Белковые маркеры для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки

Букурова, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белковые маркеры для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Белковые маркеры для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки"

На правах рукописи

Букурова Юлия Александровна

БЕЛКОВЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ СЫВОРОТОЧНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ ТОЛСТОЙ кишки

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 ОКТ 2012

Москва-2012

005053058

Работа выполнена в Лаборатории структуры и функций хроматина Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Берестень Сергей Федорович

доктор биологических наук Белявский Александр Вадимович доктор биологических наук Лебедев Юрий Борисович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской академии наук

Защита состоится « Л6 » с¿У>?,с2012 г в /А* _часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32

Автореферат разослан <<Л^'у> (/¿¿•С/г? 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

Крицын А.М.

Актуальность проблемы

Одной из актуальных проблем современной молекулярной биологии является разработка новых способов молекулярной диагностики различных заболеваний. Рак толстой кишки (РТК) является одним из наиболее распространенных заболеваний в развитых странах. В России ежегодно диагностируется более 50 тыс. случаев заболевания и более половины пациентов умирают в течение пяти лет после диагноза, что связано с отсутствием эффективных методов ранней диагностики, прогнозирования и лечения опухолей.

Современные методы сывороточной диагностики рака основаны на количественном анализе содержания проникающих в кровоток белков и микроРНК, содержание которых заметно изменяется в опухоли по отношению к норме. Диагностические маркеры должны быть достаточно стабильны в сыворотке крови, где они могут быть обнаружены высокочувствительными методами, не требующими использования многостадийных процедур. Идентифицированные до настоящего времени потенциальные белковые маркеры РТК пока недостаточно надежны и чувствительны для диагностики рака в образцах сыворотки крови населения из групп повышенного риска.

Существует несколько методов для выявления потенциальных маркеров, пригодных для сывороточной диагностики опухолей.

Методы протеомики in vitro, основаны на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей и последующей масс-спектрометрической идентификации белков, содержание которых наиболее заметно и часто изменяется в опухолях. При этом используют три основных метода разделения белковых экстрактов:

1) двумерный гель-электрофорез (2DE) белков нормальных и опухолевых тканей с последующим выявлением белковых пятен с заметными различиями в интенсивности;

2) двумерный дифференциальный гель-электорофорез (2D DIGE) белков нормальных и опухолевых тканей с последующим выявлением белковых пятен с заметными различиями в интенсивности;

2) разделение белковых смесей, основанное на различиях в адсорбции к обработанным различным образом участкам поверхности микрочипа (методы MALDI и SELDI);

Методы обратной протеомики основаны на идентификации белков, способных связываться с аутоиммунными антителами, присутствующими в сыворотке крови онкопациентов, но не в крови здоровых доноров. При этом используются три методических подхода:

1) сравнение результатов иммуноанализа двух идентичных копий бактериальной экспрессионной клонотеки кДНК опухолевой ткани с использованием конъюгатов антител онкопациентов и здоровых доноров с последующей идентификацией потенциальных онкомаркеров секвенированием

(метод SEREX, серологическая идентификация рекомбинантно экспрессируемых клонов);

2) сравнение двумерных электрофореграмм опухолевых и нормальных тканей после иммуноблоттинга с использованием аутоиммунных антител онкопациентов в сочетании с масс-спектрометрической идентификацией опухолеспецифичных белковых пятен (метод Proteomex);

3) сравнение двумерных электрофореграмм белков нормальных и опухолевых тканей, полученных после иммунопреципитации белков с использованием аутоиммунных антител онкопациента в сочетании с масс-спектрометрической идентификацией опухолеспецифичных белковых пятен (метод AMIDA, идентификация антигенов с помощью аутоантител).

Наконец, методы протеомики in silico направлены на выявление отклонений в содержании (или процессинге) мРНК опухолей по сравнению с нормальными тканями (биоинформатический поиск в базах данных Oncomine, SAGE и EST).

Методы транскриптомики. Весьма перспективным транскриптомным подходом к поиску диагностических маркеров является анализ некодирующих РНК (нкРНК). Профилирование содержания тканеспецифичных микроРНК в сыворотках крови позволяет четко определить локализацию опухолей (часто с определением ее подкласса) и прогнозировать дальнейшее ее развитие. При этом некоторые из длинных нкРНК достаточно стабильны в сыворотке крови и могут использоваться для сывороточной диагностики опухолей, поскольку секретируются в кровоток в составе стабильных белковых комплексов.

Геномные методы. Поиск геномных онкомаркеров основан на двух подходах: 1) идентификации точечных мутаций, делеций, амплификаций и транслокаций, возникающих в ДНК опухолевых клеток на всех стадиях канцерогенеза (генетические маркеры); 2) выявлении специфического гиперметилирования промоторных областей и глобального гипометилирования ДНК (эпигенетические маркеры).

Двадцатилетние усилия по идентификации сывороточных маркеров опухолей толстой кишки привели к выявлению около дюжины белков, лишь небольшая часть которых используется в клинической практике, при этом специфичность имеющихся тестов РТК пока невысока (30-40%).

Цель работы. Целью данной работы являлась идентификация белковых маркеров, пригодных для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки.

Основные задачи исследования

1. Сбор коллекции образцов нормальных и опухолевых тканей, а также сывороток крови у пациентов с диагнозом рак толстой кишки.

2. Дифференциальный анализ методами масс-спекрометрии протеомов парных образцов норма-опухоль с целью идентификации белков с

повышенным содержанием в опухолях по сравнению с нормой.

3. Биоинформатический поиск белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток или во внеклеточное пространство, уровень синтеза которых заметно повышается в опухолях.

4. Экспериментальный отбор белков, идентифицированных в п. 2 и 3, уровень синтеза которых наиболее заметно и часто повышается в образцах опухолей толстой кишки по сравнению с нормальными тканями.

5. Сравнительный анализ содержания отобранных белковых маркеров в образцах сыворотки крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки и здоровых доноров.

Научная новизна

1) Разработка двух новых модификаций метода дифференциального анализа протеомов.

2) Идентификация десяти белков с повышенным содержанием в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой.

3) Разработка нового алгоритма биоинформатического поиска потенциальных белковых маркеров для сывороточной диагностики опухолей.

4) Идентификация кишечного альфа дефензина 5 - нового маркера для сывороточной диагностики субпопуляции опухолей толстой кишки.

Практическая ценность

Сывороточные тесты для диагностики опухолей толстой кишки в пациентах из групп повышенного риска позволяют увеличить выживаемость пациентов, вследствие детекции заболевания на возможно более ранних стадиях, когда терапевтическое воздействие является наиболее эффективным. Использование таких тестов уменьшает затраты системы здравоохранения на лечение онкопациентов.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на международной конференции «Томск-Тайвань» (2009), а также на отчетных конференциях программ Президиума РАН (№ 07-04-12243-офи «Транскриптомные и протеомные маркеры для ранней дифференциальной диагностики, прогностики и мониторинга рака толстой кишки; № 09-04- 13869-офи ц «Идентификация белковых маркеров для ранней сывороточной диагностики опухолей толстой кишки на основе анализа профилей экспрессии микроРНК») и гранта РФФИ (№ 08-04-01807-а «Протеомика рака толстой кишки»).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (151 наименование). Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 15 рисунков.

Результаты исследований и обсуждение

1. Поиск сывороточных белковых маркеров опухолей толстой кишки

1.1. Сравнительный анализ изменений протеома нормальных и опухолевых тканей с помощью метода 2DE

До настоящего времени методом 2DE анализировались суммарные экстракты опухолевых тканей, в состав которого входит большое количество нерастворимых структурных белков. Исключение составляет работа, в которой белки фракционировали с помощью аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе перед 2DE анализом. В настоящей работе проведено усовершенствование стандартного метода 2DE (Краснов и др., 2009), основанное на предварительной экстракции белков, растворимых в солевом буфере. Такой подход повышает вероятность идентификации диагностических сывороточных маркеров РТК вследствие увеличения их относительной доли в солевом экстракте.

Сравнение парных электрофореграмм (Рис. 1) позволило отобрать десять белковых пятен, интенсивность которых возрастала в опухолевой ткани по сравнению с нормой в десять и более раз. Методом матричной лазерной десорбционной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) в отобранных пятнах были идентифицированы следующие белки: CISH, TAF9, GSTOl, TAGLN, RBP1, S100A11, PCBD1, S100A9, PPIA и S100A8. Повышенное содержание восьми из десяти белков в опухолях толстой кишки подтверждается литературными данными, тогда как повышение уровня синтеза белков TAF9 и CISH обнаружено нами впервые. Однако ни один из впервые идентифицированных белков не является секреторным и не может использоваться в качестве сывороточного маркера РТК.

Анализ базы данных SAGE показал, что гены, кодирующие восемь из десяти отобранных белков (S100A8, S100A9, S100A11, GSTOl, PPIA, PCBD1, TAGLN, TAF9) экспрессируются в нормальных и опухолевых тканях на среднем уровне, тогда как для белков RBP1 и CISH характерен низкий уровень синтеза в большинстве нормальных тканей организма и опухолях с другой локализацией.

Рисунок 1. Фрагменты двумерных электрофореграмм, полученных при разделении белков из нормальной (А) и опухолевой (Б) тканей с использованием тотальной экстракции; (В) и (Г) - соответствующие результаты разделения белков, растворимых в солевом буфере. Цифрами обозначены белки: 1 - CISH, 2 - TAF9, 3 - GSTO1,4- TAGLN, 5 - RBP1, б - S100A11, 7-PCBD1, 8 - S100A9, 9 - PPIA, 10 - S100A8, 11 - CAI. Буквами обозначены: |3-актин (АСТВ) и тропомиозин (ТРМ1, две изоформы). Гели окрашивали Кумасси.

