Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белок-нуклеиновое взаимодействие эндонуклеаза BspRI и ее сайты узнавания

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Белок-нуклеиновое взаимодействие эндонуклеаза BspRI и ее сайты узнавания"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 577.21.152

САГИТОВ Валерий Роальдонич

БЕЛОК-НУКЛЕИНОВОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ: ЭИДОНУКЛЕАЗА В5рЯ1 И ЕЕ САЙТЫ УЗНАВАНИЯ

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.А.Александров

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

профессор В.И.Иванов

доктор химических наук Е. С. Громова

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина АН СССР

Зашита состоится 991 г. в I 7 часов на за-

седании Специализированного Совета Д 098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва. 1-0 Дорожный пр., д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского, института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ... ......

Автореферат разослан "11" КС^Е^Ь^ьЯ. 1991 г.

Ученый секретарь ' Специализированного совета, кандидат биологических наук

-л..,'/ , В. И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бурное развитие молекулярной биологии за последние 10-15 лет в значительной мере обусловлено открытием рестрикционных эндонуклеаз. Эти ферменты широко используются для конструирования рекомбинантных молекул, физического картирования и секвенироваиия ДНК. Во многих научных лабораториях и коммерческих фирмах проводится целенаправленный поиск новых рестриктаз. В последние годы отклонировано несколько' десятков генов рестрикционных систем, главным образом силами фирм-производителей продуктов для генной инженерии. Это приводит к тому, что с каждым годом все большее количество рестриктаз становится доступным для исследователей.

Помимо прикладной значимости, рестрикционные эндонуклеазы и метилазы интересны как модельные объекты при изучении ДНК-белкового взаимодействия из-за своего небольшого размера и высокой специфичности узнавания нуклеотидных последовательностей, а также ввиду отсутствия каких-либо регуляторных механизмов, модулирующих ферментативную активность и усложняющих исследование многих других ферментов, работающих на ДНК.

Однако, несмотря на большое значение рестриктаз и метилаэ для науки и практики, кинетика и механизм их действия изучены крайне недостаточно. Известно, например, что все или большинство сайт-специфических эндонуклеаз расщепляют различные сайты узнавания с разной скоростью, но до сих пор неясно, какие детерминанты на ДНК определяют эффективность расщепления того или иного сайта, и изменением какого кинетического параметра реакции обусловлена разная скорость ее протекания. Тем более открыт вопрос о возможной биологической роли подобной избирательности рестриктаз.

Много лет назад было показано, что некоторые рестриктазы разрезают ДНК путем последовательного внесения кинетически независимых однонитевых разрывов, т.е. по двухударному механизму, в то время как другие гидролизуют обе нити без диссоциации с ДНК (по одноударному механизму). Пока остается невыясненным, чем

обусловлен механизм расщепления ДНК в каждом конкретном случ! и играет ли какую-нибудь роль в его определении нуклеотид] последовательность сайта узнавания. Непонятно также, поч< некоторые ферменты в разных условиях или на различных субстра' реализуют разные механизмы реакции.

Изучение кинетики рестрикционных эндонуклеаз и мети, важно для понимания общих принципов ДНК-белкового взаимодейст] и существенно расширяет возможности использования этих фермен' в практике генной инженерии.

Цель работы. В настоящей работе мы ставили целью изуче] ряда кинетических характеристик взаимодействия изошизомер: рестриктаз BspRI, Pall и НаеШ, а также метилазы BspRI, с Д] В частности, предполагалось:

1. Измерить относительные скорости расщепления (или мети, рования) ряда сайтов вышеуказанными ферментами и выявить зако: мерности, определяющие эффективность использования каждого caí в качестве субстрата реакции.

2. Выяснить, по какому механизму, одно- или двухударно! работают рестриктазы BspRI, Pall и НаеШ.

3. Изучить влияние метилирования внешнего цитозина са' узнавания (GGCC) на эффективность его расщепления рестриктаза!

Научная новизна и практическая ценность работы. Провед ■ сравнительное изучение кинетики нескольких изошизомерных ре риктаз. Обнаружено, что рестриктазы BspRI, Pall и НаеШ про ляют сходство по ряду признаков: с наибольшей эффективное расщепляют одни и те же сайты, работают по двухударному механ му. Метилирование внешнего цитозина сайта узнавания (GGCC) с. жает скорость его расщепления рестриктазами Pall и НаеШ, но BspRI. Выявлены особенности нуклеотидной последовательное позволяющие предсказывать эффективность расщепления сай BspRI. Измерены относительные скорости модификации различ сайтов рестрикционной метилазой BspRI. Показано, что метилаз наибольшей эффективностью модифицирует сайты, плохо расщепляв парной рестриктазой, и наоборот. Это позволяет предположить I ществование альтернативной биологической функции рестрикций!

