Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бета-амилаза бацилл и характеристика нового продуцента

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Бета-амилаза бацилл и характеристика нового продуцента"

НАЦИОНАЛЬНАЯ AK АНЕМИЯ НАУК АР ПЕНИИ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

РГ6 ОД

3 He правах рукопиов

ГАСПАРНН Ануа Вэзгвновва

БЕТА-АШВ1А8А БАЦИЛЛ И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО ЯРСДУЦЕЭТА

Специальность 03.00.23 - Биогэхяоаогвя

АВТ0РЕ9ВРАТ •

дисоартации не Ьояонэнив ученой с*еп»ни кандидата биологических наук

Абовяв - 1994-

Работе вилолноне в Институте микробиологии HAH Армении.

Неучние руководители: академик HAH Армении, доктор

биологических неукпрофессор

Э.Г.АФРШШ кандидат биологических наук ¿.А.АШйН

Официвяьнйв оппоненты: таен-корреслондент HAH Армении,

докгор биологических наук, профессор и.а.ДА£Ш

кандидат биологических кэук

Д.С.ЫАРКОСЯН

Ведущая организация: Ереванский государственный университет,биологический факультет, кафедра анатомии и физиологии растений.

Защита диссертации состоится "dO"U/a(A, 1994 г. в d^k:• чесов на заседании специализированного Совета К 005.00.01 в Институте микробиологии HAH Армении по адресу: Ъ7оШ$7Республике Армения, тАш^У'&рсйщъкоп yiocsc.QfzA^tci-t-cU/ Stoö-U-ayk. Н-А-Н ил^бссс^.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

микробиологии.

Автореферат "разослан " 199k г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических неук

Л.АЛШАЬйй

СШАЯ ХАРАКТЕРliUTilKÄ РАБОТЫ

Актуальность. Аыилолитичесние ферменты1 микроорганизмов аиро-ко используются в переработке крахмалистого сырья, производстве оахаристых продуктов, подсластителей и разнообразных биологичео-ки активных вецеств. 08 последние 30 лет„ прошадлеа со времена первых сообщений об обнаружении f -аиилаз микробного проио-ховдения, выделены и описаны многие штаммы бактерий, актиноии-цэтов и других микроорганизмов, продуцврущих этот фермент (Решал с соавт., 1981; Глемад с соавт., 1985; Фогарти, 1986; ?о-garty , Kelly ,1979; Ytmmmeto , 1988 ). На основе использования высокоактивных штаммов-продуцентов /-амилазы в ряде стрэн организовано ее проиыаленноа производство, а вырабатываемые препараты успешно применяются в крахмало-паточной, кондитерской и других отраслях пищевой промышленности, в получении мальтозы и других продуктов.

Вместе с тем, многие вопросы изучения я использования j-аил-лаз микробного происхождения проработаны а недостаточной мере. Ке проведено систематических исследований характеристика этого ферменте и его особенностей у различных хороао идентифицированных видов микроорганизмов, в .частности их зкстремо^ильных £ори. В равной степени слабо изучены вопросы получения комплексных препаратов /-аиилаз с другими ферментами, в особенности целенаправленного выделения продуцентов J~ и других амилаз. Не vro-нее важным является изучение и применение а^ктивных иммобилизованных систем микробных /-амилаз, в особенности о другими ферментами, например, аз аыилолигического комплекса,, трансфера-заыи при получении олигосехеридов, подслэогителей и других продуктов.

^ели и задачи. Основными целями работы являлась изучение биосинтеза f-аиилаз аэробными спорообразуювдка бэктариямй, о выделением активного продуцента ферменте, его характеристикой и перспективой практического применения.

В работе были поставлены следующие задачи: -изучить амилилигический комплекс бацилл; -изучить распространение ß -амилаз у различных видов опорообразуюдих бактерий и выделить активные ее продуценты;

- исоледоввть услозия биосинтезе /-8милазы активных про-

к -

дуцевтов;

- выделить а охарактеризовать свойства /-амилазы;

- подучить и испытать иммобилизованную §> -амилазу для до-лучения иадьтозы в проточных условиях.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование распространения -амилазы у хорошо идентифицированных культур разных видов аэробных опорообрэзущих бактерий и их экстренофильных форы. Охарактеризованы наиболее перспективные виды и выделены активные продуценты этого фермента, исследованы и оптимизированы условия биосинтеза f -амилазы у ее активного продуценте В*с111ив ро1утухв ат. И1ША-1518. Выделен, очицен и изучены свойства фермента продуцируемого этим штаммом, выявлены отличительные особенности /-амилаз, продуцируемых разными видами бацилл и установлено, что амилолитический комплекс культур сдорообразующих бактерий характеризуется определенной видовой специфичностью.

Исследована и охарактеризована циклоденстрин гликозилтранс-ферезз экстреаофиаьвых форы спорообразуюцих бактерий.

11рактическ8й ценность. Выделен активный продуцент -амилазы в.ро1уиуха ат. кйША-1518, выявлены условия биосинтеза и', получения ферментного препарате.

Разработан эффективный метод получения мальтозы в проточных условиях с применением иммобилизованной /-аиилазы.

Охарактеризованы перспективные итаыыы экстремофильных форм бацилл для.получения циклодекстринов.

Апробация работы. Результаты работа долокэна на Ш Всесоюзной конференции "Биосинтез' ферментов микроорганизмами" (Кобулети, апрель 21-23, 1986 г.), не 1У Всесоюзной конференции: "Биосинтез ферментов микрооргвнизие'ии" (Ташкент, 19-22 сентября, 1988 г.).

Публикации. Основное ре.зульта-гы исследований изложены в б публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзоре литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 176. страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 таблицами и 36 рисунками. Цитированная литература включает 207 наименований.

- ь -

Обзор литературы обобщает современное состояние вопроса о получении, свояствэх и практической применение ß -вимввы. Опясэха особенности известных культур - продуцентов фермента, метода их получения и использования, в той числе иммобилизованных фор«.

