Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка экспресс-метода определения сортовой чистоты путем электрофоретического анализа белков семян овощных культур семейства капустных

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка экспресс-метода определения сортовой чистоты путем электрофоретического анализа белков семян овощных культур семейства капустных"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРТОВОЙ ЧИСТОТЫ ПУТЕМ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВ СЕМЯН ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР СЕМЕЙСТВА КАПУСТНЫХ

. (06.01.05 ~ селекция и семеноводство)

На правах рукописи

БАТМАНОВА Лариса Сергеевна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва — 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте селекции и семеноводства овощных культур и Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова АН СССР.

Научные руководители:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор П. Ф. Коненков,

доктор химических наук Ц. А. Егоров.

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор И. П. Фирсов,

кандидат сельскохозяйственных наук П. П. Демкин.

Ведущее предприятие — ВНИИ растениеводства имени Н. И. Вавилова.

Защита состоится « » «ГС^/АА А 4 199(г. в' 13 ОС час на заседании специализированного совета К. 053.22.22 но присуждению ученой степени кадида-та сельскохозяйственных наук в Университете дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу: 113093, Москва, М-93, ул. Павловская, 8/5.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университета дружбы пародов имени Патриса Лумумбы по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность проблемы.

Одна из основных задач семеноводства состоит в размножении сортовызс сеыян и сохранении их высоких сортовых и посевных качеств. В процессе семеноводческой работы контроль за подлинностью сеыян и их сортовой чистотой проводится с помощьо грунтового контроля, т.о. посева семян на специальных участках и анализа растений по морфологическим признакам. До недавнего времени оценка растений по фенотипу была основной, использовавшееся селекционерами. Однако большинство морфологических признаков имеет полигенную природу и зависит от условий выращивания. Кроме того, оценка растительного материала по морфологическим признакам часто бывает затруднительной: иногда невозможно учесть и правильно оценить все характерные признаки сорта, тем более, что большее число создаваемых новых сортов, отличаясь от прежних устойчивостью к болезням и вредителям, не всегда отличаются по морфологическим признакам. Все ото создает проблемы при подборе пар пля скрещивания и отбора лучших генотипов. Принципиально новые возможности пля идентификации сортов и характеристики семян открылись с разработкой электрофорвтического,метода анализа белков семян. Этот метод позволяет изучить межвидовой и внутривидовой полиморфизм, идентифицировать сорта и биотипы, опрепелить чистоту инбрелных линий, проводить генетический анализ гибридного материала, выявлять гены маркеры определенных хозяйственно-полезных признаков, умтанавливать эволюционные связи между видами. Широко используется электрофоретичв-ский анализ белков семян для идентификации сортов и биотипов злаков и бобовых культур. Капустные овощные культуры изучены в этом плане недостаточно, хотя народнохозяйственное значение их велико. Капуста является важнейшей овоцной культурой, в СССР она выращивается практически на всей территории и занимает около 30$ всей площади, отведенной под овощные культуры, В связи с чем остро стоит вопрос выведения высокоурожайных сортов капусты с ценными потребительскими качествами. Большое значение в народном хозяйстве имеют и другие представители семойотва капустных - редис и релька. В связи с этим разработка электро-форетических методой анализа белков семян представителей сеией-стяа капустных, которые могли бы быть использованы в сортовой семгнном контроле, является чрезвычайно актуальной.

Цель и задачи исследования. Цель нас тощей работе состояла в разработке биохимического экспресс-метода определения сортовой иизтоты капустных растений. В связи с чем была поставлена задача разработки электрофоретических методов анализа белков - - семян представителей семейства капустных, которые могли бы быть использованы в семенной сортовом контроле для идентификации сортов.

Основными экспериментальными задачами явились следующие:

- анализ различных фракций белков семян методом электрофореза в полиакриламидноы геле в присутствии отю-Иа для характеристики сортов капусты, исследование альбуминов семян путем изоблектрофокусироаания в геле;

- исследование полиморфизма кислой фосфатазы семян для контроля чистоты сорта и анализа биотипного состава;

- анализ изоферментов амилазы семян для проверки чистоты партий капусты Аматер 611;

- использование высокоэффективной жидкостной хроматографии белков семян для сортового контроля капустных культур;

- сравнительное изучение способа определения сортовой чистоты капусты методом грунтконтроля и электрофореза.

