Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические механизмы адаптации к битоксибациллину в онтогенезе насекомых Holometabola

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические механизмы адаптации к битоксибациллину в онтогенезе насекомых Holometabola"

На правах рукописи

£

Салтыкова Елена Станиславовна

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К БИТОКСИБАЦИЛЛИНУ В ОНТОГЕНЕЗЕ НАСЕКОМЫХ НОЬ ОМЕ ТАВОЬА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

О 3 СЕН 2009

Уфа 2009

003476049

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Николенко Алексей Геннадьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Анисимов Анатолий Иванович Санкт-Петербургский государственный аграрный университет

доктор биологических наук, профессор Ибрагимов Ринат Исмагилович Башкирский государственный университет

доктор биологических наук, доцент Князева Ольга Александровна Башкирский государственный медицинский университет

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится « / £» 200 9 г. в УУ ^ часов

на заседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН.

Адрес: 450054, Уфа, пр. Октября, 71, www.ibg.anrb.ru/dissov.html.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайте ВАК

Автореферат разослан " д/губПI 200>.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

^ Бикбулатова С. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Устойчивость насекомых к патогенным микроорганизмам и продуктам их жизнедеятельности обусловлена хитинизированными покровами, скоординированным взаимодействием биохимических механизмов с деятельностью клеточных структур гемолимфы, жирового тела и кишечника, выстланного пе-ритрофической мембраной, а также особенностями структуры и функционированием генома.

К настоящему времени изучены и описаны основные биохимические защитные механизмы насекомых. Часть из них базируется на индукции протеолитических каскадов, приводящих к меланизации и коагуляции гемолимфы при ранении, а также продукции активных кислородных метаболитов и сигнальных молекул, в том числе участвующих в распознавании антигенов (Marmaras et al., 1996; Teopold et al., 2004; Ling, Yu, 2005; Jiravanichpaisal et al, 2006; Williams, 2007). Существуют системы, продуцирующие биологические восстановители и активированные глюкозиды, агглютинины с различной углеводной специфичностью, участвующие в процессах распознавания (Basseri et al., 2002; Галактионов, 2004; Ottaviani, 2005), и набор антимикробных пептидов, обуславливающих бактерицидные и фунгицидные свойства гемолимфы (Черныш, 1998; Львов, Николенко, 1999; Bulet et al., 2004). Защитная система, опосредованная клетками гемолимфы, участвует совместно с гуморальными факторами в фагоцитозе, синтезе антимикробных пептидов, а также в гистолизе и гистогенезе в процессе метаморфоза (Глупов, 2001 ; Гайфуллина и др., 2004). Таким образом, данные биохимические системы насекомых принимают участие не только в защитных процессах, но и регуляции онтогенеза, что, как считает ряд исследователей, обусловлено сугубо врожденными факторами (Leclerc, Reicchart, 2004).

Исследования последних лет опровергают сложившиеся представления о непреодолимой грани между врожденной и адаптивной защитной системой насекомых (De Gregorio et al., 2001; Eason et al., 2004). Основная проблема заключается в том, что до сих пор биохимические механизмы устойчивости насекомых к патогенным микроорганизмам изучались без учета их метаболической взаимозависимости и онтогенетических особенностей функционирования. В то же время наличие адаптивного ответа у насекомых допускает возможность существования специфичных и долговременных биохимических защитных реакций. Эти процессы должны быть связаны с онтогенетическими особенностями насекомых, поскольку личинка кардинально отличается от взрослой особи. Они, как правило, занимают разные экологические ниши, имеют различную пищевую специализацию, а также продолжительность существования, что может играть важную роль в функционировании биохимических механизмов и факторов, опосредованных гемоцитарной защитой.

Следует отметить, что для изучения перечисленных аспектов необходима новая модель эксперимента. Она должна базироваться на изучении динамики общих биохимических и клеточных защитных реакций насекомых на начальном этапе инфекционного процесса, использовании патогенного препарата общего типа действия (для чего был использован битоксибациллин), естественном способе заражения насекомых, применении патогена в дозировках и степени вирулентности, не вызывающих глубоких патологических изменений в организме насекомого, а также с учетом стадий онтогенеза. Эти особенности модели не всегда учитывались в иссле-

дованиях последних лет (Ekengren, Hultmark, 2001; Tzou et al., 2001; Zambón et al, 2005; Sorensen et al, 2005).

Энтомопатогенные кристаллофорные бактерии Bacillus thuringiensis антагонистичны для многих видов насекомых. На основе различных штаммов Вас. thuringiensis создан широкий спектр микробиологических препаратов, в том числе битоксибациллин, который содержит жизнеспособные споры бактерий и продуцируемый ими экзотоксин (Смирнов и др., 1982;Кандыбин, 1989). Практика применения данного препарата в системе защиты от насекомых-вредителей способствует появлению устойчивых особей с эффективными механизмами распознавания и элиминации патогенных бактерий.

Не менее важны онтогенетические и другие условия функционирования биохимических защитных механизмов и для прикладных исследований. В процессе поиска и практического применения, биологически активных в отношении насекомых веществ, часто не учитываются условия формирования защитных реакций, предшествующие контролируемой стадии эксперимента. Это замечание можно отнести к изучению южных подвидов медоносной пчелы, интродуцированных в климатические условия средней полосы России. По аналогичной причине пока не увенчались успехом попытки разработки препаратов на основе хитозана для пчеловодства (Ал-булов, 2008).

Ранее в исследованиях биохимических защитных механизмов насекомых, как правило, использовались иные методологические подходы, связанные с инъекционными способами введения и/или заведомо высокими концентрациями препаратов. На фоне торможения защитных реакций сформировалось представление о неспособности насекомыми формировать адаптивный ответ (Флоренсов, Пестова, 1990; Vidal et al., 2001; Hultmark, 2003). Сохраняются суждения об исключительной роли отбора особей с наиболее успешной реализацией защитных систем в возникновении устойчивых популяций насекомых. Роль иммунизации при этом считается несущественной, в том числе в силу малой продолжительности жизни насекомых.

Результаты отдельных исследований можно рассматривать как принцип формирования адаптивного ответа к конкретному патогену (Kurtz, 2005; Gaifullina et al., 2005). Более того, в последние годы появились сообщения, свидетельствующие о трансгенерационной передаче индуцированного адаптивного ответа у общественных насекомых, высказываются предположения о возможных механизмах данного явления (Moret, Schmid-Hempel, 2000; 2001; Sadd et al., 2005). Тем не менее, до сих пор не раскрыты онтогенетические условия формирования подобного феномена, возможно, раскрывающего исключительные возможности насекомых к формированию широкого спектра устойчивости в короткий эволюционный период (Марков, 2006; Колчанов, 2007).

Таким образом, изучение вопросов онтогенетических и внутривидовых особенностей реализации биохимических защитных реакций, метаболической взаимозависимости компонентов данных систем, возможности преадаптации насекомых, условий формирования долговременных биохимических защитных реакций и возможности их трансгенерации может изменить общее представление о механизмах биохимической устойчивости насекомых к неблагоприятным факторам среды, обеспечивающих адаптивную пластичность видов класса ¡mecía.

Цель данной работы заключалась в выявлении онтогенетических закономерностей реализации биохимических защитных механизмов при действии битоксиба-циллина у насекомых с полным типом превращения. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новую модель эксперимента для изучения экзогенных воздействий на насекомых, охарактеризовать на этой основе реализацию основных биохимических защитных реакций насекомых, в том числе определить временные рамки фаз их развития.

2. Определить онтогенетические особенности формирования биохимических защитных реакций насекомых при действии битоксибациллина.

3. Выявить внутривидовые особенности формирования биохимических защитных реакций и оценить возможность использования биохимических параметров для характеристики состояния пчелиных семей.

4. Оценить возможность иммунизации насекомых и их способность к развитию долговременной иммунной памяти на основе биохимических защитных механизмов, особенностей их онтогенетического формирования.

5. Охарактеризовать онтогенетические особенности влияния биологически активных для насекомых веществ на функционирование биохимических механизмов защиты и перспективы их применения в качестве адаптогенов.

6. Оценить влияние критических периодов в онтогенезе насекомых на активацию биохимических защитных систем и долговременность их реакции.

7. Определить роль критических периодов в проявлении эффекта трансгенерации биохимических защитных реакций в ряду поколений насекомых.

Научная новизна. Выявлена тесная взаимосвязь антиоксидантной и фенолокси-дазной систем в формировании начального этапа реализации защитных реакций у насекомых. Выявлены онтогенетические различия в проявлении биохимических защитных реакций и их связь с клеточными структурами гемолимфы насекомых. Это проявляется в преобладании на личиночной стадии неспецифических, а на имаги-налыюй - специфических биохимических механизмов. Доказана возможность пре-адаптации насекомых воздействием нслетальными дозами битоксибациллина, выражающейся в стимулирующем влиянии на развитие защитных реакций и повышении выживаемости в целом. Показана возможность применения хитозана в качестве адаптогена для медоносной пчелы. Выявлена возможность формирования долговременной иммунной памяти насекомых. Показана значимость критических периодов онтогенеза насекомых в формировании долговременных защитных реакций, связанных с фазами стадий развития. Фенолоксвдазная и антиоксидантная системы, участвующие в реализации устойчивости насекомых, многократно повышают свою активность при воздействии бактериальным препаратом в критические периоды развития. Показано, что индуцированная активность защитных реакций у личинок насекомых воспроизводится на последующих этапах онтогенеза, а также в последующих двух поколениях на той же стадии развития насекомого без дополнительного влияния индуцирующего фактора.

Практическая значимость. Получены данные по высокой биологической активности хитозана в отношении хозяйственно значимых насекомых, которая выражается в преадаптивном действии и во влиянии на скорость морфогенетических

процессов, что было показано па медоносной пчеле и колорадском жуке. Применение хитозана в пчеловодстве или в области защиты растений рекомендовано с учетом нового регламента, основанного на четком определении физиологического статуса и стадий развития насекомых. Обоснована возможность использования начального этапа реализации биохимических защитных реакций в качестве тест-системы для диагностики состояния пчелиных семей. На основе выявленных внутривидовых различий у медоносной пчелы в характере развития биохимических защитных реакций предложены биохимические критерии в качестве показателей адаптиро-ванности пчелиной семьи к климатическим условиям Урала.

Положения, выносимые на защиту:

1. Стадия онтогенеза и начальный этап воздействия битоксибациллином являются значимым моментом в определении преимущественного типа реализации биохимических реакций насекомых. Нейтрализация сублетальных доз патогенного препарата происходит за счет реактивации биохимических защитных систем, высоких доз битоксибациллина - посредством реакции защитного торможения биохимических процессов.

2. Воздействие битоксибациллином в сублетальной концентрации оказывает на насекомых иммунизирующее действие и способствует формированию, как кратковременных биохимических защитных реакций, так и долговременной иммунной памяти у продолжительно живущих особей. Иммунизация насекомых вносит вклад в развитие общей устойчивости популяций наряду с действием отбора.

3. Ключевыми моментами онтогенеза у насекомых с полным типом превращения являются критические периоды при переходе от личиночной стадии развития к куколке и от куколки к имаго. Критические периоды онтогенеза у насекомых характеризуются перестройкой многих функциональных систем организма, повышенной реактивностью биохимических защитных реакций и более высокой чувствительностью к внешним воздействиям.

4. Активность факторов защитных реакций, индуцированная в критические периоды онтогенеза, у личинок насекомых воспроизводится как на последующих этапах онтогенеза, характеризуя наличие долговременной иммунной памяти, так и в последующих поколениях насекомых на той же онтогенетической стадии, подтверждая трангенерационный эффект передачи индуцированных биохимических механизмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Изучение, рациональное использование природных ресурсов», (Уфа, 1991), «Biologically Active Polysaccharides», (Oslo, 1998), «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии», (Челябинск, 1999), 6th European Training Course on Carbohydrates, (Hungary, 2000), 4th Carbohydrate Bioengineering Meeting, (Stockholm,

2001), VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002), «Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства» (Пенза, 2002), на XII съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург,

2002), на III съезде Всероссийского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2004), на Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока, (Новосибирск, 2006), на IX Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция - стратегия жизни» (Уфа, 2006), на Международной конференции «Current

Evolutionary Thinking in Biology, Medicine and Sociology» (Новосибирск, 2007), на XIII съезде Русского энтомологического общества (Краснодар, 2007), на III съезде Биохимического общества (С.-Петербург, 2002) и IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на IX Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008).

Публикации. Основные результаты исследований отражены в 22-х научных статьях, в том числе 16 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы (452 работы, в том числе 308 зарубежных). Работа изложена на 363 страницах, содержит 42 таблицы и 61 рисунок.

Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад автора заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Благодарность. Выражаю благодарность коллегам по лаборатории биохимии адаптивности насекомых за конструктивные замечания, помощь и поддержку в выполнении данной работы.

Объекты и методы исследований

В качестве объектов исследований были использованы одновозрастные личинки, куколки и имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. из природной популяции и комнатной мухи Musca domestica L. лабораторной линии Cooper, рабочие особи темной лесной Apis mellifera mellifera L. и серой горной кавказской Apis mellifera caucasica Gorb. медоносной пчелы, доставленные с пасеки республики Башкортостан. Условия содержания насекомых соответствовали специальным методикам ведения лабораторной культуры колорадского жука (Беньковская, 2001), медоносной пчелы и комнатной мухи (Салтыкова, 2000). Обработка биологических объектов адаптогенами (хитозан и аскорбиновая кислота), а также модельное воздействие в лабораторных условиях на насекомых битоксибациллином (БТБ), представляющим спорокристаллический препарат на основе Bacillus ihuringiensis var. thuringiensis, проводили по методикам, разработанным Е.С. Салтыковой (2000), JI.P. Гайфуллиной (2004). В экспериментах использовали гемолимфу, гомогенаты кишечника, нервных ганглиев, жирового тела, мышечной массы или целый гомоге-нат насекомого в зависимости от поставленных экспериментальных задач. Повтор-ность экспериментов была не менее трех раз. Опыты включали по 3 биологических и аналитических повтора.

Приготовление клеточных препаратов гемолимфы производили фиксированием мазков 96%-ым этанолом и окрашиванием по методу Романовского-Гимзы (Кост, 1957). Типы форменных элементов гемолимфы определяли по классификации М.И. Сиротиной (1961). Титр и углеводную специфичность гемаггшотшшнов гемолимфы насекомых определяли по D.Stynen (1982). Спектрофотометрическое измерение фенолоксидазной (ФО) активности проводили по Е.Ю. Животенко (1987), пе-роксидазной (ПО) активности -по А.Н. Бояркину (1951). Активность каталазы изме-

ряли по методу В.М. Мерщиева [1990]. Активность супероксидцисмутазы (СОД) определяли по С. Чевари (1985). Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) измеряли по Н.В. Алексахиной (1979), удельную активность выражали в мкМ/мип/мг белка. Активность протеиназ и ингибиторов протеиназ (ИП) проводили по S. Saul, М. Sugumaran (1986), выражали в ед.акт./мин/мг белка. Количество ТБК (тиобарбитуровой кислоты) - реагирующих продуктов (МДА - малоновый диаль-дегид) определяли по Д.И. Стальной и др. (1977) и выражали в нМ/гткани. Активность кислой фосфатазы (КФ) оценивалась по скорости гидролиза 2-нафтилфос-фата (Филиппова, 1985). Содержание гликозоаминошиканов (ГАГ) определяли по ГШ. Шараеву (1987) в мг/г ткани. Активность тирозиназы, дифенолоксидазы (ДФО), супероксидцисмутазы и пероксидазы выражали приростом оптической плотности в минуту, в перерасчете на концентрацию белка (ед.акт./мин/мг белка), удельную активность каталазы выражали в нМ/мин/мг белка. Концентрацию белка определяли по О. Лоури (Lowry et al., 1951). Электрофорез молекулярных форм фенолоксида-зы проводили в 7,5% полиакриламидном геле по системе В. Davis (1962). Выявление ферментативной активности на электрофореграммах осуществляли по Г.Ю. Рау-шенбах(1997).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием среднеарифметического значения, ошибки средней, доверительного интервала, дисперсионного анализа с применением критерия Фишера и пепараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Достоверность различия средних определяли по t-критерию Стюдента (Лакин, 1990). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ StatSoft (Statistica 6.0).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биохимические защитные реакции насекомых па начальном этапе развития инфекционного процесса

К настоящему времени сведения об особенностях функционирования защитных систем у насекомых имеют фрагментарный характер и отражают ограниченную феноменологию этих процессов (Magalhaes et al., 2008; Aggarwal et al., 2009). Наличие высокоразвитой антимикробной врожденной защиты, а главное, особенности развития биохимических процессов в первые сутки, значимость скорости развития защитных реакций и взаимосвязь систем, обеспечивающих первичный ответ при внедрении патогена, зачастую оставались за пределами внимания исследователей. Битоксибациллии был выбран в качестве препарата широкого энтомопатоген-ного действия с довольно устойчивыми характеристиками при применении его в лабораторных условиях. Многолетние лабораторные исследования позволили выявить определенные закономерности в реакциях насекомых при применении данного бактериального препарата (Салтыкова, 2000). При этом определенные особенности воздействия данного препарата более наглядно могли быть продемонстрированы на насекомых с полным типом превращения. С этой целью для определения фаз развития защитных реакций у различных представителей наиболее эволюционно молодых отрядов насекомых была разработана лабораторная модель воздействия бактериальным препаратом. Было отработано воздействие на насекомых разными

концентрациями битоксибаниллина для выявления реакций ферментативных систем, которые входят в систему защитных реакций насекомых при действии экзогенных факторов. Были выявлены определенные фазы реализации биохимических защитных реакций, характер их реагирования (Табл. 1).

Таблица 1

Схема развития защитных реакций у медоносной пчелы при действии БТБ

Оч 1ч 4ч 6ч 24ч 48ч

Состояние Попадание Начало Завершение Нарастание количества

патогена спор в прорастания образования вегетативных клеток патогена.

полость спор вегетативных Увеличение количества

кишечника клеток, выделяемых токсинов

начало

выделения

токсинов

Изменение Увеличение Уменьшение Увеличение доли делящихся

клеток доли доли макро- прогемоцитов, фагоцитирующих клеток,

гемолимфы ееретеновидн нуклеоцитов и эозинофилов и ЭНОЦИТОИДОВ

ых фагоцитов эозшгофилов

Состояние ФО л протеазы л каталаза ) протеазы/ ФО + ФО +

биохимии- каталаза МДА ) ИП ) Г6ФДГ ) МДА ) МДА )

ческих ПО ГАГ ) Г6ФДГ ) МДА ) ИП ) ип ;

показате- Г6ФДГ ^ ПО = по = ФО ! протеазы ) протеазУ

лей протеазы ^ ФО ФО = ПО ) Г6ФДГ ГбФДГ^

ИП Г6ФДГ ^ протеазьЛ ИП ) ГЛГ ГЛГ ^

ГАГ ^ каталаза ^ МДА ^ ГАГ ^ каталаза ^ кагал.

МДА "I ГАГ каталаза-. ПО ^ ПО"|

Фазы Период Латентный Начало Нарастание Стабильно Период,

реализации неспецифи- период запуска специализи- е развитие опреде-

защити ых ческой специализи- рованных реакций ляющий

реакций защитной рованных реакций адапта-

реакции реакций цию

Оч 1ч 4ч 6ч 24ч 48ч

Примечание: л - пик активности, + - устойчиво высокая активность,) - рост активности; = - активность на уровне контроля, ^ - спад активности, -I - устойчиво низкая активность.

Установлено, что необходимым условием для инициации защитных процессов, не связанных с развитием патологии в течение первых суток, является применение нелетальных концентраций. Именно при таких условиях были выявлены определенные принципы реализации защитных реакций. Обработка личинок колорадского жука БТБ вызывает нарастание числа веретеновидных фагоцитирующих клеток, что подтверждает полученные ранее результаты на других видах насекомых (Сиротина, 1961; Рагялис, 1982). При этом повышается активность антиоксидантных ферментов. Кроме того, у личинок колорадского жука гемоцитарный ответ на битоксибациллин (0,1%) выражается двукратным увеличением процента эноцитоидов, клеток продуцирующих гуморальные факторы. Повышение интенсивности дифференцировки

эноцитоидов, продуцирующих биохимические факторы защиты, в том числе фено-локсидазы и агглютинины, в течение первых суток развития инфекции достоверно подчеркивает значимость гуморальных факторов у личинок в данный период. Внедрение чужеродных агентов в короткий срок индуцирует в организме насекомых комплекс скоординированных клеточных и, опосредованных ими, биохимических защитных реакций (Глупов, 1992; Gillespie, Kanost, 1997).

В гемолимфе в течение суток наблюдали значительные изменения в активности пероксидазы (к 1 часу развития процесса активность фермента увеличивалась почтив 100 раз). Каталаза снижала свою активность к 4 часам от начала заражения, ак концу вторых суток ее активность увеличивалась почти в 5 раз, что свидетельствует о возрастании значимости антиоксидантных процессов (Рис. 1). Активностьтирози-назы от начала действия битоксибациллином постепенно снижалась к концу первых суток почти в 10 раз. Судя по всему, наиболее задействованы в защитной реакции биохимические факторы клеточных элементов гемолимфы, и это в значительной

Рис. 1. Изменение активности ферментов антиоксидантной и фенолоксцдазной систем в гемолимфе и кишечнике у личинок 3 возраста колорадского жука при действии БТБ (данные приведены относительно контроля); -ф- достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95), активность ферментов выражена в ед.ак./мин/мг белка

степени происходит к концу первых суток после воздействия бактериальным препаратом.

Что же касается кишечника, активность пероксидазы значительно возрастала в течение первого часа действия препарата, второй период роста активности начинался от 4 часов (Рис. 1). Рост активности каталазы начинался несколько раньше, от 2 часов. Рост активности дифенолоксидазы до уровня контроля наблюдали от 4 часов и до конца первых суток. К концу первых суток нарушается сбалансированное взаимодействие двух антиоксидантных ферментов в самом кишечнике и в кишечном секрете личинок.

У личинок комнатной мухи начала третьего возраста, обработанных 0,01% БТБ фиксировали изменение активности ферментов антиокевдантной и фенолоксидаз-ной систем в течение первых суток в гемолимфе. От начала эксперимента активность тирозиназы к 1 часу в 5 раз превышала контрольный уровень (Рис. 2). Активность пероксидазы снижалась незначительно в течение первого часа, превышая контрольный уровень почти в 2 раза и образуя пик активности (3,5 раза по отношению к контролю) к 2 ч от начала действия бактериального препарата. Рост активности каталазы приходится на время снижения активности пероксидазы, а спад активности приходится, наоборот, на период роста активности пероксидазы.

Очевидно, что согласованная активация данных систем направлена на формирование куколочных покровов (Салтыкова, 2003). А достоверное сокращение сроков развития личинок косвенно подтверждает адаптивный характер происходящих изменений на уровне организма.

Рис. 2. Активность ферментов фенолоксидазной и аптиоксидантной систем в гемолимфе у личинок Musca domestica в начале 3 возраста при действии БТБ (данные приведены относительно контроля); -ф- достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

В лабораторных условиях битоксибациллип (0,5%), скормленный пчелам вместе с сиропом per os, как энтомопатогенный препарат, оказывал определенное воздействие на насекомых. Это требует соответственно быстрой перестройки внутренних систем для адекватного ответа, вызывая значительное функциональное напряжение. Снижение степени воздействия битоксибациллина при остальных равных условиях (продолжительность воздействия, возраст организма и др.) будет вызывать

меньшую степень повреждений и тип направленности метаболических процессов с начала действия фактора. Для выявления внутривидовых различий на начальной стадии процесса, вызываемого действием различных концентраций БТБ (0,01% и 0,5%), использовались подвиды медоносной пчелы Apis mellifera melliferaL. и Apis mellifera caucasica Gorb. с пасек Башкирского госагроуниверситета.

