Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика

Плотникова, Елена Генриховна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика"

На правах рукописи

ПЛОТНИКОВА Елена Генриховна

БАКТЕРЮ1-ДЕСТРУ(К10РЬ1 АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ И ИХ ХЛОРПРОИЗВОДНЫХ: РАЗНООБРАЗИЕ, ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

004605050

Пермь - 2010

004605050

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

чл. - корр. РАН, профессор Демаков Виталий Алексеевич доктор биологических наук Евтушенко Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич доктор биологических наук Донова Марина Викторовна доктор медицинских наук Несчисляев Валерий Александрович

Ведущая организация: Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

Защита состоится ЦЛЛ>кЯ 2010 г. в /0 часов на заседали

диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетш микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Фак (342)2446711.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан «27 » М.&А. 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема очистки наземных и водных экосистем, загрязненных токсичными, устойчивыми к разложению и представляющими опасность для здоровья человека химическими соединениями, занимает центральное место в ряду актуальных задач современной экологии. Среди поллютантов, обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, а также тенденцией к биоаккумуляции, наиболее распространенными являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), бифенил и его хлорированные производные (Hall, Graver, 1999; ATSDR, 2000). ПАУ поступают в окружающую среду с разливами нефти, отходами коксохимических, газоперерабатывающих производств и химических предприятий, образуются при неполном сгорании топлива и бытовых отходов (Seo et al, 2009). Полихлорированные бифенилы (ПХБ) широко применялись в течение нескольких десятилетий при производстве лакокрасочных материалов, пластификаторов, пестицидов, в электротехнической промышленности. В настоящее время производство и использование ПХБ, как особо стойких органических загрязнителей, запрещено Стокгольмской Конвенцией (http://www.unep.org). Наряду с задачами по восстановлению экосистем, загрязненных этой группой токсикантов, остро стоит проблема детоксикации больших объемов невостребованных коммерческих смесей, созданных на основе хлорбифенилов (Васильева, Стрижакова, 2007; Pieper, Seeger, 2008). Биоремедиация почв и других объектов окружающей среды с использованием микроорганизмов-деструкторов (хлор)ароматических соединений имеет ряд известных преимуществ по сравнению с другими методами экобиотехнологии (Sutherland et al., 1995; Pieper, 2005; Cao et al, 2009).

К настоящему времени обнаружены и описаны бактерии различных эволюционных групп, способные разлагать нафталин, фенантрен, антрацен, другие высокомолекулярные ПАУ (Воронин и др., 1989; Бабошин и др., 2005; Kanaly, Harayama, 2000; Jones et al., 2003; Reng et al, 2008). Способность к трансформации ПХБ описана для широкого круга бактерий - протеобактерий (Acinetobacter, Alcaligenes, Cupriavidus, Pseudomonas, Sphingomonas), актинобактерий (Rhodococcus, Arthrobacter), споровых (Bacillaceae) (Bedard, Haberl, 1990; Furukawa, Fujihara, 2008; Pieper, Senger, 2008). Однако известны лишь единичные штаммы, исключительно представители протеобактерий (Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas и Ralstonia), которые могут полностью разлагать моно-и дихлорбифенилы (Km, Picardal, 2001; Adebusoye et al., 2008).

Большинство известных штаммов-деструкторов трансформируют ПХБ до соответствующих хлорбензойных кислот (ХБК). Последующие этапы деградации хлорбензоатов в ПХБ-деградирующих микробных системах осуществляют обычно другие группы организмов (Unterman, 1996). Среди них значительная роль принадлежит бактериям, осуществляющим отщепление галогена на первых этапах разложения хлорбензоатов, в результате чего образуются менее токсичные соединения, доступные для использования в качестве субстрата для многих почвенных микроорганизмов (Карасевич, 1982; Scholten et al., 1991; Fetzner, 1998; Field, Sierra-Alvarez, 2008).

Развитие молекулярно-генетических методов и исследования в области структурной и функциональной геномики бактерий-деструкторов способствовало

пониманию молекулярных механизмов биодеградации вышеназванных ,г

1 у

соединений. Показано, что генетические детерминанты (гены/опероны) бактериальной деструкции ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК локализованы в хромосоме и высокомолекулярных плазмидах, и могут присутствовать в клетке в нескольких копиях (Boronin, 1992; Sanseverino et al, 1993; Reíneke, 1998; Shímizu et al., 2001; Dennis, Zylstra, 2004; Basta et al, 2005; Chain et al., 2006; Iwasaki et al., 2006). Имеются сведения о горизонтальном переносе генов биодеградации в составе мобильных генетических элементов (плазмид, транспозонов, интегронов), в том числе между бактериями различных филогенетических групп (Fuhhorpe, CampbelJ, 1992; Herrick et al., 1997; Nishi et al., 2000; Gartemann, Eichenlaub, 2001; Habe, Omori, 2003; Reng et al, 2008). Установлена важная роль диоксигеназ на начальных этапах аэробной деструкции ПАУ и бифенила/ПХБ (McKay et al., 1997; Gibson, Parales, 2000; Seeger et al., 2001; Jakoncic et al., 2007; Schuler et al., 2009). Ферменты этой группы способны осуществлять трансформацию многих полиароматических соединений, что определяет их важную роль в развитии различных биотехнологий (Harayama, 1997; Boyd et al., 2001; Bamforth, Singleton, 2005; Shindo et al., 2007; Cao et al., 2009).

Функциональные особенности бактерий-деструкторов в комплексе с данными по структурной и функциональной геномике находятся в фокусе внимания современной микробной экологии, а также активно развивающейся системной биологии. Концепции системной биологии и синергия экологических подходов и технологий геномики, метагеномики, протеомики и метаболомики являются, с точки зрения современной науки, наиболее перспективным подходом к пониманию механизмов адаптации и (микро)эволюции индивидуальных микроорганизмов и микробных сообществ к условиям изменяющейся природной среды, особенно в условиях многофакторного негативного воздействия (Trigo et al., 2009). Изучение микроорганизмов, обитающих в определенных эколого-географических условиях и подверженных одновременному воздействию различных антропогенных факторов (в т.ч. высокий уровень токсичных поллютантов и повышенная минерализация среды), вызывает особый интерес. Актуальность таких исследований, наряду с теоретическими аспектами, обусловлена также и практическими задачами экобиотехнологии. Основной среди них является разработка новых стратегий биоремедиации, в том числе в связи с неэффективностью технологий, созданных на основе не адаптированных к соответствующим условиям микроорганизмов.

Имеющиеся сведения о микроорганизмах, способных к деструкции полиароматических углеводородов в условиях высокой солености, немногочисленны и касаются, в основном, грамотрицательных или «морских» бактерий родов Pseudomonas, Cycloclasticus, Vibrio, Lutibacterium, Neptunomonas (Garsia-Valdes et al, 1988; Dyksterhouse et al., 1995; Geiselbrecht et al, 1998; Hedlud et al, 1999, 2001; Chung, King, 2001; Kasai et al., 2002; Garcya et al., 2005; Abed et al., 2006), а также спорообразующих бактерий (Paenibacillus) (Daane et al, 2002). Крайне слабо изучены механизмы адаптации бактерий к таким условиям существования (Roberts, 2005; Oren, 2008), а также взаимодействия внутр микробных сообществ: регуляция их состава, метаболической активности устойчивости к высокому содержанию солей. До начала наших работ практическ отсутствовали сведения о разнообразии и функциональных особенностя грамположительных бактерий - резидентов наземных экосистем, в которы ведущими факторами формирования микробиоценозов являются соленость среды токсичный лоллютант. Все вышесказанное определяет актуальность

перспективность фундаментальных и прикладных исследований в этом направлении.

Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование таксономического, генетического, функционального разнообразия аэробных бактерий-деструкторов ПАУ и ПХБ, а также создание и изучение бактериальных штаммов и ассоциаций с заданным биодеградативным потенциалом.

Основные задачи исследования:

1. Выделение бактерий-деструкторов нафталина, фенантрена, бифенила/ПХБ, ХБК из почв/грунтов, загрязненных отходами химических и соледобывающего производств.

2. Изучение генотипических и фенотипических характеристик изолятов и определение их таксономического положения с использованием принципов полифазной таксономии.

3. Характеристика экологических особенностей и биодеградативного потенциала выделенных бактерий.

4. Изучение разнообразия ключевых генов деструкции нафталина, бифенила/ПХБ и ХБК у бактерий.

5. Конструирование метаболических путей деструкции хлорированных соединений на уровне бактериальной клетки и ассоциации бактерий.

6. Выделение и изучение галотолерантных нафталинметаболизирующих консорциумов бактерий.

Научная новизна. Получены новые сведения о разнообразии микробных сообществ, обитающих в условиях повышенной солености, высокого уровня загрязнения среды токсичными поллютантами. Выделено и изучено более 500 штаммов-деструкторов ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК - представителей классов Proteobacteria (роды Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), Actinobacíeria (Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces) и семейства Bacillaceae (Bacillus, Paenibaállus). Выявлены бактерии, разлагающие токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40°С), pH среды (от 5 до 9) и при повышенной солености среды (до 90 г/л NaCl). Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 -орото-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) - (орто)пара-ионоХБ и 2,4'диХБ. Впервые выделены в культуру и охарактеризованы галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина и фенантрена), относящиеся к родам Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий от ближайших таксонов валидно описаны новый род Salinicola, включающий вид S. socius, а также новые виды рода Brevibacterium - В. permense, В. antiquum и В. aurantiacum; выявлены новые виды «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov., «Thalassospira permensis» sp. nov. и ряд других видов.

сравнении с природными штаммами. В результате селекции на высоких концентрациях 4ХБК рекомбинантного штамма P. putida K3-6R (рРСЗ) получены супердеструкторы 4ХБК. Впервые у бактерий рода Rhodococcus обнаружены и охарактеризованы fcb-re ны, кодирующие компоненты 4ХБК-дегалогеназы. Клонированы и изучены новые ohb-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов. ойЬ-Гены фланкированы 15/.?96-подобными последовательностями, содержащими предполагаемые гены транспозазы A (tripА) и ДНК топоизомеразы I/III (top).

Впервые выделены и исследованы ассоциации бактерий, способные к росту и утилизации нафталина в условиях высокой солености среды (до 8 - 9 % NaCl). Показано, что в состав ассоциаций входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. Экспериментально подтверждено присутствие протокооперативных взаимоотношений в консорциуме SMB3 между деструкторами нафталина и бактериями-спутниками. Впервые получены данные о положительном влиянии экзогенных осмопротекторных соединений, продуцируемых галофильными/галотолерантными бактериями исследуемых микробных ассоциаций, на разложение ПАУ штаммами-деструкторами в условиях повышенной солености среды. Для представителей рода Rhodococcus (деструкторов нафталина из консорциума SMB3) впервые описана комбинация осмопротекторов: глутамат, эктоин и гидроксиэктоин.

На основе выделенных и детально охарактеризованных штаммов-деструкторов ПХБ и ХБК предложены и экспериментально обоснованы новые подходы к созданию бактериальных ассоциаций, способных эффективно осуществлять утилизацию различных конгенеров ПХБ (как индивидуальных, так и в составе коммерческих смесей).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные о способности аэробных бактерий разлагать ароматические соединения при повышенной солености среды расширяют представления о системах биодеградации ПАУ и могут быть использованы для создания новых эффективных биотехнологий восстановления окружающей среды. Выделенные и детально охарактеризованные уникальные штаммы-деструкторы ПХБ, в частности, Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) (Патент РФ №2262531), могут применяться для восстановления почв и водоемов, загрязненных ПХБ, а также в технологиях детоксикации промышленных смесей, содержащих хлорбифенилы. Полученные путем селекции галотолерантные нафталинметаболизирующие консорциумы являются перспективными для биоремедиации загрязненных ПАУ почв и водоемов в условиях засоления. Данные по механизмам функционирования консорциумов могут быть использованы для усовершенствования методов биоремедиации засоленных экосистем. Результаты изучения D-плазмид галотолерантных бактерий-деструкторов найдут применение при конструировании рекомбинантных штаммов для создания биотехнологий ремедиации антропогенных экосистем.

основе fcb- и оЛЬ-генов был создан ряд генноинженерных штаммов, осуществляющих полную утилизацию орто- и ияра-хлорбифенилов. Полученные рекомбинантные штаммы-деструкторы хлорированных бензойных кислот и бифенилов могут быть использованы при создании инновационных технологий защиты окружающей среды от токсичных галогенароматических соединений.

Новые данные о разнообразии бактерий и генетическом потенциале микробного сообщества района солеразработок (г. Березники, Пермский край) являются основой для разработки критериев мониторинга этого уникального микробиоценоза. Результатом изучения таксономического разнообразия явились усовершенствованные системы классификации и идентификации бактерий ряда групп - важными для микробиологической практики и в связи с вопросами интеллектуальной собственности.

Создана обширная рабочая коллекция бактерий-деструкторов (галогенароматических соединений и галотолерантных/галофильных бактерий, доступных для фундаментальных и научно-прикладных исследований специалистами разного профиля. Большинство штаммов включены в фонд Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, ИБФМ, г. Пущино) и Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь). Дубликаты типовых штаммов описанных новых видов депонированы в ВКМ и Биологических ресурсных центрах мира (в Германии, Бельгии, Франции, Японии), а также включены в международную поисковую систему Straininfo (http://www.straininfo.net). Сведения о последовательностях генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, nar, bph) штаммов-деструкторов включены в GenBank (Национальный центр биологической информации, США; http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и сопряженные базы данных (EMBL, DDBJ, EzTaxon) других стран.

Материалы диссертации используются в лекционных курсах Биологического факультета (на Кафедрах микробиологии и иммунологии; ботаники и генетики растений) Пермского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas преобладают среди культивируемых аэробных галотолерантных бактерий-деструкторов ПАУ из микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Бактерии содержат разнообразные генетические детерминанты (D-плазмиды, гены/опероны), контролирующие ключевые этапы разложения нафталина и фенантрена.

2. Полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов (феномен ранее не известный для грамположительных бактерий) осуществляют штаммы Microbacterium sp. В51 [(орто-моно(ди)ХБ] и Rhodococcus ruber Р25 [(орто)пара-моноХБ и 2,4'диХБ]. Другие активные штаммы бактерий характеризуются разной окислительной способностью по отношению к орто- и поря-хлорированным бифенилам. Бактерии-деструкторы моно(ди)хлорбифенилов, относящиеся к родам Arthrobacter, Rhodococcus, Janibacter и Pseudomonas, содержат структурно различающиеся гены, контролирующие начальный этап разложения бифенила/ПХБ.

3. Впервые клонированы и изучены fcb-гены А. globiformis КЗТ1, контролирующие реакцию гидролитического дегалогенирования 4ХБК. В клетках Р. putida с использованием/сЬ-генов сконструирован рекомбинантный путь полной

деградации 4ХБК и получены супердеструкторы, характеризующиеся высокой стабильностью признака утилизации этого соединения. Клонированы и охарактеризованы новые оАЬ-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов.