Научная новизна. Разработан метод анализа различных белков семян капусты путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, позволяющий идентифицировать разновидности и сорта капусты. Показана возможность использования электрофокусирования в геле для сортовой идентификации капусты. Разработан;метод сортового контроля капустных культур по электрофоретическим спектрам изоферментов кислой фосфатазы и амилазы. Путем анализа изоферментов амилазы проведена проверка чистоты партий капусты сорта Аматер 611.

Показано, что данные, полученные путем электрофореткческого анализа белков семян, Подтверждаются результатами грунтконтроля, Впервые показана возможность применения высокоэффективно! жндцостной хроматографии для определения разновидностей к сорт( Научная и практическая ценность. Работа имеет больное практическое значение, поскольку предлагает заменить грунтконтрол] капустных культур биохимическим экспресс-методом, состоящим в »лектрофореткческом анализе белков семян. В отличие от грунтового контроля, результаты которого становятся известными через год, электрофорез белков сеиян относится к экспресс-методам

проверки качества семенного материала, что позволяет ускорить а&готовку сортовых семян. Кроме того, он является более достоверным критерием чистоты, т.к. состав полиморфных белков, в отличие от морфологических признаков, не зависит от условий произрастания. Элекгрофоретический контроль чистоты семян является и более дешевым.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на У Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987). Экспериментально проведена проверка 18 партий семян капусты сорта Аматер в "Россортсемовощ" в 1988 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов. Объем работы 133 страницы, включая II рисунков и 10 таблиц. Список литературы вклвчает 106 наименований.

МАТЕРИАЛЫ и жгсда ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом исследования служили семена элитных и суперэлитных сортов и разновидноетей капусты: Braasic* olsracefe Вгяяз1ся oler.-coF L. vsr. cnpitfts. Brassica olöracseo 1. vor. (s-suaifam, rraioicfi о1егво«ао 1. vnr acephala, Brassica r-iiviir'.ris Liil. -

редиса Pnl'hrnus oativua L. vor sntivus. tenet. и рбДЬКИ Raj-iipnüü r:rtivu2 L. vnr. niger mill урожаев 1983-1985 ГГ.

В работе были использованы следующие сорта: капуста белокочанная: Амагер 611, Подарок, Золотой гектар, Московская поздняя 15, Ликуришка 498/15, Слава 1X5, Стахановка 153, Слава грибовская 231. Капуста краснокочанная: Каменная головка 447, Гако 741. Капуста брюссельская: Геркулес 1342. Капуста савой-ская: L6идейная 2170, Вертю 1340.

Редис: Ьаря, Редис Тепличный грибовский, редис Сакса, Редька Черная зимняя круглая, редька Зимняя сквирская черная, редька зимняя сквирская белая, редька Гайворовзкал. В качестве стандарта для белокочанной капусты был взят сорт Амагер 611, выведенный во ВНИИССОК методом индивидуально-семенного отбора из ипелакого образца. Районирован в СССР широко, в PCSCP повсеместно.

- 4 - . .

Фракционирование белков семян. Альбумины экстрагировали на муки одного семени или 30 семян водой (мука:вода - 1:5) при 4^С в течение I часа в присутствии ингибитора лротеолиза фешишвтил-сульфанилфторяда (Ф:>Ш) в концентрации Глобулины выделяли

из ыуки 0,5ii раствором к a ci (после предварительного удаления альбуминов) также в присутствии Для получения неэкотраги-ровавшихся водой и солевым раствором белков к отмытой цуке добавляли 0,0625 iM трис- кс1 буфер рН 6,6, содержащий 2% ddc -Ка • 10$ сахарозы и % 2-меркалтоэтанола. Экстракцию вели I ч при комнатной температуре.

Электрофорез белков семян в полиакрйламидном геле в присутствии iiuc-Ка вели по модифицированному методу Лэммли (Xesuull, 1970). Разделение производили в 10 и 15^-ном акриламидном геле, а также в геле с линейно* концентрацией акридамида (10-17«).

, Электрофорез продолжали в течение 4 часов при напряжении 150 в. После разделения в геле белки окрашивали Кумасси R-250 (0,05£-ный раствор в 25^-ноы иэопропаноле и 10^-ной уксусной кислоте), В качестве метчиков для определения кажущихся молекулярных масс использовали стандартнуо смесь белков фирмы rhsr^rcia.