В максимальной концентрации активность Г6ФДГ у темной лесной пчелы в 4 раза превышала активность ферментау серой горной кавказской пчелы к 1 часу от начала развития защитных реакций (Рис. 3). При этом, если у темной лесной пчелы с повышением концентрации БТБ наблюдалось снижение уровня активности фермента, то у серой горной пчелы, напротив, активность возрастала. Повышение активности Г6ФДГ при действии на темную лесную пчелу минимальной концентрации БТБ может свидетельствовать о повышении уровня активности окислительно-восстановительных процессов, нуждающихся в НАДФН2 (фенолоксидазный каскад, система цитохрома Р-450 и т.д.) (Tzou et al., 2001; Zambón et al., 2005). К 1 часу от начала действия 0,01% БТБ на темную лесную пчелу также наблюдалось превышение активности пероксидазы в 2,5 раза по отношению к контролю, чем в концентрации 0,5%. Уровень содержания ГАГ у темной лесной пчелы в действующей концентрации БТБ 0,01% постепенно нарастал, особенно на отрезке от 4 до 24 часов. И незначительно изменялся в пределах контрольного уровня при повышенной кон-

Рис. 3. Изменение биохимических показателей у Apis mellifera mellifera при действии БТБ в зависимости от концентрации (данные приведены относительно контроля); 1 - 0,01% БТБ, 2 - 0,5% БТБ. достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

центрации. У темной лесной пчелы в концентрации 0,5% к 1 часу содержание ГАГ резко снижалось, повышаясь до контрольного уровня к 4 часам и далее.

По-видимому, в низкой концентрации у темной лесной пчелы репаративные процессы преобладают над деструктивными, в концентрации 0,5% уровень многих процессов снижается в соответствии с принципом защитного торможения (Мелехов, 1992) и реакции, обеспечивающие восстановительные процессы, начинают активироваться к концу суток. У серой горной пчелы эти процессы запаздывают на сутки (Рис. 4).

В отношении тирозиназы у всех пчел наблюдалась одна и та же тенденция: с возрастанием концентрации битоксибациллина достоверно увеличивалась удельная активность данного фермента, что отличало ее от других выше рассмотренных процессов. При этом темные лесные пчелы по скорости и уровню развития реакции достоверно превосходили серых горных пчел.

Вероятно, это связано с тем, что тирозиназа принимает участие в процессах обеспечивающих распознавание и интернализацию патогена с фагоцитирующими клетками. Участие данного фермента в распознавании ранее было показано исследователями на других видах насекомых (А8Ыс1а, 1983; ТеороИ е1 а!., 2004). Учитывая все вышеизложенное, можно полагать, что у серой горной кавказской пчелы перестройка в режим энергосбережения и перераспределения внутренних ресурсов происходит с некоторым запаздыванием (как правило, к концу первых суток), что во многом может определять уязвимость серой горной пчелы и более высокую устойчивость темной лесной пчелы в данных климатических условиях. Очевидно, что

Рис. 4. Изменение биохимических показателей у Ар'к теШ/ега саисаяка при действии БТБ в зависимости от концентрации (данные приведены относительно контроля); 1 - 0,01% БТБ, 2 - 0,5% БТБ. достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

повреждения, вызванные сублетальными концентрациями препарата, эффективно снимаются преимущественно при интенсификации метаболизма, в случае высоких концентраций для последующей ликвидации повреждений в основном наблюдается снижение уровня метаболических процессов.

Таким образом, выбор стратегии реализации защитных реакций у рассматриваемых видов насекомых в зависимости от интенсивности действующего фактора определяется в течение первых суток. Он отражает элементы общности в развитии защитных процессов (увеличение количества фагоцитирующих клеток, взаимодействие фенолоксидазной и антиокислителыюй системы при воздействии БТБ), но в то же время демонстрирует функциональный полиморфизм компонентов защитных систем на видовом и подвидовом уровне.

2. Онтогенетические и внутривидовые различии в формировании биохимических защитных реакций насекомых

Функциональные особенности защитных реакций насекомых складывались как результат приспособления к конкретным условиям жизни вида, то же самое касается и онтогенетических стадий развития (Cui et al., 2000; Housseaw et al., 2001; Dash et al., 2008). Стратегия формирования защитного ответау разных по времени развития стадий онтогенеза может отличаться, как и принципы реализации защитных реакций внутри вида, способствуя расширению видового ареала.

При воздействии БТБ на насекомых на разных стадиях онтогенеза в организме особей наблюдался рост титра гемагглютининов. Титр агглютининов в гемолимфе колорадского жука изменялся в онтогенезе, увеличиваясь к имагинальной стадии (Табл. 2). Причем с увеличением концентрации препарата увеличивалась и скорость изменения агглютинирующей активности гемолимфы. Наиболее интенсивный рост титра гемагглютининов регистрировался при действии нелетальной и пятикратно увеличенной концентрации БТБ у личинок 4 возраста и перезимовавших имаго. Необходимо отметить, что гемагглютинины L. decemlineata на всех стадиях онтогенеза проявляли сходную углеводную специфичность, связываясь только со сложными олиго- и полимерными сахарами - сульфатировалным полисахаридом гепарином, хитозаном со степенью полимеризации 15 и гиалуроновой кислотой (ГУК).

Таблица 2

Титры агглютининов гемолимфы в онтогенезе L. decemlineata на начальном этапе развития инфекции при действии БТБ

Возраст Контроль 0,1%БТБ 0,5% БТБ

2ч 4ч 24 ч 2ч 4ч 24 ч

личинки 3 возраста 64 64 64 64 64 64 128

дичинки 4 возраста 512 512 512 1024 2048 4096 4096

куколки 256 256 256 512 256 512 512

имаго Ю 1024 1024 1024 1024 1024 2048 256

имаго V/ 1024 2048 2048 2048 2048 4096 4096

Имаго 1G - имаго 1 -ой генерации, имаго W - перезимовавшие имаго

При всем том гемагглютинины L. decemlineata не обладали сродством к М-ацетил-О-глюкозамину (NAGA) - ацетилированной структурной единице хито-зана. Очевидно, для связывания гемагглютининами L. decemlineata углевод должен обладать достаточной молекулярной массой или дополнительными связями. При действии БТБ у личинок 4 возраста и перезимовавших имаго минимальная ингиби-рующая концентрация ГУК не изменялась, тогда как у хитозапа и гепарина она увеличивалась вдвое. Данное наблюдение говорит не только об увеличении количества агглютининов в гемолимфе имаго колорадского жука, имеющих сродство к хитозану и гепарину, но и о включении специфических по отношению к БТБ механизмов защиты, поскольку токсины, нарабатываемые В. ihuringiensis, имеют в своем составе сходные с хитозаном гликозидные фрагменты (Dulmage, Rhodes, 1971). При действии БТБ у личинок 3 возраста наблюдались увеличения дифенолоксидаз-ной и каталазной активности. Начальный этап действия БТБ у 1-суточных личинок 4 возраста сопровождался повышением уровня активности тирозиназы и пероксида-зы, а в середине 4-го личиночного возраста - увеличением активности всех рассматриваемых ферментов. Первые часы действия препарата у имаго L. decemlineata сопровождались некоторым снижением уровня активности фенолоксидаз и повышением пероксидазной активности в гемолимфе (Рис. 5). Активность каталазы не имела достоверных различий с контрольным уровнем. В рассматриваемых нами системах гуморального ответа, согласно литературным данным, можно выделить два механизма защиты: неспецифический - дифеполоксидазная, каталазная и пе-роксидазная активности гемолимфы, и специфический - агглютинирующая и тиро-зиназная активности гемолимфы (Marinaras et al., 1996; Nakamura et al., 2001; Cyxopy-кова, 2002).

AOC

0,5 1 2 ' 4 час

Рис. 5. Динамика активности ферментов фенолоксидазнои (ФОС) и антиокислительной (АОС) систем в гемолимфе имаго Ь.(1есетИпеШа при действии БТБ. Данные нормированы по контролю. * - достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95). ■■И дифенолоксидаза, -Ф- тирозиназа, — катал аза, ......

пероксидаза

С данной точки зрения можно заключить, что на начальном этапе развития защитных реакций у колорадского жука на стадии личинки 3 возраста преобладают неспецифические механизмы, а у половозрелого имаго - специфические. В гуморальном ответе личинки 4 возраста представлены как неспецифические, так и спе-

цифические механизмы защиты. Вероятно, это связано с тем, что у колорадского жука личинка 4 возраста занимает относительно длительный период развития, с течением которого в защитном ответе личинки начинают работать элементы специфической защиты - тирозиназа и агглютинины.

Действие БТБ вызвало у личинок колорадского жукаЗ и 4 возраста достоверное повышение процента защитных клеток гемолимфы (Рис. 6). Различие в доле верете-новидных фагоцитов обусловлено, скорее всего, различным процентным соотношением гемоцитов данного типа у личинок 3 и 4 возрастов в норме, так как к 24 часам развития защитной реакции в обоих вариантах процент активных фагоцитов увеличивается в 1,7 раза. Доля эноцитоидов, напротив, нарастает с различной интенсивностью у личинок 3 и 4 возрастов: если у первых к 24 часам развития инфекции процент эноцитоидов возрастает вдвое, то у вторых - втрое.

6% 4 3-

Рис. 6. Доля веретеиовидных фагоцитов (А) и эноцитоидов (Б) у личинок 3 возраста и 3-х суточных 4 возрастаЬ.йесетИпеШа на начальном этапе развития инфекции. * - различие опыта и контроля достоверно, Р>0,95. ПК личинки 3 возраста, I I личинки 4 возраста

Таким образом, у личинок на начальном этапе развития защитных реакций с возрастом достоверно увеличивается интенсивность гемоцитарной дифференциации в направлении клеток, вырабатывающих факторы гуморального иммунитета. Характер гемоцитарной реакции куколки на обработку нелеталыюй дозой БТБ отличается от личиночной некоторым снижением доли веретеиовидных фагоцитов. Действие 0,1% БТБ на 10 суточных имаго 1 генерации вызвала резкое увеличение процента веретеиовидных фагоцитов. При этом доля сферулоцитов и эноцитоидов постепенно уменьшалась к 24 часам развития инфекции.

Приспособленность темной лесной пчелы к суровым природно-климатическим условиям может определяться уровнем и последовательностью проявления активности различных фермен тов и набором физиолого-биохимических реакций, которые могут отличаться от таковых у серой горной кавказской пчелы. Действие бактериального препарата, вызывая видимые изменения кишечника и клеточного состава гемолимфы, должно вызывать закономерные изменения метаболических

процессов. У темной лесной пчелы рост удельной активности Г6ФДГ начинался к 4 часам (Табл. 3). Уровень активности каталазы у всех пчел был достаточно высок, поэтому на этом фоне изменения активности были незначительны.

Таблица 3

Изменение биохимических показателей у рабочих пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica при действии 0,05% битоксибациллина

Варианты 1 нас 4 часа 24 часа

Пчелы Ар. т. mellifera Пчелы Ар.т. caucasica Пчелы Ар. т. mellifera Пчелы Ар. т. caucasica Пчелы Ар.т. mellifera Пчелы Ар. т. caucasica

Г6ФДГ 0,97 4,67 2,24 8,4 1,09 5,87

Каталаза 0,88 1,01 0,89 0,98 0,97 0,98

Пероксидаза 1,09 0,61 1,29 1,26 1,19 0,77

Уроновые кислоты 0,98 2,61 0,93 1,71 1,68 2,08

ДФО 0,88 0,74 1,22 0,95 1,22

Тирозин аза 1 0,81 1,07 1,24 2,79 2,71

КФ 2,39 0,69 3,28 0,34 2,07 0,76

Эстеразы 0,71 0,75 0,91 0,65 1,04 0,75

Протеазы 0,22 0,57 0.3 0,34 0,32 0,32

данные нормированы по контролю, темным фоном отмечено недостоверное отличие от контрольного уровня, Р > 95%; активность Г6ФДГ, каталазы, КФ и эстеразы измеряли в мМ/мин/мг белка; пероксидазу, ДФО, тирозиназу и иротеазы - в ед.ак./мин/мг белка; уроновые кислоты - в мг/г ткани

Небольшие различия в активности пероксидазы были отмечены к 1 часу, наиболее высокий уровень отмечали у темной лесной пчелы. По уровню дифенолокси-дазной активности на начальной стадии воздействия БТБ наблюдались существенные различия между подвидами; наиболее высокий уровень удельной активности отмечался у темной лесной пчелы. Наибольшие различия наблюдали по уровню активности кислой фосфатазы, более высокий уровень активности в течение первых 4 часов был у темной лесной пчелы с последующим снижением к концу суток, и наоборот, самый низкий был у серой горной пчелы. Самый высокий уровень содержания ГАГ наблюдали у темной лесной пчелы и низкий у серой горной пчелы.

При первичном действии на пчел 0,05% БТБ количество прогемоцитов у темной лесной пчелы было относительно стабильным в течение суток и составляло около 80% от общего числа клеток гемолимфы, из которых 20% составляли делящиеся прогемоциты (Рис. 7 А). Постепенно увеличивался процент веретеновидных фагоцитов, в начале эксперимента они составляли всего лишь 2%, но к 4 часам

количество их возросло до 16%, уменьшаясь к концу I суток почти вдвое. Количество прогемоцитов у серой горной пчелы в начале эксперимента несколько превышало 80% (Рис. 7 Б). У серой горной пчелы к 1 часу от начала эксперимента снижается количество амебоидных фагоцитов (от 9% до 1%) и пропорционально увеличивается количество веретено видных фагоцитов,

А Б

100%

□ Мкц

■ Эоз. ИВер.фгп Ш Ам.фгц ВДПГ

■ ПГ

100% ■—¡I.....ML_Jgfm

80% L 1

60% Д

40% Д

20% Д

0ч. 1ч. 4ч. 24ч.

□ Мкц

■ Эоз. ЦЩВер.фш

■ Ам.фгц НДПГ ВПГ

Рис. 7. Изменение гемограммы у пчел Ар. да. melllfcra (А) и Ар. да. caucasica (Б) при действии 0,05% битоксибациллина; Мкц-макронуклеоииты,Эоз-эозинофи-лы; Вер.фгц- веретеновидные фагоциты, Ам.фгц-амебоидные фагоциты, Дпг-де-лящиеся прогемоциты, Пг-прогемоциты

Таким образом, нелетальные дозы патогенного препарата вызывают у насекомых активную гуморальную реакцию с участием специфических гемаггдютининов и фенолоксидазной и антиокислительной систем на начальном этапе защитного процесса, различающуюся по уровню специфичности на разных этапах онтогенеза насекомого. В то же время гуморальные защитные реакции насекомых функционируют в тесной взаимосвязи с клеточными компонентами гемолимфы, являющимися как источниками, так и мишенями для целого ряда факторов гуморального иммунитета.

3. Особенности иммунизации насекомых и реактивность биохимических защитных механизмов при воздействии битоксибацидлином

Способность насекомых к иммунизации, повышающей устойчивость особей, обычно вызывали сомнение. Сроки сохранности приобретенного иммунитета остаются спорными, считается, что в отношении некоторых микроорганизмов он исчезает быстро, в отношении других медленно (Полтев, 1969; Cui et al., 2000). Очевидно, что в данных исследованиях не были учтены особенности онтогенеза насекомых и подробное изучение биохимических процессов при иммунизации. Кроме того, спорным остается значимость вклада иммунизации в формирование общей устойчивости насекомых (Pesh et al., 2000; Омельянчук, 2001). Открыт также вопрос о влиянии иммунизации на формирование онтогенетической адаптации насекомых (Cohen, Crittenden, 2004; Lopez-Martinez et al., 2008).

Предварительная обработка насекомых нелетальной дозой БТБ изменяла соотношение защитных клеток гемолимфы при повторном заражении в сравнении с

неиммунизированными особями. Следствием иммунизации личинок в 3 возрасте являлось увеличение доли сферулоцитов и эноцитоидов в первые часы после повторного заражения личинок 4 возраста. Иммунизация личинок в 1 -е сутки 4 возраста проявлялась в увеличении доли активных фагоцитов на начальном этапе развития инфекции в сравнении с неиммунизированными особями (Рис. 8 А).

А Б

О 0,5 1 2 4 24

Рис. 8. Изменение доли веретеновидных фагоцитов у иммунизированных личинок 4 возраста (А) и имаго первой генерации (Б) колорадского жука. □ однократно обработанные БТБ, В повторно обработанные БТБ. Данные нормированы по контролю. * - различие опыта и контроля достоверно, Р>0,95.

Обработка личинок 4 возраста нелетальной дозой БТБ оказала иммунизирующее действие при повторном заражении куколок, стимулируя у последних направление дифференциации гемонитов в сторону веретеновидных фагоцитов, образующихся как при активации амебоидных фагоцитов, так и из прогемоцитов (Рис. 8 Б). Действие нелетальных доз БТБ на имаго колорадского жука (1 -ой генерации и перезимовавших) производило иммунизирующий эффект, увеличивая процент активных фагоцитов в первые часы после повторного заражения. Реализация биохими-

Рис. 9. Динамика активности ферментов фенолоксидазиой (ФОС) и аитиокисли-тельной (АОС) систем в гемолимфе имаго Ь.йесетИпеШа при двукратном действии БТБ. Данные нормированы по контролю. * - достоверное отличие опыта от контроля (Р>0,95).

И дифенолоксидаза, •♦«• тирозиназа, — каталаза, ......

пероксидаза

ческих защитных механизмов при повторном заражении ЬЛесетИпеШа также характеризуется онтогенетическими особенностями. У личинок 4-го возраста она проявляется в стабилизации активности ферментов антиокислительного комплекса и в повышении реактивности дифенолоксидазы и титра агглютининов, а у имаго - в повышении активности тирозиназы и титра агглютининов (Рис. 9).

Таким образом, и при двукратном действии бактериального препарата иммунный ответ личинки 4-го возраста сочетает как неспецифическую реакцию, так и элементы специфических механизмов защиты, тогда как у перезимовавшего имаго агглютинирующая и тирозиназная активности гемолимфы обеспечивают эффективное распознавание. В целом, повышенная активность биохимических и клеточных реакций на повторное введение бактериального препарата и сохранение эффекта иммунизации при смене возрастов личинок и онтогенетических стадий ЬЛесетИпеШа позволяют говорить о способности насекомых к развитию иммунной памяти. Эксперимент по выживаемости мух и колорадского жука при иммунизации на стадии личинок показал, что предварительная обработка маленькой концентрацией битоксибациллина 0,001% (СК16) повышала выживаемость мух при действии повторной концентрацией 0,005% (СК50), а также при действии БТБ 0,02% (СКМ) (Рис. 10).

А В

личинки имаго

Рис. 10. Иммунизирующее действие нелетальной концентрации (НК) БТБ на насекомых

А - смертность (%) имаго Musca domestica L.; Б - смертность (%) Leptinotarsa decemlineata Say. НК - нелетальная концентрация, СК50 и СК84 - концентрации, вызывающие гибель 50% и 84% особей соответственно.

Повторное воздействие на пчел через 7 суток более высокой концентрацией бактериального препарата вызвало значительные изменения в динамике активности практически всех показателей (Табл. 4).

Уровень удельной активности Г6ФДГ у серой горной пчелы при повторном заражении значительно ниже, чем у темной лесной пчелы, что, возможно, свидетельствует о большей активации гликолитических процессов у последних. Количество уроновых кислот у серой горной пчелы возрастал о. У иммунизированной темной лесной пчелы количество их на протяжении первых суток уменьшался, что позволяет предположить у этой группы пчел интенсивный процесс гликоконыога-ции, способствующий связыванию токсических продуктов. Так, например, было

Таблица 4

Динамика биохимических показателей у иммунизированных пчел

Варианты Apis melliferacaucasica \ Apis mellifera mellifera

Время развития защитных реакций

0 час 1 час 4 час 24 час 0 час 1 час 4 час 24 час

Г6ФДГ 0,002±0, 0002 0,002±0, 0001 0,0031± 0,0002 0,0195± 0,0011 0,048± 0,0012 0,003+ 0,0002 0,002 8± 0,0001 0,048±0, 0011 . ■

Каталаза 16,17+ 0,23 16,02г. 0,21 18,78+ 0,22 19,24± 0,24 17,08+ 0,23 21,37+ 0,25 17,33± ' 0,19 18,25± 0,19

Пероксидаза 0,047± 0,004 0,092± 0,008 0,021± 0,002 0,096± 0,005 0,113± 0,008. ' 0,086+ 0,003 0,048+ 0,004 0,08± 0,006

Малоновын диальдегид 0,002+ ■ 0,0002 0,0020.0002 0,0021± 0,0001 0,0039+ 0,0003 0,001 + 0,0001 0,001± 0,0002 0,0021± 0,0004 ' 0,003± 0,0003

Уроновые кислоты 2,42± 0,034 2,404± 0,034 1,92+ 0,024 0,8 8± 0,01 1,0+ ■ 0,011 . 1,36± 0,014 2,07± 0,034 0,83+ 0,01

Дифенал-оксидаза 0,00£± . 0,0009 0,006± 0,0004 0,002± 0,0003 0,029± 0,001 0,008+ 0,0009 0,009+ 0,0008 0,007+ 0,0009 : 0,00Stt • 0,0007

Тирознназа 0,0006+ 0,0002 . 0,000-±. 0,0001 0,0095± 0,0009 0,0026± 0.0004 0,013± 0,0008 0,004+ 0,0001 0,0046± 0,0009 0,0094± 0,0005

Протеазы кишечника 0,076+ 0,01 4,2 5± 0,02 2,71± 0,01 3,01± 0,04 2,09+ 0,03 7,86± 0,06 3,48± 0,04 2,41 ± 0,01

Эстеразы 10,34± 0,09 8,86± 0,04 10,95± 0,08 9,79± 0,05 9,61+ 0,04 13,12± 0.09 12,37± 0,08 9,21± 0,04

Кислая фосфатаза 2,11+ 0,02 1,72± 0,01 1,26± 0,01 1,58+ 0,02 1,2 9± 0,03 1,84± 0,01 1,97± 0,02 1,77± 0,01

Примечание: активность дифенолоксидазы, тирозиназы, протеаз, пероксидазы указаны в условных единицах, эстераз и кислой фосфатазы в мг/мин/мг белка, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, каталазы мкМ/мин/мг белка, малонового диальдегида в нМ/мг ткани, уроновых кислот мг/г ткани; темный фон обозначает недостоверное различие с контролем при Р ^ 95 %.

показано, что у других видов насекомых при токсических воздействиях активируется ключевой фермент пентозного шунта Г6ФДГ и образование активированных гшокозвдов, принимающих участие в гпикоконьюгации токсинов (Екеп^еп, НиИтагк, 2001; Богепьсп й а1., 2005). Дифенолоксидазная активность после обработки БТБ низкой концентрации не менялась у всех групп пчел относительно контроля. Однако при воздействии БТБ удвоенной концентрации этот показатель оставался относительно стабильным только у темной лесной пчелы. Активность тирозиназы при обработке малыми дозами БТБ почти не отличалась от исходного уровня у всех пчел; в то же время на удвоенную концентрацию препарата максимальная реакция выявлена в группе семей темной лесной пчелы, тогда как для серой горной пчелы эти отклонения не столь значительны.

Таким образом, иммунизирующее действие низких доз битоксибациллина способствует повышению реактивности защитных клеточных и гуморальных факторов

при повторном действии БТБ на насекомых, способствуя формированию долговременной иммунной памяти.

