Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ"



ГДШГРОБИОЦРОМ ПРИ ГОСКОШССИИ СМ СССР

по продовольствие и. вакупкаи

ф»оиа«оао*1к ^ _

На праяах р^юшяя .

ГРИНШКО С»мш Гнпцпв!

УДК 619:616:3^-00?.37 '

БИОХИМИЧВСШ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ■УСТОЙЧИВОСТИ Р1СТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ .. РШЧШ

{06.01.II -'авшм раотбвкв о» >р«д*«1в1 1 боавево!)'

А>»ореф»ра»

д1Св»р(вп>1 «а ооавмнав учвао* птччи кввдвдам бюжогкчвзмт ил л

Голкцяно, 1990

Работе выполнена во ВШИ фитопатологии Главагробиопрома при Госномассии СМ СССР по продовольствию ж закушшм.

Научный руководитель; профессор, доктор биологических наук Д.И. Чканинов.

Официальные оппоненты:доктор биологических наук В.В. Мавкн, кандидат биологических наук Л.А. Смирнова,

Ведущее учреждаю : Московский государственный университет им. Н.В. Ломоносова (кафедра микологии и альгологии).

Защита диссертации состоится Й'^/.Ч'^Ш 1990г. в

часов на заседании специализированного совета К. 120.66.01. во ВНИИ фитопатологии по адресу: 143050, Московская область, Одинцовский район, п /о Большие Вяэёьш. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке институте.

Автореферат разослан "/Й" 1990г.

Ученый секретарь специаливироваиного совета - /Й.Н. Яковлеве

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК* РАБОТУ

Актуальность темы. Увеличение производства зерна остается одной ил самых актуальных задач нашей экономики. Для рело-ния этой задачи постоянно наращивается производство минеральных удобренгй и различных сельскохозяйственных машин, что позволило заметно поднять культуру земледелия, однако необходимое повышение урожайности зерновых культур все же не достигнуто (Воронновв,1979; Политико,1939; Фадеев,1988). Это объясняется, конечно, множеством причин, среди которых но последнее место принадлежит тому обстоятельству, что заболевания продолжают наносить урожаю ощутимый урон.

Специалисты вполне обоснованно считает, что возделывание сортов, устойчивых к наиболее опасным и распространенны« ваболеваниям, позволяет резко уменывить остроту проОлеьщ ( Но-Мгшоп, ОШаглрр», 1977; Вгойпу ей., 1988) тем более,что применение современных химических средств защиты растений б нашей стране пока еще не получило должного распространения. ' Как известно, бурая ржавчина -одно из наиболее часто случавшихся и приносящих ощутимые потери урожая заболевание пшеницы ( МшяоПо,. 1978; Новохатка и др.,1979; Воронкоъа, 1980). Однако процесс создания устойчивых к данному возбудителю сортов по ряду причин не может быть когда-нибудь остановлен; наоборот, масштабы этой работа непрерывно возрастам, а трудоемкость ее заметно не уменьшается.

иежду тем эффективность селекция устойчивых сортов пиени-цы могла бы стать более высокой, если бы удалось усовершенствовать и упростить методику отбора перспективных образцов. Пр» этом нужно было бы основываться на знании сущности процессов взаимодействия хозяина и паразита. Попытка разработки именно та них лабораторных методов была предпринята при выполнении настоя ней диссертационной работы.

Цель и задачи исследования. Основная цель наяих исслеюм ний заключалась в изыскании биохимических критериев опенки степени устойчивости сортов и сортообрэзцоя пшениц« к ОуроЗ рвазч* не. Б результате этой работы было необходимо обосновать теэко*-Яость использования биохимических методов для золипеотданного определены отепеня сошеотямости пчтогчяя и ¡соэяиао, Ляони;*»*:

яось выполнение слеяущях этапов:_________ ...

? ~ ц

| Н,ЛУ' Г''Л ^ ">Т::Л\ |

А'ШЙ

1. Выяснение роли фитогормонов во взаимоотношениях возбудителя Су роя ржавчины и растений пшеницы в целях определения возможности использования данных о состоянии гормонального статуса инфицированных растений для оценки степени совместимости партнеров;

2. Научение возможности использования результатов определения содержания хитине в инфицированных бурой ржавчиной ли' стьях для оценки степег • устойчивости к заболеванию сортов

пвеницы;

3. Экспериментальное определение круга задач, ревение которых возможно при помощи имыуноферментного метода анализа грибного белка в инфицированных листьях пвеницы. В частности, подлежало изучить возможность применения этого метода для: : а) определения темпов нарастания грибной биомассы в инфицированных листьях; б) выявления признаков медленною ржавенир и частичной устойчивости сортов пиевицы, различающееся по степени совместимости с патогеном; в) определения степени ресонеспецифичности частичной устойчивости растений к бурой ржавчине;

т) определения уровня противоржавчинной активности фунгицидов.

Предполагалось, что результаты изучения биохимических методов оценки степени совместимости возбудителя бурой ржавчины с растениями пвеницы могут быть полезны для опециалистов-пммуиологов и токсикологов, участвующих в создании устойчивых сортов и новых фунгицидов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предприняты попытки изыскания таких биохимических методов, которые могли бы облегчить и ускорить отбор растений ппеницы, проявляемое ту или яиую степень устойчивости к возбудителю бурой ржавчины. Показано, что из всех использованных в исследовании методов (анализ на этилен, кндолил-3-уксусну» кислоту, гиббереялины, хитин и грибные антигены) наиболее полезными и перспективными оказались определение содержания и динамики накопления хитииа гв^ицировоиными листьями, характеризующее спорообразуицую способность патогена в конкретной комбинации партнеров, и прямое" количественное определение грибного белка в инфицированных ли-С1ЬЯХ при гомоши Прямого конкурентного метода нммуноферментного апелкэп. Показано, что с помощью этих биохимических методов,нож-

но тестировать частичную устойчивость, судить о расоспецн*ич~ ности устойчивости сортообразвд к патогену.

