Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические основы фармакологических свойств метилкобалазма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические основы фармакологических свойств метилкобалазма"

РГ6 од

1 О УЛ!1 1993

ОРДЕНА друга НАРОДОВ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖШ НАРОДОВ

На правах рукописи

ЦУ1СЕРЫАН ЕЛЕНА САМАРЬЕВНА

УДК 616.154.164.161-02:[615.874. 24:647.98:577.164.1841-092.9

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСШВЫ ФАРИАК0Л0ГИЧЕСЩ1Х СВОЙСТВ МЕШК0БАЛШЕ14 (G3.00.04 - бкохинкл)

Автореферат

на соискадке учеиоЗ степе¡гл кандидата биологических наук

Мооказ - 1333

Работа выполнена в Научно-производственном Объединении "Витамины". ■ '

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор А.А« Познанская Научный консультант доктор медицинских наук В.М. Авакумов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.И. Воробьева член-корреспондент РАМН, профессор Б.©. Коровник

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится 11993 Г. В '/Ш часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Российском Университете Дружбы Народов по адресу: 117198 £00. Москваул™«¿ялухо-Маклая, д.8, Медицинский факультет.

О диссертацией можно ознакомиться в научной библиотэ Российского Университета Дружбы Народов по адресу: Москва, у Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан ^ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук,

профессор В.Э. Торбек

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность, темы. Среди известных витаминов, коферментов и их производных витамин В12 отличается большим разнообразием своих би-эхимических функций. Несомненно, что такая полифункциональность витамина В12 связана с его уникальной химической структурой: он принадлежит к координационным соединениям кобальта, отличающимся своей реакционной способностью. В настоящее время известны две ко-Верментные формы витамина В12 - метилкобаламин (МеСЫ) и аденозил-кобаламин (АйоОЫ). а<1оОЫ является коферментом метилмалокил-КоА-мутазы, МеСЫ - коферментом метионинсинтетазы, вовлеченной в синтез' метионина. Т.о. МеСЫ участвует в многочисленных реакциях метилирования в организме млекопитающих. Возможно также, что Месы иогет саы выступать в роли метилирующего агента (РЬоы-Ьевгкоу1ог А., 1991). С момента открытия коферментных форм витамина

В^ внимание исследователей привлекала возможность их использования в качестве лечебных препаратов. Первой коферментной" формой витамина, нашедшей применение в качестве средства метаболической терапии, был даосы. Исследования, касающиеся возможного применения Месы в качестве терапевтического средства,. в основном, проводились в Японии, и в настоящее время МеСЫ используется, в этой стране в качестве лечебного препарата при диабете, различных неврологических симптомах и некоторых других заболеваниях. В нашей стране МеСЫ был синтезирован в НПО "Витамины" под руководством профессора А.Ы. Юркевича. В сбязи с этим возникла необходимость изучения этого коферментного препарата в качестве потенциального лекарственного средства. Учитывая, что к этому времени в стране выпускалось уже 3 препарата на основа витамина В12 (цианкобаламин, снсы; окснкобаламин, ОНСЫ, и АйоСЫ), особое внимание мы уделили доказательству либо преимуществ Месы в сравнении с АйоСЫ, либо поиску других областей возможного применения Иесы в'лечебной практике. Самостоятельный интерес представляло изучение спектра индивидуальных форм кобаламинов при ряде патологических процессов и возможности коррекции возникающих нарушений с помощью Месы и АйоОЫ. Эти данные позволили бы обосновать выбор той или иной коферментной формы витамина В12 как лекарственного средства. Принимая во внимание вовл€:ч :ние витамина В^2 в поддержание статуса восстановленных эи-групп, представлялось актуальным изучение возможных нарушений со сторс>нъ некоторых компонентов глутатионовой системы при ряде патологических состояний и влияния на них Месы.

Цеди и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось акспериментальное обоснование использования МеСЫ как лекарственного средства с помощью биохимических методов исследования. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить характер изменений со стороны кроветворения и обмена кобаламинов при анемии, вызванной введением фенилгидразина (ФГ), и возможность коррекции обнаруженных нарушений с помощью НеСЫ.

2. Выявить изменения в обмене кобаламинов и состоянии некоторых компонентов глутатионовой системы (уровень общи* и небелковых БН-групп, активности глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы) в условиях белково-холиновой недостаточности у крыс и изучить возможность коррекции нарушений, возникающих при в той патологии с помощью МеСЫ.

'3. Изучить возможное гепатопротекторное действие МеСЫ на модели токсического гепатита, вызванного галактозамином (ГА).