4. Биохимические основы использования биологически активных веществ в качестве адаптогенов для насекомых

В ряде работ было показано, что олигосахариды, олигонуклеотиды, олигопеп-твды и оксигенированные производные ненасыщенных жирных кислот и каротино-идов могут действовать как элиситоры (Чалова, Озерецковская, 1976; Ryan, Farmer, 1991; Тарчевский, 1992; Jing et al., 2007). При обычных, стационарных условиях их регуляторная функция мало заметна, но при сильных изменениях окружающей среды или действии патогенных организмов, когда усиливается распад биополимеров, она проявляется в подключении триггерных механизмов обеспечения выживания организмов. Особый интерес представляет использование с этой целью хитиновых олигосахаридов. В литературе имеются единичные сведения по использованию хитиновых олигосахаридов в качестве биологически активных соединений на насеко-

Таблица 5

Недельная динамика активности биохимических показателей пчел в норме и при действии хитозана

Вариант Г6ФДГ (мМ/мин/мг белка) Каталаза (мМ/мин/ мг белка) ПО (ед.акт./ мин/мг белка) МДА (нМ/г ткани) ФО (ед.акт,/ мнн/мг белка) Протеиназы (ед.акт./ мин/мг белка) ИП (едакт/ мин/мг белка) ГАГ (мг/г ткани)

Недельная динамика (контрольные пчелы)

1 суг. 0,0018+ 0,0003 44,81± 0,27 0,171± 0,017 4,64± 0,15 0,111± 0,004 12,79± 0,01 4,23± 0,02 2,54+ 0,05

2 суг. 0,0021+ 0,0003 30,77± 0,27 0,135± 0,033 5,05± 0,06 0,125+ 0,017 2,91± 0,04 4,79± 0,03 2,16+ 0,03

3 сут. 0,0160+ 0,0002 55,81+ 0,37 0,145± 0,004 5,24± 0,04 0,257+ 0,026 0,43± 0,01 1,38+ 0,11 3,64± 0,01

4 сут. 0,0051± 0,0006 25,22± 0,21 0,124+ 0,003 7,43+ 0,10 0,155+ 0,030 4,41+ 0,01 2,41± 0,24 ЗД1± 0,02

5 сут. 0,005 8± 0,0004 45,99+ 0,41 0,241± 0,001 11,61± 0,09 0,401+ 0,014 0,56+ 0,06 2,44+ 0,03 1,82+ 0,26

Недельная динамика при действии хитозаном на пчел

1 сут. 0,005 8± 0,0004* 45,06± 059 0,077± 0,001* 5,42± 0,08 0,162+ 0,012* 0,82± 0,04* 1,61± 0,09* 3,14± 0,12*

2 сут. 0,0041± 0,0003* 35,25± 1,55* 0,141± 0,003* 4,64± 0,12 0,101± 0,009* 0,52± 0,01* 1,79± 0,01* 5,48± 0,06*

3 сут. 0,0148± 0,0012* 53,39± 0,14 0,197± 0,008* ЗД2± 0,13* 0,174+ 0,003* 0,43 ± 0,01 1,14± 0,07* 6,72± олз*

4 сут. 0,0215± 0,0015* 35,11+ 0,22* 0,109+ 0,021 6,23± 0,09 0,119± 0,014* 0,93± 0,04* 2,81+ 0,028 5,96+ 0,005*

5 сут. 0,005 5± 0,0004 82,01+ 1,04* 0,139+ 0,005* 9,22+ 0,11* 0,641± 0,023* 0,47± 0,01* 2,47± 0,03 2,28± 0,01*

*-доверительный интервал, р=0,95

мых (Furukawa et al., 1999; Zaharoff et al., 2007), так было показано, что хитозан вызывает экспрессию генов антибактериальных пептидов у тутового шелкопряда, повышая уровень гуморального иммунитета. Наличие хитиновых структур у насекомых и комплексов деградирующих их ферментов позволяет предположить, что продукты катаболизма хитина могут выполнять достаточно важные регуляторные функции в организме насекомых. Пчелы в течение 5 дней содержались на обычном сиропе и для сравнения на сиропе с хитозаном, и ежедневно из садков отбирались насекомые для проведения биохимических исследований 5 раз с промежутком в 1,5 часа в одно и тоже время суток. Наблюдая суточную и недельную динамику биохимических показателей в норме, можно отметить плавное протекание биохимических реакций, без значительных подъемов и спадов (Табл. 5). При скармливании пчелам хитозана и регистрации активности ферментов в течение пяти суток отмечалось повышение активности пероксидазы с пиком на третьи сутки. Несколько снижалось содержание ТБК-реагирующих продуктов, особенно на третьи сутки, когда отмечался пик активности антиокислительных ферментов. Ранее было показано, что производные хитина проявляли значительную активность против гидроперокевд- и пе-роксид- радикалов, стимулируя активность лизосомальной системы (Xue et al., 1998). Следовательно, правомерным будет утверждение того, что хитозан стимулировал активность систем, снижающих уровень пероксид радикалов.

Начиная с третьих суток, происходило повышение активности Г6ФДГ. С первых суток наблюдался устойчивый рост ГАГ с пиком активности между 3-ми и 4-ми сутками от начала эксперимента. Спад активности Г6ФДГ и содержания ГАГ происходили к концу пятых суток. Можно предположить, что хитозан, воздействуя на определенные рецепторы, подвергается дальнейшей деградации системой хитино-литических ферментов и включается в обмен углеводов. При этом может происходить активация пентозофосфатного пути и метаболически связанного с ним процесса образования эндогенных тликозоаминогликанов. Подобного рода механизмы были отмечены при клиническом патогенезе у млекопитающих в результате применения экзогенной субстанции гаикозоаминогликанов, выделенных из плацентарных тканей, что способствовало индуцированию восстановительных процессов (Зим-ницкий А.Н., Башкатов С. А., 2006). Помимо образования УДФ-глго ко з идо в в глюку-ронат-ксилулозном цикле, который также имеется у насекомых, повышение активности пентозофосфатного пути способствует образованию НАДФЧН2, что может активировать систему цитохромоксидаз, фенолоксидаз, синтез экдистероидов и других важных защитных процессов, заинтересованных в использовании НАДФЧН2 Подобного рода процессы были отмечены у лабораторных крыс при экспериментальных нагрузках (Лабори, 1970; Парк, 1973), а также у насекомых (Rabea et al., 2006). Интенсификация этих процессов активизирует антирадикальную защиту, что является значимым звеном в цепи реакций, обеспечивающих взаимосвязь между соста-

вом липидов, степенью их окисле1шя и структурой мембран. Наряду с этим хитозан определенно воздействовал на уровень активности и спектр молекулярных форм ферментов фенолоксидазной системы. Вероятно, имеется какой-то исходный набор изоформ ФО, обеспечивающий потребности организма в норме.

Поэтому последующее действие на насекомых бактериальным препаратом, клеточные стенки бактерий которого имеют; вероятно, некоторое сходство с хитоза-ном, могут вызывать более быструю и эффективную реакцию уже подготовленной ферментативной системы. Довольно сходный тип реакции был описан в отношении такой же сложной ферментативной системы цитохрома Р-450 по отношению к постоянно действующим одним и тем же ксенобиотикам (Арчаков, 1979; Ковалев, Шипулина, 1992; Сибиряк, Вахитов, Курчатова, 2003). В нашем эксперименте достаточно выраженные изменения активности почти всех наблюдаемых биохимических ферментов приходятся иатретьи сутки содержания пчел нахитозане. Заметное влияние хитозана, как сигнальной молекулы, на биохимические процессы позволяет предположить, что они могут оказывать преадаптивное действие на насекомых (Рис.11).

Рис. 11. Преадаптивное действие хитозана на медоносную пчелу при заражении битоксибациллином (подкормка 3 суток) (показатели нормированы по контролю, р>0,95).

Ферментативные системы «откликались» значительно раньше при действии на пчел БТБ, чем у пчел не получавших хитозан. В течение первых суток количество ГАГ повышалось примерно в 4 раза. Интенсивность образования ГАГ в первые

часы заражения позволяет предположить активацию этих процессов хитозаном как до заражения, так и после него. Значительный «запас» глюкуронидов, вероятно, способствовал более интенсивной нейтрализации токсических агентов на протяжении первых суток при заражении БТБ. В течение суток происходило снижение активности Г6ФДГ с последующим восстановлением почти до контрольного уровня, однако уровень активности при предварительном содержании пчел на хнтозане оказывался значительно выше, чем у пчел, не получавших хитозан. Активность ферментов фенолоксидазной системы к концу 1-х суток возрастала почти в 1,5 раза.

Для того, чтобы оценить возможное проявление биологической активности хи-тосахаридов на других видах насекомых, подобного рода эксперименты были поставлены на личинках 4 возраста второй генерации колорадского жука и личинках 2 возраста комнатной мухи. Результаты экспериментов приведены в таблице 6. Использовали комнатную муху и колорадского жука для определения воздействия хи-тосахаридов на онтогенез насекомых, и было установлено, что их добавка в корм личинок оказывала влияние на время развития насекомых. Процент выхода имаго снижался в варианте с подкормкой хитином и сохранялся на высоком уровне в вариантах с хитозаном и NAGA. На скорость развития личинок мухи большее влияние оказал хитозан и NAGA, а на личинок колорадского жука- NAGA. Таким образом, можно утверждать, что хитозан и NAGA обладают выраженной биологической активностью по отношению к организму насекомых, что заключается в повышении выживаемости особей при действии неблагоприятных факторов, а также в изменении стереотипа поведенческих реакций во времени. При этом характер действия хитосахаридов зависел от степени полимеризации и деацетилирования, стадии онтогенеза и вида насекомого.

Таблица 6

Зависимость выживания колорадского жука, комнатной мухи и медоносной пчелы от концентраций хитосахаридов

Вариант Кон- NAGA, вьгж. в % Хитозан, выж. в % Хитин, выж. в %

Конц. в % троль 0,0001 0,001 0,01 0,0001 0,001 0,01 0,0001 0,001 0,01

Колорад- 84± 86+ 88± 50± 80± 82± 46± 66± 58+ 22+

ский жук 3,1 2,5 3,1 5,1* 4,2 2,2 3,4* 2,4* 4,2* 2,4*

Комнат- 70± 76± 80± 30+ 86± 88+ 40± 50± 68± 20±3,

ная муха 5,0 4,2 2,8* 2,2* 1,6* 3,4* 4,0* 4,6* 2,8 4*

Медонос- 70,0± 65,3± 75,2+ 25,1+ 70,5± 84,6± 29,7± 58,7± 35,0± 12,5+

ная пчела 4,5 2,5 3,1* 3,2* 2,4 5,1* 4,2* 3,5* 2,5* 2,4*

•-различия с контролем достоверны, р=0,95

Для медоносной пчелы наибольшая степень адаптивного действия установлена для хитозана, что выражается в индукции гуморальных факторов защитных реакций, формируя так называемый ферментативный структурный след адаптации.

5. Роль критических периодов онтогенеза в проявлении трансгенерационного эффекта защитных реакций в ряду поколений Musca domestica

Тесная взаимосвязь иммунной и нейроэндокринной систем с генетическими механизмами преобразования насекомых может играть значительную роль в формировании долговременной иммунной памяти, обеспечивающей устойчивость на протяжении всего онтогенеза, а возможно и в последующих поколениях, что до сих пор для них считалось невозможным. Именно поэтому большую роль в изменении фенотипической реализации генотипа могут играть критические периоды развития насекомых. Они связаны с периодами преобразования особей в ходе индивидуального развития и могут представлять собой наиболее значительные этапы для действия отбора в процессе эволюции. По мнению Л.И. Корочкина (2002) стало очевидным, что живые системы обладают оперативной "памятью", которая находится в непрерывном контакте со средой и могут использовать средства природной эмбри-огенетической инженерии для быстрого наследуемого перехода из одного режима функционирования в другой. Такими важными моментами в процессе индивидуального развития, когда при действии стимулирующих факторов внешней среды происходит «запечатление той самой оперативной памятью» необходимых процессов, могут стать периоды повышенной чувствительности. Стимуляция защитных систем в эти периоды может способствовать возникновению так называемого трансгенерационного эффекта, т.е. некоторым адаптивным изменениям в активации или регуляции некоторых защитных механизмов, которые смогут передаваться в нескольких поколениях насекомых. Подобного рода эффект был описан на шмелях и дафниях, однако биохимические механизмы и реализующие их условия отмечены не были (Moret, 2001; Kurtz, 2004; Moret, 2006).

Для выявления чувствительных периодов в онтогенезе насекомых фиксировали изменение активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем, участвующих в формировании покровов при метаморфозе и при воздействии аскорбиновой кислоты -модулятора данных защитных процессов и активного антиок-сиданта. В формировании экзоскелета насекомых важную роль играют производные тирозина, в связи с чем, процессы линьки и метаморфоза сопровождаются у насекомых изменениями в обмене тирозина (Гилмур, 1968; Terwilliger, 1999; Kramer et al., 2001), начальный путь превращения которого катализируют ферменты, наделенные фенолоксидазной активностью. У насекомых выделены и описаны тирози-наза и дифенолоксидаза, активность которых значительно изменяется в онтогенезе. Использование определенных различий в субстратном предпочтении может быть полезным при выяснении сложных ферментативных механизмов линьки и метаморфоза у насекомых. Хорошими субстратами для всех фенолоксидаз являются дифенолы, однако, только тирозиназа способна катализировать гидроксилирование тирозина с образованием дигидроксифенилаланина (ДОФА). Отличительной особенностью этой реакции является также то, что для ее протекания требуется присут-

ствие доноров электронов (Fontecave, Pierre, 1998; Rodriguez-Lopez et al., 2001; Гука-еян, 2002). Для определения максимумов и минимумов в активности этих ферментов в онтогенезе, исследовали подробную динамику активности этих ферментов, а также изменение активности в эти периоды под влиянием донора электронов и регулятора активности этих ферментов аскорбиновой кислоты (Рис. 12). Несмотря на изменения активности ферментов, при дисперсионном анализе с применением критерия Краскелла-Уоллиса нами было получено подтверждение значимости фактора «возраст» для признака активности ферментов при р>95%: фактические значения критерия Н превышали табличные как для тирозиназы (Нфак1=7.83; НтагЬ=7.82), так и для дифенолоксидазы (Н4якг=4.76; HrfjI=4.71).

Рис. 12. Действие аскорбиновой кислоты на динамику активности тирозиназы (А) и дифенолоксидазной (Б) активностей в ходе развития комнатной мухи. По оси абсцисс: 1; 2-8-е, 10-е сутличиночной стадии; 3-фаратпый пупарий; 4-8-2; 4; 12; 18; 24-й чкуколочного развития; 9; 10-2-; 4-е сут куколочного развития; 11-фаратные имаго; 12; 13 -1-; 2-е сут имагиналыюго развития. По оси ординат-активность фермента, ед. акт/мин/мг белка. Сплошная линия- контроль, пунктирная-аскорбиновая кислота, Достоверное повышение активности ферментов.

В альтернативных экспериментах было рассмотрено действие битоксибацилли-на на личинок комнатной мухи в концентрации, исключающей летальное действие (Табл. 7), отсекая фактор отбора устойчивых особей, но оказывающей при этом определенное стимулирующее действие на защитные системы.

При воздействии бактериальным препаратом битоксибациллином в концентрации 0,01% (концентрация была отобрана в предварительных экспериментах, вызывающая гибель особей на уровне контроля, около 5-8%) на разных сроках развития личинок комнатной мухи можно отметить следующее. При действии БТБ на 3-х суточных личинок отмечали достоверное сокращение сроков развития личиночной стадии примерно на трос суток и почти на 2 суток сокращение сроков развития пупариев. При этом процент окуклившихся личинок и вылетевших имаго был выше, чем в контроле.

При воздействии бактериальным препаратом на 6-ти суточных личинок достоверно возрастал средний вес пупария и увеличивался срок развития личиночной стадии. Действие БТБ на 8-ми суточных личинок достоверно уменьшало процент окуклившихся особей и вылетевших имаго. При воздействии препаратом на 10-ти суточных личинок наблюдался самый высокий процент окуклившихся особей и вылетевших имаго.

Таблица 7

Жизненные показатели Musca domestica L. при действии БТБ в концентрации 0,01% на разных сроках развития личинок

Вес Р, Продолжительность стадии % выживших Дли- К плодо-

мг развития особей на стадии тельност витости

L, сут Р, сут I, сут Р I ь репродуктивного периода, сут

Контроль для 3-х суточных личинок

13,9+1,3 | 11,0±1,0 6,511,0 40,0+5,0 36,012,0 | 30,0+2,0 25,015,0 0,1510,03

Контроль для 6-ти суточных личинок

12,4±1,2 11,4±0,3 5,911,0 41,014,0 40,014,0 38,012,0 24,0+3,0 0,1910,2

Контроль для 8-ми суточных личинок

11,5±0,2 12,4+0,5 6,010,9 39,015,0 41,0±3,0 35,012,0 24,0+3,0 0,1610,2

Контроль для 10-ти суточных личинок

13,6±0,9 11,2±0,2 6,2+0,8 40,014,0 41,012,0 38,013,0 26,012,0 0,1810,4

БТБ на 3-х суточных личинок

17,2+1,6 8,5±0,5 4,011,0 45,014.0 41,012,0 38,013,0; 27,0+3,0 0.2710,05

БТБ на 6-ти суточных личинок

Т 7,011,0 I 13.510.6 5,110,9 46,011,0 39,0+3,0 36,013,0 25,0+2,0 0,18+0,4

БТБ на 8-ми суточных личинок

12,4+1,2 | 11,5+0,5 6,3+0,5 41,011,0 35;ш,0 | 31,0+2,0 24,012,0 0,12+0,1

БТБ на 10-ти суточных личинок

20,4+1,2 | 12,6+0,4 4,9+0,4. 45,0+2,0 49.013,0 . 46,0+1,0 28,014,0 0,2610,4

Ь — личинка, Р — куколка, I — имаго, цветом отмечено, что различие между опытом и контролем достоверно (Р<0,05)

Значительные изменения наблюдали в активности ферментов антиоксидант-ной и фенолоксидазной систем на последующих стадиях развития комнатной мухи (Рис. 12). При воздействии БТБ на 3-х суточных личинок наблюдали возрастание активности дифенолоксидазы в 8 раз в гемолимфе у этих же личинок, но на 6-е сутки развития, и в 9 раз у куколок 1 -х суток развития. Самую высокую активность тирози-назы также наблюдали на этих же сроках развития, что подтверждает наличие долговременной онтогенетической стимуляции данных ферментов. Наибольшая активность пероксидазы также проявлялась на стадии формирования куколок, подтверждая взаимодействие данных систем и участие в формировании куколочных покровов.

жгивп ость дифепо.шксидаи.)_

Г ± - грГ" ~~

■ 'г . + " *

. г-

.1 +

Л Л ■ п п

1 В II II !■ II! Л

Ьб Ь8 цо р| Р4 12

Рис. 12. Динамика активности ферментов фенолоксидазной и антиоксидантной систем в онтогенезе комнатной мухи при действии БТБ на 3-х суточных личинок. Ь- личиики, Р - пупарии, I- имаго. 1 - покровы, 2 - кишечник, 3 - гемолимфа; для пупария: 2 - задняя часть, 3 - содержимое. Данные нормированы по контролю. * - различие опыта и контроля достоверно, Р>0,95.

При воздействии битоксибациллииом на 8-ми суточных личинок комнатной мухи можно отметить повышение активности дифенолоксидазы и тирозиназы у 10-ти суточных личинок во многих тканях организма, кроме гемолимфы (Рис. 13). Дифенолоксидаза превышала контрольный уровень почти в 2 раза у суточных пу-париев в общем гомогенате и передней части куколки, у четырехсуточных пупари-ев этот фермент почти в 3 раза превышал контрольные значения в задней и передней частях куколки, а также в кишечнике у суточных имаго. В остальных случаях активность этих ферментов была сопоставима с контролем. Трехкратное превышение контрольного уровня активности каталазы наблюдали в передней части суточных пупариев. Более чем в 2 раза этот показатель превышал контрольные значения в передней и задней частях у 4-х суточных пупариев. Пероксидазная активность превышала контрольный уровень более, чем в 2,5 раза у 10-ти суточных личинок в кишечнике и в голове. У суточных пупариев пероксидаза активировалась почти в 3,5 раза по отношению к контролю в покровах, у всех этот показатель превышал контроль более чем в 2 раза в кишечнике, а у 2-х суточных имаго также в покровах. В данном случае можно отметить, что воздействие бактериальным препаратом на насекомых проводилось в те моменты онтогенеза, когда активность данных ферментов была максимальной. На последующих стадиях онтогенеза активность данных ферментов была значительно снижена.

3 та 1 ю 1 2 I <5 5 f ак"| nuHoci ь дифенилокчтида^ы а + □ ■ □

3 -У- 1

■i

'■л L1 FT 1

I

0 PI >4 12 15

2 3

1 2 3

Рис. 13. Динамика активности ферментов фенолоксидазной и антиоксидантной систем в онтогенезе комнатной мухи при действии БТБ на 8-ми суточных личинок. L—личинки, Р - пу парии, I - имаго. 1 - покровы, 2 -кишечник, 3 - гемолимфа; для пупария: 2 - задняя часть, 3 - содержимое. Данные нормированы по контролю. * - различие опыта и контроля достоверно, Р>0,95.

Таким образом, можно отметить следующие особенности. При воздействии на 3-х суточных личинок бактериальным препаратом сохранялась стабильно повышенная активность всех параметров в покровах и гемолимфе, при действии на 6-ти суточных личинок активность сохранялась, в основном, в тканях кишечника и во внутреннем содержимом пупариев. При действии на 10-ти суточных личинок активность сохранялась, в основном, в покровах, в тканях головы и содержимом у пупариев. Общим для всех этих экспериментов было то, что при воздействии на 3-х, 6-ти и 10-ти суточных личинок, когда рассматриваемые ферменты иммунитета были на минимуме своей функциональной активности, наблюдался рост и сохранение активности данных параметров на последующих стадиях онтогенеза в определенных органах и тканях. При этом жизнеспособность особей в определенной мере повышалась. У 8-ми суточных личинок, наоборот, в этот период был некоторый подъем активности данных ферментов, но при воздействии наних БТБ наблюдалось на последующих стадиях общее снижение активности ферментов и жизненных показателей. Эти экспериментальные данные свидетельствуют о наличии критических и основных периодах онтогенеза. Возникает при этом идея малого параметра, высказанная A.M. Молчановым (1975), и особенно принятая в биохимии, обозначающая узкое место в реакции или функциональной системе. Как правило, такими узкими

местами являются ферменты с низкой каталитической активностью или обладающие важными регуляторными функциями (Анохин, 1975; Панин ,1983). Такой ферментативной системой, по-видимому, в данном случае может быть фенолоксидаз-ная система. Вероятно, что активация наблюдаемых защитных процессов в гемолимфе и покровах, а также в содержимом пупарисв, и дальнейшее сохранение повышенной активности в этих же тканях в онтогенезе могут указывать на интенсификацию защитных процессов именно здесь.

По результатам предварительного биотеста и проведенных ранее исследований (Салтыкова, 2000), NAGA был выбран нами в качестве фактора, условно модулирующего действие патогена, для проведения эксперимента, в котором определялась длительность биохимических защитных реакций на действие факторов разной природы (NAGA и высокая температура) в онтогенезе M.domestica. В данном эксперименте определялся уровень активности дифенолоксидазы, каталазы и пероксидазы личинок, куколок и имаго M.domestica в 4-х вариантах: 1) контроль, 2) личинки перенесли тепловой стресс, 3) личинки развивались в среде, содержащей NAGA, 4) личинки развивались в среде, содержащей NAGA, и перенесли тепловой стресс. Воздействие проводили в критические периоды онтогенеза, для того чтобы определить продолжительность активации защитных механизмов. Действие NAGA и высокой температуры на личинок вызвало достоверное повышение (Р>0,95) активности каталазы, пероксидазы и дифенолоксидазы на куколочной и имагинальной стадиях (Табл. 8). Полученные нами данные, демонстрирующие после воздействия темпе-

Таблица 8

Активность каталазы, пероксидазы и дифенолоксидазы в о иго relíese М. domestica при действии NAGA и высокой температуры

Активность каталазы, нМ/мин/мг белка Активность пероксидазы, ед.акт./мин/мг белка Активность дифенолоксидазы, ед.акт./мин/мг белка

L Р I L Р / L Р I

К 11,30 ±1,50 6,12 ±0,78 25,30 ±2,45 0,053 ±0,004 0,048 ±0.008 0,109 ±0,011 0,033 ±0,004 0,050 ±0,002 0,030 ±0,003

т°с 31,50 ±2,7 18,24 ±2,20 59,62 ±2,54 0,058 ±0,003 0,102 ±0.008 0,187 ±0,006 0,035 ±0,002 0,090 ±0,004 0,080 ±0,002

NAGA 22,43 ±1,32 10,51 ±0,73 20,25 ±1,40 0,057 ±0,003 0,098 ±0.004 0,140 ±0.008 0,026 ±0,002 0,095 ±0,003 0,059 ^±0,006

NAGA +Т°С 17,80 ±2,10 12,00 ±1,20 36,55 ±2,75 0,055 ±0,003 0,070 ±0.003 0,140 ±0,005 0,036 ±0,004 0,122 ±0,009 0,085 ±0,008

В затемненных клетках различие опыта с контролем достоверно (Р>0,95). L — личинка, Р — куколка, I — имаго. К — контроль, Т°С — личинки перенесли тепловой стресс, NAGA — личинки перенесли действие NAGA, NAGA+ Т°С — личинки перенесли действие NAGA и тепловой стресс.

ратурного фактора на насекомых, повышенный уровень активности ферментов антиокислительной системы и дифенолоксидазы на последующих этапах онтогенеза, свидетельствует о долговременности функционирования стимулированных температурным фактором антиоксидантной и фенолоксидазной систем. Повышение активности ферментов фенолоксидазной и антиокислительной систем при действии температурного фактора у насекомых рассматриваются как часть защитных реакций, направленных на снижение цитотоксического действия перекиси водорода и на регуляцию уровня биогенных аминов (Раушенбах и др., 1993; Сухорукова, 2002).

