ресурсы, 2003. Т. 39, вып. 3. С. 77-82.

52. Кожевников Ю.П. Заметки о родах Rhodiola и Sedum (Crassulaceae) // Бот. журн., 1988. Т. 3, № 73. С. 414-423.

53. Комисаренко Н.Ф., Сацыперова И.Ф. Флавоноиды и кумарины листьев Heracleum antasiaticum Manden // Растительные ресурсы, 1974. Т. 10, вып. 4. С. 567572.

54. Коряк А.Д. Разнообразие морфологических признаков Rhodiola rosea как показатель генофонда вида // УНВсесоюзное совещание по вопросам изучения и освоения флоры и растительности высокогорий: Тез. докл. Новосибирск, 1977. С. 220221.

55. Красная книга Республики Коми (редкие и находящиеся под угрозой виды растений и животных) / Под ред. А.И. Таскаева. Москва-Сыктывкар: ДИК, 1998. 528 с.

56. Красная книга СССР. Дикорастущие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране. Л.: Наука, 1975. 264 с.

57. Краснов Е.А. Флавоноиды Rhodiola litvinovii II Химия природных соединений, 1997. №6. С. 851-852.

58. Краснов Е.А., Вейц JI.A. Исследование эфирного масла родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) // Стимуляторы центральной нервной системы. Томск, 1986. Вып.2. С. 18-20.

59. Краснов Е.А., Куваев В.Б., Хоружая Т.Г. Хемосистематическое исследование видов Rhodiola L. // Растительные ресурсы, 1978. Т. 14, вып. 2. С. 153-160.

60. Краснов Е.А., Саратиков А.С., Суров Ю.П. Растения семейства толстянковых. Томск, 1979.207 с.

61. Кретович B.J1. Основы биохимии растений. М.: Высшая школа, 1971. 464 с. Куркин В.А. Фенилпропаноиды перспективные природные биологически активные соединения. Самара, 1996. 80 с.

62. Куркин В.А., Дубищев А.В., Титова И.Н., Волоцуева А.В., Петрова Е.С. Нейротропные свойства некоторых препаратов, содержащих фенилпропаноиды // Растительные ресурсы, 2003. Т. 39, вып. 3. С. 115-121.

63. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Горбунов Ю.Н., Нухимовский E.JL, Шретер А.И., Щавлинский А.Н. Химическое исследование некоторых видов родов Rhodiola L. и Sedum L. и вопросы их хемосистематики // Растительные ресурсы, 1986. Т. 22, вып.3. С. 310-319.

64. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Дубичев А.Г., Воронцов Е.Д., Александрова И.В., Панова Р.В. Фенилпропаноиды каллусной культуры Rhodiola rosea II Химия природных соединений, 1991. № 4. С. 481-490.

65. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Щавлинский А.Н. Методы определения подлинности и качества корневищ родиолы розовой //Хим.-фарм. журн., 1985. №3. С. 185-190.

66. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Щавлинский А.Н. Флавоноиды надземной части Rhodiola rosea II Химия природных соединений, 1984. № 5. С. 657-658.

67. Лазурьевский Г.В. Терентьева И.В. Алкалоиды и растения. Кишинев: Штиница. 1975. 150 с.

68. Лихонос Т.А., Калашник Н.А. Кариосистематическое изучение некоторых видов рода Rhodiola (Crassulaceae) // Бот. журн., 1999. Т. 84. № 11. С. 107-113.

69. Ловкова М.Я. Биосинтез и метаболизм алкалоидов в растениях. М.: Наука, 1981. 170 с.

70. Лункер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. М.: Мир, 1979. 548 с.

71. Маргна У.В. Взаимосвязь биосинтеза флавоноидов с первичным метаболизмом растений. М., 1990. 176 с. (Итоги науки и техники. Сер. Биол. химия / ВИНИТИ АН СССР; Т. 33).