Кроив того, показано, что ииауноферментный анализ к анп-Л113 на хитин могут танке использоваться в токсикологических исследованиях, поскольку они позволяют судить о влиянии на гриб различных препаратов в разных их концентрациях и вести сравнительную оценку эффективности системных фунгицидов уже через 3 суток после обработки. Бее это позволяет считать лабораторные методы определения темпов нарастания грибной биомассы в инфицированных проростках пиеницы ввиду их акслресснэсти я относительной простоты полезными при селекции шненицы на устойчивость к бурой ржавчине, а также в токсикологических исследованиях.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались Da Всесоюзной совещании "Физколого-биохимические ocüjbh иммунитета растений к грибным болезням для целей прикладной селекции" в г.Уфе в апреле 1933 г. и на юбилейной научной конференции "Актуальные вопросы запиты животных и растений от болезней" в Научно-исследовательском сельскохозяйственной институте в art Гвардейском (Джамбульская обл.) в сентябре 1580 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 сообщений.

Структуре и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их, обсуждение, заключения, выводов и списка использованной литература. Работа иэложенз на 117 страницах машинописного текста, содержит 7 рисунков и 14 таблиц* Список литературы включаеч 192 наименовании, из них

работы аерубекных авторов,

МАТЕРИАЛЫ К МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили растекяп пшеницы ьосьми сортов зарубежной селекции, иноку л иро ванные уредоспорамк фазкологн-ческих рас 77, 52, 25 и 1И возбудителя бурой рзшвчиги пвчянцч ( ruooini» recondite Rob. *t D»bm. f. «y . trltioi £Hk«. ). 3 чекоторых опытах при среннении возбудителей бурой и стебле го ft ржаадияы использовали расу 15 возбудителя стеблевой радэчеан

Пщеяиян Р,кгаа4п1* Г. ер, tritioi Srike, et Я.Нвип.

Илонуллцию растений проводили в возраста ? суток методом опркскиишия суспензией у ре доело р гриба (0,2 мг/ыл) в 0,.156-ном водной id пне 20. Контрольные растения опрыскивали С.ф^ным раствором того же детергента.

;* Образцы дли биохимических анализов отбирали в первыв 10 суток поело тюкуляции и хранили в жидкой азоте. Интенсивность ворэкокал растений шпении.- бурой ржавчиной оценивали по шкале Иейясз и Джексона (Геиеле,1??1), а также подсчетом количества пустул на перлах листьях 20 произвольно выбранных растений,

В нолевой опыте по изучению динамики развития заболевания ив частично устойчивых сортах пшеницы растения шрещва-i(icb на делянках площадью I кв,и в 4-кратной повторности с обеспечением пространственной изоляции. Инокуляцию проводили ;ff4i доспорим и бурой ржавчины (10 мг/кв.ы), сметанными с талы*а, -» фзау виходэ в трубку. Использовали биотипы следующих физиоло-гс.чвски* рао: 77, 105» 149 « 192.

Определение степени поражения растений проводили по шкале Петерсона, а такко рассчитывали площадь под кривой развития йомена (ПКНз).

Для определения количества образуемого листьями этилена гепопьвоизли свежесрезанные листья пшеница исследуемых сортов.

шлиэа использовали газо-хроматографический метод, ранее, подробно описанный применительно к стеблевой ржавчине пшеницы (Чшшкав и лр-Нетодические указания,1987).

Длв определения содержания "свободной" IfУК в листьях пие-itiîua использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматография, отгонный Е.Н:Артвменко с сотрудниками (1980). Содержанке 1<ЛС в лроросвих и непроросших уредоспорах, а также в культураль-ной «идкости определяли по методу, описанному А.Н.Умновык о сотрудниками (1981).

Для определения гиббяреллиноподобных веществ в уредоелорак ряарчинного гриба кспольпошли биологический метод, основанный ва стимуляции роста гипокотклвй салата ( gruikiui«, «watng, 1?С0; Кефоли и др.,1975). Экстракты из спор,

ne .w «ада я; ткэу f биотесто, получали при помощи процедур,опи-епннше А.Т.БаЗкяец (1988) и в«« нам- (1997), а затеи делили

на отдельные фракции при понощи бумажной хроматографии » системе растворителей I,S H Н-бушюл-Ш4ОН (3:1).

Для изучения секреции гиббвреллиноподобних воцас:ть прорастающими уредоспорами в биотесте использовали непосрсд-зтьеи-но экстракты из спор без разделения их ва отдельные фракции ¡ -при помощи бумажной хроматографии.

Им мук офе рм е нтнн й анализ грибных антигенов в ияфицщхтж-них возбудителем бурой ржавчина растениях паениад проводили по методу прямого конкурентного варианта ЙФА, основанного на применении иммобилизованных грибных антигенов и меченних ферментом проти во ржавчинных антител.

Этот метод разработан ранее применительно к стеблешй ржавчине ппеницм (Щербакова и др.,1908), и отличие навей процедуры состояло лить в том, что использовали конгюгат, полученный из крови нроликов, иммунизированных антик, юм проростах спор p.greninie , а антиген для анализа получали из проросших спор P.rfloondit» . Это оказалось возможным, так как сыворотки из крови кроликов» иимунигированных premíale , не обладают видовой специфичностью и, как показали специально проведенные эксперименты, взаимодействуют с белками возбудителя бурой ржавчины точно так же, как и с антигенами возбудителя стеблезой ржавчины.

Количество грибного мицелия в лиспях определяли по формуле: • у х - 1,25 *

где х - количество грибного мицелия (мйг/г листьев),

X - ингибнрошние реакции мзченых антител с имиобш'иаот".-кым антигеном {%).

