Взаимосвязь вирулентности и RAPD-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы

Кудинова, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Взаимосвязь вирулентности и RAPD-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы
ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь вирулентности и RAPD-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы"

На правазду^описи

005020365

КУДИНОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЗАИМОСВЯЗЬ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ЯАРБ-ПОЛИМОРФИЗМА СЕВЕРОКАВКАЗСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ

06.01.07 - зашита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДПР 2072

Краснодар - 2012

005020365

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБЗР Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Волкова Галина Владимировна

Официальные оппоненты:

Пивень Василий Тимофеевич,

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, зав. отделом защиты растений ГНУ ВНИИ масличных культур имени В. С. Пустовойта Россельхозакадемии

Ведущая организация:

Чесноков Юрий Валентинович,

доктор биологических наук, ГНУ ВИР Россельхозакадемии, зав. лаб. молекулярной и экологической генетики

Федеральное государственное бюджетное общеобразовательное учреждение высшего профессионального Образования «Кубанский государственный университет»

Защита диссертации состоится 18 апреля 2012 г. В 10 ч 00 мин. на заседании диссертационного совета ДМ 220.038.06 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина 13, главный учебный корпус, конференц-зал (аудитория 104), тел./факс: (861)221-58-85.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет».

Автореферат разослан « марта 2012 г.

Ученый секретарь ^¡С? Горьковенко

диссертационного совета ор IX <'А— Вера Степановна

Актуальность исследований. Бурая ржавчина (возбудитель Puccinia triticina Rob. ex Desm. f.sp. tritici Erikss. et Henn.) - одна из самых распространенных и вредоносных болезней пшеницы. Потери урожая при раннем и сильном развитии патогена на восприимчивых сортах достигают 30-40 % (Лукьяненко, 1973; Орлюк, Гончарова, 1987). При 80-100 % развитии болезни в фазу колошения пшеницы ущерб урожая может составить 50 % и более (Лебедев и др., 1994; Танский и др., 1998).

Возбудитель бурой ржавчины пшеницы обладает большой экологической пластичностью, поэтому болезнь распространена во всех регионах культивирования пшеницы, а Северный Кавказ является зоной высокой вредоносности и широкого распространения болезни. Северокавказская популяция патогена всегда отличалась генетическим разнообразием и большим количеством вирулентных изолятов (Волкова с соавт., 2005). Защита растения-хозяина от возбудителя бурой ржавчины предполагает использование как химических, так и биологических методов, в первую очередь через выведение и использование устойчивых сортов. Успех селекции в этом направлении зависит от знаний закономерностей изменчивости популяции возбудителя болезни (особенно связанной с естественным отбором по вирулентности) и генофонда устойчивости пшеницы. Поэтому исследования структуры популяции гриба по вирулентности всегда остаются актуальными. Тем не менее, маркеры вирулентности позволяют оценить только малую часть общей генетической изменчивости в популяции. У ржавчинных грибов с помощью биохимических и молекулярных маркеров оценивают изменчивость независимо от селекции растения-хозяина (Chen, Line, Leung, 1993; Kolmer, Liu, Sies, 1995), и поэтому данные маркеры могут быть полезны для более полного анализа структуры популяций фитопатогенов.

В основном изучение структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы ведется с помощью классического фито-патологического метода, включающего тестирование по генам вирулентности. Исследования популяции патогена по ДНК-полиморфизму начались в 90-х гг. прошлого века и продолжаются в настоящее время, все более совершенствуясь. Несмотря на многолетнее использование подобных методик за рубежом, в России этот вопрос до конца не решен. Использование комплексного подхода в изучении структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы позволит наиболее полно описать изменчивость патогена и проследить его динамику.

понятие этого термина не применимо к возбудителю бурой ржавчины пшеницы в связи с тем, что гриб зимует в уредостадии и популяция является клональной (Михайлова, Васильев, 1985). Использование дополнительных маркеров (таких как ЯДРО-маркеры) может помочь в решении этого вопроса.

Взаимосвязь вирулентности и молекулярной изменчивости фитопатогенов является одним из дискуссионных и неизученных вопросов, который имеет теоретическую и практическую ценность (Х1а й а!., 2000). В связи с чем изучение взаимосвязи вирулентности и ЯАРО-полиморфизма возбудителя бурой ржавчины пшеницы является актуальным.

Цель и задачи исследований. Целью исследований является изучение взаимосвязи вирулентности и НАРБ-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- оценить распространенность и развитие Р. /гШста в различных агроклимати-ческих зонах Северо-Кавказского региона;

- проанализировать частоту встречаемости генов вирулентности и фенотипов вирулентности в популяции Р. 1г1(Ыпа из различных агроклиматических зон Северного Кавказа;

- охарактеризовать молекулярно-генетическую структуру северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины по ЯАРЭ-маркерам;

- провести сравнительную оценку географически отдаленных популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы по признаку вирулентности и ЯАРО-маркерам;

- установить взаимосвязь вирулентности и НАРБ-полиморфизма северокавказской популяции гриба.

Научная новизна. Впервые изучена северокавказская популяция Р. /гШс 'та по признаку ЯАРО-полиморфизма.

Предложен новый подход сравнительной оценки двух методов исследований структуры популяции Р. 1гШста, основанный на взаимосвязи частоты встречаемости генов вирулентности и ЛАРО-фрагментов.

Впервые установлена взаимосвязь между фенотипами вирулентности и ЯАРО-фенотипами северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы.

В отличие от существующих исследований, впервые проведено сравнение северокавказской популяции с географически отдаленной популяцией по ДНК-маркерам.

Практическая значимость работы. Результаты ежегодных маршрутных обследований государственных сортоучасков, производственных и селекционных посевов пшеницы предлагаются для

фитосанитарного картирования бурой ржавчины на Северном Кавказе в качестве корректной основы для прогноза развития болезни.

Выявленные эффективные гены устойчивости пшеницы к P. triticina (L'r9, Lr24) предлагаются для использования в селекции.

Созданный набор ДНК изолятов возбудителя бурой ржавчины пшеницы, а также подход сравнительной оценки двух методов предлагается для использования в работе научно-исследовательских учреждений.

Новая научная информация о структуре популяции P. triticina по RAPD-полиморфизму и взаимосвязи с вирулентностью предлагается для включения в курсы лекций по популяционной биологии грибов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Северокавказская популяция Puccinia triticina по фенотипам вирулентности и RAPD-фенотипам обладает высоким разнообразием.

2. Установлена взаимосвязь вирулентности и RAPD-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы.

3. Предложен новый подход сравнительной оценки двух методов исследования структуры популяции P. triticina.

Место проведения работы и декларация личного участия автора. Диссертационная работа выполнена на базе Всероссийского НИИ биологической защиты растений в период с 2007 по 2011 гг. в лаборатории иммунитета зерновых культур к грибным болезням. В основу работы положены результаты исследований структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы по вирулентности и RAPD-полиморфизму, полученные лично автором или с его непосредственным участием.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований доложены на восьмой региональной, I и III Всероссийской научно -практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, КГАУ- 2006, 2007,2009 гг.); IV Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (Анапа, 2007 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей» (Одесса, 2007 г.); 15 Congress of European mycologists (St. Peterburg, 2007); 9th International Congress of Plant Pathology (Torino, Italy, 2008); Международной научной конференции, посвященной 45-летию основания Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Минск, 2010 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИБЗР «Биологическая защита растений как основа

экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2010 г.); Международной конференции «Студен™ и аспиранты в науке 2011», проводимой в рамках Дней молодежной науки в Оренбургской области (Оренбург, 2011 г.).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе три - в журналах, рекомендованных ВАК РФ: «Научный журнал КубГАУ» (электронный ресурс), «Известия Оренбургского государственного аграрного университета», «АгроЭкоИнфо» (электронный журнал).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы, практических рекомендаций и приложения. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 27 рисунками. Список использованных источников включает 241 наименование, из них 192 работы иностранных авторов.