72. Маслова А.В., Лишманов Н.Б., Маслов Л.Н. Кардиопротекторные действия адаптогенов растительного происхождения / Бюл. эксперим. биол. мед.," 1993. № 3. С. 269-270.

73. Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск: Наука, 1978. 255 с.

74. МодинаТ.Д. Климаты Республики Алтай. Новосибирск, 1997. 178 с.

75. Носов A.M. Вторичный метаболизм // Физиология растений / Под ред. И.П. Ермакова. М., 2005. С. 588-614.

76. Нухимовский Е.Л. Начальные этапы биоморфогенеза Rhodiola rosea L., выращиваемой в Московской области //Растительные ресурсы, 1976. Т. 12, вып. 3. С. 348-355.

77. Нухимовский Е.Л., Юрцева Н.С., Юрцев В.Н. Биоморфологические особенности Rhodiola rosea L. при выращивании (Московская область) // Растительные ресурсы, 1987. Т. 23, вып. 4. С.489-501.

78. Пасешниченко В.А. Растения продуценты биологически активных веществ // Соросовский образовательный журнал, 2001. Сер. Биология. Т. 7, № 8. С. 13-19.

79. Племенков В.В. Введение в химию природных соединений. Казань, 2001. 376 с.

80. Пунегов В.В., Савиновская Н.С. Метод внутреннего стандарта для определения экдистероидов в растительном сырье и лекарственных формах с помощью ВЭЖХ // Растительные ресурсы, 2001. Т. 37, вып. 1. С. 97-102.

81. Редкие и исчезающие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране. Л.: Наука, 1981.264 с.

82. Редкие и нуждающиеся в охране животные и растения Коми АССР. Сыктывкар, 1982. 152 с.

83. Рихтер Г.Д., Чикиев А.Г., Север Европейской части СССР. М., 1966. 238 с.

84. Роньжина Е.С. Сравнительный анализ действия фузикокцина, АБК и БАЛ на транспорт и распределение веществ в изолированных листьях в связи с проблемой аттрагирующего эффекта цитокининов // Физиология растений, 2004. Т. 51, № 4. С. 493-500.

85. Рощина В.Д., Рощина В.В. Выделительная функция высших растений. М.: Наука, 1989.213 с.

86. Рубин А.Б. Биофизика. В 2-х томах. М.: Изд-во МГУ, 2004. 469 с.

87. Рыбакова Г.Р. Накопление биомассы и содержание салидрозида в родиоле розовой при различных спектральных режимах искусственного облучения и возможности ее использования как функциональной добавки: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Красноярск, 2003. 18 с.

88. Санадзе Г.А. Биогенный изопрен // Физиология растений, 2004. Т. 51, № 6. С. 810-824.

89. Сапожников Д.И., Красовская Т.А. Маевская А.Н. Изменения соотношения основных каротиноидов пластид зеленых листьев при действии света // ДАН СССР, 1957. Т. 113, №2. С. 465-467.

90. Саратиков А.С., Краснов Е.А., Хныкина JI.A., Дувидзон JI.M. Выделение и химическое исследование индивидуальных биологически активных веществ из родиолы розовой и родиолы четырехлистной // Изв. СО АН СССР, 1967. Сер. биол.-мед. наук. № 5. С. 54-60.

91. Сацыперова И.Ф., Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Паутова И.А Химический состав корневищ Rhodiola arctica Boriss., интродуцированной в Ленинградскую область // Растительные ресурсы, 1991. Т. 27,вып. 4. С. 55-60.

92. Сацыперова И.Ф., Паутова И.А., Куркин В.А., Запесочная Г.Г. Биологически активные вещества корневищ родиолы розовой, интродуцированной в Петербург // Растительные ресурсы, 1993. Т. 29, вып. 2. С. 26-31.

93. Семенов А.А. Очерк химии природных соединений. Новосибирск: Наука, 2000.664 с.

