Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические особенности поверхностных липидов хвойных (Coniferae)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические особенности поверхностных липидов хвойных (Coniferae)"

КШ^ЬІШЙН^ОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

о

БЕР1ЕШНА ОКСАНА ВАЛЕРІІВНА

УДК. 577.115+665.322

БІОХІМІЧШ ОСОБЛИВОСТІ ПОВЕРХНЕВИХ ЛППДГО ЛИСТЯ ХВОЙНИХ

(іСопі/егаа)

03.06.04 - біохімії

Авторгфгряг дисертації на здобуття нпугссрого ступеня . кандидата біологічних наук

КіЕЇа - 2000

Дисертацією є рукопис:

Робота виконана в Дніпропетровському дерзяавиому університеті. Міністерство освіти У крайні.

1 Ілу(сотій періщиш: доктор біологічних наук, професор Штемегасо Наталія Іванівна, завідувач кафедрою біофізики та біохімії Дніпропетровського державного університети.

Офідіііпі ошшшгв:

Доктор біологічних наук, професор Сгародуб Микола Федорович завідувач відділом біохімії сенсорних та регуляторних систем Інституту біохімії ім. Паяяадша НАН Уісраїаа. ,

Кандидат біологічних наук, старший науковий гаізрсЗпшк ©кашпко Олеіазшдр Аркадьсазч, кафедра фізіології та екології роедші, Кпїашгого національного університету імені Тараса Шевченка.

Провідна уставала - ЧершвеадаШ.Дервявшш університет ім. Ю. Фсдьковнчз, кафедра біохімії та експериментальної екології, м. Чернівці.

Захист дисертації відбудеться 2000 р. о -/Л годїші на

засіданя спецлалшшшої вчгвсї рада Д.26.001.24 прп Київському національному універсітеті імені Тараса • Шеачсшса за адресою: 03127, иі<иів, проспект Глушкова, 2, корп. 12, біофак, ауд215.'Поштова адреса: Київ, 01033, вул. Володпішрська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного унівсрсітсту шеці Тараса Шевченка (м. Київ, вул. Володішірська, 58)

Автореферат розісланий » *{1л*4МС{ 2000 р.

Вчений егкретар

спеціалізованої П'штї раді:, професор О.В. Брайон

Актуальність проблеми. Поверхневі ліпіди (ПЛ) листя рослин є позаклітинним гідрофобним шаром, біохімічним бар’єром, який забезпечує пасивну стійкість рослинного організму та є першою точкою контакту рослин з навколишнім середовищем. Вивчення біохімії ПЛ с напрямком який розкриває біохімічні основи стійкості рослинних організмів. ПЛ є сумішшю складних ефірів (восків), алканів, алканолів та інших сполук з вуглеводнім радикалом значної довжини (Св- Сзб) (Blaker 1988, Bianchi 1987-1939, Prasad 1990, Gulz 1992, Maloney 1998).

Вважється, що найважливішими функціями ПЛ є захист рослини від УФ-випромінювашія, проникнення гідрофільних токснкаитіп та патогенів (Jenks 1995). Вивчення складної гетерогенної суміші ПЛ потребує розробки нових підходів з використанням сучасних спектральних та хроматографічних методів. Цим можна пояснити невелику кількість зивчешшх вадів рослин та відсутність узагальнюючих робіт, прнсвячеинх закономірністям формування епікутнкулярного гідрофобного шару. Знання про механізми біосинтезу компонентів ПЛ обмежені (Kollatukudy 1973-1987, Baker 1982) эта носять дискусійний характер. В той же час, питання про функціональне значення біосинтезу близьких за структурою сполук, часто гомологічних, є одним із найбільш інтригуючих проблем біохімії (Судьипа 1981). До найбільш актуальних аспектів вивченая ПЛ відносяться питання родових та видоспецифічних особливостей складу ПЛ, існування закономірностей формування ПЛ в процесі розвитку хвої, взаємини складу ПЛ з газостійкістю та іншими видами стійкості рослин. Значна екологічна пластичність хвойних та пов’язашшн з нею широкий ареал їх'розповсюдження робить ці рослини найбільш зручним об’єктом для вивчення біохімічних основ бар’єрної функції ПЛ, з одного боку, а їх здатність створювати значну біомасу в умовах непридатних для більшості дерев робить хвойні цікавими як джерело ліпідних компонентіз, що можуть використовуватись в практиці.

Оскільки епікутикулярний шар рослин є унікальним джерелом довголанцюгових молекул, які потребують від організму значних енертичннх витрат, пов’язанния з елонгацією вуглеводневого ланцюга та секреторними механізмами, актуальною є також проблема препаративного виділення та хімічної модіфікації ПЛ з метою іх практичного використання.

Мета та основні завдання дослідження. Метою даної робото було:

- розробити методичні підходи до вивчення поверхневих ліпідів рослин, які дають можливість виявити біохімічні особливості формування поверхневих ліпідів

1 листя хвойних та здійснити препаративна виділення компонентів;

- виявити біохімічні особливості процесу формування ПОВерХНЇЕНХ ліпідів хвої та основні біосинтетичпі напрямки, які активні п ПЛ хвої.

- вивчити динаміку накопичення ПЛ Основними задачами роботи було:

1. Вивчити поверхневі ліпіди листя хвойних спектральними методами, методом газо-рідинної хроматографії вуглеводнів та метилових ефірів жирних кислот гідролізатів сумарної фракції, методом диференційиого термічного аналізу т:: функціонального аналізу.

з

2. Виявити родові та видоспещіфічні особливості процесів біосинтезу вуглеводнів та жирних кислот в ПЛ хвої.

3. Запропонувати схему напрямків біосинтезу компонентів поверхневих ліпідів, активних в процесі розвитку хвої рослин.

4. Розробити метод отримання вищих жирних кислот з листового опаду хвойних.

Наукова новизна, теорітічиа та практична цінність роботи. Розроблено методичний підхід, який вкшочає дослідження сумарної фракції ПЛ листя рослин спектральними та хроматографічними методами, методом функціонального та дифереиційного термічного аналізу, газо-рідииної хроматографії метилових ефірів жирних кислот гідролізатів сумарної фракції. Розроблений підхід дозволив встановити родові та видоспецифічні особливості процесів біосштгезу основних компонентів поверхневих ліпідів, активних в процесі розвитку хвої рослин. Розроблено метод одержання вищих жирних кислот з опаду листя на основі отриманих даних про динаміку накопичення жирних кислот в ПЛ хвойних.