Изоэлектрофокуаироваяие в полидкрилаиианом геле. Отдельные семена капусты экстрагировали I М мочевиной в течение I часа при комнатной температуре. Экстракты центрифугировали 4 мин при 18000' в . Супернатанты использовали для изоолектрофокусирования. Гели содержали акриламида, 0,15% метиленбисакриламида, 3%,-mft раствор амфолиноа (рН 3-10) и 2 А мочевины. Фокусировку проводили при 40и в в течение 30 мин, а затем при постоянной мощности 7,5 вт. Гели окрашивали 0,1??.-ным раствором Кумасси И -250 в смеси метанол-уксусная кислота - вопа (25:10:65) в течение 15-20 мин, после чего высушивали на воздухе.

Электрофорез изоферментов кислой фосфатазы. Изоферменты кислой фосфатазы .экстрагировали из 48-часовьк проростков 0.05М трис-НС 1 буфером (рН 7,2), содержащим 20% сахарозы, 0,04М аскорбиновой кислоты, 0,05 М цистеина - HCI, 0,05 Ji ЭДТА-Яе2 и Ы сефадеиса С - 26. Экстракцию проводили в течение 12 час при 4°С, образцы центрифугировали при 16000g в течение ЭО мин. Электрофорез белков проводили в двухслойном геле: верхний (концентрирующий) содеркал акриламида, а никний (разделяаций) -

В концентрирующем геле соотношение акриламида к -мвтиленбис&крилакиду составляло 20:1, а в разделящем - 20:2.

- Б -

Разделение проводили в трис-ЭДТА-бораТной системе при рН 8,0, Перед электрофорезом проводили праэлектрофорез при нпряжении и«200 в в течение 30 мин. Электрофорез вели 2,5 часа при градиенте потенциала 40 в/см. Окрашивание иэоферментов кислой фосфатаэы проводили прочным синим (иа -соль). Окрашиващий раствор содержал 100 мг ив -нафтилфосфата, I г поливинилпирролидона, 200 мг прочного синего (ка -соль), 40 мл 0,25 г! Ко-ацетатного буфера (рН 5,0) и 200 мл воды. Для проявления ферментативной активности гель инкубировали с красителем при температуре 3?°С в течение I часа 40 мин, затем промывали водой и хранили в 7%-ном растворе уксусной кислоты.

Электрофорез изоферментов амилазы. Изоферменты амилазы экстрагировали из семян буфером, содержащим 0,02 ¡1 СаС1£ и 20% сахарозу, при 4°С в течение 3 часов, затем центрифугировали 30 мин 15000 об/мин. Разделение провопили в 7,555-ном геле в трис-глициновой буферной системе при рН 8,3. Предварительно провопили преэлек-трофореэ при 200 В в течение 30 мин, а затем электрофорез 1,5 ч при 500 в. Для выявления активности амилазы гель инкубировали в смеси растворимого крахмала в 0,1М растворе ацетата натрия при рН 4,5 в темноте при 39°С в течение 30 мин. Затем гель промывали водой и заливали 5$-ной ТХУ с 0,5% К1 и 0,26

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭКХ). ВЭ1Х альбуминов семян проводили на колонках с обращенной фазой используя для элюции белков градиент концентрации ацетонитрила (Буфер А: 15%-ный ацетонитрил в 0,1^-ной водной трифторуксусной хислоте). Белки детектировали при 214 ни.

Изучение сортовой чистоты 18 партий семян капусты сорта Амагер методом грунтконтроля.

Апробацию у кочанных видов капусты проводят в фазе хозяйст- . венной годкозтн кочанов, когда они достигают нормального для сорта размера, становятся плотными, верхние, покрывагщие кочан листы, приобретают блеск, при этом у белокочаяной капусты они белеет.