г

темы BspRI.

В настоящей работе впервые проведено подробное сравнение ¡етических характеристик нескольких изошизомерных ферментов, [влены особенности, позволяющие предсказывать эффективность ¡щепления сайта рестриктазой, измерены скорости модификации jличных сайтов метилазой.

Получение результаты позволяют расширить возможности прак-геского использования изучавшихся ферментов, в частности в :периментах с использованием недорестрикции и при работе с гилированной ДНК.

Ахшо0адия_£аботы. Материалы диссертации были доложены на I учной конференции молодых ученых ВНИИГенетика (Москва, 1986), II Международной школе-конферешщи молодых ученых социалис-ческих стран "Молекулярные основы биотехнологии" (Пущино, 87) и на I рабочем совещании по ферментам рестрикции-модифика-и (Пущино, 1989)

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 науч-ie работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, ¡тырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, ¡суждение) и выводон. Работа изложена на 107 страницах машино-шного текста, включающих И рисунков, 13 таблиц и список цити-¡ванной литературы (145 наименований).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гомогенный препарат рестрикционной эндонуклеази BspRI ыделяли по оригинальной методике, включающей стадии хроматогра-ии на колонках цибакрон-РЗСА-сефарозы, СМ-Сефадекса С-25, осфоцеллюлозы и гепарин-сефарозы.

Выделение метилази BspRI из E.coli HB101(pNT12) описано в лаве "Результаты". Активность метилази во фракциях определяли э защите ДНК фага лямбда от расщепления рестриктазой BspRI: 1 кг ДНК инкубировали с 1 мкл пробы в буфере для метилирования

з

(20м№ трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА и 0.1 мМ дитио треитол) с 50 мкМ S-аденоэилметионина ("Серва" ФРГ) 20 минут пр 37°, после чего добавляли MgCl, до 20 мМ и 20 единиц рестриктаз BspRI и инкубировали еще 20 минут. За единицу активности ирини малось количество метилазы, достаточное для полной защиты ДН фага лямбда от рестриктазы в таких условиях.

Трансформацию E.coli, выделение плазмидной ДНК, обработк ДНК ферментами (кроме изучавшихся в данной работе) и электрофо рез ДНК проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др, 1984). Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы (фирм "Calbiochem", США) осуществляли но методу Лэнгрнджа (Langridg et al., 1980).

Антитела к эндонуклеазе BspRI получали инъекцией около 20 мкг белка (1 мг/мл в физиологическом растворе) в подколешш лимфатический узел кролика (Гусев, Язова, 1970). Фракцию lg получали осаждением белков из сыворотки сульфатом аммония последующим пропусканием растворенного и отдиализованиого осад ка через колонку DEAE-целлюлозы.

Ингибирование антителами активности рестриктаз проверялос следующим образом. Фермент (20 единиц) смешивали с 1мкл разве денного препарата антител в 10 мкл рестрикциониого буфера (см ниже) н инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Зато добавляли 1 мкг ДНК фага лямбда и инкубировали еще 20 минут Степень рестрикции определяли электрофорезом.

Относительные скорости гидролиза различных сайтов опреде ляли следующим способом. На первом этапе плазмидную ДНК линеари зовали изучаемой рестриктазой. Реакцию останавливали в то момент, когда около 10% ДНК перешло в линейную форму. Линеариза ция может происходить по любому из многих рестрикционных сайто (в нашем случае GGCC). Поскольку убыванием субстрата в ход реакции можно пренебречь, доля • молекул, линеаризованных г данному сайту, пропорциональна константе скорости гидроли; (k г ) ДНК в этом месте. Различные сайты на одной молекуле ДН1 можно рассматривать как конкурирующие субстраты фермянтативш реакции, присутствующие в равных концентрациях, поэтому относ

!льные константы скорости реакции для кахдого сайта, выраженные терминах ферментативной кинетики, равны ke,t/K„ (Фершт, I960), орезав фракцию линеаризованной ДИК рестриктазой, имеющей в газмиде уникальный сайт, и разделив получение фрагменты элек-юфорезом, можно по интенсивности соответствующих полос опреде-1ть вероятности линеаризации плазмиды по индивидуальным сайтам ;стрикции, а значит, и относительные скорости разрезания для гих сайтов. Аналогичным образом определяли константы скорости тролиза сайтов на линейной ДНК.