4. В условиях повышенной солености среды (до 8-9% NaCl) эффективная деструкция и утилизация в качестве источника углерода нафталина может осуществляться консорциумами бактерий, включающими галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. В галотолерантных нафталинметаболизирующих ассоциациях микроорганизмов присутствуют протокооперативные взаимоотношения.

5. В составе микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей присутствуют галофильные и галотолерантные бактерии новых таксонов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 119 печатных работ, включая 24 экспериментальные статьи в реферируемых зарубежных, центральных и региональных журналах, 1 обзор, 2 патента, 1 учебное пособие (в соавторстве), 18 статей в сборниках научных статей, 73 тезисов докладов и сообщений на российских и международных конференциях и симпозиумах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 3t& страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц и ./'/рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, отражающих результаты исследований, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего литературных источников, из них ¿V на русском и на английском языках. В Приложении приведены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и функциональных генов (fcb, ohb, nar, bph) исследуемых штаммов, депонированных в международной базе данных GenBank.

Связь работы с крупными научными программами. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН, тема «Биохимические и генетические системы трансформации сложных органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологии» (№ гос. per. 0120.0406511), а также в рамках Программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные основы воспроизводства и оптимизации генофондов растений, животных и человека»; Программы интеграционных фундаментальных исследований Президиума УрО РАН, выполняемых в содружестве с учеными СО РАН; проектов РФФИ №00-04-49056-а, №02-04-49043-а, РФФИ-Урал №02-04-96404_а, №04-04-96042_а, №07-04-96078_а, №07-04-97625-р_офи.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на международных симпозиумах и конференциях: III Международном симпозиуме «Pseudomonas» (Триест, 1991), Конференции Американского общества микробиологов «Анаэробное дегалогенирование» (Атенс, 1992), Съездах Американского общества микробиологов (1993; 1994; 1996), X Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Париж, 2002), I Конгрессе Европейского микробиологического общества (Любляна, 2003), Международных конференциях «Загрязнение окружающей

среды» (Москва, 1998; Волгоград-Пермь, 2001; Пермь, 2008), IV и V Международных семинарах-презентациях инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» и «Биотехнология-2001» (Пущино, 2000; 2001), Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса» (Пермь, 2001), Международном Байкальском симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2003), Международной конференции «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (Саратов, 2003), Ни III Международных конференциях «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь, 2005; 2008), Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), IV и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007), Международных научных конференциях «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2004, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Международной научной конференции «Актуальные проблемы микробиологии и биотехнологии» (Кишинев, 2009) и других.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, заведующему лабораторией химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, чл.-корр. РАН В.А. Демакову - за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении работы; научному консультанту, заведующей отделом ВКМ Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, д.б.н. JI.H. Евтушенко - за консультативную помощь при выполнении таксономических исследований. Автор признателен коллегам лаборатории, участвовавшим в проведении исследований, чей вклад отражен в совместных публикациях - к.б.н. О.В. Ястребовой, к.б.н. Д.О. Егоровой, к.б.н. JI.H. Ананьиной, к.б.н. Е.С. Шумковой, к.б.н. А.В. Назарову, а также другим сотрудникам ИЭГМ УрО РАН, способствовавшим успешному выполнению работы. Особую благодарность автор выражает Т.В. Цой и |О В. Мальцевой|; сотрудникам ИБФМ РАН к.б.н. И.А. Кошелевой, д.б.н. Л.А. Головлевой, д.б.н. И.П. Соляниковой и другим сотрудникам института за искреннюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы н плазмиды. Исследуемые бактериальные штаммы были изолированы из образцов почв, грунтов и донных отложений, отобранных с трех локальных территорий, загрязненных отходами предприятий химической промышленности, территории завода конденсаторов г. Серпухова Московской области; территории предприятия ОАО «Галоген» г. Перми; производственных площадок соледобывающего производства ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край). При изучении генетических систем раннего дегалогенирования ХБК использовали штаммы Arthrobacter globiformis КЗТ1, P. putida K36 (Зайцев, Карасевич, 1981, 1984, 1985), P. aeruginosa 142 (Романов и др., 1993), а также P. putida mt-2 (Bagdasarian et al., 1981) и Pseudomonas sp. B13 (Dorn et al.,

1974). Для проведения генетических исследований (определение размера D-плазмид, конъюгационные эксперименты) штаммы Р. pulida BS394 (сул", nah', sar), Р- pulida PpG7 (Dunn, Gunsalus, 1973) и pRK2013, NPL-1, NAH7, pASNl, pDK8 были получены из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН. При клонировании и изучении функциональных генов использовали рекомбинантные штаммы Е. coli: JM109 (Yanish-Perron et al., 1985), DH5oF («Bethesda Research Laboratories», США), X925 (F* minA minB thr leu thi) (Stoker et ai, 1984) и векторные плазмиды pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985), BlueScript («Stratagene», США), pSP329 (Schmidhauser, Helinski, 1985), pRK415(Keen et al, 1988). Для сравнительного изучения использовали типовые культуры из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино), Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь) и из зарубежных коллекций.

Методы. Для выделения и роста бактерий-деструкторов были использованы жидкие и агаризованные минеральная среда К1 (Зайцев, Карасевич, 1981) и минеральная среда Раймонда (Розанова, Назина, 1982). В качестве полноценных сред использовали среду LB (Маниатис и др., 1984), а также модифицированную среду Раймонда при добавлении 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта в качестве ростовых субстратов. Чистые культуры бактерий хранили в глицерине при -80°С и в лиофильно высушенном состоянии. Для получения биомассы с целью измерения активностей и очистки ферментов проводили культивирование бактерий в среде К1 методом периодического культивирования, используя нафталин, фенантрен, салицилат, 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии. Определение количества биомассы проводили спектрофотометрически при Х^540 нм. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли методом серийных разведений с последующим высевом и подсчетом колоний бактерий на чашках с полноценной агаризованной средой. Кинетические характеристики растущей периодической культуры определяли согласно рекомендациям (Перт, 1978).

Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий изучали по стандартным методикам (Методы общей бактериологии, 1983). Состав аминокислот и Сахаров в препаратах клеточных стенок (Schleifer, Kandier, 1972) определяли хроматографически (Suzuki et al, 1993). Определение состава жирных кислот целых клеток и хинонов определяли с использованием методов ГЖХ и масс-спектрометрии (Zhilina et al, 1997; Suzuki et al, 1993).

Выделение тотальной ДНК проводили методом, описанным (Current protocols in molecular biology, 1995). Нуклеотидный состав ДНК определяли по температуре ее тепловой денатурации (Owen, Lapage, 1976). Выявление клонов и предварительную группировку штаммов бактерий осуществляли методами ДНК типирования (REP-ПЦР, ВОХ-ПЦР и ARDRA) как описано ранее (Versalovic et al 1994; Scortichini et al., 2002). Амплификацию 16S pPHK генов проводили по описанным методам с использованием универсальных бактериальных праймеров (Weisburg et al, 1991). Определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и функциональных генов проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBACE 1000 в соответствии с рекомендациями производителя («JSC GE Healthcare», США). Для филогенетического анализа использовали последовательности 16S рРНК генов, депонированные в GenBank

(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www.eztaxon.org).

Последовательности 16S pPHK генов выравнивали с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических древ производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, DeWachter, 1994).