Для определения содержания хитина в тканях к и^щиромннн--растений использовали метод, основанный на выделении препарат"! клеточных стенок инфицированных растений пшеницу, его гвдслиа* в соляной кислоте и определении в гидролкмте продуктов гидро-лиэа хитина с помодья автоматического аминокислотного пнзг-лзп-тора (Методические рекомендации,I9S7).

Математическую обработку получевных дчинше нрово^л/ t:o методам, описанным в руководств Ас»тм>п и Eoj.oíímm (l$'/¿)

- б -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение возможности использования даиних о гормональной ста гусе растений пшеншщ, инфицированных возбудителен бу- . рой рапвчшш, для определения степени совмсстп.юсти партнеров. ,При мучении патогенеза с те блею Л ряашгош пшеницы Д.И.Чканн-новыи к сотрудниками било обнаружено, что уровень продукции Hiii'iimiporaiiirtïMii листьями таких тесно связанных между собой JuroropMOHOiï, как этилен и МУК, настолько хорошо отражает степень совместимости того или иного сорта пшеницы с возбудителен стоблошй резв чина, что вполне мог служить диагностический признаком. Нам предстояло, прежде всего, выяснить, может ли использоваться аналогичный подход и для определения стеле- -ни совместимости сортов пшеницы с возбудителем бурой ржавчины.' Б связи с эти« кзКбряли ингенеявность образования этилена ин-{шшрованннми возбудителе« бурой ржавчины растениями пието*; ряда сортов пшеницы, среди которых были восприимчивый Тэтчер, устойчивые Дмитровка 5-12 и линия Тэтчер - la? 9, в также частично уотоПчивые Ахилл и Плане!.

Вопреки ожиданиям, заражение растений бурой ржавчиной сопровождалось лишь неэначителышм усилением биосинтеза этилена в случае крайне высокой совместимости (сорт Тэтчер). Во всякой случае, пабвюдашкеся изменения интенсивности образования этилене но «мели очевидной связи со степень» совместимости партнеров, а это могло бы быть результатом того, что ИУК, вндуци-рушчя биосинтез этилена, не играет такой реиэющей роли во вза-иаоотносенипх паразита и хозяина, как это имеет место при вара-яонии растения пшеницы возбудителем стеблевой ржавчины.

Е целях проюрки этого предположения, мы провели ерзвни-Т( льшй опит о растениями, инфицированными возбудителями стеблевой и бурой ржавчины.

Эстония пшеницы сортов Лигтл Клаб и Тэтчер инокулироваяи соответственно уредоспорими возбудителей стсблевоЯ (роса 21) и {pica ?7) ржавчины. Оба сорта пшеницы универсально вое-irpcKvc:]-!» и соотеотетиуюодм вида« ржчвчиш, так что и та, и другая яои^ккаг.ги бил:; со мостимым и, a это давало возможность кор-piitîiîo сг=;:--:ат1. особенности течения интересу стих кпе процессов 7îi<. aircriutic cteSsesoa « бурой рхавчшш.

Инфицирование листьев возбудителем стеблевой ржавчина о разу же приводило к некоторому повышению содержания ИУК, причем по-настоятему значительным оно становилось на 6 суткл после инокуляции, й если первоначальные изменения концентрации 11УК могли быть отнесены за счет привнесения ауксина прорастающими спорами, то резкое увеличение количества 117к на 6 сутки являлось скорее всего следствием бурного образования спор с высоким содержанием этого фитогормона (Дртоиенко и ди., 1950', Уинов и Пошившие мятенсивиости биосинтеза

этилена по времени совпадало с увеличением концентрации ауксина и это может .объясняться тем, что последний выполняет функцию индуктора АЩ-синтазы - фермента, ответственного за образование непосредственного предшественника этилена (Уи *t nl.f 1979). При инокуляции листьев пвеницы уредоспорамг возбудителя бурой ржавчины содержание КУК на протяжении 4 суток практически не изменялось, и только в период спорообразования концентрация ауксина несколько возросла. В поттом соответствии с указанными обстоятельствами находится тот факт, что интенсивность биосинтеза этилена при заражении растений возбудителем бурой ржавчины возрастает незначительно и лишь не короткое время.

Еще одно подтверждение неучастия ИУК во взаимоотношениях возбудителя бурой ржавчины с растениями пшеницы получено при диализе покоявдхся и прораставших уредоспор той и другой ржавчины. Выяснилось, что уредоспоры возбудителя бурой ржавчины пшеницы отличаются от спор стебловой ржавчины значительно боасе низким содержанием ауксина, особенно "свободной" ичдолнл-3»уксусной кислоты. При проращивании спор как стеблевой, ток и tfy-poü ргзвчины содержание ЙУК в них резко падало. Один ко если прорастание спор стеблевой ржавчины сопровождалось шдеявнием в кулЕтуральную жидкость значительной доки ИУК, то у ре до ело ры бурой ржввчииы такой способность» не обладали. Полученнчд и опу-те данные могли бы интерпретироваться т^ккм обозом, что дитель бурой ржавчины в отличие от возбудителя стеблеооЗ рзпи'чг-н» пшеницу (Уинов и др. ,198*0, не распе-япет г*тю ^остыс hi' пользовать ИУК дет установления контакта с

, Полученные данные позволяли считать, iw КУК, игрыкич,

- в -

пилимо, счэнъ важную роль в патогенезе стеблевой ржавчина ппвпиця, не шее* серьезного значения для таксономичееки (Оттого возбудителя бурой ржавчины. Из этого вытекало по пекшей мере г.ва следствия, Во-первых, стало ясно," что по количеству индуцируемого ЙУК этилена, образуемого иифидиро-тюииими листьями, невозможно судить об устойчивости сортов ncetr/ци к бурой ржавшие. Иными словами, "этиленовый тест", угпчко разработанный применительно к системе "пненица-возбудитель стеблевой ржлвчины'1 (Ч ка ников и др., 1904; Умно в и др*, в данной случае оказался неприемлемым. Во-вторых, следовало допустить, что teaииодвйствие возбудителя бурой ржавчины с пшеницей осуществляется с участием каких-то иных фито-гор'онов. Такими факторами совместимости могли бн быть, как Htm показалось» гиббереллины.

О возможности участия гиббереллинов во взашоотношек-.их гозбудктеля бурой ржавчины и растений пшеницы свидетельствовало описанное В.Н.Чекуровым и Н.Г.Нитрофановым (1983) повышение содержания гкббереллнноподобных веществ в листьях восприимчивого сорта пшеницы уже через 12-13 часов после их инфицирова-fvs; при этом содержание гибберелликоа в листьях устойчивого сортft паеящи оставалось неизменный.

Предположение о том, что гиббереллины способны играть ?оль гормонального фактора совместимости возбудителя бурой ржлвчшш и растений пшеницы, могло получить поддержку в виде ,т;шых о содержании гибборелдтюповобных веществ в у ре до спорах гриба. В ток называемой кислой фракции экстракта из покоящихся спор бурой ржавчины содержание гиСЗереллинов оказалось очень лыгокг" - примерно I икг/г, однако в спорах стеблевой ржавчины, KOTopie анализировались для сравнения, оно было еще большим -1,5 ыкг/г. В нейтральной Фракции акстрактов гиббереллинов обна-ГСгжоно гораздо меньшее количество - примерно 0,1 мкг/r, что, ирярдэ, вдвое н ре бн шало содержание гормонов в той же фракции экстр-жтэ кз спор стоблецой ржавчины, где концентрация'этих гормонов составляла 0,05 мкг/г.

Устэкогг.смэ кроао того, «го прорастающие споры бурой pv^yiv/iiii г.* . некоторое количестго гиббвреялиноподобных

¡■•■'а^гта в пул f ту pi вшу» жидкость. Черс:* б часов после начала

прорастания спор концентрация гиббереллинов в нейтральной фракции экстракта составила 0,0'+2 нг/ил или в пересчете на массу уродоспор - 15,9 нс/Г.

Следовательно, уредоспора бурой ржавчины содержат заметное количество гкббереллшоцоиобных. вевдстз, коториз ког51 ■ секретироваться в среду при прорастании. Можно полагать, что эти гиббереллины имеют функциональное значение, однако полученные к настоящему времени данные не дают основания дли более определенных выводов,

С точки эрения целей нашей работы имеет значение тот вывод, что ни изменение содержания НТК пли гибберолликов, ни интенсивность биосинтеза этилена не могут служить критериями оценки степени совместимости возбудителя бурой ржавчины с растениями пшеница. Метод, оказавшийся полезным для изучения устойчивости сортов пшеницы х стеблевой ржавчине пшеницы, в данном случае оказался неэффективным.

Определение содержания хитина а инфицированных листах

как способ выяснения степени устойчивости сортов пшеиу.цн к бурой ржавчине. Хитин (полимер р -1-4-* -ацетилглююэамина), который является важным компонентом клеточных стенок грибов, практически.отсутствует в.растительных тканях ( м»уад>» »ъ »1,, 1975» Торр*п вt »г., 1976), что и дает в ряде случаев возможность судить о темпах накопления массы триба в анонсированных растениях именно по содержанию хитина ( Л14» «г »г., 1971;

*и »-1 1975). Это давало основание считать, что огсредале-'ние количества хитина в растениях пшеницы, инфицированных возбудителен бурой ржавчины, такжа позволит судить о степе«« местности партнеров.

В эксперименте использовали растений пшеницы, различаемся по своему отношении к лоабудителв бурой ржавчины: угиоэр^п-ио восприимчивый сорт Тэтчер, его кэогеннуи линию с геиои устойчивости Ьг 9 , характоризуюксуюся высокой устойчивость« во тем биотипам у.гвоопсЩж , а токже три частично устоячиьах сорти зарубежно* селекции - Планет, Лхилл и фортуна. Суля по диччиичч , образования пустул, заболевание развивалось нзиЛэясч иктеши-мо на универсально шеприимчивом сорте Тэтчер, е го вотю" адк »а листьях изо генной линии Тэтчер - 9 , хзрзктегизугадйсй »чч)-

- ш -

кии уровнем расослеиифвческой устойчивости, пустулы совсем не формнродались. Частично устойчивей сорт Ахилл отличался от воспой(шчтюго Тэтчер существенно меньшим количеством образовав щхс я пустул.

По динамике накопления хитина в тканях инфицированных 'аистьеь изученные три сорта расположились в том же поряда, т.н. ш)иболее энергично этот процесс протекал в листьях вое-триимдиьото сорта Тэтчер, со значительно меньшей интеисивно-зги> о листьях сорта Ахилл, тогда как по содержанию хитина листья устойчивой лиаил Тэтчер - Ьг 9 практически не отлича-от не инфицированного контроля1, Следует отметить, что запалившие {в сравнении о сбргом Тэтчер) накопление хитина происходило также в листьях других изученных частично устой-чншк сортов - Планет и фортуна (табл.1).

Таблица I

Динамика накопления хитина в листьях сортов шланици, различающихся по степени устойчивости к бурой ржавчине

[ Содержание хитина (мкг/г листьев) через

л,... „„„..„„„ , различные промежутки времени после иноку-

оорг пшеиилы I ¿яции уредоспорами расы 77

! (сутки)

тт 1 5 а. 4 ! 5 ! 6 ! ' 18

Тэтчер 10 7 12 8 51 105 234

Тетчер- ьг 9 19 21 гг 19 24 14 13 15

Липнет 15 14 17 17 - 75 106 170

Ахилл 10 13 15 18 65 юз III

Фортуна 10 9 9 13 26 67 хоо 150

Обрэдав* нз себя внимание гот факт, что в условиях нашего ариаинтп обраэоьание пустул практически завершалось яа 7-8 тш. ¡шсг.о инокуляции, тогда как накопление хитина продолжалось ы!ле?ь до оно]гптщ опыта через ГО дней после инокуляции. Это.

гмуятть подтверждением оСосновдииоети точки зрения, в , р^ммтстг«.) с которой присутствие хитина свойственно не веге-гчткг,у п. тш\ 1 спо\к>тттчк ткяяям и сэш!М уредо спорам { к*»11м1су1, й«*^, 19=2; Е-зйяног-а и Но так пли ш;а-

ча, сведения о динамике накопления хитина инфицированными листьями могут, вероятно, свидетельствовать о степени совместимости воз (Зудите ля бурой ржавчины с растением-хозяином и во всяком случае - характеризовать спорообразупщую способность патогена в конкретной комбинации партнеров. Разумеется,при подобной оценке особую важность приобретают правильность подбора восприимчивого сорта (эталона) и обеспечение идентичных условий инокуляции и последующего развития заболевания,

ИимуноДерментниЙ анализ (ИФА) грибных антигенов инфицированных бурой ржавчиной растений пшеницы. Как следует из предающего раздела, тестируемая по содержанию хитина спорообра-зующая способность гриба не во всех случаях дает адекватное представление о степени совместимости партнеров..

Представлялось желательны« изыскание более универсально-' го критерия оценки степени совместимости пшеницы с возбудителей бурой ржавчины. Таким критерием мог бы служить темп накопления грибной биомассы в инфицированных листьях пшеницы, как это показано исследованиями,-проведенными ранее со стеблевой ржавчиной пшеницы {Найденова,1988). Именно указанные исследования дали докаэательство'того, что динэыива накопления биомассы паразитического гриба в растительных тканях является интегральным показателем, который лучше других свидетельствует о характере его взаимоотношений с растением-хозяином.

В одном из первых экспериментов инфицированные растения группы сортов, различающихся.по своему отношению к возбудителю бурой ржавчины, на протяжении В суток ежедневно анализировали на содержание грибных антигенов с помочь» ИФА. Полученные в этом опыте данные убеждали в том, что темпы формирования ми-целиольной массы в инфицированных листьях находятся в зависимости от совместимости партнеров (табл,2). .

В тканях самого восприимчивого (из изученных) сорта Тэт-чар развитие гриба происходило наиболее бурно (тпбл.2). Совершенно иная картина наблюдалась в случаях полной несовместимости патогена и хозяина (линия Тэтчер - Ъг 9), где гриб практически не рззвишлса .(твбл.2). Однако наиболее интересные, по нашему мнению, результаты получены при анализе сортов, характеризующихся частичной устойчивостью к бурой ржавчине. Все эти сорта (Тур-

Табмца 2

Динааина закопления грибного мицелия в листьях сортов пшеницы, различающихся по степени устойчивости в бурой ржавчияе (раса 77, биотип 1,2а

2в,3,2с,10,14а,14в,16,18,26)

[ Количество мицелия (ыг/г листьев) после инокуляции через (сутки)

Тэтчер 0,05 0,25 2,95 11,75 43,75 125. ,07 146,28 153,75

Тэтчер- 0,09 . 0,12 0,24 0,33 - 0,56 1,05

Шгаяет 0,06 0.1* 0,53 5,37 - 73,95 83,82 97,07

Ахютл 0,09 0,20 0,51 4,61 - 51,51 68,05 71,99

фортуна 0,38 0,75 1,6* 6,23 20,13 39,94 - . .; ш,1б

Турбо 0,36 0,49 0,96 6,57 13.86 47,05 71,84 .122,74

бо, фортуна, а особенно Планет и Ахилл) реагировали на попользованный ииокулюм замедленным, в сравнении с Тэтчер, накоплением ржавчинного мицелия, несмотря на то, что для них так к«, как и для сорта Тэтчер, характерна высокий тип инфекции (табл. 2). Иначе говоря, замедленное накопление грибной массы происходило в листьях тех сортов, которые известны как "медленно ржавеющие" или характеризующиеся относительно малой площадь» под кривой, описывающей динамику развития болезни.

Сказанное позволяло сделать вывод о том, что ИФА ржавчинных антигенов в листьях молодых растений пшеницы «ожат способствовать шявленшо "медленно ржавеющих" или частично устойчивых сортообразцов в процессе селекции и облегчать необходимые^ таких случаях фитопатологические (или иммунологические) исследования ( Johnaon, 1978,1983; iande ■!»» 1978; 1л», 1985; feres, RoeIf1988; lorebi, Mannerв, 1983). Определение темпов накопления мицелия паразитического гриба в инфицированных листьях дает,кроме того, возможность составить представление о сравнительной продолжительности латентного периода, служащего одним из факторов частичной устойчивости, в самом деле, из данных табл.2 следует, что в листьях частично устойчивого сорта Ахилл бурный рост мицелия р.гееопш* начинается,-по, крайней мере, на сутки позже, чем в листьях восприимчивого сорта Тэтчер.

Далее следовало выяснить, нельзя ли с помощью ИМ определять степень расоопецифичности частичной устойчивости, Подобная задача диктовалась, прежде всего, практическими соображениями, ибо только расолеспецифичноеть частичной устойчивости может обеспечить длительность сохранения этого свойства сорта на фоне непрерывной модификации популяции патогена (Tarlevliet, 1998);

Листья 7-дневпых растений пиеняцы внокулировали уредоспо-рами четырех биотипов различных физиологических рас (77, 52, 25, с неодинаковым спектром вирулентности. Через 5, б и 8 дней после инокуляции количество образовавшегося ва соответствующий период вегетативного мицелия ржавчины определяли иммуноформент-ным «етодоы. Полученное результаты свидетельствовали о бистром накоплении массы мицелия ржавчины всех четырех биотипов в ли-

- и -

стьях восприимчивого сорта Тэтчер. В то же время в листьях частично устойчивых сортов темпы нарастания грибной массы * оказались существенно более низкими (табл.З). При этом вдяо-шшсь, что уровень расонеспецифичкости у изученных сортов далеко не одинаков. Например, в листьях ппеш'.цы сорта фортуна рост мицелия ржавчины биотипов рас 25 и 7? тормозился гораздо более резко, чей двух других биотипов. В листьях сорта Гамут, особенно сильно тормозился рост биотипов рас 77 и 52 (табл.З), В этих случаях наблюдалась типичная реакция сверхчувствительности, Следовательно, устс, Дчивость сортов Фортуна и Гамут имеет черты рэсоспецифичности,

С другой стороны, в листьях сортов Ахилл и Букет рост гриба всех изучавшихся биотипов тормозился (но сраачению с восприимчивым Тэтчер) почти в одинаковой мере (табл.3). Иными словами, "медленное ржавение" указанных сортов имело расоне-специфический характер. Если учесть при этой, что при всех сочетаниях тип инфекций оставался высоки» (балл.А), то «окно с "большой долей уверенности относить сорта Ахилл я Еукет к числу частично устойчивых сортов с выраженной расонеспецифично-стыо. Следует предполагать, что такая устойчивость окажется длительной, поскольку вероятность появления в популяции вирулентного для этих сортов биотипа весьма мала. Конечно, такой вывод был бы более корректный, если бы в исследовании использовались не А, а 10-20 различных биотипов, ко наши данные свидетельствуют о принципиальной возможности получения при помощи ИН и таких данных.

Таким образом, прямое определение грибных антигенов в инфицированных листьях не только дает возможность судить о степени совместимости возбудителя бурой ржавчины и растений пшени- ' цы, но и позволяет выявить проявление частичной устойчивости сортообрязца к этому заболеванию, а также констатировать выраженность ее расонеспецнфичности.

Видимо, этот метод способен существенно повысить эффективность иммунологических исследований при селекции устойчива к бурой ркэвчиие сортов пшеницы. •

Таблица 3

Накопление биомассы четырех различных биотипов возбудителя бурой ргавчивы в листьях сортов с неодинаковой устойчивостью к заболеванию

!Бреия 'после

IMHoitv—1 77 (1;2а;2в:2е; 52 (1;3;3а;4;10; 25 f£c;3;3a;^i 144 (1;2в;3;3а;

§S5* ' 3;i6;l5;26i 20) ! ^

Ивокулад (биотипы физиологических рас)

"Т"

Сорт

¡касса 1 « 0_ "luacca Г с0! ¡мицелия; £мицелия,; * 01

! »'/* "г S '«А

¡листьев; ¡листьев ;

контроля

22)

масса ] . Умзсса ] % ,

иг'Е > ооля I мг'г ! листьев i ^^ листьев ;

__________________I________

роля

•Тэтчер (контроль, восприимчивый эталон)

Ахилл

Фортуна

Букет

Гаму*

4 б

в *

6 8

4

б

3

4

6

5

4

6 3

1,51 32,25 68,79

0,19 16,71 18,89

А'В

3,86

0,04 12,28 37¡9*

0,02 4,34 2,14

100,0 100,0

47,40 27,46

ЪЫ2

5,61

34^84 55,15

Tz'si ■ 3,И

3,41 46,27 91,39

0,61 24,25 24,69

0,16

8 00 23,48

0,45 25,62 44,51

0,45

6^21 И,92

100,0 100,0

. 52,41 27,02

17,29

25.69

55,37

48.70

13,42 13,04

1,91 42,43

65.7

0,44 30,32

45.08

2,04 О'Эб

1.45

24.57 46,90

.1,45 27,99

40.58

100,0 100,0

71,46 52,59

4,81 1,12

57,91 54,72

65,97 ■ 47,3.7

6,16

49,02 100,0 75,15 100,0

1,47 29,13 29,11

0,95 18,08 15,90

1,86 16 19 42,39

1,86 •32,60 28,87

59,42 38,74

ЗбТзВ 2X^16

ззТоз

56,41

66,50 38 >2

- к -

Об адекватности оценки уровня частичной устойчивости биохимическими методами. Материалы двух предыдущих разделов свидетельствовали о том, что инфицированные проростки частично устойчивых к бурой ржавчине сортов пшеницы отличаются от восприимчивых существенно более низкими темпами накопления хитина и грибной биомассы. Однако нами изучено не настолько много частично устойчивых сортог., чтобы отбросить сомнения в корректности сделанного вывода» Кроме того, против использования проростков пшеницы при оценке устойчивости часто возникают возражения, основанные на "ом, что при этом уходит из поля зрения такое явление, как "возрастная устойчивость", имеющая иногда, по мнению некоторых исследователей, решающее значение ( Poyuta, Hyde, 1937). Бее это делало желательным получение доказательств того, что результаты биохимического тестирования проростков могут давать адекватное представление об устойчивости растений тех же сортов на протяжении всего вегетативного периода в реальных полевых условиях.

На опытном поле ВН1М была посеяна пшеница универсально восприимчивого сорта Тетчер и частично устойчивых сортов Планет, Ахилл и Турбо. Для инокуляции растений в фазе выхода в трубку использовали свежесобранные уредоспоры бурой ржавчины четырех физиологических рас: 77, 105, 1^9 и 192. Таким образом, в инокулшв присутствовал максимально возможный набор генов вирулентности.