94. Соболевская К.А., Минаева В.Г. К изучению флоры Алтая как источника флавоновых веществ // Изв. СО АН СССР, 1961. Сер. биол.-мед. наук. № 4. С. 68-72.

95. Соколов С.Я., Ивашин В.М. Запесочная Г.Г. Исследование нейротропной активности новых веществ, выделенных из родиолы розовой // Хим.-фарм. журн., 1985. Т. 19, № 11. С. 1367-1371.

96. Степанов Э.В., Крылов Г.В. Золотой корень высокогорных районов Кузбасса // Изв. СО АН СССР, 1973. Сер. Биол. наук. Т. 10. №. 2. С. 53-58.

97. Суров Ю.П. Краснов Е.А. Солярик П.С., Выдрина С.Н Химическое исследование и запасы Rhodiola pinnatifida A. Borris в Туве // Изв. СО АН СССР, 1973. Сер. Биол. наук. Т. 10. № 2. С. 64-69.

98. Суров Ю.П., Сахарова Н.А., Сутормина Н.В. Ресурсы лекарственного и плодово-ягодного сырья в Горном Алтае. Томск, 1981. 242 с.

99. Танасиенко Ф.С. Эфирные масла. Содержание и состав в растениях. Киев: Наукова думка, 1985. С. 5-7.

100. Тихомиров А.А., Долгушев В.А., Рыбакова Г.Р. Продуктивность растений родиолы розовой и качества их биомассы при различных спектральных режимах искусственного облучения // Докл. РАСХН, 2002. № 2. С. 8-10.

101. Тихонов А.Н. Защитные механизмы фотосинтеза // Соросовский образовательный журн., 1999. № 11. С. 16-21.

102. Тюлина Л.К. Материалы по высокогорной растительности Южного Урала // Изд. ГГО. 1931. Вып. 5-6. Т. LXIII. С. 453-499.

103. Филиппова Л.Н. Биология северных растений при введении их в культуру. Л.: Наука. 1981.117 с.

104. Фитоэкдистероиды / Под. ред. В.В. Володина. СПб.: Наука, 2003. 293 с.

105. Фролов Ю.М., Полетаева И.И. Родиола розовая на европейском Северо-Востоке. Екатеринбург, 1998. 192 с.

106. Хоружая Т.Г., Краснов Е.А. Углеводный состав некоторых растений семейства толстянковых // Основы развития фармации и изыскание новых способов изготовления лекарств и методов их исследования: Матер, науч.-практ. конф. Тюмень, 1970. С. 103-104.

107. Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). СПб., 1995. 992 с.

108. Черкозьянова А.В, Высоцкая Л.Б., Веселов С.Ю., Кудоярова Г.Р. Гормональная регуляция соотношения массы побег/корень не связана с водным обменом при дефиците минерального питания у растений пшеницы // Физиология растений, 2005. Т. 52, №5. С. 708-715.

109. Шарафитдинов М.И. Горные тундры массива Иремель (Южный Урал) // Флористические и геоботанические исследования на Урале. Свердловск, 1983. С. 110119.

110. Штер Г.Е., Куркин В.А., Космынин А.С., Авдеева Е.В. Термический анализ корневищ родиолы розовой // Фармация, 1992. № 1. С. 67-70.

111. Юнусов С.А. Алкалоиды. Ташкент, 1974. 320 с.

112. ЯремийИ.Н. Григорьева Н.Ф. Гепатозащитные свойства экстракта родиолы жидкого // Эксперим. клинич. фармакол., 2002. № 6. С. 57-59.

113. Ярошенко К.В. Адаптогены как средства профилактической медицины. Томск, 1990. 93 с.

114. An F., Yue S., Guo D., Zheng J. Determination of salidroside in eight Rhodiola species by TLC-UV spectrometry // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 1998. Vol. 23, № 1. P. 434-64.

