Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бiохiмiчна характеристика плазматичноi мембрани та особливостi регуляцii епителiю тонкого кишечника великоi рогатоi худоби в онтогенезi та при порушеннi функцi

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Бiохiмiчна характеристика плазматичноi мембрани та особливостi регуляцii епителiю тонкого кишечника великоi рогатоi худоби в онтогенезi та при порушеннi функцi"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ 1НСТИТУТ БЮХ1МП 1м. 0.В.ПАЛЛАД1НА

РГБ ОД

На правах рукопису

У С А Т Ю К ПЕТРО ВОЛОДИМИРОВИЧ

Б10Х1М1ЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛАЗМАТИЧНОI МЕМВРАНИ ТА ОСОВЛИВОСТ1 РЕГУЛЯЦ11 ЕП1ТЕЛ1Ю .ТОНКОГО КИШЕЧШКА ВЕЛИКОI РОГАТО! ХУДОЕИ В ОНТОГЕНЕЗI ТА ПРУ! ПОРУШЕНН1 ФУШП

03.00.04 - б1ох1м1я

Автореферат дисертацП на здобуття наукового ступеня доктора Й1олог1чних наук

К И I Ь - 1УУ4

Робота виконана на кафедр1 61ох1м11 i б1отехнолог11 Укра1нського державного аграрного ун1верситету.

Нзуковий консультант - доктор б1олог1чних наук, член-кор. HAH Укра1ни, акещем1к УААН, npodecop Мельничук Д.О.

0ф1ц1йн1 опоненти:

академ1к HAH Укра1ни, доктор медичних наук, професор Шуба М.Ф.

доктор б1олог1чних наук, професор войцщький в.м.

доктор б1олог1чних наук. Дмитренко М.П.

Пров1дна орган1зац1я:

1нститут ф1з1олог11 Ки1вського ун1верситету 1м.Т.Шевченка

Захист дисертацП в1дбудетъся "^б" ^e-^ew«. Ю94 р. о 14 годин1 на зас1данн1 спец1ал1зовано! вчено1 ради Д 016.07.01 для эахисту дисертанди в 1нститут1 б1ох1м11 1м.0.В.Паллад1на HAH Укра1ни за адресою : 252601, м. Ки1в, вул. Леонтовича, 9.

3 дисертац1ею можна оэнайомитася в б1бл1отец1 1нституту б1ох1м11 1м. О.В,Паллад1на HAH Укра1ни.

Автореферат роэ1сланий

Вчений секретар спец1ал1зовано1 вчено! рад канд. б1ол. наук

Об'ектом наших досл1джень 6у.л а велика рогата худоба, оск1льки бюх1м1я та Ф1з|0лог1я мембранного .травления в тонкому кишечнику цих тварик слдао вивчен1.Кр!м того, гостр! розлади правления, як1 дуже поширен1 у новонароджених телят, п1деилюють актуальн1сть ц1-е! проблеми з практично! точки зору 1 можутьмати певне'значения для ьетеринарП 1 тваринниЦтва з погляду розробки нових та моди-ф1кац11 !снуючих м9тод1в проф1лактики 1 л1кування Щей патологП.

Дооидження б!ох!м1чних показник1в АМ 1 БМ, а також внутр!ш-нъоюитинних регуляторких систем доц1льно проводити з виксристан-ням високоочищених мембранних преларат1в та 1зольованих еп1тел1-альних кл1тин. На даний час в!дпов1дн1 методичн1 процедури для велико! рогато1 худоби не описан!.

Виходячи з мети робота. 6ули поставлен! так! задач!г

1. Розробити метод отримання ап1кальних 1 базолатеральних мембран епПел1ю тонкого кишечника 6елико1 рогато! худоби.

2 Розробити метод отримання !зольованих кл1тин еп1те.щй тонкого кишечника таарин.

3.. Досл1дити л!п!дний Сфосфол1п1ди, холестерин, жирн1 кис-лати), б1лковий склад та густину-ап1кальних 1 базолатеральних мембран еп1телт тонкого кишечника тварин.

4. 1дентиф1кувати та оц1нити питому ачтивнють транспортних АТРаз ал1кальних 1 базолатеральних мембран еп1тел1ю тонкого кишечника тварин.

5. Вивчити обм1н цикл1чних нуклеотид1в та 1]ростагландин1в в • 1зольованому еп!телП тонкого кишечника тварин.

6. Встановита особливост1 перерахованих процес1в у доросли* таари'н 1 новонароджених .телят Та при захворюванн1 остеншх на д1арею.

Наукова новизна робота. Вперше розроблено методи вид1лення ап1кальних 1 базолатеральних мембран та 1зольованих кл1тин еп1-тел1ю тонкого кишечника великаI рогато1 худоби.

Вперше для велико! рогато!-худоби вивчено л!п!дний та б!л-ковий склад ап1кальних 1 базолатеральних иембран. Показано, шр за вм!стом фосфол!п!д1в, холестерину, як!сному 1 к1льк!сному складу жирних кислот 1 мембранних 61лк1в ап1кальн! мембрани в1д-р1эняються в1д базолатеральних. Встановлено, шр густина БМ Менша в!д АМ. В ап1кальних мембранах 1дентиф!кована актавн1сть Са,М§~ АТРази 1 Ма-АТРази,.а в базолатеральних, додатково, На,К-АТРази. Показано, шр цикл!чн! нуклеотиди СсА1ИР, сбМР) та простагландини

- 3 -В С Т У п

АктуальШсть проблеми. В проблем1 б1ох1м11 та ф1з1олог11 травления значка увага в останн1й час прид1ляеться плазматичШй мембран i еп1тел1ю тонкого 1а-1шачника, яка дш1йренц1йована на дв1 Функд1онально-ыорфодог1чн1 д!лянки - ап1кальну i базолатеральну. Розвиток теорЦ. поромшнного та прист1нкового травления (Уголев, 1963-1967) доповнилось концепцию мембранного травления СУголев, 1972-1986) з по г ляд у вннятково! функдЮнально! рол1 ап1кальних 1 базолатеральних мембран.

Ап1кальна мембрана САМ) звернена до порожнини кишечника 1 бере участь в Пдрол1з1 речовин, 1к всмоктуванн!, а також в про-цесак секрацП (Морозов, 1938). Базолатеральна мембрана СЕМ), контактуючи з внутр1шн!м середовищем орган1зму, завершуе процес веыоктування та транспорту речовин в м1жкл1тинний npocTlp, a Tajeo» бере участь в регуляцП i п1дтрмманн1 кл1тинного гомеостазу.

Проте, роэум1ння молекулярних механ1зм!в мембранного травления ,транспорту речовин, секреторних явищ, норми та латологП травного каналу некюжливе без урахування б1ох1у1чних та б1оф1зичнин характеристик ап1кальних 1•базолатеральних мембран - як1сним та к1льк1сним складом л1п1д1в, спектром мембранных 61лк1в (Богач, Курський, 1981: Vance,1991) та ф1зичким станом мембрани - II гус-тиною (Eloya, 1933,1985). Кр1м структурно! рол1 мембранн1 л1п1ди - фосфатидил!ноз1тол (Bevridge, 1984), арах1донова кислота (Vane, 1979) - беруть також участь в регуляц11 кл1тинних та мембранних процес1в, робеут1 Юнних помп (АТРаз).

До кл1тиннмх регуляторних систем в еп1тел11 тонкого кишечника в1дносяться"також цикл1чн! нуклеотиди (cAMP, cGMP) (Doramelen, 1884-1886; Rao,Field, 1986) та простагландини (RasH-Madsen, 1984). Im же належить основна посередницька роль при патолог! 1 тонкого кишечника - д1ари1 1нфекц1йного (холера, дизентер1я, сальмоне-льоэ, E.coll) та не1н£екц1йного походження (Field, 1971; Сидаков, 1982; Юш.ук, 1982; Hdund, 1984; Hitsche, 1989). В той же час, бю-х1м1чн1 иляхи посилення секреторних явищ в еп1тел11, но маигь м1с-це при д!аре1 ал1ментарно! природи у новонародже:»их лодини та теа-рин (Анохин.1985; Frazer, 1986; Фролькис, 1989), мало БЦачен1. .

Дана робота спрямована на досл1дження особливостей структура. ап1кальних 1 базолатеральних мембран та молекулярних механ1зм1в регуляцП функц1онувшня еп1тел1альних кл1тин тонкого кишечнике.

- 5 -

беруть участь в регуляцП Функц1онально1 активност1 епИ£л1ю тан-ксго кишечника велико! рогато1 худоби.

Встановлено, шо молекулярна орган1зац1я Сл1п]дний, О1лко-вий склад, густинаЧ дм 1 ■ БМ та стан обм1ну циюЦчних нуоеотид1в в еп1тел11 тонкого кишечника новонароджених телят манят.' особлн-врст!, як1 характеризуют!. стаи процес1в травления, транспорту та секрецП в постнателъний пер1од.

Вперие на молекулярному р1вн! проведено досл1дження >.:е>:ан1э— м1в розвитку не1нфекц1йко! д1аре1 новонароджених телят. Встановлено, шр при ц1й патологП в АМ 1 БМ еп1тел1ю в1дбувакггься зм1ни -поява л1зоформ ¿ос({ол1п1д1в, зниження р1вня фосФатидилКюзитолу та арах1доново! кислота, активност! Ма,К-АТРази, як1 можуть приводите до П1ДЕИ1Д9ННЯ проникност1 (пасивного, активного транспорту) плазмалеми еп!телш для води 1 електрол!т1в. При д1аре! В еп1тел11 п1двиш.уеться р1венъ сЙАР Сале не сА№) та вм'ст проста-гландин1в. Стверджуеться, ио не!нфекц1йна д1ар^я новонароджених телят розвиваеться по сбМР-залежному механ1зму.

На основЬотриманих даних запропонована схема 1мов1ргах кля-к1в посмлення секрецП в еттелп при д1аре1 новонароджених телят за участю мембранник та внутр1шнъокл1тинних б1ох1м1чних смгтем.

„Практична ц1нн!стъ_робота. Виконана робота являе собой

комплексна доелХдкення структури, молекулярно1 орган1заиД1. ф1-зичного стану, функд1онування 1онних помп АМ 1 ЕМта б1ох1м1чних Енутр1шньокл1тмнник регуляторних систем 6 епТтелП тонкого кишечника Еелмко! рогато1 худоби. Отриман! дан1 можуть бута базою для фундаментальних I прикладних досл1д«ень иехан1з:Лв мембранного травления, впливу фактор1в зовн1шнього сепедов1"да на тонкий кишечник. який одним з периих зазнае 1х д11 Срад5ац1я, нитрита, н!трати, важкД метали, герб1циди, пестициди>.

Дан1 шодо б1лкового складу АМ 1 ЬМ ештел1ю новонароДяених телят е основою для вивчення явища колострального Шун1тету велико! рогато! худоби 1 корекцП !мунодеф!цот1в новонароджених.

Д1ерея новонароджених телят йоже бута зручною экспериментальною моделей для вивчення аналог)чно1 пробпзми в пед1атр11 з мэтою Щленаправленого пошуку ейективних преФ1лактачни:< та-л1кУ- , вальних засо51в.

Запропзнован1 нетоди отримання АМ 1 БМ, а також 1зольова«кх кл1тин еп!тел1ю тонкого кишечника рекомендуютъея для широкого використання э науков1й практииД.

- б -

-OcHQBHl положения, шо виносятъся на ззхист:

1. Розроблено Метод отримання AM 1 БМ еп1тел1ю тонкого кишечника велико1 рогато! худоби.

2. Встбновлен1 в1дм1нност1 молекулярно! срган1эац11 Сл1п1дний, б1лковий склад: густина) AM в1д БМ.

3. Виявлен1 особливсст! активностей транспортник АТРаэ AM та БМ.

4. Показан! особливос'т1 б1он1м1чного стану AM 1 БМ еп1тел1ю тонкого кишечника в постнатальний пер1од розвитку телят. пор!вня-но.э дорослиыи тваринами.

5. Встановлен! значн1 б!ох1м1чн! зм1ни AM 1 БМ еп1тел!ю тонкого кишечника телят при патологи травного каналу.