Полученные данные суммированы в таблице Все изучавшиеся сортв реагировали на внокулюы как восприимчивые: балл поражения по шкале Мейнса и Джексона - 4 то всех случаях, за исключением комбинации "сорт Ахилл - раса 149" (тип реакции 0). Судя по площади под кривой развития болезни (ПКРБ), для всех частично устойчивых сортоз при инфицировании любым и но кул игом было характерно "медленное ркавение" (таблЛ). Это могло расцениваться как доказательство расонеспецифичности частичкой устойчивости сортов Планет, Ахилл и Турбо, Именно поэтому не кажется удивительным, что указанные сорта реагировали кэ смешанный кнокупим (смесь на раваых долей всех четырех биотипов) так не, как и не кпждий биотип в отдельности. Замедленное (в сравнении с восприимчивым зтзленом) развитие заболевания в полевых условиях

Таблице ^

Равхнгкз буроя ржам ивы на растениях п«*кшш частично . уСТОИМВХ сортов ио двннны подмоге эпям

7?" _ ~юГ[" иГ" | 192

эталон)

Планет

Ахклл

Турбо ■

Тетчер (вое-врияичхвыЯ

1050 324 75 603

1037 282 30 399

1050

ги

О

500

1012 343 112 520

■ожнооты) ооотхатетхожавд более ннххии темиам яакехлвння иаш-1хя х пророотках явеница. Вмоокая овеявкь корреляции между орвв-янхвемымж показателям* для раем 77 ( около 0,9 ) свидетельствует

0 тон, что лабораторное тестирование темнов н*хопления иицелия

1 проростках до авол«в* ярогноировать характер раввнтнк »»Й01Р-аания х реальных умами. Точно так же х определение «еженш расовое яетфхчноом хяохяе может биь овущвотххеио х лабораторном опмте".

К сожаление нужно отметить, что х яохохом опте испольво-хахвж несколько иной набор бжопнох, чем х опыта да бора торном. Однако а то« и другом случае раоонесяецифвчвость чаотнчваА уд-то1«хоот1 сорта Аххлл, к ярнмеру, демонатрнровалась сохервеви» ведвуеммеленво.

Следовательно, лабораторные методы определения темвоа на-растанкя гриСнса бномаосм х шнфяцяроханнмх вроростках жвеницм «иду их ежсвресснооти и относительное аросгогм могут окаввться хесьма подвмыи при селекции пменхцы на увтоЯчивоовь к буро! ржавчине.

Иадчение возможности испозьвованхя биохимических критериев устойчивости пнакипи к аовбздитолв б?ро! ржавчин» при исследовании эффективности протаворжавчинных фунгицидов, Как жв-веотмо, системные фунгициды озли одним ив непременных факте-

ров интенсификации зернового хозяйства (Полигыко ,1988), Среди яих заметное место занимают, по мнению ряда исследователей, ингибиторы биосинтеза стероидов. Они действуют на паразитические грибы примерно так же, как эндогенные факторы частичной устойчивости растений, поскольку вызываемые ими эффекта проявляются в подавлении роста мицелия в формирования инфекционных струк-jyp ( Kuok et al., 198Г1 Kato, 1985). Следовательно, методы регистрации фунгицидной активности вновь синтезируемых химических соединений, предполагающие оценку их влияния на прорастающие споры, не могут быть адекватными, из-за чего возникает возможность признания неперспективными потенциально фунгитоксич-ных соединений. В этой связи мы предположили, что. изученные нами методы определения темпов накопления биомассы ржавчинного гриба в тканях инфицированных листьев могут оказаться полезными и при скрининге фунгицидов, и при изучении различных осо- . бенпоетай реализаций их физиологической активности. Предположение было проверено в экспериментах с использованием некоторых известных фунгицидов, эффективных против бурой ржавчины паени-цы.

Таблица 5

Сравнительная токсичность тилта, байлетона и трифмина для возбудителя бурой ржавчины пшеницы

ф^нриттип я 1 Подавление .заболевания (%}, определенное концентрации ! на 9 сутКй П0Сле инокуляции растений

г™ * n \ I по количеству [по содержанию [ по концентрации д.в.; | пустул |мииелия гриба j ции хитина

Тллт 60,8 61,9 . 57,8

Байлеток 53,? "t5,9 50,3

Трифмин 24,0 34,5

Вначале были подобраны концентрации фунгицидов, при ко-, торых они оказнвэЕТ существенное влияние на развитие мицелия, ве подавляя его на 10056,а также гнявлены условия постановки экспериментов,позволяясие вести намеченные наблюдения.Быяснено, что данные о сравнительной фунг«токсичности тилта^байлетона и три$минз могут быть получены при использовании их в концентрации 4 кг/я, причем наилучшие результаты достигались опрыскиванием

растений пшеницы через 3 суток после инокуляции уредоспорами возбудителя бурой ржавчины. Количественны» анализ грибного мицелия, проведенный через б суток после инокуляции растений, когда появились лишь единичные пустулы, позволил установить, что наибольшую фунгитоксичность проявил тилт, подавляющий развитие мицелия на 88,1$, несколько ненмую - байлетов, подавление на 80Л56, и наименьшую - трифмип, подавляющий рост мицелия на 27,2$.

С помощью инмуноферментного анализа удалось определить' динамику накоплент мицелия ржавчины в листьях пшеницы, обработанных тремя названными фунгицидами.

• Подтверждено , что трифмин в концентрации 4 иг/л относительно слабо влияет на развитие, патогена, тогда как тилт в той хе концентрации явно замедляет накопление ржавчинного .мицелия; как бы продлевая латентный периодов результате этого образование заметных количеств мицелия начиналось позже и протекало в течение последующего периода на гораэдо более нкзшн уровне, чем в контроле. Байлетон оказывал на развитие гриба примерно такое жв.но несколько более слабое воздействие, чем тилт.

Существенно, что при определении степени подавления заболевания. по содержанию в обработанных растениях грибного мицелия я хитина были получены результаты, практически не отли-чаюциеся от данных фитопатологического анализа (табл.5).