Плазмидную ДНК выделяли стандартными (Marco et. al., 1982; Бабыкин и др., 1984) и оригинальными методами. Электрофорез в агарозном геле, обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, щелочной фосфатазой, нуклеазой Ва/31, фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I E.coli, лигазой фага Т4 проводили в соответствии с рекомендациями (Маниатис и др., 1984). Коньюгационный перенос плазмидной ДНК осуществляли, используя модифицированный метод (Dunn, Gunsalus, 1973). Элиминация бактериальных плазмид проводилась согласно стандартной методике (Rheinwald et al., 1973). Трансформацию плазмидных ДНК в клетки Е. coli и P. putida осуществляли по общепринятой методике (Dagert, Ehrlich, 1979), а также методом электропорации на приборе Е. coli Gene Pulser («Bio-Rad Laboratories», США). Клонотеки генов A. globiformis КЗТ1 и P. aeruginosa 142 конструировали при использовании плазмидных векторов pUC19, BlueScript, pSP329 в клетках Е. coli JM109 и Е. coli DH5kF. Для обнаружения рекомбинантных клонов, содержащих fcb- и ойб-гены, использовали оригинальные подходы с применением методик (Резников и др., 1970; Parke, 1992). Реакцию ник-трансляции, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию ДНК-ДНК осуществляли по (Rigby et al., 1977; Southern, 1975). Получение мини-клеток E.coli и включение 358-метионина проводили в соответствии с рекомендациями (Stoker et al., 1984). Электрофорез белков проводили по (Laemmli, 1970), используя 12.5% полиакриламидный гель.

Структуру ассоциации бактерий SMB3 исследовали методом ДГГЭ фрагментов гена 16S рРНК, амплифицированных с применением эубактериальных праймеров 27F и 518R (Tiirola et al., 2002). Электрофорез был выполнен на Dcode™ Universal Mutation System («Bio-Rad Laboratories», США) согласно протоколу (Muyzer etal., 1993)

Для амплификации/сб-генов использовали праймеры, сконструированные на основе гомологичных последовательностей fcb-генов штамма A. globiformis КЗТ1 (Rodrigues et al., 2001). При изучении Ьр/г-генов штаммов деструкторов бифенила/ПХБ применяли вырожденные праймеры, подобранные к участкам генов, кодирующих а-субъединицы известных ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Witzig et al., 2006).

Продукты бактериального разложения ПАУ и 4ХБК определяли методами ТСХ и ВЭЖХ. Анализ метаболитов деструкции ПХБ проводили спектрофотометрически при длине волны 390 - 450 нм и методом ВЭЖХ (Maltseva et al., 1999). Динамику дегалогенирования ПХБ и ХБК контролировали по содержанию ионов хлора в культуральной жидкости, освобожденной от клеток (Резников и др., 1970).

Определение активности ферментов проводили спектрофотометрически. Удельные активности нафталин и фенантрен диоксигеназ определяли согласно (Dua, Меега, 1981), салицилат и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилаз - (Kiyohara, Nagao, 1978), катехол 2,3- и 1,2-диоксигеназ - (Feist, Hegeman, 1969 и Omston, 1966), гентизат диоксигеназы - (Crawford et al., 1975). Единицу активности определяли как количество фермента, катализирующее превращение 1 мкМ

субстрата или образование 1 мкМ продукта в минуту. Относительную активность рассчитывали, принимая за 100% активность с незамещенным субстратом. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Брэдфорда (Schlomann et al., 1990).

Выделение осмопротекторов проводили из галофильных и галотолерантных бактерий, выращенных в минеральной среде Раймонда с разной соленостью и глюкозой в качестве субстрата. Спектры ЯМР регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP80SY («Bruker», Германия) (Хмеленина и др., 2000).

Повторность экспериментов, как минимум, трехкратная. При статистической обработке определяли среднюю арифметическую, стандартное отклонение, доверительный интервал, достоверность результата. Для обработки результатов использовали статистический модуль Excel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов

Методом накопительного культивирования из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений было выделено 240 штаммов-деструкторов нафталина и фенантрена. Данные анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, морфологических, физиолого-биохимических и хемотаксономических особенностей изолятов позволили установить их принадлежность родам Arthrobacter, Brevibacterium, Dietzia, Kocuria, Rhodococcus, Streptomyces, Janibacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. Ниже приводятся характеристики 3-х групп бактерий-деструкторов ПАУ: актинобактерий порядка Actinomycetales (роды Arthrobacter и Rhodococcus)', спорообразующих бактерии родов Bacillus и Paenibacillus; протеобактерий рода Pseudomonas. Ряд этих бактерий входит в состав нафталинметаболизирующих комплексов (см. раздел 4.1.).

1.1. Бактерии-деструкторы рода Arthrobacter

Результаты генотипирования восьми штаммов рода Arthrobacter, выделенных из почв района солеразработок, показали, что штаммы В901, В904, В905 составляют одну геномогруппу. Штаммы SF27, DF14, SN17, SMB145 и SMB11 отличаются как от данной группы, так и между собой по BOX-ДНК профилям. Пять штаммов (В905, SMB11, SMB145, SF27 и DF14) были наиболее близки по нуклеотидным последовательностям 16S рРНК генов с типовым штаммом вида A. crystallopoietes (уровень сходства 99.7%), a SN 17 - с типовым штаммом вида A. arilaitensis (уровень сходства 99.8%). На рисунке 1 представлена дендрограмма, отображающая положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter.

Большинство исследуемых артробактерий являются

галоалкалотолерантными организмами: растут при щелочных значениях pH (до 9.0), а также в присутствии до 110 г/л NaCl на полноценных средах и до 60 г/л соли на минеральной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии. Штаммы SMB145 и В905 растут на нафталине в присутствии до 90 г/л NaCl, а штамм SF27 - на фенантрене при содержании до 60 г/л соли.

0.02

SN17

A. arilaitensis CIP 1080371 (AJ609628) A. nicotianae DSM 201231 (NRJ26190) A. mysorens DSM 12798* (AJ617482)

A. uraloxydans DSM 20647T (X83410) Lf A. ardleyensis An25T (AJ551163) 1 A.bergeri CIP 108036 T (AJ609630) -A. creatinolyticus giftil2498T(D88211)

a. protophormiae DSM 20168х (X80745) a. psychrophenolicus DSM 15454X(AJ616763) A. kereuelensis KGN15X (AJ606062) A. sulfureus DSM 20167х (X83409) - A. gangotriensis Lzl YT (AJ606061)

-A. rhombi F98.3HR69T (Y15885)

ino I— A. globiformis M234UT(ARGSSRNA) bfij a. ramosus DSM 20546т (X80742)

B7T (AF134179J ------A. stackebrandtii CCM 2783T (AJ640198)

А. тайки! GTC 863т (AB071950)

A-sul/onivorans DSM 14002r (AF235091) — A.roseus CMS90T (AJ278870) A. chlorophenolicus A6T(AF102267) A. scleromae YH-2001T (AF330692) A. polychromogenes DSM 20136х (X80741) A. oxydans DSM 20U9T (X83408)

-A. woluwensis 1551т (X93353)

~ A. methylotrophus DSM 14008х (AF235090)

— 'г A. crystailopoietes DSM 20117х (X80738) 56 ЧГ DF14 ISF27 54 j B905

A.agilis DSM 20550т (X80748)

~A.tecti LMG22282X(AJ639829) - A. parietis LMG 22281* (AJ639830) "A. lumbae LMG 19501T(AJ315069) " A. luteolus DSM 13067T (AJ243422) - A. koreensis CA15-81 (AY116496) - A. citreus DSM 20133х (X80737) - A. gandavensis R5S121 (AJ316140) ioo_( A. nicotinae DSM 20123х (X80739)

A. histidinolovorans DSM 20115т (X83406) A. ureafaciens DSM20I26T ОШ744)

-A. ¡litis DSM 20138 (X83407)

A. nitroguajacolicus CCM4924T (AJ512504) A. aurescens DSM 20116т (X83405) — A. monumenti LMG 195021 (AJ315070)

I-A. pigmenti LMG 22284х (AJ639827)

A. eastern LMG 222831 (AJ639826)

-A. nasiphocae M597/99/10T (AJ292364)

-A.atrocyaneus DSM 20127г (X80746)

LI—A. eumminsii445х(X93354) '-A. alius DSM 13068T (AJ243421)

Mycobacterium tuberculosis H37/Rv (X52917)

Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода "neighbor-joining", отображающее положение исследуемых штаммов в системе рода Arthrobacter. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap''-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).