При грунтконтроле капусты <^ределение сортовой чистоты проводилось по следующим сортовым признакам: форма и масса кочана, высота наружной кочерыги, высота и диаметр розетки, форма и величина листовой пластинки. Сорта капусты разнятся так же по величине розетки и кочанов, окраске и плотности последних, длине внутренней кочерыги, характеру воскового налета на листьях, скороспелости и лр. Эти признаки при апробации используют а качестве пополнительных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ белков семян разновидностей и сортов капусты кагором электрофореза в ПААГ в присутствии UixMfe. Объектом исследования служили воздушно-сухие семена различных сортов и разновидностей капусты, выращиваемые в СССР. Электрофоретическому анализу подвергались альбумины, глобулины и "остаточные белки". Для выделения альбуминов и глобулинов семян капусты в стандартную методику были внесены некоторые изменения; экстракцию проводили на холоде в присутствии ингибитора протеолиза ФМСФ, что позволило получить воспроизводимую картину электрофоретического разделения белков. Предварительное обезжиривание семян не влияло на компонентный состав альбуминов и глобулинов, а также не сказывалось на качестве разделения при электрофорезе, поэтому в дальнейшем делипидирование не проводили. Описано разделение белков семян капусты методом электрофореза в ПААГ в щелочных условиях ( veushpn et si . 1966). Однако разделяющая способ* ность этого метода для данной культуры не высока, поэтоцу мы использовали для фракционирования белков электрофорез в ПААГ я присутствии üDc-iia по метолу Лэммли ( Leemai , 1970), который позволяет делить полипептиды по молекулярным массам и с успехом используется для фракционирования хапасных белков. Сравнение электрофоретического спектра альбуминов и глобулинов различных сортов урожаев 1983-1985 гг. показало, что они идентичны для каждого сорта и не зависят от условий выращивания. В однородных гелях во фракции альбуминов удалось обнаружить 35-40 компонентов, однако разделение в низ ко молекулярно й зоне было недостаточно хорошим. Значительно лучшее разделение в этой воне было достигнуто при использовании градиентного геля (10-17%). При фракционировании в гаком геле альбумины разделились на две зоны (35-95 и 20-25 кДа) (рис. I), из которых первая содержала только минорные компоненты. Для изучения гетерогенности минорных компонентов анализировали "перегруженные" по белку гели. В табл. I дано распределение электрофоретических компонентов альбуминов семян капусты (табл. I). Компоненты расположены в порядке увеличения электрофоретической подвижности . В качестве стандарта был вэят смоделированный спектр, вкхвчшций все обнаруженные варианты белковых полос. Во фракции альбуминов всех сортов капусты вида Brassica olerácea L. var. or.pitr.tft h. обнаружено 8 инвариантных и 35 вариабельных

компонентов. Различия заключались либо в наличии (отсутствии) определенных компонентов, либо в интенсивности их скрещивания,

»чкшш ста щде аящ вуд

___ —.ааз* Зййар! двза

4И* — t^ ,

г ' J v s e ' > ' * •

Рис. I. Электрофоретическое разделение водорастворимой фракции семян капусты (ПААГ 10-17?; ojc-Na ): I - Подарок, 2 - Золотой гектар; 3 - Амагер, 4 - Слава, б - краснокочанная, 6 - брюссельская, 7 - Ликуришка, 8 - савойская, 9 - дикая. Изображена зона 20-35 кДа.

причем все исследованные сорта имели характерный спектр. Сравнение электрофореграмм альбуминов разновидностей кочанной капусты Brajsics oierrcai о vrr. Ciipi1:>-tn L. С другими разновидностями капусты (савойской и листовой) позволило выявить межразновилно-стные различия в этой фракции белков. При анализе фракции глобулинов метопом электрофореза в ПААГ в присутствии ^йС-Ка. оказалось, что эта фракция белков менее гетерогенна по сравнении с альбуминами. В градиентном геле она разделилась примерно на 16 компонентов. Кроме того, основные компоненты солерастворимой фракции совпадают по электрофоретической подвижности с главными компонентами альбуминов с молекулярными массами 33 и 25 кДа. Специфических компонентов, присущих лишь этой фракции, выявить не удалось. По молекулярным массам основные компоненты водо-и солерастворимой фракций сходны с субъелиницами глобулинов бобовых, что, вероятно, связано с высоким нонсерватозиом этих белков. Ранее при исследовании белков семян представителей рода вгп-:г,1с."с*г<; во фракции глобулинов было обнаружено 3-5 компонентов, а во фракции альбуминов около 10 ( Ve'i?.h'!n et el. f 1962). Низкий полиморфизм и сходные значения Kf глобулинов в электрофоретической системе Дэвиса делали их непригодными для таксономических исследований. Значительно более гетерогенными в этой системе оказались альбумины. Однахо, анализируя даже эту фракцию белков, упадось обнаружить лишь межвидовые различия, в частности мекпу Б. nigra , 3. carrpss-tris • и В. о1-чгр- • севе