6. Запропоносано схему cGMP-залежного механизму посилення секре-ц11 електрол1т1в еп1тел1ем тонкого кишечника при д1аре1 у но-вонароджених телят.

Апробаи1я робота та публ1кац!1. OchobhI результата робота буяи докладем! на: Всес. симп."Биохим. с.-х.животных и прод.про-гр.", Ташкент, 1986 та Ки1в. 1989; Всес. симп." Обмен липидов и использование »¡ров в питании с.-х. животных", Суш, 1989: Всес. симп."Мембрана неточной каймы. Ферментные и транспортные процессы, "Рига, 1990; Всес. конф."Физиология пищеварения и всасывания", Краснодар, 1990; Всес. съезде гастроэнтерологов, Санкт-Петербург, 1990; сеи1нару лаб.травления (зав. лаб. акад.Уголев A.M.) 1н-ту ф1з1олог11 1м.I.П.Павлова, Санкт-Петербург. 1991: 1У-Укр.б1ои1-м1чному з'1зду, Ки1в, 1992; сем!нару лаб.'простагландин1в (зав. лаб.проф.Channa Reddy), Пенс1лъвансъкмй ун1верситет, США. 1992; 2nd IUBMB Conf.. "Blocheirilstry of Cell Membrane", Вагу, 1тал1я. 1993; Ann.ffeetlng of Amer.Soc.Anlm.Scl.. Minneapolis. СЙА. 1994: Кон4еренц1ях про^есорсько-викладацького складу Укр. держ. агр. ун1верситету, 1988-1994 pp.

По тем1 дисертацП опубл1ковано 2-4 пращ, з них - 12 статей та 12 - тези допов1дей.

Дана робота е частиною досл1джень, щэ вжснуаались по ?аз-данню Державного ком1тету Укра1ни з питань науки 1 технолоПй, тема N 5/193, шифр "Еп1тел1й".

Структура та об'ем робота. Дисертац1йна робота включае роздан "Вступ","Огляд л1тератури"(3 розд1ли), "Матер)али 1 матоди". "Результата 1 обговорення"(5 розд1л1в), "Заключения","Висновки" а також список виксристано1 л1тератури (491 найменування). Робота викладена на 237 стор. машинописного тексту, 1люстрована 28 рис. та 25 табл.

МАТЕРIАЛИ I МЕТОДИ.

В яосл1дженнях вмкористовували д1лянки порожню! кийки велико! рогато! худоби в1коы 2-5 рок1в чи новонароджених тэлят в1~ ком 3-5 д1б - здорових 1 хворих на не1нФек1Лйну д!ерею См1крсб1о-логЧчний та в1русалог1чния контроль). Екслердаентальних тварич, яких використсвували в гострому досл1д1, попередньО витримували на голодн1й д1ет1 протягом 12-18 годин.

Ап1кальн1 те Зазолатеральн1 мембрани отримували 1з з!скобу сдизово1 оболонки. розробленою нами методикою С рис. 15. суть яко! полягаег в таких, процедурах. Визначальниыи етапами отримання дво,х р1зних д1лянок плазматиччо! мембраии еп1тел]ю тонкого кишечника - ап1кальнмх .та базолагеральних мембран - е го.моген1зац1я ткани-ни, в1дд1лення пп1кальник 1 базог.атеральнмк мембран в1д гомогена ту, розд1лення 1х одна в1д одно! 1, нереит!. висока очистка кожно1.

Гомоген1зац1п порц!й слизоьо! оболснки проводили ножевим гомоген1з тором МРУ-302 (Польша) в середовиии такого складу (мМ): 0,25 сахароза, 5 ЕДТА, 5 трис-НС1 буФе£> рН 7,4 температура 4-6« С. об'ем 380 мл. '

Використовуючи зро£таюч1 фактори центрЬфугувакня в меж'ах 15-100 тис. е були энайденЗ оптимальн1 умови для отримання грубо! Фракц11 АМ (при 15 тие.Я) та БМ (при 70 тис.В.. Додаткову очистку препаратов здХйенювапи на град1£ни густини сахарози (%): 30. 35. 40. 43. 45. 46.5. 48 1 50 - для ап1кальник. та 20. 25. 30. 31,5, 33, 35 1 40 - для базолатеральних мамЬран,

Як1сть отриманих препарат!а оц1нювали за актиакхстю мэр-керних фермент1в ап1кальник (лужна фосфатаза) 1 базолатеральних' мембран <.Мэ,К-АТРаза)(Мигег, 1976). Забруднення комтролгвали по дом1шках субк.ч1тинних елемент1з - м1тохондр!й (сукцинатдег1дроге-наза.КПрохорова,1832), л1ээсом Скисла фосшатаза). еидаплазматич-ного ретикулуму СМАОР-Н-цитохром с-редуктаза, (Шг&г.1&?61 га компонентами цитоилазми (лактатдег1дрсгенаэа) СПро.чс зва ,5.682).

Р1зн1 популяцП везикул (правильно замкнен1. неправильно замкнен! та текучП визначши в ап1кальнмх та базолатеральних мембранах за допомогою. каншофэрмера елеметицину (Лопег. 1980; ашзеп. 1932

бисок! показкики. чистота, перехр&сногр, зебрудкення,'завруд-

нення субкл1тинними органелами, ор1ентац1я везикул АМ 1 БМ у до-рослих та новонароджених тварин (табл.1) доэволяють використов^-вати ц1 препарата для б1ох1м1чних досл1джень. Розроблена нами схема отримання агЦкалълих 1 базолатеральних мембран еп1тел1ю тонкого кишечника велико! рогато! худоби С Цвилиховский,' Усатюк, Мельничук, 1988) знайшла п1дтвердження в аналог1чн1й робо.т1 (VII-200. УеЬЬ, 1990).

Гомогенлт

р •<-10тие. £ 15 *в.

Л»

-1 15ти^60

+ ' _

промиекл -^

| 70тие.| 60 х®.

(а) . 1^70

Юэгис. ¡А г««,.

Рис.1. Схема отримання ап1кальних (а) 1 базолатеральник (б) мембран еп1тел1ю тонкого кишечника велико! рогато! худоби.

Таблиця 1.

Пор1вняльна характеристика АМ 1 БМ еп1тел1ю тонкого кишечника доросло1 велико! рогато! худоби та новонароджених телят.

М + т. п. = 5.

Покаэник АМ ! ( ! Доросл1 1 ' 1 Нэвонароджен1

К1льк!сть матер!алу,мг 10,5 ± 0.8 6.7 ± 1,1

Лужна фосфатаза,мкмоль/мг.хв:

-вих1дна актавн!сты» 0,26 + 0.02 0.22 ± 0,05

-в мембранах 2,21 ± 0,22 1,88 ± 0,22

Ступ1нь очистки 8,5 8,5

На,К-АТРаза,мкмоль/мг-хв:

-вих1дна активн1сть« 0,65 ± 0,12 0,50 + 0,02

-в мембранах 0,43 ± 0,11 1.17 ± 0,06

Ор!ентац!я везикул СО:

-правильно замкнен! 20 14.2

-неправильно замкнен1 25 27,6

-текуч1 56 58,2

Показник БМ ! ( Доросл1 ! 1 Новонароджен1

К1льк!сть матер!алу,мг 4,8 ± 0,8 4.3 ± 0.6

Лужна фосфатаза,мкмоль/мг.хв:

-вих1дна активн1сть« 0,26 ± 0,02 0,22 ± 0,05

-в мембранах 0,84 ± 0,24 0.44 + 0,05

На,К-АТРаза,мкмоль/мг-хв:

-вих!дна ективШсть* 0,65 ± 0,12 0,50 ± 0.02

-в мембранах 5,9 .+ 1,1 11,70 ± 1,04

СтуШнь очистки 9,1 22

0р!ентац1я везикул (X):

-правильно замкнен1 49,1 53,6

-неправильно замкнен1 18.4 14,6

-текуч! 32,' 7 31,8

- активн!еть фермент! в в гомогенат!

- 10 -

При отриманн1 1золъованих кл1тин еп1тел1ю д1лянку голодно! кишки (10-15 см), Промпту роэчином Р1нгера, рН 7,4 при 6-8° С, вивертали 1 розм1щували в попередньо оксигеноване сум1шю 95% Ой та 5% С02 1нкубац1йие саредовищв р1зного складу.

Х1м1чний метод включав посл1довну 1нкубац1ю кишечника в роз-чинах А 1 Б, до складу яких входят!, д1юч1 компонента - в1дпов1дно 27 мМ л:шонокислого натр1ю 1 1,5 мМ ЕДГА, як описано Hegasy, 1S83.

Отримання кл1тан з використанням фермент1в проводили в се-редовищ1 Р1нгера, модиф1кованого манн1том, такого складу (мМ): 120 NaCl, 4,7 КС1, 10 [lEPES-трис рН 7,4, 1,2 №304, 1,2 КН2РО4, 0,5 CaCls, 1,5 МаНССз, 100 манн!та. при 37° С. П1сля оксигенацИ додавали в1дпов!дну к1льк!сть ферменту: акризим-3 (0,1 30 або г!алурон1дазу (0,1 %) чи колагеназу (0,05 %,безкальц1еве сере--довишьО.З отримано! суспензИ ссаджували кл1тани при 500 е 4 хв. на кутовому ротор1.

Морфолог1чн1 показники отриманих кл1тин оц1нювали г1столо-г!чно та електронно-м1кроскоп1чно. Метабол1чний стдн оц1нювали за внутр1иньоо1танним bmIctom лактату, п1рувату (Hohorst,1959), цитрату (Taylor, 1953) та активност! цитозольно1 лактагдепдро-генази (Прохорова, 1982). Щл1сн1сть плазматично! мембрани кл1-тин-оценивали фарбуванням 0,1% трипачовим син1м (Klnuiilch, 1975) та за зростанням в 1нкубац1йшму середовищ1 лактатдег1дрогенази, : .щр вив1льнюеться 1з загинувших кл1тин.

Виходячи з морфолог1чних та метабол Л них шжазник1в отрима-шх кл1тан, 1х к1льК.ост1' (рис.2) та житгездатност1 (рис.3), ефек-тивнють використаних процедур знижуеться в ряду: колдгеназа > г1а.аурон1даза > цитрат/ЕДГА = акризим-3. Тому, вивчення показни-к1в обм1ну цикл1чних нуклеотид1в та простаглондинШ проведено з еп1тел1альни).(и кл1тшшМя> отриманими при допомоз1 колагенази.

Л1п1дпия якШз ал1кзльних та беголатералъних мембран проводили п1сля 1х екстракиД 1 за методом i.Blight, Dyer, 1959).

Холестерин попередньо вид1ляли за допомогою м1кротонкоша-роЕо!хрометографП 1 анал1зуьали кй-газо-р1динному хроматогра-<j>i(C.hrom-5), up дозволило розмежувата холестерин та його е<Ь1ри.

ФосфоЛ1п1дний склад мембран вивчали методом двом1рно:& м1к-ротонкошарово! хроматаграфП за методом (Vaskovsky, 1975 ).

Газо-р1динне ,хромато1'раФ1чне розд1лення металових еф]р1в жирних кислот зд!йснввали на склян!й колонц! 240 х- 2 мм, залов-

0} 06

1

0.7

2 0,6 •й'

и ОМ %

0.8

10

20 30

Оа)

Рис.2. ЕфективнЮть одеркання кл1тин еп1тел1ю тонкого кишечника (мг б^ка/сы^) в залежнос?1 га1д д1ючого фактору: контроль (¡0, акризим-3 (А). цитрат/ЕДТЛ Се). палурон1даза ССО, колагёназа Со).

Схв-)

Рис.3. Нэростання актибност1 лактатдеПдрогенази (%) в 1н-кубац1йному середовищ1, шо м1стоть еп1тел1альн1 кл1тида. отриман! р1зними методами: акризим-З (А), цитрат/ЕЯГА Се), г1алурон1даза (а), колагеназа Со). да 100 % активност1 прийнято контрольну пробу э 0.05 % тритоном Х-100.

нен1й 10 X Si lar 10 С на Chromsorb V/HP (80-100 ые'щ) CSupelco, ТШ a pexMMl ираграмування темперетури.