У бактерий выявлены разнообразные пути метаболизма ПАУ. Штаммы В901, В904, В905, 5МВ11 и 8МВ145 осуществляют катаболизм нафталина с образованием салицилата и катехола как ключевых интермедиатов. Анализ

деструктивных особенностей другой группы штаммов (штаммов SF27, DF14 и SN 17) указывает на наличие у них двух путей разложения салицилата - через катехол и гентизат (Yen, Serdar, 1988; Grund ei al., 1992). Штаммы SF27 и DF14 эффективно растут на фенантрене и возможных продуктах его метаболизма -1-гидрокси-2-нафтоате и ojpwo-фталате. Три других штамма В901, В904 и SMB11 способны к слабому росту на фенантрене и не растут на орто-фталате. На основании анализа метаболитов и изучения ферментативных активностей можно предположить, что утилизация фенантрена штаммами SF27 и DF14 идет по орто-фталатному пути, как описано для нескольких деструкторов рода Arth.roba.cter (Бабошин и др., 2005; Seo et al., 2006), а штаммы SMB11, В901 и В904 осуществляют деструкцию фенантрена с образованием 1-гидрокси-2-нафтоата, 1,2-дигидрокси-нафталина и салицилата при участии ферментов пути утилизации нафталина (Iwabuchi, Harayama, 1998). Штаммы SN17, В905, В901 и В904 обладают широкой субстратной специфичностью и способны к деструкции не только нафталина, фенантрена, но и бифенила, фенола, алифатических углеводородов.

Результаты исследований на наличие экстрахромосомальной ДНК показали, что штамм SN17 содержит плазмиду размером -85 т.п.н., в штаммах DF14, SF27, В901, В904 и В905 зарегистрированы плазмиды размером -120 т.п.н. (рис. 2). При обработке клеток штамма SF27 митомицином С были получены элиминанты, которые не росли на нафталине, фенантрене и 1 -гидрокси-2-нафтоате, но 1 сохраняли способность к росту на салицилате. Полученные данные позволяют предположить, что ферменты первичной атаки ароматического кольца фенантрена и 1-гидрокси-2-нафтоата, а также ферменты утилизации нафталина до салицилата у штамма SF27, кодируются плазмидными генами. Факт локализации генов, ответственных за разложение ароматических соединений, в плазмидах описан для многих бактерий (Hayatsu et al., 1999; Eaton, 2001; Sandu et al., 2005; Jerke et al., 2008).

Рис. 2. Электрофореграммы плазмидных ДНК: (А) 1 - рВ905; 1 2 - рКЗТ1 (110 т.п.н.); 3 —рВ904; 4- рВ901. (Б) 1 - pSF27; 2 - I pDF14; 3 - pSN17; 4 - NAH7 (83 т.п.н.).

1.2. Бактерии-деструкторы рода Rhodococcus

Исследовано тринадцать бактерий-деструкторов рода Rhodococcus, двенадцать из которых выделены из района солеразработок. По результатам типирования выявлено шесть геномогрупп, и у десяти штаммов определены нуклеотидные последовательности 16S рРНК генов. Анализ фрагментов генов 16S рРНК размером около 560 п.н. этих бактерий с аналогичными последовательностями типовых штаммов рода Rhodococcus показал 100% сходство со штаммами R. wratislaviensis 13082 т (штаммы G10, В13, В14), R. ruber

DSM 43338т (штаммы DB11, SN31), R. erythropolis АТСС 4277т (штамм 125). Штаммы SMB37, В2-1 и В1-4, по всей вероятности, относятся к новому виду, наиболее близкому к R. pyridinivorans (уровень сходства 97.3%), а штамм SMB38 скорее всего представляет новый вид, близкий к R. marinonascens (уровень сходства 98.9%).

Все родококки, выделенные из накопительных культур при повышенной солености среды (30-60 г/л NaCl), способны расти при содержании хлорида натрия до 90-120 г/л в полноценной среде и до 60-90 г/л - в минеральной среде с нафталином. Штаммы SMB37, SMB38, В2-1, В13, В14 и В1-4 растут в пределах pH 6.0-9.0, штаммы G10,117,117а - при pH 7.0-9.0, штаммы 125,131 - при pH 7.0-8.0, штамм SN31 - при pH 6.0-7.0 и штамм DB11 - при pH 6.0-8.0.

Бактерии росли на нафталине, бифениле, салицилате, гентизате и протокатехате в качестве источника углерода, большинство из них способны расти на бензоле, толуоле, феноле, бензоате и дизельном топливе. Штаммы SMB37, В2-1, В13, В14 и В1-4 осуществляли разложение хлорароматических соединений (ХБК и 2,4-Д). Рост штаммов на салицилате и гентизате дает основание предполагать, что разложение нафталина изученными штаммами осуществляется по гентизиновому пути, описанному для ряда представителей этого рода (Grund et al., 1992; Di Gennaro et al, 2001; Kulakov et al, 2005).

У двух изученных штаммов были обнаружены плазмиды разного размера (рис. 4): у SN31 - одна плазмида (-100 т.п.н), а у G10 - две плазмиды (-85 т.п.н. и 70 т.п.н.). В то же время, необнаружение плазмид у других изученных штаммов родококков не дает основания считать, что экстрахромосомальная ДНК у них отсутствует, так у представителей этого рода плазмиды часто имеют значительно большую молекулярную массу и для их выявления необходимо использование специальных методов выделения и детекции (Shimizu et al, 2001).

1.3. Спорообразующие бактерии родов Bacillus и Paenibacillus

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК генов семи спорообразующих штаммов из района солеразработок показал, что штаммы И2Ь, 123 и 127 являются представителями разных 16S рРНК-групп рода Bacillus (Ash et al., 1991) (рис. 3). Штаммы 123 и 127 входят в кластер «В. pumilus» (уровни сходства 100% и 99.3%, соответственно, с В. pumilus DSM27T). Штамм I12b наиболее близок к В. hwajinpoensis SW-72T (уровень сходства 98.8%). Полученные данные не позволяют однозначно отнести ни один из вышеперечисленных штаммов к какому-либо известному виду; два из них (И2Ь и 127), по всей вероятности, представляют собой новые виды. Анализ генов 16S рРНК штаммов 110b и SN501 выявил принадлежность штаммов к роду Paenibacillus (рис. 3), виды которого ранее входили в одну из филогенетических групп Bacillus (Ash et al., 1993). Штамм UOb наиболее близок к P. amylolyticus NBRC 15957т (уровень сходства 16S рРНК генов 99.8%), а штамм SN501 - с P. naphthalenovorans PR-N17 (уровень сходства 99%).