Рестриктаза Pall была приобретена у фирмы "Pharmacia", ieIII- у НИКТИ БАВ (Новосибирск). Реакцию расщепления ДНК эсгриктазами BspRI, Pal] и НаеШ проводили при 37"С в одинако-=ix условиях (25 мМ трис-HCl, рН 8.0, 20 мМ MgCl2 , 0.1 мМ итиотреитол, 5мкг ДНК и 1 ед. фермента в 25 мкл). Время реакции эдбирали эмпирически. Фракцию линейных пермутированных молекул гделяли от кольцевых форм ДНК электрофорезом в агарозе и элюи-овали из геля, после чего обрабатывали рестриктазами PstI, coRI, EcoRV или SalGI. После электрофоретического разделения родуктов вторичной рестрикции гель окрашивали бромистым этидием фотографировали в УФ-свете на пленку "Микрат-300", которую атем денситометрировали на микроденситометре ИФО-451. Относи-елъную молярную концентрацию продуктов вторичной рестрикции ассчитывали, разделив откалиброванную площадь соответствующего ика денситограммы на длину фрагмента.

Для определения механизма действия рестриктаз через.опре-;еленные промежутки времени после начала реакции отбирали али-воты, в которые немедленно добавляли ЭДТА для остановки реак-;ии. Затем все пробы анализировали электрофорезом в 1% агарозе, ель фотографировали и получений негатив денситометрировали.

Относительную скорость метилирования BspRI сайтов плазмид iBR322 и pUC19 определяли следующим образом. Плазмидную ДНК 0.2мкг) инкубировали с 0.2 ед. метилазы в буфере для метилиро-1ания (см. выше), содержащем 2мкКи Б-аденозил-Ь-Сметил-Н1] ютионина (80 Ки/ммоль, "Amershara", Англия), в течение 20 минут, ¡атем добавляли 2мкг необработанной плазмидной ДНК, после чего

б

строго равные аликвоты реакционной смеси переводили в нужны буфер и обрабатывали одной или двумя рестриктазами, имеющим множество сайтов на использованной ДНК (Alul, Hinfl, Mspl, Rsal Pvull и т.д.). Получение фрагменты разделяли в 3% агарозе вырезали из геля. Кусочки агарозы растворяли в соляной кислоте после чего определяли количество включившейся радиоактивно метки. Поскольку большинство полученых рестрикционных фрагменте содержат в своем составе один или два сайта BspRI, по включени; метки в эти фрагменты легко определить относительную скорост метилирования (kMet) сайтов. В использованных условиях метилиру-'ется лишь очень небольшая часть сайтов, поэтому кие1, как i Кр.стр» пропорциональна величине кс1,/Кя (Фершт, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Избирательность рестрикционных эндонуклеаз BspRI, Pall и Haelll.

В таблице 1 представлены величины К=кс„/К„, характеризующие относительную скорость гидролиза, и нуклеотидные последо вательности окружения для ряда сайтов BspRI, Pall и Пае III плаз мид p(JC19 и pBR322. Значения констант вычислялись отдельно i опытах с использованием рестриктаз EcoRI, EcoRV, PstI и SalG для вторичного расщепления pBR322, а также EcoRI для pUC19. П( условиям эксперимента можно определить только относительны! значения k^/К, в каждом опыте. Однако, поскольку для некоторых сайтов константы были измерены независимо с помощью разни: рестриктаз на этапе 2, а на плазмиде pUC19 большинство исследованных сайтов находится в области гомологии с pBR322, оказалос! возможным сравнивать значения констант из разных опытов мекдз собой и пронормировать их на максимальное полученное для каждol рестриктазы значение К. Приведенные в таблице величины представляют собой среднее из трех или более измерений. Расхождение между результатами разных опытов не превышало 25%.

Как видно из таблицы, относительные значения kc,t/Ke для всех трех рестриктаз различаются по крайней мере в 10 раз. Таку»

' в

аблица 1. Значения констант скорости расщепления различных лйтов плазмид pBR322 и pUC19 рестриктазами BspRI, Pall и jelll.