Таким образом, в настоящем исследовании продемонстрирована эффективность предложенной модификации метода 2DE анализа. Установлено, что предварительная солевая экстракция приводит к удалению мажорных структурных белков, что позволяет увеличить количество детектируемых минорных белков и повысить чувствительность 2DE анализа.

Для дальнейшего повышения чувствительности двумерного электрофореза после экстракции белков солевым буфером мы применили окраску белков солями серебра вместо красителя Кумасси. На рисунке 2 представлены фрагменты электрофореграмм, полученных после 2DE анализа одной из нескольких пар образцов нормальных и опухолевых тканей (Рис. 2А и 2Б). Сравнение электрофореграмм парных образцов позволило идентифицировать двенадцати белковых пятен, интенсивность которых

заметно возрастает в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой и идентифицировать белки, содержащиеся в семи пятнах: ЕЕР1В2, НЕА ОМА, N111., РИОХЗ, 8Г)НС, ТРИ и ТХМ При этом в пяти случаях (пятна 8-12 в зоне 10-25 кДа) имеющегося в пятне материала оказалось недостаточно для достоверной идентификации белка методами масс-спектрометрии.

-25 -20

■ 15

• - 10

8 рН

Рисунок 2. Фрагменты двумерных электрофореграмм, полученных при разделении белков из нормальной (А) и опухолевой (Б) тканей с использованием солевой экстракции. Панели (В) и (Г) - результаты 20Е разделения растворимых белков после гель-фильтрации объединенных фракций из нормальных и опухолевых тканей, соотвественно (окраска солями серебра). Цифрами обозначены белки: 1 -ЕЕР1В2, 2 - НЬЛ-ЭМА, 3 - ЫКЬ, 4 - РБШХЗ, 5 - ЗБНС, 6 - ТРИ, 7-ТХЫ, Я-БЮОАб, 9-8100А9, 10-ТАОШ, 11-РШХ5, 12- иВВ.

Для идентификации белков в составе пятен, содержащих недостаточное количество материала, была разработана модификация метода 2БЕ, которая включала в дополнение к вышеописанному протоколу следующие процедуры (Букурова и др., 2010):

1) объединение фракций образцов опухолей, в которых было обнаружено повышение концентраций одних и тех же минорных пятен, не детектируемых методами масс-спектрометрии;

2) фракционирование объединённых экстрактов гель-фильтрацией и разделение белков индивидуальных фракций методом ЮЕ.

Модификация позволила успешно идентифицировать белки, содержащихся в минорных пятнах, два из которых обнаруженны нами впервые - Р1ШХ5 и ЦВВ. Кроме того, на электрофореграммах индивидуальных фракций, полученных после гель-фильтрации, появился ряд дополнительных пятен с молекулярной массой 10—25 кДа, что указывает на заметное повышение чувствительности вышеописанной модификации ЮЕ анализа по сравнению с ранее использовавшимся протоколом. Однако, разработанная модификация слишком трудоемка для массового использования.

Анализ полученных результатов показал, что повышение содержания четырех белков (ТХЫ, ТАСЬЫ, 8100А9 и БЮОАб) в опухолях толстой кишки описано ранее, тогда как повышение синтеза восьми белков (ТЧЯЬ, НЬА-ОМА, Р1ШХЗ, ТРИ, ЗЭНС, ЕЕР1В2, Р1ШХ5 и иВВ) обнаружено нами впервые. При этом литературные данные указывают на то, что содержание четырех из восьми белков (НЬА-БМА, ТР11, РГЮХЗ и Р1ШХ5) повышается и в опухолях других типов.

Таким образом, с использованием разработанных подходов было идентифицировано 10 новых белков с повышенным синтезом в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой, краткая характеристика которых приведена в таблице 1. Большинство белков локализуется в ядре, а некоторая часть в цитоплазме и митохондриях. Поскольку использование протеомных подходов не привело к идентификации секреторных белков, пригодных для сывороточной диагностики РТК, был разработан принципиально новый подход их поиска, основанный на использовании методов биоинформатики.

Таблица 1. Характеристика впервые идентифицированных белков с повышенным содержанием в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой

Белок Мол. масса, клеточная локализация Функция белка

CISH Cytokine inducible SH2-containing protein 28.7 кДа, цитоплазма Ингибирование действия цитокинов

TAF9 TAF9 RNA polymerase II ЗОкДа, ядро Регуляция транскрипции (компонент ТАТА-связывающего комплекса)

EEF1B2 eukaryotic translation elongation factor 1 beta 2 24.7 кДа, цитозоль Активация обмена GDP на GTP белком EF-1—а

HLA-DMA major histocompatibility complex, class II, DM alpha 29.2 кДа, мембрана эндосом Освобождение CLIP пептидов белками HLA

NRL neural retina leucine zipper 25.9 кДа, ядро Регуляция экспрессии генов ретины (транскрипционный фактор)

PRDX3 peroxiredoxin 3 27.7 кДа, митохондрии Регуляция окислительно-восстановительных процессов

SDHC succinate dehydrogenase complex 18.6 кДа, внутренняя мембрана митохондрий Окислительное фосфорилирование в системе цепи II переноса электронов митохондрий

ТРИ triosephosphate isomerase 26.7 кДа, цитозоль Катализ изомеризации глицерапьдегид 3-фосфата и дигидрокси-ацетон фосфата в гликолизе и глюконеогенезе

PRDX5 Peroxiredoxin 5 22.0 кДа, митохондрии, цитоплазма, пероксисомы Регуляция окислительно-восстановительных процессов

UBB Ubiquitin В 8.7 кДа, цитоплазма, ядро Деградация белков

2. Разработка алгоритма биоинформатического поиска потенциальных белковых маркеров для сывороточной диагностики опухолей

Белки, уровень которых заметно повышен в опухолях, можно идентифицировать методами биоинформатики при наличии достаточно представительных баз данных. Для сравнительной оценки эффективности поиска онкомаркеров с помощью методов 2DE и биоинформатического анализа имеющихся транскриптомных баз данных (EST, SAGE и Oncomine) была отобрана контрольная панель из 19 белковых маркеров РТК содержание которых заметно и часто повышается в опухолях толстой кишки. На первом этапе был проведен анализ эффективность биоинформатического поиска с использованием базы данных SAGE, содержащей данные серийного анализа генной экспрессии около ста тысяч коротких последовательностей - "ярлыков" в нормальной слизистой толстой кишки (два образца) и ста тысяч ярлыков в опухолях толстой кишки (два образца). Результаты сравнения эффективности анализа базы данных SAGE по сравнению с контрольной панелью, основанной на результатах 2DE и ряда других независимых методов, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнение уровней синтеза маркеров РТК из контрольной панели ( метод 2DE и др.) с результатами поиска в базе данных SAGE

Белок Метод определения повышенного уровня синтеза белка Уровень синтеза мРНК в РТК по данным SAGE

TXN игх +

S100A6 ВБА, ИГХ

S100A9 ОТ-ПЦР, ВБА 0

TAGLN ПЦР-РВ +

S100A8 ОТ-ПЦР, ВБА -

S100A11 БЕГ^-ТОР-МБ 0

GSTOl ВБА, ПЦР-РВ 0

PPIA ИГХ 0

CALR -

PCBD1 ИГХ +

ТРМ1 ВБА, НБА -

HSPD1 ИГХ н/д

CLIC1 -

HSPA5 ИГХ -

СКВ -

HSPA9 ИГХ 0

Сокращения: ИГХ - иммуногистохимия; ВБА - Вестерн блот анализ; НБА -Норзерн блот анализ; ОТ-ПЦР - ПЦР с применением обратной транскрипции; ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени. Плюс - уровень синтеза повышен в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой, минус - уровень синтеза понижен по сравнению с нормой, 0 - уровень синтеза не различается в норме и опухоли.

Как видно из таблицы, результаты, полученные с использованием 2DE анализа, полностью совпали с данными, полученными другими методами, за исключением белка ТРМ1 (изменение уровня синтеза которого в РТК не было выявлено только в одной из четырех цитируемых работ). Анализ уровней экспрессии мРНК, кодирующих белки из панели с использованием базы данных SAGE показал, что в базе представлены данные о 15 из 16 мРНК, причем повышение экспрессии этих мРНК в РТК обнаружено в 33% случаев (Табл. 2). Для остальных 67% маркеров из панели не найдено совпадения результатов SAGE. При этом по результатам анализа базы данных SAGE, в отличие от данных контрольной панели, уровень синтеза пяти мРНК (28%) был одинаковым в нормальных и опухолевых тканях, а уровень семи мРНК (39%) снижался в опухолях. Таким образом, использование базы данных SAGE оказалось неэффективным. Идентификация маркеров РТК in silico на основе анализа уровня транскрипции мРНК может осложняться в результате целого ряда причин. Во-первых, количество образцов, использованных для создания базы SAGE, явно недостаточно для статистически значимой оценки различий в уровнях экспрессии генов в нормальных и опухолевых тканях, что может частично объяснить несовпадение результатов SAGE и контрольной панели. Во-вторых, повышение уровня синтеза белка в опухоли при использовании транскриптомных баз данных во многих случаях просто невозможно зарегистрировать, поскольку повышение концентрации белка часто обусловлено регуляцией на уровне трансляции (Bartel, 2004), что приводит к несовпадению результатов SAGE и 2DE. Наконец, недостаточное количество содержащихся в базе последовательностей-ярлыков часто не позволяет надежно оценить содержание целого ряда низкокопийных мРНК в сравниваемых образцах.