Б1лксьий склад ап1кальних 1 базолатеральних мембран вивча-ли методом електрофорезу в пол1акр1лам1дному гел1 С7 X) в при-cyTHüOTl 0,1 X цодецилсульфата натр1ю зПдно процедур«, описа-н1й (laeitimly, 1S70). Як] сну та к1льк1сну характеристику б1лк1в проводили шляхом денситометр11 гел1в. Малекулярну масу охремих б1лкових фракц1к розрахсьували з кап1бровочнцго граф1ку електро-форатично! pyxoMOCTl 61лк1в-стандарт1в молекулярних мае.

Густину ал1Кальних 1 базолатеральних мембран визначали за методом (Воловик .Демченко, 1688) з використанням флуоресцентних зонд1в, 1нтемсивн1стъ флуресценцИ яких визначали за допоыогою спектрофлуориметра Hitachi MPF-4.

Активн1сть АТРаз в ал1кальних 1 базолатеральних мембранах визначали в незабуференому середовищ за дспомогою рН-метра з чутлкс1стю 0,05 од. pH та автоматичною реестрац1еи в експеримен-тальних умовах, як рекомендовано (Болдырев, 1977).

BmIct cAMP, cGMP, PG E2 та PG Fla в суспенз11 ^зольованога еп1тел1ю визначали за допоwoгаю набору реактив1в (Araersham, Англ1я\

Активн1сть аден1латциклези та фосфод1естерази визначали за методом. описании в робот1 (Ткечук , 1983), а гуан1латциоази -у в1длов1дност1 (Albane, 19^3).

0триман1 результата оброблено статистично (Иоляков, 1Ш5),

OCHOBHI.РЕЗУЛЬТАТА ДОСЛ1ДЖЕНЬ Л1п1дн*« склад ап!кальних 1 базолатеральнин мембран.

• Проседйнлми доелддженнями вставлено, шэ л1п1дний склад ап1калъних мембран Ыдр1зняеться в1д базолатеральнцх, а обох мем-бранних фракц1й - Ml« дорослиыи та новонародженими тваринами.

Так, аагальний вм1ст фосфол1п1д1в в базолатеральних мембранах eiiu>£, н1ж в ап1кальних С табл. 2.) а у дорослия цэй показник айщр, н1ж у новонароджених.

Оеновнмми фосфол1п1дами ап1кальних 1 базолатеральних мембран £ фосфатадилхйл1н (ФХ) l фосфатидилетанолш1н СФЕ), як це показано для 1нших тварин - щура та кроля (Schwarz, 1984, 1685), ыорсько! свинки (Hayashy, 1982).К1лькЛсний buIct еказаних фосфо-

л1п1д1в виший в базопатеральних мембранах. Для ап1кальних мембран типовим е наявн1сть л1зофосфатидилхол1ну Сл1зо-ФХ) (табл.2), присутн!сть якого в ц!й чзстин! плазматично! мембрани еп1тел!ю описано також в 1иших роботах CBrasltus, 1980: Schuarz. 1984: Hauser, 1980). Для базолатералъних мембран властивия високия процентами вм1ст сф1нгам1е.Нну (СФ).

Таблиця 2.

К1льк1сний emIct фосфол1п1д1в в AM 1 БМ (нмоль/мг).М + m.n = 5.

Показник ! Доросл!

Новонароджен!

AM ! t здоров1 ! 1 XBOJ)!

Заг.вм1ет 674 + 13,4 530,7 ±51,4* 427,4 34,8

ФХ 351 + 9 219,8 + 20,1* 200.5 + 4,9

Л130-ФХ 11,1 + 4,9 25,1 ± 9,9 18,2 + 1,6

ФЕ 204 + 11 139,4 ± 12,7* 128 + 8.9

Л1зо-ФЕ - - 16 ± 0,9

№ 52,9 + 2,6 62,2 ± 4,9* ' 28 + 2,3**

1С 30 + 3.4 27.8 + 8.2 13,7 + 1,5

Л1зо-ФС - - 6,2 4- о:?

Ф1 17.3 + 2,7 41,1 t 8.5* 16,4 + 0,8**

Показник Доросл! Новонароджен1

БМ здоров1 ! 1 XEOpl

Заг. вм1ст 1555 + 34 1063 ± 35* 1225 76

ФХ 728 26,7 501,7 ± 29* 416,2 + 12**

Л1зо-ФХ - 31,1 + 10,1 74,5 16,5

ФЕ 448 + 29 302 ± 11,1* 336 15

Л1зо-ФЕ - - 43,3 + 5,3

СМ 223 + 5,7 106 ± 4* 161 + 8**

ФС 89 + 12.8 60,6 ± 16,5 78 4- 8

Л130-ФС - - 36,3 4- 3,7

Ф1 53.7 7.5 49.7 + 5 79.8 + 5,6

Прим1тка: в1дм1ннзст! достов1рн1 по в1дношенню до дорос-лих (*).! здорових новонароджених С**) тварин.

- 14 -

Пор1£шюючи фссфол1п1дний сад ад мембран доросли?! 1 новона-роджених встанорлено достов1рно п1дв1дений процентний еш1ст в ап1кальних мембранах СМ, фосфата ди л 1 но зито л у (Ф1), а в базолатеральних - Ф1 та поява л!зо-ФХ. До показник1в, шр знизилисъ, в1д-носяться ФХ (ап1калън1) та СМ Сбазолатеральн1 мембрани).

Хоча склад мамбранних "фосфол1п1д1в детерм1новачий гекетич-но СУап Реепеп, 19715, багаточисланн1 фактори середовищэ можуть слразляти значний вплиа на 1к склад. До таких фактор1в можна в1дн9сти стан, шр супроводжуеться .гострими розладаш травления в тонкому кишечнику.

Так, в ап1кшьних мембранах знижуеться вм1ст СМ, фоефатидил-серину (ОС.) та ФГ, В базолатеральних мембранах в1дм1чеио знижен-ня т1льки-р1вня ФХ, тод1 як СМ виявлено в б1льш1й к1лькост1.

Для обрх мембранних фракц1й в стан1 патологП тонкого кишечника характерним е тдвищзння р!вня'та поява нових л).зоформ фос-фол1п1л!в. В сумарнаму в!дноиенн1 лио|}оефол1п1дй стакавлят. 9,5 % вап1кальних х 12,6 % в базолатеральних мембранах.

В1дош, щр для шноацильдая лох1дних £осфол1лШ.в- прита-манна висока детергентна активы1сть (Гула, 1086,1988; Волков, 1986) 1 1х утьйрення в шмбранних структурах щце до п1двишэння прониклиаост1 CVan Оеепеп, 1971) та зм!ни активност! ыембранозв'я-заних фермент1в (Грибанов, 1975; Волков. 1986).

Тому, встановлений експериментальний факт Шдвишенного р1в-ня л1зофосфол1п1д1в в плаэматичн1й мембран1 еп1тел1ю хворих но-вонароджзни.ч телят шже яелятися одним 1з сизначаючих параметра В характеристиц! патолог1чних зм1н в ап1кальних 1 базолатеральних мембранах при Д1аре1.

Р1вень холестерину у вс1х досл1джених груп тварин вищий б базолатеральних мембранах в пор1внянн1 з ап1кальними (тайн Я)! в дорослих в 6,5 рази, , новонароджених - в 3,7.

В той же'час в досл!дженнях (Ка«а1. 1974: ВгазНиз, 1680) тгких в1дм!нностей не виявлено. У новон&роджених телят р1вень холестерину тякче в!д дорослих в 1,3 та 2,3 рази в1дпов1дно в ап1кальних 1 базолатеральних' мембранах шо, очевидно, е характерним у зв'язку з низькою густиною у них плазматично1 мембрани (НауазЫ, '1982: БЬас^ег, 1977-1986: ВгазИш, 1980).У као-рих тварин достов1рне зниження холестерину виявлено т1льки в базолатеральних мембранах (табл.З). 0триман1 дан1 п1дтверджують в1дм1нност1 л1п1дного складу та 1х зм!ни при пагалогП в ап!-,

Таблиця 3.

Вм1ст холестерину в АМ 1 БМ еп1тел1ю тонкого кишечника (нмохь/мг б1лка). М ± ш, п = 5.

Група тварин !

АМ

БМ

Доросл! 285,6 + 18,9

Нзвонароджен'.:

1864 ± 103

-здоров 1 212,3 ±4,7« -хвор! 207,3 ± 14,3

790 ± 106« 593 ± 32**

Прим1тКа; в!дм1нност1 достов1рн1 ло в!дношенню до дорослих С») 1 здорових новонароджених С**) тварин

(сальник 1 базолатеральних мембранах.

Виходячи з вм1сту фосфол1п1д1в, загальний вм1ст жирник кислот також вижии в базолатеральних мембранах еп1тел1ю тонкого кишечника. В процентному в1дношенн1 р1вень насичених жирних кислот /ршр вивдй в1д ненасичених (табл.4), тод1 як локазники насичених 1 ненасичэних жирник кислот под1бн1 в обох мембрак-них фракц1я!(. Це стосуеться такозк загальних показник1в ненаеи-чених жирних кислот - моноенових, ди-, три- та тетраенових. Найнижчий вм!ст зареестровано для триенових жирник кислот.

В ап1кальних мембранах дорослих тварин встановлено 13 1н-див1дуальних жирния кислот, а в базолатеральних - 9 (табл.5). Основна доля вм!сту Еипадае в обох чембранних фракц!ях на паль-м1танову (16:0), стеаринову (18:0), олеХнову (18:1), л1нолеву (18:2) та арах1дондву (20:4"* кислота. 0триман1 дан1 узгоджуюгь-ся з л1тературними даними для щура (5сЬиаггЛ985), кроля (ЗсЬ«аг2,1984), морсъко1 свинки (НауазЬу, 1982). Особлив1стю ешкальних мембран е наявнЮть в 1х склад1 15:0, 17:0, 17:1 та 18:3 жирних кислот, як1 в1дсутн1 в базолатеральних мембранах.

Жирнокислотний склад плазматично! мембрани епйтел1ю ново-иароджених телят мае в1дм1нност! в1д дорослих.

В ап1кальних мембранах достов1рно више загальний р1вень тарник кислот, цричому як насичених, так 1 ненасичених' (табл.4). Зм1ни серед ненасичених стосуються п1двищэння моноь- • нових жирних кислот.

-16 -

Tac, прйцентний/х1льк1сний bmIct пеш>ы1тооле!ново1 (16:1) кислота эростае в 4,6/7,6 рази, . в1дпов1дно. Для оле1ново! (18:1) кислота цей покаэник становить 1,5/2,5 (табл.5).

Встановлено в1дм!нност! в к1лысост1 1нд1в1дуальних жирн, кислот от1кальних мембран (10) та базолатеральних (11), хоча осноьними кислоталш е т1 ж, ' щр 1 для дорослих тварин.

В безола!ерш1ьних мембранах зростае р1венв пальм1тооле1ново1 та стеариново.1 кислот.

Таблиця 4.

Загальний bmIct жирних кислот в АМ 1 БМ (нмоль/м б1лка).

M ± m, п = 5

5 Ап1 кальн 1 мембран и Жирн1 » Доросл! ! Мзвонароджен! кислота !_! здоров! ! хвор!

Заг, bmIct 718,9 ± 105,3 1041 + 77* 1022 + 56

Насичен!

Нэнасичен1

Маноенов1

Диенов1

Триенов1

Тетраенов!

406.5 ±9,2

311.6 + 6,2 134,4 ±8,3

90,6 ± 15,6 2,5 ±0,4 84,1 ± 2,8

533,5 ± 12

507.5 ± 11,6*

324.6 ±10,4* 129,1 ± 16

2,3 ± 1,0* 51,5 ± 13,5*

498 + 12,7

523.7 + 17,4

431.8 ± 22** 74,6 ± 16,2**

17, 4 ± 6,3**

!Еаэолатеральн1 мем-брани

Жирн! 1 Доросл! ! Новонароджен!

кислота !

! здоров! !

Заг.bmIct Насичен1 Нвнасичен! !-Ьноенов1 Диенов 1' Tf>nenûai

2461 1326 1134 584,5 202,3 2,65

± 194 ± 13,8 ±21' ± 8 ± 44 * 0,08

хвор!