Т

положение сайта на рВВ322

1945"

нуклеотидная последовательность вокруг сайта_

относительная скорость асщепления сайта

вокруг сай TACATGCCC"

ЦрНГ

X

Ш

Та! Т

ТТ750Г

"НаёТТТ

"Л732~

"5"

"ЛИГ

CCGG GCGAA

"TTGCJTGGCC"

CCGG TACGA

W

Ж Ю7"

СТССГСШГ

______CCGG TGCCC

"GTGGTGGC

..... CCGG ATTGA

"ATCGTGGCC ...7Г

..... CCGG CCGTA

~TGGXT~GGCCr77777~

.....CCGG aaGGG

Т5ШСГСССС"777ГГ ..... CCGG TTGCG

—шгтссс

CCGG CGTCA

TJ78T

w

"W 15Г

"W

РУС19)

"0739" "0737"

T7DD"

1ШГ

CA'l'CT GGCCT

..... CCGG

КШГСССС"

CCGG TGGAG

HIT

ТГ2Т

GTGCCTGGCfr

..... CCGGgaGAA

--------ШХГ7ГГ7Г

CCGG ACaGC TlCaagTXCCTTTTTT"

..... CCGG CTCGC

-TCa АСГССССГ77777"

..... CCGG agTTG

"САС11~ССССГ77:77"

..... CCGG gaaGA

"ATGG€TGGCCT77~

..... CCGG CTGCG

" i AGCA-GGCCTT----

..... CCGG TAATA

13725"

ТГ35Г"

ОТБТ

0782

~07T5"

0.35

"TOR"

W "W

"07ВГ

И7ЖГ

ТГ7ПГ

Примечания.

1. Особенности нуклеотидной последовательности, характерные яя сайтов с высокими скоростями расщепления рестриктазой ВэрК!, зделены обратным шрифтом, для сайтов с низкими скоростнми-Зозначены строчными буквами.

3. При составлении таблицы учитывалось, что сайты в пози-,1ях 2952, 3757, 3410 и 3490 плазмиды рВИ322 гомологичны соот-¿тственно сайтам 1283, 1741, 1821 и 2088 плазмиды риС19.

избирательность в нашем случае нельзя объяснить влиянием кош ДНК или шпилечных структур, как предлагается некоторыми автор; (Nath & Azzolina, 1981, Armstrong & Bauer, 1984), поскол! эксперименты, проведенные на линейной ДНК pUC19, дали аналог! ные результаты (данные не приведены), а потенциальных шии. вблизи GGCC сайтов pBR322 и pUC19 нами найдено не было. Наи( лее правдоподобным кажется предположение о зависимости эффект! ности сайта от ближайшего нуклеотидного окружения.

В случае рестриктаэы BspRl косвенным подтверждением этс является сходство нуклеотидных последовательностей вокруг Д1 самых "хороших"(с высокой скоростью гидролиза), а также сан "плохих" (с низкой скоростью гидролиза) сайтов из табл.1, обоих случаях идентичны 6 из 10 нуклеотидов.

Какие же особенности нуклеотидного окружения отличают рошие" BspRI сайты от "плохих"? Прежде всего, во всех случа) когда К > 0.3, в 5'-положении рядом с сайтом хотя бы с 0Д1 стороны находится Т, причем если К> 0.5, перед сайтом стоит Pi обычно в составе мотива СРиТ, в то время как в сайтах с К<0.: этом положении Т не встречается ни разу. С другой стороны, п; сайтам из шести с К <0.3 хотя бы с одной стороны предшеств; пара PuPu. В самом "плохом" сайте пуршшьие блоки находято обеих сторон, а в случаях с К > 0.5 не встречаются ни разу. 1 конец, в "хороших" сайтах (К>0.5) ни разу не встречается аде! в третьем положении относительно сайта, в то время как в четы| из шести "плохих" он встречается пять раз. Таким образом, п| слеживаются два тина особенностей нуклеотидного окружения cai Bsplil. Первый тип - это последовательность СРиТ (или РиТ) в ! положении, характерная для "хороших"сайтоь (К>0.5), и иросп рядом с сайтом (1Ь0.3). Второй тип - ото пара PuPu с 5'-CTopi и А в третьем положении, характерные для "плохих" сай (К<0.3), но в сочетании с особенностями первого типа встречаю! еся вплоть до К-0.5.

Для проверки обнаруженных закономерностей мы попытались о, нить относительную эффективность четырех сайтов B;;pR! плазм рАОЗ исходя из окружающих нуклеитидных последовательностей (

и

Таблица 2. Значения констант скорости расщепления сайтов плазмиды рАОЗ рестриктазой Взрй!. Обозначения те же, что и блице 1.

Рестриктаза, по которой проводилось вторичное расщепление

положение сайта

"77Б~

'ЕсоЕГ

нуклеотидная последовательность вокруг сайта_

AGTCG

_____ CCGG TGaTG

"GTaCA'GGCC'".