Связь работы с государственными научными программами, грантами, конкурсами. Диссертационная работа выполнена в рамках государственной программы Россельхозакадемии по заданию 05: «Разработать агротехнологии интегрированной защиты растений, использования ассортимента биобезопасных, экологических и экономически эффективных химических и биологических средств защиты растений нового поколения, сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредным организмам, и на их основе региональных систем управления процессами фитосанитарного оздоровления агроценозов товаропроизводителей различных форм собственности», тема 05.03.01.01., номер государственной регистрации 01201054063.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе приводятся данные литературы отечественных и зарубежных авторов о распространении возбудителя бурой ржавчины пшеницы, о структуре популяции гриба по вирулентности и ДНК-полиморфизму. Также рассмотрены основные типы ДНК-маркеров применительно к фитопатогенным грибам и проанализирована взаимосвязь между вирулентностью и полиморфизмом по ПАРО-маркерам у ржавчинных грибов.

ГЛАВА 2. МЕСТО, УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Место и условия проведения исследований.Научно-исследователь-ская работа выполнялась во Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук с 2007 по 2011 гг.

Мониторинг развития и сбор инфекционного материала возбудителя бурой ржавчины пшеницы проводили в трех основных зернопроизводящих регионах Северного Кавказа: Краснодарском, Ставропольском краях и Ростовской области.

Исследования популяции патогена по вирулентности проводили в теплице при благоприятных для развития P. triticina условиях -температура в пределах от плюс 18 до плюс 22 С с продолжительностью светового дня не более 16 ч. Интенсивность освещения 13-15 тысяч люкс. Относительная влажность воздуха при проведении работ была 60-70 %.

Погодные условия в период проведения исследований были различными. Так, 2007 и 2009 гг. были крайне засушливыми и неблагоприятными для развития патогенов на пшенице. Условия 2008 и 2010 гг. способствовали развитию заболевания. Наиболее благоприятным годом для развития возбудителя бурой ржавчины пшеницы стал 2010 г.: в апреле среднемесячные показатели температуры воздуха (Т) составили 11,8 °С, относительной влажности воздуха (f) - 76,1 %, сумма осадков (£г) - 62,0 мм; в мае Т - 19,1 °С, f- 73 %, S,- 3,2 мм; в июне Т - 24,6 °С, f- 74 %, Zr -23,6 мм.

2.2 Объекты исследований. Объектом исследований служил инфекционный материал P. triticina, собранный в пяти агроклиматических зонах Северного Кавказа в 2007-2010 гг., а также в Ленинградской области в 2007 г.

Для изучения популяции P. triticina по вирулентности использовали северо-американский набор близкоизогенных линий, полученных на основе возвратных скрещиваний восприимчивого сорта Thatcher (см. табл. 2).

Для оценки структуры популяции по ДНК-полиморфизму материалом служила ДНК, выделенная из монопустульных изолятов северокавказской и ленинградской популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы (всего проанализировано 317 монопустульных изолятов гриба).

2.3 Методы исследований. Для оценки распространения и интенсивности развития болезни в период 2007-2010 гг. в фазу молочно-восковой спелости зерна были проведены маршрутные обследования Государственных сортоучастков и производственных посевов пшеницы в

пяти агроклиматических зонах Северного Кавказа. При сборе инфекционного материала растения обследовали в десяти точках, расположенных по диагонали поля примерно на равных расстояниях друг от друга. На посевах ГСУ оценивали каждую делянку в четырех повторностях. При этом руководствовались правилом Грина (Green, 1971): соотношение изолят - фенотип должно быть равно 20:1. Распространение болезни оценивали по общепринятой методике (Санин и др., 2002). Для оценки интенсивности развития болезни использовали шкалу Петерсона с соавт. (1948). Сбор, хранение, выделение монопустульных изолятов Р. triticina проводили по рекомендациям ВНИИФ (1977). Идентификацию монопустульных изолятов гриба вели согласно северо-американской номенклатуре по Kolmer (1989). Типы реакции близкоизогенных линий оценивали по шкале Майнса и Джексона (1926). Выделение ДНК из урединиоспор гриба проводили по методике Chen (Chen, Line, Leung, 1993), а полимеразную цепную реакцию - по протоколу Kolmer (Kolmer, Liu, Sies, 1995). В работе использовали три праймера, рекомендованные Kolmer (Kolmer, Liu, Sies, 1995) и отобранные после предварительного скрининга на информативность и воспроизводимость продуктов амплификации: UBC 450, UBC 517 и OPA 18. Электрофорез проводили в 1,5 % агарозном геле по общепринятой методике (Тютерев, Евстигнеева, 2001). Уровень различия между популяциями патогена определяли по индексу Роджерса (Rogers, 1972), уровень разнообразия популяции - по индексу Шеннона (Афанасенко, 1998; Kolmer et al., 2003). Для проведения кластерного анализа использовали программу Statistica 6.0. В качестве метода кластеризации был выбран UPGMA, в качестве меры расстояния - квадрат эвклидовых расстояний. Коэффициент корреляции рассчитывали в программе DIASTA.

ГЛАВА 3. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И РАЗВИТИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ

3.1 Развитие Puccinia triticina в различных агроклиматических зонах Северо-Кавказского региона. В ходе маршрутных обследований, проведенных в фазу молочной спелости зерна пшеницы, были оценены на пораженность Р. triticina посевы озимой пшеницы на Госсортоучастках (Северский, Лабинский, Зеленокумский, Ачикулакский, Ейский, Кущевский, Целинский), опытных станциях (Ленинградская, п/о «Ботаника») и участках селекционных учреждений (Зерноградский селекционный участок), принадлежащих к различным агроклиматическим зонам Северного Кавказа. Также были обследованы производственные посевы пшеницы в различных районах региона.

2007 г. был экстремальным для развития патогенов на зерновых культурах, поэтому в период обследования бурая ржавчина зафиксирована на естественном инфекционном фоне с низким процентом развития (таблица 1). Максимальное развитие болезни (до 5 %) наблюдалось в западной приазовской зоне. В южной предгорной, восточной степной и северной зонах степень развития болезни не доходила до 1 %.

Таблица 1 - Степень развития бурой ржавчины в различных агроклиматических зонах Северного Кавказа в фазу молочной спелости _зерна пшеницы (2007-2010 гг.)_

№ Агроклиматические зоны Средняя степень развития болезни, %

зоны 2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.

1 Южная предгорная 0,3 3,0 2,0 4,0

2 Западная приазовская 5,0 8,0 3,0 4,0

3 Центральная 1,0 4,0 1,0 9,0

4 Восточная степная 0,3 2,0 ед.п* 13,0

5 Северная 0,1 _ 1,0 ед.п 5,0

* -единичные пустулы

В 2008 г. погодные условия были более благоприятны для развития патогенов. Максимальное развитие болезни (8 %) отмечено в западной приазовской зоне. В центральной зоне степень поражения составила 4 %, но некоторые зарубежные сорта (п/о «Ботаника») поразились до 60 % (например, сорт Arfort).

Вегетационный сезон 2009 г. характеризовался недобором осадков, и в зонах недостаточного увлажнения (восточной степной и северной) были отмечены только единичные пустулы патогена. Максимальная степень развития Р. triticina (3 %) отмечена в западной приазовской зоне (сорта Донская Лира и Кранодарская 99 на Ейском ГСУ были поражены бурой ржавчиной до 40 %). В центральной зоне, несмотря на низкую степень развития болезни на большинстве производственных посевов, отдельные сорта поражались бурой ржавчиной на 50-60 % (например, сорт Jones Tife, п/о «Ботаника»).

Весна 2010 г. отмечена значительными осадками в апреле и недобором осадков в мае и июне. Развитие бурой ржавчины на естественном фоне на момент обследования было выше по сравнению с предыдущими годами. Максимальное развитие болезни наблюдалось в восточной степной зоне (13 %); в южной предгорной, западной приазовской и северной зонах степень развития составила 4-5 %. Но встречались отдельные сорта, имеющие высокую степень поражения в данных зонах. Так, например, сорта Регата,

Зимтра и Паллада в Северском ГСУ (южная предгорная зона) поражались бурой ржавчиной на 70-90 %; сорт Евклид (Ейский ГСУ, западная приазовская зона) - на 70 %; сорта Юлиус, Матрикс, Норд 128 (Целинский ГСУ, северная зона) - на 70 %.

В результате изучения распространенности и развития возбудителя бурой ржавчины пшеницы на Северном Кавказе установлено, что во все годы исследования распространенность болезни была повсеместной. Развитие заболевания было разным за период исследования, т. к. погодные условия вегетационных сезонов сильно отличались, и составило от единичных пустул до 13 %.

ГЛАВА 4. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ

РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ ПО ПРИЗНАКУ ВИРУЛЕНТНОСТИ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ

4.1 Характеристика северокавказской популяции РиссШа Ыйста по генетической структуре и фенотипическому составу. Изучение вирулентности северокавказской популяции Р. 1гП1с1па проведено на наборе из 16-ти близкоизогенных линий, полученных на основе сорта Тэтчер. Использование такого набора было сделано для упрощения сравнительного анализа четырехбуквенных фенотипов вирулентности и ЯАРО-фенотипов по аналогии с исследованиями других ученых (Ко1шег, 1995; 2000).

По результатам идентификации северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы установлено ее высокое феноти-пическое разнообразие. Индекс Шеннона по фенотипам вирулентности в годы исследований составил 3,89; 4,06; 4,89 и 4,28, соответственно.

Всего за период исследований проанализировано 317 изолятов северокавказской популяции, из которых выявлено 232 фенотипа вирулентности. При сравнении фенотипического состава по годам найдено 19 фенотипов, которые повторяются как минимум в двух годах (таблица 2).

Только фенотип КН11(3 встречается каждый год в течение четырех лет исследований, два фенотипа (РС11(3, КСК.С>) встречаются в трех годах, остальные фенотипы повторяются дважды. 11 фенотипов являются общими для популяции патогена 2008 и 2010 гг.

Таблица 2 - Общие фенотипы Р. 1гШс 'та в северокавказской популяции _(2007-2010 гг.) _

! Фенотип вирулентности Количество изолятов с данным фенотипом в северокавказской популяции Р. (гШста, шт.

2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.

кило 3 1 1 2

РШБ 0 0 1 1

РНББ 0 1 1 0

ВВВВ 0 1 1 0

ксяо 0 1 1 1

квяо 0 0 1 1

РОК} 1 3 0 3

КНЯБ 2 0 0 3

сняд 0 1 0 1

рняс> 0 1 0 1

РСТБ 0 1 0 1

FHTN 0 0 1

мнтт 0 1 0 1

рнтд 0 1 0 1

ТвТБ 0 1 0 I

тило 0 1 0 1

рсдд 1 1 0 0

ОШ8 1 1 0 0

ротт 1 1 0 0

Частота встречаемости генов вирулентности в северокавказской популяции 2007-2010 гг. представлена в таблице 3. Во все годы исследований в северокавказской популяции гриба отмечена высокая частота вирулентных изолятов к большинству из изученных генов Ьг: 2с, 3, 16, Зка, 11, 17, В, 10, 14а. Увеличилась частота вирулентных изолятов к гену Ьг26. Частота встречаемости изолятов с генами Ьг: 1, 2а, 18 варьирует по годам. Не обнаружено изолятов, вирулентных к гену Ьг9. В 2009-2010 гг. стали появляться единичные изоляты, вирулентные к Ьг24. Можно сделать вывод, что северокавказская популяция Р. пШста представлена большим количеством вирулентных изолятов.

У изолятов северокавказской популяции Р. ¡гШста можно заметить, что фенотипы с малым (0-5) и большим (12-16) количеством генов вирулентности составляют наименьший процент (таблица 4). Наибольший процент в популяции гриба на Северном Кавказе составляют фенотипы, содержащие от 6 до 11 генов вирулентности из 16 изученных. Это подтверждает сделанный ранее другими авторами вывод о том, что наиболее конку-

рентоспособными при отборе являются изоляты со средним количеством генов вирулентности (Берлянд-Кожевников и др., 1978).

Таблица 3 - Генетическая структура изолятов Р. (гШста из Северного Кавказа (2007-2010 гт.)_

ГенЬг Частота вирулентных изолятов Р. тйс'та, %

2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.

1 60,0 32,3 67,7 58,8

2а 27,5 15,4 63,4 38,7

2с 57,5 81,5 83,9 85,7

3 82,5 89,2 72,3 78,2

9 0,0 0,0 0,0 0,0

16 67,5 70,8 58,8 64,7

24 0,0 0,0 1,1 1,7

26 47,5 84,6 69,9 71,4

Зка 85,0 86,2 73,1 86,6

11 80,0 92,3 75,3 94,1

17 70,0 56,9 43,0 71,4

30 80,0 84,6 9,7 94,1

В 85,0 87,7 51,6 87,4

10 75,0 84,6 60,2 84,0

14а 57,5 53,9 53,8 65,6

18 47,5 10,8 29,0 5,9

Таблица 4 - Фенотипы северокавказской популяции Р. IгШста с разным количеством генов вирулентности (2007-2010 гг.)_

Фенотипы с разным количеством генов вирулентности рр Частота встречаемости изолятов северокавказской популяции/*. ¡гШстас разным количеством генов вирулентности, %

2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.

0-5 2,6 4,6 12,9 1,7

6-11 86,9 75,4 84,9 78,2

12-16 10,5 18,5 2,2 13,5

Для изучения динамики северокавказской популяции Р. /гШста было проведено сравнение популяций 2007-2010 гг. по частоте встречаемости генов вирулентности и фенотипов вирулентности по индексу Роджерса (таблица 5).

За все годы исследований индекс Рождерса между популяциями патогена по частоте встречаемости генов вирулентности показывает незначительные различия (11=0,07-0,26), в то время как по частоте встречаемости фенотипов вирулентности различия во всех случаях довольно высоки (11=0,78-0,99).

Из полученных данных можно заключить, что генетическая структура северокавказской популяции патогена в целом остается неизменной, а меняются лишь сочетания генов вирулентности, т. е. изменчивость имеет не мутационный, а комбинативный характер.

