Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические основы фармакологических свойств метилкобаламина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические основы фармакологических свойств метилкобаламина"

' ' . ОРДЕНА ДШБЫ НАРОДОВ РОССШСККЯ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

На правах рукописи

ЩГКЕРЯАН ЕЛЕНД САМАРЬЕВМ

УДК 616.1Б4.164.16]-02: [615.674. 24:64?.96:677.164.1841-092.9

БИОХИМИЧЕСКИЕ 0С1ЮШ ©АРМЖОДОгаЧЕСКМХ СВОЙСТВ ЫЕТИЛК0БАЛАК121А (КЗ.00.04 - биохимия)

Автореферат

из соискание ученой степей! кандидата биологических наук

Москва - 1233

Работа выполнена в Научно-производственном Объединении "Витамины".

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор А.Л. Познанская Научный консультант доктор медицинских наук В.М. Авакумов

'к

(¡Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.И. Воробьева член-корреспондент РАМН, профессор Б.Ф. Коровкин

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится ^ *** 1993 г. в

'IjL часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Российском Университете Дружбы Народов по адресу: II7I98 '^ОД, Москва, yjTT"ктлухо-Маклая, д.8. Медицинский факультет.

О диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского Университета Дружбы Народов по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан fj-u^uiA^ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук,

профессор /} В.Э. Торбек

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность, теш. Среди известных витаминов, коферментов и их производных витамин В12 отличается большим разнообразием своих би-охгодгаеских функций. Несомненно, что такая полифункциональность витамина В12 связана с его уникальной химической структурой: он принадлежит к координациокнш соединениям кобальта, отличающимся своей реакционной способностью. В настоящее время известны две ко-фзрментные Форш витамина В|2 - метилкобаламин (МеСЫ) и аденозил-кобаламин (А<1оОЫ). АйоСЫ является коферментом метилмалонил-КоА-мутазы, МеСЫ - коферментом метионинсинтетазы, вовлеченной в синтез' метионина. Т.о. ЦеСЫ участвует в многочисленных реакциях метилирования в организме млекопитающих. Возможно также, что МеСЫ монет сам выступать'в роли метилирующего агента (Phoh.l-Leazkovi.os А., , 1991). С момента открытия коферментных форм витамина

В|2 вшмание исследователей привлекала возможность их использования в качестве лечебных препаратов. Первой коферментной' формой витамина, нашедшей применение в качестве средства метаболической терапии, был АйоСЫ. Исследования, касающиеся возможного применения Несы в качестве терапевтического средства, в основном, проводились в Японии, и в настоящее время МеСЫ используется в этой стране в качестве лечебного препарата при диабете, различных неврологических симптомах и некоторых других заболеваниях. В нашей стране Иесы был синтезирован в НПО "Витамины" под руководством профессора А.М. Юркевича. В ссязи с этим возникла необходимость изучения этого коферментного препарата в качестве потенциального лекарственного средства. Учитывая, что к этому времени в стране выпускалось уже 3 препарата на основе витамина В12 (цианкобаламин, сисы; оксикобаламин, онсы, и АйоСЫ), особое внимание мы уделили доказательству либо преимуществ Несы в сравнении с АйоСЫ, либо поиску других областей возможного применения НеСЫ в' лечебной практике. Самостоятепьный интерес представляло изучение спектра индивидуальных форм кобаламинов при ряде патологических процессов и возмокно-сти коррекции возникающих нарушений с помощью МеСЫ и АйоСЫ. Эти данные позволили бы обосновать выбор той или иной коферментной формы витамина В12 как лекарственного средства. Принимая во внимание вовлмлше витамина В^2 в поддержание статуса восстановленных БН-групп, представлялось актуальным изучение возможных нарушений со сторонь 'лзкоторых компонентов глутатионовой системы при ряде патологических состояний и влияния-на них МеСЫ.

- г -

цел;; и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось експериментальное обоснование использования 11аСЪ1 как лекарствен-иого средства с помощью биохимических методов исследования. Для достижения втой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить характер изменений со сторо:ш кроветворения и обмена кобаламинов при анем1п.т, вызванной введением фенилгидразина (ФГ), ц • возмокность коррекции обнаруженных нарушений с помощью НеСЫ.

2. Выявить изменения в обмене кобалалншов я состоянии некоторых компонентов глутатионоаоЕ системы (уровень общих и небелковых БН-групп, активности глутатнонтрансферазы и глутатионредуктазы) в условиях белково-холиновой недостаточности у 1ср;.;о и изучить возмокность коррекцт: нарушений, возникающих при втой патологии с помощью НеСЫ. •

'3. Изучить возможное гепатопротекторное действие Месы н:: модели токсического гепатита, вызванного галактозамином (ГА). 4. Изучить потенциальную противовоспалительную Шчтьн иосгь КсСЫ, влияние его на спектр индивидуалышх фор;< кобаламинов и крови и внутрешшх органах, а также состояние детоксицирущеК фун,<щ:ч печени при адъювантном артрите (ЛА) у крис.