..... CCGG ТТТАТ

TA'CGTCCCC '.,

..... CCGG aaCAA

TTTCC"GGCCrT7777~ ..... CCGG aaTAG

EcoRl

TZTT

EcoRI KcoRl

. 2). Из вышеприведенных рассуждений следует, что сайт 1255 ен иметь наименьшее значение скорости гидролиза, а сайт 776 ен бить "лучше", чем 363. Что касается сайта 1212, то оце-его эффективность трудно, но он должен быть по крайней мере хуже", чем сайт 1255. Из таблицы 2 видно, что эксперимента данные согласуются с нашими предположениями. Правда, ичия между сайтами 776 и 363 находятся в пределах ошибки еримента.

Для рестриктаз Pall и НаеШ картина представляется менее й. В случае Pall наибольшие отклонения от случайного распре-ния наблюдаются для G в третьем положении, который характе-пля "хороших" сайтов, а также для А в третьем положении и G рвом положении, чаще встречающихся среди "плохих" сайтов. В гтности "хороших" сайтов НаеШ некоторое предпочтение зтся А в пятом положении, в окрестности "плохих"- А в первом кении.

Заметно, что некоторые сайты имеют сходную эффективность для трех рестриктаз. Например, сайты Н45, 2952 и 1909 всегда этся "хорошими", 030, 1261 и 3490 - промежуточными, а с<-.пт -"плохим". Таким образом, по-видимому, существует опрлде-1Я корреляция между скоростями гидролиза одного и того же 1 разними рестриктазами. Она наиболее сильна в случае пари l-Pall, где коэффициент корреляции равен 0.51, что соответ-:т (для данного размера выборки) вероятности случайного

и

совпадения 0,05. Для двух других пар рестриктаз уровень значимости находится в пределах 0.1-0.05. Это позволяет предполагать (но не утверждать) существование корреляции и в этом случае.

2. Влияние метилирования внешнего цитозина сайта GGCC_на

эффективность его расщепления рестриктазами.

Рестриктазы BspRI, Pall и НаеШ чувствительны к модификации внутреннего цитозина сайта CGCC, но могут расщеплять ДНК, метилированную по внешним цитозинам сайта. Сайт 1145 плазмиды pBR322 перекрывается с сайтом dcm-метилазы E.coli таким образом, что один из его внешних С оказывается модифицированным в пятом положении: CGCmCAGG (сайт dem подчеркнут). Это позволило нам измерить относительную эффективность гидролиза этого сайта в метилированном и неметилированном (на ДНК из dem" штамма) виде. Результаты, представленные в таблице 3, показывают, что модификация внешнего С не влияет на расщепление сайта рестриктазой BspRI, но существенно замедляет работу НаеШ и особенно Pall.

3. Механизм реакции рестриктаз BspRI, Pall и HaelII с ДНК.

Нас интересовало, по какому механизму, одно- или днухудар-

Таблица 37" Влияние метилирования внешнего цитозина сайта 1445 pBR322 на эффективность его расщегменпя рестриктазами BspRI, Pall и Hael И. На ДНК из dem* штамма сайт находится в метилированном состоянии, на ДНК из dem" штамма- в неметилированном.

dem" штамма ГИсш' штамма!

BspRI

О.ЙЗ

0.80

Pall

0.64

0.0?

НаеШ

0.72

0.28

К)

:ому, расщепляют ДНК рестриктазы BspRI, Pall и НаеII!. Для этого IU проследили ход изменения содержания различных форм ДНК pBR322 [а начальных стадиях гидролиза сверхспирализованной плазмиды юследуемыми рестриктазами (рисунок 1). Из рисунка видно, что ice три фермента имеют сходную кинетику гидролиза ДНК. В течение трвого периода времени концентрация открытых колец возрастает 'ораздо быстрее, чем концентрация линейной формы, Это говорит о -ом, что в работе изучаемых ферментов доминирует двухударный юханизм. Чтобы проверить, заметен ли вообще вклад олноударного механизма, мы попытались описать экспериментальные данные ошетическими кривыми, соответствующими двухударной схеме )еакции:

к, к2 СС + ОС, ----- ОС, ----- LN,

^де СС- сверхспирализованная форма ДНК, ОС,- релаксированная [юрма с однонитевым разрывом в произвольном месте; ОС,- та же рорма с разрывом по одному из GGCC сайтов (промежуточный продукт реакции), LN- линейная форма ДНК. Как видно из рисунка, наши результаты удовлетворительно описываются этой схемой. Таким эбразом, в пределах ошибки эксперимента гидролиз' ДНК рестриктазами BspRI, НаеIII и Pall происходит только по двухударному механизму.

