Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Белковые маркеры в сортовой идентификации риса

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Белковые маркеры в сортовой идентификации риса"

На правах рукописи

ДУБИНА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

БЕЛКОВЫЕ МАРКЕРЫ В СОРТОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РИСА

/

Специальность 06.01.05- селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КРАСНОДАР 2003

Научный руководитель -

Официальные оппоненты-

доктор сельскохозяйственных наук В.С.Ковалев

доктор биологических наук Т.С.Антонова

кандидат сельскохозяйственных наук Е.В.Алексеенко

Ведущая организация - Краснодарский научно-

исследовательский институт сельского хозяйства им. ГШ. Лукьяненко

Защита состоится «_»_ 2003 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 006.026.01 при Всероссийском научно - исследовательском институте риса по адресу: ¡550921, г. Краснодар, п/о Белозерное

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно- исследовательского института риса

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Гончарова Ю. К.

2©озИ

^ ^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Современные сорта зерновых культур и в частности риса - это сложные сорта-популяции, которые обладают высокой пластичностью и адаптивностью, но их труднее сохранить в процессе семеноводства. В этой связи возникла необходимость разработки принципиально новых методов семеноводства. Перспективным направлением в решении этих проблем на рисе является использование в качестве генетических маркеров полиморфных запасных белков семян. У риса такими белками являются спирторастворимые проламины.

Выявление генетической внутрисортовой изменчивости у сортов самоопыляющихся культур на основе изоэлектрофоретического (ИЭФ) анализа запасных белков дает возможность поддерживать сорта в чистоте, сохраняя их генетический полиморфизм (34).

Кроме того, ИЭФ позволяет диагностировать скрытую краснозерность у зерновок риса с неокрашенным перикарпом, что является перспективным методом для практического применения. Принимая во внимание масштабность проблемы увеличения количества краснозерных фенокопий в производственных посевах риса, эта информация чрезвычайно важна при закладке семенных питомников. Семьи, в зерновках которых методом ИЭФ обнаружены зоны, специфичные для краснозерного риса должны быть элиминированы из дальнейшего размножения.

Вместе с тем, характеризуя этот метод сортовой идентификации, следует учитывать, что он ни в коей мере не умаляет значение других полевых и лабораторных методов идентификации сортовой принадлежности, а является ценным дополнением к ним.

Цель работы. Основной целью настоящего исследования было изучение полиморфизма проламинов зерновки российских сортов риса, в качестве генетических маркеров для сортовой идентификации и оценка перспективности ИЭФ (изоэлектрофокусирования) проламинов риса для диагностики феномена скрытой краснозерности.

Задачи исследований:

1. Составить эталлонные белковые формулы проламинов эндосперма зерновки риса, широко используемых в отечественном семеноводстве сортов.

2. Провести сортовую идентификацию отечественных сортов риса.

i рос. национальная"

i библиотека

I С.Петербург (ц.г

» оэ ант 77 у

3. Выявить биотипный состав сортов на основе ИЭФ- спектра проламинов риса.

4. Провести диагностику скрытой краснозерности сортов риса, с которыми ведется семеноводческая работа.

5. Определить приоритетные биотипы для каждого изученного сорта в условиях Краснодарского края.

Научная новизна. В рамках данного исследования впервые »

проведена паспортизация районированных в Краснодарском крае и Ростовской области сортов риса с привлечением методов молекулярного маркирования, определен их биотипный состав, выявлены биотипы, играющие первостепенную приспособительную роль в условиях Краснодарского края и Ростовской области. Составлены эталонные белковые формулы используемых в данной работе сортов.

Апробирование метода ИЭФ проламинов позволило впервые идентифицировать зону ИЭФ спектра, специфичную для краснозерных форм риса.

Практическая значимость. Эталонные белковые формулы сортов риса, используемых в данной работе, на основе ИЭФ анализа проламинов позволят контролировать сортовую чистоту риса, как в системе первичного семеноводства, так и в условиях производственного выращивания (посевов).

Выявление зоны ИЭФ спектра, специфичной для краснозерных форм, у зерновок с неокрашенным перикарпом служит хорошим диагностическим признаком для практического применения и позволяет контролировать чистоту питомников семеноводства, не допуская появления краснозерных форм, начиная с первичных звеньев семеноводства. Следовательно, можно говорить о внедрении новой маркерной системы, чрезвычайно важной для современного российского рисоводства, испытывающего немалые трудности, связанные с ростом процента засорения рисовых полей краснозерными формами.

Основные положения, вынесенные на защиту. Методом изоэлектрофокусирования проведена паспортизация районированных в Краснодарском крае и Ростовской области сортов риса. Составлены эталонные белковые формулы этих сортов.

Проведена кластеризация всех используемых в работе сортов по признаку генетического родства на основе сходства их ИЭФ - спектров.

Методом ИЭФ проламинов впервые идентифицирована зона ИЭФ I спектра, специфичная для краснозерных форм риса.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: заседаниях методической комиссии селекционного центра ВНИИ , риса (2000 -2002 г.г.); Ill съезде биохимического общества России

(Россия, г. Санкт- Петербург, 26. 06. - 1.07. 2002 г.); Международной научно - практической конференции «Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений» (Россия, г. Краснодар, ВНИИ БЗР, 1.06.2002 г.); Международном симпозиуме по генетическим ресурсам и селекции риса в Европе и странах с умеренным климатом (Краснодар, ВНИИ риса, 3 - 8.09.2001); Международной научной интернет- конференции (г. Ставрополь, СГАУ, июнь - август, 2002 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного тексту и состоит из введения, трех глав, выводов и предложений для селекции и семеноводства. Работа иллюстрирована 50 рисунками, 17 таблицами. Список литературы включает 144 наименования, в том числе 84-иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы. В этой главе собраны сведения о методах сортовой идентификации и регистрации культурных растений по белкам семян.

2. Материал, методика и условия проведения исследований.

Исследования на возможность использования полиморфизма запасных белков зерновки риса, в качестве генетических маркеров для сортовой идентификации и выявления биотипного состава проводили методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в полиакриламидном геле, с присутствием мочевины, амфолинов рН 3,5 - 10, рН 5 -8, рН 7-9, рН 9 -11, на приборе «Мультифор», по методике разработанной в ВИРе [Иванова Д. И., 1988; Иванова Д. И., 1980], на сортах Лидер, Спринт, Славянец, Курчанка, Хазар, Рапан, Лиман, Снежинка, Лагуна, Спальчик, Павловский, Изумруд, Нафант, Жемчуг; на выявление

скрытой краснозерности - триста семей сорта Рапан и триста семей сорта Лиман из П-1 (питомник испытания потомств первого года) и изогенные линии сорта Раздольный, полученные Донским селекцентром (г. Зерноград); анализ на сходство компонентного и число биотипного составов проводился на сортах Раздольный и Юпитер выращенных в условиях Краснодарского края и Пролетарска (Ростовской области).

Проламин извлекали из индивидуальных зерновок прямой экстракцией. Регистрацию компонентного состава ИЭФ - спектра проводили в соответствии с разработанной в ВИРе (Всероссийский институт растений имени Н.И. Вавилова) номенклатурой по отношению к реперным (R) компонентам сквозной нумерацией от старта в возрастающем порядке - от анода к катоду. Уточняли их позиции путем сопоставления с таковыми у образцов-анализаторов. Нами в качестве сортов- анализаторов использованы образцы к-1886 и к-5008, рекомендованные ВИРом. При этом интенсивные компоненты подчеркиваются снизу, слабые - сверху, как принято в номенклатуре глиадина [Конарев В. Г. Белки растений как генетические маркеры. М.-Колос.- 1983 г.- 320с.]. При составлении таблиц белковых формул используют трехбалльную оценку интенсивности полипептидов: 1 -слабый, 2 - средней интенсивности, 3 - интенсивный.

Для статистической обработки -полученных данных составляли матрицы, в которых присутствие позиций обозначали цифрой 1, отсутствие - цифрой 0. На основе этих матриц проведен кластерный анализ методами Ward, NJTree, UPGMA и Score, выполнена иерархическая классификация (дендрограмма).

3. Результаты исследований. 3. 1. Сортовая идентификация риса методом ИЭФ. С использованием запасных белков семян в качестве маркеров связаны практические достижения в идентификации и регистрации сортов важнейших сельскохозяйственных культур, в семеноводстве и семенном контроле, что закреплено в решении междунородной организации ISTA (Международная организация по тестированию качества семян).

3. 1. 1. Составление белковых формул сортов по спектрам проламина зерновки риса. Для идентификации и регистрации сортов и линий важно иметь унифицированную номенклатуру электрофоретических компонентов и рациональный способ записи электрофоретического спектра в виде белковой, или сортовой формулы.

По данным проведенного нами ИЭФ суммарный ИЭФ-спектр спирторастворимого белка используемых в работе сортов насчитывает от 37 до 50 компонентов, что позволяет провести сортовую дифференциацию.

По характеру их распределения в спектрах выделены 3 зоны: I -компоненты в позициях 29 - 44; II - компоненты в позициях 45 - 83 и III- 84- 123 [Иванова Д.И., 1983]. Зона I ввиду невысокого уровня фенотипического разнообразия и слабой интенсивности компонентов (к тому же следует отметить, что позиции некоторых из них трудно идентифицировать из-за подковообразной деформации) малопригодна для идентификации сортовой принадлежности анализируемых образцов. В зоне III из-за слабой интенсивности затруднена идентификация и регистрация компонентов катодной части зоны. Но компонентный состав зон I и III может служить дополнительной информацией при отсутствии различий между образцами в зоне II. Наиболее высоким уровнем фенотипического разнообразия отличается зона II. Она представляет наиболее специфичную часть ИЭФ спектра спирторастворимого белка и, следовательно, наиболее пригодную для различения сортов риса.

Компонентный состав анализируемых сортов записывался нами в виде белковых формул, включая в их состав компоненты проламинов зон II и III (рис 1).

При сравнительном изучении ИЭФ - спектров проламинов анализируемых сортов нами обнаружены общие для всех сортов компоненты: 60, 62, 70 и 82.

45

50 55 60 70

ти

47

49

V/// /1\ ..

54 56 62 64 66 68 72 74 75 78 80

В 49 54 56 62 64 66 68 72 74 75 78 80 82 С 889092

Рисунок 1 - Номенклатура и запись формулы спирторастворимого белка сорта риса Славянец

№ компонента ИЭФ-спектра

Ё а В* О

Э-

Я X

2 3

2 3

1 2

2 3

3 3

3 3

3 2

1 3

3 1

3 3

£

2 I

1 2 3

3 2

: 3 2

м

№ компонента ИЭФ-спектра

ОС о Tt о (N сг, un un «о «п ОС Ц-1 с VO (S ю с; VO ■ч- VD tr> \о VC VO г- 'С 00 43 о г- rs f- г- ? U-l г- г- ос г- о- о ОС X rv 00 ОС •ч-00 1Г1 ОС 00 00 ОС о 5 <N о- vt о- »л О1 с: с >у с

Павловский 3 2 г 3 2 3 1 1 3 3 1 2 1 3 3 2 3 3 2 2 3 3

Спальчик 3 2 3 3 3 2 3 3 1 2 3 2 3 2 3 1 3 3 3 2 3 3 3

Снежинка 3 2 1 3 2 3 3 3 2 3 2 3 2 3 3 1 3 2 3 2 3

Изумруд 3 1 3 2 2 3 3 1 3 3 2 1 3 2 2 2 3 3 3 2 3

Лиман 3 2 3 2 3 2 1 3 3 2 3 2 3 2 2 3 2 2 3 3 2 3

Нафант 3 3 2 2 3 2 3 3 2 2 3 3 3 2 3 3 2 1

Примечание: «+»- присутствие компонента, «-»- отсутствие компонента Как отмечалось ранее, Ивановой Д.И. выделены позиции компонентов специфичные на уровне подвидов: Rj 45, Rj 55 (для сортов O.sativa subsp.japonica) и Ri 52, Ri 54 (для сортов O.sativa subsp. indica). Присутствие в ИЭФ-спектре одного из двух компонентов у сорта, относящийся к подвиду indica (Ri 52 или Ri54) или japónica (R45 или R55) говорит о том, что сорт относится к промежуточному подвиду javanica. У сортов Лидер, Славянец, Павловский, Лиман, Спальчик, Нафант, Изумруд, Спринт, Жемчуг, Лагуна Курчанка, Хазар

обнаружены в ИЭФ- спектре компоненты R52 и R54, специфичные для сортов подвида indica и R45, R55- специфичные для сортов подвида japónica. Следовательно, эти сорта на основе ИЭФ анализа, можно отнести к промежуточному подвиду-javanica.

Таким образом, методом ИЭФ можно определить к какому подвиду относится сорт - O.sativa subsp.japonica, O.sativa subsp. Indica или -O.sativa subsp. javanica.

3.1. 2. Выявление биотипного состава проламинов зерновки риса при выращивании в условиях Краснодарского края. На генетическую однородность сорта оцениваются позерновым анализом случайных выборок из 100 зерен [Конарев В.Г., 1998 г.].

Изучение однородности анализируемых сортов при позерновом анализе позволило нам установить высокую степень их гетерогенности, так как при этом анализе сорта характеризуются присутствием большого числа вариантов спектра. Это разнообразие создается за счет общего числа компонентов, их различного сочетания, как в отдельных зонах, так и в целом спектре, а также за счет степени интенсивности одинаковых по электрофоретической подвижности компонентов.

Для выявления биотипного состава мы проанализировали по 300 индивидуальных зерновок каждого сорта. По результатам ИЭФ анализа нами выявлены основные по проламиновому спектру биотипы, которые являются приоритетными при выращивании этих сортов риса в условиях Краснодарского края.

У сорта Славянец (табл. 2, рис. 2) выявлено до 10 вариантов спектра с встречаемостью от 57% до 3%.

СЛЛПЯИГ.Ц

с.ч»вят:ц

Рисунок 2 - Биотипный состав сорта Славянец

Примечание: 1-1-й биотип, 2- 2-й биотип, 3- 3-й биотип, 4- 4-й биотип, 5- 5-й биотип, 6- 6-й биотип, 7- 7-й биотип, 8- 8-й биотип, 9- 9-й биотип, 10-10-й биотип; Б!- стандарт

40

Биотип № компонента ИЭФ- спектра

45 47 49 50 54 55 56 60 62 64 66 68 70 72 74 75 78 80 82 88 90 92

1 + + + + + + + 4. + + + + + + + + + + - - - -

2 + + + + + + - + + + + - + + + + + + + - + -

3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

4 + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - - -

5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - -

6 + + + + + + + + - - + + + + + + + + + - - -

7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + -

8 + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + +

9 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

10 + + + + + + + + - - + + + + + + + + + + + +

Примечание: «+»- присутствие компонента, «-»- отсутствие компонента Из анализа величин встречаемости вариантов спектра можно заключить, что сорт Славянец состоит из основного биотипа с встречаемостью 57% и 9 редко встречающихся биотипов: №2 с встречаемостью 9%; №3 - 7%; №4- 5%; №5- 4%; №6- 5%; №7- 4%; №8-3%; №9- 3%; №10- 3%.

У сорта Лиман (табл. 3, рис. 3) выявлено 4 варианта спектра с встречаемостью от 82% до 2%.

исунок 3 - Биотипный состав сорта Лиман

Примечание: 1- 1-й биотип, 2- 2-й биотип, 3- 3-й биотип, 4 - 4-й биотип Б!- стандарт

Биотип № компонента

45 48 50 52 55 57 58 60 62 63 65 66 70 73 74 75 77 78 82 85 87 90

1 + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + +

3 + + + - + - + + + + + + + + + + + + + + + +

4 + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Примечание: «+» - присутствие компонента, «-» - отсутствие компонента

Вариант спектра № 1 по величине всиречаемости является основным- 82%. Варианты спектра 2, 3 и 4- редко встречающимися с частотой встречаемости 11: 5: 2% соответственно.

У сорта Курчанка (табл. 4) выявлено три варианта спектра с встречаемостью от 83% до 4%.

Таблица 4 - Специфичность спектра спирторастворимых белков сорта Курчанка по наличию и отсутствию отдельных компонентов белка при позерновом анализе_

Биотип № компонента

45 50 55 57 60 62 65 67 70 72 74 75 77 78 81 85 88 95 100

1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + + + - + + + + + + + + + + + +

3 + + + + + + - - + + - + + + + + + + +

Примечание: «+» - присутствие компонента, «-» - отсутствие компонента

У сорта Курчанка вариант спектра №1 является основным с встречаемостью 83%. Варианты спектров 2 и 3- редко встречающимися с частотой встречаемости 13% и 4% соответственно.

У сорта Хазар (табл. 5) выявлено 4 варианта спектра с встречаемостью от 89% до 2 %.

а

Би № компонента

от ип 4 5 4 8 5 0 5 5 5 7 6 0 6 2 6 7 7 0 7 4 7 5 8 0 8 2 8 4 90

1 + + + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + + + - + + + + + + + +

3 + + + + + + + + + + + + + - +

4 + + + + + + + - + + + + + + +

Примечание: «+» - присутствие компонента, «-» - отсутствие компонента

По величине встречаемости вариант спектра №1 сорта Хазар является основным, с встречаемостью 89%, а варианты спектра №2, 3 и 4 - редко встречающимися - с частотой встречаемости в ИЭФ- спектре 6: 3: 2% соответственно.

У сорта Снежинка (табл. 6) выявлено 3 варианта спектра с встречаемостью от 86% до 5%.