Результати проведених досліджень дозволяють глибше зрозуміти зв’язки між хімічним складом поверхневих ліпідів листя рослин різного віку та формуванням гідрофобного біохімічного бар’єру, здатного захистити фотосинтетичний апарат від зовнішнього впливу. Зроблені спостереження та висновки значно розширюють уявлення про механізми функціонування різних біосинтетичних процесів в ПЛ листя рослин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Ця робота є частиною досліджень, які проводяться кафедрою біофізики та біохімії Дніпропетровського держуніверсітету за темою: “Дослідження механізмів змінності ліпідів рослин та розробка біохімічних основ отримання речовин ліпідної природи з рослинної сировини”, які входять в координаційний план №15 Міносвіти України.

Особистий внссо;: здебувача. В процесі виконання дисертаційної роботи автором вивчено та проаналізовано наукову літературу за темшо дослідження. Дисертантом розроблено програму проведення експериментів та підібрані методи рішення поставлених задач. Дослідження складу поверхпевих ліпідів хвої частково проводились в співпраці зі співробітниками НД1 біології ДДУ, кафедри біофізики та біохімії ДДУ та кафедра неорганічної хімії УДХТУ, які с співавторами наукових праць здобувача. Обговореїшя та аналіз результатів досліджень проведені з науковім керівником.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на ХНІ міжнародному конгресі захисту рослин (Гаага, Нідерланди, 1995), Міжнародній конференції “Стійкий розвиток: забруднення навколишнього середовища та екологічна безпека” (Дніпропетровськ, 1995), IV міжнародному симпозіумі “Реакції роелшїного метаболізму на атмосферне забруднення та глобальні зміни” (Нідерланди, 1997), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), Міжнародної конференції з екотоксікології (Аиталія, Туреччина, 1998).

Публікації. Основні положення роботи опубліковані в 10 наукових роботах, з яких 6 статей.

Структура та об’єм робото. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, результатів обговорення, висновків та

списку літератури, який включає 174 найменування. Робота викладена на 133 сторінках друкованого тексту та включає 18 рисунків, 19 таблиць.

Матеріали та метод» дослідехепь.

Об’єктами досліджень були окремі дерева 6 видів: Picea abies L. Karst., Picea pungens Engelm., Pinus pallasiana D. Don., Pinus sylvestris L., Pinus nigra Arnold., Larix sibirica Ledeb., які зростають на території Ботанічного саду Дніпропетровського держуніверситету. Відбір хвої проводився в період активної вегетації протягом 3-х років (1994-1997). Вивчалась хвоя різного віку (першого, другого та третього років), яку збирали з середнього ярусу піЬдешю-східного боку крони. Експерименти проводились в 3 - 4 біологічних повторах.

Екстракцію проводили за Гусаковою (1986). Подані діяли згідно зображеній нижче комплексній схемі досліджень, або в залежності від поставленої мети обирали однії з напрямків досліджень; ■

Жирні кислоти (ГРХ и етилових ефірів)

Спектри поглинання в УФ-сбласті знімали в гексан стих розчинах на спектрометрі Зресогй М-40 (Німеччина) в 0.2; 0.5 або І-саптиметроитх кюветах, концентрація розчинів 0.013-0.3%. Інфрачервоні спектри вивчали на спектрометрі Бресогі ІЖ-20 у вигляді суспеїпії речовин в вазеліновому маслі на оптичному склі з броміду кальцію .

Вуглеводні аналізували в екстрактах після випаровування аліквоти па газорідинному хроматографі нСЬгот-5"(ЧССР) із полум'яно-іонізаційним детектором. Використовували скляну спіральну колонку розміром 2.5м х 0.4 см, заповнену 5% БР- 2100 на СЬгошаІоп М-Зирег 80-100 меш. Температура детектора та введення проби 250° С, температура термостата програмувалась від 150° до 250° С зі швидкістью 5°С/хв. Швидкість газа-носія (гелія) 40 мл/хв. Ідентифікацію , проводили порівнянням з часом утримання маркера - н-доктрноконтанолу.

Гідроліз сумарних ГШ, реекстракція та сцявлешга двох ліпідшгх фракцій -неацильннх речовин та жирних кислот - проводили зз Кейтсом (1975).

Синтез штрозометіілсечовши!, виготовленню розчину діазометану та ^етилювання яагриих шіслот проіюдіші за Физгр (1971). Газо-рідшшу хроматографію жирних-кислот проводили за металами Рудешсо (1971) та Шаршунової (1980). Розділення імтринх кислот проводили у вигляді їх мєтилор:« ефірів. Хроматографічне розділення суміші метнлсзих ефіріп гсирних ккслог проводили двома методами:!) розділення на неполярних силіконових сллстомерс: типа БР-2100 та и режимі, описаному вище для вуглеволніз; 2) розділення ні

Сушарні ПЛ

-{► ДнфгрекцЩішїі t

полярних носіях па скляних колонках 2,5 х 0,4 см, заповнених 15% Reoplex 400 на Chromaton N-Super 0,125-0,160 меш або 10% ПЕГС на Chromosorb Р 80-100 меш при ізотермічному режимі при температурі термостату 200°С та температурі камери випаровування 250°С. ідентифікацію вищих зжирннх кислот виконували за допомогою стапдЕртшіх сумішей метилових ефірів зкирішх кислот та окремих ■жирних кислот виробництва фірми Serva Feinbiochemica Heidelberg.

Дифгргшцшгий термічний аналіз (ДТА) зразків проводили на дериватографі системи Паулік-Паулік-Ердєй (Paulik 1987) марки Q-1500 D (МОМ) в динамічному режимі в умовах ззичайного теплообміну в іштервалі температур 10-500°С, зі швидкістю нагрівання 10°/хв., еталон - А120з, при масі зразків 0,1г та реєстрацією кривих днференційного термічного аналізу з максимальною чутливістю.

Присутність оксосполук (апьдепідів та кетонів) перевіряли за реакцією з

2,4-дішітрофеЕгілгідразішом після розчинення сумарних ПЛ в етанолі (Органікум 1979). Статистичне опрацювання результатів експериментів проводили за Латаним (1980) ‘ .