.jATEPîIAjI il iiETWJ ИССЛЕДОВАИМ

объектами исследований являлись хороао идентифицированные ^T3uwiJ разных видов аэробных спорообразуюаих бактерии из кол-яекци;; культур лабораторий сгюрообрэзующих бвктериЯ Института микробиологии HAH Армении. Она были представлены следующими видами: 23 итамма Bacillus polyrayx« , 2 - Bacillus aaoeraant II - Bacillus cçreus , 2 - Bacillus myxoides « ^9 - Bacll -lus thurlaslenels , I - Bacillus ."ubtllle , 13 - Eacillue эр. , i* термофильных и 10 элкало^ильних культур бацилл.

3 качестве наиболее активного продуцента /-амилазы отобран штамм Bacillus polynyia .Ш11А-1518.

Для вырацивания иоследуеыах культур использовали следующие среды. Для мезофильаых культур - среду CP-I (г/д):крзхмал~ [0,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0. Для термофильных (ультур среду СР-2 (г/я): крахмэя - 10,0; пептон - 5,0; нуку-}узный экстракт - 5,0;NaCi - 5,0; CaCOj - 5,0, а также среду ÎP-3 (г/л): крахмал - 7,0; кукурузный экстракт - 5,0; mi^HOj -

; СаС03 - 2,0. Для алкалофилытых культур - среду - СР-4 г/л): крахмал - 10,0; лептов - 5,0; дронаевой экстракт - 5,0; :нгГ0д - 1,0; MgSO^.ÇHjO - 0,2; aoci - 5,0 . Щелочную реакцию :рэды - добавлением ка2со3 .

Для изучения условий синтеза амилаз, особенно / -вмилваа, ¡спольэоввли следующие среды. Среде СР-5 (г/л): крахмал - 20,0; ептоя - 10,0; нукурузвый экстракт - 10,0; яасх - 5,0. Среде Р-6 (г/л): крэхиал - 10,0; попгон - 10,0; ксг - 1,0; KgCl2 . Н20 - 0,2; KaHjPCJj - 5,n*2hpo4 - 7,0; caci2 . 2Н2о -,25; PeS04 , 7Н20 - 0,005; MnS04 . 5Н20 - 0,01. СрвДЭ СР-7 г/л): крахмал - 10,0; дрозхевоа экстракт - 5,0; (nh4)3so4 -,ü; KgS04 . 5Н20 - 0,5; КК2Р04 - 5,0; СаС12 . гн2о -"0,132.

Среды инокулировэли односуточными культурами, выращенными э соответствующих згэризовэнных ила аадких средах в количеот-е Гг/i по объему.

Культивирование мезо^ильных или адкалофидьных культур прово дили в колбах йрленмайэра викостью 25Ü ил содвркацих 30 ил оре ды, на круговых качалках (200 оо/мин) при 30° в течение 60 ча> в термофильных - при 56° - 18 часов.

Биомессу отделили центрифугированием при 6UüO-IOüOOg в тачание 20 мин и высушивали при 80° до постоянной массы. В суперпатенте куд'ыуральной жидкости (ит) анализировали амилааную активность, редуцирующие вэцества (рв), рН.

Концентрированно кх, s также получение мальтозы проводили на ультрафильтрационной установке УШ-0,6 на полых волокнах типа АР-0,2 с размерами пор пролускаю4Их веаеотва с молекулярной массой 15 кДа.

Для получения большого количества кк о целью выделения j -эмилазы, культуру B.polymyx* вырацивали глубинный способом в ферментере AHKÍ1Í-2Í в течение 48 часов с аэрацией 1:1 об.воздуха/об. кк в мин со скоростью вращения мешалки 5С0 об/ыин при том пературе 30-32°.

Об осохаривавдей активности судили по образованию в результате ферментативной реакции редуцирующих вецеств , которые опре дзляди по методу шомоди •• Нельсона ( Sonogyi ♦ 1952; Neieon , 1944). . .

За единицу освхариааюцвй активноетв принимали количество, фермента, которое катализирует образование из Ш растворимого крахмале I ыг глюкозы за I час.

Определение о( -выипазной, или декстринирующей активности проводили методом Рухлядевой (Рухлядева, йолыгалина, 1981).

За единицу активности принимали количество (¿ермента, катализирующее расщепление I .г растворимого крахмала со отепенью его гидролиза 30^ зэ lo иии.

Определение циклодекстрин гликозилгрансферазной активнооти проводили колориметрическим методом-( н*1е , RowIíde . , 1952). За единицу трансферазной активности принимали количество фермента, которое за 10 мин конвертирует 50% крахмале.

Определение f -аиилавкой активности проводили по модифицированному нами методу Бернфельде ( Bernfelü , 1955.). Зз единицу активности принимали количество фермента, которое за I-мин при рН 7,0 и 30° обеспечивало образование в продуктах гидролиза 1 мкыоля мальтозы. Удельную активность выражали в единицах

штивности на I мг балке (мкмоль мальтозы /ыин/мг белке).

Продукты гидролиза крахмала в рээкционной смеси определяли 1втодом тонкослойной и бумажной хроматографии. Диклодекотрины ЦД) определяли также методом микросколирозения, окрашивая йод-гым раствором (Tilden .Hudnon , I94¿). Мальтозу идентифицирова-;и с помощью высокоэффективной шдкоотной хроматографии на upa-Sope ÜPP-4U0I (Чехословакаин).

Определение белка проводили по методу Jioypa (Lowry et al., :95I). •

Гомогенность J -амилазы опраделяли гедь-элентрофорезои а ',5/Î-hou полиакрилемндном геле аа прибора щирмы Рваная (Венгрия) Devis , 1964).

иолекулярнуо массу j -аыилэзы определяла h«-ds - злвкт-Ю'форезои, в текке галь-филирацкея нэ Superóse 12 HR ( Laenali, 1970).

Колнчественяыа и качеотвешшл состав аминокислот f -энилэ-IM определяли иа анализаторе аминокислот ААА-339 »¿>нрмы "Микро-ехна" (Чехословакия).

»^мобилизации ß -амилозы осуществляла нозадентныы свлзывз-[ием ферменте не силохроае С-вО, предварительно обработанном эии8-оуинопропнлтриэгонсаоилзвои и глутароаым аяьдегадои. Ак-иввосгь иммобилизованной /-аыалааы рзосчятывада ао холачэогзу бразовавиейся мальтозы в акаодлх нэ I г носителя з тачание часа.

Полученные данные обработаны статастзчвонв обцопрааятыаа етодами (Ашаарин, Воробьев, 1962).

РКЗИЫАТУ ЙССЗДОВШЗ .

Характеристика эаааоаатячеояах саоЗота сдорообээзуааах актарий. Распроирэпаиае гаадаа у 'разных ззДоз бацилл изучено е материале 125 итенаов. Установлено, что яспытаяные яулыту-ы разных групп и видов бзцаял характеризуйся выраженными милслитаческаыи свойствами, за вокдюченавн зтаиаов нового зи-а бацилл (Bacillus яр. ). (таба.1).

Таблица I

Амилолитическея активность культур разных видов бацилл

Виды и группы бактерий Всего испытано ПРОДУЦИРУЙ! амилазы

всего в т.ч. активных

В.eubtille I I I

B.aycoldes 2 ¿ 2

В.сегеив II II 6

B.polyayxa 23 23 13

B.tburinglensis ,

(серотапы - 19) 49 49 48

B.macerans г 2 I

Becllluo ер. 13 0 0

Термофильные бациллы 4 4 4

Алкало^идьные бациллы ю 10 I

У всех изученных кулмур обадя аиилолитическвя активность ' характеризовалась декстринируюш.ей, или с< -амилазной и осаха-ривэючей активностями. Внутри отдельных разновидностей в.-ььц-rinsiensis обнэруаиваются обэ активности, наиболее ярко проявляется oi -аиияазнвя активность. Сильной аыилаэной активное« 0бЛЭД8Ю2 кулыури. разновидностей thuringienalB , caucasicus -darmstadleneia , eotto-dendrollnus , gallería . близко родственные B.thuringlencis btsuuu b.nycoldes и в. сегеаз характеризуются слвбой декстринирующей и сильной осахаривающеи активностями. Преобладающей освхэризэщея активностью характеризуются культуры в. poiyroyxe . Наиболее выраженной эыилезной активностью выделяется культура в.- eubtiiie . Кулиураи экстремальных форм бацилл - термофильным и алкадофильным штаммам также свойственны эти ферментативные активности.

Исследования по характеристике конечных продуктов ферыен-сативного гидролизе крехизла, выявляют наличие определенной . специфики амилаз у изученных видов бацилл.

у штаммов в. poiymyxaсреди продуктов гидролиза крахмала' обнаружена только мальтоза, у шхаммов.В. сегеив и В. nycoidea-

мальтоза и следы других олигосахаридов, что свидетельствует о наличии /-амилазы, продуцируемой испытанными отйммоми. У культур в, 1Ьиг1пй1епв1в среди продуктов гидролиза крахмале накапливается мальтоза, глюкоза и некоторые олигооахэриды» чем моашо предположить, что крьтуры данного вида облэдзют комплексом ами-лэз, обусловливающих разнородность конечных, продуктов. в.

еимшв в результате гидролиза крэхмала образует только гаю-нозу. У штаммов термофильных и элкалофильноя культур среди конечных продуктов гидролизэ крахмала выявляются иередуцирующие веществе - циклические олигосахзриди или циклодекстрины. Зто свидетельствует о продуцировании фериеата цаклодекстрив глико-зилтронсфоразы.

Среди представителей в. ро1угоуха яэиболее ярко выреаднной / -аиилаэной активностью обладает атэим ИН1Ш-1518.

Амилолитическа:', комплекс культур эктомопэтогэнных бацилл, ¿нтомопатогенные культуры в. гьиг1г^1епв1в, а также близко родственные им в. еегеив а з. тусо!авв обладают /-эыилез-ноя активностью. В сравнительном аопекге изучались игами з.^и-г1пв1епв1в ИНаЛА- 876 (серотип 10) и штамм в. иуео1(1«я ИН(Ш-1995. выявлено, что у в. 1Ьиг1пя1впв1я максимальный выход Р-эмилазы наблюдается в экспоненциальной фазе роста (15ч) и составляет 0,065 ед/мл на, а ^ -амилазы - в стационарной фазе роста (25-27ч) и составляет-4,0 ед/мл к*. У культуры В.гау-со1<1ев максимальная /-эыилэзнзя активность проявляется а вовне стационарной фазы роста (55-60 ч), не уровне 0,82 ед/мл кх.

Изучение зависимости амилояитической активности от рН показало, что оптимальный рН каталитической активности /-змклааы в. 11шг1лв1епв1в находится при рН 6,5-7,0, а << -аиилвзы - рН 7,0-7,5, хотн высокое значение обеих активностей наблюдается з пределах рН 6,0-8,0. Оптимальный рН /-амилазы в, яусо1йвв яэходитсн при рН 7,0, но достаточно высокая активность ваблю-цэется и при рН 5,5-6,0. Оптимальная темперотура «< и / -эни-193 у в. 1Ьиг1пг1епв1я - 5С°, но достаточно высокие значения 1вблюдяются и в пределах 30-65°. Оптимальной температура ¥-зкилазы у в. пусо1<1ев -50°, сильная активность в пределах 3050°. .

Не основании наших данных иокно заключить, что оптимальные значения рН и теипэратура каталитической активности Р-еиилеш

3. thuringienale И В, mycoidee s основном аналогичны, однако ферментативный уровень Р -эмилазы у в. raycoidee намного выше, чей у В. thuringlenele .

На основании полученных результэгоь мокао полагать, что биосинтез Р -амилази является характерной особенностью для Представителей З. mycoldes И В. thuringletieie , что МОлат служить дополнительным биохимическим гестом для дифференциации и идентификация двнноп группы Зэцилл.

ДрОДУЦбНТ 'А -ЭМИЛаЗЫ B«cill.ua eubtilla шт. tiHiHA-3001. Итамм является продуцентом <*С-амилазы хзрактериууыаейся декстринируюцаП и осахаризоющэй активностями, что составляет 250 ед/ыл и 25 едД'д к*» соответственно. Установлено,что оп-гиаальный pH <*'-емплавной активности находится в пределах 5,06,0, в оптимэльвап температура - 50-55°.