Таблица 6 - Специфичность спектра спирторастворимых белков сорта Снежинка по наличию и отсутствию отдельных компонентов белка при позерновом анализе_

Биотип № компонента

45 47 49 50 57 60 62 65 67 70 73 74 75 77 80 83 85 87 95 97 100

1 + + + + + + 4- + + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + + 4- + + + + - + - + + + + + + + 4-

3 + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + +

Примечание: «+» - присутствие компонента, «-» - отсутствие компонента

Вариант спектра №1 сорта Снежинка является основным с встречаемостью 86 %. Варианты ИЭФ- спектра 2 и 3 с встречаемостью 9: 5% соответственно.

У сорта Нафант (табл. 7.) выявлено 3 варианта спектра с встречаемостью от 70% до 8%.

{Ь

Биотип . № компонента

45 50 52 54 55 58 60 62 67 68 70 71 75 78 80 82 84 86 105

1 + + + + + + + + - - + + + + + + + + +

2 + + - + + + + + - - + + + + + + + + +

3 + + + - + + + + + + + + + + + + + + +

Примечание: «+» - присутствие компонента, «-» - отсутствие компонента

Вариант спектра №1 является основным с частотой встречаемости 70%. Вариант спектра № 2 характеризуется отсутствием компонента 52, свойственного для подвида индика. Частота встречаемости его в спектре составляет 22%. Вариант спектра №3 характеризуется отсутствием компонента 54, свойственного для подвида индика и частота его встречаемости в спектре составляет 8%.

У сорта Лагуна (табл. 8) выявлено два биотипа с встречаемостью 79% и 21%, соответственно, которые характеризуются отсутствием компонента 45, свойственного для подвида японика.. Вариант спектра №1 является основным с частотой встречаемости 79%.

Таблица 8 - Специфичность спектра спирторастворимых белков сорта Лагуна по наличию и отсутствию отдельных компонентов белка при позерновом анализе_

Биотип № компонента

50 52 54 55 60 62 65 67 70 73 74 75 77 80 82 85 87 90

1 + + + + + + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + + + + + + + + + + + + - - +

Примечание: «+» - присутствие компонента, «-» - отсутствие компонента

У сорта Изумруд (табл. 9) выявлено два биотипа с встречаемостью 74% и 26%.

и

Биотип № компонента

45 47 50 52 60 62 67 70 72 78 79 80 81 83 86 87 90 92 96 97 100 105

1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

2 + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + +

Примечание: «+» - присутствие компонента,«-» - отсутствие компонента

Вариант спектра №1 сорта Изумруд является основным с встречаемостью 74%. Первый и второй варианты спектра характеризуются присутствием компонента 52, свойственного для подвида индика и отсутствием вспомогательного реперного компонента 55, свойственного для подвида японика.

Биотипное разнообразие проламинов отражает гетерогенность сортов риса по проламиновому составу, закрепленную отбором в ряду поколений в процессе селекции. Очевидно, такая гетерогенность связана с адаптивными способностями сортов, их экологической пластичностью.

Вопрос о количественном и качественном составе биотипов у сортов выращенных в различных эколого- географических зонах актуален, поскольку позволяет проследить, какие биотипы чаще встречаются в этих зонах.

Нами был проведен анализ на сходство компонентного и число биотипного составов сортов Раздольный и Юпитер, выращенных в условиях Пролетарска (Ростовской области) и Белозерного (Краснодарского края) (табл. 10, 12).

Таблица 10 - Биотипный состав сорта Раздольный, выращенного в разных эколого- географических условиях_

а X ¡3 X а Эколого-географическая зона выращивания № компонента

44 45 48 50 55 58 60 62 64 65 67 72 77 78 86 87 89 92 97

1 Краснодар + + + + + + + + - - + + + + + + + + ^

2 + + + + + - + + - - + + + + + + + + f

3 + + + + + - + - - + + + + + + + -

1 Пролетарок + + + + + + + + + + - + + + + + + ■ь 4-

2 + + + + + + + + - - - + + + + + + -

3 + + + + + + + + - - - + + + + + + ■ь ■1-

Iб

Эколого-географическая зона выращивания Биотип

1 2 3

% встречаемости биотипа в МЭФ- спектре

Краснодар 79 11 10

Пролетарск 82 12 6

Сорт Раздольный, выращенный в эколого- географических условиях Краснодара и Пролетарска (Ростовской области) отличается компонентным составом в ИЭФ- спектре и числу биотипов. Из фореграммы и таблицы мы видим, что у сорта Раздольный, выращенный в Ростовской области отсутствует компонент 67, а компонент 72 слабо выражен. ИЭФ- спектр ростовского Раздольного имеет 3 биотипа с встречаемостью 82%: 11%: 6% соответственно. В ИЭФ- спектре сорта Раздольный, выращенного в Краснодарском крае отсутствуют компоненты 64, 65 и в нем выявлено 3 биотипа с встречаемостью 19%: 11%: 10% соответственно.

Таблица 12 Биотипный состав сорта Юпитер, выращенного в разных эколого- географических условиях_

Эколого- № компонента

о к георгафическая зона 44 45 46 48 50 52 54 55 57 59 60 61 65 66 67 70 73 75

выращивания

1 Краснодар + + + + + + + + + + + + + + + - + +

2 + + + + + + + + + + + + + + + - - +

1 Пролетарск f + + + + - - + + + + + + + + + + +

2 + + + + + - - + + + + + + - + + + +

Примечание: «+» - присутствие компонента, «-» - отсутствие компонента

Из таблицы 11 видно, что компонентный состав ИЭФ- спектра сорта Юпитер различается по присутствию и отсутствию некоторых компонентов. Так, в ИЭФ- спектре сорта Юпитер, выращенного в почвенно- климатических условиях Ростовской области отсутствует компоненты 52, 54 и в ИЭФ- спектре выявлено 2 биотипа с встречаемостью 89% и 11%. В ИЭФ- спектре сорта Юпитер,

£

выращенного в Краснодарском крае отсутствует компонент 70 и в ИЭФ- спектре выявлено так же 2 биотипа с встречаемостью 77% и 23%. Таблица 13 - Частота встречаемости биотипов сорта Юпитер,

Эколого-географическая зона выращивания Биотип

1 2

% встречаемости биотипа в МЭФ- спектре

Краснодар 77 23

Пролетарск 89 11

Из таблиц 11, 13 видна реакция биотипного состава сортов при выращивании их в различных эколого- географических условиях, очевидно, как следствие адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды.

3.1.3. Кластеризация сортов риса. Нами проведена кластеризация используемых в работе сортов по признаку генетического родства на основе сходства их ИЭФ-спектров.

Для статистической обработки полученных данных составляли матрицы, в которых присутствие позиций обозначали цифой 1, отсутствие - цифрой 0. На основе этих матриц проведен кластерный анализ, выполнена иерархическая классификация (дендрограмма) (рис. 4). Дендрограммы построены на основе кластерного анализа

методами Ward, NJTree, UPGMA и Score позволяет разделить все сорта минимум на пять кластеров. Нами получена аналогичная кластеризация по результатам изучения этого же набора сортов ДНК (микросателлитными) маркерами.

—»Stall

—IS*?

—PGT"

Lr

-гЧЬ*

I—Ift-

<Pi«0 -•№»

■fi-is

r-vf—«ЯИ»

мн-:

iCZTsw"

C_

<SM

■G

•-ca,

<M

xj—'—|Ш —Iltal

_P . »Hte« ~-ittafl

Г»!—Ml T-iKirt

<M

.Si

Рисунок 4 - Дендгрограмма, иллюстрирующая генетическое родство между российскими сортами риса, построенная на основе изучения полиморфизма запасных белков зерновки методом NJTree

Примечание: SLAV- Славянец, SPR- Спринт, LID- Лидер, PAVL- Павловский, LAG-Лагуна, LIM-Лиман, KHAZ-Хазар, ZEM-Жемчуг, NAFANT-Нафант, RAP-Рапан, REGUL-Регул, SPAL-Спальчик, SNEZ-Снежинка, КШ-Курчанка

Таким образом, кластеризация всех изучаемых в работе сортов методами Ward, NJTree, UPGMA и Score, позволила разделить их минимум на пять кластеров.

3. 2. Изоэлектрофокусирование как диагностический метод выявление скрытой краснозериости. В отечественном семеноводстве риса одной из основных проблем является наличие краснозерных фенокопий. Краснозерные . формы имеют высокую осыпаемость, длительный период покоя высокую конкурентноспособность, что позволяет им вытеснять белозерные формы [Туманьян Н.Г., 2001 г.].

Данные, полученные лабораторией семеноводства и семеноведения ВНИИ риса, показывают, что каждый процент примеси красных зерен в семенах может снижать урожай на 1,5 - 2,3% [Комплексная система эффективных мер борьбы с краснозерными формами риса,-Методические рекомендации,- ВНИИ риса,- 1986 r.j. Растения этих форм легко поражаются пирикулярией и зачастую служат источником заболевания посевов, отрицательно влияя на продуктивность сортов.