На следующем этапе был проведен сравнительный анализ эффективности использования методов 2DE и биоинформатического поиска в базе данных Oncomine (на примере опухолей желудка и щитовидной железы). База данных Oncomine содержит информацию о профилях экспрессии генов, полученных с помощью гибридизации тотальных мРНК нормальных и опухолевых тканей к коммерчески распространяемым микрочипам. Сравнительный анализ показал совпадение результатов поиска в БД Oncomine и метода 2DE для 65% опухолей желудка (Григорьева и др., 2011) и 75% случаев папиллярного рака щитовидной железы (Sipina et al., 2010).

Для идентификации секреторных белков с повышенным уровнем синтеза в опухолях различной природы был разработан новый алгоритм биоинформатического поиска. Уникальность алгоритма состоит в отборе мРНК-мишеней, регулируемых микроРНК, уровень синтеза которых наиболее часто понижается в опухолях по сравнению с нормой, что должно приводить к увеличению содержания в опухолях белков, кодируемых этими мишенями. В последнее десятилетие стало очевидным, что раковые клетки возникают в результате мутаций в мультипотентных стволовых клетках, приводящих к нарушениям в программе их дифференцировки. Важную роль в регуляции процессов дифференцировки играют микроРНК - короткие одноцепочечные некодирующие белки РНК, синтез которых начинается на ранних стадиях эмбриогенеза и продолжается в течение всей жизни любого многоклеточного организма. Понижение уровня транскрипции некоторых микроРНК, происходящее в опухолевых клетках, является причиной увеличения экспрессии онкогенов, тогда как повышение содержания микроРНК может приводить к снижению экспрессии генов-супрессоры опухолевого роста.

Разработанный алгоритм для идентификации секреторных белков с повышенным уровнем синтеза в опухолях включает пять этапов (см. Рис. 3).

Поиск микроРНК со стабильно пониженным содержанием в РТК

Hptam

t Данные \ V литературы J

10 микроРНК

туг

Идентификация соответствующих мРНК-мишенен

TargetScan \ X microTar

------------w .................

miRanda

Более 2800 мРНК-мишеней

.......:.................................................................

Определение мРНК, кодирующих секреторные белки

Sys-BodyFluid

U'c

LOCATE

I'LOC ) WolfPSORT ) Babelomics )

139 мРНК

Выявление мРНК с повышенным содержанием в опухолях толстой кишки

dbEST

Oncomine

34 мРНК

..................I..................

Идентификация мРНК с низким содержанием в различных нормальных тканях

(СепеНиЬ CEPJS)

1 ( Oncomine

SAGE

Исключение мРНК, кодирующих известные ранее онкомаркеры

I' 7 мРНК потенциальных сывороточных \ \ маркеров опухолей толстой кишки у

Рисунок 3. Диаграмма алгоритма биоинформатического поиска потенциальных белковых маркеров для сывороточной диагностики опухолей.

На первом этапе биоинформатического поиска было отобрано десять микроРНК, уровень синтеза которых наиболее заметно и часто понижается в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой: hsa-mir-1, -9, -99а, -133а, -137, -186, -202, -218, -335, и -340. Идентификация потенциальных мРНК-мишеней этих микроРНК на втором этапе привела к отбору 2800 мРНК, среди которых было идентифицировано 139 мРНК, кодирующих белки, секретируемые в кровоток или во внеклеточное пространство (Рис. 3). На следующем этапе поиска отобрали 34 мРНК, содержание которых значительно повышается в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой, а среди них идентифицировали 14 мРНК с низким содержанием в крови и болыпенства других нормальных тканей (поскольку их использование в сывороточной диагностике опухолей неэффективно). После исключения идентифицированных ранее онкомаркеров было отобрано семь мРНК, кодирующих следующие секреторные белки: AD AMTS 14 (металлопептидаза, содержащая мотив тромбоспондина первого типа), ANGPT2 (ангиопоэтин 2), CCL7 (лиганд хемокина 7, содержащий С-С-мотив), DEFA5 (кишечный а-дефензин 5), ММР11 (металлопептидаза матрикса 11), ММР14 (металлопептидаза матрикса 14, или металлопротеаза мембранного типа 1, внеклеточный фрагмент, которой отщепляется протеазами и может попадать в кровоток и внеклеточное пространство) и PLAU (активатор плазминогена урокиназного типа). Дальнейший анализ показал, что одна из семи мРНК синтезируется исключительно в нормальном эпителии толстой кишки (DEFA5), а другая (ADAMTS14) - содержится во взрослом организме только в опухолях толстой кишки, поскольку кодирующий её ген транскрибируется исключительно в ходе эмбрионального развития человека.

3. Анализ содержания идентифицированных белковых маркеров в нормальных и опухолевых тканях толстой кишки

Для дальнейшего анализа были отобраны два из семи идентифицированных белков: ММР14 и DEFA5. Функция белка ММР14 состоит в деградации белков внеклеточного матрикса (в частности коллагена) в результате активации каскада протеаз, секретируемых во внеклеточное пространство. Частое повышение уровня синтеза ММР14 в опухолях толстой кишки приводит к ускорению их роста и инвазивности. Кроме того, этот белок играет важную роль в процессах ангиогенеза и регуляции пролиферации клеток. В то же время, кишечный альфа дефензин 5 (DEFA5) - это бактерицидный катионный пептид, секретируемый в просвет кишечника и подстилающую соединительную ткань. Анализ имеющихся баз данных секреторных белков давал основание предполагать, что этот белок может массово секретироваться в кровоток при возникновении опухолей.

Методом Вестерн блот анализа показано, что уровень синтеза обоих белков в опухолях заметно повышен, по сравнению с нормальной ткани (Рис.

4). При этом в случае белка ОЕРА5 результаты анализа с использованием коммерческих антител соответствовали информации компании-поставщика (белок мигрирует в районе 12 кДа). В то же время антитела к белку ММР14 выявили мажорный полипептид с молекулярной массой 28 кДа (ожидаемая молекулярная масса 66 кДа), что указывает на расщепление белка протеазами внеклеточного матрикса эпителия толстой кишки (как ранее обнаружено и для других тканей). Поэтому для дальнейшего анализа сывороток онкопациентов был выбран белок ОЕРА5.

N Т N Т N Т N Т N Г 28кОа* т *» " ММР-14

N Т N Т N Т N Т N Т 12 кОа# «9 "Ж ■ • ЦЕРА5

N 'Г N Т N Т N Т N Т 42 к Па -.— —»м I ... —— Ве1а-Ас1м1

ЫТЫТЫТЫТЫТ 36 к Па - — ———— — — ОАРЭН

Рисунок 4. Результаты Вестерн блот анализа содержания белков ММР14 и ЭЕРА5 с использованием коммерческих антител.

4. Сывороточная диагностика рака толстой кишки с использованием основного кишечного альфа дефензина 5

Важными параметрами при отборе мишеней для сывороточной диагностики опухолей являются: 1) специфичность их экспрессии в клетках, из которых образуется опухоль; 2) отсутствие маркера в крови здоровых доноров; 3) степень и частота повышения содержания маркера в сыворотках крови пациентов; 4) стадия опухоли, на которой маркер становится обнаруживаемым в кровотоке. С этой точки зрения наиболее перспективным маркером, идентифицированным с использованием разработанного алгоритма, является основной кишечный альфа дефензин человека. Ранее было показано, что дефензин 5 синтезируется в болыиенстве аденом толстой кишки, что открывает возможность ранней сывороточной диагностики РТК в группах населения повышенного риска.

В нормальных тканях альфа дефензин 5 главным образом секретируется в просвет кишечника и в меньшей степени в подлежащую соединительную ткань. Поэтому в сыворотках крови здоровых доноров он практически не содержится и массово проникает в кровоток лишь при возникновении опухоли. Опубликованные данные указывают на то, что на начальных этапах канцерогенеза мутации в стволовых клетках приводят к конститутивной активации сигнального пути и дифференцировке этих клеток

одновременно по программе клеток-предшественников и клеток Панета. Это приводит к 60-кратному увеличению уровня синтеза дефензинов 5 и 6 в аденомах по сравнению с нормальными клетками. Кроме того, и аденомы и аденокарциномы приобретают способность массово секретировать кишечные альфа дефензины в кровоток. Наконец, было показано, что повышение синтеза альфа дефензина 5 в опухолях толстой кишки приводит к ускорению их роста и инвазивности.

Кишечные альфа дефензины человека синтезируются в виде препробелков-предшественников, часть которых имеет антимикробную активность. Препродефензин 5 (1-94 а.о.) (рисунок 5) содержит сигнальный пептид (1-19 а.о.) и пропептид (20-94 а.о.), который затем процессируется трипсином с образованием мажорного (63-94 а.о.) и минорного (56-94 а.о.) зрелого пептида. Сигнальный пептид необходим для транслокации препродефензина в эндоплазматический ретикулюм, тогда как пропоследовательность (20-55 а.о.) необходима для внутриклеточного трафикинга белка в секреторные пузырьки.

МЯТ1А1ЬАА1 ЬЬУАЬдАдАЕ ЗЬдЕЫАБЕАТ ТСЩ^ЕВ^ ОЬАКРАСЫС ЬЗАЬЯТЗСБд Л1Ъ\ТСУС11ТС КСАТЫЕЗЬЗС УСЕКСМ^Я ЬССЯ

Рисунок 5. Аминокислотная последовательность препробелка альфа-дефензина 5 человека. Синим цветом выделена сигнальная последовательность (1-19 а.о.), черным - пропоследовательность (20-59 а.о.), а красным -последовательность мажорной формы зрелого дефензина (63-94 а.о.).