4. Изучить потенциальную противовоспалительную активность МеСЫ, влияние его на спектр индивидуальных форм кобаламинов в крови и внутренних органах, а также состояние детоксицирупцей функции печени при адыовантном артрите (АА) у крыс.

5. Провести изучение фармакокинетики МеСЫ в сравнении с другищ формами витамина В12.

. Выбор моделей патологических состояний определялся участие» Иесы в обмене веществ. Большинство исследований проводилось I сравнении с хаосы для выяснения возможных отличий в действии втш двух коферментных форм витамина В12«

Научная новизна. Впервые изучен спектр индивидуальных форм коба-ламинов в крови и органах экспериментальных животных при гепатита различной этиологии, ФГ-анемии и АА, что позволило выявить наруше ния в обмене кобаламинов при этих видах патологии. Установлено что в большинстве случаев в крови животных развивался дефици Иасы. показано, что только Кеоы (но не АОоОЫ) норнализуе спектр индивидуальных форм кобаламинов при отравлении кроликов ФГ ГА-гепатите и белково-холиновой недостаточности у крыо. Впервы изучено состояние некоторых компонентов глут^гионовой системы пе чени при ГА-гепатите и АА. Показано, что Косы способствует под держанию статуса 8Н-грутш при белково-холижшэй недостаточности ГА-гепатите. Установлено, что ЫаОЫ предотвращает снижение актин ности глутатионтрансферазы при белково-холиновой недостаточности активности глутатионреДуктазы при ГА-гепатите и АА. Проведено срг В1штелыюе изучение, фармакокинетики МаОЬ1, А<ЗоСМ, ОНСЫ и СЫОЬ]

- э -

позволившее выявить определенные закономерности фармакокинетичес-. кого поведения этих кобаламинов и рассчитать их основные фармако-кинетические параметры.

Научно-практическая значимость. Проведенные исследования показали, что изучение спектра индивидуальных форм кобаламинов в крови и органах экспериментальных животных позволяет выявить нарушения в обмене витамина В^. тогда как определение только общего содержания кобаламинов малоинформативно. При клиническом использовании препаратов на основа витамина В^ необходимо учитывать специфику нарушений в обмене кобаламинов при разных видах патологии и применять ту форму витамина, в которой больной организм нуждается прежде всего.

На основании обнаруженной у МеСЫ противовоспалительной активности при ДА, а также способности препарата поддерживать на нормальном уровне обмен кобаламинов и систему биотрансформации ксеноби-отшсоз (детоксицирующую функцию печени) получено разрешение Фарм-комитета ( протокол N 10 от 30 мая 1990 г ) на клинические испытания препарата в комплексной терапии ревматоидных артритов у человека. Аналогичное разрешение (протокол N 10 от 10 июля 1991 г) получено на клинические испытания МеСЫ как гепатопротектора. Соответствующие материалы представлены в Фармкомитет для получения разрешения на клинические испытания МеСЫ в гематологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изуче!ше спектра индивидуальных форм кобаламинов при различных видах экспериментальной патологии: ФГ-анемии, АА, гепатитах различной'этиологии позволяет выявить определенные нарушения в обмене кобаламинов в организме животных.

2. Развитие ФГ-анемии, белково-хожповой недостаточности, ГА-гепатита к АЛ сопровождаются нарушением функционирования глутатио-иовоП системы печени гшвотных, которое мсзет быть предотвращено введением несы.

. 3. МеСЫ оказывает нормализующее действие на процессы кроветворения при ФГ-анемии.

4. МеСЫ обладает гепатопротеятоикми свойствами при остром ГЛ-ггпатите.

5. Обе коферментгае формы витамина В1?~ Це.сьх и ЛйоСЫ обладают противовоспалительной активностью при АЛ у крыс, причем МеСЫ в этом отношении более эффективен. МеСЫ способствует поддержанию детоксицирующей функции печени, нарушающейся при этом патологическом процессе.

6.' Каждая из четырех физиологически активных форм витсдашг 31й.

имеет индивидуальные особенности фармакокинетического поведения. Определены основные ' фармакокинетические параметры МеСМ. Апробация. Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы экспериментальной и теоретической медицины" (Одесса, 1986), 2-й Всесоюзной конференции по фармакокинетике (Каунас, 1987), 19-й конференции ФЕБО (Рим, 1989) VII Биохимической конференции Прибалтийских республик (Каунас,

1990), Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва,

1991), Симпозиуме »Витамины и здоровье" (Москва, 1993). Публикации. По материалам диссертации опубликовано II печатны

работ.

структура и объем диссертации. Диссертация состоит и& введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц и 4 рисунка. Библиографический указатель состоит из 126 источников литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ. Работа выполнена на 876 белых беспородных крысах-самцах массо! тела 160-200 г и 50 беспородных кроликах-самцах массой тела 1,6-2 кг. В работе использовали модели следующих патологически состояний: ФГ-анемии у кроликов, гепатитов, вызванных введение» ГА и скармливанием рациона, дефицитного по белку и холину крысам, а также АД у крыс. - Црепараты Нвсъх и Айосм применяли 1 лечебно-профилактических целях в течение 7-21 дня в дозах 50-5СХ мкг/кг, внутримышечно (в/м) или внутрибршинно. Для исследовани! использовали 1фовь, печень, почки, селезенку. Определяли уровеи общих кобаламинов мшфобиологическим методом с тест-культуро! Е.0о11 113/3 (Милевская Ю.Л.,1960,- Куцева Л.С., 1961), соотношеши индивидуальных форм кобаламинов с помощью хроматографии (Канопкай те С.И., 1978) с последующей биоавтографией {Млпе11 ¿Г. е* а1. 1969). Концентрацию общих и небелковых БН-групп определяли по ме тоду (ЭваО-ак J. в* а1., 1968). Активность глутатионтрансферазы п (НаЫв V. вt а1., 1981) и глутатионредуктазы по (Ланкин В.З. др., 1976) определяли в гомогенатах и цитозольной фракции печен (Карузина Н.И. и др., 1977), используя спектрофотометры Бресо1-21 и Саггу-219. Для статистической обработки результатов с использо вашем ^критерия Стьюдента применяли ПЭВМ Правец-16. месы идру гие формы кобаламинов были получены в лаборатории тиоорганически соединений НПО "Витамины".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I. Влияние метилксбаламина на процесс кроветворения и обмен витамина В^о при фенилгидразиновой анемии у кроликов.

ФГ широко используется для создания моделей гемолитических анемий, при которых картина крови напоминает таковую, развивающуюся при недостатке витамина В12- Введение ФГ в течение 3-х дней, ежедневно, в дозе 15 мг на кг массы телз, подкожно, приводило к развитию гемолитической гиперхромной анемии на 7-й день опыта, о чем свидетельствовало повышение цветного показателя, снижение числа эритроцитов и гемоглобина и резкое увеличение количества ретину лоцитов (табл. I).

Таблица I

Влияние МеОЫ и АйоСЫ на показатели периферической крови кроликов при ФГ-анемии

Группа

Показатели периферической крови

Эритроциты, нь, г% Цветной Ретикулоциты-млн показатель на 1000 эрит-

роцитов

интактные 6,62+0,2 12,9+1,1 0,95+0,05 3,25+0,2

ФГ 7 да 2,22+0,1* 3,4+0,1* 1,20+0,08* 21 ,3+1 .3*

ФГ 14 дн 4,6+0,5* 6,3+0,3* * 1,10+0,02 12 ,4+1 ,4*

ФГ+ ЫеСЫ 6,1+0,3 8,9+0,8* 0', 9+0,03 9 ,4+3 ,3*

ФГ+АйоСЫ 5,3+0,3* 7,3+0,5* 1,0+0,02 11 ,9+1 ,0*

Примечание: здесь и далее • - различие относительно контрольных крыс достоверно ( Р < 0,02 )

Помимо этого под влиянием ФГ возникал лейкоцитоз и увеличивалось почти в 2 раза количество тромбоцитов. Заметные изменения наблюдались также и со стороны костномозгового кроветворения (повышался индекс созревания нейтрофилов и эритробластов).

Введение Месы в течение 7 дней с 7-го по 14-й дни опыта в дозе 600 мкг/кг, в/м, приводило к полной нормализации ряда показателей крови и кроветворения. Фармакологическое действие АйоСЫ было выражено значительно слабее. Таким образом, меСЫ оказался более эффективен в отношении нормализации гемопоэза при ФГ-анемии у кроликов. Данная часть работы была выполнена совместно о сотрудниками лаборатории фармакологии НПО "Витамины".

Нами было впервые изучено соотношение индивидуальных форм ко-баламинов в крови интактных кроликов: Масы: (онсънсысЫ):АйоСЫ, составлявшее 15:43:42 (табл. 2).

- ъ -

Таблица 2

Влияние о^от и А<1оСЫ на общее содержание и соотношение индивидуальных форм кобаламинов в крови кроликов при ФГ-анемии

Группа Число Содержание отношение MeCbls

животных кобаламинов (OHCbl+CNCbl)sAdoCbl

- М + т (нг/мл)

Интактше 22 29,9 * 2,2 15 : 43 : 42

ФГ 7 дн 9 ' 42,4 + 5,2 15 : 40 : 42

ФГ 14 дн 8 19,6 + 2,4 G ; 49 : 45 .

ФГ + МеСЫ В 104,7 i 12,9 27 : 30 : 43

ФГ + AdoCbl в 77,0 i 8,9 • 8 : 4£ : 50

На 7-И день опыта, когда у кроликов развивалась гиперхромная анемия, общее содержание кобаламинов у большинства животных повышалось, что свидетельствовало о нарушении депонирования кобаламино! в печет;. На 14-й день опыта, когда наблюдалось спонтанное восстановление кроветворения, общее содержание кобаламинов снижалось п< сравнению с исходным уровнем, при этом развивался дефицит МеСЫ что согласуется с представлениями о непосредственном вовлечени МеСЫ в процессы кроветворения (Schneider Z. et al., 1987).

Введение MeCbl или AdoCbl вызывало повышение общего содержали кобаламинов в крови. Применение МеСЫ приводило также к значитель ному повышению содержания «eCbl в крови, тогда как при введени AdoCbl дефицит МеСЫ в крови сохранялся. Таким образом, дефици MeCbl в крови, развивающийся на стадии спонтанной нормализаци кроветворения, компенсируется только введением именно этой кофер ментной формы витамина В12. В этом отношении MeCbl не может быт заменен AdoCbl.

2. Влияние метилкобаламина на соотношение индивидуалышх форц кобаламинов и статус SH-групп при белково-холиновой недостаточности у крис.

Алиментарная белково-холиновая недостаточность широко исгкш зуется для создания моделей жировой инфильтрации, фиброза, цирро: и злокачественного перерождения печени (Ghoehal-А. гД al. , 19Ш; ' Изучение содержания и соотношения индивидуальны* форм. кобаламш в крови и печени крыс, получавших,раодон, дефицитный по-белку холину, в течение 3-х недель, выявило' значительные-изменен^ в о* -мене кобаламинов. Общее .содержание витамина В12 в кроЬи. крио белково-холиновой недостаточностью, было существенно выше,/чем интактных животных (табл. 3)1 В печени при этом не было, отмечё] изменений содержа)шя витамина Вт„. . .

Таблица 3

Влияние Месы и Айосы на общее содержание и соотношение индивидуальных форм кобаламиков в сыворотке крови и печени крыс при белково-холиновой недостаточности

Группа Содеряание кобаламинов Соотношение Месы: нтохншс (Ы+т) (-OHCbl+CNCb1) -ЛйоСЫ

Кровь (пг/мл) Печень (пг/мг) Кровь (*)

-холин 3897 + 216 85,3 + 6,6 16:42:42

+холин 1813 ± 269* 84,1 + 6,9 25:37:38

* *

-холин+MeCbl 5415 + 135 1507 + 5,0 32:35:33

-Х0ЛИН+А<10СЬ1 «5040 i 1Б* 1477 ± 144* ,3:46:51

контроль 633 + 55 НО ± 21,3 34:28:38

По-видимому, повышение уровня кобаламинов в крови при данной патологии происходит в связи с нарушением депонирования кобаламинов в почках, т.к. почки являются основным депо этих соединений у крыс (ЫлпоИ J et al., 1983). Белково-холиновая недостаточность приво-. дала к развитию дефицита ЫеСЫ в крови крыс за счет повышения потребности в нем тканей в условиях недостатка холина. Лечебно-профилактическое применение ЫеСЫ или AdoCbi, с 1-го дня опыта в течение 3-х недель в дозе 50 мкг/кг массы тела, в/м, приводило к накоплению кобаламинов как в крови, так и в печени. Введете Месы оказывало нормализующее влияние на спектр индивидуальных форм кобаламинов в крови, тогда как AdoCbl в этом отношении был малоэффективен. Таким образом, дефщит MeCbl в крови, развивающийся при белково-холиновой недостаточности, удается компенсировать только введением этой коферментной форм кобаламинов.

Изучение содержания общих и небелковых SH-групп п активности глутатионтрансферазы в печени крыс при белково-холиновой недостаточности показало, что уровень как общих, так и небелковых" SH-групп (основной вклад в которые вносит глутатион), зачетно снижается (табл. 4), падает также, и активность глутатионтрансферазы -фермента, принимающего участие во Il-Й стадии детоксикации ксенобиотиков»

Введение ЫвОЫ и idocbl способствовало, сохранению концентра- : ции общих я небелковых SH-групп, однако MeCbl был значительно более еффекткген в отношении поддержания концентрации небелковых SH-групп в пределах нормы. Применение KeCbl предотвращало также ските кие активности глутатионтрансферазы, AdoCbl в этом отношении был малоэффективен.

Таблица 4

Содержание БН-групп и активность глутатионтрансферазы в печени крыс при белково-холиновой недостаточности

Группа Общие БН-группы

мкмоль на 1 г ткани

Небелковые SH-группы

мкмоль на I г ткани

Активность глутатионтрансферазы

мкмоль за I мин на I мг белка

-холин 16,90 + 0,49

+ХОЛИН 21,60 i 1,52

-ХОЛИН+МеОЫ 22,63 +0,98 -ХОЛИН+AdoCbl 23,40 ±0,95 •интактные 21,35 + 0,90

0,92 + 0,03 1,55 ± 0,10* 4,90 ± 0,26 3,29 + 0,25* 5,40 ± 0,20

0,63 ± 0,05 0,91 i 0,08 1,05 ± 0,11 0,66 ± 0,06* 0,89 ± 0,19

Таким образом, применение МеСЫ в условиях белково-холиновой недостаточности способствовало поддержанию статуса БН-групп и активности глутатионтрансферазы в пределах нормы.

3. Гепатоггротекторное действие метилкобаламина йри ' галактозаминовом гепатите у крыс.

ГА-гепатит, по морфологическим и некоторым биохимическим показателям напоминающий вирусный гепатит человека (Keppler D. et al., 1968), вызывали однократным внутрибрюшинным введением ГА в дозе 1000 мг/кг. Токсическое действие ГА связано с нарушением синте-■ ьг дуклеиновых кислот и белка. Развитие ГА-гепатита сопровождалось нарушением гхетоструктуры и ультраструктуры печени: наблюдалось множество очагов лимфоцитарной инфильтрации, зернистая и баллонная дистрофия гепатоцитов. При кариометрии отмечали увеличение площади и диаметра ядер, уменьшение площади ядрышек, что свидетельствовало о нарушении синтеза белка. ГА-гепатит вызывал также ферментеми* (повышение активности алакин- и аспартатаминотрэнсфераз) и билиру-бинемию. Профилактическое применение Месы в дозе 100 мкг/кг, в/м, в течение 14 дней до введения ГА предотвращало развитие гепатита.

ГА-гепатит вызывал также заметное нарушение обмена кобалами-нов. Через 24 часа после введения ГА в печени а гичках заметно по вышалось общее содержание кобаламинов, через 72 часа атот показа тель практически нормализовался. Изменения наблвдались также : спектре индивидуальных форм кобаламинов в крови. Так, содержанй МеСЫ через 72 часа после введения ГА составляло лишь 13% (пр норме 35%), уровень AdoCbl не изменялся. Профилактическое примене ние МеСЫ приводило к повышению общего содержания кобаламинов крови, печени и почках крыс, причем в почках накапливалось значи

тельно большее количество кобаламинов, чем в печени. Введение НеСЫ способствовало сохранению относительного содержания этой ко-ферментной формы в крови, уровень AdoCbl и в этом случае оставался неизменным, что согласуется с представлениями о том, что статус кобаламинов направлен на сохранение постоянного содержания AdoCbl за счет расходования МеСЫ (Bhatt R., 1990).

Изучение некоторых компонентов глутатионовой системы печени при отравлении ГА, показало, что через 24 часа после его введения заметно снижается активность глутатионтрансферазы и глутатионре-дуктазы - фермента, участвующего в поддержании пула восстановленных SH-групп. Введение Иесы предотвращало снижение активности глутатионредуктазы и повышало уровень небелковых SH-групл в 1,7 раза по сравнению с крысами, не получавшими препарат. Т.к. глута-тион и глутатионредуктаза - одно из звеньев антиперекисной защита в .клетке (Кулинский В.И. и др., 1990), можно считать, что НаСЫ косвенно проявляет антиоксидантные свойства. Таким образом, НеСМ оказывает положительное влияние на глутатионовую систему печени крыс, отравленных ГА.

4. Влияние метилкобаламина на воспалительный процесс, обмен кобаламинов и детоксицирупцую систему печени при адъювантном артрите у крыс.

Адъювантный артрит (АА) рассматривается как адекватная модель реаматоидного артрита человека. АА - системное заболевание, приводящее к серьезным нарушениям в структуре и функциях многих внутренних органов крыс, а также в обмене белков, липидов и др. (Neve J. et al., 1983). АА у крыс вызывали путем подкожного введения адыованта Фрейнда во внутреннюю поверхность стопы задней лапы. Q. развитии заболевания свидетельствовало опухание лап, объем которых увеличивался, в среднем, в 2,6 раза по сравнению синтактными животными. Также заметно повышалась скорость оседания эритроцитов (СОЭ; более, чем в б раз) и число лейкоцитов.

Лечебно-профилактическое применение МеСЫ и AdoCbl в течение 7 дней до введения адъиваита и 16 дней после его введения в дозе 100 мкг/кг тормозило развитие опухания. При этом МеСЫ достоверно снижал степень опухания, тогда как при введении AdoCbl наблюдалась лишь тенденция к его снижению. Введение того и другого препарата сникало количество лейкоцитов и СОЭ. Развитие АА сопровождалось также нарушением в обмене кобаламинов. Из рис.1 видно, что АА приводит к достоверному повышению общего содержания кобаламинов в крови и 2-х коферментных форм - МеСЫ и OHCbl. При этом в клетках крови, наоборот, снижается как общее содержание кобаламинов,-так и

содержание Косы и онсы. Таким образом, несмотря на то, что при АА в крови содержится больше кобаламинов, чем в норме, в лейкоцитах наблюдается дефицит кобаламинов, что, по-видимому, связано о нарушением транспорта этих соединений в клетки. Введение животным с АА ЫеСЫ или АйоСЫ приводило к повышению содержания кобаламинов как в плазме крови, так и в лейкоцитах. При этом в лейкоцитах сох-

ранялся уровень ыесы и оном, характерный для интактних животных

Рио.1: Влияние МеСйб и АвоЖ на содержание кобаламинов в плазме (А) и клетках крози (Б). : .

1

иятактные АА

АА + МеСве АА + AdoC6e

Iобщее содержание. кобаламинов

2 - месее

3 - онсее

Л - ЛНоСб?

Изменение содержания кобаламинов и соотношения их индивидуальных форм наблюдалось также в печени, почках и селезенке крыс, больных АА. Эта часть исследований была проведена совместно с сотрудниками Института биохимии АН Литовской Республики под руководством профессора С. И. Канопкайте.

Применение МеСЫ и АйоСЫ предотвращало возникновение изменений, характерных для АА у крыс. Преимущества МеСЫ, выявленные в отношении предотвращения опухания суставов, более значительном накоплении кобаламинов в почках, а также поддержании статуса кобаламинов в селезенке, говорят о предпочтительном использовании этой коферментной формы . витамина В12 в качестве лечебно-профилактического средства при АА. Эти эффекты, по-видимому, осуществляются за счет влияния Иесы на иммунную систему организма (Закапо Т. в! а1.; 1982).

На модели АА было изучено также состояние детоксицирущей системы печени и влияние на нее МеОЪ1, т.к. в нашей лаборатории было показано, что ЫеОЫ является индуктором этой системы (Корсова Т.Л. и др., 1989).

При АА в печени крыс снижалось как содержание, так и м-деметилазкая активность цитохрома Р-450, наблюдалось повышение содержания небелковых БН-групп и снижение активности глутатионре-дуктази (табл. 5); Также отмечали достоверное снижение п-гидрокси-лазной активности цитохрома Р-450 и активности глутатион-грансферазц у больных животных.

Таблица 5

Влияние УеСЫ т состояние детоксицирущей системы . и статус ви-групп в печени крыс при АА (ы+ш)

Показатель Группы крыс

Интактине АА (17 да) АА+МеСЫ

Цитохром Р-450, нмоль за I мин на I мг белка 0,42+0.03 0,19+0,03* 0.21+0.02*

активность даметиланилик и-деметилазц, шлоль нсно . за 1 мин на I мг белка '1,95+0.II 0,73+0,07* 1,27+0,07"

иощие зн-групгш, мкмоль на I г ткани 25,1+1.6 . 24,5+0,67 23.2+1,08

небелковые БН-группы,-мнмоль на 1 г ткани 2.72+0.21 4,64+0,29* 4,45+0,22*

Активность глутатион-редуктазц, шлоль за Г мин на I мг белка 56.1+2.7 33,9+4,5* 47,3+3,1

Таким образом, АА сопровождался нарушением детоксицируюцей функции печени. Введение Меоы на оказывало заметного влияния -на

содержание шпсгроыа Р-450, однако способствовало сохранению его деметилазной активности, т.е. оказывало положительное влияние на детоксицирупцую функцию печени. Препарат также поддерживал активность глутатионредуктазц на более высоком уровне, чем у нелеченых животных.

б. Фармакокинетика метилкобаламина.

Фармакокинетическое поведение ИеСЫ изучали при разных способах введения и разных дозах, а также проводили сравнение фармако-кинетики Хесы с другими формами витамина В12 - АДоСЫ, онсы и снсы. Значение некоторых параметров Месы совпадало с аналогичными АЛоСЫ или онсы. Так параметры Месы, характеризующие процессы всасывания и элиминации, в основном, были близки таковым оцсы, а параметры распределения - Айосы. Хотя каждый из изученных препаратов имел индивидуальные особенности фармакокинетического поведения, параметры двух коферментных форм и ОНСЫ имели более близкие значения между собой, чем с снсы.

Рио. 2. Динамика средах концентраций кобаламинов в крови крыс после перорального введения Иеоы в дозе 500 мкг/кг (А) и внутримышечного введения в дозе 10 мкг/кг (Б).

Для изучения фармакокинетюш Месы при пероральном введении использовали дозы 500 и" 1000 мкг/кг, для внутримышечного введения

- 10 мкг/кг. Динамика концентрации препарата при пероральном введении удовлетворительно описывалась одночастевой фармакокинетичес-ко8 модель® о учетом всасывания, в случае внутримышечного введения

- двухчастевой моделью. Экспериментально найденные средние значения концентрации препарата удовлетворительно согласуются с величинами, рассчитанным! по соответствующим уравнениям (рис.2).

Основное фэрмакокинетические параметр* ыосы, рассчитанные о йспользованием системы программ ASPID, приводятся в табл. 6. Условные обозначения: т^ - время достижения максимальной концентрации, максимальная концентрация, tJ/2 - время

полуэлиминации, АОО - площадь под кривой, kel(0) - константа скорости элиминация, оц - общий клиренс, t - биодоступность.

Из полученных результатов следует, что доза, применяемая при вñt введении может быть примерю на 2 порядка ниже, чем при перо- , ральном введении препарата.

^ Таблица 6.

- Фэрмакокинетические параметры ИеСЫ

Параметр Пероральное введение Внутримышечное введение

тазе, (Wx.HU *1/2, 4 дио, нг/ч-мл' 4-1 01t, мл/мшмег t, % 1000 мкг/кг 500 мкг/гсг 10 мкг/кг

2,0 i 0,5 I,36 ± 0,64 5,0 ± 2,8 10,7 * 6,4 0,14 1 0,06 II,6 ± 3,0 1,0 0,9 ± 0,2 I,80 ¿ 0,38 4,0 t 2,2 9,4 i 3,1 0,17 t 0,08 II,1 t 2,4 1,7 3,8 t 2,4 f II,I ±4,1 0,18 ± 0,09 II,I ± 3,4 100

Результаты наших исследований показали, что биодоступность МвСЫ крайне низка, поэтому высокие дозы препарата целесообразно назначать в случае нарушения всасывания кобаламдеюп в организме.

вывода

1. Впервые изучен спектр индивидуальных форм ' кобаламинов в крови интактных кроликов и выявлены его изменения при фенилгидра-зиновой анемии. Указанные нарушения купировались введением метил-кобаламина.. Обнаружен лечебный эффект -метилкобаламина при атой форме патологии у кроликов, выражавшийся-fe нормализации морфология крови и процессов кроветворения.

2. Установлено, что алиментарная белково-холиновая недостаточ-. ность у крыс сопровождается нарушением обмена кобаламинов, в частности, дефицитом метилкобаламина в крови, а также нарушением статуса SB-групп и снижением активности глутатиоктрансферазы в печени., Метилкобаламин препятствовал возникновению отмеченных нарушений, оказывая лечебно-профилактическое действие.

3. Впервые показано гепатопротекторное действие метилкобаламина при развитии острого Д-галактозаминового гепатита у крыс. Про-'филактическое введение метилкобаламина препятствовало нарушению обмена кобаламинов и изменениям некоторых компонентов глутатионо-бой системы печени при данном отравлении.'

. 4. При адаювантном артрите у jq?nc выявлено противовоспалительное действие метилкобаламина и аденозилкобаламина, причем метилкобаламин в. этом случае оказался, более эффективным. Впервые был изучен спектр индивидуальных форм кобаламинов в крови и органах крыс при адъювантном артрите. Установлено, что развитие этого заболевания сопрововдается существенным изменением в спектре индивидуальных форм кобаламинов в сыворотке крови и-лейкоцитах, а также во внутренних органах 1фыс. Метилкобаламин способствовал повышению уровня коферментных форм кобаламинов в лейкоцитах и плазме крови, что коррелировало с эффектом. торможения воспалительного процесса в суставах конечностей. Месы оказывал положительное влияние на функционирование' детоксицирувдей "системы печени, нарушенное при данной патологии. .