Влияние антител_к__рестриктазе BspRI__на__работу ее

изошизомеров.

Чтобы проверить, не являются ли рестриктазы Pali и НаеШ

Рис. 1 "(смТ стр. 12). Кинетика начальных стадия расщепления кольцевой ДИК pBR3¡22 рестриктазами Pall, Haelll и BspRI. Точки-относительное содержание каждой формы ДНК в разные моменты времени, определенное экспериментально . Кривые- решение системы дифференциальных уравнений, соответствующей кинетической схеме на стр. п с подобранными оптимальными значениями констант к и к . Обозначения: СС, Í- сверхспирализованная форма: ГС, релаксированная форма; LN, линейная форма. По оси абсцисс-время в секундах, по оси ординат- доля каждой формы в пуле плазмшшой ДНК.

и

FRflCTI ON IN TQTRL PLBSHID DNR, X

родственными BspRI, мы решили выяснить, реагируют ли эти ферменты с антителами к BspRI. Для постановки традиционных иммунологических реакций мы не располагали достаточно охарактеризованными препаратами Pall и НаеШ, но поскольку антитела хорошо ингиби-ровали- работу рестриктазы BspRI даже в больших разведениях, мы проверили их влияние на активность двух других ферментов. Оказалось, что антитела к рестриктазе BspRI не влияют на работу ее изошизомеров.

5.' Конструирование плазмиды-продуцента ДНК-метилазы BspRI и выделение этого фермента.

Сохраняется ли избирательность ферментов рестрикции in vivo, и если да, то играет ли какую-нибудь биологическую роль или выступает как следствие физико-химических свойств фермента? Пытаясь прояснить этот вопрос, мы решили исследовать избирательность ДНК-метилазы BspRI, являющейся функциональной парой изученной рестриктазы. Мы предполагали, что если и в клетке рест-риктаза проявляет разное сродство к различным сайтам, то метила-за должна в какой-то мере компенсировать ее избирательность, предпочтительно модифицируя сайты, наиболее подверженные расщеплению.

Поскольку к моменту начала работы в литературе была описана лишь частичная очистка метилазы BspRI и упоминалось о малом содержании фермента в клетках Bacillus sphaericus, било решено сконструировать генноинженерний продуцент М.BspRI и использовать его для выделения фермента. С этой целью была создана плазмида pNT12, содержащая ген метилазы BspRI под контролем Рк промотора фага лямбда. Для этого EcoRI-фрагмент из плазмиды pES2 (Szoino 1 any i et al., 1980), несущий ген метилазы, бил вставлен (в соответствующей ориентации) в экспрессорннй вектор pPR2 (Нашко и др., 198?) путем замени его малого EcoRI-фрагмента. Для выделения метилазы BspRI штамм Е.coli HB101(pNT12) наращивали при 30"С до А50<1—1, а затем индуцировали Ря промотор при 42" в течение 5 часов. Метилазу выделяли последовательной хроматографией на ни-бакрон-РЗСА-сефорозе, IJEAE-сефирозе и гепарин-сефарозе. Конечный

выход гомогенного белка составил около 200 мкг на 1 г клеток, удельная активность метилазы- 2000 единиц на 1 мкг белка.

6. Избирательность метилазы ВэрИ!.

Метод измерения относительных констант скорости модификации различных сайтов метилазой ВэрМ (ки.т) описан в главе "Материалы и методы". Полученные результаты представлены в таблице 4, где приведены также нуклеотидные последовательности окрестностей и (для сравнения)- значения к11встр.

Из таблицы 4 видно, что сайты с высокой скоростью метилирования обладают низкой скоростью гидролиза, и наоборот. Это отражено и в особенностях нуклеотидной последовательности вокруг сайтов. Так, мотив СРиТ (РиТ) или просто Т с 5' стороны встречается среди сайтов с кр.отр > 0.3 и кме1 < 0.3. Пара РиРи, напро-

Таблица 4. Относительные скорости метилирования различных (КСС сайтов ДНК-метилазой ВзрК!

N0 п/п

Т7 "27 "37

"57 Т7

67

т.