Техническими требованиями к заготовляемому зерну риса ГОСТом 6293-68 установлены базисные критерии, ограничивающие содержание красных зерен до 2%. Между тем, в Краснодарском крае, например, засоренность товарного риса в 1976-1980 гг. составила 4,7%, за четыре последующие года - свыше 10,5%. На хлебоприемные пункты поступают отдельные партии риса с содержанием красных зерен до 25 -35%, что совершенно недопустимо. [Комплексная система эффективных мер борьбы с краснозерными формами риса, 1986 г.].

В связи с масштабностью, которую приобрела проблема краснозериости в последние годы, отечественное рисоводство остро нуждается в методах диагностики наличия краснозерных форм в посевах риса, позволяющих также предсказать и спрогнозировать появление краснозерных форм даже в потомстве растений с неокрашенным перикарпом зерновок. Для ее решения необходим комплексный научно-производственный подход, который предполагает глубокое знание генетических причин возникновения краснозериости. Особое значение здесь приобретает технология молекулярного маркирования. Очевидна необходимость поиска молекулярных маркеров, тесно сцепленных с генами, отвечающими за красную окраску перикарпа. В этой связи немалый интерес представляют белковые маркеры. Создание белковых маркеров, тесно сцепленных с комплексом признаков краснозериости, позволит проводить массовый

скрининг растений родоначальников семей во всех звеньях первичного семеноводства. Метод изоэлектрофокусирования (ЙЭФ) позволяет диагностировать скрытую краснозерность риса.

В составе изоэлектрофореграмм проламинов культурного риса различают 3 зоны.

Сравнительное изучение ИЭФ-спектров зерновок с окрашенным и неокрашенным перикарпом, всех сортов используемых в работе, позволило установить идентичность первой и второй зон ИЭФ-спектра проламинов. Главное отличие между ними - отсутствие III зоны у зерновок с окрашенным перикарпом (рис. 5, 6). То есть отсутствие в ИЭФ- спектре III зоны сцеплено с комплексом признаков краснозерности. Выявление такой зоны у зерновок с неокрашенным перикарпом в ИЭФ- спектре проламинов является хорошим диагностическим признаком для практического применения при выявлении скрытой краснозерности у растений родоначальников семей в первичных звеньях семеноводства.

Рисунок 5 - Сорт Лидер с окрашенным и неокрашенным перикарпом зерновки

Примечание: ЭТ- стандарт

сорт Спринт с окрашенным перикарпом

сорт Спринт с неокрашенным перикарпом

Рисунок 6 - Сорт Спринт с окрашенным и неокрашенным перикарпом зерновки

Примечание: ЗТ- стандарт

Кроме того, нами были проанализированы изогенные линии сорта Раздольный, различающиеся окраской перикарпа (рис. 7).

ЗОНА III

ЗОНА II

ЗОНА I

Изогенная линия сорта Раздольный (с окрашенным перикарпом)

Изогенная линия сорта Раздольный (с неокрашенным перикарпом)

Рисунок 7 - Изогенные линии сорта Раздольный с окрашенным и неокрашенным перикарпом зерновки риса Примечание: БТ- стандарт с неокрашенным перикарпом

Эксперимент на присутствие или отсутствие третьей зоны подтвердил ее отсутствие в ИЭФ-спектре у зерновок с окрашенным перикарпом.

и

Разработанная методика анализа была использована при проведении скрининга 300 семей сорта Рапан и 300 семей сорта Лиман (все зерновки были с неокрашенным перикарпом) из П-1 (питомник испытанная потомств первого года) на выявления феномена скрытой краснозернэсти. На основе ИЭФ- анализа проламинов у сорта Рапан выявлено 60, так называемых семей- риска, у которых в ИЭФ- спектре отсутствовала Ш зона и 32 семьи- риска у сорта Лиман. Эти семьи были элиминированы из последующих звеньев семеноводства и будут высеяны изолировано в полевых условия для подсчета процента краснозерных форм в семьях- риска и семьях контороля (рис 8, 9). Это позволит установить эффективность метода ИЭФ, как информативного для выявления скрытой краснозерности у зерновок с неокрашенным перикарпом при закладке питомников семеноводства для производства элиты.

Семья 15 сорта Ратш с нгокрапкнкым хкзшкярпом

Рисунок 8 - Семья 18 сорта Рапан с неокрашенным перикарпом Примечание: 6, 9, 10, 14, 21, 22, 23, 26- изоэлектрофоретические дорожки зерновок сорта Рапан с неокрашенным перикарпом, у которых отсутствует III зона; БТ- стандарт

1в1 1 6С 15« 16© 1«Т 1 6в 166 1 64 163 162 161 1вО 140 140 147 148 145 144 143 142 141 1 40

Рисунок 9 - Семьи сорта Лиман с неокрашенным пеоикаопом Примечание: 147, 148, 149 и 153 изоэлектрофоретические дорожки семей сорта Лиман с неокрашенным перикарпом, у которых отсутствует Ш зона

гг

Таким образом, ИЭФ-спектр первой и второй зон зерновок с неокрашенным перикарпом и их краснозерных фенокопий тестируемых сортов показал, что у зерновок обеих форм он идентичен. Главное отличие между ними - отсутствие П1 зоны у зерновок с окрашенным перикарпом.

ВЫВОДЫ

1. При сравнительном изучении отечественных сортов риса, методом ИЭФ, подтверждена полиморфная природа спирторастворимых белков зерновки риса.

2. Высокая степень внутривидового полиморфизма спирторастворимых белков зерновки обеспечивает специфичность их ИЭФ спектров и делает возможной идентификацию и регистрацию сортов риса по этим белкам.

3. При изучении ИЭФ - спектра проламинов анализируемых сортов нами обнаружены общие для всех сортов компоненты: 60, 62, 70, 75 и 82.

4. Методом изоэлектрофокусирования можно определить, к какому подвиду относится сорт - O.sativa subsp.japónica, O.sativa subsp. Indica или . O.sativa subsp. javanica.

5. Позерновой анализ открывает возможность изучения биотипного состава сортов и его динамики при выращивании в различных эколого-географических условиях. Биотипное разнообразие проламинов отражает гетерогенность сортов риса по проламиновому составу, закрепленную отбором в ряду поколений в процессе селекции.

6. Выращивание сортов в различных эколого- географических условиях отразилось на изменении соотношения частот встречаемости их биотипов.

7. Кластеризация изученных в работе сортов позволила позволила разделить их минимум на пять кластеров.

8. Метод изоэлектрофокусирование является эффективным для выявления феномена скрытой краснозерности. Апробирование метода ИЭФ проламинов позволило впервые идентифицировать зону ИЭФ спектра, специфичную для краснозерных форм риса. Выявление такой зоны у зерновок с неокрашенным перикарпом в ИЭФ- спектре проламинов является хорошим диагностическим признаком для

гъ

практического применения при выявлении скрытой краснозериости у растений родоначальников семей в первичных звеньях семеноводства. 9. Скрининг на выявление скрытой краснозериости 300 семей сорта Рапан и 300 семей сорта Лиман (все зерновки были с неокрашенным перикарпом) из П-1 (питомник испытанная потомств первого года) на основе ИЭФ- анализа проламинов позволил выявить у сорта Рапан 60, так называемых семей- риска, у которых в ИЭФ- спектре отсутствовала III зона и 32 семьи- риска у сорта Лиман.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Запасные спирторастворимые белки зерновки риса необходимо использовать в качестве генетических маркеров в селекционном и семеноводческом процессах и генетических исследованиях. Это повышает эффективность селекции и семеноводства. Метод изо: лектрофокусирования проламинов зерновки риса позволяет выявлять наличие в изоэлектрофоретическом спектре зоны специфичные для краснозерных форм даже у растений с неокрашенным перикарпом зерновки и тем самым элиминировать эти растения из дальнейшего размножения. Поэтому мы рекомендуем использовать ИЭФ в первичных звеньях семеноводства риса, что позволит более качественно контролировать чистоту семян. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кругликова Е. В. (Дубина Е. В.) Белковые маркеры в соротовой идентификации риса. III съезд биохимического общества России,- СПб, 2002,-С. 40- 43.

2. Кругликова Е. В. Изоэлектрофокусирование как диагностический метод выявления скрытой краснозериости риса. Научно-производственный журнал «Рисоводство»,- Краснодар, 2002,- №2,- С. 40- 43.

2. Кругликова Е. В., Мухина Ж.М. Сортовая идентификация риса с использованием белковых маркеров. Материалы Международной научной интернет- конференции,- Ставрополь, 2002,- С. 122- 127.

3. Кругликова Е. В., Мухина Ж.М., Ковалев B.C. Апробация метода изоэлектрофокусирования применительно к отечественным сортам риса. Научно- производственный журнал «Рисоводство».-Краснодар, 2002,-№1.- С. 21-22.