Таблица 5 - Уровень различия по частоте генов вирулентности и фенотипов

вирулентности в популяции Р. ¡гШста (2007-2010 гг.) _ (по индексу Роджерса)_

Индекс Роджерса по фенотипам вирулентности Индекс Роджерса по генам вирулентности

северокавказская популяция Р. (гШста 2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.

2007 г. 0,10 0,26 0,08

2008 г. 0,91 0,26 0,07

2009 г. 0,99 0,98 0,14

2010 г. 0,92 0,78 0,96

Исследования структуры популяции Р. IгШста из различных агроклиматических зон Северного Кавказа проводили в 2009-2010 гг. (таблица 6). Изоляты гриба были сравнены по частоте встречаемости генов и фенотипов вирулентности. В результате найдено, что по генам вирулентности различия между агроклиматическими зонами в каждом году незначительны (значение индекса Роджерса меняется от 0,06 до 0,24), а по фенотипам фирулентности - максимальны (11=0,80-1,0).

Таблица 6 - Различия (по индексу Роджерса) популяции возбудителя бурой

ржавчины пшеницы по фенотипам вирулентности и генам вирулентности из различных агроклиматических зон Северного Кавказа (2009-2010 гг.) _

Сравниваемые агроклиматические зоны Северного Кавказа Фенотипы вирулентности Гены вирулентности

2009 г. 2010 г. 2009 г. 2010 г.

1-2 1,00 0,86 0,20 0,06

1-3 1,00 0,82 0,13 0,08

1-4 1,00 0,96 0,19 0,06

1-5 1,00 0,96 0,24 0,10

2-3 1,00 0,90 0,14 0,07

2-4 1,00 0,92 0,20 0,06

2-5 1,00 0,80 0,21 0,08

3-4 1,00 0,92 0,12 0,07

3-5 1,00 0,86 0,16 0,08

4-5 1,00 0,93 0,13 0,10

Примечание: цифрами от 1 до 5 обозначены агроклиматические зоны, как показано в таблице 1.

4.2 Сравнительная характеристика по вирулентности изолятов Р. иШс'ти из Северного Кавказа и Ленинградской области. Для сравнительного анализа вирулентности географически отдаленных популяций Р. IгШста использовали изоляты северокавказской и ленинградской популяций гриба. Индекс Шеннона по фенотипам вирулентности для исследуемых популяций патогена составил 3,89 и 3,58, соответственно, что указывает на высокий уровень разнообразия обеих популяций по фенотипическому составу.

Частота встречаемости генов вирулентности для изолятов из двух регионов приведена в таблице 7. Для изолятов обоих регионов отмечено высокое содержание клонов (40 % и выше), вирулентных к Ьг: 1, 2с, 3, 16, 26, Зка, 11, 17, 10. Среди изолятов из Северного Кавказа также много клонов, вирулентных к Ьг: 30, В, 14а и 18. Выборка изолятов из Ленин-градской области содержит большое количество клонов, вирулентных к Ьг2а, и обнаружены изоляты, вирулентные к Ьг24. Индекс Роджерса между изолятами двух регионов составил 0,15, что свидетельствует о незначительных различиях по генетическому составу.

Таким образом, найден высокий уровень разнообразия изолятов данных регионов по фенотипическому составу, несмотря на небольшую разницу в генетической структуре. Полученные результаты еще раз подтверждают мнение ряда исследователей (Г. К. Сорокина и др., 1990) о том, что северокавказская популяция входит в состав обширной европейской, являясь субпопуляцией.

Таблица 7 - Генетическая структура изолятов Р. IгШста из Северного __Кавказа и Ленинградской области (2007 г.)_

ген Lr Частота в клонов(% на теп ирулентных ), собранных ритопии ген Lr Частота bi клонов (%' на Teni фулентных ,собранных эитооии

Северного Кавказа Ленинградской области Северного Кавказа Ленинградской области

1 60,0 66,7 Зка 85,0 69.4

2а 27,5 47,2 11 80,0 75,0

2с 57,5 72,2 17 70,0 58,3

3 82,5 83,3 30 80,0 38,9

9 0,0 0,0 В 85,0 38,9

16 67,5 61,1 10 75,0 61,1

24 0,0 2,8 14а 57,5 38,9

26 67,5 58,3 18 47,5 36,1

ГЛАВА 5. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ ПО RAPD-ПОЛИМОРФИЗМУ

5.1 Характеристика северокавказскои популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы по RAPD-фрагменгам и молекулярным фенотипам. В анализ были включены 317 ДНК изолятов северокавказской популяции Р. triticina 2007-2010 гг. Были использованы три праймера, отобранные после предварительного скрининга на информативность и воспроизводимость продуктов амплификации: UBC 450, UBC 517 и OPA 18. Каждый из трех праймеров показал полиморфизм RAPD-фрагментов. RAPD-спектры фрагментов ДНК изолятов северокавказской популяции Р. triticina с праймером OPA 18 показаны на рисунке 1.

а) б)

Рисунок 1 - RAPD-профили изолятов северокавказской популяции Р.

ínfí'cí/м.Цифрами обозначены различные изоляты популяции гриба а) 2008 г. б) 2009 г. (праймер ОРА18), М - маркер молекулярной массы Gene Ruler, 50 b.p.

Для наиболее объективной информации каждому изоляту по трем праймерам был присвоен трехзначный индекс, обозначающий молекулярный фенотип, в котором первая цифра отражает праймер UBS 450, вторая - UBS 517 и последняя - OPA 18. Цифрами от 1 до 9 были обозначены различные варианты сочетания RAPD-паттернов (таблица 8).

С возрастанием нумерации убывает встречаемость изолятов с данным фенотипом. Всего было найдено 58 молекулярных фенотипов у изученных изолятов северокавказской популяции 2007-2010 гг.

Таблица 8 - Система обозначения трехзначных RAPD-фенотипов P. triticina

Присутствие RAPD-фрагмента Отсутствие указанного фрагмента

В таблице 9 приведены RAPD-фенотипы, которые повторялись в популяции гриба 2007-2010 гг. два и более раз.

Общим для всех изученных групп изолятов является RAPD-фенотип 111, который и самый распространенный в каждой группе. Различные RAPD-фенотипы показали не только изоляты с различной, но и с одинаковой формулой вирулентности. Это еще раз подтверждает аналогичные результаты других исследователей и 'свидетельствует о том, что данные фитопатологического тестирования могут быть дополнены информацией, полученной по молекулярным маркерам. Разнообразие северокавказской популяции P. triticina по RAPD-полиморфизму ниже по сравнению с вирулентностью, но все же на достаточно высоком уровне. Индекс разнообразия Шеннона по молекулярным фенотипам для популяции 2007, 2008,2009 и 2010 гг. составил 1,28; 2,48; 2,69 и 3,35, соответственно.

Таблица 9 - Общие ЛАРО-фенотипы ДНК изолятов северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы 2007-2010 гг.

Количество изолятов с данным

ЛАРО-фенотип фенотипом в северокавказской популяции Р. нШста, шт.

2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.