Воздействие NAGA на личинок М.domestica также стимулировало защитные системы организма насекомого, вызывая стойкое повышение уровня активности дифенолоксидазы на следующих стадиях онтогенеза. На фоне теплового стресса NAGA оказывало стабилизирующее действие на активность антиокислительных ферментов. Возможно, предварительное содержание насекомых на NAGA активизирует процесс ферментативной деградации перекиси водорода при тепловом стрессе и стабилизирует активность антиокислительных ферментов на уровне, приближающемся к соответствующим контролю значениям. Вместе с тем, NAGA повышал у насекомых уровень метаболизма в целом, физиологическими показателями чего являлись сокращение сроков развития личинок и куколок, увеличение веса куколок, а также оказывал компенсаторное действие при тепловом стрессе, значительно повышая жизнеспособность особей (Рис. 14).

Сроки развития, сут

Вес куколок, мг

NAGA

контроль

контроль NAGA

Количество жизнеспособных имаго,

нормировано по контролю 1,1

I | Т°С цщ NAGA TV

Рис. 14. Воздействие NAGA на жизненные показатели M.domestica. * - достоверное отличие от контроля (Р>0,95).

личинка I II III IV

куколка I II III IV

имаго I II III IV

0 0,2 «,4 -0,6 0,8 -

1 1,2 1,4 1,0 "

Рис. 15. Индукция дополнительных молекулярных форм фенолоксидазы в онтогенезе M.domesfica L. при действии NAGA и (или) теплового стресса. I - контроль, П -личинки перенесли тепловой стресс, Ш-личинки перенесли действие NAGA, IV-личинки перенесли действие NAGA и тепловой стресс.

Действие NAGA на M.domestica L. индуцировало дополнительные изоформы фенолоксидазы, отличные от тех, что инициировались при тепловом стрессе (Рис. 15). Действие теплового фактора индуцировало у личинок изоформу фенолоксидазы с Rf 0,5, специфичную для куколочной стадии. Данная молекулярная форма фермента сохранялась у имаго. Действие NAGA на личинок индуцировало ряд изо-форм фенолоксидазы, также стабильно воспроизводившихся на последующих стадиях онтогенеза. Наибольшее внимание обращают на себя молекулярные формы с Rf 0,3 и >1. Данные изоформы фермента специфичны для строго определенных этапов развития комнатной мухи. Изоформа с Rf 0,3 характерна для куколочной стадии развития, а изоформы с Rf> 1 - для моментов перехода одной онтогенетической стадии в другую: при окукливании, у молодых куколок и фаратных имаго. И если исходить из положения, что в морфогенетических и защитных процессах насекомых задействованы сходные механизмы (Natori et al., 1999), то молекулярные формы фенолоксидазы с Rf 0,3 и >1, инициируемые на строго определенных этапах онтогенеза M.domestica, могут индуцироваться и при развитии иммунной реакции у насекомых. Предполагается, что механизм образования новых молекулярных форм фе-нолоксидаз при действии NAGA заключается в изменении степени гликозилирова-ния фенолоксидаз и функциональным отбором необходимых изоформ на предыдущих стадиях онтогенеза. Что не оказывает влияния на субстратную специфичность ферментной системы, но способствует лучшему выполнению их функций при развитии защитной реакции насекомых на действие патогена (Салтыкова и др., 2003). К

настоящему времени установлено, что молекулы фенолоксидазы (а именно, тиро-зиназы) насекомых ответственны за распознавание антигенов (Ratkliffe, 1985). В результате воздействия на M.domestica теплового стресса и (или) NAGA в последующих поколениях насекомого на отдельных стадиях онтогенеза отмечаются повышенные уровни активности каталазы, пероксидазы и фенолоксидазы, а также обнаруживаются ее индуцированные изоформы. Причем, активность ферментов антиокислительной системы и фенолоксидазы обнаруживает повышенный уровень при тепловом стрессе родительского поколения только в поколении F1, а при действии NAGA на родительское поколение - в двух последующих поколениях. Аналогичным образом, молекулярные формы фермента, индуцируемые тепловым стрессом в родительском поколении, сохраняются только в поколении F1. Легкие же изоформы с Rf >1, индуцированные в родительском поколении действием NAGA, стабильно воспроизводятся в двух последующих поколениях комнатной мухи.

С точки зрения классической менделевской теории наследственности, передача адаптивного ответа организма на условия среды последующим поколениям невозможна. Однако появилось много экспериментальных данных, не вписывающихся в классическую теорию наследственности и свидетельствующих в пользу выдвинутого Ж.Б.Ламарком принципа наследования приобретенных признаков (Каллис, 2000; Чураев, 2000; Стал и др., 2002), включающих механизмы эпигенетического наследования, активации транспозонов и др. Следовательно, интерпретация полученных данных может не ограничиваться отбором особей с повышенным уровнем активности рассматриваемых ферментативных систем, поскольку, с точки зрения аспектов неоламаркистской концепции, полностью не исключена и возможность наследования наблюдаемых индуцированных онтогенетических изменений в защитных ферментативных системах.

Таким образом, на основе полученных данных можно полагать, что фенолок-сидазная система участвует в формировании долговременной иммунной памяти, отбором необходимых гпикозилированных молекулярных форм фермента при контакте с патогеном на предшествующих стадиях онтогенеза, которые сохраняются на протяжении двух последующих поколений без дополнительного воздействия фактором. Условием возникновения трансгенерационного эффекта являются чувствительные периоды онтогенеза, характеризующие моменты метаморфоза насекомых.

Заключение

Результаты экспериментов и анализ литературных данных позволяют утверждать, что начальный этап формирования биохимических и клеточных защитных реакций у насекомых с полным типом превращения является определяющим для тече-1шя дальнейших этапов и финала действия бактериального препарата. На начальном этапе происходит распознавание, задействуются необходимые пусковые механизмы защитных реакций и формируется эффективная стратегия реализации метаболических процессов. Ранее было покгиапо, что насекомые обладают сложной и эффективной системой конституциональных механизмов (Черныш, 1999; Глупов, 2001). Динамика изменений биохимических и клеточных показателей гемолимфы позволяет выявить основные фазы развитая защитных реакций (30 мин; 1ч; 2ч; 4ч; 24ч) у насекомого при действии бактериальным препаратом. У них увеличивается процент содержания фагоцитов в гемолимфе, активируются фенолоксидазная и анти-оксидантная системы. Используя различные концентрации битоксибациллина, выявили, что повреждения, вызванные малыми дозами патогена, эффективно снимаются при интенсификации метаболизма, при высоких дозах наблюдается снижение уровня метаболических процессов. Такая направленность отчетливо выражена на начальной стадии действия битоксибациллином в лабораторных условиях на A.m.mellifera, в отличие от A.m.caucasica, а также на личинках колорадского жука. Внутривидовые особенности реагирования биохимических и клеточных защитных систем у медоносной пчелы заключаются в скорости преодоления пороговой чувствительности к бактериальному препарату. Пчелы A.m.mellifera отличаются от пчел A.m.caucasica повышенной фагоцитарной реакцией гемолимфы и более ранней активацией окислительно-восстановительных процессов.

Были выявлены также существенные различия в биохимических и клеточных защитных механизмах на разных этапах онтогенеза у колорадского жука. С точки зрения иммунизации личинка третьего возраста и имаго колорадского жука представляются совершенно разными организмами (Глупов, 1993; Marmaras et al., 1996; Nakamura et al., 2001; Сухорукова, 2002). В гуморальном ответе нами выделялись два механизма защиты: неспецифический - дифенолоксидазная, каталазная и перокси-дазная активности гемолимфы, и относительно специфический - агглютинирующая и тирозиназная активности гемолимфы. Таким образом, в онтогенезе были выявлены явные различия в индуцировании защитных механизмов у личинок и взрослых особей. В повышении устойчивости к бактериальному препарату у личинки задействованы менее специфичные защитные системы (ферменты антиоксидант-ной системы, дифенолоксидаза, клетки гемолимфы - эноцитоиды и сферулоциты).

В случае половозрелого имаго ведущая роль в данном процессе переходит к более специфичным механизмам защиты (гемагглютинины, тирозиназа, иммунокомпе-тентные клетки - веретеновидные фагоциты). Увеличение активности фенолоксидаз на начальном этапе повторного воздействия БТБ на личинок L.decemlineata при снижении активности антиокислительных ферментов лишний раз указывает на взаимодействие фенолоксидазного и антиоксидантного путей (см. схему).

Дифепопоксидаза:

ДОФА -»ДОФА-семихипоп + 02 ->ДОФА-хшюн + 02~ Супероксиддисмутаза (СОД}:

•02~ + -02~ + 2Н+ —» 02 + Н202 (псроксид водорода)

Каталаза:

2Н202 -> 2Н20 + 02

Пероксидаза:

2Н202 + Н2А—> 2Н20 + А

Схема реализации цитотоксического эффекта в гемолимфе при фагоцитозе в процессе меланизации и инкапсуляции у насекомых

Очевидно, что основанный на этом взаимодействии механизм сопровождается временным ингибированием собственных антиоксидантных систем и играет важную роль в антимикробном иммунитете насекомых за счет производства высокореактивных интермедиатов (Салтыкова, 2000; Whitten et al., 2001).

Возможна преадаптация насекомых, способствующая повышению их устойчивости к действию средовых факторов, при введении им биологически активных веществ, например хитозана, которые создают ферментативный структурный след адаптации (Меерсон, 1999). Показана преактивация конституциональных защитных систем с помощью антиоксиданта- аскорбиновой кислоты (Салтыкова и др., 2000), посредством которой можно модулировать реакцию фенолоксидазной и антиокси-дантной защитных систем у насекомых. Аскорбиновая кислота тормозит образование дофахинона за счет восстановления, снижая активность дифенолоксидазы в гемолимфе и жировом теле у пчел. Но при этом увеличивается активность тирозина-зы, поскольку для ее активации нужен восстановитель - аскорбиновая кислота, что приводит к увеличению диоксифенилаланина, а это в свою очередь последовательно стимулирует реакцию ацетилирования для удаления излишков дофамина, что более характерно для гемолимфы, а также покровов и жирового тела (см. схему).

дофахинои ' Аскорбиновая к-та

тирошн

тирозиназа

дфо = |^ Дофа

до

иорадреиалип

]»-ацет11лтрансфера за

ГЧ-ацстплдофамнп

я[

до^муущувн

Аскорбиновая к-та

Схема модулирования аскорбиновой кислотой защитных реакций фенолоксвдазной и антиоксидантной систем; ДФО-дифенолоксцдаза, ДЦК-дофадекарбоксилаза

В экспериментах была показана возможность иммунизации насекомых, как под воздействием бактериального препарата, так и при действии адаптогенов. В данном случае под иммунизацией мы понимаем стойкое усиление активности, либо реактивности защитных систем, рост резистентности организма насекомого к повторному воздействию повреждающего фактора. Мы полагаем, что иммунизация колорадского жука низкой концентрацией БТБ стимулирует в гемоцитах экспрессию факторов, активирующих фенолоксидазы и ингибирующих активность антиокислительных ферментов, для накопления определенного уровня цитотоксическош арсенала к моменту перехода начального этапа повторной инфекции в острое течение болезни. Наконец, в экспериментах с нелетальными дозами патогена, которые оказывают легкое стимулирующее действие на организм насекомого (так называемый эффект гормезиса) было показано, что иммунизация потенциально вносит вклад в рост общей устойчивости популяции наравне с естественным отбором (Гайфулли-на и др., 2002).

Длительность сохранения иммунизации зависит от множества факторов. Наиболее долговременно, часто в течение всего онтогенеза, иммунная память сохраняется при воздействии бактериальным препаратом на организм насекомого в критические периоды развития, приходящиеся на моменты частичной или полной перестройки организма в период, предшествующий линьке личинки в куколку или куколки в имаго (Салтыкова и др., 2005). При этом заметно возрастает роль более специфичных биохимических защитных систем. Более того, в экспериментах с комнатной мухой мы наблюдали эффект трансгенерационной передачи ряда признаков -повышение уровня активности антиоксидантной системы и появления индуциро-

ванных молекулярных форм фенолоксидазы в последующих поколениях без дополнительной стимуляции.

Таким образом, проблема управления популяциями насекомых требует знания специфики их развития, в том числе и особенностей формирования защитных реакций каждой стадии онтогенеза. Большие усилия по созданию инсектицидов, разработке интегрированных систем управления численностью насекомых-вредителей, поиск новых веществ, регулирующих рост растений, сводятся на нет в результате недостаточного внимания к особенностям формирования устойчивости насекомых, игнорированию их чрезвычайно высокой внутривидовой гетерогенности, в т.ч. внутривидовых и межвидовых различий в стратегии развития защитных реакций.

Выводы

1. В экспериментальной модели выявлены определенные фазы реализации биохимических защитных реакций: фаза неспецифической реакции (до 1 ч.), латентная фаза (1-4 часа), начало запуска специализированных защитных реакций (4-6 часов), их нарастание (6-24 часов), стабильное развитие защитных реакций (24-48 часов) и последующая фаза, определяющая адаптацию.

2 Выявлено наличие двух стратегий реализации у насекомых биохимических защитных систем на начальном этапе действия битоксибациллина. Сублетальные концентрации препарата формируют защитные реакции, направленные на ликвидацию последствий повреждающего фактора, на фоне активации общего метаболизма. Высокие концентрации битоксибациллина вызывают активацию защитных реакций, направленных на локализацию и элиминацию патогена на фоне общего снижения метаболизма.

3. На примере колорадского жука определены онтогенетические различия в реализации защитных реакций у насекомых к битоксибациллину: на стадии личинки преобладает развитие неспецифических механизмов защиты, увеличивается доля эноцитоидных гемоцитов; у имаго увеличивается доля фагоцитирующих гемоци-тов, формируются механизмы специализированной защиты.

4. Выявлены подвидовые особенности реакций защитных систем у темной лесной пчелы по сравнению с южными подвидами: повышение фагоцитарной активности клеток гемолимфы, возрастшше активности антиоксидантных ферментов, гаю-козо-6-фосфатдегидрогеназы, ферментов фенолоксидазной системы, поддержание повышенного уровня гликозоаминогликанов. Полученные биохимические критерии предложены в качестве показателей адаптированности пчелиной семьи к климатическим условиям Урала.

5. Обнаружена способность насекомых к формированию долговременных защитных реакций в онтогенезе. Повторное воздействие битоксибациллином на последующей фазе развития насекомого вызывает всплеск активности антиоксидантных и фенолоксидазных ферментов в гемолимфе, повышение титра специфических агглютининов, ускоряется дифференциация фагоцитирующих клеток из прогемо-цитов.

6. Показана возможность применения хитозана в качестве индуктора защитных реакций у насекомых, что проявляется в быстрой нейтрализации токсичного эффекта битоксибациллина и повышение выживаемости насекомых.

7. Выявлены критические периоды онтогенеза у насекомых, сопутствующие процессам линьки, которые определяют формирование долговременных биохимических защитных реакций к внешним воздействиям.

8. Выявлено наличие трансгенерационного эффекта в реализации биохимических механизмов на примере комнатной мухи: индуцированная в родительском поколении в критические периоды онтогенеза активность биохимических защитных реакций сохраняется у личинок и имаго в последующих наблюдаемых двух поколениях без дополнительного стимулирования.

Основные публикации по теме диссертации, в том числе в журналах рекомендованных ВАК

I. Поскряков A.B., Салтыкова Е.С., Амирханов Д.В. Активность инсектицидов и ферменты детоксикации в онтогенезе колорадского жука // Агрохимия, 1993, № 9, С.63-68

2 Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г., Хайруллин P.M. Иммуномо-дулирующее действие хитоолигосахаридов на медоносную пчелу Apis mellifera // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2000. №5. С.563-568

3. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков A.B., Николенко А.Г. Влияние хитосахаридов на медоносную пчелу Apis mellifera L. // Агрохимия. 2001. №2. С.70-73

4. Беньковская Г.В., Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г. Влияние хитина и его производных на онтогенез колорадского жука // Агрохимия. 2001. №6. С.73-77

5. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков A.B., Николенко А.Г. Влияние хитосахаридов на биохимические процессы у медоносной пчелы в условиях действия экстремально высокой и низкой температур // Агрохимия. 2002. №3. С. 70-74.

6. Гайфуллина JI.P., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. Клеточный иммунитет насе-комых//Успехи современной биологии. 2003. том 123. №2. С. 195 - 206.

8. СалтыковаЕ.С., Беньковская Г.В., Поскряков A.B., Сухорукова О.В., Николенко А.Г. Экспрессия фенолоксидазной системы при использовании хитосахаридов в качестве иммуномодуляторов // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2003.№4. С.346-350.

9. Гайфуллина JI.P., Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Николенко А.Г. Иммунные реакции личинок и имаго колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say) при применении препарата биологической защиты картофеля //Агрохимия. 2004. №9. С. 1-7

10. Sokolyanskaya М.Р., Benkovskaya G.V., Saltykova E.S., Udalov M.B. and Nikolenko A. G. Biochemical Changes in the Larvae of the Housefly (Musca domestica L.) During Selection by Different Stressors // Resistant Pest Management Newsletter. 2004. V. 14. №. 1.P.43.

II. Беньковская Г.В., Николенко А.Г., Салтыкова E.C., Ишмуратова Н.М, Хари-сов Р.Я, Ишмуратов Г.Ю. Адаптогенное действие препарата биосил на медоносную пчелу и комнатную муху//Агрохимия. 2005.№3. С. 74-78.

12. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Гайфуллина Л.Р., Новицкая О.П., Поскряков A.B., Николенко А.Г. Реакция отдельных физиологических барьеров при бактериальной инфекции у различных рас медоносной пчелы Apis mellifera II Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005.Т.41. № 3. С.254-258.

13. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Сухорукова О.В., "Удалов М.Б., Поскряков A.B., Николенко А.Г. Внутривидовые различия гуморального защитного ответа у медоносной пчелы Apis mellifera II Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005.Т.41. №4. С.314-318.

14. Салтыкова Е.С., Львов A.B. .Беньковская Г.В., Поскряков A.B., Николенко А.Г. Межрасовые различия экспрессии генов антибактериальных пептидов абецина, ги-меноптецина, дефензина у пчел Apis mellifera mellifera и Apis mellifera cancasica II Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2005.Т.41. №5. С.404-407.

15. Saltykova E.S., Benkowskaya G.V. The Mechanism of bacterial insecticide resistance in colorado potato beetle // Resistant Pest Management Newsletter. 2005. V.l 5. №l.P.33-34.

16. Gayfullina L.R., Saltykova E.S., Benkowskaya G.V, NikolenkoA.G. Humoral immune reactions participation in resistance formation of colorado beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) larvae and imago to a biopreparation for potato // Resistant Pest Management Newsletter. 2005. V. 15.№ l.P.9-12.

17. Беньковская Г.В., Салтыкова E.C., Сухорукова O.C., Николенко А.Г. Метаболическая регуляция двух типов фенолоксидазной активности в онтогенезе комнатной мухи // Онтогенез. 2006. Т.37. № 2. С.142-148.

18. Gayfullina L.R., Saltykova E.S., Nikolenko A.G. Cellular immune reactions participating in resistance formation of Colorado beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) larvae and imago to a Biopreparation for potato // Resistant Pest Management Newsletter. 2006. V. 15.№2.P.22-24.

19. Гайфуллина Л.Р., Салтыкова E.C., Николенко А.Г. Структура и механизмы индуцированного гуморального иммунитета насекомых // Журнал Успехи современной биологии. 2006. Т. 126. №6. С.617-629.

20. Gayfullina L.R., Saltykova E.S., Nikolenko A.G. Induction of the additional phenoloxidase isoforms in insects under N-acetyl-D-glucosamine and bitoxibacillin action // Resistant Pest Management Newsletter. 2007. V. 16. №. 2. P. 22-24.

21. Салтыкова E.C, Беньковская Г.В, Николенко А.Г. Внутривидовые различия в механизмах формирования защитных процессов у медоносной пчелы Apis mellifera// Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2007. Т.43. №2. С. 53-57.

22. Салтыкова Е.С., Гайфуллина JI.P., Николенко А.Г. Изменение порога чувствительности Apis mellifera к действию патогена в различные периоды голодания // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2008. т. 44. № 4. с. 409-417.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Салтыкова, Елена Станиславовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Биохимические защитные реакции насекомых: теоретические и практические аспекты (обзор литературы)

1.1. Биохимические механизмы защитных реакций насекомых

1.1.1. Гемолимфатические агглютинины насекомых и их участие в защитных реакциях

1.2.2. Фенолоксидазная система и ее место в защитных реакциях насекомых

1.1.3. Участие активированных кислородных метаболитов и антиокислительных систем в защитных реакциях насекомых

1.1.4. Антимикробные пептиды насекомых

1.2. Защитные системы насекомых, опосредованные клетками гемолимфы

1.2.1. Клеточные защитные реакции: фагоцитоз, гранул о- и капсулообразование

1.3. Онтогенетические особенности биохимических и клеточных защитных реакций насекомых

1.4. Роль биохимических защитных реакций в процессах адаптациогенеза насекомых

Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований

2.1. Характеристика биологических объектов исследований

2.2. Постановка лабораторных экспериментов 62 2.2.1 .Способы бактериального воздействия

2.2.2. Методы изучения биологической активности хитина, хитозана, 1М-ацетил-Б-глюкозамина и аскорбиновой кислоты

2.2.3. Оценка действия хитосахаридов или аскорбиновой кислоты на медоносную пчелу

2.2.4. Оценка эффективности хитосахаридов для колорадского жука

2.2.5. Метод оценки биологической активности хитосахаридов или аскорбиновой кислоты для комнатной мухи

2.2.6. Преадаптивное влияние хитосахаридов или аскорбиновой кислоты при действии препаратом БТБ на насекомых

2.2.7. Постановка лабораторных экспериментов для оценки роли моносахаров в формировании защитных реакций в онтогенезе M.domestica

2.3. Методика биохимических экспериментов

2.4. Методика приготовления препаратов гемолимфы

2.5. Математическая обработка результатов

Глава 3. Биохимические защитные реакции насекомых на начальном этапе развития инфекционного процесса

3.1. Биохимические защитные реакции насекомых при действии битоксибациллина

3.1.1. Реакция биохимических защитных систем у Leptinotarsa decemlineata Say

3.1.2. Биохимические защитные реакции на начальном этапе действия БТБ у личинок III возраста Musca domestica L.