4.1. Получение высокоаффинных антител к зрелому дефензину 5 4.1.1. Получение антител к конъюгатам пептидов

Предварительные эксперименты по анализу содержания дефензина 5 в образцах сыворотки крови онкопациентов с использованием коммерческих антител показали, что их аффинность и специфичность недостаточны доля надежной детекции белка. Поэтому для определения содержания ОЕЕА5 в

сыворотках были получены моно- и поликлональные антитела. Первоначально, для иммунизации мышей и кроликов использовали конъюгаты трех частично перекрывающихся друг с другом пептидов DEFA5 (59-68 а.о., 67-77 а.о. и 74-89 а.о.) с белком-носителем - шапероном HSP70. Однако титры антисывороток, полученных после иммунизации, оказались чрезвычайно низкими для всех трех конъюгатов (в среднем 1/500- 1/1000).

4.1.2. Получение моноклональных антител

Для получения моноклональных антител к дефензину 5 были синтезированы три гибридных белка, содержащие фрагменты 59-79 а.о., 60-94 а.о., 76-94 а.о. и белок тиоредоксин. Кроме того, для последующей иммунизации был получен рекомбинантный продефензин (20-94 а.о.). Участки ДНК, кодирующие фрагменты белков, синтезировали химически, продукты клонировали в вектор pGEM®-T Easy, секвенировали и после подтверждения правильности последовательности участки ДНК субклонировали в два экспрессионных вектора рЕТ29Ь (в случае продефензина 5) или рЕТ32а (в случае экспрессии гибридов белковых фрагментов).

Анализ показал, что трансфекция штамма E.coli BL21 (DE3) каждой конструкцией приводит к экспрессии ожидаемого продукта с выходом достаточным для дальнейших экспериментов. После отбора бактериальных клонов-продуцентов с наиболее активным синтезом рекомбинантного белка, была проведена препаративная наработка и очистка рекомбинантных белков по стандартной технологии. Технология основывалась на фракционировании бактериальных лизатов центрифугированием и хроматографической очистке рекомбинантных белков содержащих гистидиновую метку на никелевой колонке. Выход негибридного продефензина 5 составил около 0.1 г, а гибридных белков 10-20 г на литр клеточной суспензии.

Мышей иммунизировали тремя полученными гибридными белками, а затем проводили слияние клеток и селекцию гибридом проводили по стандартной технологии (совместно с ОАО ВНЦМДЛ). В результате были отобраны три линиии гибридом, секретирующих моноклональные антитела к DEFA5, в количествах достаточных для проведения дальнейших экспериментов. Специфичность полученных антител оценивали по результатам дот блот анализа тотальных белковых экстрактов опухолей толстой кишки и нормальных тканей. При этом чувствительность детекции антигена по результатам оказалась недостаточно высокой (10 нг, данные не приводятся), что указывает на невозможность использования полученных антител для сывороточной диагностики РТК.

4.1.3. Получение поликлональных антител

Кроликов иммунизировали рекомбинантным продефензином 5. При этом, хотя титр антисывороток оказался невысоким (1/30000), аффинность антител оказалась весьма значительной, поскольку их очистка проводилась с использованием нового способа, основанного на конкурентной аффинной хроматографии и последующей гель-фильтрации высокоаффинных антител, разработанного в нашей лаборатории. Чувствительность детекции антигена ТКХ-ОЕЕА5 (60-94 а.о.) с использованием полученных антител составила 3-10 пг (Рис. 6), а их средняя аффинность (Ка) оказалась равной 109 литр/моль. Таким образом, разработанная технология получения высокоаффинных поликлональных антител позволяет увеличить специфичность антител в сто и более раз по сравнению с коммерческими аналогами, что позволяет диагностировать появление опухолей на более ранних этапах их развития. Использование нового способа очистки антител также открывает возможность резкого увеличения чувствительности детекции низкокопийных белков в образцах тканей и биологических жидкостей и значительного повышения эффективности иммунологических методов сывороточной диагностики и прогнозирования ряда социально значимых заболеваний.

Юнг 1нг Юпг 1пг

« • т #

Рисунок 6. Определение чувствительности поликлональных антител к ОЕРА5 методом дот блот анализа. Сверху указано количество гибридного белка ТЮС-ОЕЕА5 в пятне.

Специфичность полученных антител (т.е. отсутствие перекреста с другими белками) оценивали по результатам Вестерн блот анализа тотальных белковых экстрактов опухолей толстой кишки и нормальных тканей. Показано, что предшественник альфа дефензина 5, синтезируемый в опухолях толстой кишки (м.в. 11 кДа) процессируется протеазами крови (5 кДа) после секреции в кровоток. При этом количество белка предшественника заметно возрастает в двух из семи проанализированных образцов опухолей толстой кишки (Рис. 7), что соответствует ранее полученным результатам иммуногистохимического анализа.

ВЕРА5 Т N Т N Т N Т N1 N I N Т N кДа

Рисунок 7. Определение чувствительности поликлональных антител к альфа дефензину 5 (1ЖНЛ5) в парных образцах методом Вестерн блот анализа (в последних трех дорожках, содержащих экстракты нормальных тканей, добавлены указанные количества гибридного белка П)ЕРА5-ТКХ). АСТВ - |3-актин.

4.2. Сравнительный анализ количества дефензина 5 в сыворотках крови пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки и здоровых

доноров

Анализ количества дефензина 5 в образцах сывороток крови проводили методом Вестерн блот анализа иммунопреципитатов. Для получения иммунопреципитатов поликлональные антитела к ОЕРА5 иммобилизовали на агарозе, конъюгированной с белком А, и инкубировали аликвоты агарозы с образцами сывороток крови, а затем связавшиеся с носителем белки сыворотки элюировали. Результаты количественного анализа присутствия дефензина 5 в иммунопреципитатах методом Вестерн блот анализа, представленные на рисунке 8, показали, что зрелый дефензин 5 обнаруживается в образцах сыворотки крови 30% онкопациентов при полном его отсутствии в крови здоровых доноров. Согласно БД Опсотте, уровень синтеза мРНК, кодирующей ЭЕРА5, в 85% случаев повышается в 15 раз в аденомах по сравнению с нормальной тканью, тогда как в аденокарциномах повышение содержания этого белка обнаруживается в 20% случаев.

Таким образом, проведенный нами анализ показал, что кишечный альфа дефензин 5 является маркером для сывороточной диагностики субпопуляции опухолей толстой кишки, частично дифференцирующихся по программе клеток Панета. Этот результат продемонстрировал эффективность разработанного алгоритма поиска сывороточных маркеров опухолей.

123 4 56789 10 NNN NN TT TTT kDa

Рисунок 8. Анализ присутствия БЕРА5 в сыворотках здоровых доноров (дорожки 1-5) и пациентов с аденокарциномой толстой кишки (дорожки 6-10) методом иммунопреципитации и последующего Вестерн блот анализа. Стрелка указывает положение процессированного белка.

Выводы

1. Разработаны две модификации метода сравнительного 2DE анализа протеомов, повышающие его чувствительность. Использование разработанных модификаций позволило обнаружить 10 новых белков с повышенным уровнем содержания в опухолях толстой кишки по сравнению с нормой: CISH, TAF9, EEF1B2, HLA-DMA, NRL, PRDX3, SDHC, TPI1, PRDX5 и UBB.

2. Разработан новый алгоритм биоинформатического поиска секреторных белков для сывороточной диагностики опухолей. Использование алгоритма привело к отбору семи секреторных белков: ADAMTS14, ANGPT2, CCL7, DEFA5, ММР11, ММР14 и PLAU.

3. С использованием новой технологии получены высокоаффинные поликлональные антитела к одному из белков, идентифицированных с использованием алгоритма - зрелому дефензину 5. Показано, что этот белок надежно обнаруживается в 20% сывороток онкопациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки при полном его отсутствии в крови здоровых доноров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Краснов Г.С., Ханкин СЛ., Букурова Ю.А., Зацепина О.Г., Опарина Н.Ю., Гарбуз Д.Г., Ершов А.Н., Машкова Т.Д., Карпов В.Л., Берестень С.Ф. 2009. Протеом злокачественных опухолей толстой кишки человека: идентификация растворимых белков с повышенным содержанием в опухоли. Молекуляр. биология. 43, 610-615.

2. Григорьева Е.С., Букурова Ю.А., Чердынцева Н.В., Афанасьев С.Г., Комарова Т.В., Тузиков С.А., Родичева Н.С., Берестень С.Ф. 2009. 20-протеомика рака желудка: идентификация белков с повышенным синтезом в опухоли. Сибирский онкологический журнал. 5(35), 37-42.

3. Степанов И.В., Завьялова М.В., Григорьева Е.С., Букурова Ю.А., Афанасьев С.Г., Чердынцева Н.В. 2010. Клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности интестинального и диффузного типов карцином желудка. Сибирский онкологический журнал. 4 (40), 55-66.

4. Букурова Ю.А., Ханкин C.JL, Краснов Г. С., Григорьева Е.С., Машкова Т.Д., Лисицын H.A., Карпов В.Л., Берестень С.Ф. 2010. Оценка эффективности идентификации белковых маркеров опухолей толстой кишки методами 2D-анализа и биоинформатического поиска. Молекуляр. биология. 44, 375-381.