115. Barz W., Koster J. Turnover and degradation of secondary (natural) products // Secondary Plant Products. Vol. 7. Biochemistry of plants/ Eds. P. M Conn., P. M. Conn. N.-Y.: Acad. Press, 1982. P. 35-84.

116. Battistelli M., De Sanctis R, De Bellis R., Cucchiarini L., Dacha M., Gobbi P. Rhodiola rosea as antioxidant in red blood cells: ultrastructural and hemolytic behaviour // Eur. J. Histochem., 2005. Vol. 49, № 3. P. 243-54.

117. Bensaddek L., Gilleta F., Edmundo Nava Saucedob J., Fliniauxa M. The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots // J. Biotechnol., 2001. Vol. 85, № 1. P. 35-40.

118. Bergamasco R., Horn D.H.S. Distribution and role of insect hormones in plants // Invertebrate endocrinology. Vol. 1. Endocrinology of insects / Eds. R.G.H. Downer, H.N.Y. Laufer, A.R. Liss. N.-Y, 1983. P. 627-654.

119. Bergamasco R., Horn D.H.S. The biological activities of ecdysteroids and ecdysteroid analogues // Developments in endocrinology. Vol. 7. Progress in ecdyson research / Ed. J.A. Hoffmann. Amsterdam, 1980. P. 299-324.

120. Brown R. P., Gerbarg P. L., Ramazanov Z. Rhodiola rosea: a phytomedicinal overview // J. American Bot. Council., 2002. № 56. P. 40-52.

121. Buchanan B.B., Gruissem W. Jones R.L. Biochemistry and molecular biology of plants. Maryland (USA), 2000. 1367 p.

122. Buckingham J. The dictionary of natural products. London (England), 1993. 8584 p.

123. Cheeke P.R. Toxicants of plant origin. Vol. 1. Alkaloids. Boca Raton. Florida. (USA). 1989.352 p.

124. Chung H.H., Barnes R.L. Photosynthate allocation in Pinus taeda. Substrate requirements for synthesis of shoot biomass // Can. J. Forest Res., 1997. Vol. 7. № 1. P. 106-111.

125. Cui S., Ни X., Chen X., Hu Z. Determination of p-tyrosol and salidroside in three samples of Rhodiola crenulata and one of 'Rhodiola kirilowii by capillary zone electrophoresis // Analyt. Bioanalyt. Chem., 2003. № 2. P. 370-374.

126. Dennis C.G.,. Liu-Gitz L., J. W. McClure J. W., Huerta A. J. Effects of a PAL inhibitor on phenolic accumulation and UV-B tolerance in Spirodela intermedia (Koch.) // J. Exp. Bot., 2004. Vol. 55, № 398. P. 919-927.

127. Du M., Xie J. Flavonol glicosides from Rhodiola cenulata II Phitochem., 1995. Vol. 38, № 3.P. 809-810.

128. Facchini P.J., De Luca V. Phloem-specific expression of tyrosine/dopa decarboxylase genes and the biosynthesis of isoquinoline alkaloids in opium poppy // Plant Cell, 1995. Vol. 7,№ 11. P. 1811-1821.

129. Fan W., Tezuka Y., Ni K.M., Kadota S. Prolyl endopeptidase inhibitors from the underground parts of Rhodiola sachalinensis II Chem. Pharm. Bull., 2001. Vol. 49, № 4. P. 396-401.

130. Ferreira M.J.P., Rodrigues G.V., Emiricano V.P. Monoreg an expert system for structural elicidation of monoterpenes // Can. J. Chem., 2001. Vol. 79, № 12. P. 1915-1925.

131. Frohnmeyer H., Staiger D. Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants. Balancing damage and protection // Plant Physiol., 2003. Vol. 133, № 12. P. 1420-1428.

132. Furmanowa M.,.Hartwich M,. Alfermann A. W, Kozminski W., Olejnik M. Rosavin as a product of glycosylation by Rhodiola rosea (roseroot) cell cultures // Plant cell, tissue and organ culture, 1999. Vol. 56, № 2. P. 105-110.