6. Провести изучение фар-лакокшетики .НеСЫ в сравнении с дгрупр"! формами витамина В12.

. Выбор моделей патологических состояний определялся участкам Пасы в обмене веществ. Большинство исследований' проводилось в сравнении с Лйосы для выяснения возмохзшх отличий в действии огих двух коферкентных форм витамина В12-

Научная новизна. Впервые изучен спектр индивидуальных фор.! коба-ламинов в крови и органах вкспериментальшх ежвотных при гспагить:; различной этиологии, ФГ-анемии и АА, что позволило выявить каруиония в обмене кобаламинов при этих видах патологии. Установлено, что в большинстве случаев в крови швотных развивался дефицит ИвСЫ. Показано, что только ЫоОЫ (но не АЛоОЫ) нормализует спектр индивидуальных форм кобаламинов при отравлении кроликов СГ, ГЛ-гепатите и белково-холиновой недостаточности у крыс. Впервые изучено состояние некоторых компонентов глутатионовой системы печени при ГА-гепатите и АА. Показано, что ЫеСЫ способствует поддержанию статуса вк-групп при бежово-холинонэй недостаточности к ГА-гепатите. Установлено, что ЫеОЫ предотвращает снихение активности глутатионтрансферазы при белхово-холимлюй недостаточности и активности глутатионредуктазы при ГА-гепатите и АА. Проведено сравнительное изучение, фармакокинетики ЫеОЫ, Айосы, ОНСЫ и Ш)Ы,

позволившее выявить определенные закономерности фардакокинетичес-. кого поведения этих кобаламинов и рассчитать их основные фармзко-хннетические параметры.

Научно-практическая значимость♦ Проведенные исследования показали, что изучение спектра индивидуальных форм кобаламинов в irpoBir и органах окспераменталышх ютотишс позволяет выявить нару-пенил в сб"сн2 витадпи тогда как определение только общего содержания кобаламинов малоинформатигно. При клиническом использо-' вгшш препаратов на основе витамина QÍZ необходимо учитывать спа-ici-íiaty нарушений в обмена кобаламинов при разных видах патологии и , применять ту Форму витамина, в которой больней организм нуждается презде всего.

На основании обнаруженной у Носы противовоспалительной активности при АА, a таюка способности препарата поддерживать на нормальном уровне обмен кобаламинов и систему биотрансфэрмации ксенобиотиков (детоксицирущуя функцию печени) получено разрешение Фарь комитета ( протокол N 10 от 30 мая 1990 г ) ка клинические испытания препарата в комплексной терапии ревматоидных артритов у человека. Аналогичное paspeneinse (протокол N 10 от 10 июля 1991 г) получено на клшшческие испытания МоСЫ как гепатопротектора. Соот-вегствуодие материалы представлгии в Рярмкоттет для получешш разревеши па клнпгческие испыташш ííoCbl в гематологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. Изучеше спектра индивидуальных форм кобаламинов при раз-jamtux видах оксперимснталыгой патологии: ОГ-анемтт, АА, гепатитах различной зтиолопш позволяет выявить определенные пзрупення в оСшкз кобаламинов в организма агоотных.

2. Развитие ФГ-снегппг, белюпо-хошюваЯ недостаточности, ГА-гепатита ц АА сопровождается наруоепием (йдекциоипрованпя глутатио-новоИ системы печшш .т.гоотшх, которое г,газет быть предотвращено введением ffeCbl.

3. L'cCbi'оказывает нормализующее -эЯстше на процессы кроветворения при ФГ-анегяш.

í. L'cCbl обладает гепатопротокторкаш свойствами при остром ГА-гепатите.

5. Обе коферлентнне Форш витгшна Bj2- üe.cbi н ЛйоСЫ облада-КГГ противовоспалительной активностью ттр'-т М у крыс, прием ?1сСЫ з отом отношении более эффективен. ííeCbl способствует подцерзашю детохсицирукцей функции печени, наруиащайся mtf jtcm патологическое щюцессс.