5. Сипина Л.В., Букурова Ю.А., Никитина И.Г., Краснов Г.С., Сергеев A.C., Лисицын H.A., Карпов В.Л., Берестень С.Ф. 2010 Идентификация белков с повышенным уровнем синтеза в папиллярных опухолях щитовидной железы. Биохимия т. 75, вып. 9, с. 1284 - 1289.

6. Букурова Ю.А., Никитина И.Г., Ханкин С.Л., Краснов Г.С., Лисицын H.A., Карпов В.Л., Берестень С.Ф 2011. Поиск белковых маркеров для сывороточной диагностики рака на основе анализа профилей экспрессии микроРНК. Молекуляр. биология. 45, 376-381.

7. Григорьева Е.С., Букурова Ю.А., Краснов Г.С., Афанасьев С.Г., Чердынцева Н.В., Тузиков С.А., Чойнзонов Е.Л., Карпов В.Л., Лисицын H.A., Берестень С.Ф. 2011. Идентификация белков с повышенным уровнем синтеза в злокачественных опухолях желудка: сравнение результатов двумерного электрофореза и биоинформатического поиска. Молекуляр. Биология. 45, 738743.

8. Lisitsyn N.A., Bukurova Yu.A., Nikitina I.G., Krasnov G.S., Sykulev Yu., Beresten S.F. 2012. Enteric alpha defensins in norm and pathology. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 11,1.

9. Никитина И.Г., Букурова Ю.А., Краснов Г.С., Гринева E.H., Карпов В.Л., Лисицын H.A., Берестень С.Ф. 2012.Структура и функция а-дефензинов в норме и патологии. Молекуляр. Биология. 46, 31-36.

Заказ № 36-П/08/2012 Подписано в печать 29.08.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Букурова, Юлия Александровна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МЕТОДЫ ПРОТЕОМИКИ

1.1. Методы протеомики in vitro

1.1.1. Двумерный гель-электрофорез

1.1.2. Двумерный дифференциальный гель-электорофорез

1.1.3. SELDI

1.2. Методы обратной протеомики

1.2.1. SEREX

1.2.2. Proteomex

1.2.3. AMIDA

1.3. Методы протеомики in silico

1.3.1. Биоинформатический поиск в базе данных Oncomine

1.3.2. Биоинформатический поиск в базе данных EST

1.3.3. Биоинформатический поиск в базе данных SAGE 26 МЕТОДЫ ТРАНСКРИПТОМИКИ

1.4. Профилирование экспрессии микроРНК

1.5. Высокопроизводительное секвенирование нкРНК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение образцов ткани

2.2. Получение сывороток крови

2.3. Экстракция белков

2.4. Определение концентрации белков

2.5. Разделение белков в ПААГ

2.5.1. Метод одномерного гель-электрофореза

2.5.2. Метод двумерного гель-электрофореза

2.5.3. Метод трис-трицинового гель-электрофореза

2.6. Окрашивание гелей Кумасси G

2.7. Окрашивание гелей солями серебра

2.8. Гель-фильтрация объединенных белковых экстрактов

2.9. Идентификация белков

2.10. Биоинформатический поиск потенциальных белковых маркеров опухолей толстой кишки

2.10.1. Поиск в БД SAGE

2.10.2. Поиск микроРНК

2.11. Вестерн блот анализ

2.12. Иммунопреципитация зрелого дефензина 5 из сывороток крови

2.13. Получение моно- и поликлональных антител к дефензину

2.13.1. Получение рекомбинантных фрагментов и конъюгатов синтетических пептидов дефензина

2.13.2. Получение монклональных антител к зрелому дефензину

2.13.3. Получение поликлональных антител к зрелому дефензину

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Поиск сыворточных белковых маркеров опухолей толстой кишки

3.1.1. Сравнительный анализ изменений протеома нормальных и опухолевых тканей с помощью метода 2DE

3.2. Разработка алгоритма биоинформатического поиска потенциальных белковых маркеров для сывороточной диагностики опухолей

3.3. Анализ содержания идентифицированных белковых маркеров в нормальных и опухолевых тканях толстой кишки

3.4. Сывороточная диагностика рака толстой кишки с использованием основного кишечного альфа дефензина

3.4.1. Получение высокоаффинных антител к зрелому дефензину

3.4.1.1. Получение антител к конъюгатам пептидов

3.4.1.2. Получение моноклональных антител

3.4.1.3. Получение поликлональных антител

3.4.2. Сравнительный анализ количества дефензина 5 в сыворотках крови здоровых доноров и пациентов с диагнозом аденокарцинома толстой кишки

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белковые маркеры для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки"

Рак толстой кишки (РТК) является одним из наиболее распространенных видов рака в мире (Jemal et al., 2006; http://www.cancer.org/docroot/home/index.asp). В России ежегодно диагностируется более 50 ООО случаев заболевания РТК, и более половины пациентов умирают в течение пяти лет после постановки диагноза. Это связано с отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания и явным недостатком эффективных методов ранней диагностики, прогнозирования и лечения РТК.

В настоящее время проводят интенсивные исследования механизмов канцерогенеза РТК для разработки новых терапевтических подходов и поиск потенциальных молекулярных маркеров, пригодных для ранней диагностики и/или прогнозирования течения заболевания. Однако выявленные до настоящего момента потенциальные маркеры РТК не достаточно надежны и чувствительны и непригодны для диагностики.

Протеомные маркеры - это белки, содержание которых изменяется в опухоли по отношению к норме (Duncan et al., 2008; Ruginis et al., 2006). Использование протеомных маркеров представляется весьма актуальным: они достаточно стабильны в сыворотке крови, опухоле-специфичны и могут быть обнаружены быстрыми методами, не требующими многостадийных процедур. Для детекции протеомных маркеров применяют масс-спектрометрические и/или иммунохимические методы, которые на несколько порядков менее чувствительны, чем методы, основанные на ПНР - 10"12 - 10" 14 г по сравнению с 10"15-10"18 г.

Для выявления потенциальных белков-маркеров широко применяют профильную протеомику, основанную на сравнении белковых профилей в нормальной и опухолевой тканях методом 2DE гель-электрофореза и последующим масс-спектрометрическим определением белков с наиболее достоверными различиями в их содержании в сравниваемых парах образцов (Cho, 2007).

При выборе потенциального протеомного маркера следует учитывать, что в опухоли, начиная с самых ранних стадий, процессы деградации и протеолиза белка проходят значительно активнее, чем в нормальной ткани (Wasch and Engelbert, 2005; Yamasaki and Pagano, 2004). В результате этого в крови пациентов могут присутствовать небольшие фрагменты крупных белков, в том числе нерастворимых, мембранных и структурных, таких как, например, коллаген (Ylisirniö et al., 2001; Ghosh et al., 1990). Это позволяет при разработке методов сывороточной диагностики РТК ориентироваться как на небольшие секреторные белки, способные выйти в кровоток из нормальных тканей, так и на более крупные белки.

Двадцатилетние усилия по идентификации сывороточных маркеров опухолей толстой кишки привели к выявлению шестнадцати белков, лишь небольшая часть которых используется в клинической практике. Наиболее используемым маркером является карциноэмбриональный антиген (CEA) -мембранный гликопротеин, повышение уровня синтеза которого в сыворотке до 2.5 нг/мл ассоциировано с плохим прогнозом развития опухоли. Хотя специфичность экспрессии этого маркера в опухолях толстой кишки весьма высока (87%), чувствительность современных методов его детекции не превышает 30-40% (Kim et al., 2008). Кроме того, СЕА-маркер неприменим для ранней диагностики опухолей, поскольку уровень его синтеза заметно повышается при целом ряде нераковых заболеваний (воспаление кишечника, легких и панкреатит).

Вторым по значению маркером опухолей толстой кишки является полисахарид CA 19-9 (антиген группы крови Льюиса типа а), который оказался весьма информативным маркером рака поджелудочной железы, но значительно уступает CEA по специфичности детекции и прогнозирования развития опухолей толстой кишки. Наконец, третьим (хотя и малоиспользуемым) маркером является белок TIMP-1, ингибирующий активность металлопротеиназ типа 1. Повышенная экспрессия TIMP-1, по-видимому, характерна для не инвазивных опухолевых клеток, пытающихся «нащупать» способ деградации базальной мембраны и выхода в кровоток. Количественный анализ уровня синтеза этого маркера в сыворотке крови может быть использован для выявления опухолей на относительно ранних стадиях их развития.

В последнее пятилетие усилиями коммерческих компаний был идентифицирован целый ряд маркеров опухолей толстой кишки, надежность и информативность использования которых для сывороточной диагностики в настоящее время оценивается в различных лабораториях (спондин-2, TRAIL рецептор 2, 6 В рецептор TNF, а-дефензины, фактор ингибирующий миграцию макрофагов и др.).

Наконец, многообещающие данные были получены в результате анализа изменения профилей экспрессии микроРНК в опухолях толстой кишки (Schetter et al., 2008). Было показано, что повышенная экспрессия микроРНК miR-21, по-видимому, блокирующей синтез генов-супрессоров, подавляющих развитие опухолей, связана с плохим прогнозом, риском повторного роста опухоли после операции и низкой эффективностью терапевтического воздействия. Неожиданно оказалось, что повышение экспрессии miR-21 происходит в аденомах (это первый обнаруженный маркер раннего развития опухолей). Весьма вероятно, что впоследствии будут идентифицированы микроРНК, синтез которых, напротив, понижается на ранних стадиях канцерогенеза в доброкачественных опухолях. Секретируемые белки, кодируемые мишенями этих микроРНК, могут оказаться ценными маркерами для ранней сывороточной диагностики опухолей в группах пациентов повышенного риска.