иве 450 иВС 517 ОРА 18

1 5 1 0 0 5 1

1 4 1 0 1 5 0

1 1 1 5 5 15 11

5 1 5 0 0 2 1

1 5 5 1 0 2 2

1 1 5 0 0 7 2

5 1 1 0 0 4 1

2 1 2 0 0 3 3

2 1 1 3 0 2 3

2 3 1 0 0 1 1

1 3 1 0 0 2 I

4 1 2 0 5 0 3

1 1 2 0 5 0 6

4 1 1 1 4 0 5

1 2 2 0 2 0 4

Для установления сходства или различия северокавказской популяции 2007-2010 гг. по молекулярным фенотипам и НАРО-фрагментам было проведено попарное сравнение по частоте встречаемости указанных признаков (таблица 10).

По частоте встречаемости КАРО-фрагмснтов в северокавказской популяции Р. 1гШста 2007, 2008, 2009, 2010 гг. установлена средняя степень различий (11=0,25-0,50). По частоте встречаемости ЯАРВ-фенотипов во всех случаях индекс Роджерса показывает высокую степень различий (11=0,69-0,81), за исключением пары 2008-2010 гг. (11=0,58).

Для установления взаимосвязи между фитопатологическим и молекулярно-генетическим методами исследования структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы была посчитана корреляция между показателями индекса Роджерса по фенотипам вирулентности и ЯАРО-фенотипам. В результате была найдена значимая корреляция между двумя показателями (г=0,72). Что касается КАРО-фрагментов и генов вирулентности, то была обнаружена средняя положительная корреляция между данными признаками (г=0,39).

Таблица 10 - Уровень различия по молекулярным фенотипам и ИАРО-фрагментам в популяции Р. иШс'та в 2007-2010 гг. (по _ индексу Роджерса)_

Индекс Роджерса по 11АРО-фрагментам

о с 2 та « " с О. к О) С * 2 ч я о <и а, •©• северокавказская популяция Р. ?гШста 2007 г. 2008 г. 2009 г. 2010 г.

2007 г. 0,32 0,45 0,50

о О * К 2008 г. 0,76 0,25 0,50

¡Я* 2009 г. 0,70 0,81 0,26

2010 г. 0,74 0,58 0,69

Для популяции гриба из пяти агроклиматических зон 2009 и 2010 гг. было проведено попарное сравнение индекса Роджерса по частоте встречаемости ЯАРО-фрагмснтов и ЯАРО-фенотипов. Сравнение проводили как между всеми парами зон в пределах каждого года, так и между каждой из зон между годами. Результаты сравнения представлены в таблице 11.

По КАРО-фрагментам между агроклиматическими зонами был найден низкий и средний уровень различий (11=0,22-0,64). По каждой из зон между годами индекс Роджерса по КАРО-фрагментам показывал среднюю степень различий (11=0,33-0,52) и в одном случае - высокую (в западной приазовской зоне) (11=0,71).

Эти данные не совпадают с данными по генам вирулентности, что вполне объяснимо, поскольку КАРЭ-фрагменты по трем праймерам отражают генетическую изменчивость патогена в целом, а не только по признаку вирулентности.

Что касается фенотипического состава, то как в случае фенотипов вирулентности, так и молекулярных фенотипов найдена средняя и высокая степень различий популяции гриба из разных агроклиматическими зон (11=0,56-1,00). Это еще раз подтверждает высокую адаптационную способность патогена к меняющимся абиотическим и биотическим факторам. К тому же северокавказская популяция Р. &Шста всегда отличалась от остальных своим разнообразием по фенотипическому составу (Волкова с соавт., 2005; Анпилогова с соавт., 2011). Это связано с близостью региона к закавказскому генетическому центру происхождения

пшеницы, а также с разнообразием высеваемых сортов пшеницы, благоприятными для развития патогена погодными условиями.

Таблица 11 - Различия (по индексу Роджерса) по ИАРО-фрагмснтам и !1АРО-фенотипам северокавказской популяции возбудителя бурой гжавчины пшеницы из разных агроклиматических зон (2009-2010 гг.)

Агроклиматические зоны ЛАРО- фенотипы 11АРО-фрагменты

2009 г. 2010 г. 2009 г. 2010 г.

1-2 0,89 0,66 0,42 0,47

1-3 1,00 0,67 0,48 0,42

1-4 0,56 1,00 0,44 0,45

1-5 0,67 0,77 0,34 0,38

2-3 0,92 0,75 0,64 0,22

2-4 0,93 1,00 0,50 0,23

2-5 0,77 0,59 0,63 0,32

3-4 1,00 0,93 0,48 0,30

3-5 0,87 0,82 0,35 0,27

4-5 0,71 1,00 0,41 0,30

5.2 Сравнительная характеристика возбудителя бурой ржавчины пшеницы из Северного Кавказа и Ленинградской области по ДНК-полиморфизму. Проведено сравнение ДНК изолятов гриба из Ленинградской области и Северного Кавказа популяций патогена 2007 г. Индекс Роджерса по ЯАРВ-фрагментам составил 0,1, что указывает на незначительные отличия изолятов двух регионов по наличию мажорных фрагментов. При сравнении по молекулярным фенотипам, индекс Роджерса составил 0,73, что указывает на высокую степень различия между изолятами из двух регионов по этому показателю. Полученные значения индекса Роджерса по НАРО-фенотипам и по ДНК-фрагментам аналогичны таковым по фенотипам вирулентности и генетическому составу. Из этого следует, что два метода исследования изолятов Р. ггМста по вирулентности и ДНК-полиморфизму не противоречат, а дополняют друг друга и еще раз подтверждают тот факт, что различия между изолятами из двух изученных регионов основаны лишь на фенотипическом составе, т. е. незначительны. Значительных отличий в генетической структуре и составе мажорных фрагментов не найдено, что является подтверждением вывода, сделанного на основе данных по вирулентности.

ГЛАВА 6. ВЗАИМОСВЯЗЬ ВИРУЛЕНТНОСТИ И 1*АРО-ПОЛИМОРФИЗМА СЕВЕРОКАВКАЗСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ

6.1 Взаимосвязь вирулентности и КАРБ-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы. Для

сравнения результатов двух методов исследования патогена был проведен кластерный анализ северокавказской популяции Р. ггШста 2009 и 2010 гг. (рисунки 2,3). Кластеризацию проводили по фенотипам вирулентности и молекулярным фенотипам.

При сравнении дендрограмм по вирулентности и ДНК-полиморфизму популяции Р. IгШста 2009 г. можно отметить общую особенность: изоляты из восточной степной и северной зон обособлены в отдельные кластеры. Та же тенденция наблюдается и для обеих дендрограмм популяции 2010 г.

9 мм.,..,..,.................,,,,.,,................................................

Рис. 2 - Дендрограмма различия вирулентности фенотипов северокав-

казской популяции Р. /гШста 2010 г. 10

КАРО-фенотипы

Рис. 3 - Дендрограмма различий молекулярного полиморфизма фенотипов северокавказской популяции Р. ¡гШста 2010 г.

Изоляты Р. КШста восточной степной и северной агроклиматических зон Северного Кавказа отличаются от остальных как по фенотипам вирулентности, так и по молекулярным фенотипам. Это может быть связано с различными условиями для развития патогена в данных зонах, а также с устойчивостью высеваемых сортов.

В результате проведенной кластеризации по фенотипам вирулентности и ЯАРВ-фенотипам наблюдалось совпадение числа и состава кластеров. Также наблюдалась связь образуемых кластеров с агроклиматическими зонами. Это свидетельствует о взаимосвязи двух методов исследования структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы, что подтверждается сравнительным анализом северокавказской популяции патогена по частоте фенотипов вирулентности и КАРО-фенотипов, а также корреляционным анализом.

выводы

1. В ходе маршрутных обследований Государственных сортоучастков, производственных и селекционных посевов пшеницы, проведенных в 20072010 гг. в пяти агроклиматических зонах Северного Кавказа в фазу молочной спелости зерна, установлено повсеместное распространение бурой ржавчины. Развитие болезни составило от единичных пустул до 13 %.

2. Установлено высокое фенотипическое разнообразие в северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы. Наибольший процент (81,3) в популяции гриба составляют фенотипы, содержащие от 6 до 11 генов вирулентности из 16 изученных.

3. Выявлены незначительные различия по частоте генов вирулентности (11=0,07-0,26) и существенные - по частоте фенотипов вирулентности (11=0,78-0,99) в популяции Р. /гШста из разных агроклиматических зон Северного Кавказа в 2007-2010 гг.

4. Сравнение изолятов возбудителя бурой ржавчины пшеницы из Северного Кавказа и Ленинградской области по вирулентности и ЯАРБ-полиморфизму показало незначительные различия по частоте генов вирулентности (11=0,15) и КАРБ-фрагментов (11=0,10); высокий уровень различий по фенотипам вирулентности (11=1,00) и ЯАРЭ-фенотипам (11=0,73), что подтверждает мнение Г. К. Сорокиной и соавторов (1990), что северокавказская популяция входит в состав обширной европейской, являясь ее субпопуляцией.

5. Установлена средняя степень различий по частоте ЯАРО-фрагментов (11=0,25-0,50) и высокая - по частоте НАРБ-фенотипов (11=0,69-0,81), за исключением пары 2008-2010 гг., северокавказской популяции Р. ¡гШста, что согласуется с данными по частоте фенотипов вирулентности.

6. Выявлен низкий и средний уровень различий по частоте ЯАРО-фрагментов в популяции гриба из различных агроклиматических зон (11=0,22-0,64), средний и высокий - по частоте ЛАРО-фенотипов (11=0,56-1,00), что согласуется с данными по вирулентности.

7. Обнаружена высокая положительная корреляция между значениями индекса Роджерса по частоте фенотипов вирулентности и ЯАРО-фенотипов (г=0,72) в северокавказской популяции Р. IгШста, что свидетельствует о взаимосвязи двух признаков.

8. В результате проведенной кластеризации изолятов возбудителя бурой ржавчины пшеницы из различных агроклиматических зон Северного Кавказа было выявлено совпадение образуемых кластеров при обоих подходах и их связь с зонами. Изоляты гриба из восточной степной и северной зон как по вирулентности, так и по ЛАРО-полиморфизму обособились в отдельные кластеры.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты ежегодных маршрутных обследований государственных сортоучастков, производственных и селекционных посевов пшеницы предлагаются для фитосанитарного картирования бурой ржавчины на Северном Кавказе в качестве корректной основы для прогноза развития болезни.

Выявленные эффективные гены устойчивости пшеницы к Р. triticina (Lr9, Lr24) предлагаются для использования в селекции.

Новая научная информация о структуре популяции Р. triticina по RAPD-полиморфизму и его взаимосвязи с вирулентностью предлагается для включения в курсы лекций по популяционной биологии грибов

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Кудинова O.A., Кремнева О.Ю., Волкова Г.В. Вирулентность и ДНК-полиморфизм изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области /7 Научный журнал КубГАУ. - 2010. - №62(08). -http://ei.kubagro.ru/2010/62/pdf/l 5pdf. - 0420700012X0043.

2. Кудинова O.A., Кремнева О.Ю., Волкова Г.В. Изменчивость популяции Puccinia triticina по вирулентности и ДНК-полиморфизму в различных агроклиматических зонах Северного Кавказа // «АгроЭкоИнфо» (электронный журнал). - 2011. - №2. http://agroecoinfo.narod.ru/iournal/STATYl/201 l/2/st 23.doc.

3. Кудинова О, А. Динамика северокавказской популяции бурой ржавчины пшеницы (возбудитель - Puccinia triticina) по вирулентности и ДНК-полиморфизму // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2011. -№ 3(31). - С. 63-65.

Публикации в других изданиях

4. (Кудинова O.A., Волкова Г.В.) Швец O.A., Волкова Г.В. Методы определения структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы {Puccinia triticina Erikss.) // Материалы восьмой региональной научно -практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». Краснодар. — КГАУ. - 2006. - С. 131 — 132.

5. (Кудинова О. А.) Швец O.A. Применимость методов молекулярно-

генетического анализа для изучения структуры популяции бурой ржавчины // Труды 4-й всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах». Анапа. - 2007. - С. 102 - 103.

6. (Кудинова O.A., Волкова Г.В., Киль В.И.) Швец O.A., Волкова Г.В., Киль В.И. Молекулярно-генетический полиморфизм популяций возбудителей ржавчины пшеницы И Тезисы докладов международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы иммунитета и зашиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей». - Одесса - 2007 -С. 38.

7. (Кудинова O.A., Волкова Г.В.) Швец O.A., Волкова Г.В. Вирулентность популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы в различных агроклиматических зонах Северного Кавказа // Материалы первой всероссийской научно - практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». Краснодар. - КГАУ - 2007. -С. 109-110.

8. (Volkova G.V., Kil V.l., Kudinova O.A) Volkova G.V., Kil V.l., Shvetc O.A. DNA polymorphisms of leaf rust pathogen and other wheat rust species according to RAPD markers // Abstracts «15 Congress of European mycologists». - Saint Petersburg - 2007. - P. 268-269.

9. . Volkova G.V., Anpilogova L.K., Kudinova O.A., Kremneva O.J. Characterization of leaf rust population genetics in the North-Caucasian region of Russia in 2006 // 9th International Congress of Plant Pathology. Abstracts. -Torino. - 24-29 August. - 2008. - P. 248.

10. Кудинова O.A., Кремнева О.Ю. RAPD-полиморфизм северокавказской популяции Puccinia triticina в 2008 году // Материалы третьей всероссийской научно - практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса». Краснодар. - КГАУ-2009.-С. 157-158.

11. Кудинова O.A., Кремнева О.Ю., Волкова Г.В. Использование RAPD-маркеров в изучении структуры популяции Puccinia triticina // Материалы международной научной конференции, посвященной 45-летию основания Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» - Минск. -2010.-С. 118.

12. Кудинова O.A., Волкова Г.В., Кремнева О.Ю., Ваганова О.Ф. Вирулентность и молекулярный полиморфизм Puccinia triticina на Северном Кавказе // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИБЗР «Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем» - Краснодар. - 2010. - С. 576-582.

Подписано в печать 14.03.2012 г. Бумага офсетная Печ. л. 1 Тираж 100 экз.

Формат 60x84 1/16 Офсетная печать Заказ №207

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Кудинова, Ольга Александровна, Краснодар

61 12-3/1154

Российская академия сельскохозяйственных наук

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (ГНУ ВНИИБЗР РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ)

На правах рукописи

УДК 633.11:632.938

КУДИНОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЗАИМОСВЯЗЬ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ЯАРО-ПОЛИМОРФИЗМА СЕВЕРОКАВКАЗСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ

РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ

Специальность: 06.01.07 - защита растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата

биологических наук Научный руководитель

доктор биологических наук Волкова Г.В.