1730 ± 6Я* 1353 ± 20 1107 + 23 657,1 ± 27,8* 260,9 ± 34 4,4 + 1,7

1789 ± 153 1023,3 ± 7,0** 765,7 + 7** 531 ±8,7 134,2 ± 4 7,9 ± 1,2**

Тетраенов! 344,5 ± 44 182,1 + 19,7* 124 + 2S.5

Прим1тка: в1дм1нност! досто 1рн! по в1дношенню до дорослих (*) 1 здо^оьих новонароджених (**) тварин.

Для обох мембранних фракц1й новонародданих теляг загальни-т оссбливостями е присутнють м1ристиново1 кислота (14:0) 1 низький р'сень арах1доново! кислота (20:4).

НаявнЮть м1рист1Гново7. кислота в плазматичн1й меморан1 еп1тел1ю новоиароджених, що описана 1 в робот1 (ЗсЬиаге, 1985). може. поясншатаси э позиций 1нтеясивност1 б!ооинтетнчних прзцс-. с1в в постаатальниа пер!од, участ! м!ристиново1 кислота в транс-

Таб.пиця 5.

Вм1ст 1ндив1дуальних жириих киоот о плазматичн1й мемб'ран1 еп1тел!ю (нмоль/мг б1лка). М ± и. л = 5.

Жирн1 кислота

Ап 1 к а л ь н 1 мьмбранм Доросл! ! Нэвонароджек!

! здоров! ! хвор!

Доросл!

14:0 1зо-15:0

сл1ди 5,39 + 1,65 8,7 + 3,3

15:0 16:0 16:1 17:0 17:1 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:4 22:0 22:1 22:2 22:3 22:4 24:0 24:1

0,45 ± 0,08

125,5 + 8,2 144.6 ^ 11,2 170 ± 9,6**

2 43 + 0,3 18,3 + 2,8* 15,8 + 4,3 1,06 + 0,'12.

0,53 ± 0.12 сл!ди сдиди

96 ± 22,2 120.6 ± 16,8 64,2 + 18,2**'

55,1 + 10,3 140 + 16.1* 205 + 29**

39,3 + 6.76 03 + 7,7* 38,'2 -> 8,3*-«

0,5 + 0,25 1.12+0,51

36,4 + 1,03 25,12 + 6,6* 8,9 + 3,2*1,75 + 0.45 0,53 ± 0,18*

сл!ди сл1ди

0.59 + 0.15

5,41+0,28 .2,45 + 1,06*

порт1 мембранних б1лк1в з м1сця !х синтезу до м1сцезнаходження в мембран!»

Склад жирних кислот значно зм1нюеться при петахогП у но-вонароджених телят. К1льк1сть 1ндив1дуальник жирнмх кислот зменшуеться в ап1кальних мембранах до 7, а в базолатеральних мембранах, навпакм. зб1лъшуеться до 20.

Наиб1льш характерними зм1нами (табл.5), то стосуютьея ал1-кальних мембран, е: високия р1вень пальм1тиново1 (16:0) 1 оле!-ново1 (18:1) кислот, 1 низький р1вень - стеариново! (18:0), л1-нолево! (18:2), арах1доново1 (20:4) при повн!й в1дсутност1 л1-

Продовження табл. 5

16 в з о л а т е р а л ь н 1 мембран и Жирн1 ! Доросл! I Нэвонароджен1 кислота ! ! здоров1 ! хвор1 __!__!_!_

14:0 - 48 + 17,8 106,7 + 12,2**

1зо-15:0 - - 1,02. + 0,37*

15:0 - - 2,25 + 0,98**

16:0 504.4 ± 25 342 + 20* 216,9 + 15,8**

16:1 2,95 ± 0.3 46,5 + 11,5* 48,7 + 6,3

17:0 СЛ1ДИ - 3,2 + 0,8*

17:1 - 1,2.2 + 0,77 5,2 + 1,2**

18:0 192.3 ± 6 341 + 15* 244 71

18:1 266,5 ± 7 248 + 25 158 + 10,6**

18:2 83,2 ± 20,3 117 + 15 56 + 4,3**

18:3 - 2,0 + 1.1 0,7£ + 0.23

20:0 - - 1,84 + 0,3

20:4 158,7 ± 20 . ■ 82 + 8,8* 53.1 + 11.3

22:0. 3,45 „ 0,93 3,25 + 2,03 4.2 4- 1,12

22:1 - - 0,7 + 0,21

22:2 - - 1,22 4- 0,7

22:3 1,36 ± 0,4 - 2,76 + 0,7

22:4 - - 2,22 + 0,04

24:0 13,5 ± 4,6 10 1,08 4,7 + 2,05

24:1 - 1,38 + 0.61

Прим1тка: в1дм1нност1 достов1рн1 по в1днашенню до дорос-лих (*) 1 здорових новонароджених (**) т&ерин.

ноленово1 (18:3), бегсново1 (22:0) та л'1гмоцериново! (24:0) кислот. Особливо важливим э нашо! точки sopv е <Ьакт зникгння в ал1кальн(й мембрен1 пол1ненасичених жирних кислот, а тему чие-л1 арах1доново1,як1 & попередниками простаглакдин1в (Vane.1979).

Жирнокислоткия склад баэолатерадъних мембран зазнае еутге-вих зм1и. По-перше, в пор1вняннг 1з здоровими в базолатсраль-них мембранах хворих тварин встановлено п1движения в 2,2 рази м1ристиново! кислота (14:0). 1мов1рно, такий зисокий р!венъ ц1-el кислота пов'яээний з 1нг]був9нням реакцШ по нерошуванню вуглецевого остову I перетвореннп м1ристаново! в стеаричову кислоту. • По-друге, в бозолатералън1й . мембран1 вмявлено ц1лий ряд жирних кислот - 1зо-15:0, 15:0, 17:0, 20:0. 22:1,22:2, 22:3, 22:4, 24:1. як1 не властив1 для здорових новонэродкених. a bmIct 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 20:4 1 24:0 нмжча в1д здорових. Безсумн1вно, щр отримян1 зм1ни жирнокислотного складу баэолате-ральних мембран гЛдображаютъ як глибок1 патолог1чн1 зм1ни. так 1 компенсаторы! реакцП еШтелИи при д1яре1. Наприклад. олеХ-нова, пальм1тооле!ново та лШолева кислота е ефектиэними 1нг1б1-торами Na.K-ATFasii (Kasnhlko. 1690; Olshl, 1690: Shvartr-, i&fiO). 0ле!нова кислота подавляе роботу б1лк1в-перскосчик!в(Т1гарра1Ы, 1988), октавуе роботу 4юсфод1естерази (Северин, 1983)

Б)лкоеип склад ап1кальних 1 базолатералъних мембран.

Б1лковкп склад ап1калы:их мембран в1др!зняеться в1д базо-латеральних як1сним та к!льк!сним складом, мае ссобливост! для новонародхенмк тварин.

В ап1калъних мембранах зп1тел1ю тонкого кишечника доросло! велико! рогато! худоби методом «электрофорезу в пол1акр1лам!дно-му гел1 виявлено йлизько 17 б!лк.ових ^ракц1й, тод1 як в базола-теральних мембранах - 7 (рис.4).

В агИкдльнмх мембранах переважають високомолекулярн1 о'1лки (140-440 кД , як! эаямаотп б1ля 27 % в)д yclx б1.пк!в Стабл.6) 1, очевидно, являють собою г1дрел!п:чн! карбогхдоази еп1тел!ю. IJ! 61лрчи можуть представлять трегалазу, мальтазу, 1зомальтазу чи сахаразу. Можка в 1дмпита 1 -зисокий bmict низькомолекулярник 51л-к!в в мржех 25-35 кД (31 %), як! за молекулярном масою в1дпов1яа-ють багаточисельним б1лкам-переносчикам ам1нокислот ! монисахеря-- д)в (Semenza. 1932; Haasе. 1930; Hoffman, 1921).

- 20 -

В С1лкоьому спектр1 Сазолатералъних мембран (рис.4) дорослих теьрич переважакггь середньо- (100-80 кД) та ниэькомолек.улярн1 (60-15 кД) б1лков1 фракц11, як1 стоновлятъ в1дтов1дно 32% та 54% в1д ус1х'мембранних б!лк1в (табл.7).

У новонюоджених телят встановлено 17 б1лкавих Фракц1й в ап1кальних мембранах 1 12 - в баэолатеральних. Пор^внюючи отри-

Рис.4. Денситограш б1лкових фракц1й АМ (А) 1 БМ (Б) еп1Ге-. л1ю тонкого кишечника доросло! (а) велико1 рогато1 худоби, здоровий (б) та хворих (в) новонароджених телят. Цифрззд позпзчсш нгмсри б1лкових фракЩЯ, стр!лкою -напрямок електрофореэу..

ман! дан! з дорослими тваринами, можна в!д.м1тити зниження р1ьня б1лк1в з мол^кулярНими масами 340-440 кД та 80-82 кД 1 п1двишен-ня б1лкових фракц1й 130-140 кД, 93-100 кД, 88-90 кД, 8ГЗ-85 кД, 55 - 60 кД та 43-50 кД. ЗПдно малочисельним даним л!тергтури

Таблиця 6.

Б1лковия склад ап1кальних мембран (%). М ± т, п = 5.

Б1лки, ! ! Нэвонароджен1

кД ! Доросл1 ! здоров1 ! хвор1 _!_!___!__

340-440 16,19 + 3,76 7,54 + 0,2* 6,61 + 1.12

200-240 6,81 + 0.98 7,63 + 1.1 . 6,52 + 0.93

140-160 4,33 + 0,64 5,8 + 0,29 6,25 + 0,14

130-140 3.49 + 0.11 4,17 + 0,16* 4,76 + 0,40

110-130 4.26 + 0,42 4,14 + 0,17 4,84 + 0,50

93-100 1.7 + 0,14 2,39 + 0,08* 2,4 + 0,17

' 88-90 1.52 + 0,18 3,34 + 0,37* 3,62 + 0,42

85-88 2,25 0,58 3,50 + 0,28 3,18 + 0,28

83-65 1,43 + 0,3 2,82 + 0,34* 2,82 + 0,44

82-63 1.9 + 0,41 3.52 + 0,79 4.27 + 0,04

80-82 6,59 0,71 3.86 + 0,46* 4.66 + 0,33

55-60 3,41 + 0,74 6,09 + 0,53* 6,3 + 1,51

48-50 2,64 + 0,19 7,54 + 0,08* 6.2 + 0.98

33-35 . 15.21 + 0,61 14.37 + 0,30 14.11 + 1.5

25-28 15,94 + 2,4 15,06 + 1,5 13,99 + 2,74

20-22 6,42 + 0.97 4,35 + 0,53 4,59 + 0.17

15-17 5,89 + 1,53 3,77 4- 0,49 4,56 + 0,6

Прим1тка: * - достов1рно по в1дношенню до дорослих тварин.

(ЗееИчагат, 1977), для новонароджених тварин характерним е п1дви-шрчня р1вня одних б1лк1в 1 зниження 1нших. Не може пояснюватась особлив1стю год1вл1 та типом травления - молозивним пер1одом. В раньому постнатальному пер!од1, наприклад, досить висока актив-н1сть лактази, та низька - сахарази. 3 в1ком, активн1сть першого ферменту падае, а другого зростае (ЗееИ1ага1П,1977). Кр1м того, для жуйних тварин в1доме явишэ колострального 1мун1тету, яке по-лягае в формуванн! р1Еня 1мунних б'1лк1в плазми кров1 за рахунок 1муноглобул1н1в молозива (ВиПег, 1983). Всмоктування в тонкому кишечнику в нативному вигляд! цих 1мунних б1лк1в в1дбуваеться за рахунок молекулярних структур еп1тел!ю (Назегеиа, 1990) 1, мож-

Таблиця 7.

Б1лкоьий склад базолэтеральних мембран (%). М + ш, п = 5.

В1лки, ! Дэросл1 I Нзвонародовн1

кД Г ! 1 » здоров1 ! 1 хвор1

340-440 5,77 > Й.5 • - 5,29 ±1,0 . 4,39 X 0,57

240-340 3,04+1.73 5,09 + 0,5 4,83 ± 1.43

200-240 ; СЛ1ДИ 2.82 + 0,0.1« 3.17 + 0,48

140-160 . слхди 5,3 + 0,32« 6.98 ± 0,63

88-90 17,84.+ 2,73 6.22 + 0,31« 6.82 + 0.29

83-85 14,31 ± 0.71 10,22.+ 0,15» 9.47 + 0,79

80-32 V 5,53 + 0.16 6,61 4. 1,14

43-50 >16,68 + 1,33 12,18.4 0.36 11,88 ± 1.2

33-35 14.23 + 0,32 13,94 ± 0.6

30-32 ] 12,97.'+0,38 , . 12,21 ± 0,44

25-28 20,89 + 0,4 10.87 + 0.38* 10,57 ± 0,2

15-17 16,48 4 0,62 8.5 + 0,09* ; 0Д ± 0,81

Прим1пш:' * ~ достов1рно. по в1дношённ» до дорослих твярин.

ливо, за учаспо не1дентиф1кованих . б1лк1в-перегюсчик1в. Ц1лком 1к(ов1рно, ио чаеткна б1лк!в ап1квлъних або базолатералъних мембран, шр описан1 наш, мають в1днашення до ц!еи функцП оргенХзиу новонароджених телят.

Патология травного каналу достов}рно не зм1нке як1сного та к1льк'1еного бокового-складу ап1калъних 1 базолатёральних мембран (табл.6 1 7). На осноа1 цього можна заключите, цо при д1аре1 новонароддагних телят не в1дбуваеться структурных зы1н б1лкпваго остову мембран, а шр Щ зм1ни стосукггься, очевидно, т1льки 1х функц1о-нальних иаректеристик.

1нтегральн1 покьзники л1п1дного 1 бокового складу . мембран..

Функц1ональн1 властивост1 В1олог1чних мембран, . мембра-нозв'язаних фермент1в, 1онних канал1в. рецепторта 1н«х .61л- ковия структур мають високу зале«н1сть з!д Л1п1дного складу

мембран, к1льхост1 окрепли клас1в чи 1ндив1дуальних л1п1д1в Олова, 1988; Vance, 1991).Тому, все част1ше для характеристики б1олог1чних иембрад використовуюгь так1 1нтегральн1 показняки : в1дношення л1Шд/й1лок, холестерин/лос4ол1п1ди, насичен!/ненаси • чен1*!«ирн1 кислота.

Так,. л1п1д/б1лкове сп1вв1дношення в ап1калъних мембранах "доросли* тварин менше, н1ж в базолатеральнии, 1 може тюлошватось

Таблиця 8.

1нтегральн1 показники л1п1дного 1 б1лкового складу AM 1 БМ .

! ^п1кальн1 мембрани Покаэник ?- Д)росл1 ! гЬвонароджен!

-" ! • ! здоров1 : хвор! __■ :!- ____^__„!_.___:_!____;

Сп1вв1дношення"

-л1п1д/б1лок 0,77 • 0,60 0,36

-холестерин/

фосфол1п1ди 0,42 0,40 0,46

-насичен1/нена-

сичен1 ЖК 1,30 ; 1,05 0,95

Густана

мембрани 2Д6 1,38

(Б б з о лат ералън1мембрани ГЬказник ( Доросл1 ! Нивонародкен1

! I здоров1 ! . xbopI

-__j____- . I - - I___^___

Сп1вв1дношення:.

-Л1П1Д/61лок 1.37 . ■ 1, ,07 > 0,70

-холестерин/

фосфол1п1ди 1/20 • 0, .74 0,48

-насичен1/нена-

сичен1 ЖК ' 1Д7 1, .22 1,33

Густана -

мембрани 1,14 . . 1. 00 -

високим BWlCTOU Г1ДРОЛ1ТИЧНИХ, структурник, транс-портних 1 ско-ротливих структур а ц1и д1лянц1 . плаэмалеми era тал1ю. Високий BMlcT холестерину в базолагеральких мембранах п1двищуе в них 1ндз1сс холестерин/фосфол1п1ди. В1длов1дн6, висский р1Еень наси-чених жирних кислот в ап1кальних мембранах веде до високого 1н--дексу наеичен!/ненасичен1 жирн1 кислота. В результат1. експери-ментальна величина густини ап1кальних мембран становить 2,16 проти 1,14 в базолатеральних Стабл.8).

Sk вказухлъ дан1 л1тератури, д1йсно, ап1кальн1 нембрани еп1тел1ю тонкого кишечника р1зних тварин маоть б1льшу густину (Meddlngs. 1969; Pang, 1983: Schwarz,-1989: Brasltus, 1984).

Густина обох мембранних фракций у новонародкених тварин 'значно нижча, в пор!внянн1 з дорослими. При цьому спостер1гаеть-ся зниження 1ндексу холестерин/фосфол1п1ди, насичен1/ненасичен1 жирн1 кислота.

За гострих розлад1з травления тонкого кишечьика знижуеться сп1вв1дношекня л1п1д/б1лок, холестерин/фосфол1п1ди. Е£;эсумн1вно, щр це noMlTKO знижуе густину мембран 1 коже п1двищуаата 11 про-никлив1стъ 1 впливати на. роботу багагьох ферментних систем та Ьннич пош (Бурлакова, 1984; Elova, 1663, 1S85: Shachter. 1Ô8S).

Тому наступна частана ншо1 робота була приев'ячена вив-ченню АТРаз ллазматачно! мембрани епггел1ю.

Аденозинтрифосфатази ап!кальних 1 базолатеральних мембран.

При ВИВЧ2НН1 г!дрол1зу АТР мембранними фраоЦями еп1тел!й тонкого кишечника необх 1дио враховувати, uip як в an¡кальних, так 1 ь базолатеральних мембранах м1ститься високоактивна луж-на фосфатаза, яка здатка зд!ясп:ж£ти неспециф1чний г!дрол1з ATP (Staitz, 1973: Ghijsen, 1982: Gilles, 1934).

ГЬвне 1нгШування лужно! фосфэтгаи за до помогаю в1домого 1нг1б1тора - теофШиа .(Ghijsen, 1982) в!дбуваеться в ап1кальних мембранах при концентрацИ теоф1л1на 40 ыМ, а в базолатеральних мембранах - 20 мМ, щр викликане резною питомою актавн1стю фермента в цих мембранах, в!дпов1дно 2,21 ± 0,22 1 0,84 + 0,24 мкмоль/ыг.кв.

Прис.-утн1с-ть теофШну дозволяв стеерджувати, щр г!дрол1з АТР на цьоыу фонГ Срис. 5) в ап1кальних та базолатеральних мембранах притаманний -робот! АТРаз.

В присутност1 уаб«1ну эниженнч АТР-г1дрол1зуючим власти -воете« рееструсться т1.чъки в баэолатералъних ме^йиан^к, 'ф св1дчить про наявн!сть в них Ма,К-АТРази, 1 в1дсутн1сть цъого ферменту в ап1кальних мембранах. '

Проба э безкальц1евим середоьищем Щдтверджуе наявн!еть активноеП Са, Мй-А1Рази в обох мембракних ФракЩях.

Сум1сне внесения в !нкубац1йне середовиада теофШму, ЕГТА, уаба!ну виключае. активн1сть лужно! <№сфатази, Са.Мй-АТРази, Ма.К-АТРази, а актибЩсть, яка рееструеться, наложить Мз-АТРа-э1, яка не виявляетьея в безмагн1евому сербдовмщ (рис.5). Створення 1нкубац1йних умов, в яких не здатн! проявити сво! АТР-г1дрол1зуюч1 властавост1 э гад ян! фэрменти, приводить до в1д~ сутност! г!дрол1эу АТР.

ю го зо fx в)

С* в)

Рис.5. Г1дрол1з АТР ап1кальниш (а) 1 базолатералъниш (б) мембранами-. Сгр1лкою вказана 1н1ц1ац!я реакдИ добавкою На-АТР. По значения: 1 - контроль: 2 - в середсвиш.1 дсяатаово' присутньо 40 (20) мМ теофШ-на, в1дпоыдко для а (б), в пссл1дуючих пообах вс1 добавки сумукться; 3 - теоф1л1н + ЕГТА (5 мМ): 4 -теофШк + ЕГТА + уаба1н С1 мМ); 5 - вс-ь. як ч по-'передиШ проб!, .апэ у в1дсутност!

Ha ochqbI отриманих даних можиа стверджувати, шо в ani- , кальних мембранах локал1зовгжа активн1сть Ça.Mg-АТРази 1 Мй-АТР-ази, а в базолатеральних мембранах - Ма,К-АТРазн, &:,Мй-АТРази 1 Mg-АТРази.

Очевидно, шр традицдино розрахована активн1сть АТРаз не в1дображае слравжньо1 актувност1 цих фермент1в в ал1кальних 1 базолатеральних мембранах. Активн1стъ Ма.К-АТРази в!«пов1дае актив-hoctI цього фермента т1лъки'в текучих везикулах Ода.тоблЛ ), коли А'ГР-г1дрол1зуюча та уаба1н-зв'язуюча д1лянки досгупн1 для сво-1х субстрат1в. Для 1нших АТРаз невраховансю е 1к актавн1сть в правильно эямкнених везикулах. Сл1д сказати, шо про обережн!сть п1дходу при б1ох1м1чних досл1дааннях везикульааших мембранних преларат1в попереджуюе ряд досл1дник1в (Мэрозов, 1988; Murtr-, 1984).

3 урахуванням проценту невиявлених активностей АТРаз за-гальна питома активн1стъ цих фермент1в в ап1кальних 1 базолатеральних мембранах представлена в табл.9.

- .....v^^ ч Таблица 8.

; Питома. ачтивн1сть АТРаз в АМ 1 БМ. ( мкшль/мг.'б liка': №. ). M i .m. п = • 5.

! ! • .

Фериент-.....»-—"-•дм ! БМ

о'- i<> v -г- '"'■•___

Na.K-ATPaan сл1ди >0,990 + 0,031 Са.Мй-АТРаза 0,393 ± 0,018 0,795 ± 0,025 Мё-АТРаза 0,220 + 0,013 0,403 + 0.022

Йайвнкггь Ш. К-АТРази т1льки в , базолатеральних мембранах зр<мум1ла э-точки'зору $1з1блог11 та Б1он1мЦ еп1тел!ю. бо робота ферменту'в напрямку порожнйни кишечника недоцхльна. Аналопчна локал1зац!я Wa.K-АТРази для плазматично! мембрани еп1тел1в тонкого киаечнйка описана для . щура , (Freednan, 1977: Scalera. 1&S0: Mlrcheff, 1980: Faelv, 1984), кот! (FuJlta. 1972), морсько! свинки (Тяхег.яяьц, 1978), кроля (Colas, 1980) 1, на думку СИаvahara, 1S83). е типовою для bcíx тап1в еп!тел1альних кл1тан - секретую-чих та есмиктуючих,

- 27 -

Питома активн1еть Na,K-ATPs3n, отримана нами для велико! рогато! худоби, узгоджуеться з роботами, в яких waairь без ура-хувакня ор1ентац11 везикул представлен 1 значения актизнос-rl: 0.32-0,75 (Gratecor, 1973: Van Оз. 1080: De Jong. 1881) та 1,07 -3,34 мкмоль/мг-хв. (Scalers, 1930; Faelll, 19S4).

Пор1внпючи активн1сть Na,К-АТРази в р1зних тканинах, можна в1дзначити 11 еиший р1вень в еп1тел11. На нешу думку це мажь по-яснюватись к1лькома причинами. По-перше, Na. К-АТРаза базолатэ--рально1 частини плазмалею1 еп1тел1ю виконуе в1дпов1дну фувдлЦ» 1 за ап1калъну мембрацу, де цей фермент вддсутн1й. Гю-друге, високий пот1к Na+ разом э моносахаридами 1 ам1нокислотечи через ап1кальну мембрану (Никольский, 1977) викликае необх)дн1сть в1д-качуьання надлишку натр1ю з цитоплазма. Правда, альтэрнативним може бути 1енування Na-АТРеэи, що пропонуеться в робот! CDs.. Castillo, 1985).

Са.Ма-АТРазна алтиЕн1еть ап1кальних мембран належить. очевидно. м1озиипод1£)Ному б!лку цих мембран (Марозов. 1988; Dr«nk-hahn, 1?М: bfeaseker.iQSS"). оск1льки аналог)чью На.К-АТраз1 1с-нущння Са-транспортуючо1 помпи в ц1й частин1 плаэматмчно1 мембрани еп1тел1» недоц1лъне.Питома актигн1сть Са.Мй-АТРази. що виявлена для велико! рогато* худоби, близька за величиною амало-г1чн1й активност1 Са,Mg-АТРази ап1к.альних мембран свин1 COiiva-• shlky. 1987), щура (Ghllsep. 1980).

Б базолатеральних мембранах Ca.Hg-AiPasa транспорту^ Саг+ з цитоплазми в м1йзсп1'гинний прост1р. Питома активнЮть 11 для щура, шо описана в роботах (Neelans, 1981; De Jong, 1981; №v, 1986), становить 0.024-0,08 i/кмслъ/мг 61 лка-у.в.

Локал1гац1я Mg-АТРази в обох мембранник фракц1ях узгоджу-еться з даними л1тератури про I! розпод1л в плазыатичн1п мемб-рак1 еп1тел1» (№у, 1SQ6; Tirupnathl. 1982J, хоча ф!э1олопчна роль Mg-АТРази до к1кця не вивчена. Передбачаеться 11 участь.в регуляц11 рН кл1тини 1 зовц1шнъокл1тиннога простору (Tiruppathl. 1982),як це лостулюеться для №-АТРази гепатецит!в (Luu.1983).

Таким чином. О'гримдн! j!£tnl св1дчать про ная»н1сть в anl-*альних мем5рана5£ еп1тел1ю тонкого кишечника велико! рогато! худоби Са,'-й-А,ТР.дзи. Нз-АТРази. а в базолатеральних - Na К-АТР-ази, Са,Мй-АЛРази та Ме-ДТРазы з р!зною питомою активн1етю 1". ' очевидно, р1зноо 6Юлог1ч№й) ф\-нкц1е«з.

У зэ'язку з активно» участ® транегюртних АТРаз в р}знома~

5 <

'5 и

\ £35 •в ъ 2

г

Рис.6. Актавн1сть На,К-АТРази в БМ еп1тел1ю тонкого кишечника доросло! велико! рогато! кудоби (1). новонародженик • здоровик (2) 1 кворих (3) телят.

<

у <

'5

и *

р.*

л

§

5 г I

iy.fi)

(.Уй)

Рис.?.

Актмвн1сть Са.Ш-АТРази в АМ (а) 1 БМ (б) еп!тел!ю тонкого кишечника доросло! велико! рогато! худоби (1), новонароджених здорових (2) 1 хворих (3) телят.

Н1ТНИК процесах кл1тини, 1к чутлив1стю да зм1ни стану мембран, м1крооточення, сл1д чекати особливостей в"активност1 цих Фермен-т1в у новонароджених тварин в норм1 1 при порушенн! функц11 тонкого кишечника.

Активн1еть Na.K-АТРазм базолатеральнизс мембран не в1др1э-няетьея м1ж дорослими 1 здоровими^новонародженими тааринами, то-д1 як у хвори.ч вона знижена в 5,3 рази (рис.б). Враховуючи Функцию М.а.К-АТРази ri ел1тел!1, в!дом! втрати Na+ орган!змом при д!а-

Схв) С* в-)

Рис.8. Активн1стъ Mg-АТРази в AM (а) 1 15М (б) еп1тел1ю тонкого кишечника доросло1 велико! рогато! худоби С10, новонароджених здорових (2) 1 кворих (3) телят.

pel новонароджених телят СМэльничук, 1937), очевидна причетн!сть даного фермента до патологи. Град1ент концентрацП Na+ в систем1 кров-ец!тел1й-порожданя кишечника направлений, s план1 зменшання, в сторону кишечника. Тобто при наявност! двох фактор1в - знижння активност! Na.K-АТРази базолатеральних мембран 1 л1дви1ф;ння про-hhkhqctI ап'1кальник v.ewSpaH буде е1дбуватись б'еэконтрольна втрата организмом'цього основного юну б)алаИчних р1дин - кров1, л1мфи. м1жкл1тин>к>1 р1дини. При цьому на один Юн Ma бу^« втрачатаеь до 14 молекул еадм в ног о г1лратних обо лайках.

1нг!буцжння tto,i{-ATPd3U баэолат£рзльних мембран мсжлиее як за рахудак. здгального ¿тану мембранних л!п1д!в. окремиу 1х

KJisclE, гйк I через вкутр)шньоклItmhhJ регулятора! системи - цик-jil4Hl нуклеотати. лростагляндини. ,пррте1нк1назу С. Так, эниження активкост! Na.K-АТРези описане п1д вппивом л!зофосфол1п1д1в (Olsbl, 1989), парекчечого окисления л!л1д1в (.'Владимиров, 19??; Мусил. 1G8S; ОЬуагЫЫ. 1985).

Л1двищений ем1ст л1з0-ФХ. новоугворення л1эо-ФЕ та л1зо-ФС зареестровано нами в базолатеральних мембранах. Нэ виключений таю* еплив осмотачния ефект!й на активн1сть Na.K-АТРази (Yare-mento, 1991), я<1 можлив1 в еп1!гел1.1 при патологи.

Активн1сть Са,Mg-АТРази вище в ап1калььих мембранах ново-народженик 1 можи в!дпов1дати 1нтеистя-1и' робот! скоротливого шерату ulKpoBopcuHoit п1д час особливого транспорту речовин nl-ноштозним шляхом в uen в1ковий пер!ол. У хворих телят, як в ап1кальних, так 1 в базолатеральних мембранах активн1сть Са,№-АТРази зндаена (рис.7). При цьому ¿>!домо, що при д!аре! знижу-етьс? р1вэнь СЬ1> в, плазм! кров! (Мйльничук, 1987).

Ме-АТРазна активн1сть в обох мембранних Фракц1ях еп!тел1ю .новонароджених телят вмща, в!д дорослих (рис.8). Яюцр прииняти Ппотеэу (Tlr-uppathl, 1.9ЙЗ:. Luu, 1888) про роль цього ферменту поверхнево1 иембрани кл1тини в регулядП рН, го п!ноцитозний шлях в*оду речовин в еп1тел1й новонароджених потребуе 1 б1льш потужно1 рН-регулюючо! системи. А знження активност1 Mg-АТРази при д1аре! узгоджуеться з пррушенням кислотно-лужно>1 р!вноваги .орген1зму (Мгльничук. 1987).

В=* нашу душу, якшр розглядати не!нфакц!йну д1ерею новонароджених як компенсаторна-адаптшийну реакц!к) орган 1зму, до обговорюеться для тонкого кишечника в цдлому (Parsons. 1990; Груздков. 19®7), .1 яка направлена на вимиьання несприятливого вм1с!гу травного каналу (перегодовування, кезе!нов1 згустки, не-доброякЮна 1жа ia !н. 1 то стае в!рог1дною необх1дн1сть знач-но! секрецП води 1 електрол1т!в в поражнину кишечника.

В осноа1-пускових механ1зм!в секрацП в тонкому- кишчнику< е цикл1чн1 чуклеотиди та простагландини.

Показники обм!ну цикл!чних нуклеотад1в та пр0стагландин1в.

На дания час р1вень цикл!чних нуклеотид1в в тонкому кишечнику вивчено в б!оптатах, з!екобах слизоео! оболонки чи частмн-ках кишечно! ет!нки. Безсумнйвно, що значний вклад в показник.

шр досл1джуеться, вносять 1ншЛ тканини. Особливо це актуально при д1аре1, яка супроводжуеться високою моторною актавн1стю кишечника. Кр1м того, шлунково-кишковий тракт може бути джерелом цякл1чних нуклеотид1в в кров1, як! ф1льтруються через нирки. Тому, кр1м 1зольованого кишечного еп1тел1ю нами контролювався р1вень сАМР 1 сбМР в плазм! кров! та сеч1 тварин.

Вм!ст сАМР в 1зольованому еп1тел11 тонкого кишечника доросло! велико1 рогато! худоби становит& 59,4 ± 10,9 пкмоль/мг б1лка (рис.9) 1, очевидно, в1-дпов1дае видовому ф1з1олог1чному р1вню цього вторинного посередника. У здорових новонароджених телят цей показник- не в!др!знявся в!д дорослих (46,21 + 20,6).

«г

ii <

ю

l

i

<

о

2 у

с

бо

so

зо

2.Q

10

- X

а

I

б

во

so < 1

Ао \

JD

зо

•ао

ю

<

о 2

с

1 г 3

1 2 з

125

Рис.9. Вмют сАМР в 1золъованому еп1тел11 тонкого кишечника (а), кров1 (б) та сеч1 (в) велико! рогато1 худоби. Позначення: 1 - доросл.1 тварини; 2 - здо-ров1 новонароджен1: 3 - хвор1.

У новонароджених телят, хворих на д1арею, р1вень сАМР значно Снижений у пор1внянн1 1з здоровими новонародуеними (8,03 + 1,37). Бисокий р1вень еАЧР в тонкому кииечнику отмгдмо при холер1 (Field,1971:.Parkinson, 1972), сальмонольоjl (Ющук, 1982; QmJike,- 1SSQ). дизентерИ (Бунин. 1981; Сидаков. 1982). 1нфекц1йн! д!аре! супроводжуоться эростбнням сА№ в плазм! кро-

в1 1 ееч1 (Бунин, 1881; Сидаков,1982; Ю1дук, 1982). Але в наюк досл!дженнях р1вднь сАМР в плазм1 кров! та сеч1 телят не в1др1э-няетъся ы1ж здоровими та хворими новонародженими тваринами.

Тому, отриман1 дан1 щрдо низького р1вня сМ*Р в ел1тел11 при д.<аре1 дозволяют стверджувати, цо сЛМР не приметна до патологП.

При дизентерН', яка розвиваеться по сАМР-эалекному меха-н1зму, з ростом р1вня в кишечному еп1тел11 сА№ <гпостер1гаеться зни'ження сиМР (Бунин, 1931).

Як ми показали (рис.10), при порушенн1 функц11 тонкого ки-кечника новонароджених телят вм1ст в еп1тел11 сОМР на порядок виший у хворих, в пор1внянн1 1з здоровими та дорослими (сл1дов1 к1лькост1).3 цими даними узгоджук/гься р1вн1 сбМР в плазм! кров1. В сеч! спостер!гаеться зворотяя картина. Причетн1сть сОМР до се-

<г

У < -10

ш с 8

г

\ &

л

§ А

1

¥ с 2,

а

<

о <

0

1 у с

I

125

ло •10

8

3 < 2 4

6 - Ч 6 ■

0

А ГГ к 0 г м -

2 - в X 2, - 1

,11 1

1 г г 1 2 Ъ

Рис.10. Вм.<ст СиМР в 1зольованому еп1тел11 тонкого кишечника Са). кров1 (б) та сеч1 (в) велико! рогато! худоби. Позначення: 1 - доросл! тварини; 2 - здоров! новонароджен1; 3 - хвор1.

креторних явит в кирках, необх1дн1еть зменшення сечоутеорення при втратах р!дики у хворих, як це описано (Бунин, 1931; Сарг1с111, 1980), пояснюе кизькип р1вень сйМР у сеч1 новонароджених телят при д1аре!.У дорослих тварин ' здорових новонароджених, як! вживе-

ють велику к1льк1сть р1дини з кармами, виникае необх1дн1сть сек-рецП значно! к1лькост! р1дини. Зв1дси, вм1ст сбМР в сеч1 хворих телят в 44 рази нижчий,н!ж у дорослих 1 в 10 раз - н1ж у здорових новонароджених телят.

Таким чином, отриман1 результата св1дчать про пряму участь с6№ в розвитку секреторних явищ при гострих розладах травления новонароджених телят.

Активн1сть аден1латциклази в еп1тел11 тонкого кишечника дорослих 1 здорових новонароджених тварин (рис.11), узгоджуеть-ся з описании више р1внем в1дпов1дного ци(«л1чного нуклеотиду. Величина питомо! актавност1 аден1латциклази близька до тако1 в: 1нших тканинах (Курський, 1980; Сл1нченко, 1979).

1дентично низькому р!вню сАМР в еп1тел11 хворих на д!арею

Рис.11. Активн1сть аден1латциклази (а), гуан1латциклази (б) 1 фосфод1естерази (в) в 1зольованому еп1тел11 тонкого кишечника вёлико1 рогато! худоби. Позна-чення: 1 - доросл! тварини; 2 - здоров1 новонарод-^ жен1: 3 - хвор1.

телят у них зареестровано нижчий на 35 % р1вень активност1 аде-н1латциклази.

Висунута концепЩя про участь с£МР в 1н!ц1ац11 секред!!

при дlapel новонароджених телят п1дтверджуетъся 1 високмм р!в-нем в 1х еп1тел11 активност1 гуан1латциклази (рис.11), яка в 2,2 рази вищз, н1ж у здоровил.

Активн1сть фосфод1естерази у дорослих тварин близька до опиеано1 у кроля (Куреький, 1984), а у здорових новонароджених телят б1льш н1ж в 2 рази нижча (рис.11). В той же час; у хворих новонароджених телят в пор1внянн1 1з здоровими спостер1гаеться Шдвишення активност1 фосфод1естерази. Очевидно, процэси. як1 приводять до активацН гуан1латциклази, зниження активност1 аде-н1латциклази, ведуть до активацН фосйод 1естерази. 1ншм пояснениям шжа бути стимуляц1я ферменту п1двишеним р1внем цикл1чного гуанозинмонойосфату.

В1домо, цр р1зноман1тн1 кл1>инн1, мембранн1 та зовн1шн1 Фактори можуть справляти вплив на системи регуляцП при участ1 цикл1чних нуклеотид1в.

Аден1латциклазний комплекс здатний кр1м гормон1в 1 мэд1а-тор1в в1дпов1дати на зм1ну фосфол1п1дного складу мембран (Hedvlchakova, 1987), густини (Salesse, 1984), концентрацИ каль-ц1ю (Юрк1в, 1980), р1вкя простагландин1в (Ayton, 1988).

В протилежн1сть аден!латциклаз1, яка локал1зована в базо-латеральн1й ыембран1 1 достатньо вивчена, мехзн1зми управл1ння гуан1латциклази (Севергина 1937) ап1кальних. мембран нев1дом1. Кр1м стимулюючих ефакт1в термостаб1льного токсину E.coll СDoir.me-len, 1986), окису азота (Arnold, 197?), ведуча роль в управл1н-Н1 секреторними процесами в еп1тел1! за рахунок Шдвищення р1вня cGMP в1дводиться в останн1й час GTP-зв'язуючим б1лкам (С-б!лкам) (Hlrata, 1990; Gllman, 1987). Значна регуляторкз роль може нале-жати окремим класам л1п1д1в ап1кальних мембран. За нашими дяними, в ц1й частин1 плазматично1 мембрани еп!тел1» при д1аре1 давона-родж&нии телят достогйрпа зникуеться р1венъ б1олог1чно активних фосфол1п1д1в - Ф1 1 ÎC - 1 попередника проетагландин1в - apaxl-доново1 кислота. Зв!дси, ыожна було оч1кувати втя.гнення в пата-лог1чний процес простагландин1в.

BmIct простагландин1в Ей та. Fla в 1зольоеаному еп1тел11 тонкого кишечника доросло! велико! рогато! худоби(рнс.12) в!дпо~ в1дае Ix б1олог1чному р1вню в тканинах (Preellk, 1967; Rasît-ffedsen, 1934).

В еп1тел11 новонароджених телят р1вень простагдандии1е нижчий в1д дорослих в 5 раз - PG Ей 1 ' в 3 рази - RS Pu

s"oo

500

Meo • £

ЧОО

300

zoo • т

1 г з

1 2 s

Рис.12. Вы ici простагландин1в Ей (а) та Fla (б) в 1золъ-ованому еп1тел11 тонкого кишечника велико1 рогато1 худоби. Позначення: 1 - доросл1 тварини; 2 - здо-poBi новонароджени; 3 - хвор1.

(рис.12). Встановлена оссблив1сть для новонароджених телят (.гаже в1дображати специфику травного каналу в ранн1й постнатальдай перЮд. Молозивний тип год1вл1 твгфин супроводжуеться зниженою функцию сичуга (шлунка). а значить 1 зниженою продукцию HCl. Як вказують (Takeuchl, 1990: hfcCle, 1988), б1ох1м!чна функц1я простагландин1в, особливо Е2, пол'ягае в стимуляцП секрецИ НСОз-в кишечному еп1тел11 1 направлена на нейтрал1зец1» Н21. Кр1м того, п1ноцитозний шлях всмоктування речовин передбачае зниження секреторних явищ в еп1тел11. А наявн1сть в молозив1 ложивних речовин - моносахарид1в, ям1нокиелот, цитрату та 1н. - не передбачае секрец11 травних фермент1в, типово! для тварин старшого в1ку. Ним, очевидно, можна пояснювати низький р1вень секреторних мед1а-ToplB (cGMP, PG E£, PG Fla) в еп1тел11 тонкого кишечника новона-роджених телят. Знижений р1вень PG Ей та PG групи F описано ,1 для новонароджених шурят в досл1дженнях (Wu-Wang, 1987).

При гострих'розладах травления новонароджених телят в enl-телП Шдвищуеться в 6,3 рази р!еень PG Е2 та в 4,1 рази - PG

Fla в пор1внянн1 1з здоровими тваринами 1 переважае нав1ть 1х р1вень у дорослих.

Вмвстив1стъ екзагенних простагландин1в,. особливо Ей, вик-ликати Стан, под1бний до д1аре1, добре в1дома (Milton, 1975; Mlttenmayer,1989; Sharma,1983). При цьому показана здатн1сть PG Ей активувати аден1латциклазу (Felder,1989) та 1нг1бувати Na,K-АТРазу (Johanson, 1982). В той же час, причетн1стъ ендогенних простагландин1в до виникнення та розвитку д1аре1 ставиться п1д сумн1в (Muller, 1987). Вказуеться, шр в результат1 розвитку па-толог11 травного каналу, порушення осмотичних явищ в тканин1, розвитку запальних явищ в1дбуваеться безконтрольнии р1ст проста-гландин1в в еп1тел11 за рахунок вив1льнення з мембран арах1доно-eio 1 кислота. За Даними (Jenkins, 1988). 1нг1б17ор простагландин-синтетази асп1рин не попереджуе Д1ере1.

Однак, в попередн1х наших дбсл1дженняк отримано дан1, як1 св1дчать про пряму.чи часткову причетнЮть простагландин1в до порушення гомеос-тазу тканини 1 орган1зму при дlapel новонароджених телят. До таких порушенъ можна в1днести перш за все значн1 втрати орган1змом ЬСОЗ-1 С1-(Мэльничук 1987; Захаренко, 1S83), зменшення в ал1кальних мембранах р1вня арах1доново! кислота та знихення активност1 Na, К-АТРази базолатеральних мембран.

З.АКЛЮЧЁННЯ

Таким чином, отриман1 результата ыодо малекулярно! орган1-зацП плазматично! мембрани еп1тел1ю тонкого кишечника велико! рогато! худоби - л1п1дний, 61лкобий склад, густина - можуть ле-жати в ochobI розум1ння та поглибленого вивчення мембранного травления, транспорту речовин та секреторних явищ. Експеримен-тальн1 дан1, шр характеризуют мембранн1 та ¡ся1танн1 прошей функц1онування кишечного еп1тел1ю новонароджених телят представлять безумовний 1нте'рес в теоретичному та практичному план1 з точки зору вивчення механ1зму всмоктування нативних 1муноглобу-л1н1в; формування загального 1мун!тету у новонароджених та м1с-цёвого, кишечного 1мун1тету, розкриваоть можл1щосг1 розум1ння 61ох1ы1чних основ розвитку гострих ррозлад1в травления з явишэм д1аре!.

Так, на ochobI сукупност1 отриманих дачих - зм1ни л1п!д-ного складу .мембран, активност! АТРаз, р!вня cGNP i PG Е2 та 1с-

нуючин дани* л1тератури пропонуеться схема основних шлях1в сек-рецП води та електрм1т1в ь епЛтелП тонкого кишечника при не-1н4екц1ин1й д1аре! новонароджених телят (рис.13).

а, нго

нсо" С1"

Рис.13. Схема можливих шлях1в секрецП алектрол1т1в 1 води в еп1тел11 тонкого кишечника при д1аре! но-вонароджених телят. Поэначення: S-циклаза - гуа-н!латоиклаза; Фл С - фсэсфол1паза С.' л1зо-Фл - л1-зофосфол1тди; Ф1 - ФосФатидил1ноз1тол: ФХ - фос-фатидилжшн; .Фл А2 - фосфол1паза А2: IP3 - 1но-зитолтрифосфат: DG - диацилгл1церин: Arch - ара-х!донова кислота: (Ж С - проте!нк1наза с: хол/Фл - сп1вв1дношення холастерин/фосфол1пЛди.

Патогенетичн1 фактори (недоброяк1сна 1жа, козе!нов1 згуст-ки, рН послаблююч1 фармаколог1чн1 речовини та 1н.) через гл1ко-проте1дн1 рецептори ап1кальних мембран модиф1кують 6-б1лки, як1 активукггь мембранозв'язану гуан1латциклаэу Идентично термоста-б1льному токсину E.coli) та фосфол1пазу С. Цикл1чний гуанозин-монофосфат, активукми сбМР-запежн1 проте!нк1нази, як1 фосфорилю-игъ б1лков1 субстрата ап1калъних мембран, актавуе секрец1ю Na+, CI- 1 НСОз--. На один 1он натр1ю секретуеться до 14 молекул води в склад1 його г'дратних оболонок.

0осфол1паза С г1дрол1зуе фосфатидил1нозитол, в результат! чого утворюеться 1Рз, який актиауе вив!лънення Сай+ з внутр1ш-ньокл1тинних депо. 1они кальц1ю активують фосфол1пазу Ай та калъ-модул1н. Фосфол1паза А2 атакуе фосфол1п1ди, шр веде до утворення в мембранах л1зоформ фосЗол1п1д1в та вив1льнення в цитоплазму арах1доново1 кислота. Л1зоформи фосфол1п1д1в зменшукггь густину мембран 1 п1двищуюгь 1х г.асивну прониклив1сть. 3 арах!донэво! кислота синтезукггься прос.тагл.андини Ей, групи F та 1н., як1 п1дсилю-ють секрец1ю НСОз- та С1-.

Са-кальмодул!н здатнийвласне активувата проте!нк1нази. 1они Сай+, диацилгл1церин, л1зо-ФХ активують проте1нк1назу С, яка 1н-ridye potcrv 1онник помп, зокрема - Na.K-АГРазу.

Загальна патолог1я тканини 1 еп!тел1ально1 кл1тани веде до аначних зрушень осмотичного тиску, проникност1 мембран. Поступан-ня 1он1в калыЦю з молозива (молока) в еп1тел1й здатне эначно п1дсилювати описан1 ефекти, в результат1 чего д1арея. як. компенсаторна, адаптац1йна, захисна функц1я та реакц1я орган1зму переходить в безконтрольку стад'1нэ секрецП Na+, НгО, С1-, HCQ3-, У* та 1н. Очевидно, в1домий ефект на усунення подразника (молозиво, молоко), як джерела Сайк, дозволяв зупинити секретари1 процеси .1 з достатньою ефектавн1стю пройодити л1кувапьн1 .заходи. Запрог.онований О^Р-запежний механ!зм виникнення те розвитку не-1нфекц1йно1 д1аре! у новонароджених телят дозволяе проводит» ц1-леспрямований пошук профХлактичних та л1кувальних засоб1в у ветеринарии практиц1 1 служити зручною моделей для вивчення аналогично! поширено! та акгуешьяо! проблеми в пед1атр13.

- 39 -ВИСНОВКИ

1. Розроблено метод отримання везикульованин оп1кальних САМ) 1 базолатеральних (ЕЮ мембран еп1тел1ю тонкого кишечника велико! рогато! худоби задов1льно1 чистота з мгшмальними за-брудненням гншими субкл1тинними елементами. Показано, шр стадИ Фракц1онування АМ 1 БМ 1дентичн! для дорослих, новонароджених здорових 1 хворих тварин.

2. Розроблено оптимальн1 експериментальн! умови для отримання 1зольованих кл1тан еп1тел1ю ферментативним та х1м1чним методами. За еФективн1стю, показниками житгездатност1 ,чл1тин процедур« розташован! в ряду: колагеназа > г1алурон1даза > цит-рат/ЕДТА = акризим-3.

3. Встановлено. шр л1п1дний склад АМ в!др1зняеться в1д БМ ниж-чим загальним вм1стом фосфол1п1д1в, холестерину, жирних кислот, наявн1стю л1зофосфатадилхол1ну та 15:0, 17:0, 17:1, 18:3 жирних кислот.

4. Л1п1дний склад АМ 1 БМ еп1тел!ю новонароджених тварин характеризуемся. в пор1внянн1 1з дорослими. низьким вм1стом Фос~ Фол1п1д1в, холестерину, вишим р1внем Фосфатидил1ноайтолу, моноенових жирних кислот та наявн1стю м1ристанош1 кислота.

5. Показано, шо при порушенн! функцП тонкого кишечника (д1арея) в АМ еп1тел1ю новонароджених тварин значно зростае к1льк1сть л1зофосфол1п1д1в, знижуеться вм1ст сф!нгом1ел1ну, фосфатадил-серину. Фосфатидил1нозитолу та арах1доново1 кислота: для БМ показано наявн1стъ л1зофосфол1п1д1з, низький вм1ст фосфатидил--хо.Ину, холестерину та эначн1 зм!ни в склад1 жирних кислот.

6. Встановлено як1сн1 в1дм1нност1 в б1лковому склад1 АМ 1 БМ еп1-тел1ю дорослих тварин. Показано, шр у здорових новонароджених

. тварин, в пор1внянн1 1з дорослими, понижений вм1ст низькомоле-кулярних б1лкових фракд1й. № встановлено як1сних 1 к1льк1сних зм5н б1лкового складу АМ 1 БМ при порушенн1 функцП тонкого кишечника новонароджених тварин, у пор1внянн1 1з здоровими.

7. Густана АМ С1льша в1д БМ, а густана обох мембранних Фракц1й здорових новонароджених тварин знижена,. в пор1внянн1 1з дорослими-. 1нтегральн1 показнмкм АМ 1 БМ (л1п1д/б1лок, холестерин/ фосфол!п1ди. насичен1/ненасичен1 жирн! кислота) зазнать знач-нмх зм!н при порушенн! ФункцП тонкого кишечника новонароджених тварин.

8. В AM еп1тел.1ю тонкого кишечника велико1 рогато1 худоби охарактеризовано активн1сть' Са,Ма-АТРази та Ма-АТРази. а в БМ -додатково №а,К~АТРази.

9. Показано, шо при порушенн1 функцП тонкого кишечника новонароджених тварин знижуеться активн1сть в БМ Na.K-АТРази Св 5,3 рази), Са.Мг-АТРазч (в 1.33) та Mg-АТРази (в 1.83 - в AM 1 1,64 -в БМ).

10. Встановлено, шр при порушенн1 функцП тонкого кишечника новонароджених тварин в еп1тел11 зб1лыиуеться bmIct cGMP 1 актив-н1сть гуан1ла'пл«лази, та зменшуыгься в1дпоь}ян! показникм для сАМР 1 аден]латциклази. Показано, шр патолог1 я травного каналу супроводжуетъся п1двишэнням вм1сту в еп1тел11 PG Ей та- PG Fia.

11. На ûCHObl отр^маних даних ствердкуеться, що аиникнення та розвиток не1нфекц1йно1 д1аре1 новонароджених тварин в1дбува-еться cGMP-залежним шляхом. Запропонована схема 1мов1рних ' б1ох)м1чних мйхан.1^м1в секрецП води та електрол1т1в при nopyiiieHHl функцП тонкого кишечника, як1 супроводжуються яви-шем fllapel у новонароджених тварин.

12. Проведенный досл1дженнями вивчена молекулярна орган!зац1я плазматично! мембрани еп1тел1ю тонкого кимечника велико1 рогато! худоби. Вздм1нност1 л1п1дного, б1лкового складу 1 гус-тини та активност1 АТРаз в1дображають р1зну стуктурчу, функ-ц1онадъну роль 1 онтагенеточн1 особливост! ап1кальних 1 базолатеральних мембран в процесах травлений, транспорту та секрецП.

Список роб1т, опубл1кованик по тем! дисертац.11.

1. Засекин Д.А., Захаренко H.A., Мельникова H.H., Уеатюк П.В. Шабельник H.М. Электролитный баланс крови новорожденных телят /В кн.: Тез.докл. Всес. симп. "Биохим. с.-х.животных и прод. прогр."- Ташкент.- 1986.- С. 62.

В. Мельничук Д.А., Засекин Д.А., Захаренко Н.А., Мельникова H.Н., Тишенко Г. Н., Шабельник Я.М., Усетюк П.3. Особенности электролитного баланса крови новорожденных телят в норме и при диарее //Укр.биохим журн,- 1Ô87.- 59, N 6.- С. 59-63.

3. Цвилиховский H.H., Усатек П.В., Мельничук Д.А. Депение плазматическая ые.мбраны клеток кишечного эпителия крупного рога-

- 41 -

того скота на фракции щеточной кеймы и базолатеральные мембраны// Докл. АН УССР.- 1988. N 9. - С. 83-85.

4. Цвилиховский Н.И., Усатхк П.В., Мэльничук Д.А. Выделение, очистка и характеристика щеточной каймы и базолатералъных мембран из клеток кишечного эпителия крупного рогатого скота //Укр.биохим.журн.- 1388.- 60, N 6.-С. 91-94.

5. Мэльничук Д.А., Усатюк П. В., Цвилиховский Н.И. Изменения активности щелочной фос(1«тазы и №а,К-АТРазы в мембранных фракциях эпителия тонкой кишки в норме и при диарее // Физиол. журн.- 1989.- 35, N 3.- С. 99-102.

6. Усатюк П.В., Волков Г. Л., Цвилиховский Н.И., Мэльничук Д.А. Характеристика липидного состава плазматической мембраны эн-тероцита крупного рогатого скота //Докл. АН МХР.- 1989, N 7.-С. 76-78.

7. Усатюк П.В., Цвилиховский Н.И. Белковый состав плазматической мембраны энтероцита тонкого кишечника крупного рогатого скота//В кн.:Тез.докл. Всес. симп. "Биохйм. с.-х.животных и прод. прогр."- Киев, УСХА.- 1989,- С. 71-72.

8. Усатюк П.В., Цвилиховский Н.И., Мельничук Д.А. Активность ферментов шеточной каймы и базолатералъных мембран энтероцита крупного рогатого скота в норме и при диарее //В кн.:Тез.докл. Всес. см. "Биохим. с.-х. тавотных и прод. прогр. "-Киев, УСХА. - 1989. - С. 75-76.

9. Мельничук Д.А., Усатюк П.В. Мэлекулярная организация апикальной и базолатеральной мембран энтероцита тонкого кишечника крупного рогатого скота //В кн.:Тез.докл. Всес.симп." Мэмбра-на щеточной каймы. Ферментные и транспортные процессы."- Рига, Зинатае.- 1990.- С. 82-83.

10.Цвилиховский Н.И., Усатюк П.В. Получение апикальной и базолатеральной мембран энтероцита тонкого кишечника взрослых, новорожденных здоровье и больных диареей животных // В кн.: Тез.докл. Всес.симп." Мгмбрана шэточной каймы. Ферментные и транспортные процессы."- Рига, Зинатае.- 1990.- С;142-143.

11.Усатм П.В., Цвилиховский Н.И.. Мэльничук Д. А. Аденозинтрибос-фатазы плазматической мембраны клеток кишечного эпителия крупного рогатого скота // Биохимия. -1990.- 55, N 4.-С. 712-717.

12.Усатюк П.В.. Волков Г..Л.. .Цвилиховский Н.И., Мэльничук Д. А.-Липидный состав плазматических мембран знтероцитов тош.ей кишки крупного рогатого скота различного возраста //Укр.биохим.журн.

- 42 -

- 3990.-- 62, W 3.-C. 87-94.

13 Усаткк П.В., Прилиховский Н.И. Особенности белкового состава плазматической мембраны энтероиитоа тонкого кишечника в пост-натальнып период //В кн.:Тез.докл.Всес.еимп."Физиология пище варения и всасывания",- Краснодар.- 1990. -С. 288.

14.Томчук S.A., Усатюк П.В.," Мельничук Д.А. Изолированные клетки эпителия тонкого кишечника и их характеристика // В кн,:Тез. докл.Всее.симл."Физиология пищеварения и всасывания",- Краснодар - 1990. -С. 281.

15.Усатюк П.В., Цвилиховский Н.И., Мэльничук Д.А. Возрастные особенности активности транспортных А'ГРаз- в плазматических мембранах знтероиитов тонкого кишечника // Вюлл.зксп.(5иол.и ыед.-1991.- N 3.- С. 309-311.

16.КэльНичук Д.О., Усаткк П.В., Томчук В.А. Вуглеводний 1 енерге-тичний обм1н в 1зольоааному еп1тел11 тонкого кишечника велико! рогато! худоби р1зного в1ку у норм1 та при патолог!1/, Доп. АН Укра1ни.- 1991.- N 11. - С. 133-135.

17.Усатюк П.Е., Цвилиховский H.H., Мальничук Д.А. Фракционировав

. ние плазматической мембраны знтероцитов теплей кишки новорожденных телят // В кн.: Акт. проблемы вет. науки. Киев.- 1991.-С. 156-160.

18. Мэльничук Д. 0., Усатюк П. В.. Цвилиховский Н. И. Структурно-функциональные изменения в плазматической мембране эпителия тонкого кишечника при диарее новорожденных телят // В кн.: Акт. проблема зет. науки. - Киев. - 1991.- С. 150-155.

19.Усатюк П.В., Воловик З.Н., Волков Г.Д. (>Ьрфйлагические и доз-растныа особенности вязкости клеточной мембраны эпителий тонкого кишечника крупного рогатого скота //В сб.: Несимметричные трикарбоцианиновые красители и структурно-динамические свойства биомембран, белок-мембранных комплексов.-Киев.-1991.-С. 10-11.

SO.Мелышчук Д.0.,Томчук В.Д., Усатюк П.В., Прищепа Л.О. Стан об-м1ну цшШчних нуклебтид!в та простагландин1в в 5п1телП тонкого кишечника велико! рогато! худоби // В кн.: Таз.доп. "Y1 -Укр. б! oxiwiчния з'!зд.- Ки1в. УСГ/ - 1S92.- С. 67.

21 Усатюк П.В. Розпод1л транспортних АТРаз в плазматичнШ мембра-н1 еп1тел!я тонкого кишечника велико! рогато1 худоби // В кн.: Тез. доп. "\'1-Укр.б1ох1м1чний з'1зд,- Ки!в. УСГА.-iOQS.- С.93.

22.Мальничук Д.О., Усатюк Пй., Потоцький М.К.'. та 1н. ¡зольован! клГмш еп!тел!ю тонкого кишечника велико! рагьга! худоби: от-

pMMaHHfl, xapsKTepMCTMKa Ta M6Ta6ojilMna aitTMsnicTb //b kji. :Tea. Aon. "Yi-yKp.eioxlMlMHiiR a'laa.- KMJB, yCTA.-Ift32. C. 68.

23.Us=>tyuk P., Melnlchuk I).Composition and biophysical properties of' plasma roembrine of bovine Intestinal epithelial cells //In: Abstr. 2nd IUBMB Conf. "Blochem. cf cell aembranea".- 1993,-Barv, Italy.- P. 1S5.

24.lfeat.vuk P.V, Touchuk V.A., telnlchuk D.A. Patterns of cyclic nucleotides raetabollsm In small ln'sstlne epl'hella of cattle and new born alves In norm and with non-infection diarrhea // In: Abstr. Ann.Nfeet. Aiier.Soc.Anlm.Sci.. "Anlm. Health, Fharm. and Toxicol."- 1994.- Minneapolis, USA.- Abstr. numb. 397.

PbK VZJ/t^ 2W;./C€>