Целью данной работы являлась идентификация белковых маркеров, пригодных для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Сбор коллекции образцов нормальных и опухолевых тканей, а также сывороток крови пациентов с диагнозом рак толстой кишки.

2. Дифференциальный анализ методами масс-спекрометрии, протеомов парных образцов норма-опухоль с целью идентификации белков с повышенным содержанием в опухолях по сравнению с нормой.

3. Биоинформатический поиск белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток или во внешклеточное пространство, уровень синтеза которых заметно повышается в опухолях.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Букурова, Юлия Александровна

выводы

2. Разработан новый алгоритм биоинформатического поиска секреторных белков для сывороточной диагностики опухолей. Использование алгоритма привело к отбору семи секреторных белков: AD AMTS 14, ANGPT2, CCL7, DEFA5, ММР11, ММР14 и PL AU.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Букурова, Юлия Александровна, Москва

1. Букурова Ю.А., Ханкин С.Л., Краснов Г. С. и др. 2010. Оценка эффективности идентификации белковых маркеров опухолей толстой кишки методами 2В-анализа и биоинформатического поиска. Молекуляр. биология. 44,375-381.

2. Букурова Ю.А., Никитина И.Г., Ханкин С.Л. и др. 2011. Поиск белковых маркеров для сывороточной диагностики рака на основе анализа профилей экспрессии микроРНК. Молекуляр. биология. 45, 376-381.

3. Григорьева Е.С., Букурова Ю.А., Краснов Г.С. и др. 2011. Идентификация белков с повышенным уровнем синтеза в злокачественных опухолях желудка: сравнение результатов двумерного электрофореза и биоинформатического поиска. Молекуляр. биология. 45, 738-743.

4. Краснов Г.С., Опарина Н.Ю., Ханкин С.Л. и др. 2009. 2-D потеомика рака толстой кишки: идентификация белков с измененным содержанием в опухоли. Молекуляр. биология. 43, 348-356.

5. Краснов Г.С., Ханкин С.Л., Букурова Ю.А. и др. 2009. Протеом злокачественных опухолей толстой кишки человека: идентификация растворимых белков с повышенным содержанием в опухоли. Молекуляр. биология. 43, 610-615.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. 1984. Молекулярное клонирование. М: Мир.

7. Никитина И.Г., Букурова Ю.А., Краснов Г.С. и др. 2012. Структура и функция а-дефензинов в норме и патологии. Молекуляр. Биология. 46, 31-36.

8. Adams M.D., Kelley J.M., Gocayne J.D., et al. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science. 252, 1651-1656.

9. Alfonso P., Nunez A., Madoz-Gurpide J., et al. 2005. Proteomic expression analysis of colorectal cancer by two-dimensional differential gel electrophoresis. Proteomics. 10, 2602-2611.

10. Alon U., Barkai N., Notterman D.A., et al. 1999. Broad patterns of gene expression revealed by clustering analysis of tumor and normal colon tissues probed by oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6745-6750.

11. Alrawi S.J., Schiff M., Carroll R.E., et al. 2006. Aberrant crypt foci. Anticancer Res.26, 107-119.

12. Al-Shahrour F., Carbonell J., Minguez P., et al. 2008. Babelomics: advanced functional profiling of transcriptomics, proteomics and genomics experiments. Nucleic Acids Res. 36, W341-6.

13. Amanda P. Liggins, Barbara A. Guinn, et al. 2005. Identification of Lymphoma-Associated Antigens Using SEREX. Methods Mol Med. 115, 109-128.

14. Bandyopadhyay S., Mitra R., Maulik U., et al. 2010. Development of the human cancer microRNA network. Silence. 1,6.

15. Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297.

16. Basile J.R., Holmbeck K., Bugge T.H., et al. 2007. MT1-MMP controls tumor-induced angiogenesis through the release of semaphorin 4D. J. Biol. Chem. 282, 6899-6905.

17. Bjellqvist B., Ek K., Righetti P.G., Gianazza E., et al. 1982 Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. JBiochem Biophys Methods. 6, 317-39.

18. Bischoff R., Luider T.M. 2004. Methodological advances in the discovery of protein and peptide disease markers. J Chromatogr B Analyt Technol BiomedLife Sci. 803, 27-40.

19. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

20. Byun H.O., Han N.K., Lee H.J., et al. 2009. Cathepsin d and eukaryotic translation elongation factor 1 as promising markers of cellular senescence. Cancer Res. 69, 4638-4647.

21. Caputo E., Moharram R., Martin B.M. 2003. Methods for on-chip protein analysis. Anal Biochem. 321, 116-124.

22. Castle J.C., Armour C.D., Lower M., et al. 2010. Digital genome-wide ncRNA expression, including SnoRNAs, across 11 human tissues using polyA-neutral amplification. PLoS One. 5, el 1779.

23. Chaurand P., DaGue B.B., Pearsall R.S., et al. 2001. Profiling proteins from azoxymethaneinduced colon tumors at the molecular level by matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Proteomics. 10, 1320-1326.

24. Cho W.C., Cheng C.H. 2007. Oncoproteomics: current trends and future perspectives. Expert Rev. Proteomics. 4, 401^410.

25. Collet B., Guitton N., Sa'ikali S., et al. 2011. Differential analysis of glioblastoma multiforme proteome by a 2D-DIGE approach. Proteome Sci. 9, 16

26. Cottingham K. 2006. HUPO Plasma Proteome Project: challenges and future directions. J Proteome Res. 5, 1298.

27. Cummins J.M., He Y., Leary R.J., et al. 2006. The colorectal microRNAome. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 3687-3692.

28. Duncan R., Carpenter B., Main L.C., et al. 2008. Characterisation and protein expression profiling of annexins in colorectal cancer. Br J Cancer. 98, 426-433.

29. Dundas S.R., Lawrie L.C., Rooney P.H., et al. 2005. Mortalin is over-expressed by colorectal adenocarcinomas and correlates with poor survival. J. Pathol. 205, 74-81.

30. Elphick D., Liddell S., Mahida Y.R. 2008. Impaired luminal processing of human defensin-5 in Crohn's disease: persistence in a complex with chymotrypsinogen and trypsin. Am J Pathol. 172, 702-713.

31. Eskinazi R., Thony B., Svoboda M., et al., 1999. Overexpression of pterin-4a-carbinolamine dehydratase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 in human colon cancer. Am. J. Pathol. 155, 1105-1113.

32. Friedman D.B., Hill S., Keller J.W., et al., 2004. Proteome analysis of human colon cancer by two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics. 4, 793-811.

33. Friedman R.C., Farh K.K., Burge C.B., et al. 2009. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105.

34. Gallego M., Virshup D.M. 2007. Post-translational modifications regulate the ticking of the circadian clock. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 139-148.

35. Garrisi V.M., Abbate I., Quaranta M., et al. 2008. SELDI-TOF serum proteomics and breast cancer: which perspective? Expert. Rev. Proteomics. 5, 779-785.

36. Gelfi C., Bossi M.L., Bjellqvist B., et al. 1987. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients in the pH 10-11 range. J Biochem Biophys Methods. 15, 41-48.

37. Ge X., Yamamoto S., Tsutsumi S., et al. 2005. Interpreting expression profiles of cancers by genome-wide survey of breadth of expression in normal tissues. Genomics. 86, 127-141.

38. Ghavami S, Kerkhoff C, Los M, et al, 2004. Mechanism of apoptosis induced by S100A8/A9 in colon cancer cell lines: the role of ROS and the effect of metal ions. J. Leukoc. Biol. 76, 169-175.

39. Ghosh M, Aroor A.R, Raghavan M.R. 1990. Clinical utility of serum fibrinogen degradation products (FDP) in the diagnostic and prognostic evaluation of oral cancer. Ann Dent. 49, 11-12.

40. Ghosh D, Porter E, Shen B, et al. 2002. Paneth cell trypsin is the processing enzyme for human defensin-5. Nat. Immunol. 3, 583-590.

41. Gires O, Münz M, Schaffrik M, et al. 2004. Profile identification of disease-associated humoral antigens using AMIDA, a novel proteomics-based technology. Cell. Mol. Life Sei. 61, 1198-1207.

42. Graudens E, Boulanger V, Mollard C, et al. 2006. Deciphering cellular states of innate tumor drug responses. Genome Biol. 7, R19.

43. Gibb E.A, Brown C.J, Lam W.L. 2011. The functional role of long non-coding RNA in human carcinomas. Mol. Cancer. 10, 38.

44. Griffiths-Jones S, Saini H.K, van Dongen S, et al. 2008. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-8.

45. Guttman M, Garber M, Levin J.Z, et al. 2010. Ab initio reconstruction of cell type-specific transcriptomes in mouse reveals the conserved multi-exonic structure of lincRNAs. Nat. Biotechnol. 28, 503-510.

46. Haleem J. Issaq and Timothy D. Veenstra. 2008. Two-dimensional Polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE): advances and perspectives. BioTechniques. 44, 697-700.

47. Horton P, Park K.J, Obayashi T, et al. 2007. WoLF PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Res. 35(Web Server issue):W585-587.

48. Hsiao L.L, Dangond F, Yoshida T, et al. 2001. A compendium of gene expression in normal human tissues. Physiol Genomics. 7, 97-104.

49. Hutchens T.W., Yip T. 1993. New Desorption strategies for the mass spectrometric analysis of macromolecules. Rapid Commun Mass Spectrom. 7, 576-580.