133. Gang D. R, Wang J., Dudareva N., Нее Nam K., Simon J. E., Lewinsohn E. An investigation of the storage and biosynthesis of phenylpropenes in sweet basil // Plant Physiol., 2001. Vol. 125, № 2. P. 539-555.

134. Gershenzon J., McConkey M. E., Croteau R. B. Regulation of monoterpene accumulation in leaves of peppermint // Plant Physiol., 2000. Vol. 122, № 1. P. 205-214.

135. Gyorgy Z., Tolonen A., Pakonen M., Neubauer P., Hohtola A. Enhancing the production of cinnamyl glycosides in compact callus aggregate cultures of Rhodiola rosea by biotransformation of cinnamyl alcohol // Plant Sci., 2004. Vol. 166, № 1. P. 229-236.

136. Hager A., Holocher K. Localization of the xanthophylls cycle enzyme violaxanthin de-epoxidase within the thylakoid lumen and abolition of its mobility by a (light-dependent) pH decrease //Planta, 1994. Vol. 192, № 4. P. 581-589.

137. Hakulinen J. Nitrogen-induced reduction in leaf phenolic level is not accompanied by increased rust frequency in a compatible willow (Salix myrsinifolia) Melampsora rust interaction //Physiologia Plantarum, 1998. Vol. 102. P. 101

138. Hao-Yang W., Yun-Long G. Rapid analyses of the volatile compounds in the rhizomes of Rhodiola rosea and Rhodiola sacra by static headspase-gas chromatography -tandem mass spectrometry //Analyt. Lett., 2004. Vol. 37, № 10. P. 2151-2161.

139. Harborne J.B. Introduction to ecological biochemistry. San Diego: Acad. Press, 1994.384 p.

140. Harborne J.B. Plant flavonoids in biology and medicine // Plant flavonoids in biology and medicine: biochemical, pharmacological, and structure-activity relationships / Ed. V. Cody, E. Middleton, J. Harborne. N.-Y., 1986. P. 15-24.

141. Harborne J.B., Mabry T.J. The flavonoids: advances and research. London-New York, 1982. 744 p.

142. Hart't H. The unilacunar two-trace nodal structure of the caudex of Rhodiola rosea L. (Crassulaceae) // Bot. J., 1994. Vol. 116, № 3. P. 235-241.

143. Herrmann K.M., Weaver L.M. The shikimate pathway // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1999.Vol. 50, № 6. P. 473-503.

144. Kang S, Wang J, Zhang J, Liu F, Xu Z. Quantitative analysis of salidroside and lotaustralin in Rhodiola by gas chromatography // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 1998 Vol. 23, №6. P. 365-384.

145. Kelly G.S. Rhodiola rosea: a possible plant adaptogen // Altern. Med. Rev., 2001. Vol. 6, № 3. P. 293-302.

146. Keski-Saari S., Julkunen-Tiitto R. Resource allocation in different parts of juvenile mountain birch plants: effect of nitrogen supply on seedling phenolics and growth // Physiologia Plantarum, 2003. Vol. 118, № 1. P. 114.

147. Khripach V., Zhabinskii V., de Groot A. Twenty years of brassinosteroids: steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century // Ann. Bot., 2000. Vol. 86, № 3. P. 441-447.

148. Kliebenstein D.J. Secondary metabolites and plant/environment interaction: a view throw Arabidopsis thaliana tinged glasses (review) // Plant, cell and environment, 2004. Vol. 27, № 6. P. 675-684.

149. Konga J.M., Chia L.S., Goha N.K., Chiaa T.F., Brouillardb R. Analysis and biological activities of anthocyanins // Phytochem., 2003. Vol. 64, № 5. P. 923-933.

150. Kramer G. F., Normana H. A., Krizek D. Т., Mirecki R. M. Influence of UV-B radiation on polyamines, lipid peroxidation and membrane lipids in cucumber // Phytochem., 1991. Vol. 30, № 7. P. 2101-2108.

151. Machackova I., Vagner M., Slama K. Comparison between the effect of 20-hydroxyecdisone and phytogormones on growth and development in plants // Eur. J. Entomol., 1995. Vol. 92. P. 309-316.

152. Merino J., Field С., Mooney H.A. Construction and maintenance cost of mediterranean-climate evergreen and deciduous leaves. II. Biochemical pathway analysis // Acta Oecol./Oecol. Plant, 1984. № 5. P. 211-229.

153. Mort M.E., Soltis D.E., Soltis P.S., Francisco-Ortega J., Santos-Guerra A. Phylogenetic relationship and evolution of Crassulaceae inferred from matK sequence data //Amer. J. Bot., 2001.Vol. 88. № 1. P. 76-91.

154. Murphy T.M., Hamilton C.M., Street H.E. A strain of Rosa damascena cultured cells resistant to ultraviolet light // Plant Physiol., 1997. Vol. 64. P. 936-941.

155. Ohba H. A revision of Asiatic species of Sedoidae (Crassulaceae). Pt. 2. Rhodiola (subgen. Rhodiola, sect. Rhodiola) // J. Fac. Sci. Univ. Tokyo, 1981. Sec. 3. Vol. 13, № 2. P. 65-119.

156. Olfelt J.P., Glenn R.F., Luby J.J. What data determine whether a plant taxon is distinct enough to merit legal protection? A case study Sedum integrifolium (Crassulaceae) //Amer. J. Bot., 2001.Vol. 88, № 3. P. 401-410.

157. Pangarova T.T., Zapesochnaya G.G., Chertkov V.A. The structure of alginoside, a-lactone of Rhodiola algida II Chemistry of natural compounds, 1976. Vol. 11, № 3. P. 349352.

158. Penning de Vries F.W.T., Brunsting A.H.M., Laar van H.H. Products, requirements and efficiency of biosynthesis: a quantitative approach // J. Theoretical Biol., 1974.Vol. 45. P. 339-377.

159. Sanctis R., De Bellis R., Scesa C., Mancini U., Cucchiarini L., Dacha M. In vitro protective effect of Rhodiola rosea extract against hypochlorous acid-induced oxidative damage in human erythrocytes // Biofactors, 2004. № 3. P. 147-59.

160. Shuangxiu W., Yuangang Z., Madeline W. High yield production of salidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis II J. Biotechnol., 2003. Vol. 106, №1. P. 33-43.

161. Slama K. Ecdysteroids: insect hormones, plant defense or human medicine? // Phytoparmasitica, 1993. Vol. 21, № 1. P. 3-8.

162. Suzich J.A., Dean J.F.D., Herrmann K.M. 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase from carrot root (Daucus carota) is a hysteretic enzyme // Plant Physiol., 1985. Vol. 79. P. 765-770.

163. Taiz Т., Zeiger E. Plant physiology. Sunderland (USA), Sinauer Associates Inc. 2002.690 p.

164. Tegelberg R., Julkunen-Tiitto R. Quantitative changes in secondary metabolites of dark leaved willow (Salix myrsinifolia) exposed to enhanced ultraviolet-B radiation // Physiologia Plantarum, 2001. Vol. 113. № 4. P. 541-547.

165. Teklemariama T.A., Blakeb T.J. Phenylalanine ammonia-lyase-induced freezing tolerance in jack pine (.Pinus banksiana) seedlings treated with low, ambient levels of ultraviolet В radiation // Physiologia Plantarum, 2004. Vol. 122, № 2. P. 244-253.

166. Teramura A.H. Effects of ultraviolet-B radiation on the growth and yield of crop plants // Physiologia Plantarum, 1983. Vol. 58, №. 3. P. 415-427.