~В7 "97

нуклеотидная последа вателыюсть в окрест ноети сайта_

—шагсссстттг.—

..... СССС ¿аЛАй

-СТКХГГОССГ7777:-

_.____СССС яаСАА

--Шагтасс~. 7777-

СССС СТССС

ТЛШГШХГ

..... СССС а^ААС

~гатст~сасс"77777~

..... СССС вбТСА

"ААСТГтаСС.г:тт~

..... СССС ССТСА

~СТССГСССС""Т.""777~

..... СССС АТТСА

"АСС АСГСССС"7 777Т"

..... СССС ТСАСТ

~ААСАТ~СССС~77"777~ ..... СССС СССАА

положение сайта

на р!Ш22 4344"

"174 "3430"

"34ТГГ ~3757~1 15552

Т949"

на риС19 2675"

"ТВ2Г "287" "1741" "2088" "12113" ЗВ9""

_отн._скорость_

метили гидро

рования лиза

сайта сайта

ТДИГ 0707"

~07Ш~ ~072Г

~ТГЛГ ~ОЛ1Г

0761 не опр.

074 Г """0733""

—0732"" 0733"

—0730" 0757"

~07ГО~ не опр.

"70702" Г700"

Примечание. Особенности нуклеотидной последовательности, характерные для сайтов с высоким и низким значением к , обозначены обратным шрифтом и строчными буквами, соответственно.

тив, характерна для сайтов с низким значением крестр и высоким-киет. Значение выборочного коэффициента корреляции между величинами kp<,cip и киет удовлетворяет уровню значимости 1%, что говорит о статистической достоверности выявленной закономерности.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нами былм измерены относительные скорости расщепления ряда сайтов рестриктазами BspRI, Pall и Haelll. Для BspRI удалось выявить достоверные различия в нуклеотидной последовательности вокруг сайтов с высокой и низкой скоростью расщепления. Для Pall такие различия тоже хорошо заметны, но не могут объяснить значения kc,t/Ki> некоторых сайтов. Важно было бы попытаться объяснить механизм влияния окружающей последовательности на эффективность гидролиза ДНК. В связи с этим интересно, что окрестность "плохого" BspRI сайта представляет собой полипуриновый блок (вместе с двумя G сайта), а окрестность "хорошего"- последовательность чередующихся пуринов и пиримидинов. По современным представленит ям, структурные параметры и гибкость двойной спирали в последовательностях PuPy, PyPu и PuPu сильно различаются (Kalladine, 1982). Поэтому можно предположить, что при специфическом* взаимодействии с рестриктазой BspRI ДНК претерпевает определенные конформационные изменения, а склонность конкретного сайта к подобным изменениям определяется нуклеотидным окружением. Похожая ситуация, по-видимому, имеет место в случае EcoRI (McClarin et al., 1986). Неожиданным оказался тот факт, что существенные (в случае BspRI) или наибольшие (в случае Pall) отклонения от случайного распределения нуклеотидов наблюдаются в позиции -3 относительно края сайта. Интересно, что основание в этом положении отстоит от середины сайта на пять нуклеотидов (полвитка двойной спирали), поэтому не исключены какие-то взаимодействия белка, специфически связанного с сайтом, с функциональными группами оснований, находящихся на расстоянии 1/2 витка от места I связывания.

Нам удалось показать корреляцию между скоростями гидролиза

одного и того же сайта рестриктазами BspRI и Pall. Можно предполагать наличие корреляции и для двух других пар рестриктаз. Кроме того, было показано, что все три фермента гидролизуют ДНК по одному и тому же, а именно двухударному, механизму. Возможны два объяснения такого сходства кинетики изошизомерных рестриктаз- или эти ферменты являются родственными, или особенности реакции гидролиза ДНК определяются не столько свойствами ферментов, сколько нуклеотидной последовательностью сайтов узнавания. Поскольку антисыворотка к рестриктазе BspRI не ингибирует работу ее изошизомеров, а для Haelll, в отличие от двух других рестриктаз, характерна высокая термост^бильность, можно заключить, что все три фермента не являются близкородственными. Поэтому мы склонны считать, что одинаковый механизм действия и сходная избирательность изученных рестриктаз каким-то образом определяются сайтом узнавания и потому присущи данной изошизомерной группе. Аналогичный вывод был сделан ранее по поводу положения точки расщепления ДНК изошизомерными рестриктазами (Nishimura & Tsuboi, 1984). . Правда, метилирование по внешнему С сайта по-разному сказывается на активности трех исследованных нами ферментов, частично ингибируя Pall и НаеШ, но не влияя на работу BspRI.