50. Issaq H.J., Veenstra T.D., Conrads T.P., et al. 2002. The SELDI-TOF MS approach to proteomics: Protein profiling and biomarker identification. Biochem Biophys Res Comm. 292, 587-592.

51. Jastaniah W.A., Alessandri A.J., Reid G.S., et al. 2006. HLA-DM expression is elevated in ETV6-AML1 translocation-positive pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leuk. Res. 30, 487-489.

52. Jemal A., Siegel R., Ward E., et al. 2006. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 56, 106-130.

53. John B., Enright A.J., Aravin A., et al. 2004. Human MicroRNA targets. PLoS Biol. 2, e363.

54. Joo M., Shahsafaei A., Odze R.D. 2009. Paneth cell differentiation in colonic epithelial neoplasms: evidence for the role of the Apc/beta-catenin/Tcf pathway. Hum Pathol. 40, 872-880.

55. Kaiser S., Park Y.K., Franklin J.L., et al. 2007. Transcriptional recapitulation and subversion of embryonic colon development by mouse colon tumor models and human colon cancer. Genome Biol. 8, R131.

56. Ki D.H., Jeung H.C., Park C.H., et al. 2007. Whole genome analysis for liver metastasis gene signatures in colorectal cancer. Int J Cancer. 121, 2005-2012.

57. Kim H.J., Kang H.J., Lee H., et al. 2009. Identification of S100A8 and S100A9 as Serological Markers for Colorectal Cancer. J. Proteome Res. 8, 1368-1379.

58. Kim K.I., Baek S.H. 2006. SUMOylation code in cancer development and metastasis. Mol. Cells. 22, 247-253.

59. Klade C.S., Voss T., Krystek E., et al. 2001. Identification of tumor antigens in renal cell carcinoma by serological proteome analysis. Proteomics. 1, 890-898.

60. Klade C.S. 2002. Proteomics approaches towards antigen discovery and vaccine development. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 216-223.

61. Kobayashi K.S., Chamaillard M., Ogura Y., et al. 2005. Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract Science. 307, 731-734.

62. Koenig R., Stegemann H., Francksen H., et al. 1970. Protein subunits in the potato virus X group. Determination of the molecular weights by polyacrylamide electrophoresis. Biochim. Biophys. Acta. 207, 184-189.

63. Komatsu K., Murata K., Kameyama M., et al. 2002. Expression of S100A6 and S100A4 in matched samples of human colorectal mucosa, primary colorectal adenocarcinomas and liver metastases. Oncology. 63, 192-200.

64. Krueger K.E., Srivastava S. 2006. Posttranslational protein modifications: current implications for cancer detection, prevention, and therapeutics. Mol. Cell Proteomics. 5, 1799-1810.

65. Kummola L., Hamalainen J.M., Kivela J., et al. 2005. Expression of a novel carbonic anhydrase, CA XIII, in normal and neoplastic colorectal mucosa. BMC Cancer. 5, 41.

66. Kuramochi J., Arai T., Ikeda S., et al. 2006. High Pinl expression is associated with tumor progression in colorectal cancer. J. Surg. Oncol. 94, 155-160.

67. Kussmann M., Roepstorff P. 2000. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol. 146, 405-424

68. Laemmly U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

69. Lee S.K., Calin G.A. 2011. Non-coding RNAs and cancer: new paradigmsin oncology. Discov. Med. 11, 245-254.88

70. Le Naour F., Hohenkirk L., Grolleau A., et al. 2001. Profiling changes in gene expression during differentiation and maturation of monocyte-derived dendritic cells using both oligonucleotide microarrays and proteomics. J. Biol.Chem. 276, 17920-17931.

71. Lichtenfels R., Kellner R., Bukur J., et al. 2002. Heat shock protein expression and anti-heat shock protein reactivity in renal cell carcinoma. Proteomics. 2, 561-570.

72. Lin J.L., Geng X., Bhattacharya S.D., et al. 2002. Isolation and sequencing of a novel tropomyosin isoform preferentially associated with colon cancer. Gastroenterology. 123, 152-162.

73. Li S.J., Peng M., Li H., et al. 2009. Sys-BodyFluid: a systematical database for human body fluid proteome research. Nucleic Acids Res. 37(Database issue) :D907-912.

74. Lisitsyn N.A., Bukurova Y.A., Nikitina I.G., et al. 2012. Enteric alpha defensins in norm and pathology. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 11, 1.

75. Liu L., Zhao L., Zhang Y., et al. 2007. Proteomic analysis of Tiaml-mediated metastasis in colorectal cancer. Cell Biol. Int. 31, 805-814.

76. Liu J.Y., Jin L., Zhao M.Y., et al. 2011. New serum biomarkers for detection of tuberculosis using surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry. Clin. Chem. Lab. Med. 49, 1727-1733.

77. Lu J., Getz G., Miska E.A., et al. 2005. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838.

78. Luo L., Chen W.D., Pretlow T.P. 2005. CpG island methylation in aberrant crypt foci and cancers from the same patients. Int. J. Cancer. 115, 747-751.

79. Mann M., Jensen O.N. 2003. Proteomic analysis of post-translational modifications. Nat. Biotechnol. 21, 255-261.

80. Maupas-Schwalm F., Bedel A., Auge N., et al. 2009. Integrin alpha(v)beta(3), metalloproteinases, and sphingomyelinase-2 mediate urokinase mitogenic effect. Cell Signal. 21, 1925-1934.

81. Mazzanti R., Solazzo M., Fantappie O., et al. 2006. Differential expression proteomics of human colon cancer. Am. J.Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 1329-1338.

82. Melle C., Ernst G., Schimmel B., et al. 2006. Different expression of calgizzarin (S100A11) in normal colonic epithelium, adenoma and colorectal carcinoma. Int. J. Oncol. 28, 195-200.

83. Melle C., Ernst G., Schimmel B., et al. 2008. Colon-derived liver metastasis, colorectal carcinoma, and hepatocellular carcinoma can be discriminated by the Ca(2+)-binding proteins S100A6 and S100A11. PLoS One. 3, e3767.

84. Mitchell P.S., Parkin R.K., Kroh E.M., et al. 2008. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 10513-10518.

85. Morrissy A.S., Morin R.D., Delaney A., et al. 2009. Next-generation tag sequencing for cancer gene expression profiling. Genome Res. 19, 18251835.

86. Morrissy S., Zhao Y., Delaney A., et al. 2010. Digital gene expression by tag sequencing on the illumina genome analyzer. Curr. Protoc. Hum. Genet. Chapter 11: Unit 11.11.1-36.

87. Mortz E., Krogh T., Vorum H., Gorg A. 2001. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 13591363.

88. Naqvi A.R., Islam M.N., Choudhury N.R., et al. 2009. The fascinating world of RNA interference. IntJBiol Sci. 5, 97-117.

89. Notterman D.A., Alon U., Sierk A.J., et al. 2001. Transcriptional gene expression profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue examined by oligonucleotide arrays. Cancer Res. 61, 3124-3130.

90. O'Farrell P.H. 1975. High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021.

91. Panzitt K., Tschernatsch M.M., Guelly C., et al. 2007. Characterization of HULC, a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma, as noncoding RNA. Gastroenterology. 132, 330-342.

92. Park K.J., Kanehisa M. 2003. Prediction of protein subcellular locations by support vector machines using compositions of amino acids and amino acid pairs. Bioinformatics. 19, 1656-1663.

93. Patel D.J., Ma J.B., Yuan Y.R., et al. 2006. Structural biology of RNA silencing and its functional implications. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 71, 81-93.

94. Petrova D.T., Asif A.R., Armstrong V.W., et al. 2008. Expression of chloride intracellular channel protein 1 (CLIC1) and tumor protein D5 2 (TPD52) as potential biomarkers for colorectal cancer. Clin. Biochem. 41, 1224-1236.

95. Pierleoni A., Martelli P.L., Fariselli P., et al. 2007. eSLDB: eukaryotic subcellular localization database. Nucleic Acids Res. 35(Database issue):D208-212.

96. Radeva M.Y., Jahns F., Wilhelm A., et al. 2010. Defensin alpha 6 (DEFA 6) overexpression threshold of over 60 fold can distinguish between adenomaand fully blown colon carcinoma in individual patients. BMC Cancer. 10, 588.

97. Raffel J., Bhattacharyya A.K., Gallegos A., et al. 2003. Increased expression of thioredoxin- in human colorectal cancer is associated with decreased patient survival. J. Lab. Clin. Med. 142, 46-51.

98. Rajabi M., de Leeuw E., Pazgier M., et al. 2008. The conserved salt bridge in human alpha-defensin 5 is required for its precursor processing and proteolytic stability. The Journal of biological chemistry. 283, 21509-21518.

99. Rauch J., Ahlemann M., Schaffrik ML, et al. 2004. Allogenic antibody-mediated identification of head and neck cancer antigens. Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 156-162.

100. Rauch J., Gires O. 2008. SEREX, Proteomex, AMIDA, and beyond: Serological screening technologies for target identification. Proteomics Clin. Appl. 2,355-371.

101. Rhodes D.R., Kalyana-Sundaram S., Mahavisno V., et al. 2007. Oncomine 3.0: genes, pathways, and networks in a collection of 18,000 cancer gene expression profiles. Neoplasia. 9, 166-180.

102. Rhodes D.R., Yu J., Shanker K., et al. 2004. ONCOMINE: a cancer microarray database and integrated data-mining platform. Neoplasia. 6, 1-6.

103. Roth R.B., Hevezi P., Lee J., et al. 2006. Gene expression analyses reveal molecular relationships among 20 regions of the human CNS. Neurogenetics. 7, 67-80.