3.2. Биохимические защитные реакции на начальном этапе развития инфекционного процесса у Apis mellifera L. 90 3.2.1 .Реакция кишечника и гемолимфы на действие БТБ у Apis mellifera 91 3.2.2. Биохимические параметры защитного ответа и временные фазы его развития у Apis mellifera

3.3. Развитие биохимических защитных реакций у Apis mellifera при разных концентрациях бактериального препарата

3.3.1. Динамика начального этапа защитных реакций у Apis mellifera mellifera

3.3.2. Динамика начального этапа защитных реакций у Apis mellifera caucas ica

3.4. Развитие биохимических защитных реакций при разных уровнях пороговой чувствительности у медоносной пчелы

3.4.1. Динамика развития биохимических защитных реакций на фоне голодания у Apis mellifera mellifera при действии БТБ

3.4.2 Динамика развития защитных реакций при действии бактериального препарата на фоне голодании у Apis mellifera caucasica

3.4.3. Изменение реакции гемолимфы у Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica начального этапа развития защитных реакций на фоне голодания на фоне действия БТБ

Глава 4. Онтогенетические и внутривидовые различия в формировании биохимических защитных реакций насекомых

4.1. Онтогенетические различия в формировании биохимических защитных реакций у колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say

4.1.1. Онтогенетические различия в гемоцитарных защитных реакциях Leptinotarsa decemlineata при действии БТБ

4.1.2. Онтогенетические различия в агглютинирующей активности гемолимфы Leptinotarsa decemlineata при действии БТБ

4.1.3. Онтогенетические различия в активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем в гемолимфе колорадского жука при воздействии БТБ

4.2. Внутривидовые различия в реализации защитных реакций у Apis mellifera

4.2.1. Развитие биохимической защитной реакции Apis mellifera mellifera и

Apis mellifera caucasica при действии препарата битоксибациллина

4.2.2. Реакция гемолимфы и кишечника на действие бактериального препарата у подвидов Apis mellifera

Глава 5. Особенности иммунизации насекомых и реактивность биохимических защитных механизмов при воздействии битоксибациллином

5.1. Активность биохимических защитных реакций у иммунизированных личинок III возраста Musca domestica

5.2. Изменение активности биохимических защитных реакций у иммунизированных рабочих пчел Apis mellifera

5.3. Внутривидовые различия в реализации биохимических защитных реакций у рабочих пчел иммунизированных битоксибациллином

5.3.1. Изменение клеточной реакции гемолимфы и параметров кишечника у Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica

5.3.2. Реактивность биохимических защитных механизмов у иммунизированных рабочих особей Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica

5.4. Реактивность биохимических защитных систем в онтогенезе

Leptinotarsa decemlineata Say при иммунизации битоксибациллином

5.4.1. Реакция клеточных элементов гемолимфы

5.4.2. Агглютинирующая реакция гемолимфы

5.4.3. Изменения в реакции ферментов фенолоксидазной системы

5.4.4. Изменения в реакции ферментов антиоксидантной системы

Глава 6. Биохимические основы использования биологически активных веществ в качестве адаптогенов для насекомых 213 6.1. Активация хитозаном биохимических защитных систем у насекомых

6.1.1. Продолжительность действия хитозана на медоносную пчелу

6.1.2. Преадаптивное влияние хитозана на медоносную пчелу при действии бактериального препарата

6.1.3. Влияние хитозана на выживание и онтогенез Musca domestica и Leptinotarsa decemlineata при применении бактериального препарата

6.1.4. Влияние хитозана на биохимические защитные реакции у насекомых при действии БТБ

6.2. Использование модулирующих свойств аскорбиновой кислоты для выявления внутривидовых различий в биохимических защитных реакциях медоносной пчелы

6.2.1. Действие разных концентраций аскорбиновой кислоты на ферментативную активность фенолоксидазной и антиоксидантной систем медоносной пчелы in vitro

6.2.2. Влияние аскорбиновой кислоты на активность биохимических защитных механизмов в различных органах и тканях у Apis mellifera mellifera и Apis mellifera caucasica in vivo

6.2.3. Влияние аскорбиновой кислоты как активатора защитных реакций при действии бактериального препарата на медоносную пчелу

Глава 7. Роль критических периодов онтогенеза в проявлении трансгенерационного эффекта защитных реакций в ряду поколений Musca domestica

7.1. Выявление критических периодов в онтогенезе Musca domestica при использовании аскорбиновой кислоты

7.2. Продолжительность сохранения экспрессивности гуморальных факторов иммунитета в зависимости от стадии онтогенеза Musca domestica при действии бактериального препарата

7.3. Влияние Ы-ацетил-О-глюкозамина на индукцию фенолоксидазной и антиоксидантной систем в поколениях чистой линии Musca domestica

7.3.1. Оценка биохимических и физиологических показателей при действии редуцирующих Сахаров в онтогенезе комнатной мухи 275 7.4. Транс генерационные изменения в защитных реакциях поколений комнатной мухи при действии NAGA на родительское поколение Р 278 7.4.1. Проявление экспрессии электрофоретических спектров фенолоксидазы в чистых линиях М. domestica F1 и F2 при действии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические механизмы адаптации к битоксибациллину в онтогенезе насекомых Holometabola"

Устойчивость насекомых к патогенным микроорганизмам и продуктам их жизнедеятельности обусловлена хитинизированными покровами, скоординированным взаимодействием биохимических механизмов с деятельностью клеточных структур гемолимфы, жирового тела и кишечника, выстланного перитрофической мембраной, а также особенностями структуры и функционированием генома.

К настоящему времени изучены и описаны основные биохимические защитные механизмы насекомых. Часть из них базируется на индукции протеолитических каскадов, приводящих к меланизации и коагуляции гемолимфы при ранении, а также продукции активных кислородных метаболитов и сигнальных молекул, в том числе участвующих в распознавании антигенов (Marmaras et al., 1996; Teopold et al., 2004; Ling, Yu, 2005; Jiravanichpaisal et al, 2006; Williams, 2007). Существуют системы, продуцирующие биологические восстановители и активированные глюкозиды, агглютинины с различной углеводной специфичностью, участвующие в процессах распознавания (Basseri et al., 2002; Галактионов, 2004; Ottaviani, 2005), и набор антимикробных пептидов, обуславливающих бактерицидные и фунгицидные свойства гемолимфы (Черныш, 1998; Львов, Николенко, 1999; Bulet et al., 2004). Защитная система, опосредованная клетками гемолимфы, участвует совместно с гуморальными факторами в фагоцитозе, синтезе антимикробных пептидов, а также в гистолизе и гистогенезе в процессе метаморфоза (Глупов, 2001; Гайфуллина и др., 2004). Таким образом, данные биохимические системы насекомых принимают участие не только в защитных процессах, но и регуляции онтогенеза, что, как считает ряд исследователей, обусловлено сугубо врожденными факторами (Leclerc, Reicchart, 2004).

Исследования последних лет опровергают сложившиеся представления о непреодолимой грани между врожденной и адаптивной защитной системой насекомых (De Gregorio et al., 2001; Eason et al., 2004). Основная проблема заключается в том, что до сих пор биохимические механизмы устойчивости насекомых к патогенным микроорганизмам изучались без учета их метаболической взаимозависимости и онтогенетических особенностей функционирования. В то же время наличие адаптивного ответа у насекомых допускает возможность существования специфичных и долговременных биохимических защитных реакций. Эти процессы должны быть связаны с онтогенетическими особенностями насекомых, поскольку личинка кардинально отличается от взрослой особи. Они, как правило, занимают разные экологические ниши, имеют различную пищевую специализацию, а также продолжительность существования, что может играть важную роль в функционировании биохимических механизмов и факторов, опосредованных гемоцитарной защитой.

Следует отметить, что для изучения перечисленных аспектов необходима новая модель эксперимента. Она должна базироваться на изучении динамики общих биохимических и клеточных защитных реакций насекомых на начальном этапе инфекционного процесса, использовании патогена общего типа действия (для чего был использован битоксибациллин), естественном способе заражения насекомых, применении патогена в дозировках и степени вирулентности, не вызывающих глубоких патологических изменений в организме насекомого, а также с учетом стадий онтогенеза. Эти особенности модели не всегда учитывались в исследованиях последних лет (Ekengren, Hultmark, 2001; Tzou et al., 2001; Zambón et al, 2005; Sorensen et al, 2005).

Энтомопатогенные кристаллофорные бактерии Bacillus thuringiensis антагонистичны для многих видов насекомых. На основе различных штаммов

Вас. thuringiensis создан широкий спектр микробиологических препаратов, в том числе битоксибациллин, который содержит жизнеспособные споры бактерий и продуцируемый ими экзотоксин (Смирнов и др., 1982; Кандыбин, 1989). Практика применения данного препарата в системе защиты от насекомых-вредителей способствует появлению устойчивых особей с эффективными механизмами распознавания и элиминации патогенных бактерий.

Не менее важны онтогенетические и другие условия функционирования биохимических защитных механизмов и для прикладных исследований. В процессе поиска и практического применения биологически активных в отношении насекомых веществ часто не учитываются условия формирования защитных реакций, предшествующие контролируемой стадии эксперимента. Это замечание можно отнести к изучению южных подвидов медоносной пчелы, интродуцированных в климатические условия средней полосы России. По аналогичной причине пока не увенчались успехом попытки разработки препаратов на основе хитозана для пчеловодства (Албулов, 2008).

Ранее в исследованиях биохимических защитных механизмов насекомых, как правило, использовались иные методологические подходы, связанные с инъекционными способами введения и/или заведомо высокими концентрациями препаратов. На фоне торможения защитных реакций сформировалось представление о неспособности насекомыми формировать адаптивный ответ (Флоренсов, Пестова, 1990; Vidal et al., 2001; Hultmark, 2003). Сохраняются суждения об исключительной роли отбора особей с наиболее успешной реализацией защитных систем в возникновении устойчивых популяций насекомых. Роль иммунизации при этом считается несущественной, в том числе в силу малой продолжительности жизни насекомых.

Результаты отдельных исследований можно рассматривать как принцип формирования адаптивного ответа к конкретному патогену (Kurtz, 2005;

Оа1йШта е1 а1., 2005). Более того, в последние годы появились сообщения, свидетельствующие о трансгенерационной передаче индуцированного адаптивного ответа у общественных насекомых, высказываются предположения о возможных механизмах данного явления (Моге^ 8с1шис1-Нетре1, 2000; 2001; Баск! е1 а1., 2005). Тем не менее, до сих пор не раскрыты онтогенетические условия формирования подобного феномена, возможно, раскрывающего исключительные возможности насекомых к формированию широкого спектра устойчивости в короткий эволюционный период (Марков, 2006; Колчанов, 2007).

Таким образом, изучение вопросов онтогенетических и внутривидовых особенностей реализации биохимических защитных реакций, метаболической взаимозависимости компонентов данных систем, возможности преадаптации насекомых, условий формирования долговременных биохимических защитных реакций и возможности их трансгенерации может изменить общее представление о механизмах биохимической устойчивости насекомых к неблагоприятным факторам среды, обеспечивающих адаптивную пластичность видов класса 1тес1а.

Цель данной работы заключалась в выявлении и анализе онтогенетических особенностей реализации биохимических защитных механизмов у насекомых с полным типом превращения при действии битоксибациллина. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новую модель эксперимента для изучения экзогенных воздействий на насекомых, охарактеризовать на этой основе реализацию основных биохимических защитных реакций насекомых, в том числе определить временные рамки фаз их развития.

2. Определить онтогенетические особенности формирования биохимических защитных реакций насекомых при действии битоксибациллина.

3. Выявить внутривидовые особенности формирования биохимических защитных реакций и оценить возможность использования биохимических параметров для характеристики состояния пчелиных семей.

4. Оценить возможность преадаптации насекомых и их способность к развитию долговременной памяти на основе биохимических механизмов защиты, особенностей их онтогенетического формирования.

5. Охарактеризовать онтогенетические особенности влияние биологически активных для насекомых веществ на функционирование биохимических механизмов защиты и перспективы их применения в качестве адаптогенов.

6. Оценить влияние критических периодов в онтогенезе насекомых на активацию биохимических защитных систем и долговременность их реакции.

7. Определить роль критических периодов в проявлении эффекта трансгенерации биохимических защитных реакций в ряду поколений насекомых.

Научная новизна. Выявлена тесная взаимосвязь антиоксидантной и фенолоксидазной систем в формировании начального этапа реализации защитных реакций у насекомых. Выявлены онтогенетические различия в проявлении биохимических защитных реакций и их связь с клеточными структурами гемолимфы насекомых. Это проявляется в преобладании на личиночной стадии неспецифических, а на имагинальной - специфических биохимических механизмов. Доказана возможность преадаптации насекомых нелетальными дозами бактериального препарата, выражающаяся в стимуляции биохимических и других защитных реакций и повышении выживаемости в целом. Выявлена возможность формирования долговременной, охватывающей весь онтогенез насекомого, реакции биохимических и клеточных систем, определяющих устойчивость насекомых. Показана значимая роль критических периодов онтогенеза насекомых, связанных с этапами линьки при смене личиночных возрастов и стадий развития, в формировании долговременных защитных реакций. Доказано, что индуцированная активность биохимических защитных реакций у личинок насекомых воспроизводится на последующих этапах онтогенеза, а также в последующих двух поколениях на той же стадии развития насекомого без дополнительного влияния индуцирующего фактора.

Практическая значимость. Обоснована возможность использования начального этапа реализации биохимических защитных реакций в качестве тест-системы для диагностики физиологического состояния медоносной пчелы и других насекомых. Показана возможность применения хитозана в качестве адаптогена для медоносной пчелы. Полученные данные по высокой биологической активности хитозана в отношении хозяйственно значимых насекомых, что выражается в преадаптивном действии и влиянии на скорость морфогенетических процессов, рекомендованы для регламентации применения средств защиты и стимуляторов роста растений в агробиоценозах. На основе выявленных различий подвидов (пород) медоносной пчелы в характере развития биохимических и других защитных реакций предложены новые селекционные признаки, отражающие степень адаптированности пчелиных семей к условиям обитания в северной части видового ареала. Положения, выносимые на защиту: 1. Стадия онтогенеза и начальный этап воздействия битоксибациллином является значимым моментом в определении преимущественного типа реализации биохимических реакций насекомых. При этом нейтрализация сублетальных доз патогена происходит за счет активации биохимических защитных систем, а действие высоких доз патогена вызывает реакцию защитного торможения биохимических процессов.

2. Действие битоксибациллина в сублетальной концентрации на насекомых вызывает иммунизирующее действие и способствует формированию не только кратковременных биохимических защитных реакций, но и долговременной иммунной памяти. Иммунизация наряду с действием отбора вносит вклад в формирование общей устойчивости популяций насекомых.

3. Ключевыми моментами онтогенеза у насекомых с полным типом превращения являются критические периоды при переходе от личиночной стадии развития к куколке и от куколки к имаго. Критические периоды онтогенеза у насекомых характеризуются не только перестройкой многих функциональных систем организма, но и реактивностью биохимических защитных реакций и повышенной чувствительностью данных систем к внешним воздействиям.

4. Индуцированная в критические периоды онтогенеза личинок насекомых активность биохимических защитных реакций воспроизводится как на последующих этапах онтогенеза, характеризуя наличие долговременной иммунной памяти, так и в последующих поколениях насекомых на той же онтогенетической стадии, подтверждая трангенерационный эффект передачи индуцированных биохимических механизмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях «Изучение, рациональное использование природных ресурсов», (Уфа, 1991), «Biologically Active Polysaccharides», (Oslo, 1998), «Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии», (Челябинск, 1999), 6th European Training Course on Carbohydrates, (Hungary, 2000), 4th Carbhydrate Bioengineering Meeting, (Stockholm, 2001), VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002), «Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства» (Пенза, 2002), на XII съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2002), на III съезде Всероссийского Общества Генетики и Селекции (Москва, 2004), на Межрегиональном совещании энтомологов Сибири и Дальнего Востока, (Новосибирск, 2006), на IX Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция - стратегия жизни» (Уфа, 2006), на Международной конференции «Current Evolutionary Thinking in Biology, Medicine and Sociology» (Новосибирск, 2007), на XIII съезде Русского энтомологического общества (Краснодар, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на IX Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008).

Связь с планами НИР. Работа выполнялась в соответствии с планами НИР инсплуга биохимии и генегики УНЦ РАН по темам: «Генегико-биохимичсские особенности башкирской популяции среднерусской расы медоносной пчелы» (1996-1998, № гос.рег. 01.9.60 001037); «Молекулярные механизмы адаптивности южно-уральской популяции Apis mellifera mellifera к современным условиям обитания» (19992001, № гос.рег. 01.99.00 08299); «Генетико-биохимические механизмы адаптивности насекомых» (2002-2004 № гос.рег. 01.200.2 053 10); «Закономерности адаптивных процессов в онтогенезе и популяциях насекомых» (2005-2007, № гос.рег. .); «Молекулярные и клеточные механизмы адаптациогенеза насекомых» (2008-2009, № гос.рег. 012.0 801231).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны рядом грантов АН РБ и следующими грантами РФФИ: «Особенности стратегии реализации физиолого-биохимической устойчивости башкирской пчелы» (20022004, 02-04-97901-р2002агидель а); «Молекулярно-генетические основы адаптивного потенциала популяции башкирской пчелы» (2002-2004, 02-04-97925-р2002агидельа); «Генетическая структура, специфика формирования резистентности и микроэволюционные процессы в популяциях колорадского жука на территории РБ» (2005-2007, 05-04-97916-рагидельа); «Генетическая структура популяции и особенности формирования устойчивости к неблагоприятным факторам у башкирской пчелы (2005-2007 05-04-97945-рагидельа); «Молекулярно-генетические основы создания породных групп среднерусской пчелы» (2006-2007, 06-04-08183-офи); «Локализация генофонда башкирской пчелы и генетические процессы в краевых зонах ее популяций» (2008-2010, 08-04-97039-рповолжьеа).

Публикации. Основные результаты исследований отражены в 58 научных публикациях, в том числе 21 статья в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов докторских диссертаций.

Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад автора заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Благодарность. Выражаю благодарность своим коллегам по лаборатории биохимии адаптивности насекомых за помощь и поддержку в выполнении данной работы. t

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Салтыкова, Елена Станиславовна

Выводы

1. В экспериментальной модели выявлены определенные фазы реализации биохимических защитных реакций: период неспецифической реакции (до 1ч.), латентный период (1-4 часа), начало запуска специализированных защитных реакций (4-6 часов), их нарастание (6-24 часов), стабильное развитие защитных реакций (24-48 часов) и период, определяющий адаптацию.

2. У насекомых выявлено наличие двух стратегий реализации биохимических защитных систем на начальном этапе действия битоксибациллина. Сублетальные концентрации препарата формируют защитные реакции, направленные на ликвидацию последствий повреждающего фактора, на фоне активации общего метаболизма. Высокие концентрации битоксибациллина вызывают активацию защитных реакций, направленных на локализацию и элиминацию патогена на фоне общего снижения метаболизма.

3. На примере колорадского жука определены онтогенетические различия в реализации защитных реакций у насекомых к битоксибациллину: на стадии личинки преобладает развитие неспецифических механизмов защиты, увеличивается доля эноцитоидных гемоцитов; у имаго увелицивается доля фагоцитирующих гемоцитов и формируются механизмы специализированной защиты.

4. Выявлены особенности развития реакций систем защиты на битоксибациллин у темной лесной пчелы: повышение фагоцитарной активности клеток гемолимфы, возрастание активности антиоксидантных ферментов, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, ферментов фенолоксидазной системы, поддержание повышенного уровня гликозоаминогликанов.

5. Обнаружена способность насекомых к формированию долговременных защитных реакций в онтогенезе. Повторное воздействие битоксибациллином вызывает всплеск активности антиоксидантных и фенолоксидазных ферментов в гемолимфе, повышение титра специфических агглютининов, ускоряется дифференциация фагоцитирующих клеток из прогемоцитов.

6. Показана возможность применения хитозана в качестве индуктора защитных реакций у насекомых, что проявляется в быстрой нейтрализации токсичных агентов битоксибациллина и выживаемости насекомых.

7. Критические периоды онтогенеза у насекомых, сопутствующие процессам линьки, определяют формирование долговременных биохимических защитных реакций к внешним воздействиям.

8. Выявлено наличие трансгенерационного эффекта в реализации биохимических механизмов на примере комнатной мухи: индуцированная в родительском поколении в критические периоды онтогенеза активность биохимических защитных реакций сохраняется у личинок и имаго в последующих наблюдаемых двух поколениях без дополнительного стимулирования.

Заключение

Результаты наших экспериментов и анализ литературных данных позволяют утверждать, что начальный этап формирования защитных реакций у насекомых с полным типом превращения является определяющим для течения дальнейших этапов и финала действия бактериального препарата. На начальном этапе происходит распознавание патогена, задействуются необходимые пусковые механизмы защитных реакций, и формируется эффективная стратегия реализации метаболических процессов. Ранее было показано, что насекомые обладают сложной и эффективной системой конституциональных механизмов (Черныш, 1999; Глупов, 2001). В защитных реакциях насекомых участвует множество разнообразных гуморальных и опосредующих их клеточных факторов. Как у многих организмов, внедрение патогена сопровождается у насекомых фагоцитозом и оксидативным взрывом с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ), что индуцирует антиоксидантную систему, значимыми составляющими которой у насекомых являются каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза (СОД). Контроль уровня образования ТБК-реагирующих продуктов (МДА) позволяет судить об эффективности функционирования системы. Кроме того, активируются не только конституциональные антибактериальные пептиды (например, лизоцим) и агглютинины, но индуцируются специфические антибактериальные пептиды. Многие окислительно-восстановительные процессы, сопровождающие начало противоинфекционного ответа, нуждаются в биологических восстановителях типа НАДФНг. Образование его происходит при активации одного из ключевых ферментов окислительной ветви пентозо-фосфатного пути - глюкозо-6-фофатдегидрогеназы (Г6ФДГ), кроме того НАДФН2 используется также в восстановительном синтезе, образовании стероидных гормонов (например, экдизона) и других реакциях. При активации пентозофосфатного пути происходит образование кислых мукополисахаридов, например глюкуроновых кислот, обеспечивающих реакцию гликоконьюгации и нейтрализации токсичных эндогенных и экзогенных метаболитов (Гилмур, 1968). Многие гидролазы (например, кислая фосфатаза и неспецифические эстеразы) входят в состав фаголизосом и сопровождают процесс фагоцитоза.

Битоксибациллин был выбран в качестве препарата широкого энтомопатогенного действия с довольно устойчивыми характеристиками при применении его в лабораторных условиях. Действующее вещество препарата -спорокристаллический комплекс Bacillus thuringiensis *var. thuringiensis и термостабильный экзотоксин. Bacillus thuringiensis - спорообразующие грамположительные бактерии, обладающие способностью образовывать во время споруляции кристаллическое тело. После поглощения большого количества бактерий насекомыми кристаллы токсина растворяются в средней кишке. Токсичные кристаллы, поглощенные в большом количестве, ослабляют организм хозяина до такой степени, что бактериальные клетки могут легко проникнуть в гемоцель и вызывать септицемию (Кандыбин, 1983). Многолетние лабораторные исследования позволили выявить определенные закономерности в биохимических и клеточных защитных реакциях насекомых при применении данного бактериального препарата (Салтыкова, 2000). При этом определенные особенности воздействия данного препарата более наглядно могли быть продемонстрированы на насекомых с полным типом превращения, с четко разграниченными стадиями онтогенеза, переход которых из одной стадии развития в другую связан с серьезными морфогенетическими перестройками. С этой целью для определения фаз развития защитных реакций была разработана лабораторная модель воздействия бактериальным препаратом на разных онтогенетических стадиях у разных насекомых - представителей различных наиболее эволюционно молодых отрядов. Было отработано воздействие на насекомых разными концентрациями битоксибациллина для выявления реакций защитных систем, данные рассматриваемые ферментативные системы входят в систему защитных реакций у насекомых при действии экзогенных факторов. Были определены временные промежутки развития реакций данных защитных систем, характер их реагирования. Выявлено, что необходимым условием для инициации биохимических защитных процессов не связанных с развитием патологии в течение первых суток является применение нелетальных концентраций битоксибациллина именно через кишечник. При таких условиях были выявлены определенные принципы реализации защитных реакций.

Из имеющихся разнообразных данных, можно полагать, что работа данных системы у разных видов насекомых подчинена каким-то общим принципам. Использование лабораторной модели воздействия на насекомых битоксибациллином позволила выявить ряд характерных особенностей в реакции гемоцитов, кишечника, биохимических защитных реакций. Динамика изменений биохимических и клеточных показателей организма насекомых при заражении его бактериальным препаратом позволяет выявить основные временные этапы (30 мин; 1ч; 2ч; 4ч; 24ч) в активированных защитных процессах. У насекомых увеличивается процент содержания фагоцитов в гемолимфе, активируются фенолоксидазная и антиоксидантная системы. Реакция антимикробных пептидов (AMP) демонстрирует индуцибельность дифензина и абецина у медоносной пчелы на действие бактериального препарата, кроме того, были выявлены генотипические различия в степени реагирования AMP у разных подвидов медоносной пчелы. Изучение динамики начального этапа развития защитных процессов при действии различных концентраций бактериального препарата позволило выявить внутривидовые различия в стратегии направленности биохимических процессов у насекомых для минимизации последствий бактериального действия. Поскольку известно, что в случае действия высоких доз бактериального препарата на насекомых доминируют процессы повреждения, в случае низких - восстановления.

Вследствие этого повреждения, вызванные малыми дозами патогена, эффективно снимаются при интенсификации метаболизма, при высоких дозах наблюдается снижение уровня метаболических процессов в связи с общими принципами защитного торможения (Мелехов, 1987). Такая направленность отчетливо выражена на начальной стадии действия битоксибациллином в лабораторных условиях на A.m.mellifera, в отличие от A.m.caucasica. Ранее было показано, что для определения порога чувствительности насекомого желательно последовательное воздействие двух действующих факторов (Черныш, 1987). Установлено, что воздействие голодом непременно включает реакцию конституциональных защитных систем и изменяет порог чувствительности Apis mellifera L. к последующему действию битоксибациллина. Внутривидовые особенности реагирования биохимических и клеточных защитных систем гемолимфы у медоносной пчелы заключаются в скорости преодоления пороговой чувствительности к бактериальному препарату. Темные лесные пчелы отличаются от серых горных пчел повышенной фагоцитарной реакцией гемолимфы и более ранней активацией окислительно-восстановительных процессов в период, предшествующей фазе тревоги, а также повышенным уровнем активности ферментов в фазу тревоги согласно адаптивному синдрому Селье. Данные различия были достоверно подтверждены разными процентами выживания особей в конце эксперимента.