Мы показали, что скорость модификации разных сайтов ДНК-метилазой BspRI различается более чем в 50 раз, причем особенно эффективно модифицируются сайты, с наибольшим трудом расщепляемые рестриктазой BspRI. Этот результат трудно объяснить в рамках общепринятых взглядов на биологическую функцию систем рестрикции-модификации. Действительно, чтобы уберечь клеточную ДНК от гидролиза, метилаза должна в первую очередь защищать сайты с высоким значением крестр. В случае же обратной корреляции между кр и кие1 на ДНК после репликации должны долгое время сохраняться сайты, особенно хорошо гидролизуемые рестриктазой и метилированные только по одной цепи. Известно, что такие полуметилированные сайты являются хорошими субстратами для рестриктазы BspRI, которая в этом случае гидролизует только немодифицирован-

иую нить (Koncz et al., 1978). Если обнаруженная нами in vitro избирательность ферментов сохраняется in vivo, на новосинтези-рованной нити клеточной ДНК B.sphaericus в районе некоторых сайтов BspRI должны образовываться разрывы. В клетках Escherichia coli внесение однонитевых разрывов в дочернюю нить ДНК служит для дискриминации цепей в системе пострепликативной репарации. Ферментная система, осуществляющая эту функцию, полностью аналогична рестрикционной системе и состоит из сайт-специфических метилазы (продукт гена dam) и нуклеазы (продукт гена mutH) (Welsh et al., 1987). Считается, что у некоторых грамположителышх микроорганизмов, например, Streptococcus pneumoniae, узнавание дочерней цепи ДНК в системе пострепликативной репарации происходит также через внесение в эту цепь разрывов (Lacks et al., 1982). На основании обнаруженной нами противоположной избирательности рестриктазы и метилазы BspRI можно предположить подобный механизм дискриминации цепей ДНК с участием ферментов рестрикции в клетках Bacillus sphaericus.

Получение данные по кинетике рестриктаз интересны с точки зрения практического использования этих ферментов в генной инженерии. В экспериментах с применением недорестрикшш часто бывает важно знать, какие сайты на ДНК расщепляются с большей, а какие- с меньшей эффективностью. Наши результаты позволяют оценить скорость расщепления сайтов рестриктазы BspRI исходя из окружающей нуклеотидной последовательности. Выявленная корреляция скоростей гидролиза сайтов изошизомерными рестриктазами показывает, что вряд ли имеет смысл пробовать использовать другой фермент, если один из изошизомеров дал неудовлетворительные результаты в опытах по иедоресгрикцш/. Метилирование одного из двух внешних цитозинов сайта узнавания снижает скорость расщепления ДНК рестриктазами Pall и НаеШ. Есть основания предполагать, что метилирование обоих внешних С сделает сайт еще более устойчивым к гидролизу этими ферментами. Для расщепления [такого сайта лучше использовать рестрнктазу BspRI. Обратная корреляция скоростей гидролиза и метилирован» сайтов ферментами эестрикционной системы BspRI позволяет усилить, если это необхо-

п

димо, избирательность рестриктазы BspRI, предварительно модифицировав часть сайтов метилазой. Все это существенно расширяет круг возможностей использования ферментов рестрикции в практике генной инженерии.

6. ВЫВОДЫ

1. Скорость расщепления разных сайтов рестриктазами BspRI, Pall и НаеШ различается примерно в десять раз. Для BspRI выявлены особенности нуклеотидной последовательности, характерные для сайтов с наиболее высокой, а также с наиболее низкой скоростью расщепления. Обнаружена корреляция между скоростями гидролиза одного и того же сайта рестриктазами BspRI и Pall.

2. Метилирование внешнего цитозина сайта узнавания снижает скорость расщепления ДНК рестриктазами Pall и НаеШ, но не BspRI.

■ 3. Рестриктазы BspRI, Pall и НаеШ расщепляют ДНК посредством внесения независимых однонитевых разрывов.

4. Получена продукция ДНК-метилазы BspRI в E.coli, и этот фермент очищен до гомогенности.

5. Метилаэа BspRI модифицирует различные сайты узнавания с разной скоростью, причем наиболее эффективно модифицируются сайты, характеризующиеся низкой скоростью расщепления рестрикта-зой BspRI, и наоборот.

Основные результаты по теме диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Сагитов В.Р., Метлицкая А.З., Александров A.A. Избирательность рестриктаз BspRI, Pall и НаеШ. Тезисы докладов П Международной школы-конференции молодых ученых социалистических стран "Молекулярные основы биотехнологии", с. 66, 1987 г.

2. Сагитов В.Р., Метлицкая А.З., Александров A.A. Избира-1 телыюсть рестриктазы BspRI в отношении собственных сайтов на

ДНК. Биополимеры и клетка, т. 3, с. 289-294, 1987 г.

3. Сагитов В.Р., Александров A.A. Избирательность ДНК-метилазы BspRl. Доклады Академии Наук СССР, т. 298, с. 12661268, 1988 г.