104. Ruginis T., Taglia L., Matusiak D., et al. 2006. Consequence of gastrin-releasing peptide receptor activation in a human colon cancer cell line: a proteomic approach. JProteome Res. 5, 1460-1468.

105. Ruijter J.M., Van Kampen A.H., Baas F. 2002. Statistical evaluation of SAGE libraries: consequences for experimental design. Physiol Genomics. 11, 37-44.

106. Sabates-Bellver J., Van der Flier L.G., de Palo M., et al. 2007. Transcriptome profile of human colorectal adenomas. Mol Cancer Res. 5, 1263-1275.

107. Saha S., Sparks A.B., Rago C., et al. 2002. Using the transcriptome to annotate the genome. Nat Biotechnol. 20, 508-512.

108. Salzman N.H., Hung K., Haribhai D., et al. 2010. Enteric defensins are essential regulators of intestinal microbial ecology. Nat Immunol. 11, 76-83.

109. Scanlan M.J., Gout I., Gordon C.M., et al. 2001. Humoral immunity to human breast cancer: antigen definition and quantitative analysis of mRNA expression. Cancer Immun. 1, 4.

110. Scanlan M.J., Simpson A.J., Old L.J. 2004 The cancer/testis genes: review, standardization, and commentary. Cancer Immun. 4, 1.

111. Scanlan M.J., Welt S., Gordon C.M., et al. 2002. Cancer-related serological recognition of human colon cancer: identification of potential diagnostic and immunotherapeutic targets. Cancer Res. 62, 4041-4047.

112. Schagger, H., von Jagow G. 1987. Tricine sodium sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the sepration of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379.

113. Schetter A.J., Leung S.Y., Sohn J.J., et al. 2008. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA. 299, 425-436.

114. Segditsas S., Sieber O., Deheragoda M., et al. 2008. Putative direct and indirect Wnt targets identified through consistent gene expression changesin APC-mutant intestinal adenomas from humans and mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3864-3875.

115. Seliger B., Kellner R. 2002. Design of proteome-based studies in combination with serology for the identification of biomarkers and novel targets. Proteomics. 2, 1641-1651.

116. Shibata M, Takekawa M, Amano S. 1998. Increased serum concentrations of soluble tumor necrosis factor receptor I in noncachectic and cachectic patients with advanced gastric and colorectal cancer. Surg. Today. 28, 884888.

117. Shiota M, Izumi H, Miyamoto N, et al, 2008. Ets regulates peroxiredoxinl and 5 expressions through their interaction with the high-mobility group protein Bl. Cancer Sci. 99, 1950-1959.

118. Shyamsundar R, Kim Y.H, Higgins J.P, et al. 2005. A DNA microarray survey of gene expression in normal human tissues. Genome Biol. 6, R22.

119. Sipina L.V, Bukurova Y.A, Nikitina I.G, et al. 2010. Identification of proteins overexpressed in papillary thyroid tumors. Biochemistry (Mosc). 75, 1148-1152.

120. Song M.H., Ha J.C, Lee S.M, et al. 2011. Identification of BCP-20 (FBX039) as a cancer/testis antigen from colon cancer patients by SEREX. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 195-201.

121. Sounni N.E, Dehne K, van Kempen L, et al. 2010. Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta. Dis Model Mech. 3, 317-332.

122. Sprenger J, Lynn Fink .J, Karunaratne S, et al. 2008. LOCATE: a mammalian protein subcellular localization database. Nucleic Acids Res. 36(Database issue):D23 0-233.

123. Stronati L, Negroni A, Pierdomenico M, et al. 2010. Altered expression of innate immunity genes in different intestinal sites of children with ulcerative colitis. Dig Liver Dis. 42, 848-853.

124. Su A.I, Cooke M.P, Ching K.A, et al. 2002. Large-scale analysis of the human and mouse transcriptomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 44654470.

125. Tan H.T, Zubaidah R.M, Tan S, et al. 2006. 2-D DIGE analysis of butyrate treated HCT-116 cells after enrichment with heparin affinity chromatography. J. Proteome Res. 5, 1098-1106.

126. Tariq M.A., Kim H.J., Jejelowo 0., et al. 2011.Whole-transcriptome RNAseq analysis from minute amount of total RNA. Nucl. Acids Res. 39, el 20.

127. Thadani R., Tammi M.T. 2006. MicroTar: predicting microRNA targets from RNA duplexes. BMC Bioinformatics. 7 Suppl 5, S20.

128. Thomson J.M., Hansen R., Berry S.H. et al. 2011. Enterohepatic helicobacter in ulcerative colitis: potential pathogenic entities? PLoS One. 6, el7184.

129. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein B., et al. 1995. Serial analysis of gene expression. Science. 270, 484-487.

130. Vougas K., Gaitanarou E., Marinos E., et al. 2008. Two-dimensional electrophoresis and immunohistochemical study of calreticulin in colorectal adenocarcinoma and mirror biopsies. J. BUON. 13, 101-107.

131. Wang G., Wang X., Wang S., et al. 2008. Colorectal cancer progression correlates with upregulation of S100A11 expression in tumor tissues. Int. J. Colorectal Dis. 23, 675-682.

132. Wang J., Bo T.H., Jonassen I., et al. 2003. Tumor classification and marker gene prediction by feature selection and fuzzy c-means clustering using microarray data. BMC Bioinformatics. 4, 60.

133. Wang X., Chen W., Li X., et al. 2008. Heat shock protein 72 associated with CD44v6 in human colonic adenocarcinoma. Cell Biol. Int. 32, 860-864.

134. Wang X., Wilson M.J., Slaton J.W., et al. 2009. Increased aggressiveness of human prostate PC-3 tumor cells expressing cell surface localized membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP). J. Androl. 30, 259-274.

135. Wasch R., Engelbert D. 2005. Anaphase-promoting complex-dependent proteolysis of cell cycle regulators and genomic instability of cancer cells. Oncogene. 24, 1-10.

136. Wilcox A.S., Khan A.S., Hopkins J.A., et al. 1991. Use of 3' untranslatedsequences of human cDNAs for rapid chromosome assignment and95conversion to STSs: implications for an expression map of the genome. Nucleic Acids Res. 19, 1837-1843.

137. Wilson C.L., Ouellette A.J., Satchell D.P., et al. 1999. Regulation of intestinal alpha-defensin activation by the metalloproteinase matrilysin in innate host defense. Science. 286, 113-117.

138. Wong S.C., Chan C.M., Ma B.B., et al. 2009. Advanced proteomic technologies for cancer biomarker discovery. Expert. Rev. Proteomics. 6, 123-134.

139. Wu Y.I., Munshi H.G., Snipas S.J., et al. 2007. Activationcoupled membranetype 1 matrix metalloproteinase membrane trafficking. Biochem. J. 407, 171-177.

140. Yamamoto M., Wakatsuki T., Hada A., et al. 2001. Use of serial analysis of gene expression (SAGE) technology. J Immunol Methods. 250, 45-66.

141. Yamasaki L., Pagano M. 2004. Cell cycle, proteolysis and cancer. Curr Opin Cell Biol. 16, 623-628.

142. Yanai I., Benjamin H., Shmoish M., et al. 2005. Genome-wide midrange transcription profiles reveal expression level relationships in human tissue specification. Bioinformatics. 21, 650-659.

143. Yang Y., Pospisil P., Iyer L.K., et al. 2008. Integrative genomic data mining for discovery of potential blood-borne biomarkers for early diagnosis of cancer. PLoS One. 3, e3661.

144. Yasui Y., Tanaka T. 2009. Protein expression analysis of inflammation-related colon carcinogenesis. J. Carcinogenesis. 8, 10.

145. Ylisirnio S., Hoyhtya M., Makitaro R., et al. 2001. Elevated serum levels of type I collagen degradation marker ICTP and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) 1 are associated with poor prognosis in lung cancer. Clin Cancer Res. 7, 1633-1637.

146. Yoshikawa R., Yanagi H., Hashimoto-Tamaoki T., et al. 2004. Gene expression in response to anti-tumour intervention by polysaccharide-K (PSK) in colorectal carcinoma cells. Oncol Rep. 12, 1287-1293.

147. Zhang Y, Luoh S.M., Hon L.S., et al. 2007. GeneHub-GEPIS: digital expression profiling for normal and cancer tissues based on an integrated gene database. Nucleic Acids Res. 35, W152-8.

148. Zhang Z., Song T., Jin Y., et al. 2009. Epidermal growth factor receptor regulates MT1-MMP and MMP-2 synthesis in SiHa cells via both PI3-K/AKT and MAPK/ERK pathways. Int J Gynecol Cancer. 19, 998-1003.1. БЛАГОДАРНОСТИ

149. От всей души благодарю всех, кто помог в ходе выполнения диссертационной работы: Рожкову Е.А., Зацепину О.Г., Юшенову И.А., Гарбуза Д.Г., Машкову Т.Д. и Кропотову Е.С. за помощь в проведении ряда экспериментов и обсуждении полученных результатов.

150. Отдельную благодарность выражаю Григорьевой Евгении за неоценимую помощь при освоении методики двумерного гель-электрофореза и постановке дальнейших экспериментов.

151. Безграничную благодарность выражаю Краснову Георгию за помощь в биоинформатическом поиске и оформление статей.

152. Кроме того, благодарю моих родителей и близких за терпение и понимание на протяжении всего периода выполнения диссертационной работы.

Информация о работе

Букурова, Юлия Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Белковые маркеры для сывороточной диагностики опухолей толстой кишки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы