Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические особенности неспецифического иммунитета при одиночном и групповом содержании Nauphoeta Cinerea (Oliv.)

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические особенности неспецифического иммунитета при одиночном и групповом содержании Nauphoeta Cinerea (Oliv.)"

На правах рукописи

МУРЗАГУЛОВ ГРИГОРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ОДИНОЧНОМ И ГРУППОВОМ СОДЕРЖАНИИ NAUPHOETA CINEREA (Oliv.)

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

* ЛИК 2013

Уфа 2013

005543634

005543634

Работа выполнена в лаборатории биохимии адаптивности насекомых

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Салтыкова Елена Станиславовна

Доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Ибрагимов Ринат Исмагилович

Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии биологического факультета ФГБОУ ВПО Башкирского государственного университета

Рославцева Светлана Александровна

Доктор биологических наук, зав. отделом научных основ дезинсекции и дератизации ФБУН НИИ дезинфектологии Роспотребнадзора

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений РАСХН

Защита диссертации состоится «_» _____ 2013 г. в «_» часов

на заседании диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан «_»_2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Способность насекомых быстро приспосабливаться к изменениям окружающей среды не вызывает сомнений. Простое, но надежное строение их организма обеспечивает большой запас прочности. Быстрая смена поколений, плодовитость многих видов, являются одними из факторов, способствующих естественному отбору. Многие виды животных хорошо развиваются только тогда, когда объединяются в довольно большие группы. Жизнь в группе отражается на формировании многих физиологических процессов в организме животного посредством нервной и г ормональной систем [Шовен, 1970]. Оптимизация физиологических процессов, ведущая к повышению жизнеспособности особей при совместном существовании, и получила название «эффект группы». Эффект группы проявляется как нейрофизиологическая реакция отдельной особи на присутствие других особей своего вида. Высшее проявление этого эффекта у саранчовых — фазовая изменчивость — функционально связана с плотностью популяции и служит механизмом регуляции их численности. Взаимная стимуляция особей вызывает формирование стадной формы, которая характеризуется снижением плодовитости, сокращением смертности в ранних возрастах, увеличением скорости развития и повышением активности насекомых [Уваров, 1921]. При этом стоит отличать «эффект группы» от «эффекта массы», который скорее относится к демографии животных. «Эффект массы» возникает, когда на ограниченном пространстве при росте популяции появляется дефицит пищевых и других ресурсов. Эффект группы в таких условиях часто завуалирован. Высокая плотность населения, характерная для общественных насекомых, и, как следствие, частые контакты между особями значительно повышают риск заражения патогенами. Однако это не является фактором снижения устойчивости насекомых, напротив, создает некоторые преимущества для развития коллективного иммунитета [Hughes et al., 2002; Ugelvig, Cremer, 2007]. Существует некоторый уровень плотности населения, который меняется в силу экологических факторов: сезонные и многолетние изменения погоды, обилие кормов и их доступность, другие условия определяют изменчивость плотности, соответствующей критерию оптимальности. Все эти факторы, безусловно, оказывают действие на формирование устойчивости особей в локальной популяции [Barnes and Siva-Jothy, 2000].

Весьма интересным, но по-прежнему мало изученным аспектом является устойчивость таких насекомых к патогенам и паразитам в условиях высокой плотности популяций. Несомненно, что вероятность поражения особей в популяции паразитами и патогенами положительно коррелирует с плотностью населения [Anderson, May, 1981]. Было показано, что определенная численность особен в локальной популяции также влияет на повышение или снижение защитных функций индивидуумов при некотором скоплении особей [Колтунов и др., 1998; Wilson et al., 2002]. То есть, при прочих равных экологических факторах, определенная численность населения в популяциях, в частности у насекомых, может определять повышение или снижение иммунитета отдельных особей. Очевидно, что существуют механизмы, которые обеспечивают устойчивость особей и снижают риск увеличения энтомопатогенных заболеваний при определенной плотности населения. И здесь уже идет речь не об обмене сенсорными раздражителями или обмену веществ между насекомыми в группе, а о других формах проявления эффекта группы, которые способствуют тому, что физиологические процессы в организме отдельных насекомых под влиянием группы осуществляются в направлении, адаптивном для популяции в целом.

Изучение изменчивости особей в зависимости от характера их взаимодействия в группе создает основу для понимания механизмов, обеспечивающих целостность и эволюционное развитие природных популяций насекомых. Мраморный таракан (Nauphoeta cinerea, Oliv.) относится к тем видам необщественных насекомых, для выживания и развития которых необходима высокая плотность населения. Этот вид хорошо подходит как модельный объект для исследования влияния группового эффекта на биохимические составляющие иммунитета.

Цель работы - определить изменения биохимических показателей иммунитета и их характер в онтогенезе мраморного таракана под влиянием группового эффекта Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить влияние различий плотности населения мраморного таракана на выживаемость на насекомых.

2. Изучить активность ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем в гемолимфе и кишечнике мраморного таракана при различной плотности населения.

3. Определить влияние группового эффекта на изменения в активности защитных ферментов и гемагглютининов гемолимфы в онтогенезе мраморного таракана.

4. Изучить особенности изменений активности защитных ферментов в гемолимфе и кишечнике в условиях различной плотности населения насекомого при сублетальном воздействии модельного токсиканта битоксибациллина.

5. Определить влияние бактериального препарата па активность и углеводную специфичность гемагглютининов гемолимфы мраморного таракана в онтогенезе при различной плотности населения.

6. Провести анализ влияния группового эффекта на показатели клеточного иммунитета гемолимфы мраморного таракана в онтогенезе в норме и при действии бактериального препарата.

Научная новизна. На примере мраморного таракана выявлено, что оптимальная численность необщественных видов насекомых формирует «эффект группы», который повышает устойчивость особей к бактериальному препарату. Показана тесная взаимосвязь количества насекомых на единицу площади с формированием функциональной активности компонентов гуморальной защитной системы взрослых особей и нимф мраморного таракана. Отмечено, что как снижение плотности населения, так и повышение, снижает устойчивость особей к действию бактериального препарата. Выявлен характер изменения активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем в гемолимфе и кишечнике насекомых. Определены особенности состава клеток гемолимфы мраморного таракана, а также активные гемагглютшшны белков в условиях изоляции и перенаселения, как при формировании устойчивости, так и в процессе индивидуального развития.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть рекомендованы для Использования в практике сельского хозяйства при разведении полезных насекомых. Полученные результаты исследования можно использовать определения порога, определяющего устойчивость насекомых-вредителей к инсектицидам при наличии высокого потенциала роста численности. Выявленные различия в формировании устойчивости у особей, развивающихся в условиях различной плотности популяций, позволяет их использовать для разработки эффективных стратегий борьбы с насекомыми-вредителями, в том числе и с синантропным видами (тараканы, термиты). Использование полученных данных

5

возможно при разработке курсов подготовки профессиональных кадров в области защиты растений.