5. Проведено систематическое сравнительное изучение фармакоки-нетического поведения четырех физиологически активных форм витамина В12: метил-, аденозил-, окси- и цианкобаламинов. Выявлены закономерности фармакокинетического поведения метилкобаламина при двух способах введения (пероральное и внутримышечное) разных доз препа-^ рата, что позволило определить его основные фармакокинетические параметры.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Пукн-рнт Е.О., Корсова Т..Т., Познанская A.A. Кобаламины в норме и при патология.// Ьопр. ¡ад. xvae.-1935.-Т.'31.-Въга.5.-C.7-I7.

2. Цукерман Е.С., Познанская A.A., Холодов Л.Е., Курганов Б.И., Дорохов В.В., Клементьева И.В., Смирнова Т.Н., Авакумов В.М. Фармакокинетика препаратов группы витамина В12. Тез. докл. 2-й Всесоюзн. конф. по фармакокинетике.-Kayнас, 1987.-С. 175-176.

3. ЦукерМан Е.С., Познанская A.A., Холодов Л.Е., Дорохов В.В., Клементьева И.В., Смирнова Т.Н., Авакумов В.М., Курганов Б.И. Фармакокинетика окси-, аденозил-, и цианкобаламинов при пероральком введении крысам.//Хим.-фарм. жури.-1983.-N8.-С.907-911.

4. Цукерман Е.С., Померанцева Т.Я., Познанская A.A., Корсова Т.Л., Клементьева. И.В., Смирнова Т.Н., Авакумов В.М., Курганов Б.И. Влияние метилкоб ал амина и аденозилкобаламина на процессы кроветворения и обмен витамина В12 при фенилгидразиновой анемии у кроликов. //Вопр. мед. хим.-1989.-N1.-C.106-1II.

5. Познанская A.A., Корсова Т.Л., Морозова H.A., Цукерман, Е.С., Курганов Б.И. Монооксигеназная система, перекисное окисление липидов в печени и обмен витамина В12 при экспериментальном отравлении кроликов фенилгидразином, //Биохимия. -1989. -Т. 54. -N8. -С. 1290-1293i .

6. PoznafLBkaja A.A., KÖrsova T.L., Morozova N.A.', Tsukerman E.S., Kurganov B.I., Yurkevioh A.M. Effeat of vitamin B1g ooenzycies on oobalaáin metaboliem, SH-groupa and. microsome monooxygenase in experimental hepatitio. //19^ Meeting FEBS.-Rome, 1989.-Abstraot book, Fr. 201.

7. Цукерман E., Корсова Т., Познанская А. Влияние коферментных форм витамина В12 на обмен кобаламинов, содержание SH-групп и активность глутатионтрансферазы у крыс с белково-холиновой недостаточностью. //Экспериментальн. биол. N2.- Мат. YII биоХИм. конф. прибалтийских респ.-Каунас, 1990.-C,180.

•8. Корсова Т., Морозова- Н., Цукерман Е., Юркевич А., Познанская А. Влияние метилкобаламина на детоксицируюцую функцию печени крнс о адъювантным артритом.//Экспериментальн. биол. на.-Мат. vil /.«иохим. конф. Прибалтийских респ.-Каунас, 1990. 0. 84-65.

9. Цуверман Е.С., Холодов Л.Е., Познанская A.A. Фармакокинетика метилкобаламина у крыс.//Хим.- фарм. «урн.-1991.- Т.25.- N11.-0.13-15.

10. Lfc-Керман Е.С., Корсова Т.Л., Познанская A.A. Обмен витамина В12 и зостояние SH-групп при белково-холиновой недостаточности У крыо.//)Юпр.питан.-1992.-N1.-0.40-45.

11. Барткявичене В.В., Аленене А.И., Канопкайте С.И., Астраус-као В,И., ЛеонавиЛне.Л.К., Корсова Т.Л., Морозова H.A., Цукерман B.C.,- Лг/lapen А.Е.. Познанская A.A. КобаламинЫ крови и фермент»

метаболизма ксенобиотиков в печени крыс при адышантном артрите.-//БИОХИМИЯ,-1992.-Т.67.-N11.-0.1693-1699.

Использованные сокращения: КеСЫ - метилкобаламин, АОоОЫ аденозилкобаламин, оноы - оксикобаламин, СК0Ъ1 - цианкобаламин, ФГ - фенилгидразин, ГА - галактозамин, АА-адыовантный артрит, в/м -внутримышечно.

15.04.93 р.

ЗакЛбЛ'ирЛОО.ВШКЗа.