Таблица I

Распределение электрофсретических компонентов альбуминов капусты

Полоса! I 1 2 1 3 ! 4 1 Б 1 6 ! 7 ! 8 t 9

I ++ ++ ++ 44 + . 44 44 44 44

2 4 4 + + + 4 4 4 ♦

3 4 + + + 4 4 4 4

4 - - - - 4 - - -

Б 4+ ++ ++ ■к 44 44 44 44 44

6 + + + + - - 4 4 4

7 4 4 _ + + «а». m 4 4 4

8 4 4 4 4 - 4 4 4 _

9 « w» - 4 4

10 4 + 4 4 4 4 - -,

II 4 4 ♦ .. 4 4 4 4 4 4

12 ♦ , ♦ + 4 4 4 4 4 4

13 - ' - - - - - -

14 4 — - 4 - - -

16 - - 4 m 4 4 4 4

16 - - - 4 - - - - -

17 - 4

18 . я* - «р 4 - 4 4 - -

: 19 ♦ + + 4 - 4 4 4 4

20 4 . + . 4 4 4 , 4 4

21 ш - + . - 4 4 4 4

22 - ♦ - - 4 4 4 -

23 4 4 + 4 4 4 4 4 4

24 ш - - 4 4 - - 4

2Б 4 - + ♦ - 4 4 4

26 - - - - 4 4 4

27 - • - - - - - - -

28 4-Н 4+4 +++ +++ 444 444 44+ 444 4+4

- 29 ' 4++ +4+ 444 4+4 444 444 444 +44 44+

. 30 4+ 44 mm 4+ 44 - - -

31 - - 4+ - - 44 44 4+ 4+

32 4 - 4 - 4 4 4 4

- 9 - -;•-■■.

Продолжение таблицы I

Полоса! I ! 2 ! 3 1 4 1 5 1 6 ! 7 ! 8 ! 9

33 - - - 4 4 4 4 4

34 4 - 4 4 4 4 4 4

35 4 4 - 4 4 4 ' 4 -

36 444 444 444 444 444 444 444 444 444

37 4 - 4 4 4 4 4 4 4 •

38 4 - 4 4 4 4 4 4 4

39 4 - 4 4 4 4 4

40 4 - 4 4 4 4 4

41 - - - - - 4 - 4 -

42 _ - - - 4 - 4 —

43 _ 4 _

Разработанная наш методика разделения растворимых белков семян капусты в ПААГ в присутствии позволила выявить не только

межразновидноетные, но и межсортовые различия. Дня более полного исследования компонентного состава семян капусты бия проведен злектрофоретический анализ белков, экстрагируемых "^с-Кк в присутствии 2-меркаптоэтанола после отмывки водой и солевым раствором. Такой метод позволяет выделить высокомолекулярные белки, состоящие из субъединиц, соединенных дисульфидньаи связями. Электро-фореграммы "остаточных" белков после восстановления 2-меркаптаэ-танолом представлены на рис. 2.

Электрофорез в градиентном геле позволяет выявить в этой фракции 35-40 компонентов, причем каждый исследованный сорт об- -ладает специфическим спектром. У всех сортов обнаруживается коы-ч понент с молекулярной массой 67 кДа (он отсутствует липь у брюссельской капусты), а также 4 интенсивно окрашенных полипептида с молекулярной массой 19-22 кДа. Они идентичны по элевтрофорати-ческой подвижности у всех проанализированных сортов. Полученные результаты позволяют использовать электрофорез белков в присутствии иис-иа для определения процента чистосортноети оемяи, а ' : также реаать другие вопросы геиетиви я селекции капусты.

Рис. 2. Электрофоретичесие спектры "остаточных" белков семян капусты (ПААГ 10-17%, Оьс-Ы* ). 1-7 си. рис. I. .

Анализ альбуминов семян капусты методом изоялектрофокуси-ррвания в ПААГ. Следующий этап работы был посвящен анализу белков семЩ| капусты с помощью иэоплсктрофокусирования в полиакрила-мидном геле. Этот метол позволяет разделять белки по изоэлектрнче-ским точкам. Преимущество этого метода по сравнению с обычным электрофорезом состоит в том, что он обладает более высокой разрешающей способностью, т.е. позволяет выявить различия в тех случа-■ ях, когда белковые спектры в обычном геле оказываются одинаковыми. В литературе ИЭФ было использовано иля характеристики сортов ячменя, а также для проверки чистоты гибридных линий кукурузы. Основной недостаток ИЭФ заключается в высокой стоимости реактивов, необходимых для анализа, прежде всего амфолинов - полиаминополикар-боновых кислот, которые создают в геле градиент рН. Поэтому в последнее время.«се большее значение приобретает ИЭВ в ультратонких гелях, что позволяет сократить расход дорогостоящих реактивов. Кроме того, использование ИЭФ в ультратонких гелях имеет и ряд других достоинств:

I) разрешающая способность его выше, чем в обычном тле;

2) сокращается продолжительность анализа;

3) ультратонкие гели высыхают на воздухе, поэтому отпадав* необходимость фиксировать результаты анализа путем фотографирования*

Для исследования нами были использованы фракции альбуминов различных сортов капусты. Во (|рахции альбуминов удается обнаружить ^ Ю компонентов (рис, 3), причем проанализированные сорта отличались по белковым спектрам.