Краснодар - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Распространенность возбудителя бурой ржавчины пшеницы.......................................................................10

1.2 Исследования популяции РисЫта Мйста по признаку вирулентности............................................................17

1.3 Использование ДНК-маркеров для анализа генетической изменчивости ржавчинных грибов.................................29

1.4 ИАРО-анализ Р. МНста...............................................36

1.5 Корреляция методов исследования структуры

популяций патогенов....................................................37

ГЛАВА 2. МЕСТО, УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Место и условия проведения исследований.......................41

2.2 Объекты исследований.................................................47

2.3 Методы исследований.................................................48

ГЛАВА 3. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И РАЗВИТИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ

БУРОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ 3.1 Развитие Р. 1гШста в различных агроклиматических зонах

Северо-Кавказского региона...........................................60

ГЛАВА 4. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ ПО ПРИЗНАКУ ВИРУЛЕНТНОСТИ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ 4.1 Характеристика северокавказской популяции

Р. Ыйста по генетической структуре и стенотипическому составу..............................................................................65

4.2 Сравнение по вирулентности изолятов Р. МИста из Северного Кавказа и Ленинградской области....................71

4.3 Сравнительная характеристика изолятов гриба из Северного Кавказа и Омской области...............................74

ГЛАВА 5. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ

РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ ПО ЯДРО-ПОЛИМОРФИЗМУ

5.1 Характеристика северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины по КАРБ-фрагментам

и КАРБ-фенотипам....................................................77

5.2 Сравнительный ПЦР-анализ изолятов возбудителя бурой ржавчины из Северного Кавказа и Ленинградской области по ЛАРО-маркерам...........................................88

ГЛАВА 6. ВЗАИМОСВЯЗЬ ВИРУЛЕНТНОСТИ И КАРБ-ПОЛИМОР-ФИЗМА СЕВЕРОКАВКАЗСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ 6.1 Взаимосвязь вирулентности и КАРБ-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой

ржавчины пшеницы.....................................................92

ВЫВОДЫ...................................................................................99

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................101

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................102

ПРИЛОЖЕНИЕ А.......................................................................127

ПРИЛОЖЕНИЕ В........................................................................155

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований

Бурая ржавчина (возбудитель - Puccinia triticina Rob. ex Desm f. sp. tritici Erikss. et Henn.) - одна из самых распространенных и вредоносных болезней пшеницы. Потери урожая при раннем и сильном развитии патогена на восприимчивых сортах достигают 30-40 % (Лукьяненко, 1973; Lundin, 1973; Терехов и др., 1982; Орлюк, Гончарова, 1987). Возбудитель бурой ржавчины пшеницы P. triticina обладает большой экологической пластичностью, поэтому болезнь распространена во всех регионах культивирования пшеницы, а Северный Кавказ является зоной высокой вредоносности и широкого распространения болезни. Северокавказская популяция патогена всегда отличалась генетическим разнообразием и большим количеством вирулентных изолятов (Панайотиди, 2004; Волкова с соавт., 2005). Защита растения-хозяина от возбудителя бурой ржавчины предполагает использование как химических, так и биологических методов, в первую очередь через выведение и использование устойчивых сортов. Успех селекции в этом направлении зависит от знаний закономерностей изменчивости популяции возбудителя болезни (особенно связанной с естественным отбором по вирулентности) и генофонда устойчивости пшеницы. Поэтому исследования структуры популяции гриба по вирулентности всегда остаются актуальными. Тем не менее, маркеры вирулентности представляют только малую часть общей генетической изменчивости в популяции. У ржавчинных грибов биохимические и молекулярные маркеры оценивают изменчивость независимо от селекции растения-хозяина (Chen et. al., 1993; Kolmer et al., 1995), и поэтому данные маркеры могут быть полезны для более полного анализа структуры популяций фитопатогенов.

В основном изучение структуры популяции возбудителя бурой

ржавчины пшеницы ведется с помощью классического фитопатологического

метода, включающего тестирование по генам вирулентности. При

использовании молекулярных маркеров для изучения популяции гриба имеются некоторые сложности: отсутствие половой рекомбинации на промежуточном хозяине, трудность наработки большого количества биоматериала и выделения ДНК. Несмотря на многолетнее использование подобных методик за рубежом, в России этот вопрос до конца не решен. Использование комплексного подхода в изучении структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы позволит наиболее полно описать изменчивость патогена и проследить его динамику.

Ареалы популяций ржавчинных грибов могут быть огромными и занимать целые континенты. Определение границ популяций патогена на территории страны имеет важное значение для стратегии защиты и территориального распределения генов устойчивости. Но определение точного числа популяций гриба затруднительно, поскольку классическое понятие этого термина не применимо к возбудителю бурой ржавчины пшеницы в связи с тем, что гриб зимует в уредостадии и популяция является клональной (Михайлова, Васильев, 1985). Использование дополнительных маркеров (таких как КАРБ-маркеры) поможет в решении этого вопроса.

Взаимосвязь вирулентности и молекулярной изменчивости фитопатогенов является одним из дискуссионных и неизученных вопросов, который имеет теоретическую и практическую ценность (Х1а е1 а1., 2000). В связи с чем изучение взаимосвязи вирулентности и ИАРО-полиморфизма возбудителя бурой ржавчины пшеницы является актуальным.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлось изучение взаимосвязи вирулентности и КАРБ-полиморфизма северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- оценить распространенность и развитие Р. ЫИста в различных

агроклиматических зонах Северо-Кавказского региона;

- проанализировать частоту встречаемости генов вирулентности и фенотипов вирулентности в популяции Р. ЫИста из различных агроклиматических зон Северного Кавказа;

охарактеризовать молекулярно-генетическую структуру северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины по КАРЭ-маркерам;

- провести сравнительную оценку географически отдаленных популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы по признаку вирулентности и КАРБ-маркерам;

- установить взаимосвязь вирулентности и КАРБ-полиморфизма северокавказской популяции гриба.

Научная новизна исследований

Впервые изучена северокавказская популяция Р. ЫИста по признаку ЛАРО-полиморфизма.

Предложен новый подход сравнительной оценки двух методов исследований структуры популяции Р. Ыйста, основанный на взаимосвязи частоты встречаемости генов вирулентности и КАРБ-фрагментов.

Впервые установлена взаимосвязь между фенотипами вирулентности и КАРИ-фенотипами северокавказской популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы.

Практическая значимость работы

Результаты ежегодных маршрутных обследований государственных сортоучастков, производственных и селекционных посевов пшеницы предлагаются для фитосанитарного картирования бурой ржавчины на Северном Кавказе и являются корректной основой для прогноза развития болезни.

Выявленные эффективные гены устойчивости пшеницы к Р. &Шста

(Ьг9, Ьг24) предлагаются для использования в селекции.

Созданный набор ДНК нзолятов возбудителя бурой ржавчины пшеницы, а также подход сравнительной оценки двух методов предлагается для использования в работе научно-исследовательским учреждениям.

Новая научная информация о структуре популяции P. triticina по RAPD-полиморфизму и его взаимосвязи с вирулентностью предлагается для включения в курсы лекций по популяционной биологии грибов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Северокавказская популяция P. triticina по фенотипам вирулентности и RAPD-фенотипам обладает высоким разнообразием.

3. Предложен новый подход сравнительной оценки двух методов исследования структуры популяции P. triticina.

Место проведения работы

Диссертационная работа выполнена на базе Всероссийского НИИ биологической защиты растений в период с 2007 по 2011 гг. в лаборатории иммунитета зерновых культур к грибным болезням. В основу работы положены результаты исследований структуры популяции возбудителя бурой ржавчины пшеницы по вирулентности и RAPD-полиморфизму, полученные лично автором или с его непосредственным участием.

Апробация работы и публикация результатов исследования

Результаты исследований доложены на восьмой региональной, I и III

Всероссийской научно - практической конференции молодых ученых

«Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, КГАУ-

2006, 2007, 2009 гг.); IV Всероссийской научной конференции молодых

ученых и студентов «Современное состояние и приоритеты развития

фундаментальных наук в регионах» (Анапа, 2007 г.); Международной

научно-практической конференции «Актуальные проблемы иммунитета и

защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей» (Одесса,

2007 г.); 15 Congress of European mycologists (St. Peterburg, 2007); 9th

International Congress of Plant Pathology (Torino, Italy, 2008); Международной научной конференции, посвященной 45-летию основания Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Минск, 2010 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИБЗР «Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2010 г.); Международной конференции «Студенты и аспиранты в науке 2011», проводимой в рамках Дней молодежной науки в Оренбургской области (Оренбург, 2011 г.).

Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе три - в журналах, рекомендованных ВАК РФ: «Научный журнал КубГАУ» (электронный ресурс), «Известия ОГАУ», «АгроЭкоИнфо» (электронный журнал).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы, практических рекомендаций и приложения. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 27 рисунками. Список использованных источников включает 241 наименование, из них 192 работы иностранных авторов.

Сокращения

у.е. - условные единицы R - индекс Роджерса г - коэффициент корреляции Sh - индекс Шеннона

UPGMA (unweighted pair group average) - метод кластеризации RAPD-ПЦР (random amlyfied polymorfic DNA) - ПЦР с праймерами со случайной последовательностью

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Распространенность возбудителя бурой ржавчины пшеницы

Puccinia triticina наносила вред пшенице не одну тысячу лет. Упоминания об этом патогене найдены в литературе классической Греции и Рима и даже в Библии. Но она не считалась важной болезнью пшеницы, потому что не так сильно влияла на качество зерна, как стеблевая ржавчина или фузариоз (Bolton, Kolmer, Garvín, 2008).

Возбудитель бурой ржавчины пшеницы, Puccinia triticina Erikss., является облигатным биотрофным паразитом (Андреев, Плотникова, 1989; Zhang, Meakin, Dickinson, 2003). Номенклатура возбудителя бурой ржавчины пшеницы претерпела многие изменения. Де Кандоль в 1815 году отделил бурую ржавчину пшеницы от других видов ржавчин и назвал ее Uredo rubigovera. Первоначально Эриксон и Геннинг считали его специализированной формой для пшеницы и ржи Puccinia dispersa Eriks. et. Henning. Но уже в 1894 г. Эриксон выделил его в самостоятельный вид — Р. triticina (Eriksson, 1899). Мейнс и Джексон в 1921 г. сообщали о поражаемости этой ржавчиной таких видов как Aegilops, а в 1934 г. отнесли Р. aegilopsis в синонимы Р. triticina. В 1936 г. Гойман и Траншель считали, что все морфологически сходные ржавчинные грибы по существу являются лишь специализированными формами вида Р. persistens Plowr (по Хохрякову, 1975) .В 1956 г. Кумус и Кальдвел рекомендовали название Р. recóndita Rob. ex Desm./ sp. tritici Henderson как поправку для обозначения патогена бурой ржавчины пшеницы (Cummins, Caldwell, 1956). Это название впоследствии широко использовалось (Singh, Huerta-Espino, Roelfs, 2002).

Но в 1967 г. чешский миколог Урбан нашел, что название Р. recóndita было присвоено патогену ошибочно, т. к. оно должно принадлежать возбудителю бурой ржавчины ржи — Р. dispersa, связи с чем дал ему новое название — Р. perplexans Plowr. var. triticina (Eriks.) Urban / sp. triticina

(Henderson) Urban (по Хохрякову, 1975).

В 1984 г. появилась статья Севайла, в которой он предлагает использовать Р. recóndita для возбудителя бурой ржавчины ржи, а возбудителя бурой ржавчины пшеницы отнести к самостоятельному виду -Р. triticina (Savile, 1984). Это название используется и по сей день.

Систематическое положение патогена:

царство Fungi (Mycota)

подцарство Eumycota

отдел Basidiomycoa

класс Teleomycetes

порядок Uredinales

семейство Pucciniaceae

вид Puccinia triticina Erikss. (Дьяков с соавт., 2001) В полном жизненном цикле возбудителя чередуются пять типов спороношения.

0 — пикниды с пикноспорами

1 — эцидии с эцидиоспорами

2 — уредоспороношение

3 — телейтоспороношение

4 — базидии с базидиоспорами

Бурая ржавчина пшеницы имеет все пять типов спороношения, и цикл

развития считается полным. Пикниды и эцидии формируются на

промежуточных хозяевах - лещице, василистнике (Андреев, Плотникова,

1989). Василистник распространен на территории южной Европы и Юго-

Восточной Азии, но практически отсутствует в основных регионах

культивирования пшеницы (Kolmer et al., 2003). На территории России бурая

ржавчина может существовать в двух формах. Одна форма, наиболее

распространенная на территории России и Европы, может заражать в

качестве промежуточного хозяина василистник (Thalictrum flavum L.). Но

роль василистника в весеннем возобновлении ничтожна и в природе цикл

развития гриба представлен только уредо- и телейтостадией. В Сибири распространена другая форма бурой ржавчины, которая имеет промежуточного хозяина лещицу {Ьоругит /итагШЫев Ь.) (Кудряшева, 1968; Горленко, 1968). За рубежом случаи природного инфицирования василистника встречаются редко. Тем не менее такие случаи известны в Португалии, США. В Испании инфекции на василистнике являются распространенными. Янг и Прескотт изучали влияние промежуточного хозяина на расовый состав популяции Р. &Шста. Авторы инокулировали телейтоспорами, собранными с различных сортов, два вида василистника и анализировали популяцию патогена вблизи промежуточного хозяина по сравнению с полевой уредопопуляцией. В результате авторы установили, что по числу рас и по количеству генов вирулентности эциопопуляция превосходит уредопопуляцию. На основании полученных данных авторы подтвердили ранее сделанные исследования о роли промежуточного хозяина в формировании новых рас с помощью половой рекомбинации (Уоп§, Ргезсой, 1977).

Помимо пшеницы, гриб поражает многие злаковые растения. Его

дополнительными хозяевами являются различные виды эгилопса, пырея,

костра, ячменя, ржи и др. (Дьяков, Дементьева, Семенкова, 1984). Наиболее

характерным симптомом поражения пшеницы бурой ржавчиной является

появление мелких округлых или эллиптических уредопустул багряного

оттенка. Образование уредопустул сопровождается развитием хлороза тканей

пораженных участков. К периоду молочной спелости зерна бурая ржавчина

достигает максимального развития. В это же время на тех же органах

появляются черные телейтопустулы. Уредоспоры гриба одноклеточные,

округлые, эллипсоидальные, мелкошиповатые. Телейтоспоры двуклеточные,

верхняя клетка иногда усеченная, на короткой ножке (Кудряшева, 1968).

Несмотря на то, что патоген является облигатным паразитом, трофическая