4. Мухина Ж.М., Супрун И.И., Кругликова Е.В. Молекулярное маркирование генетической плазмы риса на основе полиморфизма проламинов. Международная научно- практическая конференция

«Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений»,- Краснодар, 2002. - С. 238-241.

6. Кругликова Е. В., Мухина Ж.М., Ковалев B.C. Проламин зерновки риса и его использование в селекции и семеноводстве. Научно-производственный журнал «Рисоводство».- Краснодар, 2002.- №2.- С. 44- 49.

7. Kruglikova Е, Mukhina Z, Vlasov V. The usage of prolamin storige proteins polimorphism for identification and estimation of rice cultivars purity. Proceedings of Eurorice 2001 Symposium.- Krasnodar, Russia, 2001.

8. Kruglikova E, Mukhina Z, Vlasov V., Kovalyov V. Polymorphism of prolamines of rice variety kernels, widely used in seed production and storage of proteins formula. Proceedings of Eurorice 2001 Symposium. -Krasnodar, Russia, 2001.

»

<

о

Лицензия ИД 02334 14.07.2000.

Подписано в печать02.06. 2003г. Формат 60x84

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ.л. 1,0 Заказ № 329 Тираж 100

Отпечатано в типографии КубГАУ. 350044, Краснодар, Калинина, 13.

So

\\\4[

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дубина, Елена Викторовна

ВВЕДЕНИЕ '

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1 Понятие молекулярного маркера

1.1.1 Белковые маркеры сельскохозяйственных культур

1.1.2 Запасные белки злаков как маркеры 13 1. 1. 3 Виды запасных белков

1.1.4 Проламины и их свойства

1.1.5 Проламины зерновки риса 21 1.2 История изучения белковых систем растений электрофоретическими методами ; '

1. 3 Методы исследования белковых систем

1. 3. 1 Электрофорез как метод сортовой идентификации т 1.3.2 Иммунохимические методы исследования белковых систем

1. 3. 3 Изоэлектрофокусирование как наиболее информативный метод изучения полиморфизма проламинов риса на уровне сорта

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2. 1 Материал исследований

2.2 Методы исследований. '

2.2. 1 Методика изоэлектрофокусирования '

• 2.2.2 Методика вертикального электрофореза (одномерного) в кислом (ацетатном, рН 3,1) буфере

2.2.3 Методика вертикального одномерного ЭБЭ - электрофореза

2.3 Математическая обработка данных

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ: РЕЗУЛЬТАТЫ ОПЫТОВ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Сортовая идентификация риса методом изоэлектрофокусированием

3. 1. 1 Составление белковых формул сортов риса по спектрам спирторастворимых белков (проламинов) зерновки

3.1.2 Выявление биотипного состава проламинов зерновки риса методом ИЭФ сортов выращенных в условиях Краснодарского края

3. 2. Составление эталонных белковых формул сортов риса по спектрам общего белка зерновки методом электрофореза (одномерного) в кислом (ацетатном, рН 3,2) буфере

3. 3 Сортовая идентификация риса методом БОБ-электрофореза (одномерного)

3. 4 Расчет экономически выгодного электрофоретического метода для проведения сортовой идентификации риса

3. 5 Электрофоретические методы в выявлении зависимости между признаками «структура запасных белков» и «окрашенный перикарп» "

3.6 Кластеризация сортов риса '

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Белковые маркеры в сортовой идентификации риса"

Рис занимает значительное место среди возделываемых сельскохозяйственных культур в России и является самой стабильной по урожайности зерновой культурой. Промышленная реализация потенциала сорта риса возможна только при условиях высоких посевных и сортовых качеств семенного материала риса. Получение чистосортных семян - залог хорошего урожая. Для их получения разработана специальная система семеноводства, позволяющая эффективно бороться с сортовыми примесями. Однако, в последнее время, при возделывании риса высокую актуальность приобрела проблема краснозерных форм, особенно фенокопий районированных сортов риса в производственных и семеноводческих посевах, которые не обнаруживаются при сортовых прополках. Информацию о ней можно получить, используя методы молекулярного маркирования. Перспективным методом в решении этих проблем многих сельскохозяйственных культур является использование в качестве генетических маркеров полиморфных запасных белков семян [Конарев, 1983; Созинов, 1985].

В ответ на изменяющиеся условия окружающей среды Запасные белки злаков претерпевают минимальные изменения по сравнению с другими белковыми системами (ферменты) [Иванова, 1983; Иванова, 1987; Конарев, 1983; Конарев В.Г., 1998; Созинов, 1985].

Электрофоретический анализ белков семян различных сельскохозяйственных культур в связи с проблемами селекции, семеноводства и семенного контроля показал возможность идентифицировать сорта, линии, биотипы по белковому фенотипу; оценивать чистоту и подлинность сорта, генотипическую структуру естественных и сортовых популяций и регистрировать их в виде белковых формул [Созинов, 1985].

На основании данных литературы [Hibino, 1989; Kim, 1988; Masumura, 1989] и результатов собственных исследований высокой разрешающей способностью среди электрофоретических методов, которые позволяют проводить сортовую дифференциацию Oryza sativa L. запасных белков семян обладают изоэлектрофокусирование (ИЭФ), электрофорез (одномерный) в кислом (рН 3,1) буфере. Эти методы позволяют идентифицировать морфологически неразличимые биотипы запасных белков семян, выделять их и поддерживать исходный состав сорта в процессе семеноводства.

Вместе с тем, характеризуя эти методы сортовой идентификации, следует учитывать, что они ни в коей мере не умаляют значение других полевых и лабораторных методов идентификации сортовой принадлежности, а являются ценным дополнением к ним.

Данные, полученные лабораторией семеноводства и семеноведения ВНИИ риса, показывают, что .каждый процент примеси красных зерен в семенах снижает урожай на 1,5 - 2,3%. [Методические рекомендации, ВНИИ риса,-2002 г.]. Растения этих форм легко поражаются пирикулярией и зачастую служат источником заболевания районированных сортов, отрицательно влияя на продуктивность сортов и значительно ухудшают качество крупы.

Ввиду высокой актуальности проблемы засоренности производственных посевов риса краснозерными формами для ее решения необходим комплексный научно-производственный подход, который предполагает глубокое знание генетических причин возникновения краснозерности. Особое значение здесь приобретает технология молекулярного маркирования. Создание белковых маркеров, тесно сцепленных с признаком «окрашенный перикарп», позволит проводить массовый скрининг растений- родоначальников семей в первичном семеноводстве, повысив эффективность контроля краснозерной примеси.

Основной целью настоящего исследования является изучение полиморфизма запасных белков зерновки российских сортов риса электрофоретическими методами для использования этих белков в качестве генетических маркеров в сортовой идентификации и разработать оптимальную систему сортовой идентификации и оценки сортовой чистоты на основе электрофоретических методов запасных белков семян. '

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Провести эмпирический поиск оптимальной и дешевой электрофоретической методики, основанной на изучении полиморфизма запасных белков зерновки для идентификации российских сортов риса. 2. Составить эталонные белковые формулы сортов pиca^ с которыми ведется семеноводческая работа в Краснодарском крае.

3. Выявить биотипный состав проламинов зерновки сортов риса методом ИЭФ.

4. Изучить зависимость между признаками «структура запасных белков» и «окраска перикарпа зерновки».

Научная новизна. При изучении полиморфизма запасных белков зерновки риса электрофоретическими методами [ИЭФ, одномерный БОБ- электрофорез и электрофорез (одномерный) в кислом (ацететном, рН 3,2) буфере] найден оптимальный наиболее дешевый метод сортовой идентификации риса -одномерный электрофорез.в кислом (рН 3,2) буфере. '

В рамках данного исследования впервые проведена паспортизация районированных в Краснодарском крае сортов риса с привлечением методов молекулярного маркирования, определен биотипный состав проламинов зерновки этих сортов методом ИЭФ. Составлены эталонные белковые формулы изученных в данной работе сортов методами ИЭФ и электрофореза (одномерного) в кислом (ацетатном, рН 3,1) буфере.

Апробирование методов ИЭФ и электрофореза в кислом (рН 3,2) буфере запасных белков позволило впервые идентифицировать зону ИЭФ-спектра проламинов зерновки и зону ЭФ- спектра общего белка ((электрофорез в кислом буфере), специфичную для краснозерных форм риса:

Практическая значимость. Эталонные белковые формулы используемых в данной работе сортов риса на основе ИЭФ-анализа и электрофореза в кислом буфере запасных белков зерновки позволят контролировать сортовую чистоту риса, как в системе первичного семеноводства, так и в условиях производственного выращивания (посевов).