Кьта<гя ю .гмзчологическн ектгш'л-'л iv')pa - : >

имеет индивидуальные особенности фармакокинетического поведения. Определены основные • фармакокинетические параметры МоСЫ. Апробация. Результаты работы были 'доложены на конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы экспериментальной и теоретической медицины" (Одесса,1986), 2-й Всесоюзной конференции по фармакокинетике (Каунас, 1987), 19-й конференции ФЕБО (Рим, 1989) УН Биохимической конференции Прибалтийских республик (Каунас,• 1990), Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 19Э1), Симпозиуме "Витамины и здоровье" (Москва, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано II печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит иг. введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных -исследований, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц и 4 рисушса. Библиографический указатель состоит из 126 источников литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 876 белых беспородных крысах-самцах массой тела 160-200 г и 50 беспородных кроликах-самцах массой тела 1,5-2 кг. В работе использовали модели следупцих патологических состояний: ФГ-анемии у гсролшгов, гепатитов, вызванных введением ГА и скармливанием рациона, дефицитного по белку и холину крысам, а ' также ДА у крыс. ■ Препараты ЫеСЫ и АйоСЫ применяли в лечебно-профилактических целях в течение 7-21 дня в дозах 50-500' шсг/кг, внутримышечно (в/м) или внутрибртинно. Для исследований использовали кровь, печет, почки, селезенку. Определяли уровень общих кобаламинов микробиологическим методом с тест-культурой Е.Со11 113/3 (Милевская Ю.Л.,1960,- Куцева Л.С., 1961), соотношение индивидуальных форм кобаламинав с помощью хроматографии (Канопкай-те С.И., 1978) с последующей биоавтографией (ЫлпеП <7. et а1., 1969). Концентрации общи и небелковых БН-групп определяли по методу (Бесйак а. еЪ а1., 1968). Активность глутатионтрансферазн по (НаЫв VI. et а1., 1931) и глутатионредуктазы по (Лашшг В.З. и др., 1976) определяли в гомогенатах и цитозольной фракции печени (Карузина Н.И. и др., 1977), используя спектрофотометры 5ресо1-21Л и Саггу-219. Для статистической обработки результатов с использованием 1;-критерия Стьюдента применяли ПЭВМ Правец-16. МеСЫ и-другие 'Хорш коозлаыпнов были получены в лаборатории тиоорпанических СОСГ.и. 1иП ••игха'.зйй!" -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ. I. Влияние метилкобаламина на процесс кроветворения и обмен витамина В^ при фенилгидразиновой анемии у кроликов.

ФГ широко используется для создания моделей гемолитических анемий, при которых картина крови напоминает таковую, развивающуюся при недостатке витамина В12» Введение ФГ в течение 3-х дней, ежедневно, в дозе 15 мг на кг массы тела, подкожно, приводило к развитию гемолитической гиперхромной анемии на 7-й день опыта, о чем свидетельствовало повышение цветного показателя, снижение числа эритроцитов и гемоглобина и резкое увеличение количества рети-кулоцитов (табл. 1).

Таблица 1

Влияние ЫеСЫ и АЛоСЫ на показатели периферической крови кроликов при ФГ-анемии

Показатели периферической крови

Группа Эритроциты, млн нъ, г* Цветной Ретикулоциты-показатель на 1000 эритроцитов

интактные 6,62+0,2 12,9+1,1 0,95+0,05 3,25+0,2

ФГ 7 да 2,2210,1* 3,4+0,1* 1,20+0,08* 21,3+1,3*

ФГ 14 да 4,6+0,5* 6,3+0,3* 1,10+0,02* 12,4+1,4*

ФГ+ ЫеСЫ 6,1+0,3 8,9+0,8* 0,9+0,03 9,4+3,3*

ФГ+АйоСЫ 5,3+0,3* 7,3+0,5* 1,0+0,02 11,9+1,0*

Примечание: здесь и далее • - различие относительно контрольных крыс достоверно ( Р < 0,02 )

Помимо этого под влиянием ФГ возникал лейкоцитоз и увеличивалось почти в 2 раза количество тромбоцитов. Заметные изменения наблюдались такае и со стороны костномозгового кроветворения (повышался индекс созревания нейтрофилов и эритробластов).

Введение ЫеСЫ в течение 7 дней с 7-го по 14-й дни опита в дозе Б00 !£кг/кг, в/м, приводило к полной нормализации ряда показателей крова и кроветворения. Фармакологическое действие лаосы было вырагено значительно слабее. Таким образом, МеСЫ оказался более эффективен а отношении нормализации гемопоэза при ФГ-анемии у кроликов. Данная часть работы была выполнена совместно о сотрудниками лаборатории фармакологии НПО "Витамины".

Нами было впервые изучено соотношение индивидуальных форм ко-баламинов в крови интактннх кроликов: в?еСЫ: (0НСЬИСИ0Ь1):Ас1оСЫ, составившее 15:43:42 (табл. 2).

- ь -

Таблица 2

Влияние ¿ьС^ч и МоСЫ на общее содержание и соотношение индивидуальных форм кобаламинов в крови кроликов при ФГ-анемии

Группа число Содержание Отношение MeCbl:

ЖИВОТНЫХ кобаламинов (OHCbl+CNCbl):AdoCbl

М ♦ ш (нг/мл)

Интактные 22 29,9 ♦ 2,2 15 : 43 : 42

ФГ 7 да 9 42,4 i 5,2 15 : 40 : 42

ФГ 14 дн 8 19,6 + 2,4 6 : 49 : 45 .