167. Teranishi M., Iwamatsu Y., Hidema J., Kumagai T. Ultraviolet-B sensitivities in japanese lowland rice cultivars: cyclobutane pyrimidine dimer photolyase activity and gene mutation // Plant and Cell Physiology, 2004. Vol. 45, № 12. P. 1848-1856.

168. Tolonen A. Analysis of secondary metabolites in plant and cell culture tissue of Hipericum perforatum L. and Rhodiola rosea L. Oulu: Univ. Press, 2003. 56 p.

169. Tolonen A., Hohtola A., Jalonen J. Liquid chromatographic analysis of phenylpropanoids from Rhodiola rosea extracts // Chromatographia, 2003. Vol. 57, № 9. P. 577-579.

170. Tolonen A., Pakonen M., Hohtola A., Jalonen J. Phenilpropanoid glicosides from Rhodiola rosea II Chem. Pharm. Bull., 2003. Vol. 51, № 4. P. 467-470.

171. Tom R., Jardin В., Chavarie C., Archambault J. Effect of culture process on alkaloid production by Catharanthus roseus cells //J. Biotechnol., 1991. Vol. 21, № 1-2. P. 1-19.

172. Wang S. Wang F.P. Studies of the chemical components of Rhodiola cenulata II Yao Xue Xue Bao, 1992. Vol. 27, № 2. P. 117-120.

173. Wang S., You X.T., Wang F.P. HPLC determination of salidroside in the roots of Rhodiola genus plants // Yao Xue Xue Bao, 1992. Vol. 27, № 11. P. 849-952.

174. Webb D.A. Crassulaceae DC. // Flora Europe. Cambridge, 1964. Vol. 1. P. 350-364.

175. Werker E., Putievsky E., Ravid U. Glandular hairs and essential oil in developing leaves of Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) // Ann. Bot.,1993. Vol. 71, № 1. P. 43-50.

176. Wilson G., Marron P. Growth and antithraquinone biosynthesis by Galium mollugo L. cells in batch and chemostat culture // J. Exp. Bot., 1978. № 29. P. 837-851.

177. Xu J.F., Su Z.G., Feng P.S. Activity of tyrosol glucosyltransferase andimproved salidroside production through biotransformation of tyrosol in Rhodiola sachalinensis cell cultures // J. Biotechnol., 1998. Vol. 61, №1. P. 69-73.

178. Yamamoto H. Biochemistry of the violaxanthin cycle in higher plants // Pure Appl. Chem., 1979. Vol. 51. P. 639-648.

179. Yamamoto H., Suzuki M., Suga U. Participation of an active transport system in berberin secreting cultured cells of Thalictrum minus II Plant. Cell. Rep., 1987. Vol. 6. P. 356-359.

180. Yan X., Wang Y., Guo S., Shang X. Seasonal variations in biomass and salidroside content in roots of Rhodiola sachalinensis as affected by gauze and red film shading // Ying Yong Sheng Tai Xue Bao, 2004 Vol. 15, № 3. P. 382-386.

181. Yan X., Wub S., Wanga Y., Xinhai S., Daia S. Soil nutrient factors related to salidroside production of Rhodiola sachalinensis distributed in Chang Bai Mountain // Environm. Exp. Bot., 2004. Vol. 52, № 3. P. 267-276.

182. Yun-dong S., Zang-fong S., Hory-jian Z. Determination of marker compounds in plants of Rhodiola L. from differents habitats by RP-HPLC // Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2004. Vol. 35, № 5. P. 505-508.

183. Zagrobelnya M., Baka S., Rasmussena A. V., Jorgensenb В., Naumannc С. M., Lindberg Moller B. Cyanogenic glucosides and plant-insect interactions // Phytochem., 2004. Vol. 65, №3. P. 293-306.

184. Zhang W.S., Zhu L.Q., Niu F.L., Deng R.C., Ma C.X. Protective effects of salidroside on injury induced by hypoxia/hypoglycemia in cultured neurons // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2004. Vol. 29, № 5. P. 459-462.