Сравнительная характеристика цвкломаяьтодекстрин гяькано-транс<;вр8г(цикпоавкстрин глу.козилтрансфе раз) экстремальных форм бацилл. £ сравнительно« аспекте изучен фермент цикаодакстриц гливозидтреисфеуэзе (ЦП-аза) у термофильной культуры Bacillus ер. ( Bte»rothermophilue ) iiiUÜA^OIS) и влналофильной культуры Baciiiue ар. ИНйЯА-318б. Установлено, что термофильная культуре обладает ЦГ'1-азоИ, обра вухицей из крахмала и /-ВД, а алаа-лофилънай ктзым - только|щ.

Результаты олытов локаьывают, что олеиновая кислота в коли чеотЕе 0,2-1,0^ индуцирует биосинтез ¡¡ГТ-азы у алкалофильного таима ъ 2,7-2,0 раза, s то время как у термофильного штемиа ьызыьеет ингибирующиЯ гффект. По нэавм данный, неилу.чвий источ вик углерод« дан биосинтеза ЦГТ-ез у термофильной и ваивхофиль вой культуры - крахмал. Неорганические источники взотв наибоае эффективные да йиосиищеаа цГТ-аза у термофильной культуры,оос ¿•9НН0 мористый аммоний- Пептон ••■ наилучший источник азота дл; биосинтеьа ЦГГ-ез у злкэдофильной культуры.

Заявлено, что оптимальный pH ЦП-зоной активности у термофильной культуры 6,5-7,0, высокая активность наблюдается в npt делах рК 5,5-6,0, а оптимальная температура - 70°, с выраженной активностью в пределах 60-90°. Олтииеяьнаый pH ЦГХ-азной , акзивкооти у алкалофильной культуры находится в двух облаогях яри pH 6,5 ч У,0, аффективнее при 6,5. До-эидимому, .у данного • «текла продуцирушся ЦГТ-вза 2-х типов с рвавши оптииуками

рН. Оптимальная температуре каталитическо;! активности - 50-55° при рН 6,5 и 9,0. При Солее высоких темпего турах ЦГТ-азнэя активность наиболее стабильна при рН 6,5, тогда как при рН 9,0 -резко снимается.

Показано, что изучаемые цГ1-«ази способны образовать ИД не только из крахмала, но такке из мальтозы, мелибиозы, мальтотрио-зы, амилоза и аиилоаектина. Оораьоъание циклических продуктов не. наолидэетсн из глюкозы,гснтиооиозы,ре*финозы, ннулина а декстрвнов.

ВнсПХиа polymyx» .IHitlA-ISIS - продуцент i -амилааы. Выявлено, что максимальная активность f -амилазы на резных оре-аах прсивляется в конце стационарной фазы роста (50 ч) а составляет, в среднем, 1,5 ед/мл кж. Установлено, что активному синтезу Р-емилаэы у итаммо в. p.olynyx» способсгвуцт из источников углерода - крахмал, & из источников азоте- пептон.

С цельа увеличении выхода ^-емилези проводилась оптимизация состева среды СР-5, для биосинтезе итого ферменте. В результате проведенных опытов была разработана среда СР-5-3 наиболее благоприятной для биосинтеза / -амилазы. Соствв среды »ключвет (г/л): крахквл - ¿,0; пептон - 1,0; кукурузный экстракт - ¿,0; :;»ci - 0,5; кн2ро4 - 0,5; :.lgS04 . 5Н2о - 0, 5; 1пС12 - 0,Oui; CaCI- . 2i!.,o - 0,132. Лзучение зависимости Р -амилазно:] ективносгл от рН а температуры локезело, что вы-, юкая каталитическая активность проявляется в пределах 6,5-8,0, ' оптимумом в пределах 6,5-7,0, а такае в пределах температуры -0-50°, оптимум - f0-45°.

Выделение и очистка /-амилазы. Для выделения / -амилазы спользовалась кас, полученная лооле нв-чассоой ферментации„ деленная клеток центрифугированием . Выявлено, что аз аспы-апных осадителей элективным явился, этанол в количестве двух бьеаов. Для очистки /-амилазы применяли кукурузный крахмал, такте ого гель, полученный поперечной сиивкой эпихлоргидри-см. Очистка хромвгогрофярованием не кукурузной крахмале оке-элась более эффективной, чва не геле-крахмале.

¿1ри очистке /-амилазы нами были разработаны следующие тэдии. На первой стадии к раствору к* в объеме 1500 мл, ноя-ентрированному удьтра^ильтрационныни мембранами до объеме 00 ми, добавляли сульфат еммония (20fc нзоыцения) и кукуруз-

ный крахмал (5%). Сиесь при постоянном перемешивании выдерживал ярк +4-5° в течение I ч. полученный комлекс отделяли центридуги рованием, промывали дистиллированной водой и ./-амилазу элюиро вели раствором 0,6 м и»С1 в течение I ч при 30°. Полученный Блюет в объеме 100 мл диалиоовали против водопроводной воды при 5° 16 ч. После охлаждения к элювту добавляли этанол (0°) в коли чесгве двух объемов, и спесь выдергивали при +4-5° в течение 30 мин, после чего осадок отделяли центрифугированием. Полученный раствор фермента диализовели против водопроводной воды при 5° 18 ч., после чего подвергали гель^ильтрации на се^адексе О -¿00, пропуская через колонку размерами 2,3x120 см. Злюирова-ли дистиллированной водой. йермеатный ярепврат, полученный такш способом, электрофоретачески гомогенен, имеет удельную активное: 7,83 ед кэ I мг белке, степень очистки 98 раз. (табл.2).

Таблица 2

¿»талы очистки Г-вмилэзы в.' ро!утух»

Стадий очистки Общий объем, мя Общая активность, ед. Общий белок", иг Удельн. активность, ед/иг белка Степень очистки, &

Супернетент 1500 398 4975 0,08 1,0 .

Ультр8£к1лътра~ ционяое концентрирован ие 300 398 4975 0,08 1,0

Сорбция и злюи-рование (кукурузный крахмал) • 100 92,31- •90,5 1,02 12,75

Осаад&ние этанолом (I:?. до объему) .35 44,.1 21 . 2>1 . 26,25

Гальфильтрания на сэфадексе а -200 105 28,58 3,65 7,83 90,0

Свойства / -эмилазы в.ро!ушуха Изучение зависимости активности г -амилазы от температуры доказало, что накоималь-

д.

ный гидролиз субстрата происходит в интервале'45-50 , оптималь<

ный - 45°. «¡сследуемый фермент после видершаэния при температурах до 45° (рН 7,0) в течении 2 ч сохраняет I0UJÍ. исходной активности. Лри 50° за 1ч сохраняется 95/¿, в через 2ч- ЗО-ЛО/б исходной активности.

.¡зучение зависимости зитивцооти /-амилазу от рН поназэло, что максимальный гидролиз субстрата происходи! при рН 6,8, хоти фермент проявляет достаточно высокую каталитическую активность в. пределах рН 5,0-8,2. После•выдеркивэния дермеита в течение 2 ч при температуре 45° при разных значениях рН установлено, 4ío максимальней эктивность сохраняется при рН 6,0-7,5.

Опыты по влиянию ионов металлов нч . / -змилэзьую активность проводились в присутствии разных ионов з количестве 10 в реакционной смеси при 50° рН 6,В в течение I ч„ Результаты позволяют заключить, что действие / -амилазы частично ингибкруют ионы Ni2+ , Mg2+ , Mn2+" , Ре2+ и РЬ2+ , ПОЛНОСТЬЮ - ИОНЫ Cu2+ , Zn2+ • Ионы Xf I N3* , Ва2+ ' , Со21" К Са'4 не влияют или имеют некоторое защитное влияние нз фвривв'гэаввау» активность. При укззенных условиях ЕМА и р -хлир^ерку-Р'ий бензоат в количество 1 аМ полностью йвгио^руаг действие фермента .

Лссдвдозание кинетики реакции гидролиза при различных koü-центрецаях субстрата выявило, что для / -ананазц Кк равьа 1,1 мг/un (по крэхмэлу) и. Vmax .равна 0,061 ыг/мин (но ыаль-юзе), определенные в координатах Дейнуизера-Еерка к\лихээлиоа-¿ектвн.

Аминокислотный анализ ^ерыентэ показал, что преобладающими шинокислотэки являются вспарагйновзя клспотз, оорин, алонин, ?лицин. Сравнеаив полученных наш: результатов с литературными ;анкыми свидетельствует о том, что те «се змвноьиолоты является ipeo ока дающими и у известных культур в. polyayxa и в.'сегеие Kawaau ьХ al. , 198.7; Nanmori et al., 198?) .3).

Молекулярная масса / -еыииаэа, определенная методой гель-лектрофорезв в присутствии Na-DS , а тэкке ?ваь-и;ильтра-,ИИ на Superóse 12 нв составила 46 кДз .

Иммобилизации / -амклааы в. ?olvmyxa . «Шаооилиакцию суцествляли коволеатнам связыванием на оалохроме G-6U. ilo ;¡a-иц данным за 3 ч связывается на I г носителя 6,3 иг бьлкв о статочной активностью в иммоб'ллязоваином состоянии ь 1,01 ед.

- -

Т80ЛИЦ8 3

Сравнительная характеристика аминокислотного составе овциклирных / -амилез

Количество

аминокислоты В.ро1утухо шт.мИ1Ш-1518 В,ро1утух« (Кшуаги е* »1.. тЬ В.сегеив (Г>агавэг1 е »1.. 1907)

Аспарагиноьвя кислоте 22 ,0 13,0 11,4

Треониа 5,45 5,7 6,0

Серии ¿1,9 9,0 5«'7

Глугеииноввк кислота 7,0 9,0

Пронин 2,4 4,0 ^ ,5

Цистйк 1/2 но определяли и,58 0,53

Глицин 6,2 п.* 7,5

Алании 11,0 ' 6,5 7,0

Ивдия' 0,9 3,7 5,0

йетиокин 0,7 1,25 2,5

¡ЛвОЛОйцан и, 75 М 5,0

Дейцик 1,0 и,0 7,7

Тировин 1,6 о,5 5.5

Фенйлаленик 3,0 5,0 5,0

Лиакн 5,8 7,0 7,5

ГйСТИДИК 7,0 1,25 1,5

Аргинин 7,0 1,5 2,3

Триптофан не определяли ¿,7 2,3

аа I иг белка, т.е. сохраняется оО;» исходной активности. О целью применения иммобилизованной / -аыилэаи для получения мальтоза изучены его некоторые биохимические и (¿изико-химичео-кие параметры. По нашим данном, оптимальные рН и температура каталитической активности нашивного а иммобилизованного фермента в целой идентична* 45° и уЯ 6,8-7,0. Для «шнобияиаовеи-ной /-амилагы к® ¡авне 1,25 иг/ая (по крахмалу), е Vmax -0,048 1?г/мин (по иэдыоэе). Полученный биокатализетор после вудертеная в колонке (2x20 см) при различных температурах

з течение 10 суток сохраняет 80-85$* исходиой активности при 40-45°, при 55° в продолжении 6 суток сохраняет 50% активности, а через 10 суток иммобилизованный Вермонт полностью иаашиги-руется. «(окно заключить, что нммсбилизоьеинзя на снлохромв 0-80 методом ковалеадного связывание /-амилезэ - достаточно стабильный препарат, могуад быть успешно использованный для получения иальтоеы ь проточных условиях,

Получение мальтозы осуществляли следующими способами;

а) в периодических условиях,

б) в непрерывных условиях,

в) о иопсльаогвнием уамра^ильтрационных мембран (УФ).

Получение мальтозы в периодических условиях. При получении

мальтозы в периодических условиях использовали /-амилазу, з виде к», концентрированной на У4-иембранах, э такт ~ оччадн-ной вф^анаой хроматографией из нукуруаном крахмале. Выявлено, что выход мальтозы газисит ог количества вносимого фермвнга, времени, концентрации крахмале. Концентрация крахмала до 5;<> ыомет.быть использована для получения иальтозы только f -амилазой, однако выход маямоаы снимается. Высокие концентрации субстрата (10}с а бопее)) которые в основном приманчютвя « производственных условиях яри получении мельгогы, но могут быть использованы баз предварительной обработки. Резмикение крахмального клейстера проводили о(. -виилавов в, яуьи.ия. Разадкенньсй крахмал характеризуется определенными показателями дедстрсзаого эквивалента (ДЭ) и йодного числа.

.йыкрленс, чад выход иеаиозы звьисат от предваратидьйой обработки субстрата с разным уровней да, который в лредидг-х ¿,5-0,7, з йодное число - 0,65-0,75 обеопечивэот .высокий зыход ¿адьтозы из Юркого крахмала зд г ч,

Учитывая результаты'исследований, получение мальтозу.в пародических условиях проводили следующим обрвзом. Раствор [056-яоро крахмала развикэли о( -эйклазой в.тЫШв при 60° 5а ¿0 мин, до получения показателей 0,5 ДЗ и 0,7 подоге ч«с-ю. Фермент инактивироввли кипячением, охлеададк до 45-5ос, (очтролироввли рН фоофатным буфером до 6,0 и добавляли 3 ;азу. Биоконверсию проводили ;;ри 45° 24 ч погтоянвом гвшиванййСп.уЬтя 24 ч в~рвотморе'' ярозоряая "оодерадкае' доя- '

стринов и процесс остэиовливвдк кипячением 10 мин. Раствор обрабатывали эктквчроввннии углем (4 г на 1,0 л раствора) при 60-70° в течение 20 мин при перемешивании, джльтроь'али. Ь одно» случае использовали раствор иэльтозы при 60-80° под вэкууыом и выпаривали с целью получении мальтозы лицевого назначения. В другом, раствор ыаньтозы концентрировали при 50° до насыщения ( а =1,1-1,3) и кристаллизовали при 10-15° в точение 48 чесов. Выпавшие кристаллы около 50% отделяли центрифугированием и выс} шивели, в честности .для получения мальтозы реактивного назначения. В периодических условиях из Ю^-ного крахмала получается мальтозе с выходом 65-70^.

Получение мальтозы в непрерывных .условиях, Б биореактор загружали иммобилизованный фермент и через него пропускали Ю;.--ный крахмал, разкиженный с< -эмилозо;). Выявлено, что при удельных скоростях от 0,1 до 0,25 чзз~* получайте» оптимальные результаты выходе иачьтози (табл.4).

Теплица 4

Влияние удельной скорости на образование мельтогы (М^-иый крахмал; 0,5 ДЗ, рН 6,8; 45°)

Удельная скорость, Выход ¿шльтозы,

БУ 480"1 'а

•0,10 70,0

и,20 75,0

0,25. 75,0

0,30 65,0

0,35 60,0

0,40 53,0

В непрерывных условиях из Ю^-ксго куэглипа обрежется мальтоза с выходок 75>.

Получение мальтозы о использованием осу^есилнли

на Уф-иомбуанах А?.-02, через которые пропуская*. раствор коахиэ-лэ и /-аиилеги. Бали изучены некоторые параметру, необходимые для тзх.нологических целей.

Выявлено, что в опредьдзнчых усиов.шх избыточное давления и ;,еям:'ате находятся б лрпиоЯ аевийикссги. о ходе

биоконверсии субстрат и фермент обрззуют концентрированный слой нэ поверхности мембран, что лимитирует поток, действуя как дополнительное сопротивление.

Установлено, что в начальный период процент биокснзерсии больше, выход пальтози высокий, так как концентрированный слой на поверхности мембран неполностью сформирован. Образование концентрированного слон практически заканчивается через б часов.

Эффективность трансформации существенно зависит текае от соотношения скорости фильтрации и скорости потока. Следует отке-. тить, что скорость фильтрации в большей степени зависит от исходной концентрации ирахаадв, чеь от вносимого фермента. Со временем количество мальтозы а фильтрате уменьшается, а в основной потоке - увеличивается, хотя общее количество мальтозу уменьшается. Образовавшаяся мальтоза в основном остается в реакционной среде, гея как затрудняется фильтрация из-за концентрированного слоя на поверхности лембраи.

Полученные результаты показывает, что выход ¿¡альтозы в непрерывная услоьиях с использование!! УФ-мембран затрудняется из-за образования концентрированного слоя крахмала, поэтому этиа методом могщо получить-мальтозу на низких концентрациях крахмала, ■используя маленькую поверхность мембран.

Результаты приведенных р'због указывают, что / -амаяазэ на в. ро1ушуха локег быть успешно пра.мендне для получении мальтоза в проточных условиях с применение« иммобилизованного формен-

19.

2 и В О Д ¿1

1. Исследована и охарактеризована способность биосинтеза Р -амилазы у представителей нультур равных видов и подвидов опорообразующих бактерий.

2. Выявлено, что преимущественно синтез / -зыилззы'характерен представителям.ВИДОВ В. ро1у:пухь , В. сегоия , В. аусоЫег, В. 1;Ьиг1п§1йПв18 ' , а синтез Ы. -амилазы - В. ьиМгШз, В. -№и-г1пе1епя1в , в. шасегапэ , в ю время кек синтез ЦП-аза -представителям экстремальных форм бацилл.

3. Выявлено, что энгоиопатогеннче культуры в. ^Ьиг1пв1«п-в!в , а такие родственные иив. тпуср1Лвв и в. о^геив обведет ^ -змилазной активностью, хотя у представителей подьидэз в.

13 a X b) ja K IT >-J E; fci tt K 03 e Er 'S, E a s E H» 0 r*

o bf 0) 0 rr 0 t«: er 03 «< & EC 1-1 s. CO 0 □3 CS Ä t» O er

CO s Sa a E O » tD 0 e cc 03 ü rs K S • c 1-3 e

e es •o s a << 1 CD M i? a & CT. ^ tri 0 0 H» 0 0

p x CD H IC K VD ^ —' CO • 0 CO CE ¡5; a it» 0 • •- X U1 « CC p» CS •a H-

-o o 0 •O 0 K c H E *ä • X s » E I • E • 0 Ä Ä « Q US £3

tjn iJ E 0 bt a s c O s CD •a l-i V_- X CO •0 as №

o b! cx CD O G: s» a (S E •o Hä E V. 0 E tL s O • O

«c m s s M O K -a w 0> 0 G7 0 O »-1 « CO E 03 tö S- « c ts to

o H} E CD ¡a CO «< zi Cö <x « ■. Ä u (35 0 ■ O CD !X 1 O CD

►3 CO 0 X << !B fi 0 M E U E O fcl b* >e «• cx •c « X O O J3 a

o .c M CS 0 ■ ■ 0 £ S CO X 0 0 0 •o 3: E CD « O O 8 •O CO

s; « £J a> 0 a 0 0 fa EU CS E E 0 « a w X ic 03 tä 1-J 03 ta a

o © •c; 0 a tu 0 ►; 1 •e CD CO rr: Ol <0 s- c es « tr. O. 03 « e tc X 1 O

3; 0 t-i Cd n bs CD EC ni W £C a Ä •o 3» CS tr E a u

o s O t3 ■ x O tl e O E O ra e< H 0 0 Ä 1-3 CB O 1 s: K B)

» rs CD W w m et « O zr. c •c CD re C: Ä X E SP a X

tr« 0 ^ 0 O O s s c C O K 0 to ü> t-l m X ^ 0 ££ O 03 O ^ •c w

Cü p to CD OD s •c 0 tr « Ji a 0 iT S= a X cx •a O a s

o j; CD c a e ^ W B « fc c- E n: w •a to V£ • • . CD s H <B X 0 cx

tu fc O E 0 s CS a O ^ 0 0 s r; IS "CS 0 O K 0 «+ 0

CD O >P O >e E c H K K X tt a w £ 03 E s CD 0 03 fs tt fcl

EG O. vp <s tt c CO n a> a> 0 3 E H t; Kr c: CD £ c « Cl. c 0

x 0 a •c fip c R c tJ s; t- X s: ■c; CS 0 •e ü 0 •T3 « 0

o £ w 0 E •x 0 «-<-. c s tr< O K 0 i: •c a JH a ' E d> H 0 s s öi

rj 5? Ol O r: K ti s 0 a X s. CS O VC CS •D K 0 *o c 03 tjj £5 K 0

O 6J «C 31 tJ a X •0 E s s u 0 0 03 so O Ol ■e s: C3 CO a « 0 a

Q K g •c H s •c a e •c s M c M 0 Ja ^ io CD b! er E H» 3

Ä w. K CD « x u s: ' i « SS a» •o K O a 0 S O ia S! 0 ca

>o 0: O n; • CD CS er a c *< rC a a> 0 SS ta s. )ir E CS s a 3 s

C3 äs 0 s e. tt. 0 t; 0 CO CS IW 0 M ¡s •c Ci) o> s C3 CD <c >e-

g Cl! El IC O s IS a 0 13 E CB H ro a a> X w 0 K K H 0 •a m s

C N Bi E c 0 X ^ (0 a; « K X a E74 - ~ OS . CS 3! 0 V tC

Cc ZU' O 0 e iJ CR ® to X CD cx E 0 ' X « ft' Ja CO X

a a> C c; tr Ui ES № Hl 0 3= 03 1 O K ^ C! VT i= <<: d 03 CD

CE O 0 £4 X <—^o 0 SS a er ►3 y ia <-rr. rs cc f3 c CD O a

• ta b- •c CO M «1 KT s <£ CO PI s; X CO »f c

b- H 0 1 0 Ä >G H 2? 1 s: sor 1 1 c O X 0* b) Sk

1 Ja c: 0 K c » ? CD 1 VC CO CO s tu 0 Cd LcL « CS + « O s

0 •M 0 e CO *-3 sc a M W E M H K ts « £ n.' t) Ja 1

c tu E s ff» 1—• CD 6J E a 0 * ^ 0 0 BS s f u s ca vn K 1 0 O

0) 0: a a: ü » .c ta u 0 S ' fc> H E Ol 0 a Sk u E

S» &S se - to A Q> s n s Ä W b- n; cc CD K d> CC Cc 3S SS c s S

CD Ü 03 0 « H O O !X K rj 0 E CC •a BS 0 •C! 1 tl

03 0 n 0 c. Cc n sc 1 XiS CJ Ä E 1_ bc E E cc Ew CD cc «3 cf V c <B

•CS K CO « *—' H JZ X E s 0 > K ip R ts £5 E p* cc

O •c t» « e E a s CS CJ 1 0 OJ td ►ä CO X ßi s X

O V «< s Ä rj 0 c » 0 a> CO E •g Ol s K c O ts 0 1 CS

d 0 c.- £ Ä s •c « tn E • • tE ►i fei "EX CS H »

in Ä 1 Ja << "ts & E 0 c ' * C9 s: H CS V ro • C 22 « HI 3

sc x c s a ü' ü> "J ta 0 W 0 a O <s s; SS E G? Ol

X tr CO CB 0 to 0 s CD w « 0 *ü n O a t» H» K

O X c CD rs • J r—» 0 K p "C ►J O GS M 4 « 0 0 w OS H

Ja 0 O E. g 1 a X B£ 0 tc. K rf tf 0 0 »

0 << *o X O F* CS jj 0 0 0 O e O H a •• CS 5

E 0 0 s 0 ^ 03 n 0> ►J «<; X rt C< CS CJ X X

fcl tc X fcj E X u O ^ 0 E O » •i «c CO CS t: a 0

E O • c s •0 CS « 0 tz 0 »s CS O 0 JE. 0 Ci> Ja •c ri 0

O № h. s s> E 32 «9 0 O 0 0 0 ta •ü c rc a: <S CO O" «

» S Q CO O X 0 S3 « 0 CD 0 K &< CD H fc- 0 a s w 10 tr*

tr1 X E H « 1 I H 1 0 03 H H 03 • •s 1 E CD H

1 X 1 1 0 1 K H 1 0 1 (9 1 6 SI 0 1 0 1 iS. 1 3 0 •D CO B 1 H H» 0 1 *

Список опубликованных работ но хаме дисоэртации:

1. Абелян В.А., йвякян 'д.Т., иелкумян А.Г., Балаян л.л., Уэуннн Л.Й., Гасаарнн A.Ii. Сравнительная характеристика цккло-декстрин гликоьилтрансфвраз различных групп иикроорганизиоз

// Биохимия. - I99k.-T.57. - а.5. - С.430-437.

2. Абелян В.Д., Гвспврнн a.B., Авакнн о.Г., А^риккн й.Г. Внеклеточная циклодекстрин глькозилтрансфераза из термофильной бактерии Bactilue вр.^Биохимия. - [ЭЛ. ■■ Т.56. - В.9. •• С.1578-1582.

3. Гаслврян A.B. Изучение аыилодигической активности у в. thurinsl«nsie // Ш Всесоизн.коидер."Биосинтез ферментов микроорганизмами": Тез.докл. - Луцино, 19ьь, - Li. 145.

4. Гасиарян A.B., Абелян В.А.., Аьрикян ü.K. Характеристика f -амилазы Bacillus polymyxa // Биохимия. - 1952. - 1.57.-В.о. -0.856-661.

5. Гаоларян A.B., «вакян о.Г., Макарова КЛ1. Изучение оиъ-*е-амилааы бациллярного происхождении. //Биодог.к.дриении. -1987. - Т.40. -«.4. - С.275-260.

6. Гзспэрнн A.B., Макарова £.Н. Ьетв-бмилэзноя активность эзробвых спорообразуыадх бактерий // 1У йоесоьзн. кон^."ьио-сингез (уераенсов микроорганизмами": То а. доки. - Тедши, Ibüt. - G.49-50.

• И Ii Ф (1 Ф tt t h I'

LlVinL 2 4«mqliu[i 'iiuuujujp juj'U f-ug[4^bp[i в Ьла-ш11[)|_ш11шХ| "U. "iinp ирилцрр ¿[i plinLi'jqrniLif[|

U'jiltpnopilui'UfiqtfXthpji tuif|i ^nj )1иф1{ Sbptf bXiiiiXiЬрц, uij») ijлllT f - isi/fi-l^j'Unpb'U Ц[ipлпЦnLJ h'ü ou|Bjti Ii oui^iu щшрт.'ик^пц "uiLu'ßJi 2u(tuP^'Irll t Ри"19Сш9п|-9|,|Е^Ьр(1 U р-л^'и^шЪ Цlaunigu.VjjI[ui1' ЦкЩ uauigiiiaV WJup:

utiuuibiTiuijnp^isb <?lim[ rn.uruiiWu[. ;ii{u»b l f - uil(.^u-iaj{i unapiabrttiiQ uifcpnp ищПршпм^шлЪпц guAjjibpfim'uUpp4 ¡«Ьр[.,

Sutnalt |у*и»Ц«р<ц{*Ь l^nt цвщ. U. tj¡u«pbifn4[>^ dU.bp[i (inwi

ЬЪ SЬцифири■bumli'Wbpp U щрлшцр^-

ЪЬр£»г i;f>unLJ'j«u(ipL¡»ib U рХии^мцр^шЬ b\i J1 - unT^mquij^ nU^IXIFJbaji ■пшЬй^иЛшл^п!.^jra^btipfi рмд[|^ЬЬр(| шмррЬр ubuuíl'bbpti b. ЬЪ^шиЬииЦ-tilip^ lines

m¡¡¡\iii!u>tti\ip\ib{i[i Sjiifw'U t|p<t, t» ПГ pu9tll^'jpt1

Цт. lutin, pmUbpfi иЛ[>11Ц[ия{\1( Цп^щ^bguQ p^npn^ijuLt/ t mb(jert{Uij|ib jni-pmieifl^ni.^ jmJ p : l'uiguSiu jmu(iub np j" - u[isu,J bqp «тш^Ь^л-

чЬи рЪпрпг t В. polywyxa , В. cereus, В. mycoldce, В. thuringlei sie тЬии^Ьр^и, «К upa«ir\piu.J(t\ В. eubtHie , В. thu-

rlnglenaie , B«, nacerina лЬымЦЪЬр^! ^аииия^ш!» t, np дМ^пцЬЦи-

dUbptiVt

'4iU|Kn(uih t» 1ЛnJnu^ttJ^inЦщ. ццГЦ. рш^Ьрр, npn^g щшлЦш'ипи! bti ü.tburinßlenBie wbuiali|i\i, 'UwU. Vipubij iTnui ЦшЪ^ЪшЬ B.nycoidei

U В.Cerella wbuwl^hpl> ttbpl{iUjugfiLg|i¿bbp(> od««i|«b ЬЪ J" - uiJ{>i«M^iiijfr

Ш^Я^Цпц! JUftlpi

ППипиПши^рфиЬ t ыпшЦЬ^ шЦшЩ ci - мрям^р^ц* В.виЪ-

tlllc 2«raif(i!

tyuapbi/nkjn álLbp{i> (<hpiín»{n Ii. «цЦицп»^ Цт. ^ui«tpuUbp{> i/n®, íЬницпи^иЬ b. р^т-ршсцн^тЬ I; g^ldn^b^uap^m^n^^inpuVu^bpiu^iu î>bp-iTb^imQ, 1j(i») pfinufiVfíbuf щшjifw'ljljbpp Ц npn^ шпшЬЛЪиЛшиЦт.^ .(т.'иЪЬрр:

lynyxa h\ilfbll-1518 Uewgi(ab t ¡¡""^t1 f " «^l»СИЯ"4Jt1

SriJnubU ^рЬ^шрш» : П!чит.к!\«Ш|фр1}шЬ 3>bpií b\ii»f> (i^njjJid^vrtjaV, tjiqjw Цш-ц^и^шЦшЪ liuinOwüJijbbpQ Ii. UÍIT|I\IB¡IÍ(JC|Uj{ili Цшсц/ц !

^пЦи^кЛии Цш^шЦдит'и iltylnrçnij С-ВО и^Щирп^ i)c,u ЦвяарЦяЬ t j - BJ^im^MJ^ ПИипЫЪши^шЬ ЬЪ {иГпр^ц^цшд^шЬ

>bpiíbWfi иая'ЬйЪиПинпЦщ.р jniMbpß ¡

Uü[i\¡^W.s Snjgwj^ B(Bjvr«'uVhpni.J [)if f - «ij^ ^j^

ItJipetUÍtudp lT2и»Цwt> t JiB^uinnujJi илидкГшЪ jncViuilЬл ЬциДии^, np-tnb^ i/w^wnqej^i uiniugi/uAi HpC» о^имщпрЛ^шй ínuíg^g4 ou^MJ^Q, Цощ-ifrud t 75 S:

'/í (,4л"

V