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: заседаниях методической комиссии селекционного центра ВНИИ риса (2000 -2003 г.г.); 111 съезде биохимического общества России (Россия, г. Санкт-Петербург, 26. 06. - 1.07. 2003 г.); Международной научно - практической конференции «Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений» (Россия, г. Краснодар, ВНИИ БЗР, 1.06, 2002 г.); Международном симпозиуме по генетическим ресурсам и селекции риса в Европе и странах с умеренным климатом (Краснодар, ВНИИ риса, 3 — 8.09.2001); Международной научной интернет- конференции (г. Ставрополь, СГАУ, июнь - август, 2002 г.).

Публикации. По материалам представленной работы опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, выводов и предложений для селекции и семеноводства. Работа иллюстрирована 59 рисунками, 16 таблицами. Список литературы включает 144 наименования, в том числе 81 -иностранных авторов. '

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Дубина, Елена Викторовна

выводы

1. Подтверждена полиморфная природа спирторастворимых белков зерновки риса у отечественных сортов риса при сравнительном изучении их методами изоэлектрофокусированием и электрофорезом в кислом (рН 3,2) буфере.

2. Показана возможность идентификации сортов риса на основе высокой степени внутривидового полиморфизма спирторастворимых белков зерновки по специфичности их ИЭФ спектров и общего белка по специфичности электрофоретического спектра методом электрофореза в кислом (рН 3,2) буфере.

3. Найдена оптимальная экономически выгодная система сортовой идентификации риса на основе электрофореза запасных белков зерновки в кислом (рН 3,2) буфере.

4. Составлены эталонные белковые формулы проламинов (методом ИЭФ) и общего белка (методом электрофореза в кислом буфере) зерновки сортов, районированных в Краснодарском крае.

5. Установлено, что все изученные в данной работе сорта, на основе ИЭФ — анализа проламинов зерновки, совмещают в себе белковые признаки обоих подвидов indica и japónica, независимо от подвидовой принадлежности по морфологическим признакам.

6. Установлено, что изученные сорта риса гетерогенны по составу проламинов. Определены преобладающие биотипы для каждого изученного сорта в условиях Краснодарского края.

7. Впервые методами изоэлектрофокусирования и электрофорезом в кислом буфере идентифицированы зоны спектра запасных белков зерновки специфичные для краснозерных форм риса

8. Установлена зависимость между признаками «окраска перикарпа» и «состав проламинов» по результатам ИЭФ и электрофореза в кислом (рН 3,2) буфере, проведенных на сортах селекции ВНИИ риса и их краснозерных «фенокопиях».

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Использовать эталонные белковые формулы сортов риса для оценки сортовой чистоты в системе первичного семеноводства и производственных посевах.

Использовать полиморфизм запасных белков зерновки для маркирования агрономически важных признаков.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Дубина, Елена Викторовна, Краснодар

1. Алексеенко А. Ю., Сичкарь В. И., Тимохина Е. А. и др. Консервативность субъединичного состава глицинина у разных образцов сои культурной и дикой уссурийской // Генетика.- 1985. XXI.-№7.-С. 1185-1191.

2. Алексеенко А. Ю., Седова Т. С., Николаев И. В. и др. Полиморфизм запасных белков многолетней сои подрода Glycine // Генетика.- 1987. XXIII.-№ 1.-С. 135- 142. ' ,- «

3. Аверкина Р. Ф. Приготовление антигенов и получение иммуносывороток / В кн. лабораторные методы исследования в неинфекционной иммунологии. М., 1967.- С. 55 — 56.

4. Баранов О. К. Иммунохимический анализ эволюции белков. //Усп. совр. биол., 1972.- № 4 (6).- С. 420 438.

5. Барнаков Н. В. Научные основы семеноводства зерновых культур. Новосибирск, 1982.- 249с.

6. Вавилов Н. И. Селекция как наука/ Избран, произ. Л., 1967.- Т. 1.- С. 328 -342.- «

7. Вальков В. Ф., Штомпель Ю. А., Трубилйн И. Т, Котляров Н. С., Соляник Г. М. Рисовые почвы // В кн. почвы Краснодарского края их использование и охрана.- Ростов — на Дону, 1996.- 344с.

8. Войлоков А. В. Генетический контроль изоферментов высших растений// Успехи современной генетики.- 1978.- Т. 4.- С. 150 — 170.

9. Гаврилюк И. П., Губарева Н. К., Конарев В .Г. Выделение, фракционирование и идентификация белков, используемых в геномном анализе культурных растений //. Тр. по прикл бот., ген. и сел.- 1973. № 1.- С. 249-281. /

10. Гусев А. Н., Цветков В. С. К технике постановки реакции преципитации в агаре // Лабораторное дело.- 1961.- №2.- С. 43 45.

11. Доспехов Б. А. Планирование полевого опыта и статистическая обработка его данных.- М.: Колос, 1972.- 207с.

12. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта (с осйовами статистической обработки результатов исследований). — 5-é изд., доп. и перераб. М.: Агропромиздат, 1985.-351с.

13. Журбицкий 3. И. Теория и практика вегетационного опыта.- М.: Наука, 1968.- 260 с.

14. Иванов Н. Н Проблема белка в растениеводстве. М., 1947.- 112с.

15. Иванова Д. И. Иммунохимическое изучение водо солерастворимых белков зерновки риса в связи с вопросами эволюции и таксономии культурных видов рода Oryza L. // Тр. по прикл. бот., ген. и сел.- 1979. № 3.-С. 135-144. • '

16. Иванова Д. И. Идентификация генома А у 'представителей рода Oryza по белкам зерновки // Вестн. с. — х. науки,- 1980. №9.- С. 63 — 67.

17. Иванова Д. И. Подвидовая дифференциация Oryza sativa L. по результатам иммунохимического анализа белков зерна // С. — х. биология, 1980. XV.- №6.- С. 874 877.

18. Иванова Д.И. Полиморфизм спирторастворимого белка зерновки риса и перспективы его использование в оценке внутривидового разнообразия Oryza sativa L. // С. х. биолошя.- 1983. №4.- С. 41 - 45.

19. Иванова Д. И. Идентификация геномов, субгеногЛов и подвидов риса по белкам зерновки // С. х. биология.- 1986. №7,- С. 3- 9.

20. Иванова Д. И. Идентификация геномов, субгеномов и подвидов риса по водорастворимым белкам зерновки // С.-х. биология.- 1987а. №2.- С.27-34.

21. Иванова Д. И. Идентификация геномов, субгеномов и подвидов риса по щелочерастворимым белкам зерновки // С.-х. биология.- 1987в. №3.-С. 13- 18.

22. Иванова Д. И. Полипептидный состав проламина и глютелина в изучении генофонда культурного риса // С. — х. биология.- 1992. №3.- С.71.79. ' ' 'i

23. Иванова Д.И. Идентификация и регистрация сортов риса по спирторастворимым белкам зерновки // Метод, указ.- С Пб, 2000.- С. 90-97.

24. Иванова Д. И., Репьев С. И. Глобулины зерновки риса и подвидовая дифференциация Oryza sativa L. // Физиол. и биохим. культ, раст.- 1981.Т. 13.-С. 394-398.

25. Имшенецкий Е.И. Сравнительное изучение белков зерна пленчатых и голозерных сортов ячменя. // Науч. техн. бюл. ВСТИ.- 1971. Вып. 15.1. С. 66-67. ' 'i

26. Комплексная система эффективных мер борьбы с краснозерными формами риса / Рекомендации. Краснодар, 1986.- 18 с.

27. Конарев В.Г. Н.И. Вавилов и проблема биохимической генетики растений // Н.И. Вавилов и сельскохозяйственная наука.- М.: Колос, 1969. С. 252-261.

28. Конарев В.Г. Белки, нуклеиновые кислоты и проблемы прикладной ботаники, генетики и селекции // Тр. по прикл. бот., ген. и сел.- 1973а. Т. 52.- вып. 1.- С. 4 — 28.

29. Конарев В.Г. Принцип белковых маркеров в' геномном анализе иiсортовой идентификации пшеницы // Тр. по прикл. бот., ген. и сел.-19736. Т. 49.- вып. 3.- С. 46 58.

30. Конарев В.Г. Проблема пищевой и кормовой ценности растительных белков / Растительные белки и их биосинтез. -М.: Наука, 1975.- С. 5 -20.

31. Конарев В.Г., Гаврилюк И.П. Принцип белковых маркеров и его использование в анализе исходного и селекционного материала, сортовой идентификации и регистрации растительных ресурсов // С. — х. биология.- 1977. №5.- С. 677 684.

32. Конарев В.Г Белки пшеницы,- М, 1980.- 350 с.

33. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983.- 245 с.

34. Конарев В.Г. Морфогенез и молекулярно — биологический анализ растений. С Пб; 1998.- 357 с. '

35. Конарев В.Г. Молекулярно — биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе (1967 1997). С-Пб, 1998.- 298 с.

36. Конарев A.B. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // С. х. биология.- 1998. №5.- С. 3 — 24.

37. Конарев В.Г. Белковые маркеры в сортовой идентификации и регистрации генофонда культурных растений / Метод, указ.- С. — Пб., 2000.- 182 с.