Апробация работы. Результаты работы представлены на следующих конференциях: Международная конференция «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранск, 2008); Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь, 2008); IV Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь, 2010); V Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2011); Международная научная конференция «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2011); VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей и тезисов, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 11 рисунков и 2 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 223 работ, из них 182 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Объект исследований. Тараканы вида Nauphoeta cinerea (Oliv.) для экспериментов были взяты из собственной лабораторной популяции насекомых. Исследования проводили на имаго и нимфах двух возрастов. В эксперимент отбирались синхронизированные по возрасту особи сразу после линьки. Насекомые содержались в чашках Петри (пластик, 100x20 мм) в количестве 1; 20 и 50 особей. При постановке экспериментов соблюдалось равенство физических условий. Во избежание возникновения повышенной влажности и дефицита кислорода дно чашки Петри покрывалось ежедневно заменяемой фильтровальной бумагой, вентиляция воздуха обеспечивалась перфорированием крышки.

Выживаемость имаго данный параметр контролировали на 7-е, 14-е и 30-е сутки, у нимф старшего возраста - после линьки на стадию имаго и далее по

6

предыдущей схеме. Измерения активности ферментов проводили в тканях кишечника и гемолимфе на 5-е сутки содержания тараканов в 6-ти биологических и 3-х аналитических повторностях. При одиночном содержании анализировали каждую из 20 особей. В качестве модели стресса для индукции защитных реакций у тараканов использовали битоксибацнллин (БТБ) в концентрации 2%. Сухие кусочки хлеба одного веса смачивали в суспензии битоксибациллина и давали тараканам. Контрольные насекомые получали хлеб смоченный водой.

Биохимические показатели. Выделение первичного гомогената проводили в трис-HCl экстрагирующем буфере (рН 7.5). Спектрофотометрическое измерение фенолоксидазной активности проводили по ЕЮ. Животенко и др. (1987), пероксидазной - по Бояркину (1951), каталазы по Королюк и др., (1988), оптическую плотность ферментативного образца измеряли на спектрофотометре Shimadzu. Активность дифенолоксидазы (ДФО) (о-дифенол: 02 оксидоредуктаза НФ 1.10.3.1) оценивали по скорости окисления L-дигидроксифенилаланина (L-ДОФА). Активность пероксидазы (донор: перекись водорода-оксидоредуктаза НФ 1.11.1.7) оценивали по скорости окисления бензидина. Активность каталазы (перекись водорода: перекись водорода-оксидоредуктаза ЕС 1.11.1.6) определяли по скорости разложения перекиси водорода, реакцию останавливали добавлением 4% раствора молибдата аммония. Удельную активность дифенолоксидазы и пероксидазы выражали в ед. акт./мин/мг белка, каталазы - в нМ/мин/мг белка. Концентрацию белка определяли по Бредфорду (Скоупс, 1985), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Титр и углеводную специфичность гемагглютишшов определяли по D. Stynen (1982). Клеточные препараты гемолимфы готовили фиксированием мазков 96%-ым этанолом и окрашиванием по методу Романовского-Гимзы (Кост, 1957). Типы форменных элементов гемолимфы определяли по классификации М.И. Сиротиной (1961).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием среднеарифметического значения, ошибки среднего, t-критерия Стыодента и коэффициента корреляции Пирсона с помощью программного обеспечения MS Excel 98 (Microsoft), а также пакета программы «Statistica for Windows» (версия 6.0). Достоверными считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние эффекта группы на активность ферментов защитных систем в гемолимфе мраморного таракана

Интегральным критерием оптимального содержания является выживаемость тараканов в условиях разной плотности населения (рис. 1). Как ожидалось, даже в условиях повышенной плотности тараканы оказались чрезвычайно жизнеспособными. Единично содержавшиеся нимфы развивались значительно дольше, а в условиях повышенной плотности завершали свое развитие до стадии имаго быстрее, что вполне соответствует понятию «эффекта группы» (Шовен, 1970). Выживаемость у имаго и нимф, содержавшихся по 20 особей на чашку Петри, была достоверно выше, что позволяет считать данное количество на единицу площади оптимальным.

Количество особей в чашке Петри, шт

Рисунок 1. Выживаемость особей мраморного таракана при одиночном и групповом содержании.

Имаго. Выявлено, что плотность населения оказывает значительное влияние на активность дифенолоксидазы (ДФО) гемолимфы имаго и на выживаемость особей (рис. 1, 2). Корреляция между этими двумя параметрами составляет 0,90 (!), что бесспорно указывает на важность ДФО, фермента входящего в состав фенолоксидазной системы, как фактора иммунитета насекомых [Nappí, Christensen, 2005; Гайфуллина и др., 2006; Eleftherianos, Revenís, 2011; Dubovskiy et al., 2013]. Можно отметить, что основные системы и органы насекомых - покровы, кишечник, а также гемолимфа - являются местом действия или (и) местом синтеза фенолоксидаз,

I I Имаго

□ CII

□ МП

что определяет участие данной ферментативной системы практически во многих защитных реакциях [АвМа, 1990; ТЪеороЫ е(. а!., 2004].

Количество особен в чашке Пезрн, шт

Рисунок 2. Активность дифенолоксидазы гемолимфы имаго при одиночном и

групповом содержании.

Можно полагать, что активность ДФО гемолимфы имаго при содержании по 20 насекомых является показателем оптимального состояния содержания насекомых в данных условиях, так как соответствует высокой выживаемости. Одиночное содержание приводит к снижению активности ДФО гемолимфы и связанным с этим снижением устойчивости и выживаемости.

В группе, где в чашке Петри содержались по 20 имаго, отмечен минимальный уровень активности каталазы гемолимфы (рис. 3).

Активные кислородные метаболиты (АКМ) принимают участие в реализации защитных механизмов, однако при избыточном уровне образования могут представлять угрозу для организма [Wiseman, Halliwell, 1996; Cabiscol et al 2000; Дубовский и др., 2010].

Возможно, низкий уровень активности каталазы гемолимфы связан с относительно низким уровнем АКМ в условиях предположительно оптимальной плотности населения. Изоляция и перенаселение приводят к повышению активности каталазы гемолимфы, вероятно, по причине повышения продукции АКМ.

Ми;Я,М а

Мыл».» CI

i so

Количество особен в чашке Петрн, шт

Рисунок 3. Активность каталазы гемолимфы имаго при одиночном и групповом содержании.

Нимфы. Известно, что ферменты фенолоксидазной системы играют важную роль не только в осуществлении защитных механизмов насекомых, но и в процессах развития [Cerenius et al., 2008; Eleñheríanos, Revenís, 2011].При изоляции нимф так же происходит снижение активности ДФО, но отличие заключается в прогрессивном возрастании активности фермента с ростом плотности населения (рис. 4). При этом выживаемость не коррелирует с активностью ДФО. Возможно, это связано с тем, что на личиночной стадии развития функциональность фенолоксидаз увеличивается.

А Б

8 « '«:

S s ■ И ti

в § "1

2 S «я

1 i J

1 i J

53

~n

S 2

g e «

ti:; e S

S- * 4

3 -

MoMÍ.« CI

X

'1L"

Meu.i®.« CI

Количество особрй в чашке Петри, шт

Количество особей в чашке Петри, шт

Рисунок 4. Активность ДФО гемолимфы старших (А) и младших (Б) нимф при одиночном и групповом содержании.

Выживаемость имаго, как правило, превышает выживаемость нимф, часто ранние онтогенетические стадии более восприимчивы к стрессам и негативным

воздействиям, что является распространённой в живой природе закономерностью [Гайфуллина е1 а1., 2004]. Нами выявлено, что при групповом содержании нимфы мраморного таракана достигают взрослой стадии быстрее, чем при изолированном содержании (рис. 5).

»а

К

i-' <4 к

s

5 1

|.

Рисунок 5. Сроки достижения взрослой стадии при одиночном и групповом содержании.

Данная закономерность у тараканов является одним из признаков проявления

эффекта группы [Шовен,1970]. Подобное наблюдалось у других видов тараканов

[Wharton et al., 1968; Woodhead, Paulson, 1983] и других насекомых [Bonner, Ford,

1972, Cotter et al., 2004]. При изоляции так же отмечалось снижение активности

фенолоксидаз, что объясняется их значимостью в процессах метаморфоза и

морфогенеза [Reeson et al., 1998; Wilson et al., 2001; Cotter et al., 2004]. Поскольку у

имаго процессы развития закончены, фенолоксидазная система выполняет большей

частью иммунную функцию, а также регуляторов уровня биогенных аминов, в

отличие от нимф, для которых феноЛоксидазы важны еще и как участники

морфогенеза и метаморфоза. Выживаемость младших нимф не различается

достоверно при содержании по 20 й 50 особей. Различия в активности ДФО

гемолимфы младших нимф наиболее выражены между насекомыми при

изолированном и групповом содержании, но не при содержании по 20 и 50 особей.

Возможно из-за более малых размеров, для младших нимф содержание по 20 и 50

особей не создаёт условий оптимальной плотности и их перенаселения как

соответственно для старших нимф и имаго. Поэтому нельзя с уверенностью сказать, в

каких условиях активность ДФО гемолимфы наиболее близка к физиологической

11

Условия содержания |0Д1Ш»'Ш0 □ по 20-30 особ«!

норме, однако становится ясно, что при изоляции насекомых активность этого фермента значительно ниже необходимой.

Активность каталазы гемолимфы нимф обоих возрастов наиболее высока при изолированном содержании и не отличается достоверно при групповом содержании по 20 и 50 особей (рис. 6).

А Б

в и £ г

ё| м

&• а

■в" -

S 8 Р.

2 £ н » я

О S * н

g- 2 » Ж

з s <5

а5 13

- CI

MtMtfg^S CI .

Количество особен в чашке Пепрк, шт Количество особей: в чашке Петри, шт

Рисунок б. Активность каталазы гемолимфы старших (А) и младших (Б) нимф

при одиночном и групповом содержании.

Предполагается, что высокий уровень активности каталазы свидетельствует о высоком уровне образования АКМ при стрессе, вызванном изолированным содержанием особей. Вместе с данными по выживаемости нимф уровень активности каталазы указывает на негативные последствия одиночного содержания.

Замедление индивидуального развития и угнетение иммунных реакций при изоляции, возможно, связаны с изменением гормонального фона [Wharton et al., 1968]. Так, например, при изоляции у ряда видов отмечался более высокий титр ювенильного гормона [Yagi, Kuramochi, 1976; Nijhout, Wheeler, 1982], который коррелировал с изменением активности фенолоксидаз [Khafagi, Hegazi 2001; Rolff, Siva-Jothy, 2002]. В то же время с ростом плотности населения у ряда видов отмечено повышение уровня экдистероидов [Tawfik et al., 1999], способных также стимулировать активность фенолоксидаз [Ahmed et al., 1999; Sorrentino et al., 2002]. Экдистероиды и ювенильный гормон являются регуляторами развития и метаморфоза насекомых, и поскольку плотность населения может влиять на гормональный фон, становится понятным ее значимое влияние не только на иммунитет, но и на процессы индивидуального развития.

Динамика активности ферментов защитных систем в онтогенезе мраморного таракана при бактериальном воздействии

Влияние условий содержания на активность ферментов фенолоксидазной и антиоксидантной систем отчетливо проявилось в течение первых двух суток при бактериальном воздействии согласно принятой нами модели стресса (рис. 7).

0,2

Время эксперимента, час

^ . одиночное содержание

содержание группами по 20 особей —»— содержание группами по 50 особей

Рисунок 7. Изменение активности ферментов защитных систем при действии БТБ у имаго мраморного таракана: А - ДФО кишечника, Б - ДФО гемолимфы, В - каталаза гемолимфы (данные приведены относительно контроля). Точки, в которых активность фермента достоверно отличается от контрольного значения, отмечены звёздочкой.

Полученные данные дают основания полагать, что имаго и старшие нимфы, содержавшиеся по 20 на чашку Петри, успешно нейтрализуют действие бактериального препарата на уровне органов пищеварения. В этой группе уже в первые часы после действия БТБ происходит рост активности ДФО кишечника, что связано с реализацией защитных реакций.

0.2

Время эксперимента, час

0.2

Время эксперимента, час

Картина изменений весьма схожа для имаго и старших нимф, поэтому оба графика не приводятся. Хотя имеются отличия, указывающие на более высокую устойчивость имаго - изменения активности ферментов у них происходят быстрее и быстрее возвращаются к значениям не превышающим контрольные.

При одиночном содержании тараканов активность ДФО кишечника повышается незначительно и ненадолго. Для всех трёх возрастов не отмечено значимого повышения активности ДФО гемолимфы при одиночном содержании.

Это можно объяснить тем, что одиночное содержание угнетает защитные реакции и вместо локализованного и эффективного ответа на бактериальное воздействие возникает острая генерализованная реакция. Активность ДФО кишечника в данном случае, когда заражение происходит через органы пищеварения, может служить показателем стресс-реакции [Раушенбах, 1997].

У всех возрастов наибольшая активность каталазы гемолимфы при действии бактериального препарата отмечена при содержании 50 особей на чашку Петри. В остальных случаях повышение не наблюдается или же оно не значительно. Возможно, действие БТБ вызывает образование АКМ, которое успешно утилизируется каталазой в условиях оптимальной плотности населения.

Некоторые отличия имеются при сравнении динамики изменений ДФО кишечника младших нимф со старшими нимфами и взрослыми особями.

Та же картина, что наблюдалась при содержании по 20 особей у имаго и старших нимф, у младших нимф наблюдается при содержании по 50 особей на чашку Петри. При содержании по 20 особей у младших нимф наблюдается повышение ДФО кишечника под действием БТБ, но после 4 часов от начала действия бактериального препарата (рис. 8).

Картина изменения активности каталазы гемолимфы в высшей степени похожа у младших нимф с таковой у старших нимф и имаго. Поскольку функциональная активность всех элементов антиоксидантной системы важна на всех стадиях онтогенеза насекомых. На основании этого можно сделать вывод, что оптимальная плотность населения для младших нимф лежит в пределах от 20 до 50 особей на чашку Петри.

• одиночное содержание ■ содержание группами по 20 особей - содержание группами по 50 особей

0,2 ■

Времяэксперпмеша, час

Рисунок 8. Изменение активности ДФО гемолимфы у младших нимф при действии БТБ (данные приведены относительно контроля). Точки, в которых активность фермента достоверно отличается от контрольного значения, отмечены звёздочкой.

Влияние эффекта группы на гемагглютининовуго активность и клеточную структуру гемолимфы мраморного таракана

Изменение титра гемагглютининов при одиночном и групповом содержании указывает на активацию защитных механизмов в стрессовых условиях - при изоляции и перенаселении. У имаго и нимф тигр гемагглютининов повышается при одиночном содержании, а так же при содержании по 50 на чашку Петри в сравнении с оптимальным количеством особей на единицу площади, при этом перенаселение вызывает меньшие изменения, чем изоляция (таблица 1).

Таблица 1

Изменение титра гемагглютининов (в -1о§р у имаго и нимф мраморного таракана при разной плотности населения в норме и при действии БТБ

Число имаго

1 20 50

Контроль БТБ Контроль БТБ Контроль БТБ

13 11 9 9 10 9

Число нимф

1 20 50

Контроль БТБ Контроль БТБ Контроль БТБ

11 8 8 8. 10 7

Так же важно отметить, что титр гемагглютининов не изменился при бактериальном воздействии только в условиях оптимальной на наш взгляд плотности. В остальных случаях действие БТБ вызывало его понижение, что может быть объяснено возможным попаданием бактериального токсина в гемолимфу с последующим его связыванием гемагглютининами, что приводит к снижению их титра. Эффективное устранение бактериального воздействия на уровне органов пищеварительной системы в условиях оптимальной плотности предотвращает распространение токсинов.

Исследование углеводной специфичности гемагглютининов показало наличие у имаго и нимф мраморного таракана, содержавшихся по 20 особей на чашку Петри, гемагглютининов специфичных к галактозе и лактозе (таблица 2).

Таблица 2.

Изменение углеводной специфичности гемагглютининов у имаго и нимф при разной

плотности населения в норме и при действии БТБ.

Имаго

Концентрация углевода 1 20 50

К БТБ К БТБ К БТБ

Галактоза мМ/л 31,25 15,6 7,8 7,8 0,97 3,9

Манноза мМ/л - - - - 15,6 —

Мальтоза мМ/л 125 62,5 - - - -

Лактоза мМ/л 15,6 15,6 3,9 3,9 1,95 3,9

ХОС % - 0,3125 - - - -

Нимфы

Концентрация углевода 1 20 50

К БТБ К БТБ К БТБ

Галактоза мМ/л 15,6 - 15,6 31,25 7,8 3,9

Манноза мМ/л - - - - - —

Мальтоза мМ/л - - - - - -

Лактоза мМ/л 15,6 62,5 1,95 15,6 7,8 3,9

ХОС % 0,3125 - - - — —

При изоляции и перенаселении были отмечены изменения в углеводной специфичности гемагтлютининов: гликопротеины, специфично взаимодействующие с хитоолигосахаридами, были обнаружены только при изолированном содержании. Наконец были отмечены онтогенетические различия, возникающие в условиях изоляции и перенаселения - у имаго в вышеуказанных случаях отмечались мальтозо-и маннозоспецифичные гликопротеины соответственно. Агглютинины гемолимфы насекомых способны специфически связываться с углеводными остатками гликопротеинов и гликолипидов клеточной поверхности микроорганизмов, участвуя в процессах распознавания и опсонизации не только чужеродных объектов, но и собственных разрушающихся тканей при метаморфозе [Оп1", ВгеЬеНв, 1989].

Таким образом, мы видим не только количественные, но и качественные изменения в защитных механизмах, возникающие при влиянии группового эффекта. Мобилизация защитных механизмов организма достигается активацией различных гемагтлютининов, а не просто изменением общего титра. Отдельные гемагглютшшрующис белки представлены только у имаго, а представленный как у имаго, так и у нимф ХОС-специфичный гемагглютинин, отмечен только при изолированном содержании особей.