Таким образом, ИЭФ, наряду с электрофорезом в присутствии может быть использовано для идентификации сортов капусты.

ЕГЭ капа саги кза н^пи

1 г з ❖ .г

Ркс. 3. Изоэлектрофокусирование альбуминов семян капусты в ПААГ (рН 3-10). I - Амагер, 2 - Подарок 2600, 3 - Золотой гектар, 4 - Московская поздняя, Б - Стахановка 1513.

Сортовой семенной контроль капустных культур путем изофер-ментного анализа.

I. Кислая_фос^тазаА Помимо запасных белков семян, были проанализированы и нзоферментные системы, которые могли бы быть использованы для контроля сортовой чистоты капустных. Анализ кзоферменгов обладает существенным преимуществом по сравнению с запасными белками: спектры изоферментов обычно значительно проще по компонентному составу, что облегчает анализ элвктрофорегракм, последнеа имеет больпое значение для анализа, напрнкэр, гибридного материала, спектр белков сеаян которого при кодоиинантнои наследовании представляет собой суигху спектров белков обоих родителей. Из литературы следовало, что у рода й£ааа1да в полтяр$яоЯ

мзоферментной системой является кислая фосфатаэа, Поэтому именно

эту систему мы выбрали для анализа. Однако описанные в литературе

методики электрофореза обладали низкой разрешающей способностью, что не позволяло различать близкие .генотипы. Для исследования мы использовали различные разновидности капусты, & также ряд сортов редиса и редьки.

Результат электрофоретического разделения изоферментов кислой фосфатазы семян различных сортов капусты представлены на Рис. 4

'О

Рис. 4. Электрофорегкческое разделение изоферыентов кислой фосфатазы проростков капусты в ПААГ. I,- Поаарок, 2 - Золотой гектар, 3 - Аматер 611, 4 - Слава 1306, б - краснокочанная Гако, 6 - Брюссель-

кая Геркулес, 7 - Ликурншка 498/15, 8 - савойская юбилейная, 9 - Мог ковбоя поздняя 15, 10 - капуста дикая

В геле уяается выявить ^ 10 изофсрм фермента, что указывает на большую раэреаапцуИ способность разработанного метопа разделения по сравнению с известными в литературе, которые позволяют обнаружить лишь 4-6 изоферментов. Более высокая разрешающая способность изпользованного метода яает возможность с большей достоверность» анализкровать сорта, различать сходные генотипы. Элек-трофюретмческий анализ изоферментов кислой фосфатазы позволяет обнаружить не только межвидовые, но и межбортовые различия. Каждый проанализированный сорт обладает характерным спектром. Кроме того, более детальный анализ по 100 семян кажпого сорта позволил обнаружить внутриссртовую гетерогенность большинства исследованных образцов.

^ 2. Амилаза. Помимо кислой фосфатазы нами были исслепованы

также иэоферменты амилазы капусты и других представителей семейства капустных - редиса и редьки, для проверки чистоты сортов и выявления биотипного состава. Предварительно были отработаны условия разделения изоферментов амилазы в ПААГ. Установлено, что изоферменты амилазы у капусты, редиса и рельки представлены двумя зонами ферментативной активности, которые варьируют у разных сортов и вилов по интенсивности и компонентному составу (рис. 6).

Л.2.1 Ч 3 /О и/*.'

Гйс.5. Злоктрофоретическое разделение изоферментов амилази семян напусти в ПЛАТ-

I - Лмагор 611г 2 ~ Подарок 2500, 3 - Золотой гектар 1432, 4 - Московская поздняя 15, 6 - Стахановка 1513, 7 - капуо-та дакая, g - брюссельская Геркулео 1342, 9- савойская 1к5илеШ!ая 2170,- Ю- Ликуришка 498/15, II - Слава 1306, I - капуста краснокочанная Гако.

У капусты более активной является менее подвижная зона, а у редиса и редьки, наоборот, более подвижная, различия межлу видами и сортами состоят в числе и активности изоформ. В малоподвижной , и бызтроподвижной зонах число изоферментов амилазы варьирует от , I до 3, У различных сортов капусты электрофоретический анализ изоферментов амилазы позволил выявить ыенссртовые различия, кроме того более детальный анализ изоферментов амилазы внутри сорта позволил обнаружить и внутрисортовые различия, т.е. биотипный состав сорта.