ФГ + ЫеСЫ 6 104,7 t 12,9 27 : 30 : 43

ФГ + AdoCbl 8 77,0 t 8,9 • 8 : : 50

На 7-й день опыта, когда у кроликов развивалась гиперхромная анемия, общее содержание кобаламинов у большинства животных повышалось, что свидетельствовало о нарушении депонирования кобаламинов в печен;:• На 14-Я день опыта, когда наблюдалось спонтанное восстановление кроветворения, общее содержание кобаламинов снижалось по сравнению с исходным уровнем, при этом развивался дефицит НеСЫ, что согласуется с представлениями о непосредственном вовлечении UeCbl в процессы кроветворения (Sohneider Z. et al., 1987).

Введете UeCbl или AdoCbl вызывало повышение общего содержания кобаламинов в крови. Применение ИеСЫ приводило также к значительному повышении содержания UeCbl в крови, тогда как при введении AdoCbl дефицит МеСЫ в крови сохранялся. Таким образом, дефицит lieCbi в крови, развивающийся на стадии спонтанной нормализации кроветворения, шлпенсируется только введе)шем именно этой кофер-ментной формы витамина В12- В этом отношении иесы не может быть заменен AdoCbl.

2. Влияние метилкобаламина на соотношение индивидуальных Форд кобаламинов и статус SH-групп при белково-холиновой недостаточности у крыс.

Алиментарная белково-холиновая недостаточность широко используется для создания моделей жировой инфильтрации, фиброза, цир]юза и злокачественного перерождения печени (Ghoshal.A. >Д al. , 190а). ' Изучение содержания и соотношения индивидуальных форм. кобал&чаиоЕ в крови и печени крыс, получавших.. рацион, • дефицитный по - белку я холшгу, в течение 3-х недель, выявило'значите льные -изменещщ в об-• мене кобаламинов. Общее содержание витамина В12 в Кроьц крыс , с белково-холиновой недостаточностью, было существенно выше, "чем j интактных животных (табл. 3)i В печени при этом не было, отмечёнс изменений содержания витамина В12. ,

Таблица 3

Влияние НеСЫ и Айосы на общее содержать и соотношение индивидуальных форм кобаламинов в сыворотке крови и печени крыс при белково-холиновой недостаточности

Группа Содержание кобаламинов Соотношение МеСЫ: животных (Ы+т) (ОНСЫ+СЛСЫ ):АйоСЫ

Кровь (пг/мл) Печень (пг/мг) Кровь (Ж)

-холин 3897 + 216* 85,3 ± 6,6 16:42:42

+холин 1813 + 269* 84,1 + 5,9 25:37:38

-холин+ИвСЫ 5415 + 135* 1507 ± 5,0* 32:35:33

-холин+АйоСЫ >5040 + 15* 1477 + 144* 3:46:51

контроль 633 ± 55 110 + 21,3 34:28:38

По-видимому, повышение уровня кобаламинов в крови при данной патологии происходит в связи с нарушением депонирования кобаламинов в почках, т.к. почки являются основным депо этих соединений у крыс (Ыппо11 J вt а1., 1983). Белково-холиновая недостаточность приво-. дала к развитии дефицита Несы в крови крыс за счет повышения потребности в нем тканей в условиях недостатка холина. Лечебно-профмактическое применение ЦеСЫ или АйоСЫ, с 1-го дня опыта в течение 3-х недель в дозе 50 ют/кг массы тела, в/м, приводило к накоплении кобаламинов как в крови, так и в печени. Введете ИеОЫ оказывало норгализувдее влияние на спектр индивидуальных фор! ко-балзгяшов в крови, тогда как айосы в этом отноиении был мало-сЯфективен. Таким образом, дефицит Несы в крови, развивалщШся при белково-холиновой недостаточности, удается компенсировать только введением этой коферментной форм кобаламинов.

Изучение содержшшя обоих и небелковых БН-групп н активнобтн глутатионтрансферазы в печени крыс при белково-холиновой недостаточности показало, что уровень как общих, так и небелковых' ЗП-груют (основной вклад в которые вносит глутатнон), заметно снижается (табл. 4), падает такие и активность глутатионтрансферазы -фермента, пригешалцего участие во п-й стадии детоксикацин ксено-

б1"0ТВведёш!е ИеСЫ п АйоСЫ способствовало _ сохранению концентрации общих и небелковых зн-групп, однако ЦеСЫ был значительно более оффэктнвэн в откоесшш поддержания концентрации небелковых БН-групп в пределах корш. Применение Изсы предотвращало также снижение активтгостп глутатоонтраксферазн, АйоСЫ в этом отнозении был малоэЗфектнвзн.