Изменение состава защитных клеток гемолимфы при разной плотности населения в онтогенезе мраморного таракана

У мраморного таракана, как и у других насекомых, клеточные элементы гемолимфы (гемоциты) могут быть подразделены на две группы - фагоцитирующие и метаболические клетки.

Подавляющее большинство клеточных элементов гемолимфы составляют амебоидные фагоциты. Фагоциты способны образовав пару ложноножек на противоположных сторонах клетки переходить в активную «веретеновидную» форму.

Так же были определены метаболические клетки - эноцитоиды, сферулоциты. В единичных случаях были замечены предшественники гемоцитов — прогемоциты.

Отмечено, что действие БТБ вызвало патологические изменения в морфологии клеток гемолимфы мраморного таракана, наиболее выраженные при содержании

17

насекомых в условиях перенаселенности, такие как вакуолизация, фрагментация и лизис цитоплазмы гемоцитов, децентрализация и пикноз ядер, деформация клеток.

Изучение клеток гемолимфы так же показало изменения, возникающие при одиночном и групповом содержании, и при бактериальном воздействии (рис. 9А I).

А

1 20 50 1 20 50

Б

1 20 50 1 20 50

Ка.ос-«сс1ш>ск»6<й* «ш tlctpN.Hr Ка.ог-*гс|»<кавгЯ ■ ч«шыг Ипрм. ш«

[ I Контроль Щ БТБ

Рисунок 9. Клеточный состав гемолимфы мраморного таракана при одиночном и групповом содержании (количество клеток указано в доли от общего их числа). А - имаго, Б - старшие нимфы, В - младшие нимфы. I - веретеновидные фагоциты II - метаболические гемоциты.

18

Количественные изменения были оценены как изменение доли веретеновидных фагоцитов и метаболических клеток гемолимфы по отношению к общему числу гемоцитов. У имаго заметно повышение доли метаболических клеток гемолимфы при изолированном содержании и перенаселении (рис. 9А II). При этом достоверное повышение доли веретеновидных (активных) фагоцитов отмечено под действием БТБ у изолированных особей (рис. 9А I).

Очевидно, плотность населения способна существенно влиять на состояние защитных механизмов насекомых. Повышение количества метаболических гемоцитов было отмечено у американского таракана при действии Streptomyces griseus [Basseri, 2008]. Таким образом, есть основания полагать, что экстремальные условия плотности (изоляция и перенаселение) воспринимаются организмом подобно действию патогенных факторов.

Увеличение числа веретеновидных фагоцитов так же указывает на их активацию в условиях стресса [Lavine, 2002]. Однако появление веретеновидных фагоцитов в большей степени связано с действием БТБ, а не плотности населения. У старших нимф картина изменений весьма схожа с имаго (рис. 9Б). Некоторые отличия имеются в картине изменений, возникающих у младших нимф — различия соотношения клеточных элементов гемолимфы при содержании по 20 и 50 особей на чашку Петри незначительны и недостоверны (рис. 9В).

Таким образом, общей для всех трёх возрастов является, прежде всего, реакция изолированных особей. В целом как было отмечено, доля метаболических клеток изменяется, главным образом, под действием плотности населения, а переход фагоцитирующих гемоцитов в активную веретеновидную форму - под действием БТБ.

Заключение

Плотность населения оказывает существенное влияние на метаболизм и на активность защитных систем насекомых склонных к скоплению,' в том числе у мраморного таракана. Данные по выживаемости особей двух возрастов указывают на то, что плотность населения 20 особей на чашку Петри в представленных экспериментах наиболее близка к оптимальной. Изменение активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем, титра гемагглютининов и фагоцитарных

19

клеток может считаться косвенным доказательством стрессового состояния как особей содержащихся изолированно, так и подверженных перенаселению. У нимф изменения активности ферментов антиокислительной и фенолоксидазной систем в зависимости от плотности могут быть причиной не только изменения устойчивости, но и темпов индивидуального развития. Устойчивость имаго мраморного таракана выше, чем устойчивость нимф, что так же отмечено у многих видов и является распространённой закономерностью [Siva-Jothy et al, 2000; Wilson et al, 2002].

Уровень активности ДФО гемолимфы имаго и их выживаемость при разной плотности населения мраморного таракана отличаются высоким уровнем корреляции, что подтверждает важную роль фенолоксидаз в реализации защитных реакций насекомых. Так называемый «эффект группы» обуславливает изменения в активности клеточных и гуморальных защитных систем отдельно взятых организмов в популяции.

Выводы

1. Из исследованных в работе вариантов искусственной плотности населения мраморного таракана в качестве оптимальной можно считать 20 особей на 78,5 см2, при которой наблюдается самая высокая выживаемость насекомых как на стадии нимф, так и имаго.

2. Установлено, что перенаселение влияет на продолжительность онтогенеза нимф мраморного таракана, сокращая ее по сравнению с оптимальной плотностью населения, а также изоляцией.

3. Выявлено, что при воздействии битоксибациллина, как модели инфекционного стресса, плотность населения Nauphoeta cinerea (Oliv.) определяет выживаемость особей.

4. Изученные ферменты - дифенолоксидаза и каталаза гемолимфы и кишечника, а также геммаглютинины гемолимфы тараканов участвуют в биохимических механизмах, связанных с ответом насекомых на изменение плотности популяции. Общей закономерностью для всех стадий онтогенеза является прогрессивный рост активности дифенолоксидазы и снижение активности каталазы с ростом плотности населения.

5. При инфекционном стрессе с изменением плотности популяции наблюдается рост активности защитных ферментов дифенолоксидазы и каталазы, что является общим признаком для имаго и нимф старшего возраста, что сопровождается увеличением выживаемости.

6. Установлено влияние «эффекта группы» на активность и углеводную специфичность геммагтлютининов гемолимфы таракана. При изоляции или перенаселении насекомых на одной и той же стадии развития гемолимфа различается по углеводной специфичности присутствующих в ней агглютининов. У имаго проявление гемапглютининов со специфичностью к мальтозе и маннозе, наряду с другими биохимическими показателями, может свидетельствовать об отклонениях численности популяции насекомых от оптимальной.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в научных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК

1. Мурзагулов Г.С. Влияние группового эффекта на активность антиоксидантной и фенолоксндазной систем у нимф мраморного таракана / Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Вестник Оренбургского государственного университета. Оренбург. - 2009. - №6. - С.267-268.