38. Конарев В.Г., Гаврилюк И.П., Губарева Н.К/, Пенева T.PJ. Белки растений как генетические маркеры в решении проблем прикладной ботанике, генетики и селекции // Вест. с. — х. науки.- 1986. №12.- С. 45 — 50.

39. Кочетков Е.А. Определение подлинности семян пшеницы лабораторным методом // Тр. по прикл. бот., ген. и сел.- 1971. Т. 44.-вып.З.-С 5-49.

40. Корочкин Л.И. Простой ультромикрометод электрофоретического разделения в полиакриламидном геле белков и изоферментов из изолированных клеток//Цитология.- 1972. Т. 14.-'№5.- С. 670 — 674.

41. Маурер Т. Диск электрофорез. М.: Мир, 1971.- 247с.

42. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян // Методические указания.- С- Пб, 2000.- 220 с.

43. Молекулярно — биологические аспекты прикладной ботаники, ^генетики и селекции / В сб. теоретические основы селекции.- М., 1993. 116 с.

44. Мосина С.Б., Иванова Д.И. Генетически детерминированный полиморфизм проламинов зерновки высокопродуктивных сортов риса и их белковые формулы // Научные основы современной технологии возделывания риса.- Кранснодар, 1991. С. 9 — 27.

45. Н.И Вавилов и сельскохозяйственная наука. М.: Колос., 1969.- С: 252 — 260.

46. Основные морфологические и апробационные признаки сортов и гибридов зерновых, зернобобовых, крупяных и' масличных растений. Краснодар: Советская Кубань, 2000.- 512 с.

47. Особенности агротехники новых сортов риса (рекомендации). — Краснодар, 2000.- 15 с.

48. Перуанский Ю. В., Савич И. М. Способ распознования генотипов риса // Авторское свидетельство СССР № 1164274, 1990.

49. Перуанский Ю. В., Савич И. М. Доклады ВАСНИЛ, 1990. № 4.- С. 2024.

50. Ракипов Н.Г. Биохимическая характеристика белков зерна высоколизинового ячменя хайпроли возделываемых сортов // Двтореф. дис. канд. биол. наук. М.: ТСХА, 1975.- 17с.

51. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение. М.: Мир, 1986.- 398 с.

52. Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. Методы и применение. М.: 1977.- С. 57 77, 89 - 102.

53. Савич И.М. Состав проламина зерна риса // Физиол. и биохим. культурных раст.- 1980. № 12,- С. 404 408.

54. Сафанов В.И., Сафанова М.П. Исследование белков и ферментов растений методом электорофореза в полиакриламидном геле // В кн. Биохимические методы в физиологии растений.- М.: Наука, 1971.- С. 113-136.

55. Серов O.JI. Генетика изозимов.- Генетика.- 1968.- Т. 4.- №10.- С. 134 —145. ' .i

56. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М.: Наука, 1985.- 245с.

57. Стрельченко П.П. Внеклеточный синтез как один из подходов к изучению генетической системы запасных белков пшеницы // Тр. по прикл. бот. ген. и сел.- 1981.- Т. 70.- вып.2.- С. 48 52.

58. Титов А.Ф. Генетика растительных изоферментов // Успехи современной биологии.- 1978.- Т. 85.- №3.- С. 325 339.

59. Туманьян Н.Г. Теория краснозерности риса.- Краснодар, 2001.- 95 с.

60. Шиловский В.Н., Харитонов Е.М., Шеуджен А.Х. Селекция и сорта риса на Кубани. -Майкоп, 2001.- 34 с.Яаска В.Э. Изоферменты как молекулярно- генетические маркеры в селекции растений. Институтзоологии и ботаники АН ЭССР, Тарту, 1977.- С. 251 266.

61. Autran J.A., Bourdet A.L. L' identification des varieties • de ble: Establissement d' un tableau general de determination fonde sur le diagramme electrophoretique des gliadines du grain // Ann. Amelior. Plant.-1975.- Vol. 25.- P. 277-301.

62. Belitz H.D., Lynen F. Proteolitic activity of wheat // Chem., Vikrobiol., technol. Lebensm.- 1974.- Vol. 3.- P. 60 64.

63. Biez J.A., Wall J.S. Wheat gluten subunits: Molecular weights determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis // Cereal chem.- 1972.-Vol. 49.- P. 416-430.

64. Bietz J.A., Huebner F.R. Structure of glutenin: Achievement at the northern regional research center.// Ann. Technol. Agr.- 1980.- Vol. 29.- P. 249 277.

65. Biochemical identication of varieties// Materials III Inter. Symp. ISTA.-Leningrad, USSR 1988.- 258 P.

66. Bushuk W., Zillman R.R. Wheat cultivar identification by gliadin electrophoregrams. Apparaus, method and nomenclature // CanadJ. Plant Sci.- 1978.-Vol. 58.- P. 505-515.

67. Chen L.F.O., Chen L.C. Interitance of two endosperm protein loci in rice (Oryza sativa L.) // Theor. Appl. Genet.- 1989.- Vol. 6.- P. 788 792.

68. Consden R., Gordon A.H., Martin A.J.P. Ioniphoresis in silica jelly: A methods for the separetion of amino acids and peptides // Biochem. J.-1946.-3 40.- P. 33-41.

69. Cooke R.J. The characterization and identification of crop cultivars by electriphoresis// Electrlphoresis.- 1984.- Vol. 5.- P. 59 72.

70. Du Cros D.L., Wrigley C.W. Identificaton of recently registered wheat cultivars I I J. Austral. Inst. Agr. Sci.- 1978.- Vol. 44.- P. 125 128.

71. Enari T. Composition of albumins and globulins of barley // Cfereal Sci. Today.- 1965.- Vol. 10.- P. 594 597.

72. Ewart J.A.D. Further studies on SS bonds in cereal glutenins // J. Sci. Food and Agr.- 1972. Vol. 323.- P. 567 579.

73. Feillet P., Bourdet A. Isoelement par chromatographic sur DEAE cellulose et electrophorese preparative d' une albumine du electrophoretequement homogene // C.r. Acod. Sci. D.- 1968a.- Vol. 266.- P. 2237 - 2239.

74. Feillet P., Bardet A. Les proteins solubles du ble. 1. Isolement at caracherisation des albumines et des globulines // Ann. technol. agr.- 1968b.-Vol. 17.-P. 217-225.

75. Fish W.W., Abott D.C. Isolation and characterization of a watersoluble wheat protein // J. Sci. Food and Agr.- 1969.- Vol 20.- P. 723 730.

76. Foster J.F., Yang J.T., Yui N.M. Extraction and electrophoretic analysis of protein of corn // Cereal chem.- 1950.- Vol 27.- P. 477 487.

77. Fulgiuolo G., Spaynoletti Z. Assesting durum wheat genetic diversity using nonparametric metrhods. Genetic resources and Crop Evolution.- 1987 (in press).

78. Hayward m.D., Balls T. Isozyme polimorphism in natural populations of lolium perenne // Rep. Welsh plant Breed Sta.- 1978.- P. 43 45.

79. Hibiko K., Kizu T. Amino asid composition of rice prolamin polypeptides// Agr. Biol. Chem.- 1989.- Vol 53.- P. 513 518

80. Hieb S.V. Amylase isoenzymes in seeding of Avena and Oiyza sativa L. // C. r. Acad. Bulg. Sci.- 1973.- Vol 21.- P. 117 120. ^• *

81. Hintum Th., Hodgkin Т. Applying molecular markers to ex sitti collection // New letter for Europe.- IPGRI, 1997.- Vol 12.- P. 4.

82. Hitpshi S., Eizo M. Характеристика и сортовые различия изозимов а -амилазы в тканях каллуса риса // Proc. Crop. Sei. Soc. Jap.- 1973.- Vol 42.-P. 307-314.I

83. Holmcomb J., Tolbert D.M., Jain S.K. A diversity analisis of genetic resources in rice // Euphytica, 1977.- Vol. 26.- P. 441 450.

84. Hussein K.R.F., Stegamann H. Comparison of proteins from wheat kernels by various electrophoretic methods in Polyacrylamide // Ztschr. Acker Pflanzenbau.-1978.- Vol. 146.- P. 68 78.I

85. Ingversen J., Koie В., Doll H. Induced seed protein mutant öf barley// Experientra.- 1973.- Vol. 29.- P. 1151 1152.

86. Jaaska V., Jaaska V. Isoenzymes of arimatic alcohol dehydrogenase in rye and triticale // Biochem. Und Physiol. Pflanz.- 1984.- vol.1.- P. 21 30.

87. Jamagata H., Tamura K., e.a. Cell free synthesis of rice prolamin //. Plant Cell Physion.- 1986a.- Vol.27.- P. 1419 - 1422.

88. Jamagata H., Sugimobo Т., Tanaka K. e.a. Biosynthesis of storage proteins in developing rice seed. -Plant Physiol.- 1982.- Vol.70.- P. 1094-1100.