Инмуноферментный анализ дает возможность получить более полную токсикологическую характеристику изучаемого фунгицида.* Так, определение еависимооти темпов нарастания мицелия от дозы трифмииа позволило рассчитать концентрацию, при которой рост гриба подавляетоя на 50% (ЕД 50). Она составила 21,711,7 мг/л. Определение ВД 50, проведенное с поморю независимого метода, основанного на определении содержания хитина, который является конституентом гриба и отсутствует в растительных тканях, дало близкие результаты -17,3±1,5 мг/я.

Таким образом, имиуноферментный анализ грибных антигенов и определение хитина в инфицированных растительных тканях могут использоваться в токсикологических исследованиях, в частности, при изучении сравнительной эффективности системных фуц-г вия.поъ. .

. S Ü В 0 Д Ы

I. Поиаааио, чм о стааанх оммвстхмостя »0вб)дя>вяя бура» ржавчиш о pact зекам пяеницы можно еудяп ко реаудь-fssatf оярадвденяя твштх нарастания массы граба > хнфящрс* маимх ххотьях.

¿, Дянамяхв содержа ни хитина, eioieiieESoro довбудив-in буро! ржахчнвы i практически о lay тонущего i тканях пяо-■ицн, дает адаматноо предстаивняв о отвпеям совместимости nepiaepoj, одаам ухехяченив содержании шииа в шфтирз-itHBiii хяетьях становятся длимым дивь на 4-5 оутхи поела «окупим» т.е. i период формхрованмя onoporeuaoî ткани.

3. Иимунофармввтвый анахяв (ИФД) ржавчинных антигене] s инфицярованинх дхстьях характеризуема iuooioI чуктмтвхъао-01ьв (до 0,25 мт "грибного" бедка на I г ткани), причем рас-»цельные бвмея us В1ИЯМ на результат мссхедованкя. Это да-at losMoxBocib icnoibsûiaib IM дхя хояячветмнного одредеда- . вял массы гриба ш иопт чареа 2-3 «лох аоохе хяокухяцмм,

4. С помощъс 1Ш окавахооь ювиожывы onредела aie etenaal jeioMiiocî« сортов пяеницн к буров рхавчкив, причем даыане о Темпах ispaoтам»* мзвоя гриба х ян^тхрованимх диотмх иоходнх pactsail хорояо корреаяровадж о джнамижо! раавития бодввяк i полавом оямсе.

5. Ияучвние ар« помощи ИМ характера раашкя датогвка i инфицированных inctMx иожет оиваобсмовам, вммдевмо вортовб-pasaoi, обхадащях чаотмчной увтойчнооть», В частное», такое яввхедовавив nosioiaai охарактеризовать ствооиехьнув яродолхя-тахьноать даг-фааы, ароявлевяе "медленного ржавеня*" (alow гив-

■ -tine ) я уровен» paooaecnem$«4iaotï уото1чявовп этого ша,

в, Биохимические метод» определения скорости накоплении маосв гряба i инфицированных дистих охавзлиоь пригодный* дхя бистро! оаеяи сравнительно* еф^ешвновтк яротиворхавчинних фунткдов.

7. Предположение о том, что одяим на критериев совмести-nocís вовбудятем úf pal ржавчина о растениями пионии. могут бить каменев»* гормонального статуса, на иодучило пока ехспе-рямеатального пйдтверхденяя, Установлено, однако, что еяора Mcondit» при врарастакяя секретарум гяббаредляаоиодобння щгстха, ^н«аиомаиное вначеме хоюрях яредеюят вняскт

Сивок piCoi яо m le рил и даосартадяж

Z. Гряачавжо С,Г., Шаванои Л.II., 4ias*ioi Д.И, Ншцкофарнав)-eui авали painin всаЗудмаи fljpel ринш s шик ■мята // Tenon докладов аовацавщ "Фяавоаого-еаохвив-чеожяа otio» iwufHiieta к rpiCinw болаавян pio»il"t-1фа, 1988. - С. 17-18. . . 2. Гриячанжо С,Г., 4i«gxxo> Д,И, Воможкоагъ икшошн ва-loíopai бюхмпаскях камдо! для oitui flfeiaaa j4»ol*»->oa?i раетавя! иевжЕщ ж Ojpol рхаачяжа // Няжохогм я фжоаамхогм. - 1989. - Т. 23, но. I. - С, 43-46, Гржячаям С .Г., Чхаввко» Д.И., Умао»1,И,, Пябаяом Д.Н. . Воакохяосг» асводиомнж« жмм|мофврмевиога наш« ара ■tjfeHii аффаняпаатж жрошоржапхняах фуягяшик» // Дгрохжши. - 1989. - 1 6. - С. 103-105.

4. Гржнавхо С,Г., Иш»к jl.fi., Juhoi í.U,, Чинаю! Д.И.

И»|Чвяна чааичао! ptoiimt» шипи ж ûjpol рхаш-на на«одом яшааофариаясвого шш< // Доиадя ВАСПМ,-1989. - * 9. - С. 5-7. ' - .

5. Грявчамю С,Г. Вовыожиоот» ícioibtoiaiii авхоюрах бмохаиг- <

чввках методов дав оцени «>«яавв ;«м1шмп pitniil якавмкк ж буро! ржамвва я жрх Itriui ^eiiiiui» вро-шорхаачвявкх фунгжцях*) // Вояроеи ищи oíiMimnl-etaesetx рамвяв) я lutrnu «> ОоааяваС. Чао« I. - limita, 1989. - С. 34-40.

По материалам дяосертадм оодготоалевм иа*0дячеохиа ражс-маждакяя "Бюстмиесваа овавжа joioiwioeti аяанкдм к eteCiaiol к Cjpol ржамвнв", одобрение бгро оадаявввя раогеяваюдот я вааакцяв ВАСХНЙЛ.

Л - 40173 Подписано в печать 12.03,90г. Формат 60x64/16 Ваказ 53S Тираж 100

Москва. Типография ВЛСШШ