Бактерии являются галоалкалотолерантными организмами, способны к росту в щелочных условиях (до pH 9.0) и при содержании 90-110 г/л NaCl в среде культивирования. Утилизируют дизельное топливо, ряд индивидуальных ароматических и алифатических углеводородов. Paenibacillus sp. SN501 обладает широкой субстратной специфичностью: растет на нафталине, фенантрене, салицилате, opmo-фталате, а также феноле и октане. Так как штаммы-деструкторы SN501 и 110b не растут на гентизате и 2-метилсалицилате, и не образуют

полуальдегид оксимуконовой кислоты (продукт лге/яа-расщепления катехола), можно предположить, что деструкция салицилата данными штаммами осуществляется с образованием катехола и расщеплением последнего по орта-пути (Ми1ге1 ег а1., 1996; А^иай с/ а1., 2005). РаетЬасШш ер. $N501 растет в минеральной среде с нафталином как единственном источнике углерода и энергии при концентрации соли в среде культивирования до 50 г/л.

0.02

— В. amyloliquefackns АТСС 23350т (Х60605) В. subtilis subso. subtilis DSM 10т (АЛ27635П В. subtilis subsp. spizhenii NRRL В-23049т (АГ074970) B. vallismortis DSM 11031т (AB021198) B. mojavensis IFO 1S718T (AB021191) 86j B. aerius 24KT (AJ831843)

B. sonorensis NKRL B-23154T (EUI38473) ß. licheniformis DSM 13т (Х684Ш B. atrophaeus JCM 9070т (АВ02И81) 127 г|Ш

В. pumüus DSM 27T (AY4S6263) - B. safensis FO-036bT (AF2348S4) IB. altitadinis 41KF2bT (AJ831842) ] B. aerophilus 2SKT (AJ831844) B. stratosphericus 41KF2aT (AJ831841) B. taecuiensis BH030017T (AY603978)

B. decolorationis LMG19S071 (AJ31S07S) jtgOj B. idriensis SMC 4352-2T (AY904033) ; Ii. indkus Sd/3r Ш583158) 1B. cibi JG-30T (AY550276)

S({ I-B. algicola KMM 3737T (AY228462)

Sil-ЩЬ

В. hwajinpoensis SW-72T (AF541966) 1001 Р. xylanilyticus XIL14T (AY427832)

P. pabuli JCM 9074т (AB073191) P. ittinoisensis JCM 9907т (AB073192)

P. barcinonensis BP-23T (AJ716019) P. sali DCY03 T (DQ309072) 100 r P■ elgii SD17 T (AY090110)

P. ehimensis KCTC3748T (AY116665) 100 r SN501

1P. naphthalenovorans PR-NlT (AF353681)

-P. validus DSM 3037 T (D78320)

P. alkaliterrae KSL-134T (AY960748) 99 r110b

P. amylolyticus NBRC159S7T (AB363743) JOOr P. macquariensis DSM2T(AB073193) 1 P. antarctkus LMG 22078T (AJ60S292) - Alicyclobaciüus acidocaldarius NBRC 156S2T (AB2717S4)

Рис. 3. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода "neighbor-joining", отображающее положение исследуемых штаммов в системе родов Bacillus и Paenibacillus. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap-анализа" 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 80%).

1.4. Бактерии-деструкторы рода Pseudomonas

Грамотрицательные бактерии-деструкторы (штаммы SN11, SN21, SN101, DN13, G51) были выделены при культивировании на минеральной среде К1 с нафталином в качестве источника углерода, без добавления NaCl. У штаммов G51, DN13 и SN11 определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК размером около 600 п.н., анализ которых подтвердил принадлежность штаммов к роду Pseudomonas. Наибольшее сходство сравниваемых нуклеотидных последовательностей с таковыми типовых штаммов рода Pseudomonas: для штамма G51 - с P. putida (98%), для штамма DN13 - с P. plecoglossicida (98%) и для штамма SN11 - с P. oryzihabitans (99%).

Все штаммы росли на нафталине и салицилате - промежуточном продукте разложения нафталина, и были способны к росту на 5-метилсалицилате - что предполагает наличие у них ферментов орто- и мета-пут расщепления катехола (Timmis, Lehrbach, 1985; Yen, Serdar, 1998). Следует также отметить, что после продолжительного культивирования на фенантрене, изученные псевдомонады приобретали способность к росту на этом субстрате, а также на 1-гидрокси-2-нафтоате (промежуточном продукте биодеградации фенантрена). Возможность модификации генетических систем биодеградации нафталина при длительном инкубировании на фенантрене была показана для штамма Р. putida BS3703, который приобретал способность к конститутивному синтезу ферментов "верхнего пути" окисления ПАУ и к росту на фенантрене и 1-гидрокси-2-нафтоате (Балашова и др., 1997).

У Pseudomonas sp. SN 11 были определены активности ферментов деградации нафталина и фенантрена. В связи с тем, что ферменты катаболизма нафталина у большинства бактерий индуцируются салицилатом (Bamsley, 1975), измерение активности ключевых ферментов биодеградации проводили как в отсутствие, так и в присутствии салицилата. Полученные данные подтверждают факт утилизации нафталина по пути диоксигеназного расщепления ароматического кольца с образованием салицилата и последующим его расщеплением через катехол. Индукция салицилатом фенантрен диоксигеназной активности и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы свидетельствует о возможности утилизации фенантрена штаммом Pseudomonas sp. SN 11 с участием ферментов биодеградации нафталина (Балашова и др., 1997). Низкая активность гентизат 1,2-диоксигеназы при индукции салицилатом свидетельствует о возможности окисления данным штаммом салицилата до гентизиновой кислоты, как описано на примере штамма Pseudomonas sp. U2 (Fuenmayor et al., 1998). Установлено, что салицилат является индуктором ферментов пути деградации нафталина: нафталин диоксигеназы, салицилат гидроксилазы и катехол 1,2-диоксигеназы, а также индуктором фенантрен диоксигеназной активности и 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилазы, необходимых для утилизации фенантрена с участием ферментов деградации нафталина. Фермент мета-пут расщепления катехола - катехол 2,3-диоксигеназа имеет высокую конститутивную активность и не индуцируется салицилатом.

Все исследованные штаммы рода Pseudomonas содержат плазмиды размером -85 т.п.н. (рис. 4). Для доказательства плазмидной локализации генов, участвующих в разложении ПАУ, проведены эксперименты по элиминации плазмид из штамма SN И и конъюгационному переносу. Так, перенос плазмиды pSNll в реципиентный штамм P. putida BS394 (cys~ nah' sal ) приводил к образованию трансконъюгантов с фенотипом Cys~ Nah+ Sal+ Phn+. Полученные

результаты свидетельствуют, что плазмида рБШ1 является конъюгативной и содержит гены разложения нафталина и салицилата; деградация фенантрена штаммом $N11 также контролируется плазмидой. Аналогичные эксперименты по конъюгационному переносу плазмид были проведены с использованием штаммов вИЮ! и 051. Как и в случае плазмиды р$№1, плазмиды из этих штаммов являются конъюгативными и содержат гены деградации нафталина. Рестрикционный анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции £соШ показал, что плазмиды из штаммов БШ! и в51 имеют одинаковый набор рестрикционных фрагментов, что позволяет предположить идентичность данных плазмид.

Рис. 4. Электрофореграмма плазмидных ДНК штаммов-деструкторов ПАУ: (А) 1 - NAH7 (83т.п.н.); 2 - pDN13; 3 - pSNlt; 4 - \ pSN21; 5 - pSNlOl; 6-pG51; 7- pSN31.

1.5. Галотолерантные свойства бактерий-деструкторов ПАУ

Бактерии-деструкторы ПАУ, выделенные из района солеразработок, способны как к росту на средах, не содержащих хлорид натрия, так и на средах с повышенным содержанием соли. Большинство штаммов росли на полноценных средах при концентрации NaCl выше 90 г/л. Кроме того, все исследованные бактерии, кроме Paenibacillus sp. SN501 (растет в присутствии 50 г/л NaCl), I способны к росту на агаризованной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии, при 60 г/л NaCl. Ряд штаммов росли в присутствии более высоких концентраций соли (см. раздел 4.1.). Полученные результаты ; позволяют отнести бактерии к умеренно галотолерантным микроорганизмам (Кашнер, 1981). ;

Следующим этапом изучения являлось установление некоторых механизмов галотолерантности у исследуемых бактерий. Полученные нами , трансконъюгантные штаммы (см. раздел 1.4.), содержащие плазмиду из | галотолерантного штамма Pseudomonas sp. SN 11, были проверены на способность к росту на средах с повышенным содержанием соли (табл. 2).

Таблица 2. Рост рекомбинантных бактерий при повышенном содержании NaCl

Полноценна я среда Среда Раймонда с

Штаммы Раймонда, нафталином,

содержание NaCl (г/л) содержание Na С! (г/л)

40 | 60 | 90 25 | 40 | 60

Pseudomonas sp. SN! 1* ++ ++ ++ ++ ++ +

P.putida BS394** + - _

P.putida BS394-(SN11-81) ++ + ++ +

P.putida BS394-(SN11-82) ++ + ++ +

Примечание. «++» - рост; «+» - слабый рост; «-» - нет роста. * донорный штамм; ** реципиентный штамм.

Было установлено, что редипиентный штамм P. putida BS394 способен к слабому росту на среде, содержащей 40 г/л NaCl, но не растет при 60 г/л NaCl, тогда как у трансконъюгантных штаммов был отмечен хороший рост при содержании 60 г/л соли на полноценной среде и при 40 г/л на среде с нафталином в качестве субстрата. В то же время, природный галотолерантный штамм SN11 более устойчив к повышению концентрации NaCl, чем рекомбинантные бактерии (табл. 2). Таким образом, можно предположить, что в плазмидах исследуемых бактерий-деструкторов присутствуют не только гены, участвующие в деградации ПАУ, но и генетические элементы, детерминирующие способность бактерий к росту при повышенной солености среды.

Кроме того, у галотолерантных штаммов Arthrobacter sp. SMB11 и SMB145, выращенных при повышенной солености среды (50-100 г/л NaCl), были обнаружены низкомолекулярные эндо-метаболиты: эктоин, глутамат, бетаин и трегалоза. Известно, что такие соединения относят к осмопротекторам и они обнаружены у многих галофильных и галотолерантных бактерий. Накопление в клетках организмов осмопротекторов является одним из основных механизмов адаптации микроорганизмов к высокой осмолярности среды (Ventosa et al., 1998; Grant, 2004; Lentzen, Schwarz, 2006). Также нами было показано, что штаммы рода Rhodococcus, выращенные в минеральной среде в присутствии 50 и 80 г/л NaCl с глюкозой в качестве субстрата, накапливали эктоин, гидроксиэктоин и глутамат (табл. 3). Такое сочетание осмолитов в клетках родококков обнаружено впервые.

Таблица 3. Содержание осмопротекторов у деструкторов рода Rhodococcus

Штамм Концентрация NaCl, (г/л)* Содержание осмопротекторов (% от сухого веса биомассы)

Эктоин 1 Глутамат 1 Гидроксиэктоин

SMB37 50 0.6 0.4 0.7

SMB37 80 0.3 - 0.35

SMB38 50 0.6 1.4 1.4

SMB38 80 1.2 0.6 2.0

Примечание. * вес/объем в среде культивирования,«-» - вещество не обнаружено.

1.6. Бактериальные гены, контролирующие начальные этапы деструкции нафталина

Первым этапом аэробной деградации нафталина у бактерий является гидроксилирование субстрата до соответствующего cis-дигидродиола, реакция осуществляется мультикомпонентными ферментными системами - диоксигеназами (Larkin, 1999; Gibson, Parales, 2000). Нафталин диоксигеназы (НДО), кодируемые генами nah (штаммы рода Pseudomonas) и паг (штаммы рода Rhodococcus), существенно различаются между собой структурно, сохраняя при этом основные каталитические свойства (Kulakov, 2000). Разнообразие генов, кодирующих а- и ß-субъединицы НДО, в исследуемых штаммах изучали путем амплификации участка генов nah и паг с последующим гидролизом полученных ампликонов эндонуклеазами рестрикции MseI и НаеIII. ПЦР-анализ с использованием праймеров, разработанных Ferrero с соавторами (Ferrero et al., 2002), показал наличие гена nahAc, кодирующего а-субъединицу НДО, в исследуемых бактериях рода Pseudomonas. Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного участка nahAc-гена штаммов SN11, DN13, G51 выявил высокую гомологию (99.6-100%) с таковыми референтных штаммов Р. putida NCIB9816, NCIB9816-4 и BS202. На рисунке 6 представлена дендрограмма,

отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену пакАс, исследуемых и известных штаммов-деструкторов.

Для исследования генов, кодирующих НДО, грамположительных бактерий, нами были сконструированы праймеры, при создании которых были использованы известные нуклеотидные последовательности паг-тенов, кодирующих а- и Р-субъединицы НДО, деструкторов нафталина рода Шсн1ососси$. С ДНК-матриц родококков были получены ампликоны ожидаемой длины (1936 п. н.) (рис. 7).

0.2 0.1

Pseudomonas sp. SN11 Pseudomonas sp. DN13

Pseudomonas putida NCIB9816 (M23914) Pseudomonas putida C18 (M60405) Pseudomonas putida NCIB9816-4 (AF491307) Pseudomonas putida BS202 (AF010471) Pseudomonas sp. G51 Pseudomonas putida G7 (AB237655) Pseudomonas putida OUS82 (AB004059)

100 r— Pseudomonas aeruginosa PaK1 (D84146) L Pseudomonas stützen AN 10 (AF039533) -Raistonia sp. U2 (AF036940)

Рис. 6. Дендрограмма, отображающая последовательностей, гомологичных гену nahAc .

сходство

нуклеотидных

Рис. 7. Электрофореграмма : продуктов амплификации генов пагАаАЬ штаммов-деструкторов рода Rhodococcus: 1 - G10, 2 - Р25*, 3-DB11, 4 - SMB38, 5 - SMB37, б - В2-1, 7 - В1-4, I 8 - В13, 9 - В14, 10 - отрицательный контроль, II - маркер X-HindlII («Силекс», Россия). *Описание штамма Rhodococcus ruber Р25 см. в разделе 2.2.

В то же время, применение сконструированных праймеров с препаратами 1 ДНК деструкторов нафталина родов Arthrobacter и Bacillus не дало положительных результатов, что свидетельствует о высокой специфичности сконструированных олигонуклеотидов, а также о различии генетических систем деструкции нафталина у разных таксонов грамположительных бактерий.

Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонов штаммов В13, В2-1, БВП, 8МВ38, выделенных из засоленных почв, показал принадлежность исследуемых фрагментов ДНК к семейству лаг-генов, и выявил высокую гомологию (98.5-100%) с таковыми известных штаммов-деструкторов полиароматических соединений рода Шю<1ососсиз. На дендрограммах четко прослеживается закономерность выделения взятых в анализ фрагментов пагАа-генов и пагАб-генов в два кластера (рис. 8). Степень сходства нуклеотидных последовательностей была выше 98% для пагАа- и пагАЬ-тенов внутри каждого кластера и не превышала 92% для иаМа-генов и 90% для пагАЬ-геиов между кластерами. На основании проведенного анализа можно предположить наличие двух ветвей эволюции пагАаАЬ-тъноъ у бактерий рода Ююс1ососси5. Показано, что паг-тепы этих штаммов входят в разные группы одного подклзстера (рис. 8) с гомологией нуклеотидных последовательностей внутри группы 100%, а между ними - 99%.