89. Johnson B.L. Confirmation of the genjme donors of Aegilops CylindricalI

90. Nature.- 1967.-Vol. 216.-P. 859-862.

91. Johnson B.L. Protein electrophoretic profiles and the origin of the В genome of wheat // Proc. Nat. Acod. Sei., USA.- 1972.- Vol. 69.- P.1398 1402.

92. Johnson B.L. Identificational of the apparent В genome donor of wheat // Can. J. Genet. Cytol.- 1975.- vol. 17,1.- P. 21 - 39.

93. Karp A., Edwards K. Molecular techniques in the analysis of the extent and distribution of genetic diversity. Molecular genetic techniques for plant genetic resources.- Report of an IPGRI.- Italy, 1997.- P. 11 22.

94. Kennedy S.J., Gardiner S.J., Gilliland T.J. e.a. the use of electrophoretic techniques to distinguish perennial ryegrass cultivars when sown in mixtures //J. gric.Sci.- 1985.-vol.104.-P. 1-9.

95. Kim T.K., Okita T.W. Structure, expression and heterogeneity of the riceseed prolamines //. Plant Physiol.- 1988.- Vol. 88.- P. 649 655.i

96. Konarev A.V., Vvedenskaya I.O., Nasonova E.A., e.a. Use of prolamine polymorphism in studing genetic resources of forage grasses // Genetic resources and Crop Evolution, 1995.- Vol. 42.- P. 197 209.

97. Koundal K.R., Sidding E.A., Mehta S.L. Changes in soluble proteins and isoenzymes in rice (O. sativa) during germination // Indian J. Exp. Biol.-1977.- Vol. 15.- P. 388-390.

98. Kreis M., Shewry P.R., Forde B.G., Miflin B.J. Structure and evolution of seed storage proteins and their genes with particular reference to those of wheat, barley and rye // Oxford surveys of plant molecular and biology.-1985.-Vol. 2.-P. 253-317. '

99. Kreis M., Shewry P.R., Forde B.G., e.a. Structure and evolution of seed storage proteins and their genes with particular reference to those of whrat, barley and rye // Oxford. Surv. of plant md. and cell boil.- 1985.- Vol. 2.- P. 253-315.

100. Kresovich S., Mc Ferson J., Westman A. Using molecular markers in genbanks: identity, duplication, contamination and regeneration // Molecular genetic techniques for plant genetic resources. Report of an IPGRI. Rome, Italy, 1997.-P. 23-38.i

101. Kumamaru T., Saton H., Iwata N. e.a. Mutans for rice storage proteins. I. Screening of mutans for rice storage proteins of protein bodies in the starch endosperm // Theor. Appl. Genet.- 1988.- Vol. 7;6.- P. 11 16.

102. Kumamuru T., Saton H., Omura T. e.a. Mutans for rice storage proteins. IV. Mamernally inhevited mutants for storage proteins of protein bodies in the starchy endosperm // Heredity.- 1990.- Vol. 64.- P.9 15.

103. Laemly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.- 1970.- Vol. 227.- P. 680 685.

104. Lawrence G.I., Shepherd K.W. Variation in glutenin protein subunits of wheat // Austral. J. Biol. Sci.- 1980.- Vol. 33.- P. 221 233.

105. Luthe D.S. Storage protein accumulation in developing rice (Oryza sativa L.) seeds // Plant sci. Let.- 1983.- Vol. 32.;- P. 1 2, 147 - 153.

106. Mandae B.E., Juliano B.O. Properties of prolamine in mature and developing rice grain // Phytochemistry.- 1978.- Vol.17.- P.611-614.

107. Markert C.L., Moller F. Multiple forms of enzymes: Tissue, ontogenetic and species patterns // Proc. Nat. Acad. Sci. Us.- 1959.- Vol.45.- P. 753 -763.

108. Masumura T., Shibata D., Hibino T. e.a. CDNA coining of an mRNA encoding a sulphur rich 10 kD prolamin polypeptide in rice seeds // Plant Molec. Biol.- 1989.- Vol.12.- P.*123 - 130.i

109. Mazeron P., Krischer J., Hopn P. Fractionnement des' proteins hydrosolubles de V orge // Bull. Soc. chim. biol.- 1966.- Vol. 48.- P. 239 -246.

110. Mazeron P., Krischer J., Hopn P. Fractionnement des proteins hydrosolubles de 1' orge // Bull. Soc. chim. biol.- 1967.- Vol. 49.- P. 791 -804.

111. Mikola J. Kirsi M. DiFFerences between endospermal and embryonal trypsin inhibitors in barley, wheat and rye // Acta chem. Scand.- 1972.- Vol. 26.-P. 787-795./- «

112. Nummi M. Fraction of arley globulins on dextran gelcollumns // Acta chem., scand.- 1963,- Vol. 17.- P. 527 533.• «

113. Osborne T.B. The proteins of the wheat kernels. Wash. (D.C.): Carnegie Inst., 1907.

114. Osborne T.B. The vegetable proteins. 2nd ed. L.: Longmans, Green and Co, 1924.

115. Palanichamy K., Sidding E.A. Study of interrelationship among A — genome species of the genus Oryza through isoenzyme variation // Theoret. Appl. Genetics.- 1977.- Vol. 50.- P. 201 210.

116. Pawar V.S., Gupta V.P. Peroxidase isoenzymes in development of talland dwart cultivars of rice // Ann. Bot.- 1975.- Vol. 39.- P. Ill 783.

117. Paulis J.W., Wall J.S. Albumins and globulins in exstracts of corn grain parts // Cereal Chem.- 1969.- Vol. 46.- P. 265 273.

118. Paulis J.W., Biets J.A., Wall J.S. Corn protein subunits: Molecular weights determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrohoresis // J. Agr. And Food chem.- 1975.- Vol.23.- P. 197 - 201.

119. Quensel O. Untersuchung Uber die Gerstenglobuline: Diss.// Levin. Of Uppsala, 1942.- 96 p.

120. Raymond S., Weintrau L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.// Science/- 1959.- Vol. 20.- P. 427 432.

121. Sidding E.A., Nerkar Y.S., Mehta S.L.-Intra and inter subspecific variation in soluble proteins of Oryza sativa L. // Theoret. And Appl. Genetics.- 1972.- vol. 42.- P.351 356.

122. Shewry P.R., Ellis J.R.S., Pratt H.M., Miftin B.J. F comporison of methods for the extraction and separation of hordein fractions from 29 barley varieties // J. sci. Food. And Agr.- 1978a.- Vol. 29.- P. 433 441.

123. Stegeman H. Refrospect on 25 years of cultivar identification by protein patterns and prospects for the future // Proc. ISTA symposium on biochemical tests for cultivar identification. Conbridge, 1983.- P. 20 31.

124. Stegamann H., Francksen. H., Macko V. Potato proteins: genetic and physiological changes, evaluated by one and two dimensional PAG - gel -techniques // Zeitchrift Naturforschung, -1985.- Vol. 28.- P. 722 - 732.

125. Taddei G. Ricerche sul glutine del frumento // G. Fis., chem., e stor. Nature. Brugnatelli.-1981.- Vol. 2.- P. 360 361.

126. Tanaka K., Sugimoto T., Ogawa M. e.a. Isolation and characterization of two types of protein bodies in the rice endosperm // Agr. Biol., Chem.- 1980.-Vol. 44.- P. 1633- 1639.

127. Teeson E.N.S., Esmama B.V., Lontok L.P. e.a. Studies on the extraction of rice endosperm glutenin and.prolamin // Cereal Chem.- 1971.- Vol. 48.-P. 168-181.

128. Tkachuk R., Tipples K.H. Wheat beta amylases.- Cereal Chem.- 1966.-Vol. 43.- P. 62-79.

129. Vvedenskaya I.O., Alpotyeva N.V., gubareva N.K e.a. Use of storage protein electrophoresis in the analysis of genetic resources of some cereals.-Cereal Chem.- 1993.- vol.25.- P. 187 201.

130. Wand X.F., Kuoblaunch R. and Leist N. Identification of varieties and testing of hybrid purity of rice by ultrathin layei isoelectric focusing of seed protein.- 1986.-P. 60-66.

131. Ward, J. H. Hierarchical grouping to optimize an objective function // Journal of the American Statistical Association,' 1963.- Vol.58.- 236 P.

132. Weising K., Nybom H., Wolff K. e.a. DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, 1995.

133. Weising V., Nybon H., Wolff K. e.a. DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC. Press., 1999. '

134. Wrigley C.W., Mcintosh R.A. Genetic control of factors regulating the phenjl reaction of wheat and rye grain // Wheat Inform. Serv.- 1975.- Vol. 40.-P. 6.

135. Woychik J.H., Huebner F.R., Dimler R.J. Reduction and starch gel electrophoresis of wheat gliadin and glutenin // Arch. Biochem. And biophys.-1964.-Vol. 105.-P. 151-155.