Для проверки возможности использования электрофореза ивофвр-. ментов амилазы для контроля сортовой ши тотл нами балл проспали- , зиропаны различные партии семян белокочанной капусты сорта Лкагёр 611, полученные из различных районов СССР (табл. 3): Ир 14606,

1466/90; 1452/91, 1267, 1268, 1444/2922, 1448/2923, 1441/1921, 1440/2920, 1464/69, 1477, 1459, 1461.

Таблица 2

Грунтконтроль сортообразца сорта Аматер 611

Номер I Коэффициент вариации, %

партии |-■---■-

Г розетка Гдляна ( кочаны ! лист

1» ........ 1 наруж-! _ _ !__

!»ысо- !яиа- !ноя !масса!высота!пиаметр!дли- Iшири-!та !метр !коче- ! I ! 1на !на

! ! !рыги ! ! ! ! !

Аматер ^стандарт) 15,6 12,9 24,2 36,4 17,1 13,9 15,0 18,3

1450 21,9 33,6 26,5 45,5 17,8 14,7 14,9 24,7

1466/90 17,3 14,5 21,7 21,2 13;6 9,8 14,4 16,7

1452/91 16,2 20,4 18,0 21,9 11,8 10,1 16,2 13,8

1267 13,1 14,9 20,7 36,0 13,5 14,4 22,8 25,5

1266 20,6 13,0 26,0 27,5 9,4 13,3 17,0 17,5

1444/2922 19,1 14,1 14,8 25,9 13,6 13,3 26,4 30,8

1448/2923 18,4 15,1 15,5 23,9 13,1 12,8 21,4 31,2

1441/2921 20,5 12,0 18,0 27,6 13,7 16,1 18,3 25,0

1440/2920 21,6 15,6 21,0 24,5 20,6 14,2 31,5 34,2

1464 1?.5 19,3 16,4 24,4 14,7 16,0 19,8 16,3

1462 21,0 15,4 23,1 23,6 16,6 14,0 23,2 37,2

1467 И,4 12,1 32,6 23,5 15,8 10,8 11,3 11,6

1455 15,6 16,6 27,7 29,0 13,9 10,3 24,1 17,8

1454 17,6 15,5 29,5 31,0 15,0 10,4 19,8 28,4

1266 16,3 45,5 21,8 26,2 13,0 13,7 13,1 19,1

1446/89 10,4 17,6 15,0 29,7 8,1 13,3 17,6 18,1

1477 16,7 16,6 17,7 20,8 13,6 11,1 5,3 22,4

1469 26,6 14,4 28,1 28,8 16,6 12,2 14,9 17,1

1451 30,3 16,3 15,9 30,8 12,6 15,1 23,7 27,0

Дм проверки частоты предоставленных нам партий были жполь-аовакм два метода, это - традиционный метод грунтконтроля и биохимический - по белкам семян. Грунтовой контроль показал, что не смотря на сильное, среднее, слаббе варьирование внутри каждой партии яо размеру кочана, розетки листьев, ллинн наружной коче-

рыги и нижнего листа кочана, 1(Х>% сортовая чистота была у 15 партий (табл. 2). Сортовая чистота партий 1266, 1446/69, 1477, 1459, 1451 колебалась от 98,2 во 98,7%, что соответствовало, по утвержденным отраслевым стандартам, I категории, допускающей сортовую чистоту не менее 96^.

Сравнивая электрофоретическую картину изоферментов амилазы сорта стандарта с анализируемыми партиями семян, устанавливали их сортовую чистоту, которая составила 96-100?, Проанализировав различные партии капусты сорта Аматер 611 олектрофоретичсским методом на сортовую чистоту, было установлено, что большинство партий имеют спектр изоферментов амилазы, идентичный спектру стандартного образца, биотипный состав данных партий совпадал с имеодимся стандартом. Сортовая чистота партий 1266, 1446/69, 1477, 1459, 1461 составила - 98,4, 98,8, 98,6, 98,4, 96,2^. Сопоставляя эти данные с результатами грунтового контроля, можно сделать вывод о том, что метод электрофореза в ряяе случаев более чувствительный. Однако все полученные при электрофоретическом исследовании значения сортовой чистоты находятся в пределах, допустимых для семян капусты различных категорий, за исключением партии 14Ы, у которой она составила 96,что соответствует Ш сортовой категории, а по грунтконтролю было 98,2%, т.е. относилась к I категории.