2. Мурзагулов Г.С. Роль эффекта группы в формировании устойчивости у насекомых / Мурзагулов Г.С., Гайфуллина Л.Р., Салтыкова Е.С. // Вестник Оренбургского государственного университета. Оренбург. - 2011. - №12. -С.220-221.

3. Мурзагулов Г.С. Влияние плотности населения на ферментативную активность антиокислительной и фенолоксндазной систем имаго и нимф мраморного таракана Nauphoeta cinerea / Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С., Гайфуллина

Л.Р., Николенко А.Г. // Журнал Эволюционной биохимии и физиологии. -2013. — Т.49. -№1. - С.24-29.

4. Murzagulov O.S. The influence of population density on defense system state of lobster cockroach (Nauphoeta cinerea) nymphs / Murzagulov G.S., Saltykova E.S.,

Níkolenko A.G. // Resistant Pest Management Newsletter. - Fall 2010. - V.20. -N.l. - P.22-24.

Публикации в сборниках и материалах конференций

5. Мурзагулов Г.С. Влияние плотности населения нимф мраморного таракана

(Nauphoeta cinered) на активность некоторых окислительно-восстановительных ферментов / Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Ставрополь. - 2008 - №3. - С.117-119.

6. Мурзагулов Г.С. Изменение активности антиоксидантных ферментов при одиночном и групповом содержании Nauphoeta cinerea / Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Материалы международной конференции «Биология: теория, практика, эксперимент». Саранск. - 2008. - С. 197-198.

7. Мурзагулов Г.С. Коллективные защитные механизмы общественных и необщественных насекомых / Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С., Николенко А.Г. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Ставрополь. - 2008 - №6. - С.80-82.

8. Мурзагулов Г.С. Роль группового иммунитета в формировании устойчивости насекомых / Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С. // «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке». Материалы международной научной конференции. Санкт-Петербург. - 2011. - С.29.

9. Мурзагулов Г.С. Модуляция хитозаном экспрессии гена дефензина у медоносной пчелы / Назмиев Б.К., Мурзагулов Г.С., Салтыкова Е.С., Поскряков А.В., Николенко А.Г. // Материалы VI Российского симпозиума "Белки и пептиды". Уфа.-2013. -С.156.

Подписано в печать 22.11.2013 г. Усл.-печ. л. 1,40. Заказ 131. Тираж 100 экз. Формат бумаги 60х841/1б. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Гарнитура «Тайме»

Отпечатано с предоставленных файлов в ИП «Фатиев И.В.»: 450001, РБ, г. Уфа, ул. Левченко, 8

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мурзагулов, Григорий Сергеевич, Уфа

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук

на правах рукописи

04201453295 ^

Мурзагулов Григорий Сергеевич

БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ОДИНОЧНОМ И ГРУППОВОМ СОДЕРЖАНИИ

N АИР НОЕТ А СШЕЯЕА

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. Е.С. Салтыкова

УФА-2013

Содержание

Стр.

Содержание 2

Список сокращений 5

Введение 6

Глава 1. Влияние плотности населения на устойчивость насекомых (литературный обзор) 10

1.1. Устойчивость насекомых необщественных видов при одиночном и групповом содержании 10

1.2. Фенотипический полиморфизм у насекомых при разной плотности населения 12

1.3. Гормональная регуляция устойчивости необщественных насекомых в условиях высокой плотности населения 15

1.4. Биохимические механизмы адаптации насекомых 19

1.4.1. Антиоксидантная система в защитных реакциях насекомых 20

1.4.2. Фенолоксидазная система и её роль в иммунитете насекомых 23

1.4.3. Лектины и их роль в иммунитете насекомых

1.4.4. Клеточные элементы гемолимфы в защитных реакциях насекомых

1.5. Социальный иммунитет общественных насекомых

1.5.1. Антимикробные пептиды общественных насекомых

1.5.2. Поведенческие защитные реакции общественных насекомых

1.5.3. Передача приобретенного иммунитета у общественных насекомых

Глава 2. Объекты и методы исследований

2.1. Характеристика биологических объектов исследований

2.2. Условия содержания и бактериального воздействия на объект

27

28

30

31 33

36

38

38

исследования

2.2.1. Бактериальный препарат 40

2.2.2. Схема эксперимента 41

2.3. Определение ферментативной активности 43

2.4. Определение агглютинирующей активности гемолимфы 44

2.4.1. Получение гемолимфы 44

2.4.2. Определения агглютинирующей активности гемолимфы 44

2.4.3. Определения углеводной специфичности гемагглютининов 45

2.5. Приготовления препаратов гемолимфы 46

2.6. Статистический анализ 46 Глава 3. Результаты и обсуждения 47

3.1. Влияние эффекта группы на активность ферментов защитных 47 систем в гемолимфе мраморного таракана

3.1.1. Активность ферментов в гемолимфе имаго при одиночном и 48 групповом содержании

3.1.2. Активность ферментов в гемолимфе старших нимф при 54 одиночном и групповом содержании

3.1.3. Активность ферментов в гемолимфе младших нимф при 59 одиночном и групповом содержании

3.2. Изменение активности ферментов защитных систем в онтогенезе 63 мраморного таракана при бактериальном воздействии

3.2.1. Изменение активности ферментов защитных систем у имаго 64 мраморного таракана при бактериальном воздействии

3.2.2. Изменение активности ферментов защитных систем при 71 бактериальном воздействии у старших нимф мраморного таракана

3.2.3. Изменение активности ферментов защитных систем при 75 бактериальном воздействии у младших нимф мраморного таракана

3.3. Влияние эффекта группы на гемагглюгининовую активность и 80 клеточную структуру гемолимфы мраморного таракана

3.3.1. Изменение титра и углеводной специфичности гемагглютининов 81 при разной плотности населения в онтогенезе мраморного таракана

3.3.2. Изменение клеточных защитных механизмов гемолимфы при 84 разной плотности населения в онтогенезе мраморного таракана Заключение 90 Выводы 92 Список литературы 94

Список сокращений

АКМ - активные кислородные метаболиты

АМП - антимикробные пептиды

АОС - аптиоксидантная система

БТБ - битоксибациллин

ДФО - дифенолоксидаза

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ПроФО - профенолоксидаза

ФО - фенолоксидаза

ФОС - фенолоксидазная система

ХОС - хитоолигосахариды

Введение

Способность насекомых быстро приспосабливаться к изменениям окружающей среды не вызывает сомнений. Простое, но надежное строение их организма обеспечивает большой запас прочности. Быстрая смена поколений, плодовитость многих видов, являются одними из факторов, способствующих естественному отбору. Многие виды животных хорошо развиваются только тогда, когда объединяются в довольно большие группы. Жизнь в группе отражается на формировании многих физиологических процессов в организме животного посредством нервной и гормональной систем [Шовен, 1970]. Оптимизация физиологических процессов, ведущая к повышению жизнеспособности особей при совместном существовании, и получила название «эффект группы». Эффект группы проявляется как нейрофизиологическая реакция отдельной особи на присутствие других особей своего вида. Высшее проявление этого эффекта у саранчовых — фазовая изменчивость — функционально связана с плотностью популяции и служит механизмом регуляции их численности. Взаимная стимуляция особей вызывает формирование стадной формы, которая характеризуется снижением плодовитости, сокращением смертности в ранних возрастах, увеличением скорости развития и повышением активности насекомых [Уваров, 1921]. При этом стоит отличать «эффект группы» от «эффекта массы», который скорее относится к демографии животных. «Эффект массы» возникает, когда на ограниченном пространстве при росте популяции появляется дефицит пищевых и других ресурсов. Эффект группы в таких условиях часто завуалирован. Высокая плотность населения, характерная для общественных насекомых, и, как следствие, частые контакты между особями значительно повышают риск заражения патогенами. Однако это не является фактором снижения устойчивости насекомых, напротив, создает некоторые преимущества для развития коллективного иммунитета [Hughes et al., 2002;

Ugelvig, Cremer, 2007]. Существует некоторый уровень плотности населения, который меняется в силу экологических факторов: сезонные и многолетние изменения погоды, обилие кормов и их доступность, другие условия определяют изменчивость плотности, соответствующей критерию оптимальности. Все эти факторы, безусловно, оказывают действие на формирование устойчивости особей в локальной популяции [Barnes and Siva-Jothy, 2000].

Весьма интересным, но по-прежнему мало изученным аспектом является устойчивость таких насекомых к патогенам и паразитам в условиях высокой плотности популяций. Несомненно, что вероятность поражения особей в популяции паразитами и патогенами положительно коррелирует с плотностью населения [Anderson, May, 1981]. Было показано, что определенная численность особей в локальной популяции также влияет на повышение или снижение защитных функций индивидуумов при некотором скоплении особей [Колтунов и др., 1998; Wilson et al., 2002]. То есть, при прочих равных экологических факторах, определенная численность населения в популяциях, в частности у насекомых, может определять повышение или снижение иммунитета отдельных особей. Очевидно, что существуют механизмы, которые обеспечивают устойчивость особей и снижают риск увеличения энтомопатогенных заболеваний при определенной плотности населения. И здесь уже идет речь не об обмене сенсорными раздражителями или обмену веществ между насекомыми в группе, а о других формах проявления эффекта группы, которые способствуют тому, что физиологические процессы в организме отдельных насекомых под влиянием группы осуществляются в направлении, адаптивном для популяции в целом.

Изучение изменчивости особей в зависимости от характера их взаимодействия в группе создает основу для понимания механизмов, обеспечивающих целостность и эволюционное развитие природных

популяций насекомых. Мраморный таракан {Nauphoeta cinerea, Oliv.) относится к тем видам необщественных насекомых, для выживания и развития которых необходима высокая плотность населения. Этот вид хорошо подходит как модельный объект для исследования влияния группового эффекта на биохимические составляющие иммунитета.

Цель работы - определить изменения биохимических показателей иммунитета и их характер в онтогенезе мраморного таракана под влиянием группового эффекта.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить влияние различий плотности населения мраморного таракана на выживаемость на насекомых.

2. Изучить активность ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем в гемолимфе и кишечнике мраморного таракана при различной плотности населения.

3. Определить влияние группового эффекта на изменения в активности защитных ферментов и гемагглютининов гемолимфы в онтогенезе мраморного таракана.

4. Изучить особенности изменений активности защитных ферментов в гемолимфе и кишечнике в условиях различной плотности населения насекомого при сублетальном воздействии модельного токсиканта битоксибациллина.

5. Определить влияние бактериального препарата на активность и углеводную специфичность гемагглютининов гемолимфы мраморного таракана в онтогенезе при различной плотности населения.

6. Провести анализ влияния группового эффекта на показатели клеточного иммунитета гемолимфы мраморного таракана в онтогенезе в норме и при действии бактериального препарата.

Научная новизна. На примере мраморного таракана выявлено, что оптимальная численность необщественных видов насекомых формирует «эффект группы», который повышает устойчивость особей к бактериальному препарату. Показана тесная взаимосвязь количества насекомых на единицу площади с формированием функциональной активности компонентов гуморальной защитной системы взрослых особей и нимф мраморного таракана. Отмечено, что как снижение плотности населения, так и повышение, снижает устойчивость особей к действию бактериального препарата. Выявлен характер изменения активности ферментов антиоксидантной и фенолоксидазной систем в гемолимфе и кишечнике насекомых. Определены особенности состава клеток гемолимфы мраморного таракана, а также активные гемагглюгинины белков в условиях изоляции и перенаселения, как при формировании устойчивости, так и в процессе индивидуального развития.

Научно-практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть рекомендованы для использования в практике сельского хозяйства при разведении полезных насекомых. Полученные результаты исследования можно использовать определения порога, определяющего устойчивость насекомых-вредителей к инсектицидам при наличии высокого потенциала роста численности. Выявленные различия в формировании устойчивости у особей, развивающихся в условиях различной плотности популяций, позволяет их использовать для разработки эффективных стратегий борьбы с насекомыми-вредителями, в том числе и с синантропным видами (тараканы, термиты). Использование полученных данных возможно при разработке курсов подготовки профессиональных кадров в области защиты растений.