Огаззгіі результати дослідзкеїшп.

Обгрунтування раціональності обрапмх методів дослідзкення. На основі огляду методів екстракції, був вибраний методичний підхід, приводиться обгрунтувати вибору розчинника та умов екстракції, яка призводить до вичерпної екстракції ПЛ та в той же час не зачіпляє

внутрішньоклітинні ліпіди, приводиться також

критичний аналіз методу тонкошарової хроматографії та УФ-спектроскопії, які не дозволяють виявити родові та видоспецифічні

особливості. В той же час показана інформативність ІЧ-спектроскопії . для

вивчення ПЛ рослин. Складні ефіри, жирні кислоти та інші сполуки, які містять карбонільну групу та знаходяться в складі ПЛ, проявляються в ІЧ-спекгрі у вигляді характеристичних смуг карбонільного поглинання в області 1705- 1750 см'1. Для ПЛ листя хвойних характерна наявність двох виразних смуг в цій області (рис. 1 А) на відміну від інших рослин (наприклад, Citrus limon L.) (рис.1 Б). Співвідношення цих смуг дозволяє зробити висновок про присутність речовин, які містять карбоніли в ПЛ та про зміненім їх кількості. Дані ІЧ-спектроскопії разом зі специфічною реакцією на оксогрупу продемонстрували відсутність оксосполук (альдегідів та кетонів) в неацильних речовинах (рис. 1В).

Використана нами модифікація ПЛ за Кейтсом дозволила провести повний

Рис. 1. ІЧ-слектри ПЛ листя рослин: А - Citrus limoa.; Б - Pious pallasiana (сумарні ліпіди); В • Pirns pailasiana (фравдія неаишппих речовин) , - • ,

аналіз зкирпокислотпого сіслзду фракції ліпідів та вперше показати наявність значної кілмгісті “яіршіх кислот З пепариок» юльхіс-по атомів вуглецю s ПЛ хвої. Нами вперше показано мохшпвість тіїсорпстгшня методу дпфергпційного термічного аналізу для визначення оіггогєіієпряіпх та впдоспеїщфічішх закономірностей формування ПЛ. • листа роеліш за показниками ездотермічшіх переходів ПЛ. , . ‘

Родосі та віідоспсцпфічиі осз&шсегті повсрхпгппх ліпідіз хсої першого року. Склад карбонільних сполук ТІЛ листя хвоГпшх с родаспецнфічнни, про що свідчать різні співвідношенім смуг поппшгиня ксрбошльгшх сполук (табл.1). Особливо сильно відрізняється за цим погазтпигом Р. abies.

•’ . Таблиці 1. Вуглеводні ПЛ хвої

Характеристика ІЧ-спектрів пог.ерхіюмк гргдсташіепі иепзрішмн та ' ■ ■ ' партяшії алкгтаті сід Сп до

С34 (тГіОл. 2). ПргВЗЛТСГОЧІ!'! ксшюягптсм з yens хеоГніггх е ' Cis-amcm.

Для того, щоб більш

ЯСІфЕЕО . ПОі;ЗЗ.ЇПІ

впдоспецпфічшгть вуглеводнів, було обрано тр!і підходи:

S) Оцйп:а сгуіїЄ’Г:3

гетерогегаюсті вуглелодніз ПЛ хвої. Значущії," :п ввакаля тількі компоненти, кількість яюіх перевищувала 1%, кожен тагаш компонент прпГімалп за І. Длч роду Рісез цей показник складає

3-6, для Pinus - 10-11, а для Lmx -14. Ступінь гетерогенності може

' , Таблиця 2

Склад вуглеводнів поверхневих ліпідів листя хвойних (%), вік хвої 1 рік.

Поря- док виходу компо- ненту Кількість атомів вуглецю Вид рослині!

РІсеа pungens Рісеа abies Pinus pallesiana Pinus sylvestris Pinus nigra Larix sibirica

1 Сц - - - - - 6,30+

0,13

2 С|9 - - 4,48 ± сл. 6,44+ 5,0-H

0,04 о,п 0,11

3 С20 - - сл. сл. 1,261- 2,03+

0,03 0,0)

4 сЗІ - - 1,34 + сл. 6,64 f I,l6j

0,02 0,13 0,02

ліпідів хвої першого року

Вид рослшш ГЧ-спектрн

max, cm'1 співвідношення смуг

Рісеа pungens 1705 1725 1:2,5

Рісеа abies 1705 1725 1:5,6 ,

Pinus 1710 1:2,5

pallasiana . 1735

Pinus nigra 1705 1735 1:2,1

Pinus 1705 1:2,5

sylvestris 1735

Laris sibirica 1710 1725 1:1

Продовження табл.2

5 Ся 5,67+ 12,99+ 15,12+ 6,76+ 15, 71+ 8,92+

0,03 0,13 0,29 0,07 0,28 0,08

6 См 0,71+ сл. 2,74+ 2,02+ 11,88+ 2,91+

0,01 0,05 0,05 0,32 0,06

7 С;і 0,15+ 0,01 1,42+ 0,03 5,06+ 0,11 4,87+ 0,06 сл. сл.

8 Си 0,35+ 0,01 СЛ.' 7,82+ 0,03 5,69+ 0,03 10,11+ 0,30 ' 9,31+ 0,09

9 См 0,61+ 0,02 0,33+ 0,01 7,62+ 0,08 4,18+ 0,04 10,19+ 0,31 16,45+ 0,33 ■

10 Сі7 0,30+ 0,01 3,20+ 0,05 3,96+ 0,06 3,95+ 0,06 9,50+ 0,21 10,20+ 0,28 '

11 С28 2,62+ 0,05 12,79+ 0,31 1,30+ 0,03 10,25+ 0,11 8,47+ 0,17 14,38+ 0,28

12 С27 88,68+ 0,89 75,59+ 0,76 34,55+ 0,38 47,76+ 0,49 18,87+ 0,37 19,24+ 0,29

13 Сзо 0,91+ 0,03 СЛ. 2,03+ 0,05 8,25+ 0,08 0,88+ 0,02 1,47+ 0,04

14 • Сзі сл. 3,68+ 0.05 СЛ. 5,27+ 0,06 сл. 1,02+ 0,03 '

15 С32 сл. ся. СЛ. 13,18+0,26 сл. 1,30+ 0.04

бути оцінена також внеском превалюючого компоненту: для Рісеа 75-88%, Ріпиз -18-48%, Ьагіх - 19,24%; 'Узагальїпоючи ці два показника, можна казати, що три роди вивчених хвойних відрізняються за гетерогенністю вуглеводнів ПЛ. При цьому, враховуючи, що роди Ріпиз та Рісеа вивчені в умовах однакового фізіологічного віку, можна сказати, іцо гетерогенність вуглеводнів хвойних є видоспецифічною ознакою та рід , Рісеа характеризується меньшою гетерогеїшістю, ніж рід Ріпиз.

2) Співвідношення парних та непарних компонентів.

Обрунтованість такого підходу до оцінки, отриманих даних пояснюється тим, що ці компоненти, згідно літературних даних, синтезуються різними Таблиця 3.' механізмами. Сшпез парних та непарній Доля вуглеводнів з непарною компонентів б ПЛ двох родів Рісеа та Ріпиз

(п) та парною (2п) кількістю . проходить з різною інтенсивністю (табл.З),

атомів вуглецю (%) в ПЛ хвої ігри цьому за кількістю непарних різних видів рослин. компонентів рід Рісеа переважає рід Ріпив

майже в 1,5 рази. Видова специфічність за

цим показником практично відсутня, що особливо характерно в випадку ПЛ хвої представників роду Ріпиз.

3) Вксокомолекулярнісгь компонентів За молекулярною вагою вуглеводнів ГІЛ серед вивчених рослин відзначається Ріпив вуїуезігіз, в ПЛ хвої якого знайдено значну кількість Сзо - Сзі алканів. В той же час в двох інших представниках цього ж роду значної кількості високомолекулярних

Вад рослини п 2п

Рісеа риякепз 90,05 9,95

Рісеа аЬіез 82,47 7,53

Ріпці раїїавіапа 54,89 55,11

Ріпиз зуіуезіхів 64,69 35,31

Ріпиз пІ£га 57,05 42,95

Ьагіх БІЬігіса 47,86 52,14

компонентів не знайдено. Таким чином, видоспецифічність вуглеводнів ПЛ хвої може бути продемонстрована з використанням таїсого підходу.

Для складу зкпршгх кислот ПЛ хвої характерна: насиченість та значна кількість кпіршіх кислот з пепзриоіо кількістю атомів вуглецю (та5л. 4).

. Таблиця 4

Склад ксирітх кислот поверхневих ліпідів листя хпойгінх рослин %, ■

_________________________________вік хвої 1 рік________________________________

>ІСирі:а Рісеа Рісеа Рілиз Ріпиз Ріпиз підга Ьегіх віЬігіса

кислота рипяепз р.Ьієї раїїагіїпз вуїуеїйіз

С„ 1,14± 0,02 . - 0,93+ • 0,01 - 1,56+ 0,03 . -

Си 13,73+ одп 0,73± 0,02 2,42+ 0,05 3,84+ 0,03 3,44+ 0,07 0,11+ ■ 0.02

Сц . - - ■ 0,42+ 0,01 . - 1,01+ 0,01 ' сл.

Сн 2,07+ 0,04 1,15± 0,01 8,07+ 0,16 ся. 3,55+ 0,04 0,12+ 0,01

СіЗ 14,52+ 0,15 12,09± 0,12 12,74+ 0,25 )о,77+ 0,11 . 10,75+ 0,11 . 0,1)5+ 0,01

Сі5 .6,99+ 0,14 . 2,62+ 0,03 4,39+ 0,04 6,32+ 0,13 . 3,52+ 0,03 2,09+ 0,02

■Сі7 12,32+ 0,24 ’ 10,73+ ОДІ 15,72+ 0,15 ^,43+ 0,09 12,01+ 0,12 сл

Си - 4,91+ 0,05 2,03+ 0,02 1,07+ 0,01 1,44± 0,01 1,55± 0,02

С]9 38,40+ 0,40 56,33+ 0,56 • 15,21+ 0,17 14,97+ 0,15 . 12,09+ 0.24 0,50+ 0,01

С20 - 3,02+ 5,10+ 1,81+ . . - 2,13±

0,03 0,10 ..ОД! ’ 0,02

Сл - - - 4,31± о,сз - 1,13± 0,01

Си 6,93± 0,07 4,25+ 0,05 23,72+ 0,29 36,71+ 0,37 47,79+ 0,9-1 90,30+ 0,91

Ся •- , - - 5,32+ 1 0,05 - - 0,88+ 0,01

Сї4 3,89+ , 4,15± сл. • 6,75+ 2,78± 1,04+

0,04 0,03 0,07 . - 0,03 0,01

Вивчені представника хвойних мають зпачкі мізхродозі відмінності зз / співвідношенням жпрюіх кислот, яга входять до складу ПЛ. Так, для роду Ріст характерна значна кількість зкиршіх кислот з непарною кількістю атоміа вуглецю (21-34%), для Ріпиз - Сгг-гаїріюі кислоти (29, 36, 48%), а для Ьагіх - тількі Сгг зхітрної кислоти (більш 90%). Якщо роди Рісеа та Ріпиз близькі за складом етгртге кислот, то Ілгіх суттєво відрізняється кокливо внаслідок іншого змггтесого циклу та впливу фізиологічного віку листя на склад ПЛ.

На оснозі отриманих даних та даних літератур:! можна припустита, що жирні кислоти з непарною кількістю атомів вуглецю існуюють а ПЛ у вільному стані. Надзвичайно сильне поглинання п області 1725 см Г1Л Р. г.Ьісз з цієї точки

зору можна пояснити поглинанням валентного зв’язку карбонілу, гептадеканової (Сп), пентадеканової (С15) та нонадеканової (С19) жирних кислот в неетерифікованому стані.

Сумарні псверзпгві ліпіди явої в процесі розвитку листя. На підставі отриманих даних очевидно, що навіть для одного роду Pinus склад вуглеводнів та жирних кислот в ГШ однорічної хвої відрізняється за молекулярною вагою. Так, для P. sylvestris характерна наявність більш внсокомолекуллрішх жирних кислот з кількістю атомів вуглецю більше С20 - 52% та вуглеводнів з номером виходу вище десяти 74%, в порівнянні з ПЛ P. pallasiana 34% та 45% відповідно.

В основі робочої гіпотези було припущенім, що динаміка формування компонентів ПЛ цих двох видів відрізняється, таким чином, існують значні відмінності в складі ПЛ видів Pinus sylvestris та Pir.us pallasiana в процесі розвитку хвої. Дійсно нами показано, що в процесі розвитку змінюється співвідношення смуг на користь смуги 1735 см'1 б ІЧ-спектрахПЛ.

Для P.sylvestris - вида, який характеризується більш високомолєкулярними компонентами, ця особливість виражена більш суттєво. Ці спостереження свідчать про активний синтез або розклад карбонілвмісних сполук (жирні кислоти в вільному стані та складні ефіри) в процесі розвитку хвої. Для додаткового

Таблиця 5. підтвердження цієї Результати термограві^етричішх гіпотези ми застосували

досліджень поверхневих ліпідів хвої P. sylvestris L. метод ДТА, чутливий до

молекулярно-динамічних характеристик сполук та їх сумішей. Виходячи з отриманих результатів (табл. 5), можна констатувати наявність двох низькотермічних близько розташовашіх ендотермічних ефектів (І та И).

Перший - широкий, без мінімуму в інтервалі 20-50° С, а другий -гострий з чітким мінімумом в інтервалі 45-80 С. Обидва ендотермічних ефекти проходять без втрати ваги, що свідчить про наявність фазових переходів при цих температурах.

Базуючись на даних подібних досліджень (Reinhardt 1994) та теорії термографії (Берг 1969), можна віднести ефект 1 до плавлення аморфної фази Г1Л, а II - до плавлення кристалічної фази ПЛ.

При подальшому підвищені температури спостерігається серія ендотермічних

та P. pallasiana D.Don різного віку.

Вік хвої І Ендоефеет без втрати маси 11 Ендоефект без втрати маси

Термічний інтервал, °С Міп °С Термічний інтервал, °С Міп °С

Pinus sylvestris

1 рік ■ 40-50 - 50-80 60

2 рік 35-40 - 40-60 ■ • 50

3 рік 45-50 - 50-65 57

Pir.us pallasiana

1 рік 20-40 - 45-55 52

2 рік 22-43 т 45-70 56

3 рік' 25-45 ' 45-75 60

ефектів з втратою ваги.

З точки зору біохімічних особливостей ПЛ найбільш цікаві ефекти I-1I. Параметри цих ефектів свідчать, що: 1) ПЛ листя двох вивчених рослин відрізняються за структурно-динамічними характеристиками; для P. sylvestris характерні термічні інтервали та максимуми переходів при значно вищих температурах, ніж для P. pallasiana, іцо підтверджується нашими попередніми даними; 2) для вивчених рослин характери відмінності в закономірностях формування ПЛ: якщо для P. pallasiana характерно підвищення молекулярної ваги компонентів ПЛ хвої з віком, то в P. sylvestris умовно “важкі” компоненти синтезуються ще в молодої хвої; 3) міжвидові відмінності в ПЛ характерні як для аморфної, так і для кристалічної фази ПЛ.

Таким чином, види рослин суттєво відрізняються один від одного за молекулярно-динамічними характеристиками сполук, що утворюють захисний шар. '

За шкалою газостійкості (Илькун 1978) ці рослини віднесені до різник груп: P. sylvestris - до нестійких (V группа), a P.pallasiar.a - відноспо стійких (ЦІ группа). Відносна стійкість другого виду може бути пояспена можливістю фазового переходу при фізіологічних температурах. Наявність низькотермічного фазового переходу в ПЛ хвої відмічена нагли вперше та його фізнологічне значення раніше не обговорювалось.

Мінливість складу вуглеводнів поверхневих ліпідів хвої в процесі ії розвитку. Застосовуючи показник гетерогенності, який був описаний вище, спостерігали, яісвін змінюється в Рісеа з віком: P. pungens - 3, 7, 10; P. abies - 7, 9,10;BPinus: P. pallasiana -10,13,15; P. sylvestris - 11,14,14; P. nigra - 10, 11, 12, для першого, другого та третього років, відповідно.

Отримані результати підтверджують раніше висловлеле припущення про те, що ступінь гетерогенності вуглеводнів ПЛ хвої зростає в лроцесі її розвитку. На рис. 2 показано динаміку вмісту превалюючого компоненту - нонакозаігу (С29), який ми обрали раніше як показник гетерогеннності. Рисунок демонструє специфічність двох родів відносно динаміки вмісту превалюючого компоненту. Якщо для роду Рісеа зростання гетерогенності вуглеводнів ПЛ хвої з віком проходить дуже інтенсивно та вміст превалюючого компоненту змінюється вдвічі протягом року, то для роду Pinus зафіксований процес зміни гетерогенності незначний (майже всі вуглеводневі компонента синтезуються вже п перший рік), але він практично не стосується Сгэ-апкану, тому що ионакозан залишається самим значним компонентом на всіх вивчених стадіях розвитку хвої.

Співвідношення парних та непарних компонентні зазнає значних змін в процесі розвитку хвої обох представників хвойних. Найбільш характерніш ци с для роду Pinus, де суттєво зростає частка непарних компонентів та падає частка парних. Зміни гетерогенності таком трапляються внаслідок зростання частки Сп, С|9, Сзі-алкапів. Для роду Рісеа є характерним незначна зміна співЕІдношгннл парні/непарні вуглеводні. Процес формування вуглеводнів в розылку хвої проходить по-різному: в роді Рісеа спочатку синтезується набір вуглеводнів, до превалюють (до 90%) непарні алкаїш та цей спектр поповнкилъся парними вуглеводнями; в роду Pinus парні вуглеводні знаходяться в значних кількостях

90

SO

g 70

£ €0 u

I 50

^ 4D fc

I 30 20 10 0

1 2 з

• ' - ‘ Вік хвої (FiK)

— -Ф— Pinus sylvestris —s— Pinus раШгаапа ■■-■a-—Pinas nigra -■'H Ficca pun£5ss • •»• • Picea ebies

Рис.2. Вміст іюнакозшіу (%) в вуглеводневой фракції ПЛ хвої різного віку.,. ‘

Бік хвої (ріж)

■S Picea pungciis —U—Picea abics - Pinus pallasiana

—їь—Pinus sylveslris —-й— Pinusnigra

Рис.З Динаміка вмісту високомолекулярних компонентів (%) вуглеводнів ПЛ хвої різного віку

(більше 50%) в молодому листі, а в процесі росту листя їх кількість зменьшується практично втричі. Тобто, крім різної видоспецнфічної динаміки формування спектру вуглеводнів, слід відмітити, що найбільш активним процес зміненім вуглеводного спектру є для молодого листя; починаючи з 2 року практично сформовано “дорослий” спектр, який має родові та видоспецифічні відмінності (приблизно однакову гетерогенність 11-13 та ступінь превалювання непарних компонентів).

Для 4-х представників хвойних динаміка формування умовно внсокомолекулярних компонентів (ВМК - вуглеводні з радикалом вище С29) ПЛ хвої майже схожа: низький вміст па 1 році та високий на 2 та 3 роках розвитку (рис.З). Унікальним в цьому плані є Рншэ БуїуеЕїтіз, ПЛ якої вміщують значну кількість ВМК на протязі всього вивченого періоду розвитку хвої.

Мінливість складу пяірпнх ігислот поверхневих ЛІПІДІВ ХВОШПІХ в процесі розвитку хвої. Для псих вивчених видів хвойних знайдені загальні закономірності зміни жирлокислотного сісладу сумарних ПЛ:

а) Значне збільшення частки бегенової кислоти (рис. 4). Якщо для роду Рігшз кількість цієї жирної кислота була суттєвою в ліпідах хвої першого року та її вміст з віком збільшувався вдвічи, то для роду Рісеа це збільшення досягало десятикратних величин. Раніше нами було показано, що збільшення інтенсивності біосинтезу бегенової кислоти є характерним для вікових змін ПЛ інших рослин (Батюкова 1997).

б) Збереження високого вмісту жирних кислот з парною кількістю атомів вуглецю. В процесі росту в ПЛ хвої зберігається високий вміст жирних кислот з парною кількістю атомів вуглецю без врахування бегенової кислоти. Збільшення молекулярної ваги компонентів може бути поясненням зсуву фазових переходів ДТА-кривих в область більш високих температур в ПЛ листя старшого віку.

в) Зниження вмісту жирних кислот з непарною кількістю атомів вуглецю

'/ . . - Ця закономірність також більш характерна для роду Рісеа, ніж для роду

Рігшв. Нами було висунуте припущення про існувати жирних кислот з непарною кількістю атомів вуглецю в вільному стані в ПЛ хвої, що відповідає результатам ІЧ-спектроскопії та літературним даним.

Про можливість препаративного виділення ;:аіршіх кислот з спаду листа хвойних. Нами був модифікований метод гідролізу ліпідних екстрактів рослин таким чином, що з опаду листя Ріпив 5уІУЄ£(тІ8 ми отримали до 3,8% суміші вищих жирних кислот. Були підібрані оптимальні умови обробки опаду листя: кип'ятіння подрібненого опаду в водному лузі та наступна екстракція. В залежності від використаного варіанту методу можна отримати різну за складом суміш жирних кислот.

Метод є простим в технічному виконанні, передбачає багаторазове використання розчинників, що суттєво знижує собівартість продукції та витрати на охорону оточуючого середовища. Сировина для виробництва С22 та С20 жирних кислот за цим методом є доступною та широко розповсюдженою. Можливе використання даного методу виробництва суміші вищіх жирних кислот з відходів деревообробної промисловості.

Обговорення можливої схеми синтезу компонентів поверхневих ліпідів

ВЖТ беГСЕОЗОЇ

2 З

Бк хвсі(рік)

Рісса рап^епа ->43— РюеааЬіеа

, Сі» хоої (рік)

Ріпиз •у'.увсагіа —-О—Ріпиз раій&йіиі -чаг- Рїюі пізгз

Рис. 4 Вміст бегеїЮЕОЇ кислоти (%) в поверхневих ліпідах хвої різкого віку: . А-роду Ріпім, Б-родуРісеа

хвої. На схемі показано роботу двох систем елонгації-декарбоксилювання (ЕД): ЕД-1, яка призводить до утворенім жирних кислот з непарною кількістю атомів вуглецю та вуглеводнів; ЕД-2, в результаті дії якої синтезуються високомолекулярні жирні кислоти з парною кількістю атомів вуглецю та спирти, які утворюють складні ефіри. '

На перших стадіях розвитку листа, за нашили даними, активні обидві системи, проте превалює ЕД-1, яка приводить до видоспецифічного спектру вуглеводнів, жирних кислот з непарною кількістю атомів вуглецю та зростанню високомолекулярності всієї фракції ПЛ. Це дозволяє нам стверджувати, що в процесі розвитку хвої інтенсифікується робота системи ЕД-2. Можна відмітити також деякі видоспецифічиі компонента, зокрема, превалювання Сім жирної кислоти п вільному стані в Рісеа еЬієб в листі 1 року.

Отримані нами дані розширюють та поглиблюють уявлення про механізми процесу формування компонентів ПЛ листя, який .є активним на протязі вивченого періоду та проходить з утворенням нових компонентів, а також має родові та видоспецифічиі особливості. (

' Висновки ■ ' .

1. Вивчення родових та видоспецифічиих особливостей формування

поверхневих ліпідів листя хвойних рослин повиненно включати спектральні та газохроматографічні дослідження сумарних поверхневих ліпідів, наступний гідроліз та дослідження фракції 'хирних кислот і метод диференційного термічного аналізу. . . ' .

2. ІЧ-спектроскопія інформує про активний синтез карбонільних сполук в складі поверхневих ліпідів в’процесі розвиткухвої, які полягають в зміні співвідношення інтенсивностей смуг поглинання в області 1705-1710 см'1 та 1725-1740 см"1 в поверхневих ліпідах листя хвойних різного віку.

3. Для активного формування компонентів поверхневих ліпідів листя хвойних в процесі їх розвитку характерні зміни складу вуглеводнів: підвищення ступеню гетерогенності, зростання частки Сп, Сі9, Сзі-алканів та частки високомолекуляриих компонентів. Тенденції зміни компонентного складу поверхневих ліпідів характерні для всіх вивчених видів хвойних, при цьому деякі родові та видоспецифічні особливості стосуються накопичення окремих компонентів!

4. Суттєву частку (до 79%) в поверхневих ліпідах листя хвойних складають жирні кислоти з непарною кількістю атомів вуглецю, які знаходяться переважно в вільному стані. Загальною закономірністю зміни складу поверхневих ліпідів в процесі розвитку хвої для всіх вивчених видів хвойних є різке збільшення кількості бегенової кислоти в її ПЛ (Ріпив - в

1,5-2 рази, Рісеа - в 10 разів), а також зниження кількості жирних кислот, з непарною кількістю атомів вуглецю.

5. Для поверхневих ліпідів листя хвойних характерні два низькотемпературних фазошіх переходи в областях 20-50°С та 40-80°С (без втрати ваги), які можна віднести до плавлення аморфної та кристалічної

фази. Температура фазових переходів залежить від складу та динаміки формування компонентів поверхневих ліпідів хвої.

6. Пршіусткова схема напрямків біосинтезу окремих класів та

компонентів поверхневих ліпідів листя хвойних, створена на основі отриманих даних, демонструє їх активацію або інгібування на окремих етапах розвитку хвої. ■

7. Екстракції ліпідів з опаду лнстя хвойних з наступною хімічною модифікацією екстракту дає можливість огрлмага до 3,8 % вищих жирних кислот та може бути рекомендована для практичного використання.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації:

1. Штеменко Н.І., Дукпчрпп О.В.. Заморуева Л.Ф. Особливості сісладу поверхневих ліпідів хвойних//У кр. біохім. 32yprr.-1997.-T.69, Ж4.-С.61-65.

2. Б.тпоковп О.В.. Штеменко Н.І., Глушко В.В. Вищі жирні кислота поверхневих тканин зерна кукурудзи//Бюлетень інституту зернового господарства .-1997.-Ла5.-С56-58.

3. Штеменко Н.І., Батіоковн О.В.. Штеменко О.В., Дрик Т.В. Спектральна та

термогразіметрцтша харагстеристика поверхневих ліпідів хвої різного віку // Уіф. біохім. журн,- 1999.- Т.71, J&3.-C.119-121 .

4. Штеменко Н.І., Дрик Т.В., Мартшіова В.В., Батіо;;ові О.В. Дослідження

оксосполук поверхневих ліпідів листків рослин// Укр. біохім. хсурн,- 1999.- Т.71, №4,- С.84-88 ,

5. Shtemenko N.I., Zamorueva L.F., Dnckachovn Q.V.. Vinnichenko A.M. Investigation of surface layer of plant leaves// Матеріали Першої міжнарод.-і. Науково-практнчної конфер. “Стійкий розвиток: забрудненій навколишнього середовища та екологічна безпека” Дніпропетровськ, Д ДУ - 1999.-С. 114-116

6. Дрик Т. В., Штеменко Н.І., Паталах І.І., Батюкова О.В. Склад хшрішх кислот поверхневих ліпідів деяїсих рослин// Вісішк ДДУ .Біології. Екологія.-1999. -С.58-62.

7. Shtemenko N.I., Du’:nclinvn Q.V.. Zamorueva L.F. Waxes in plant protection // Abstr. of XIII International Plant Protection Congress.- The Magus (The Netherlands.-1995.-1309;

8. Shtemenko N.I., Patnfrovn Q.V.. Diyk T.V. Responses of coniferous to air pollution // Abstr.of Tha Fourth International Symposium on ’’Responses of Plant Metabolism to Air Pollution and Global Change”.-Thc Nctherland.-1997.-P.124.

9. Бптюко^ч O.B., Штеменко H.l. Особливості біосинтезу поверхневих ліпідів хвойних // Тези доповідей. VII Українського біохімічного з ізду.- Киів.-1997.-С.82

10. Shtemenko N.I., Tlntiifcova Q.V.. Dryk T.V., Patalakh I.I. Some physical-chemical properties of leaf cuticular lipids // Abstr. of International Conference on Ecotoxicology & Environmental Safety “Secotox 98”,-Antalya (Turkey).- 1998.-P.93.

Bcrzenina O.V. Biochemical speciality surface lipids of Coniferae leaves. The manuscript. .

. The thesis for competition of scientific degree оГ candidate of biological sciences on a speciality 03.00.04 - biochemistry - Taras Shevchenko Kyiv National University,

Kyiv, 2000.

The disertation is dedicated to study of surface lipids of Coniferous plants leaves in the process of the needle development. The methodical approach for study surface lipids has been worked out. The informntivity of IR-spectroscopy is shown. The data which to confirm the active synthesis of carbonylcontaining compounds surface lipids in the process of the needle development have been obtained. The trends of change of compounds in content of surface lipids were shown for all species of studied needle plants. Meanwhile the generic and specific peculiarities have been observed. The dinamic changes in the carbohydrate fraction concerning the elevation of heterogenity level were found. The increase of both Си. C19, Сзз-аИсапез and the part of highmolecular components were noticed. The fraction of fatty acids contained high level of odd-carbon fatty acids. During the process of the needle development the high increase of behenic acid content was observed, besides the level of even-carbon acids content decreated. These data'obtained shown general tend regularity in changes of fatty acid fraction of surface lipids for all studied species. Using the method of differential thermal analysis (DTA) the presence of two phases transitions without mass loss has been shown. There transitions could be classified as surface lipids melting points of amorphous and, crystalline phases respectively. The possible way of biosynthesis some components of surface lipids has been shown in the present work. The method of purification of considerable amount of fatty acids with long chain from modified extract of deciduous needle on the base of obtained results has been proposed. This method could be recommended for practical use.

Key words: Coniferous, surface lipids, GL-chromatography, fatty acids, carbohydrates, behenic acid .

Берзеніна O.B. Біохімічні особливості поверхневих ліпідів хвойних рослий (Coniferas). Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2000.

Дисертащпо присвячено вивченню складу поверхневих ліпідів листя хвойних рослин в процесі розвитку хвої. Розроблено методичний підхід до вивчення поверхневих ліпідів. Показано інформативність інфрачервоної спектроскопії, отримані дані підтвержуїоть активний синтез карбонільних сполук в складі поверхневих ліпідів в процесі розвитку хвої. Доведено, що тенденції зміни компонентного складу поверхневих ліпідів характерні для всіх вивчених видів хвойних, але прн цьому відмічаються деякі родові та видоспецифічні особливості. Для вуглеводневої фракції в процесі розвитку притаманні: підвищення ступеню гетерогенності, зростання частки Сп, С19, Сзі-алканів та частки висомолекулярішх компонентів. Показало, що для фракції жирних кислот має суттєвий вміст жирних кислот з непарною кількістю атомів вуглецю. В ході розвитку хвої спостерігалось різке збільшення кількості бегенової кислоти, а також зниження вмісту жирних кислот з парною кількістю атомів вуглецю, що є загальною закономірністю зміни складу поверхневих ліпідів для всіх вивчених видів хвойних. Методом диференційного термічного аналізу показано наявність низькотемпературних фазових переходів (без втрати ваги) в поверхневих ліпідах

лнстя хвойних, які молена віднести до плавлення аморфної та кристалічної фази. В роботі дшю моіісливу схему напрямків сшігезу о/гремих класів' та компонентів поверхневих ліпідів лнстя в різних видах хвойних. На основі отриманих результатів розроблено метод екстракції ліпідів опаду листя хвойних з наступною хімічною модифікацією екстракту, при якій досягається ввділеши суттєвих кількостей вищих -жирних кислот та яізій мо:::е бути рекомендований для практичного використання.

Ключові слова: Coniferous, поверхневі ліпіди, ГР-хроматографія, жирні існслоти, вуглеводні, бегенова кислота

Берзешша О.В. Ьиохішіиесіаїз особгішости поверхностных дипидов хвойных (Coniferae). Рукопись. .

• . Диссертация на соискание степени кандидата биологических паук по

специальности 03.00.04. - биохимия - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2000. -

Диссертация посвящена изучению состава поверхностных липидов лвстьез хвойных растений в процессе развития хвои. Разработан методический подход включающий спектральные и газохроматографнчеекпе исследования суммарных поверхностных липидов, последующий гидролиз п изучение фракции жирных кислот, Разработанный подход позволил установить родо- и видоспецифические особенности процессов биосинтеза основных компонентов поверхностных липидов, активных в процессе онтогенеза листа. Результаты поведенных исследований позволяют более глубоко понять причшшо-следстЕенпые связи между химичес.си.ч составом поверхностных липидов листьев растений различного возраста и их защитной функцией. .Сделанные наблюдения и выводы значительно расширяют представлення о механизмах функционирования различных бносинтетйческих процессов в эпидермальных тканях растений.

Показана' информативность инфракрасной спектроскопии: полученные данные подтверждают активный синтез карбошшеодержащих соединений в поверхностных липидах заключающиеся в изменении соотношения интенсивностей полос П0ГЛОЩЄШШ в области 1705-1710 см'1 и 1725-1740 см"1 в поверхностных липидах в процессе развития хвои. В тоже время дан критический анализ метода тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии, не позволяющих выявить родо- и видоспгцифдчгскнз особенности состава поверхностных липидов. Доказано, что тенденции изменения компонентного состава поверхностных липидов характерны для всех изученных ендов хвойных. Но при этом отмечаются некоторые родовые и видоспецнфические особенности. Углеводороды хвойных представлены в основном нечетными алканами л четными алканами от Сщ до См- Превалирующим компонентом у всех хвойных является Сг9-алкан. В целом, для углеводородной фракции характерны следующие динамические изменения: повышение степени гетерогенности, возрастаний доли Сп, С|9, Сл-алканов и доли высокомолекулярных компонентов. Нб ёс;!й для рода Ріссз увеличение гетерогенности углеводородов поверхностных л'кпйдоп хвои с возрастом происходит очень • интенсивно и содер™йг.ле превалирующего компонента меняется почти вдвое в течение года, то для рода Pimis зафиксированный процесс изменения гетерогенности менее выражен (почти псе

углеводородные компоненты синтезируются уже п первый год) н он практически не затрагивает Сг^алкан, так гак пснакозан остается самым значительным компонентом на всех изученных стадиях онтогенеза.

Показано, что фракция жирных кислот имеет существенное содержание зюгрных кислот с нечетным количеством атомов углерода. Можно предположить,' что жирные кислоты с нечетным количеством атомов углерода существуют в ПЛ в свободном виде. Необычно сильное поглощение в области 1725 см'1 ПЛ P. abies с этой точки зрения можно объяснить поглощением валентной связи карбонила гептадекановой (Сп), пентадешшовой (Cis) и нонадекановой (С19) жирных кислот в неэтерифицирозанном виде.

В ходе развития хвои наблюдалось резкое возрастание содержания бегеновой кислоты, а также снижение количества жирных кислот с нечетным количеством атомов углерода, что является общей закономерностью изменения состава жирнокислотной фракции поверхностных липидов всех изученных видов растений. С помощью метода дифференциального термического анализа, который чувствителен к молекулярно-динамическим характеристикам соединений и их смесей показано наличие двух фазовых переходов (без потери массы) в поверхностных липидах листьев хвойных в областях 20-50°С и 40-80лС, которые можно отнести к плавлению аморфной и кристаллической фазы поверхностных липидов. По шкале газоустончнвосги эти растения отнесены к разным группам: Pinus sylvestris - к нестойким (V группа), a Pinus pallasiana - относительно устойчивым (Ш группа). Относительная устойчивость второго бида может быть объяснена возможностью фазового перехода при физиологически значимых температурах. Наличие низкотемпературного фазового перехода в хвойных обнаружение нами впервые и его физиологическое значение ранее не обсуждалось. В работе приводится возможная схема путей биосинтеза отдельных классов компонентов поверхностных липидов хвои обсуждается их активация или ингибирование в процессе онтогенетического развития листа. На основе полученных данных разработан метод выделения значительных количеств высших жирных кислот из модифицированного экстракта опада хвои, который может бьггь рекомендован для практического применения. .

Ключевые слова: Coniferous, поверхностные липиды, ГЖ-хроматография, жирные кислоты, углеводороды, бегеновая кислота. с