Были выявлены также существенные различия между механизмами формирования иммунной памяти на разных этапах онтогенеза у колорадского жука. С точки зрения закономерностей иммунизации личинка третьего возраста и имаго колорадского жука представляются совершенно разными организмами. В гуморальном ответе, согласно литературным данным, нами выделялись два механизма защиты: неспецифический - дифенолоксидазная, каталазная и пероксидазная активности гемолимфы, и относительно специфический агглютинирующая и тирозиназная активности гемолимфы (Глупов, 1993; Сухорукова, 2002; Магтагаз е1 а1., 1996; Ыакатига et а!., 2001). В повышении устойчивости к бактериальному препарату у личинки задействованы менее специфичные защитные системы (ферменты антиоксидантной системы, дифенолоксидаза, клетки гемолимфы - эноцитоиды и сферулоциты). В случае половозрелого имаго ведущая роль в иммунизации переходит к более специфичным механизмам защиты (гемагглютинины, тирозиназа, иммунокомпетентные клетки - веретеновидные фагоциты). Выявленные онтогенетические особенности клеточного состава гемолимфы и активности факторов гуморальной системы защиты Ь.йесетИпеа1а согласуются с полученными ранее данными на других видах /пяесгсг (Запольских, 1976; Буогшк, 1992) и подтверждают предположения об участии неспецифических и специфических механизмов защиты в процессах роста и развития насекомого.

Предварительное воздействие на насекомых сублетальными концентрациями бактериального препарата способствует преактивации защитных биохимических и клеточных систем гемолимфы, таким образом, происходит иммунизация особей. Это приводит к последовательной и взаимосвязанной активации двух защитных систем гемолимфы - фенолоксидазной и антиоксидантной. Увеличение активности фенолоксидаз на начальном этапе повторного воздействия БТБ на личинок Ь.йесетИпеМа при снижении активности антиокислительных ферментов и последующей их активации лишний раз указывает на взаимодействие фенолоксидазного и антиоксидантного путей (см. схему). Мы полагаем, что основанный на этом взаимодействии механизм сопровождается временным ингибированием собственных антиоксидантных систем и играет важную роль в антимикробном иммунитете насекомых за счет производства высокореактивных интермедиантов (Салтыкова, 2000; а1., 2001). При этом достоверно повышается выживаемость насекомых (Гайфуллина и др., 2006).

Дифенолоксидаза:

ДОФА -»ДОФА-семихинон + 02 -»ДОФА-хинон + 02 Супероксиддисмутаза (СОД):

•Q2~ + -02~ + 2Н+ 02 + Н202 (пероксид водорода) Катшшза:

2Н202 —» 2Н20 + 02

Пероксидаза:

2Н202 + Н2А-> 2Н20 + А

Схема реализации цитотокеического эффекта в гемолимфе при фагоцитозе в процессе меланизации и инкапсуляции у насекомых

Воздействие на разные подвиды медоносной пчелы двумя последовательно возрастающими концентрациями бактериального препарата позволило выявить также генотипические различия в клеточных и биохимических защитных системах, иммунизация малыми концентрациями бактериального препарата достоверно повышала выживаемость темной лесной пчелы. Это позволило предположить, что Apis mellifera mellifera наиболее адаптирована к условиям обитания средней полосы, чем южные подвиды, завезенные из районов с другим более мягким климатом, и гибридизированные особи.

В экспериментах была показана возможность преадаптации насекомых, как под воздействием бактериального препарата, так и при введении им биологически активных веществ, например хитозана, которые создают ферментативный структурный след адаптации (Меерсон, 1999), или преактивации конституциональных защитных систем с помощью антиоксиданта - аскорбиновой кислоты (Салтыкова и др., 2000). Кроме того, аскорбиновая кислота показала себя регулятором фенолоксидазной ферментативной системы насекомых, а также продемонстрировала антиоксидантные свойства в отношении насекомых (см. схему). дофахинон ^

Ж*

Аскорбиновая к-та

ДФО тирозиназа тирозин -► дофа ■

N-aцeтилтpaнcфepaзa дцк

Дофа-В-гидроксилаза дофаАин ▲ норадреналин

ГЧ-ацетилдофамин

ГЦФО

Чо-,

ДФО н дофаминхинрр. с". * • СОД, каталаза, пероксидаза

1Ч-ацетилдофамннхннон Аскорбиновая к-та

Схема модулирования аскорбиновой кислотой защитных реакций фенолоксидазной и антиоксидантной систем; ДФО-дифенолоксидаза, ДДК-дофадекарбоксилаза

У насекомых сокращаются сроки развития отдельных стадий онтогенеза, повышается репродуктивный потенциал, вероятно аскорбиновая кислота оказывает влияние на метаболический цикл стероидных гормонов. (Беньковская и др., 2006). Таким образом, вышеперечисленные биологически активные вещества способны преадаптировать или иммунизировать насекомых к действию экстремальных факторов окружающей среды. В данном случае под иммунизацией мы понимаем стойкое усиление активности, либо реактивности защитных систем, рост резистентности организма насекомого к повторному воздействию повреждающего фактора. Вероятно сам феномен существенного повышения устойчивости в онтогенезе насекомого куда важнее того, какие механизмы обуславливают реализацию этого феномена, однако все вышеперечисленные биохимические системы принимают активное участие в процессах распознавания и элиминации данного патогена. Длительность сохранения иммунизации зависит от множества факторов. Наиболее долговременно, часто в течение всего онтогенеза, иммунная память, и формирующие ее реакции гуморальных и клеточных механизмов, сохраняется при воздействии на организм насекомого каким-либо фактором в критические периоды его развития. Эти периоды приходятся на моменты частичной или полной- перестройки организма в период, предшествующий процессам линьки личинки в куколку или куколки в имаго (Салтыкова и др., 2005). При этом заметно возрастает роль более специфичных защитных биохимических систем. В экспериментах с комнатной мухой мы наблюдали эффект трансгенерационной передачи ряда признаков. Наблюдалось повышение уровня активности антиоксидантной системы и появления индуцированных молекулярных форм фенолоксидазы в двух последующих поколениях без дополнительной стимуляции, приобретённых личинкой родительского поколения в процессе иммунизации именно в критические периоды онтогенеза, т.е. отдаленное действие данного процесса.

Наконец, в экспериментах с нелетальными дозами патогена, которые оказывают даже легкое стимулирующее действие на организм насекомого (так называемый эффект гормезиса) было показано, что иммунизация может вносить вклад в рост общей устойчивости популяции наравне с отбором (Гайфуллина и др., 2002).

Таким образом, проблема управления популяциями насекомых требует знания их специфики, в том числе и закономерностей формирования защитных реакций. Большие усилия по созданию инсектицидов, разработке интегрированных систем управления численностью насекомых-вредителей, поиску новых веществ, регулирующих рост растений, сводятся на нет в результате слабого внимания к особенностям устойчивости насекомых, игнорированию их чрезвычайно высокой внутривидовой гетерогенности, в т.ч. внутривидовых и межвидовых различий в стратегии развития защитных реакций.

Аналогичные проблемы возникают при работе с полезными насекомыми. Интенсивная межпородная гибридизация пчёл и последовавшее за этим резкое снижение не только их зимостойкости, но и устойчивости к болезням и вредителям вызвало мощный всплеск исследований в поисках новых адаптогенов (Албулов, 2008). Однако сколько-нибудь существенного эффекта пока не достигнуто, поскольку простейшие подкормки лишь компенсируют погрешности в технологии содержания пчёл, а высокоэффективные вещества требуют серьёзных исследований для разработки регламента их применения^ в том числе и с учётом особенностей формирования биохимической устойчивости насекомых.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Салтыкова, Елена Станиславовна, Уфа

1. Албулов А.И. Использование препаратов на основе хитозана в сельском хозяйстве// Материалы Девятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит 2008). Ставрополь. С.24-29

2. Алексахина Н.В., Бочарникова И.М., Гончарова Н Ю., Королева Е.И., Телепнева В.И. Регуляция активности ферментов // Практикум по биохимии. Под редакцией проф. Н.П.Мешковой и акад. С.Е.Северина. М.: Изд-во Московского университета. 1979. С.296-353.

3. Ананьев Б.Г. О проблемах современного человекознания. М. Мир. 1977

4. Андросов Т.К., Алиева М.И. Защитные реакции гемолимфы насекомых при микотоксикозе //Журнал общей биологии. 1980. №5. С.726-733.

5. Андросов Г.К., Алиева М.И. Защитные реакции гемолимфы насекомых при микотоксикозе // Журнал общей биологии. 1980. №5. С.726-733.

6. Анохин П.И. Очерки по физиологии функциональных систем. М. «Медицина». 1975. 446 с.

7. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. Новосибирск: Наука. 1983. 216 с.

8. Анохин П.И. Очерки по физиологии функциональных систем. М. «Медицина». 1975.446 с.

9. Архипенко Ю.В., Газдаров А.К., Каган В.Е. и др. Перекисное окисление липидов в направление транспорта Са2+ через мембраны саркоплазматического ретикулума при Е авитаминозе // Биохимия. 1976. Т.42. №10. С. 1898-1902.

10. Бабкина Н.Г., 1995. Динамика массы различных отделов тела пчелы в условиях гипертермии // Экол. И охрана окруж. среды: Тез. Докл. 2 Междунар. Науч.-практ. Конф. Пермь, 12-15 сент. 1995. 4.2. Пермь. С. 9-10.

11. Балахонов A.B. Ошибки развития. JL: ЛГУ, 1990. 278 с.

12. Бартнинкайте И.С. Влияние энтобактеринного антигена на развитие устойчивости у насекомых к энтобактерину // Тр. АН ЛитССР.1987. В. №2/98. С.63-71.

13. Батурина' Л.И. Механизм действия кристаллофорных бактерий на личинок капустной совки (Barathra brassicae L.) // В сб. Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых. Иркутск. 1978. С.86-93.

14. Башкатов С.А. Гликозоаминогликаны в механизмах адаптации организма // Уфа: Изд-во Башкирского ун-та. 1996. 144с.

15. Беляев Т.Г. Участие полифенолоксидазы в защитной реакции вредной черепашки (Eurygaster integriceps) при заражении ее паразитами-фазиями // Докл. АН СССР. 1979. Т.247. №4. С.963-966.

16. Беньковская Г.В. Биологическое обоснование применения ингибиторов синтеза хитина для контроля численности колорадского жука в Предуралье Башкирии // Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. 1990. 20с.

17. Беньковская Г.В., Салтыкова Е.С., Сухорукова О.С., Николенко А.Г. Метаболическая регуляция двух типов фенолоксидазной активности в онтогенезе комнатной мухи // Онтогенез. 2006. Т.37. № 2. С. 142-148.

18. Бояркин А.Н. Быстрый метод определения активности пероксидазы // Биохимия. 1951, Т.16, №4, С.352-357.

19. Браун А. Д., Моженок Т. П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. //Л.: Наука, 1987. 232 с.

20. Броунов П.И. Заметки по сельскохозяйственной методологии// Сельское хозяйство. 1897.

21. Валюкас Ю.Б., Заянчкаускас П.А., Бабянскас М.А., Миселюнене И.С. Влияние иммунных сывороток и энтомопатогенных бактерий на устойчивость у насекомых.// Новейш. достижения с.-х. энтомол. Мат. 8 съезда ВЭО, Вильнюс. 1981. С.27-31.

22. Владимиров Ю.А, Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофиз. М. ВИНИТИ. 1991. - Т.29. - 252с.

23. Вольский H.H., Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Успехи соврем, биол. 1999. Т. 119. № 5. С. 440—450.

24. Гайфуллина JI.P., Салтыкова Е.С.,. Беньковская Г.В, Николенко А.Г. Иммунные реакции личинок и имаго колорадского жука (Leptinotarsa desemlineata Say) при применении препарата биологической защиты картофеля.// Агрохимия. 2004. №9. С. 78-82

25. Галактионов В.Г. Иммунология.// Academia. М.: Академия. 2004. 528с.

26. Галактионов В.Г. Очерки эволюционной иммунологии. М.:Наука. 1999. 256с.

27. Галиаскарова Г.Г., Муллагалиев И.Р., Монаков Ю.Б. Применение в медицине хитина и его модифицированных производных // Башкирский химический журнал. 1996. Т.З. Вып. 5-6. С.3-12.

28. Гилмур Д. Метаболизм насекомых. М.: Мир. 1968. 230 с.

29. Глупов В. В. Некоторые аспекты иммунитета насекомых // Успехи современной биологии. 1992. Т.112. Вып. 1. С. 62-73.

30. Глупов В.В. Иммунитет насекомых // Успехи соврем, биологии. 1992. Т. 112. № 1.С. 62.

31. Глупов В.В. Литическая активность гемолимфы колорадского жука. Сиб. биол. журн. 1992. вып.4. с. 15-20

32. Глупов В.В. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты.// М.: Изд-во «Круглый год». 2001. 712 с.

33. Глупов В.В. Фенолоксидазная и агглютинирующая активности гемолимфы хлопковой совки Heliothis armígera // Сибирский биологический журнал. 1993. Январь-февраль. №1. С.3-7.

34. Глупов В.В., Бахвалов С.А. Механизмы резистентности насекомых при патогенезе // Успехи современной биологии. 1998. Т.118. Вып.4. С.466-481.

35. Глупов В.В., Хвощевская М.Ф., Щепеткин И.А., Крюкова H.A. Морфофункциональная структура популяции гемоцитов Gallería mellonella L. (Lepidoptera: Pyralida) при инфекционном процессе // Известия АН. сер. биол. 1997. №6. с. 645-653.

36. Гробов О.Ф., Лихотин A.K. Болезни и вредители пчел // М. Изд. «Агропромиздат». 1989. 239с.

37. Гукасян Г. С. Исследование кинетики окисления монофенолов тирозиназой. Влияние восстановителей //Биохимия. 2002. Т. 67. Вып. 2. С. 332-336.

38. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. // М: Мир. 1966. с. 291.

39. Еськов Е.К. Экология медоносной пчелы. М.: Изд. Росагропромиздат. 1990. 221с.

40. Жеребкин М.В. Зимовка пчел. //Россельхозиздат. 1979. №14. СЗ-149.

41. ЖеребкинМ.В. Зимовка пчел. //Россельхозиздат. 1979. №14. СЗ-149.

42. Животенко Е. Ю., Кутузова Н. М., Филиппович Ю. Б. Изменение активности монофенол-монооксигеназы в онтогенезе комнатных мух и тутового шелкопряда// Онтогенез. 1987. Т. 18. № 2. С. 208-211.

43. Жумабаева Т.Т., Байдер JT.M., Алещенко A.B., Куроптева З.В. Аскорбиновая кислота и образование оксида азота в лейкоцитах // Тез. Докл. VI междунар. Конф. «Биоантиоксидант . Москва. 16-19 апр. 2002 г.». М. С.190.

44. Запольских О.В. Морфологический и цитохимический анализ клеток гемолимфы рабочей пчелы //Цитология. 1976. Т.18. №8. С.956-962.

45. Запольских О.В. Сравнительно-морфологическое и цитохимическое исследование клеток гемолимфы некоторых перепончатокрылых //Ин-т Цитол. АН СССР. Л. 1978. 19 с.

46. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология. М. «Мир». 1982. Т.2. 438 с.

47. Зюман Б.В. Антибактериальные пептиды в неспецифической резистентности медоносной пчелы // Докл. РАСХН. 1993(а). №4. С.70-76.

48. Зюман Б.В. Почему болеют пчелы // Пчеловодство, 1993, №4, с.24-25.

49. Зюман Б.В., Устинова Г.И. Содержание общего белка в гемолимфе и тканях медоносной пчелы в норме и при патологии // Доклады ВАСХНИЛ. 1989. №3. С.32-35.

50. Каллис Х.А. Среда как генератор адаптивных изменений // Современные концепции эволюционной генетики. Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 2000. С.168-174.

51. Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М., Агропромиздат, 1989, 173 с.

52. Ковалев И.Е. Полевая О.Ю. Биохимические основы имммунитета к низкомолекулярным химическим соедмнениям. М. Мир. 1985.

53. Ковалев И.Е., Шипулина Н.В. Иммунохимические механизмы адаптации организма к окружающей химической среде // Изв. АН СССР. 1992. Сер. биол. №1.С. 31-41.

54. Колчанов H.A., Суслов В.В., Шумный В.К. Молекулярная эволюция генетических систем // Палеонтологический журнал. 2007. № 6. С.58-71.

55. Сорогодин В.И. Проблемы пострадиационного восстановления. М.: Атомиздат, 1966. 391 с.

56. Корочкин Л.И. Онтогенез, эволюция и гены // Природа. 2002. № 7. с. 10-22

57. Корчагин В .П., Братковская Л.Б., Шведова A.A. и др. Олигомеризация интегральных мембранных белков при перекисном окислении липидов // Биохимия. 1980. Т.45. №10. С.1767-1772.

58. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования /Мл Медицина, 1957. 520 с.

59. Кузнецов Н.Я. Основы физиологии насекомых// M.-JL, изд-во АН СССР. 1948. 380 с.

60. Кулагин Ю.З. Лесообразующие виды, техногенез и прогнозирование. М. Наука. 1978. 116 с.

61. Лабори Г. Регуляция обменных процессов (теоретический, экспериментальный, фармакологический и терапевтический аспекты) // М. Медицина. 1970. 384с.

62. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., Высшая школа, 1980, 293 с.

63. Линевич Л.И. Лектины и углевод-белковое узнавание на разных уровнях организации животного // Успехи биол. химии.1979. Т. 20. С. 71-94.

64. Лухтанов В.А. Неспецифическая резистентность как показатель состояния популяции насекомых // Тез.докл. «Методика и результаты изучения физиологических состояний насекомых. 1985. Тарту. С.47-49

65. Львов A.B., Николенко А.Г. Особенности экспрессии генов антибактериальных пептидов Apis mellifera mellifera // Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии. Челябинск: ЧГМА. 1999. С. 159-162.

66. Максимов В.И., Родоман В.Е., Лунцевич В.Г. Фитоактивные хитиновые соединения // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т.ЗЗ, №4. С. 355-362.

67. Максимов В.И., Смирнова Ю.В. Сернокислотно-ферментативная переработка хитина//Биотехнология. 1993. №3. С.26-30.

68. Марков A.B., Куликов A.M. Гипотеза иммунологического тестирования партнеров — системы распознавания «своих» и «чужих» в исторической перспективе // Изв. РАН. Сер. Биол. 2006. № 4. С. 389-403.

69. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца // М. Медицина. 1984. 272с.

70. Мелехов Е.И. О возможном принципе регуляции повреждения и защитной реакции клетки // Журнал общей биологии. 1983. Т.44. №3. С.386-397.

71. Мелехов Е.И. Принцип регуляции скорости повреждения клетки и реакция защитного торможения метаболизма.// Журнал общей биологии. 1985. Т. 46. №2.С.174-189.

72. Мерщиев В.М. Манганометрический метод определения активности каталазы в организме пчел // Рацпредложение НИИП. 1990.

73. Миселюнене И. Изменения морфологии и соотношения различных типов клеток гемолимфы капустной белянки при заражении энтобактерином. // Цитология. 1976. Т.18. С.1220-1225.

74. Миселюнене И. Морфология клеток гемолимфы гусениц капустной белянки //Цитология. 1975. Т.17. №6. С.645-652.

75. Молчанов A.M. Критические точки биологических систем. В кн. Математическое моделирование в биологии. М. «Наука». 1975. 156 с.

76. Озерецковская О.Л., Ильинская Л.И., Васюкова Н.И. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням // Физиология растений. 1994. Т.41. №4. С.626-633.

77. Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Роменская И.Г. и др. Фрагменты ксилоглюкана регуляторы иммунных эффектов в картофеле // Физиология растений. 1995. Т.42. №5. С.773-779.

78. Омельянчук Л. В., Дубовский И. М., Глупов В. В. Ген-регулятор фенолоксидазной активности у Drosophila melanogaster // Генетика. 2001. Т.с37. №8. С. 1063-1067.

79. Орлова Е.Г., Ширшев C.B. Молекулярные механизмы адренергического контроля функций фагоцитирующих клеток. // Успехи соврем.биологии, 2004. Т. 124. N 4. С.342-354.

80. Осипов А.Н., Азизова O.A.,Владимиров Ю.В. Активные формы кислорода и их роль в организме.//Успехи. биол. химии. 1990. Т. 31. С. 180-208

81. Оцхели Т.А. Изучение гемолимфы гусениц тутового шелкопряда в условиях измененного режима питания. // Тр. Инст. зоол. АН ГрузССР. 1954. С. 215222.

82. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. Новосибирск: Наука. 1983. 216 с.

83. Панов A.A. Нейросекреторные клетки головного мозга тутового шелкопряда и их реакция на голодание // Докл. АН СССР. 1966. Т. 170. С. 952-955.

84. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. М. Медицина. 1973. 287с. Петров Р. В. Иммунология // М. «Медицина». 1982. 338с.

85. Полтев В.И. Микрофлора насекомых.// Изд-во «Наука». Новосибирск. 1969. 267с.

86. Полтев В.И., Александрова Л.В. Роль взрослых пчел в распространении гнильца

87. Раушенбах И. Ю., Серова Л. И., Тимохина И. С., Ченцова Н. А., Шумная Л. В. Изменение содержания биогенных аминов у двух линий БгозорЫ1а ушНб и их гибридов в онтогенезе и при тепловом стрессе // Генетика. 1990. Т. 27. № 4. С. 657-666.

88. Раушенбах И. Ю., Серова Л. И., Тимохина И. С., Шумная JL В., Ченцова Н. А., Бабенко В. Н. Генетический анализ различий в метаболизме дофамина у двух линий Drosophila virilis в норме и при тепловом стрессе // Генетика. 1993. Т. 29. № 6. С. 935-948.

89. Раушенбах И.Ю. Стресс-реакция насекомых: механизм, генетический контроль, роль в адаптации // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. № 8. С. 1110-1118.

90. Раушенбах И.Ю., Серова Л.И., Тимохина И.С. и др. Генетический анализ различий в метаболизме дофамина у двух линий D. virilis в норме и при тепловом стрессе//Генетика. 1993. Т.29. № 6. С. 935-949.

91. Раушенбах И.Ю., Серова Л.И., Тимохина И.С. Генетический анализ различий в метаболизме дофамина у двух линий D. virilis в норме и при тепловом стрессе.//Генетика. 1993. Т.29. № 6. С. 935-949.

92. Румянцев С.Н. Микробы, эволюция, иммунитет.// Л. «Наука». 1983 176с.

93. Салтыкова Е. С. Адаптивное действие хитоолигосахаридов на Apis mellifera L.: Автореф. дис. канд. биол. наук. Санкт-Петербург-Пушкин, 2000. 28 с.

94. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В. Индукция хитоолигосахаридами системы фенолоксидаз у насекомых// Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии. Челябинск. 1999. С.55-58

95. Салтыкова Е.С., Беньковская Г.В., Поскряков A.B. Индукция хитоолигосахаридами системы фенолоксидаз у насекомых // Актуальные проблемы современной биохимии и биотехнологии. Челябинск. 1999.

96. Салтыкова Е.С., Поскряков A.B., Николенко А.Г., Хайруллин P.M. Повышение адаптивности медоносной пчелы при использовании хитоолигосахаридов //

97. Экологический императив сельского хозяйства Республики Башкортостан. Уфа, 1998. С. 67-68.

98. Светлов П.Г. Физиология (механизмы) развития. Т.1. Процессы морфогенеза на клеточном и организменном уровнях. Д.: Наука. 1978

99. Светлов П.Г., Корсакова Г.Ф. Наследование изменений экспрессивности мутации eyeless Drosophila melanogaster, возникающих под влиянием температурных воздействий в критические периоды онтогенеза.// Онтогенез. 1971. Т.2. №4. 347-355.

100. Селье Г. На уровне целого организма. М. Мир. 1972. С. 321.

101. Сикура A.I. Про мускардинну шфекцио у лялечок американського бшого метелика // Доп. АН УССР. 1957. С.598.

102. Сиротина М.И. Анализ гемолимфы вредителей // Гематологический контроль при разработке микробиологической борьбы с колорадским жуком //Доклады АН СССР. 1961. Т. 140. №3. С.720-723.

103. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ // Киев. Наукова думка. 1982. 280с.

104. Смирнова О.Б. Роль антиоксидантов в устойчивости организма к стрессорному воздействию // Тез. Докл. VI междунар. Конф. «Биоантиоксидант . Москва, 16-19 апр. 2002 г.». С. 539-540

105. Соловьева Л.Ф. Токсикозы пчел и их профилактика // Сб. науч.-исслед. работ по пчеловодству. Рыбное, 1995. С.237-257.

106. Стальная Д.И., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. П/р акад. АМН СССР В.Н. Ореховича. М., Медицина. 1977. С. 66-68.

107. Стил Э., Линдли Р., Бланден Р. Что, если Ламарк прав? Иммуногенетика и эволюция. М: Мир. 2002. 237 с.

108. Сухорукова О.В. Участие ферментов фенолоксидазного комплекса в защитных реакциях насекомых: Автореф. дис. канд. биол. наук. Уфа, 2002. 24с.

109. Сытин А.Г. Селекция споровой энтомопатогенной бактерии методом хроматографии на бумаге. В сб. Исслед. по биологическому методу борьбы с вредителями сельского и лесного хоз-ва. Новосиб. 1969. 65 с.

110. Таранов Г.Ф., Шагун Л.А. Добавление минеральных солей к зимней подкормке пчел // Вопросы технологии производства меда и воска./ Сбор. науч. трудов. Рыбное.-1968. С.121-131.

111. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов // Физиология растений. 1992. Т. 39. №6. С.1215-1223.

112. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие.// Физиология растений. 2000. Т.47. №1. С. 23-25.

113. Усов А.И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул в растениях // Успехи химии. 1993. Т.62. №11. С.1119-1144.

114. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификация и физико-химические свойства // Микробиология. 1995. Т.64. №1. С.27-31.

115. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии.-М. 1986. С.94-98.

116. Флоренсов В. А., Пестова И. М. Очерки эволюционной иммуноморфологии.// Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та. 1990. 244 с.

117. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. М.: Мир. 1999. 558с.

118. Хочачка П., Самеро Д. Стратегия биохимической адаптации. М., Мир, 1977. 384 с.

119. Чалова Л.И., Озерецковская О.Л., Юрганова Л.А. Метаболиты фитопатогенных грибов индукторы защитных реакций растений (на примере взаимоотношений картофеля и Phytophthora infestans) // Докл. АН СССР. 1976. Т.230. №3. С.722-725.

120. Черныш С.И. Неспецифическая резистентность как показатель физиологического состояния насекомых // Тез.докл. «Методика и результаты изучения физиологических состояний насекомых. 1998. Тарту. С.134-136.

121. Черныш С.И. Реакция нейроэндокринной системы на повреждающее воздействие //Гормональная регуляция развития насекомых. 1983. JL. Наука. Т.64. С.118-128.

122. Черныш С.И., Лухтанов В.А., Симоненко И.П. Адаптация к повреждению у тутового шелкопряда Bombix mori. III. Адаптогены и устойчивость гусениц к стрессорной активации латентной вирусной инфекции // Энтомол. обозрение. 1985. Т. 64. № 2. С. 267-272.

123. Чиркин A.A., Романовский Р.В., Соловьев Ю.А. Диагностическая ценность определения интенсивности пентозофосфатного пути обмена углеводов в эритроцитах.//Лабораторное дело. 1983. .№11. С35-39.

124. Чураев Р.Н. Об одной неканонической теории наследственности // Современные концепции эволюционной генетики. Новосибирск: ИциГ СО РАН, 2000. -С.22-32.

125. Шамова О.В.,Кокряков В.Н. Алешина Г.М. Достижения и проблемы в изучении антибиотических пептидов животного происхождения. // Вестник РАМН. -1993 -№12.-С. 15-20

126. Шараев П.Н., Пишков В.Н., Соловьева Н.И. и др. Метод определения гликозоаминогликанов в биологических жидкостях // Лабораторное дело. 1987. № 5. С. 330-332.

127. Шевкунова B.C. Влияние бактериальных инфекций но общее число гемоцитов у личинок некоторых насекомых // Вредители и болезни с.-х. культур. Новосибирск. 1972. С.40-50.

128. Шевкунова B.C. Фагоцитарные реакции и бактерицидное действие гемолимфы насекомых //Изв. СОАН СССР. 1968. Сер. Биол.-мед. наук. Вып.1. С.90-94.

129. Шорин А.Ф. Особенности строения и поведения насекомых // Библиогр. 1931. 158с.

130. Abraham E.G., Nagaraju J., Salunke D., Gupta H.M., Datta R.K. Purification and partial characterization of an induced antibacterial protein in the silkworm, Bombyxmori//J. Invertebr. Pathol. 1995. V.65. Iss.l. P.17-24.

131. Agaisse H. An adaptive immune response in Drosophila? // Cell Host Microbe. 2007 Apr 19;l(2):91-3.

132. Ahmad S, Pritsos C.A., Bowen S.M., Kirkland K.E., Blomquist G.J., Pardini R.S., Activities of enzymes that detoxify superoxide anion and related toxic oxyradicals in Trichoplusia ni // Arch. Insect Biochem. And Physiol. 1987. V.6. No.2. P. 8596.

133. Ahmad S.D., Weinhold L.C., Pardini R.S. Cabbage looper antioxidant enzymes: Tissue spezificity // Insect Biohem. 1991. - V.21. - №5. - P.563-572.

134. Ahmed A., Martin D., Manetti A. G. O., Han S. J., Lee W. J., Mathiopoulos K. D., Muller H. M., Kafatos F. C., Raikhel A., Brey P. T. Genomic structure and ecdysone regulation of the prophenoloxidase 1 gene in the malaria vector

135. Anopheles gambiae //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 1479514800.

136. Arnold J.W., Hinks C.F. Haemopoiesis in Lepidoptera. III. A note on the multiplication of spherule cells and granular haemocytes // Can. J. Zool. 1983. V.61. P.257-277.

137. Ashhurst D.E., Glenn R.A. Some histochemical observations on the blood cells of the wax moth, Galleria mellonella L. // J. morphol. 1964. V.l 14. P.247-253.

138. Ashida M. The prophenoloxidase cascade in insect immunity // Res. Immunol. 1990. V.141. N 9. P.908-910.

139. Ashida M., Brey P. T. Role of the integument in insect defense: pro- phenol oxidase cascade in the cuticular matrix // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. -P. 10698-10702.

140. Ashida M., Dohke K. Activation of pro-phenoloxidase by the activating enzyme of the silkworm, Bombyx mori // Insect Biochem. 1980. — V. 10. - P. 37-47.

141. Ashida M., Koizunu Y. Demonstration of the presence of prophenoloxidase cascade in larval cuticle of the silkworm, Bombyx mori // Zool. Sci., 1993, V.10, №6, P. 12.;

142. Ashida M., Ochiai M., Niki T. Immunolocalization of prophenoloxidase among hemocytes of the silkworm, Bombyx mori // Tissue and Cell, 1983, V.20, №4, P.599-610.

143. Ashida M., Ochiai M., Niki T. Immunolocalization of prophenoloxidase among hemocytes of the silkworm, Bombyx mori II Tissue and Cell. 1988. - V.2. - №4. -P.599-610.

144. Ashida M., Yamazaki H. I. Biochemistry of the phenoloxidase system in insects: with special reference to its activation // Molting and Metamorphosis / Ed. Ohnishi E.,1.hizaki H. Tokyo: Japan Sci. Soc. Press- Berlin: Springer-Verlag, 1990. -P. 237-263.

145. Ashida ML, Yoshida H. Limited proteolysis of prophenoloxidase during activation by microbial products in insect plasma and effect of phenoloxidase on electrophoretic mobilities of plasma proteins // Insect Biochem. 1988. V.18. N 1. P. 11-19.

146. Ayres JS, Schneider DS. A signaling protease required for melanization in Drosophila affects resistance and tolerance of infections. PLoS Biol. 2008 Dec 9;6(12):2764-73.

147. Bai C., Vanhaecke M., Degheele D. Cytopathology of Spodoptera littoralis Boisd. midgut epithelium following treatment with 5-endotoxin of Bacillus thuringiensis Berliner.// "Meded. Fac. Landbouwwetensch. Rijksuniv. Gent." 1984. V.49. P.875-884.

148. Beaulaton J. Hemocytes and hemocytopoiesis in silkworms //Biohemie. 1979. V.61. P.157-164.

149. Brehelin M., Drif L., Baud L., Boemare N. Insect heamolymph: cooperation between humoral and cellular factors in Locusta migratoria II Insect Biochem. 1989. V. 19. P. 301-307.

150. Brookman J.L., Ratcliffe N.A., Rowley A.F. Studies of the prophenoloxidase system of insects by bacterial cell wall components.// Insect. Biochem. 1989. Vol.19. N 1. P.47-57.

151. Bulet P., Hetru C., Dimarcq J.-L., Hoffmann D. Antimicrobial peptides in insects;structure and function // Dev. Comp. Imm. 1999. V.23. P.329-344. Burmester T. Molecular evolution of the arthropod hemocyanin superfamily.//Mol

152. Biol Evol. 2001 Feb; 18(2): 184-95. Carlisle J., Loughton B., Ampleford E. Feeding causes the appearance of a factor in the haemolymph that stimulates protein synthesis // J. Insect Physiol., 1987, 33, N7. P.493-499.

153. Casteels P., Ampe C., Jacobs F. Tempst Functional and chemical characterization of hymenoptaecin, an antibacterial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee (Apis mellifera) // The Journal of Biological Chemistry. 1993. N.10. P.7044-7054

154. Casteels P., Ampe C., Jacobs F. Tempst Functional and chemical characterization of hymenoptaecin, an antibacterial polypeptide that is infection-inducible in the honeybee (Apis mellifera) // The Journal of Biological Chemistry. 1993. N.10. P.7044-7054

155. Carter J.B., Green E.J. Hemocytes and granular cell fragments of Tipula paludosa larvae // Morphology. 1987. V. 191. №3. P.289-294.

156. Charalambidis N., Bournazos S., Zervas C. Glycosylation and adhesiviness differentiate larval Ceratitis capitata tyrosinases //Arch. Insect Biochem. and Phisiol., 1994, V.27, №4, P.235-248.;

157. Charlesworth B., Langley C.N. The population genetics of Drosophila transposable elements // Annu. Rev. Genet. 1989. - V.23. - P.251-287.

158. Chen C., Durrant H.J., Newton R.P., Ratcliffe N.A. A study of novel lectins and their involvement in the activation of the prophenoloxidase system in Blaberus discoidalis II Biochem. J. 1995. - V.310. -P.23.

159. Chiang A.S., Gupta A.P., Han S.S. Arthropod immun system. 1. Comparative light and electron microscopic accounts of immunocytes and other hemocytes of Blatella germanica (Dictyoptera: Blatellidae) // J. Morphol. 1988. V.198. №3. P.257-267.

160. Chomezynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum ihio-cyanate-phenol-chlorophorm extraction // Anal. Biochem. 1987. P.156-159

161. Christensen B., Fink J., Merrifield R.B., Mauzerall D. Channel- forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V.85. P.5072-5076.

162. Clark K., Pech L.L., Strand M.R. Isolation and identification of a plasmatocyte spreading peptide from hemolymph of the lepidopteran insect Pseudoplusia includens //Journal of Biological Chemistry. V.272. 1997. P. 23440-23447.

163. Cohen AC, Crittenden P. Deliberately added and "cryptic" antioxidants in three artificial diets for insects.//J Econ Entomol. 2004 Apr;97(2):265-72.

164. Courgeon AM, Maingourd M, Maisonhaute C, Montmory C, Rollet E, Tanguay RM, Best-Belpomme M. Effect of hydrogen peroxide on cytoskeletal proteins of Drosophila cells: comparison with heat shock and other stresses.// Exp Cell Res. 1993 Jan;204(l):30-7

165. Crowley L.D., Houck M.A. The immune response of larvae and pupae of Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae), upon administered insult with Escherichia coli // Journal of Medical Entomology. 2002. V.39. .Iss.6. P.931-934.

166. Cui L., Luckhart S., Rosenberg R. Molecular characterization of a prophenoloxidase cDNA from the malaria mosquito Anopheles stephensi // Insect Molecular Biology. 2000. V. 9. P. 127-137.

167. Cullis C.A. DNA rearrangements in response to environmental stress // Adv. Genet. 1990. V.28. P.73-97.

168. Cullis C.A. Environmental induction of heritable changes in flax: Defined environments including changes in rDNA and peroxidase isozyme band pattern // Heredity. 1981. V.47. P.87-94.

169. Czajka M.C., Lee R.E. A rapid cold-hardening response protecting against cold shock injury in Drosophila melanogaster// J. Exp. Biol. 1990. V.148. P.245-254.

170. Das A., Nayak S., Parida B.B. Intrapopulational variation in starvation tolerance in Indian Droophila melanogaster // Proc. Nat. Acad. Sei., India. B. 1994. 64. N1. P. 51-56.

171. Dash R, Acharya C, Bindu PC, Kundu SC. Antioxidant potential of silk protein sericin against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in skin fibroblasts.//BMB Rep. 2008 Mar 31;41(3):236-41.

172. Davis B.J. Preprint «Disc Electrophoresis», Distillation Prod. Div. Eastman Kodak Co., Rochester N.Y., 1962.

173. De Gregorio E, Spellman PT, Rubin GM, Lemaitre B. Genome-wide analysis of the Drosophila immune response by using oligonucleotide microarrays.// Proc Natl Acad Sei U S A. 2001. Oct 23. 98(22). P. 12590-5.Ekengren. Hultmark. 2001

174. De Verno P.J., Aston P.W., Chadwick J.S. Transfer of immunity against Pseudonomas aeruginosa P II-I in Galleria mellonella larvae // Dev. Comp. Immunol. 1983. V. 7. №3. P. 423-434.

175. Desmond J.R., Gilliam M. Peroxisomal enzymes in the honey bee midgut // Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1996. 31. №3. P.87-103.

176. Diehl-Jones W.L., Mandato C.A., Whent G., Downer R.G.H. Monoaminergic regulation of hemocyte activity // J. Insect Physiol. 1996. V. 42. № 1. P. 13-19.

177. Dimarcq J.-L., Bulet P., Hetru C., Hoffmann J. Cystein-rich antimicrobial peptides in invertebrates // Biopolymers. 1998. V.47. Iss.6. P.456-477.

178. Dimarcq J.-L., Zachary D., Hoffman J.A. et al. Expression of the two major inducible antibacterial peptides, defensin and diptericin, in Phormia terranovae // EMBO J. 1990. V.9. No.8. P.2507-2515.

179. Dong Y, Taylor HE, Dimopoulos G. AgDscam, a hypervariable immunoglobulin domain-containing receptor of the Anopheles gambiae innate immune system.// PLoS Biol. 2006. Jul.4(7). P. 229.

180. Doreen A. Histochemical properties of the spherulocytes of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) // Int. J. Insect Morphol. and Embriol. 1982. V.ll. №56-. P. 258-292.

181. Drif L., Brehelis M. Agglutinin mediated immune recognition in Locusta migratoria II Journal of Insect Physiology. 1989. - V.35. - P.729-736.

182. Drif L., Brehelis M. Agglutinin mediated immune recognition in Locusta migratoria II Journal of Insect Physiology. 1989. V.35. P.729-736.

183. Dulmage H.T., Rhodes R.A. Production of pathogens in artificial media // In: Microbial Control of Insect and Mites, Burges H.D., Hussey N. W. London-New Yore, Academic Press. 1971. P.507-540.

184. Dunphy G.B., Webster J.M. Antihemocytic surface components of Xenorhabdus nematophylus var. dutki and their modification by serum of nonimmune larvae of Gallería mellonella II J. Invert. Pathol. 1991. V.58. P.40-51.

185. Durrant A. The environmental induction of heritable changes in Linum II Heredity. 1962. V.17. P.27-61.

186. Dvornik V.Y. Peroxidase and catalase in hemocytes of blackfly, Wilhelmia salopiensis edw., during preimaginal development // 9 Int. congr. Entomol. Beijing June28-July4. 1992. P.41.

187. Dyka FM, Wu WW, Pfeifer TA, Molday LL, Grigliatti TA, Molday RS. Characterization and purification of the discoidin domain-containing protein retinoschisin and its interaction with galactose.Biochemistry. 2008 Sep 2;47(35):9098-106. Epub 2008 Aug 9.

188. Eason DD, Litman RT, Luer CA, Kerr W, Litman GW. Expression of individual immunoglobulin genes occurs in an unusual system consisting of multiple independent loci.//Eur J Immunol. 2004 Sep;34(9):2551-8.

189. Essawy M., Maleville A., Brehelin M. The hemocytes of Heliothis armigera: ultrastructure, functions, and evolution in the course of larval development // Journal of Morphology. 1985. V.186. P.255-264.

190. Felton G.W., Duffey S.S. Ascorbat oxidation redaction in Helicoverpa zea as a scaverging system against dietary oxidants // Arch. Insect Biochem. And Phisyol. 1992. V.19. №1. P.27-37.

191. Ferrandon D, Imler JL, Hetru C, Hoffmann JA. The Drosophila systemic immune response: sensing and signalling during bacterial and fungal infections.// Nat Rev Immunol. 2007 Nov;7(l l):862-74.

192. Fields M.A., Tyson H. Activity and relative mobility of peroxidase and esterase isozymes of flax (.Linum usitatissimum) genotrophs. I. Developing main stems // Can. J. Genet. Cytol. 1973. V. 15. P.731-744.

193. Fleischmann J, Selsted ME, Lehrer RI. Opsonic activity of MCP-1 and MCP-2, cationic peptides from rabbit alveolar macrophages.// Diagn Microbiol Infect Dis. 1985 May;3(3):233-42.

194. Fontecave M., Pierre J.-L. Oxidations by copper metalloenzymes and some biomimetic approaches // Coordination Chemistry Reviews. 1998. V. 170. P. 125140.;

195. Forcella M, Berra E, Giacchini R, Hanozet GM, Parenti P. Changes in leucine transport activity in Chironomus riparius larvae after short-term exposure to potassium dichromate and fenitrothion.//Arch Insect Biochem Physiol. 2004 Feb;55(2):90-101.

196. Fridovich I. Superoxide dismutases // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1986. V.58. P.61-97.

197. Fujimoto K., Okino N., Kawabata S-i., Iwanaga S., Ohnishi E. Nucleotide sequence of the cDNA encoding the proenzyme of phenol oxidase Aj of Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 7769-7773.

198. Fukuhara T., Nishio S., Ono Y., Kawauchi M., Asari S., Ohmoto T. Induction of Cu,Zn-superoxide dismutase after cortical contusion injuri during hypothermia // Brain Res. 1994. V.657. P.333-336.

199. Furukawa S., Taniani K., Yang J. Induktion of gene expression of antibacterial proteins chitinoligomers in the silkworm, Bombix mori // Insect Mol. Biol. 1999. 8. (1). P.145-148.

200. Genazzani G. A., Martignoni E., Petraglia F. Stress and the Aging Brain, Integrative Mechanisms// Raven Press, New York., 1990.

201. Gillespie J.,Kanost M.R. Biological mediatirs of insect immunity // Annu. Rev. Entomol. 1997. V.42. P.611-643.

202. Gilliam M., Jeter W. Synthesis of agglutinating substances in adult honeybees against Bacillus larvae II J. Invert. Patol. 1970. V. 16. P. 69-70.

203. Ginsburg D, Zeheb R, Yang AY, Rafferty UM, Andreasen PA, Nielsen L, Dano K, Lebo RV, Gelehrter TD. cDNA cloning of human plasminogen activator-inhibitor from endothelial cells.//J Clin Invest. 1986 Dec;78(6): 1673-80.

204. Glinski Z., Grzegorczyk K. Apidaecins and lysozyme in the honeybee (Apis mellifera L.) from environment nonheavily contaminated with heavy metals // Ann. UMCS. DD. 1995. V.50. P.139-146.

205. Glinski Z., Jarocz J. Rola oksydazy polifenolowej w odpornosci przeciwzakaznej owadow // Wed. Wet. 1990. V. 46. № 7. P. 238-241.

206. Glupov V. Cell-mediated haemolytic activity of haemolymph from the Colorado potato beetle {Leptinotarsa decemlineata) // Cytobios. 1996. V.86. №344. P.35-51.

207. Goldstein I.J., Hughes R.C., Monsigay M., Osawam T., Sharon N. What should be called a lectin? //Nature. 1980. V. 285. № 5760. P. 66.

208. Gottar M, Gobert V, Michel T, Belvin M, Duyk G, Hoffmann JA, Ferrandon D, Royet J. The Drosophila immune response against Gram-negative bacteria is mediated by a peptidoglycan recognition protein. Nature. 2002 Apr 11;416(6881):640-4. Epub 2002 Mar 24.

209. Grunewald S.3 Reilander H., Mickel H. In vivo reconstitution of dopamine D25 receptor-mediated G-protein activation in baculovirus-infected insect cells: prefured coupling to G,i versus Gl2 II Biochemistry, 1996, V.35, №48, P. 1516215173.

210. Gupta A.P. Cellular elements // In Kerkut G.A. and gibert L.I. (eds.) Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. V.3. Oxford. Pergamon press. 1985. P.401-451.

211. Hagen H.-E., Klager S. L., McKerrow J. H., Ham P. J. Simulium damnosum s. i. isolation and identification of prophenoloxidase following an infection with Onchocerca spp. Using targeted differential display // Exp. Parasitol. 1997. - V. 86.-P. 213-218.

212. Hancock RE, Diamond G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.// Trends Microbiol. 2000 Sep;8(9):402-10.

213. Harm H., Renwrantz L. The inhibition of serum opsonins by a carbohydrate and the opsonizing effect of purified agglutinin on the clearance of non-self particles from the circulation of Helix pomatia I I J. Invert. Path. 1980. V. 36. P. 64-70.

214. Hattori D, Demir E, Kim HW, Viragh E, Zipursky SL, Dickson BJ. Dscam diversity is essential for neuronal wiring and self-recognition.// Nature. 2007. Sep 13. 449(7159). P. 223-7

215. Heimpel A.M., Angus T.A. Diseases caused by certain spore-forming bacteria // In: Insect Pathology: An Advanced Treatise, New York, Academic Press. 1963. V.2. P.21-73.

216. Hess CR, McGuirl MM, Klinman JP. Mechanism of the insect enzyme, tyramine beta-monooxygenase, reveals differences from the mammalian enzyme, dopamine beta-monooxygenase.//J Biol Chem. 2008 Feb 8;283(6):3042-9. Epub 2007 Nov 21.

217. Hetru C., Hoffmann D., Bulet P., Antimicrobial peptides from insects. In: Brey P.T., Hultmark D., editors. Molecular mechanisms of immune responses in insects. Chapman & Hall, 1998. P.40-66.

218. Hodkova M., Socha R. Comparison of effects of starvation and precocene II on the function to denervated corpus allatum in Dysdercus cingulatus females // Acta entomol. Bohemosl. 1982. 79, N2. P.108-111.

219. Hoffman J.A., Richhart J.-M. Drosophila immunity // Trends Cell Biol. 1997. V.7. P.309-316.

220. Housseau F., Moorthy A., Langer D. A., Robbins P. F., Gonzales M. I., Topalian S. L. N-linked carbohydrates in tyrosinase are required for its recognition by human MHC class II-restricted CD4(+) T cells // Eur. J. Immunol. 2001. V. 31. P. 26902701.

221. Jahagirdar A.P., Milton G., Wiswanata T., Downer R.G.H. Calcium involvement in mediating the action of octopamine and hypertrehalosemic peptides on insect hemocytes // FEBS. 1987. V. 219. P. 83-87.

222. Jain D., Nair D.T., Swaminathan G.J., Abraham E.G., Nagaraju J., Salunke D.M. Structure of the induced antibacterial protein from silkworm, Antheraea mylitta // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. Iss. 44. P. 41377-41382.

223. Jin LH, Shim J, Yoon JS, Kim B, Kim J, Kim-Ha J, Kim YJ. Identification and functional analysis of antifungal immune response genes in Drosophila. PLoS Pathog. 2008 Oct 3;4(10):el000168.

224. Jiravanichpaisal P., Lee B.L., Soderhall K. Cell-mediated immunity in arthropods: hematopoiesis, coagulation, melanization and opsonization.// Immunobiology. 2006. V. 211(4). P. 213-36.

225. Jomori T., Natori S. Function of the lipopolysaccharide-binding protein of Periplaneta americana as an opsonin // FEBS Lett. 1992. V. 296. №3. P. 283-286.

226. Jones J.C. Current concepts concerning insect hemocytes // J. Amer. Zoologist. V.2. 1962. P.209-246.i

227. Jones J.C. Hemocytopoiesis in insects //In: Gordon A.S. (Ed.) Regulation of Hemopoiesis .Appleton-Century-Crofts. New York. 1970. P.7-65.

228. Kaaya G.P., Flyg C., Bovan H.G. Insect immunity. Induction of cecropin and attacin-like antibacterial factors in the haemolymph of Glossina morsitans morsitans // Insect Biochem. 1987. V.17. P.309-315.

229. Kanost M.R., Dai W., Dunn P.E. Peptidoglycan fragments elicit antibacterial protein synthesis in larvae of Manduca sexta // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1988. V.8. Iss.3. P.147-164.

230. Khush R.S., Lemaitre B. Genes that fight infection; what the Drosophila genome says about animal immunity // Trends in Genetics. 2000. V.16. Iss.10. P.442-449.

231. Khush R.S., Leulier F., Lematre B. Drosophila immunity: two paths to NF-kB //

232. Comparative Immunology. 1998. V.22. P. 129. Komano H., Mizuno D., Natori S. A possible mechanism of induction of insect lectin

233. J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 7087-7089. Kopp EB, Medzhitov R. The Toll-receptor family and control of innate immunity.//

234. Kurata S. Signaling mechanisms in innate immunity // Nippon Rinsho. 2005. Apr;63. Suppl 4. P. 63-8.

235. Kurtz Jr. Semi-met oxidation level of chalcogenide derivatives of methemerythrin. Mossbauer and EPR studies.//J Biol Chem. 1983 Feb 25; 258(4):2115-7.

236. Ma C. C., Kanost M. R. A beta 1,3-glucan recognition protein from an insect, Manduca sexta, agglutinates microorganisms and activates the phenoloxidase cascade // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 7505-7514.

237. Mackintosh J.A., Gooley A.A., Karuso P.H., Beattie A.J., Jardine D.R., Veal D.A. A gloverin-like antibacterial protein is synthesized in Helicoverpa armigera following bacterial challenge // Dev. Comp. Imm. 1998. V.22. P.387-399.

238. Madden J.C., Ruiz N., Caparon M. Cytolysin-mediated translocation: a functional equivalent of type III secretion in Gram-positive bacteria.// Cell. 2001. V.104. P.143-52.

239. Magalhaes T, Brackney DE, Beier JC, Foy BD. Silencing an Anopheles gambiae catalase and sulfhydryl oxidase increases mosquito mortality after a blood meal. // Arch Insect Biochem Physiol. 2008 Jul;68(3):134-43.

240. Makdad R.-A. Rowley A.F. Studies on the cellular defence reactions of the madera cockroach, Leucophaea maderae // J. Invert. Pathol. 1990. V. 55. №3. P. 350-356.

241. Marmaras V.J., Charalambidis N. Certain hemocyte proteins of the medfly, Ceratitis capitata, are responsible for nonself recognition and immobilization Eischerichia coli in vitro // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 1992. V. 21. №4. P. 281-288.

242. Marmaras V.J., Charalambidis N. Certain hemocyte proteins of the medfly, Ceratitis capitata, are responsible for nonself recognition and immobilization Eischerichia coli in vitro // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 1992. V. 21. №4. P. 281-288;

243. Marmaras V.J., Charalambidis N.D., Lambropoulou M. Cellular defense mechanisms in Ceratitis capitata: recognition and entrapment of Eisherihia coli by hemocytes //Arch. Insect. Biochem. and Physiol. 1994. V.26. №1. P.l-14

244. Marmaras V.J., Charalambidis N.D., Zerva C.G. Immune response in insects: The role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization//Arch. Insect. Biochem. and Physiol. 1996. V.31. №2. P.l 19-133.

245. Mathieu Y., Kurkaian A., Xia H. et al. Membrane Responses Induced by Oligogalacturonides in Suspension-culturel Tobacco Cells // Plant. J. 1991.V.l. №3. P.333-334.

246. Meiler Harel HY, Fontaine V, Chen H, Jones IM, Miliner PA. Display of a maize cDNA library on baculovirus infected insect cells.//BMC Biotechnol. 2008 Aug 12;8:64.

247. Metalnikoff S. Immunité naturalle et acquise deschenilles de G. Mellonella // Compt.rend. soc. biol. 1920. S.83

248. Miranpuri G.S., Bidochka M.J., Kachatourians G.C. Morphology and cytochemistry of hemocytes ahd analisis of hemolymph from Melanoplus sanguinipes (Orthoptera: Acrididae) Il J. Econ. Entomol. 1991. V. 84. P. 371-378.

249. Mittapalli O, Neal JJ, Shukle RH. Antioxidant defense response in a galling insect // Proc Natl Acad Sei USA. 2007 Feb 6; 104(6): 1889-94.

250. Mittapalli O, Shukle RH, Sardesai N, Giovanini MP, Williams CE. Expression patterns of antibacterial genes in the Hessian fly.// J Insect Physiol. 2006 Nov-Dec;52(ll-12):l 143-52.

251. Mohrig W., Messner B. Lysozyme as antibacterial agent in honey ahd bees venom // Acta. Biol. Med. Ger. 1968. V.21. Iss.l. P.85-95.

252. Moon Y.S., Sik C.C., Ryul K.H. Antibacterial peptides from Spodoptera litura // 20 Int. Congr. Entomol. Firenze, Aug. 25-31, 1996. C.226.

253. Moore A.J., Beazley W.D., Bibby M.C., Devine D.A. Antimicrobial activity of Cecropins // J. Antimicrob. Chemother. 1996. V.37. P. 1077-1089.

254. Moret Y, Schmid-Hempel P. Immune defence in bumble-bee offspring.// Nature. 2001. Nov. 29. 414(6863) P.506.

255. Moret Y., Schmid-Hempel P. Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers.//Science. 2000 Nov 10. 290(5494). P. 1166-8.

256. Mucklow PT, Vizoso DB, Jensen KH, Refardt D, Ebert D. Variation in phenoloxidase activity and its relation to parasite resistance within and between populations of Daphnia magna.//Proc Biol Sci. 2004 Jun 7;271(1544): 1175-83.

257. Muller H.-M., Dimopoulos G., Blass C., Kafatos F. C. A hemocyte-like cell line established from the malaria vector Anopheles gambiae expresses six prophenoloxidase genes // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 11727-11735.

258. Nappi A. J., Vass E., 1997. Comparative studies of enhanced iron-mediated production of hydroxyl radical by glutathione, cysteine, ascorbic acid, and selected catechols //Biochim. Biophys. Acta. V. 1336. P. 295-302.

259. Nappi A.J., Vass E. Hydrogen peroxide production in immune-reactive Drosophila melanogasterll J. Parasitol. 1998. V.84. P.l 150-1157.

260. Nappi A.J., Vass E., Frey F., Carton Y. Nitric oxide involvement in Drosophila immunity //Nitric Oxide: Biology and Chemistry. V.4. №4. 2000. P.423-430.

261. Nappi A.J., Vass E., Frey F., Carton Y. Superoxide anion generation in Drosophila during melanotic encapsulatin of parasites //European Journal of Cell Biology. V.68. 1995. P.450-456.

262. Nappi A.J., Vass E., Frey F., Carton Y. Superoxide anion generation in Drosophila during melanotic encapsulatin of parasites //European Journal of Cell Biology. V.68. 1995. P.450-456.

263. Nardi J.B.,Gao Ch., Kanost M.R. The exstracellular matrix protein lacunin is expressed by a subset of hemocytes involved in basal lamina morphogenesis // J. Of Insect Physiolodgy. 2001. V.47. P. 997-1006.

264. Natali L., Cavallini A., Cionini G. Nuclear DNA chenges within Helianthus annus L.: Changes within single progenies and their relationships with plant development I I Theor. Appl. Genet. 1993. V.85. P.506-512.

265. Natori S., Shiraishi H., Hori S., Kobayashi A. The roles of Sarcophaga defense molecules in immunity and metamorphosis // Dev. and Comp. Immunol. V. 23. 1999. P. 317-328.

266. Orgel L.E., Crick F.H.C. Selfish DNA: the ultimate paraasite // Nature. 1980. V.284. № 5757. P.604-607.

267. Otvos L Jr. Antibacterial peptides isolated from insects.// J Pept Sci. 2000 0ct;6(10):497-511

268. Paillot A. Limmunite asquisechez les insects // Compt.rend. soc. biol. 1920. S. 82

269. Pech L.L., Strand M.R. Plasmatocytes from the moth Pseudoplusia includens induce apoptosis of granular cells //Journal of Insect Physiology. 2000. V.46. P.1565-1573.

270. Pendland J.C., Boucias D.G. Hemagglutinin activity in the hemolymph of Anticarsia gemmatalis larvae infected with the fungus Nomuraea rilevi // Dev. Comp. Immunol. 1985. V. 9. № 1. P. 21-30.

271. Persson C, Oldenvi S, Steiner H. Peptidoglycan recognition protein LF: a negative regulator of Drosophila immunity.// Insect Biochem Mol Biol. 2007 Dec; 37(12):1309-16.

272. Pieters J. Evasion of host cell defense mechanisms by pathogenic bacteria.// Curr Opin Immunol. 2001. V. 13. P. 37-44

273. Pritsos C.A., Ahmad S., Bowen S.M., Blomquist G.J., Pardini R.S. Antioxidant enzyme activities in the southern armyworm, Spodoptera eridania // Comp. Biochem. And Physiol. 1988. V.90. No.2. P. 423-427.

274. Rabea EI, El Badawy M, Rogge TM, Stevens CV, Steurbaut W, Höfte M, Smagghe G. Enhancement of fungicidal and insecticidal activity by reductive alkylation of chitosan.//Pest Manag Sei. 2006 Sep; 62(9):890-7.

275. Raina A.K. Ultrastructure of the larval hemocytes of the pink bollworm Pectinophora gossypiella (Lepidoptera: Gelechniidae) // Int. J. Insect. Morphol. and Embryol. 1976. V.5. № 3. P.187-195.

276. Ramachandran R., Mukherjee S.N., Sharma R.N/. Hormetic effect of azadirachtin jn Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) // Indian J. Exp. Biol. 1988.V.26.N 11. P.913-914.

277. Ratcliffe N. A., Brookman J. L., Rowley A. F. Activation of prophenoloxidase cascade and initiation of nodule formation in locusts by bacterial lipopolysaccharides // Developmental and Comparative Immunology. 1991. V. 15. P. 33-39.

278. Ratcliffe N., Leonard C., Rowley A. Prophenoloxidase activation: nonself recognition and cell cooperation in insect immunity // Science, 1984, V.226, №4674, P.557-559.;

279. Ratcliffe N., Rowley A. Recognition factors in insect hemolymph // Dev. Comp. Immunal. 1983, V.7, №4, P.653-656.;

280. Ratcliffe N.A., Brookman J.L., Rowley A.F. Activation of the prophenoloxidase cascade and initiation of nodule formation in locusts by bacterial lipopolysaccharides // Dev. And Compar. Immunol. 1991. V.15. N1-2. P.33-39.

281. Rauschenbach I.Y., Shumnaya L.V., Khlebodarova T.M. et al. Role of penol oxidases and thyrosine hydroxilase in control of dopamine content in Drosophila virilisunder normal conditions and heat stress I I J. Insect Physiol. 1995. V.41. P.279-286.

282. Romeo Y, Lemaitre B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. // Methods Mol Biol. 2008;415:379-94.

283. Rosenfeld Y, Shai Y. Lipopolysaccharide (Endotoxin)-host defense antibacterial peptides interactions: role in bacterial resistance and prevention of sepsis.// Biochim Biophys Acta. 2006 Sep;1758(9):1513-22. Epub 2006 Jun 2.

284. Ross A. Systemic Acguired Resistance Induced by Localized Virus Infections in Plant //Virology. 1961. V.14. №2. P.340-358.

285. Rothenfluh H. Hypothesis: A memory lymphocyte-specific soma-to-germline genetic feedback loop. //Immunology and Cell Biology. 1995. V.73. P. 174-180.

286. Rowley A.F., Brookman J.L., Ratcliffe N.A.Possible involvement of the prophenoloxidase system, Locusta migratoria, in antimicrobial activity // J. Invertebr. Patol. 1990. V. 56. P. 31-38.

287. Rowley A.F., Ratcliffe N.A. Insects // In Rowley A.F., Ratcliffe N.A. Invertebrate blood cells. V.2. Academic Press. London. 1981. P.421-488.

288. Ryan C.A., Farmer E.E. Oligosacchride signals in plants: a current assesment // Annu. Rev. Plant Phisiol. Mol. Biol. 1991. V.42. P.651-671.

289. Sadd BM, Kleinlogel Y, Schmid-Hempel R, Schmid-Hempel P. Trans-generational immune priming in a social insect. //Biol Lett. 2005. Dec 22. 1(4). P.386-8.

290. Saltykova E.S., Poskryakov A.V., Benkowskaya G.V., Khayrullin R.M., Nikolenko A.G. Adaptive effect of chitooligosaccharides on the honeybee Apis mellifera mellifera L. // Biologically Active Polysaccharides. Oslo, 1998. P.98.

291. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1989. 1626 p.

292. Sanger J., Sanger I., Southwick H. Host cell actin assembly is necessary and likely to propulsive force for intracellular movement // Insect Immun. 1992. V.60. P.3609-3619.

293. Sasaki K, Yamasaki K, Tsuchida K, Nagao T. Gonadotropic effects of dopamine in isolated workers of the primitively eusocial wasp, Polistes chinensis.Naturwissenschaften. 2009 Feb 7. Epub ahead of print.

294. Saul S., Sugumaran M. Protease inhibitor controls prophenoloxidase activation in Manduca sexta // Febs Lett., 1986, V.208, №1, P. 113-116.

295. Saul S.J., Sugumaran M. Phenoloxidase activation in the hemolymph of Sarcophaga bullata larvae // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1988. - V. 7. - P. 91-103.

296. Schachter J, Pérez MM, Quesada-Allué LA. The role of N-beta-alanyldopamine synthase in the innate immune response of two insects. // J Insect Physiol. 2007 Nov;53(ll):l 188-97.

297. Schmit A. R., Rowley A. F., Ratcliffe N. A. The role of Galleria mellonella hemocytes in melanin formation // Journal of Invertebrate Pathology. 1977. V.29. P.232-234.

298. Schmit A.R., Ratcliffe N.A. The encapsulation of Araldite implants and recognition of foreignness in Clitumnus extradentatus II J. Insect Physiol. 1978. V.24. P.511-521.

299. Schwarzenbach GA, Ward PI. Phenoloxidase activity and pathogen resistance in yellow dung flies Scathophaga stercoraria.// J. Evol Biol. 2007. Nov;20(6). P.2192-9.

300. Selker E.U. Epigenetic phenomena in filamentous fungi useful paradigms or repeat induced confusion? // Trends in Genet. 1997. V.13. P.296-301.

301. Semsei I., Verzar F. Possible mechanism of alteration in activities of three radical scavenging enzymes, superoxide dismutase and catalase // Age. 1989. V.12. № 3. P.l 11-112.

302. Shi L, Li B, Paskewitz SM. Cloning and characterization of a putative inhibitor of melanization from Anopheles gambiae.//Insect Mol Biol. 2006 Jun;15(3):313-20.

303. Shrestha R., Gateff E. Ultrastructure and cytochemistry of cell types in larval hematopoietic organs and hemolimph of Drosophila melanogaster II Development Growth & Differentiation. 1982. V.24. P.65-82.

304. Shrivastava S.C., Richards A.G. An autoradiographic study of the relation between hemocytes and connective tissue in the wax moth Gallería mellonella L. // Biological Bulletin. 1965. V.128. P.337-345.

305. Siegert K., Krippeit P., Ziegler R. Regulation of fat body glycogen phosphorylase during starvation in larvae of Manduca sexta (Lepidoptera: Sphingidae) // Acta endocrinol. 1982. 99. Suppl. 246, p. 33-34.

306. Soderhall K. Prophenoloxidase activating system and melanization — a recognition mechanism of arthropods? A review // Developmental and Comparative Immunology. 1982.-V. 6.-P. 601-611.

307. S0rensen JG, Nielsen MM, Kruhoffer M, Justesen J, Loeschcke V. Full genome gene expression analysis of the heat stress response in Drosophila melanogaster.// Cell Stress Chaperones. 2005. V.10(4). P.312-28.

308. Sorrentino R.P., Carton Y., Govind S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated // Developmental Biology. 2002. V.243. P.65-80.

309. Stanley-Samuelson D.W. The biological significance of prostaglandins and related eicosanoids in invertebrates // Amer. Zool. 1994.V.34. №6. P.589-598.

310. Stebbins M.R., Hapner K.D. Preparation and properties of haemagglutinin from haemolymph of Acrididae (Grasshoppers) // Insect Biochem. 1985. V. 15. №4. P. 451-462.

311. Steel E.J., Gorczynski R.M., Pollard J.W. The somatic selection of acquired characters // Ed. Pollard J.W. Evol. utionary Theory: paths into the future. London, 1984. P.217-237.

312. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity // Nature. 1981. V.292. P.246-248.

313. Steinhaus E. A., Dineen J. P. Observations on the role of stress in a granulosis of the variegated cutworm // J. Insect Pathol. 1960.V. 2. P. 55-65.

314. Stotz H., Powell A., Damon S. et al. Molecular Characterization of Polygalacturonase Ingibitor from Pyrus communis // Plant Physiol. 1993. V. 102. №1. P. 133-138.

315. Strand M.R. and Pech L.L. Immunological basis for capability in parasitoid-host relationships //Annu. Rev. Entomol. 1995. V.40. P.31-56.

316. Stynen D., Peferoen M., De Loof A. Proteins with haemagglutinin activity in larvae of the Colorado beetle Leptinotarsa decemlineata II J. Insect Phisiol. 1982. - V.28. - №5. - P.465-470.

317. Sugumaran M. Phenoloxidase activation and insect immunity // In "Defense molecules". A.R. Liss. 1990. P. 47-62.

318. Sugumaran M., Giglio L., Kundzicz H. Studies on the enzymes involved in puparial cuticle sclerotization in Drosophila melanogaster // Arch. Insect Biochem. and Physiol. 1992.V.19.N 4. P.271-283.

319. Sugumaran M., Kanost M. R. Regulation of insect hemolymph phenoloxidases // Parasites and Pathogens of Insects / Ed. Beckage N. E., Thompson S. N., Federici B. A. San Diego: Academic Press, 1993. P. 317-342.

320. Sun S.C., Faye I. Transcription of immune genes in the giant silkworm, Hyalophora cecropia, is augmented by H2O2 and diminished by thiol reagents // Europian Journal of Biochemistry. 1995. V.231. P.93-98.

321. Suzuki T., Natori S. Identification of a protein having hemagglutinating activity in the hemolymph of the silkworm, Bombyx mori II J. Biochem. 1983. V. 93. P. 583590.

322. Svoboda J.A., Thompson M.J., Robbins W.E., Kaplanis J.N. Insect steroid metabolism //Lipids. 1978. V.13. № 10. P. 742-753.

323. Taniani K., Wago H., Yamakawa M. In vitro phagocytosis of Escherichia coli and release of lipopolysaccharide by adhering hemocytes of the silkworm, Bombyx mori //Biochemical and Biophysical Research Communications. V.231. 1997. P.623-627.

324. Terwilliger N.B. Hemolymph proteins and molting in crustaceans and insects // American zoologist. 1999. V. 39. № 3. P. 589-599.;

325. Terwilliger N.B. Hemolymph proteins and molting in crustaceans and insects // American zoologist. 1999. V. 39. № 3. P. 589-599.;

326. Theopold U, Schmidt O, Soderhall K, Dushay MS. Coagulation in arthropods: defence, wound closure and healing.// Trends Immunol. 2004. Jun. 25(6) P. 289-294.

327. Tielecke H. Der Einfluß subletaler Dosen on Insektiziden auf die biologischen Daten und auf die Resistenz bildung einiger Insekten.// Arch. Phytopathol.und Pflanzenschutz. 1997. 13. S.277-288.

328. Tojo S., Naganuma F., Arakawa K., Yokoo S. Involvement of both granular cells and plasmatocytes in phagocytic reactions in the greater wax moth, Galleria mellonella II Journal of Insect Physiology. 2000. V.46. P. 1129-1135.

329. Toke O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections.// Biopolymers. 2005;80(6):717-35.

330. Tominaga R. Effects of He-Ne laser irradiation on fibroblasts derived from scar tissue of rat palatal mucosa. // Kokubyo Gakkai Zasshi. 1990 Dec;57(4):580-94. Japanese.

331. Tzou P, Ohresser S, Ferrandon D, Capovilla M, Reichhart JM, Lemaitre B, Hoffmann JA, Imler JL. Tissue-specific inducible expression of antimicrobial peptide genes in Drosophila surface epithelia. // Immunity. 2001. Nov;13(5). P. 737-48.

332. Tzou P., De Gregorio E., Lemaitre B. How Drosophila combats microbial infection: a model to study innate immunity and host-pathogen interactions // Current Opinion in Microbiology. 2002. V.5. Iss.2. P.102-110.

333. Van Asperen K. A study of housefly esterases by means of a sensetive calorimetric method // J. Insect. Physiol. 1962. V.8. P .401-416.

334. Vidal M, Becerra J, Mondaca MA, Silva M. Selection of Mycobacterium sp. strains with capacity to biotransform high concentrations of beta-sitosterol.// Appl Microbiol Biotechnol. 2001. Oct. 57(3). P. 385-9.

335. Vidal S., Khush R.S., Leulier F., Tzou P., Nakamura M., Lemaitre B. Mutations in the Drosophila dTAKl gene reveal a conserved function for MAPKKKs in the control of rel/NF-kappaB-depended innate immune responses // Genes Dev. 2001. V.15. P.1900-1912.

336. Vilmos P., Kurucz E. Insect immunity: evolutionary roots of the mammalian innate immune system // Immunology Letters. 1998. V.62. Iss.l. P.59-56.

337. Wagner C, Isermann K, Fehrenbach H, Roeder T. Molecular architecture of the fruit fly's airway epithelial immune system//BMC Genomics. 2008 Sep 29;9:446.

338. Wago H. Cellular recognition of foreign materials by the hemocytes of the silkworm Bombyx mori II Developmental and Comparative Immunology. 1982. V.17.P. 291300.

339. Wang Y, Oberley LW, Murhammer DW. Antioxidant defense systems of two lipidopteran insect cell lines.//Free Radic Biol Med. 2001 Jun 1;30(11): 1254-62.

340. Warr E3 Lambrechts L, Koella JC, Bourgouin C, Dimopoulos G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization.//Insect Biochem Mol Biol. 2006 Oct;36(10):769-78. Epub 2006 Aug 11.

341. Watson M.J.O., Hoffmann A.A. Acclimation, cross-generation effects, and the response to selectin for increased cold resistance in Drosophila // Evolution (USA). 1996. 50. P. 1182-1192.

342. Weaver R.J., Pratt G.E. Effects of starvation and feeding upon corpus allatum activity and oocyte growth in adult female Periplaneta americana // // J. Insect Physiol. 1981. 27, N1. P. 75-83.

343. Williams M.J. Drosophila hemopoiesis and cellular immunity.// J Immunol. 2007. Apr 15. V. 178(8). P. 4711-6.

344. Witten M.A., Ratcliffe N.A. In vitro superoxide activity in the haemolymph of the West Indian leaf cocroach, Blaberus discoidalis // Journal of Insect Physiology. 1999. V.45. P.667-675.

345. Wood Jones F. Habit and heritage. London: Trubner & Co, 1943. P.34-45.

346. Wright T. R. F. Genetic of biogenic amines metabolism, sclerotisation and melanisation in Drosophila melanogaster//Adv. Genet. 1987. V. 24. P. 127-221.

347. Xue C.H., Yu G.L. Hirata T. Antioxidative activities of several marine polisaccharides evaluated in a phosphatidylcholine suspension and organic solvents // Bioscience Biotechn. And Biochem. 1998. V.62. №2. P.206-209.

348. Yamakawa M., Tanaka H. Immune proteins and their gene expression in the silkworm, Bombyx mori //Dev. Comp. Imm. 1999. V.23. P.281-289.

349. Yu X.-Q., Kanost M.R. Manduca sexta lipopolysaccharide-speecific immulectin-2 protects larvae from bacteria linfection // Dev. Comp. Immunol. 2003. V. 27. №3. P. 189-196.

350. Zawisza-Raszka A, Dolezych B. Acetylcholinesterase, catalase and glutathione S-transferase activity in beet armyworm (Spodoptera exigua) exposed to nickel and/or diazinon.//Acta Biol Hung. 2008 Mar;59(l):31-45.

351. Zdybicka-Barabas A. Cell-free immune response in juvenile hormone JH-III treated Galleria mellonella larvae // Acta Poloniae Toxicologica. 1999. V.7. Iss.2. P.209-216.

352. Zhang X, Sato M, Sasahara M, Migita CT, Yoshida T. Unique features of recombinant heme oxygenase of Drosophila melanogaster compared with those of other heme oxygenases studied.//Eur J Biochem. 2004 May;271(9):1713-24.

353. Zhu P., Lu Z. Studies on the antibacterial substances of Pieris rapae induced by deltamethrin and trichlorfon //19 Int. Congr. Entomol. Beijing, June 28 July 4., 1992. P. 594.