Глава 1. Влияние плотности населения на устойчивость насекомых (литературный обзор)

1.1. Устойчивость насекомых необщественных видов при одиночном и групповом содержании

В настоящее время известно немало примеров повышения индивидуальной устойчивости особей необщественных насекомых в условиях высокой плотности популяции. Многие виды животных живут и нормально развиваются, когда объединяются в большие группы. Жизнь в группе через нервную и гормональную системы отражается на многих физиологических процессах в организме животного. Наблюдается тесное общение особей посредством запахов, звуков, специфики поведения. Благодаря сложной системе сигнализации у особей и их взаимному обмену информацией возрастает эффективность функционирования группы, направленная на удовлетворение важных жизненных потребностей всех ее членов.

Оптимизация физиологических процессов, ведущая к повышению жизнеспособности при совместном существовании, и получила название «эффект группы» [Пшопеп, 2000]. Эффект группы проявляется как нейрофизиологическая реакция отдельной особи на присутствие других особей своего вида. Однако эффект группы проявляется только тогда, когда количество особей в группе не превышает некоторую критическую величину, характерную для каждого вида. При превышении критической величины численности особей в силу вступает механизм ее регулирования.

Было показано, что нимфы и взрослые особи тлей Megoura у1с1ае при высокой плотности населения выживают лучше по сравнению с содержавшимися изолированно или при низкой плотности населения

[Bonner, Ford, 1972]. Kunimi и Yamada содержали личинок моли Mythimma separata одиночно и по двадцать особей на контейнер. Насекомых заражали вирусом NPV через скармливание. Было отмечено, что средняя смертность одиночных особей составляла 9 5%, а для ли чинок, содержавшихся п о 20 штук, - 37% [Kunimi, Yamada, 1990]. Значительным снижением устойчивости к вирусу NPV отличались содержавшиеся изолированно личинки капустной совки Mamestra brassicae, в отличие от личинок, содержавшихся группами от трех до десяти особей [Goulson, Cory, 1995]. Аналогичные результаты получены при исследовании устойчивости личинок Spodoptera exempta тому же патогену [Reeson et al., 1998].

Устойчивость мучного хрущ a Tenebrio molitor и саранчи Schistocerca gregaria к действию энтомопатогенного грибка M. anipsolidae значительно выше при высокой плотности населения [Barnes, Siva-Jothy, 2000; Wilson et al., 2002]. Более высокая выживаемость и устойчивость к патогенам при содержании в условиях высокой плотности населения отмечена и для личинок чешуекрылого Spodoptera littoralis [Cotter et al., 2004].

Помимо повышения устойчивости к патогенам в условиях высокой плотности были отмечены и другие изменения. Во многих случаях развитие насекомых при высокой плотности протекает быстрее, чем при низкой или при одиночном содержании, например, у тли Megoura viciae [Bonner, Ford, 1972], тараканов Diploptera punctata [Woodhead, Paulson, 1983] и Periplaneta americana, [Wharton et al., 1968] и совки Spodoptera littoralis [Cotter et al., 2004].

Повышение активности фенолоксидаз у насекомых и ускорение развития, как правило, взаимосвязаны. При росте и развитии насекомых происходят последовательные линьки, а меланизация и склеротизация вновь образующихся покровов происходят в процессе меланогенеза, участником которого являются фенолоксидазы [Cerenius et al.,2008; Eleftherianos, Revenis,

2011]. Так же отмечены и другие отличия особей одного вида содержавшихся в условиях высокой и низкой плотности населения. Во-многих случаях отмечалась меланизация особей в условиях высокой плотности, например у личинок чешуекрылых Mythimma separata, Spodoptera exempta и Spodoptera littoralis, а так же у мучного хруща Tenebrio molitor [Mitsui, Kumini, 1988; Barnes, Siva-Jothy, 2000; Wilson et al., 2001].

В данных экспериментах отчетливо прослеживается действие плотности населения на такой фактор биохимической устойчивости как фенолоксидазная система. Повышенная меланизация также связана с тем, что высокая плотность населения приводит к повышению активности фенолоксидаз, необходимых для повышения устойчивости и ускорения индивидуального развития.

1.2. Фенотипичсский полиморфизм у насекомых при разной плотности населения

Изменения фенотипа, в том числе повышение устойчивости к патогенам и ускорение индивидуального развития в условиях высокой плотности населения объясняет теория Density-Dependent Prophylaxis (русскоязычного эквивалента этого названия пока не существует), далее по тексту DDP. Особая роль в исследованиях влияния плотности населения на защитные механизмы необщественных насекомых принадлежит Кеннету Уилсону (Kenneth Wilson) из Ланкастерского Университета и его коллегам [Wilson, Reeson, 1998; Cotter et al., 2004; Wilson, Cotter, 2009].

Теория DDP основана на трёх предположениях:

1. Как правило, вероятность поражения паразитами и патогенами обнаруживает положительную корреляцию с плотностью популяции.

Возникновение разных фенотипов в условиях разной плотности населения носит название зависимого от плотности полифенизма («Density-dependent polyphenism» в англоязычной литературе). Это явление отмечено у многих видов насекомых, относящихся к таким отрядам как Чешуекрылые, Палочники, Прямокрылые, Жесткокрылые, Полужескокрылые и др. Полифенизм как правило подразумевает наличие двух фенотипов -одиночного или адаптированного к низкой плотности населения и стайного или адаптированного к высокой плотности населения. У саранчи S. gregaria это зелёная и жёлто-чёрная формы соответственно [Uvarov, 1966; Iwao, 1968; Applcbaum, 1999].

Возникновение «стайного» фенотипа интересно не только как пример модификационной изменчивости, но и с практической точки зрения. Многие необщественные насекомые, популяции которых характеризуются высокой плотностью, имеют большое практическое значение (саранча, личинки чешуекрылых, тараканы). Подробные исследования различных стимулов в изменении фенотипа показали, что наибольший эффект на нимф саранчи производит тактильная чувствительность, а визуальное и обонятельное восприятие оказывает сравнительно слабое влияние [Roessingh et al.,1998].

Исследования перехода между фенотипами низкой и высокой плотности популяции у чешуекрылых показали, что для них также важнейшим стимулом является тактильное восприятие [Sasakawa, 1973; Kazimirov, 1992; Gunn, 1998]. Как было указа