Таблица 4

Содержание БН-групп и активность глутатионтраноферазы в печени крыс при белково-холиновой недостаточности

Группа Общие БН-группы Небелковые Активность глута-БН-группы тионтрансферазы

мкмоль на I г ткани мкмоль на I г ткани мкмоль за I мин на 1 мг белка

-долин 16,90 ♦ 0,49* 0,92 ± 0,03* 0,63 ♦ 0,05*

+Х0ЛИН 21,60 ♦ 1,52 1,55 ± 0,10* 0,91 ± 0,08

-ХОЛИН+МеОЫ 22,63 + 0,98 4,90 ± 0,26 1,05 + 0,11

-ХОЛИН+А(1оСЫ 23,40 + 0,95 3,29 ± 0,25* 0,66 ± 0,06*

гИнтактные 21,35 + 0,90 5,40 + 0,20 0,89 ± 0,19

Таким образом, применение Месы в условиях белково-холиновой недостаточности способствовало поддержанию статуса БН-групп и активности глутатионтрансферазы в пределах нормы.

■ з. Гепатопротекторное действие метилкобаламина Ари ' галактозаминовом гепатите у крыс.

ГА-гепатит, по морфологическим и некоторым биохимическим показателям напоминающий вирусный гепатит человека (Керр1ег о. вt а1.,19в8). вызывали однократным внутрибршинным введением ГА в дозе 1000 мг/кг. Токсическое действие ГА связано с нарушением синте-ьо дуоеиновых кислот и белка. Развитие ГА-гепатита сопрововдалось нарушением пхстоструктуры и ультраструктуры печени: наблхщалось цножество очагов лимфоцитарной инфильтрации, зернистая и баллонная дистрофия гепатоцитов. При кариометрии отмечал!! увеличение площади и диаметра ядер, уменьшение площади ядршлек, что свидетельствовало о нарушении синтеза белка. ГА-гепатит вызывал также фермектемию (повышение активности алашш- и аспартатаминотрансфераз) и бнлиру-бинемию. Профилактическое применение Месы в дозе 100 мкг/кг, в/м, в течение 14 дней до введения ГА предотвращало развитие гепатита.

ГА-гепатит вызывал также заметное нарушение обмена кобаламинов. Через 24 часа после введения ГА в печени и почках заметно повышалось общее содержание кобаламинов, через 72 часа этот показатель практически нормализовался. Изменения наблвдались такие в спектре индивидуальных форм кобаламинов в крови. Так, содержание КеСЫ через 72 часа после введения ГА составляло лишь 13% (при норме 35»), уровень л<1оСЪ1 не изменялся. Профилактическое применение МеСЫ приводило к повышению общего содержания кобаламинов в крсьи, печени и почках крыс, причем в почках* накапливалось значи-

тглыю ©ольиаа количество кобаламинов, чем в печени. Ввэданиэ Косы способствовало сохранению относительного содержания стой ко-ферментной формы в крови, уровень /босы и в этом случав оставался неизменным, что согласуется с представлениями о том, что статус кобаламинов направлен на сохранение постоянного содержания АаоСЫ за счет расходования Иесм (впаи п., 1990).

Изучение ■ некоторая компонентов глутатионовой системы печени при отравлении ГА, показало, что через 24 часа посла его введения заметно сннгается азггивность глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы - фермента, участвующего в поддержат™ пула восстановленных вн-групп. Впадение ИэСЫ предотвращало снижеш^е активности глутатионредуктазы и повышало уровень небелковых БИ-групл в 1,7 раза по сравнении с крысами, не получавшими препарат. Т.к. глута-тион и глутатионредуктаза - одно из звеньев антиперекисной защита в .клетке (Кулинский В.И. и др., 19Э0), можно считать, что НеСМ косвенно проявляет антиоксидантные свойства. Таким образом, МоСМ оказывает положительное влияние на глутатионовую систему печени крыс, отравленных ГА.

4. Влияние метилкобалзмина на воспалительный процесс, обмен кобаламинов ;г детоксицируицую систему печени при адъювантном артрите у крыс. Лдъювантный артрит (ЛА) рассматривается :*лк адекватная модель ревматоидного артрита человека. ЛА - системное заболевание, приводящее к серьезным нарушениям в структуре и функциях многих внутренних органов крыс, а такие в обмене белкеа, липидов и др. (Неуо .Т. о! а1., 195В). АЛ у крыс вызывали путем подкожного введения здъюванта ФреПвда во внутренний поверхность стопы за/лей лапы. разЕитии заболевания свидетельствовало опухаете лап, объем которых увеличивался, в среднем, в 2,6 раза по сравнс;^ с•интактными ки-вотными. Также заметно повышалась скорость оседания эритроцитов (СОЭ; более, чем в 5 раз) и число лейкоцитов.