Высокоэффективная жидкостная хроматография альбуминов капусты для сортового семенного контроля. Нами были исследованы белки семян с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой.

ВЭЖХ на колонках с обращенной фазой позволяет фракционировать белки на основе различий в поверхностной гидрофобноети. По сравнению с электрофоретическим анализом хрематографический ыетод облапает целым рядом преимуществ: I) он требует еще меньших затрат времени для анализа опного образца - 30-40 икн; 3) обладает вьсокой воспроизводимостью и разрешающей способностью. Применение ВЭЖХ позволило выявить как можраяновидностные, тая и внутривидовые различия в семействе ГСгяз«1сйсзео ь. а следовательно, этот метод можно использовать в сортовом семенном контроле.

вывода

Так™ образом, из проделанной работы можно сделать следующие

вьшопы:

1. Разработан биохимический экспресс-метод опреяеления сорта и сортовой чистоты капустных растений. В основе метода лежит эле-ктрофоретичэгкий способ анализа запасных белков семян капустных культур. 4етов могет быть использован пля идентификации сортов в сортовом семенном контроле. Установлена возможность применения изо:>лектрофокусировамия в полиакриламипном голе лля сортовой идентификации капусты.

2. Разработаны электрофоретические метопы анализа изоферментов кислой фсюфатаэы и амилазы, которые могут быть использованы для выявления примеси дикой рельки и проверки чистоты сорта представителей корнеплодных культур семейства капустных.

3. Сравнительное изучение по определению сортовой чистоты белокочанной капусты сорта Аматер 611 метопом грунтконтроля и путем анализа изоферментов амилазы семян показало вмсокуп яффик-тивность и бояывую чувствительность электрофоретичеекого способа. Посемянный анализ позволяет изучать биотипный состав сорта, а также выявлять примеси пругого сорта и резкие гибриды.

4. Установлена принципиальная возможность использования ВЭЮС на колонке с обращенной фазой пля сортовой идентификации капустных куль*ур.

РйКОЛаВДЩИИ ПРОИЗВОДСТВУ

1, Рекомендовать научно-исследовательским учреждениям при вы-ращивп' ии семян суперэлиты и ?лнты ceMeffcma капу- тных яля контроля сортовой чистоты использовать эк:пресс-метол на базе электро-форетического анализа белков семян.

2. В/О "Сеюзсортгемовощ" и объединение "Россортсемовощ" при

1 юрвщкванни сортовых семян первой и последних репровукций капустных растения контроль сортовой чистоты проьопить электрофорети-ческим экспресс-методом.

Список работ, опубликованных по материалам виссертации I« Одинцова Т.Н., Батманова Л.С., Кононков II.Ф. Исследование гетерогенности белков семян капусты. // Теэ. докл. У1 Всесо->ззnovo симпозиума ".Молекулярные механизмы генетических лроце-- ссов"» 3-6 февраля 1987 г. 1987, с. 133-134. 2» Батманова Й.С., Одинцова Т.И., Егоров Ц.А., Кононков П.Ф., . Совшюв A.A. Исследование белков семян капусты метолом элек-' трсфореза для использояаиия в сямвнном сортовом контроле.

Доклады ВАСХНИЛ, 1987, № 7, с. 16—19.

3. Методические указания по анализу белков семян и изоферментов методом электрофореза для контроля сортовой чистоты и селекции капустных и тыквенных культур. Коненков П. Ф., Крашенинник Н. В., Дегтярснко Л. В., -Батмано-ва Л. С., Бунин М. С., Старцев В. И., Осыко Е. В., Одинцова Т. И., Егоров Ц. А., 1990., ВАСХНИЛ, М„ с. 48.

4. Заявки на изобретение № 4194862/13 «Способ контроля сортовой чистоты семян крестоцветных культур от 16.02.87, 2-я заявка № 4652329/30—13 от 16.02.89. (Положительное решение о выдаче авторского свидетельства на изобретение от 30.08. 1989 г.)

Тематический план 1990 г., „\1> 425

Подписано к печати 12.12.90. Формат 60Х997:о- Ротапрпптпая печать. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 0,96. Усл. кр.-отт. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 1039.

Бесплатно.

Издательство Университета дружбы пародов

_117923, ГСП-1, Москва, ул. Орджоникидзе, 3_

Типография Издательства УДН 117923, ГСП-1, Москва, ул. Орджоникидзе, 3