Лечебио-профилактнческое применение Иесм к АДоСЫ в течешта 7 дней до введения гдькзанта и 15 дней после его Еведа?стя в-дозе 100 ¡.зст/га1 тормозило развитие опухания. При этом Носы достоверно снижал степень опухания, тогда ::зк прм -гадзгпл лаязы исбтдалась тенденция к его с:ппению. Введение того п другого пропарата сникало количэстео лоЛкоиитов ССО, -'г.з.пгп;- ДЛ тхэтрововдадось тезее наругзением в обмене кобаламинов. Из р:;с.1 б.сто, что АА при-> водит к юстоверному повышении общего со,;еиашгя кабаламшгов в 1толи и 2-х ко-герментних форм - МеСЫ ; Чй1. Пта этом в клетках кропи. таоборот, снижаемся кас общее солевгл:п:е "С'Зэл!жнов,-так ч

содержание Месы и онсы. Таким образом, несмотря на то, что при АА в крови содержится больше кобаламинов, чем в норме, в лейкоцитах наблодается дефицит кобаламинов, что, по-видимому, связано о нарушением транспорта этих соединений в клетки. Введение■животным с АА ИеСЫ или АйоСЫ приводило к повышению содервания кобаламинов как в плазме крови, так и в лейкоцитах. При атом в лейкоцитах сохранялся уровень Месы и онсы г характерный для интактных^животных.

3000

'2000

I" " £ 1000 к

8 . ;

ё . . -^.саоо.

»О

•Ч ... : 200

• I

3

¡1

100

Рио.

2 " 3 . .4 •

I- Влаяниэ МеСй2 и Ас/оСб£ на содеряанве кобаламинов в плазме-(А) и клетках крози (Б). : г .' ^

|~~т- | интактные

ЛА ■;

АА + МеСве АЛ + AdoC6e

I'- общее содержание. кобаламинов

I-■■■■'• -! -1

2 - месее

3 - онсее

4 - АбоСЫ

содер^-няя г"?5ала*гоип ч ^-отноаенмя 1« индивидуаль-;п(х фор] наблюдалось ?акг.е в печешь почках и селезенке кряс, болънчх АА. Эта часть исследований была проведена совместно с сотру дкикаш Института биохимии АН Литовской Республики под руководством профессора С.И. Канопкайте.

Применение ЫаОЫ и АЛоСЫ предотвращало возникновение изменений, характерных для АА у крыс. Преимущества ЫеСЫ, выявленные п отношении предотвращения опухания суставов, более значительном кз-коплешга кобаламшюв в почках, а таюхе поддержании статуса кобала-минов в селезенке, говорят о предпочтительном использовании втоа коферментной формы витамина В12 в качестве лечебно-профилактического средства при АА. Эти эффекты, по-видимому, осуществляются за счет влияния Месы на иммунну» систему организма (Бакале Т. et а1.; 1982).

На модели АА было изучено также состояние детокснцирущей системы печени и влияние на нее Месы, т.к. в нашей лаборатории было показано, что ЫеСЫ является индуктором атоП системы (Корсова Т.Л. И др., 1989).

При АА в печени крыс снижалось как содержание, так и н-деметилазная актизность цитохрома Р-450, наблюдалось повышение содержания небелкошх БН-групп и снижение активности глутатионрз-дуктазы (табл. 5); Такте отмечали достоверное ошкение п-гидрокси-лазной активности цитохрома Р-450 и активности глутатион-трансферазы у больных животных.

Таблица Б

. Влияние ЫеСЫ на состояние детокснцирущей системы . и статус БК-групп в печени крыс при АА (м+т).

Показатель Группы ]фЫС

Интактные АА (17 да) АА+ИеСЫ

Цитохром Р-450, нмоль за I мин на 1 мг бежа 0,42^0,(33 0,19+0,03* 0,21+0,02*

Активность диметиланилин н-деметллазы, нмоль НСНО . за 1 тш на I мг белка 1,9510,11 0,73+0,07* 1,27+0,07*

Общие зн-группы, ккмоль на 1 г т:?аш: 25,1 + 1.В . 24,5+0,67 23,2+1,08

Небелковые БН-группы, шмоль на 1 г ткани 2,72+0,21 4,64+0,29" 4,45+0,22*

Активность глутатиок-редуктазы. нмоль за : 1 мин на 1 мг белка 56,1+2,7 33,9+4,5* 47,3+3,1

Таким образом, АА сопровокдолсл наруие1ше!.: датоксицирупцеЯ функции печени. Введение Мвоы на о:г?цоало закатного влияния -на

содержание иитсгрома Р-450, однако способствовало сохранению его деметилазной активности, т.е. оказывало положительное влияние на детоксицирупцую функцию печени. Препарат также поддерживал активность глутатионредуктазц на более высоком уровне, чем у нелеченых животных.

6. Фармакокинетика метилкобалзмина.

Фарыакокикегическое поведение Месы изучали при разных способах введения и разных дозах, а также проводили сравнение фармако-канетики Месы с другими формами витамина В^ - жйоОЫ, ОНСЫ и сисы. Значет« некоторых параметров Месы совпадало с аналогичными АЛэОЫ или онсы. Так параметры ИеСЫ, характеризующие процессы всасывания и элиминации, в основном, были близки таковы:«: онсы, а параметры распределения - Лйосм. Хотя каждый из изученные препаратов имел индивидуальные особенности фармакокинетического поведе- , ния, параметры двух коферментиых форм и онсьх имели более близкие значения между собой, чем с сисы.

Р?с. 2. Динамика средимх концентраций кобаламинов в крови крыс после периральюго введения НеСЫ в дозе 500 ыкг/кг (А) и внутримышечного кч.-декал в доза 10 мкг/кг (Б).

Дяя изучения фармакокинетики Пасм при пероралыюм введении использовал! доз» 5СО и" ICCO мкгЛг, длл внутримышечного введения

- 10 мнг/кг. Динамика концентрации препарата при пероралыюм вве-даш удовлетворительно описывалась одпочзстевоП фармакокинетачес-коЗ моделью с учетом всасывания, в случае внутрклашечного васдоюгл

- дзухчастешП кодельп. Экспериментально найдензше средние значения концентрации препарата удовлетворительно согласуются с яеличу-iiaoi, paccmainciitn по ссотвзтствргсм уравнениям (рис.2).

Сси.ОЕМне фзр.чгкоккнатические • параметр!! tísCbl, рассчитанные с использованием систе:.а программ áspid, приводятся в табл. 6. Условные обозначения: TRax - врег.ш достижения максимальной концентрации, сглх - максимальная концентрация, tj/2 - время голуэлгадшащш, Аис - плоцадь под кривой, Зсо1(р).- константа скорости элиминации, oit - оСщиЗ клиренс, í - бшдостутгость.

Из получешшх результатов следует, что доза, тпкеняе.мая пр-т в/п введении монет бить примерно на 2 порядка чей при перо-ралыта! впедсшш препарата.

Таблица 6.

- Заршо^шг-гачесипе параметр:; МоСЫ

Парс.гахр Парорз.чъное ввэде;та Внутримышечное введение

Т ч Ч/г, 4 AUG, JW/Ч-ШГ kol ÍP)' 4_I ait, мя/мгамсг I, I GOO >,ПСГ/КГ БСО 7ЭТ/ГСГ 10 кет/itr

2,0 ± 0,5 I.CG ± 0,Gi 5,0 ¿ 2,0 10,7 t 5,4 0,14 i O.CS II,G ± 3,0 1,0 0,9 + 0,2 i,eo ± o,38 4,0 ± 2,2 9,4 ± 3,1 0,17 ± 0,03 11,1 ± 2,4 1.7 3,0 ± 2,4 j II,I ± 4,1 O.IG ± 0,09 11,I + 3,4 100

Результаты iia:::;iz исследований показала, что (Птодостушгость наем крайне низка, поэтс:.^ nicoimo дссн препг-рп.та цг.пс сообразно назначать в случае нарушения всасывптш г-гг^'п-т'ллют л сргятпже.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучен спектр индивидуальных форм кобаламинов в крови интактных кроликов и выявлены его изменения при фенилгидра-зшговой анемии. Указанные нарушения купировались введением метил-кобаламина. Обнаружен лечебный эффект -метилкобаламина при этой форме патологии у кроликов, выражавшийся-Ъ нормализации морфологии .) крови и процессов кроветворения.

2. Установлено, что алиментарная белково-холиновая недостаточность у крыс сопровокдается нарушением обмена кобаламинов, в част- ' ности, дефицитом метилхобала\айш в крови, а также нарушением статуса SH-групп и снижением активности глутатионтрансферазы в пече- ' ни.. Метилкобалзмин препятствовал возникновению отмеченных наруше-1шй, оказывая лечебно-профилактическое действие.

3. Впервые показано гепатопротекторное действие метилкобаламн-на при развитии острого Д-галактозамшгового гепатита у крыс. Про-'филактическое введение метилкобаламина препятствовало нарушению обмена кобаламинов и изменениям некоторых компонентов глутатионо-еой системы печени при данном отравлении.'

. 4. При адыовантном артрите у крыс выявлено противовоспалитель-пое действие метилкобаламина и аданозилкобаламина, причем метил-кобаламин в. атом случае оказался более эффективным. Впервые бил изучен спектр индивидуальных форм кобала:лпюв в крови и органах крыс при адыовантном артрите. Установлено, что развитие этого заболевания сопровождается существенным изменением в спектре индивидуальных форм кобаламинов в сыворотке крова п лейкоцитах, а такко' во внутренних органах крыс. 1»'етклкобаяа\знг способствовал погаоюгого уровня коферменишх форм кобаламинов в лейкоцитах и плазме 1фови, что коррелировало с эффектом торможения воспалительного процесса в суставах конечностей. UeCbl оказывал пололлтелыгае влияние на функцио1шрование детоксицируюцей "системы печени, нарушенное при данной патологии.

5. Проведено систематическое сравнительное изучение фармакоки-нетического поведения четырех физиологически активных форм витамина Bjg: метил-, аденозил-, окси- и цианкобаламинов. Выявлены закономерности фармакокинетического поведения метилкобаламина при двух способах введения (пероральное и внутримышечное) разных доз препарата, что позволило определить его основные фармакокинетические параметры.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Нукзпман Е.С.. Корсова Т.Л., Познанская A.A. Кобаламинн в ••• 5гок*нзтс;.сг:-: .'/ Нош.:. %.ед. хим.-1985.-Т.31.-Вып.5.-С.7-17.

2. Цукерман Е.С., Познанская A.A., Холодов Л.Е., Курганов Б.И., Дорохов В.В., Клементьева И.В., Смирнова Т.Н., Авакумов В.И. Оэрмакокшетика препаратов группы витамина В12. Тез. докл. 2-й Всесоюзн. конф. по фармакокинетике.-Kayнас, 1987.-С.175-176.

3. Цукерман E.G., Познанская A.A.; Холодов Л.Е., Дорохов В.В., Клементьева И.В., Смирнова Т.Н., Авакумов В.М., Курганов Б.И. Фар-макокинетика окси-, аденозил-,' и цианкобаламинов при пероральном введении крысам.//Хим.-фзрм. кури.-I983.-К8.-С.S07-9II.

4. Цукерман Е.'С., Померанцева Т.Я., Познанская A.A., Корсопа Т.Л., Дементьева. И.В., Смирнова Т.Н., Авакумов В.М., Курганов Б.И. Влияние метилкобаламнна и аденозилкобаламина на процессы icpo-ветворения и обмен витамина В12 при Фенилгидразиновой анемии у кроликов. //Вопр. кед. хим. -1989 .-UI.-C.I06-111.

5. Познанская &.А., Корсова Т.Л., Морозова H.A., Цукерман, Е.С., Курганов Б.И. Могюоксигеназная система, перекисное окисление лптадов в печени и обгдзк витамина' Bj2 при экспериментальном отрав-легага кроликов фенилгидразином. //Биохимия.-1989. -Т. 54.-N8. -СЛ290-I2S3.

6. Posnanakaja A.A., Körsova T.L., Uorozova N.A.*, Tsukerman E.3., Kurganov B.I., Yurkevloh A.M. Efíeot о £ vitamin B.g ooenzymss on oobalamiri " metabolism, SH-groupa and. miorosomo oonooxygenaao in experimental hepatitis. //19^ Heating FEBS.-Romo, 1989.-Abstraot book, Pi-. ?01.

7. Цукерман E., Корсова Т., Познанская А. Влияние коферментных форм витамина В^2 на 'обмен кобаламинов, содержание SH-групп и активность глутатионтрансферазы у крыс с белково-холиновой недостаточностью. //Экспериментальн. биол. N2.- Мат. VII биохмм. кон®, прибалтийских респ.-Каунас, 1990.-С.180.

•8. Корсова>Т., Морозова-Н., Цукерман Е., Юркевич А., Познанская A. Влияние метилкобалаыина на детоксицирущую функцию печени крис с адыовантным артритом.//Экспериментальн. биол. N2.-Нат. VII .'¿иохим. конф. Прибалтийских респ.-Каунас, 1990. С. 84-85.

9. Цувэрлан Е.С., Холодов Л.Е., Познанская A.A. Фармакокинетика иетилх'баламина у крыс.//Хим.- фар*. курн.-1991.- Т.25.- И11,-0.13-15.

10. Ц$-керман Е.С., Корсова Т.Л., Познанская A.A. Обмен витамина Bj2 и зостояниё БН-групп при белково-холиновой недостаточности у крыс.//)!онр.питан.-1992.-HI.-0.40-45. •

11. Бзрткявичене В.В., Аленене А.И., Канопкайте С.И., Астраус-кас В.И., Леонави^'не.Л.К., Корсова Т.Л., Морозова H.A., Цукерлан Е.С., Любарен А.Е. Познанская A.A. КобаламинЫ крови и ферменты

метаболизма ксенобиотиков в печени крис при адьюваоткоы артрите.-//Биохимия. -1992. -Т. 57. -N11. -С. 1693-1699..

Использованные сокращения: 1!еСЫ - метилкобаламин, Айооы аденозилкобаламин, оноы - оксикобаланин, СШЫ - цианкобалашн, ФГ - фенилгидразин, ГА - галактозамин, АА-адъювантный артрит, в/и - внутримышечно.•

15-04.93 г. . Ьбгец Ьг; д* За к„У6.Тир.100 ЛШИШа.