0.1

пагАа SMB33 (ÜQ503237)

91 пагАа RUoaoeoccux sp. Р200 (AY392424)

пагАа В2-1 (GQ503241)

пагАа Rlioijococcm sp.P400 (AY392423)

100 | пагАа DIH1 (GQ503239) юо Н

пШ Rhotlacocrm sp. 124 (AF121<X>J) — dodA Я ojwntv SA0101 (ABl 10633) nidA Я opncm TKN14 (AB206671) 100 ¡narAa B13 (GQ503240)

100

ncrAa Я opacus B4 (AB 1930451 narAa R. opacmKl (DQS4Ö8S1) narAa Rlioflococcus sp. 1BN (AJ401612) narAa RhoOococcai sp.NClMB 12038 (AF0S2663) гпоАЗ Rhodococavi sp. CIR2 (AB024936)

100

narAb B2-I (GQ503241) r.arAb Rhoitococcus sp. P400 (AY392423) nidB Я ojxiau TKN14 (AB206G71) I narAb B13 (GQ503240) narAb Я орасю B4 (АБ193045) 96jnarAb DB 11 (GQ503239)

nidB Rlioilococciu: sp. 124 (AF12190J) <Щ1агАЬ SMB3S (GQ503237)

narAb Rhoflococcm sp. P200 (AY392424) — dodB Я opticus SA0101 (AB110Ö33)

100

narAb Rhoäococcm sp. NCIMB1203S (AF0S2663) narAb RhoAococcm sp. 1BN (AJ401612) narAb Я opaais R7 (DQS46SS1) ГПОА4 Rlwdoeocem sp. CTR2 (AB024936)

Рис. 8. Деидрограммы, отображающие сходство последовательностей, гомологичных генам пагАа (А) и пагАЬ (Б).

нуклеотидных

Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем деструкции нафталина бактерий рода Rhodococcus, выделенных из района разработок Верхнекамского месторождения солей.

2. Бактерии-деструкторы бифенила/полихлорированных бифенилов

2.1. Характеристика бактерий-деструкторов

Методом накопительного культивирования на бифениле из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений выделено 230 штаммов-деструкторов бифенила, из них около 50 бактериальных культур изучено более детально. На основании филогенетического анализа и фенотипических характеристик штаммы отнесены к родам: Arthrobacter, Alcaligenes, Cellulomonas, Comamonas, Flavimonas, Flavobacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, Janibacter, Xanthomonas.

Большинство изолированных бактерий росли в диапазоне температур 8-40°С и pH среды 6-9. У ряда бактерий-деструкторов выявлена способность к росту на полноценной и минеральной (с бифенилом в качестве субстрата) средах в присутствии повышенного содержания NaCI. Так, штаммы Alcaligenes sp. Р39, Pseudomonas sp. B2 и Pseudomonas sp. В106, R. ruber P25 активно росли на бифениле при содержании 60 г/л соли в среде культивирования и в полноценной среде при 100-120 г/л NaCI.

Более половины изученных деструкторов бифенила способны к росту на нафталине, толуоле, бензоле и феноле, пять штаммов могут осуществлять деструкцию фенантрена. Среди исследованных штаммов выявлены бактерии, которые осуществляли деструкцию хлорированных соединений (2ХБК, 4ХБК, 2,4-Д). Особо следует отметить штаммы R. ruber Р25, Microbacterium sp. В51, Pseudomonas spp. Gl, G12 и B106, которые обладают наиболее широкой субстратной специфичностью по отношению к моно(поли)ароматическим соединениям и их хлорпроизводным.

Все исследованные штаммы осуществляли разложение монохлорированного бифенила: при инкубации клеток бактерий с 4моноХБ (500 цМ) наблюдалось накопление 4ХБК (от 75 цМ до 230 Ц.М, в зависимости от штамма, за 1 час). Для изучения особенностей разложения орто- и пара-ХБ изолированными бактериями в качестве модельного соединения нами выбран 2,4'диХБ, хлорированный по обоим бифенильным кольцам. Все бактерии проявляли активность по отношению к 2,4'диХБ, однако эффективность и характер окислительных способностей штаммов различался. На основании анализа продуктов биодеструкции 2,4'диХБ выделены три группы штаммов, обладающие различными путями деградации данного соединения (табл. 4). У большинства штаммов (группы lull) при деструкции 2,4'диХБ происходило накопление продукта мета-расщепления дихлорбифенила - 3,8-С1 ГОФДК (лтах=397 нм), что указывает на 2,3-диоксигенирование яара-хлорированного кольца 2,4'диХБ (Seeger et al., 1995; Seah et al., 2000). Кроме того, все исследованные штаммы группы II накапливали разные количества 4ХБК, что в свою очередь говорит о более глубокой трансформации 2,4'диХБ по пути предпочтительного 2,3-диоксигенирования o/jmo-хлорированного кольца. У штамма Р25 наблюдалось существенное уменьшение количества продуктов разложения 2,4'диХБ (3,8-С1 ГОФДК и ХБК), что указывает на эффективную утилизацию не только 2,4'диХБ, но и 4ХБК.

Таблица 4. Разложение 2,4'дихлорбифенила бактериями-деструкторами

ГОФДК, ОП (Xm) ХБК

Штамм 3 часа 24 часа Положе- Концентрация ,%*

ние хлора 3 часа 24 часа

1 группа (осуществляют окисление лорд-хлорированного кольца)

Alcaligenes sp. P39 0 1.36 + 0.03 - 0 0

Flammonas sp. S214 3.1+0.11 3.05 + 0.04 - 0 0

Flavobacterium sp. P38 0 1.12 + 0.01 - 0 0

Pseudomonas sp. B106 3.5 ± 0.03 2.44 + 0.02 - 0 0

Pseudomonas sp. Gl 3.7 + 0.08 3.48 + 0.03 - 0 0

Pseudomonas sp. Gl 1 3.1 ±0.09 2.91 + 0.07 - 0 0

Pseudomonas sp. G13 3.2 + 0.01 3.78 + 0.05 - 0 0

Pseudomonas sp. P24 4.2 ± 0.3 4.48 + 0.03 - 0 0

Pseudomonas sp. S1 0 1.6 ±0.08 - 0 0

Pseudomonas sp. S2 0 2.3 ± 0.04 - 0 0

Pseudomonas sp. S9 0 0.6 ± 0.04 - 0 0

Pseudomonas sp. S13 0 0.7 ± 0.06 - 0 0

Pseudomonas sp. S15 0 1.1 ±0.04 - 0 0

Pseudomonas sp. S210 1.1+0.04 1.72 ±0.07 - 0 0

Pseudomonas sp. S212 3.0 + 0.06 2.94 ±0.02 - 0 0

Rhodococcus sp. PI 0 0.5 ± 0.04 - 0 0

Rhodococcus sp. P19 0 0.1 ±0.03 2 0 3.0

Janibaeter sp. P9 3.6 + 0.02 2.7 + 0.01 - 0 0

Xanthomonas sp P8 1.7 + 0.04 4.1 ±0.08 - 0 0

II группа (осуществляют окисление орто- и пара-хлорированных колец)

Arthrobacter sp. Р29 2.1+0.07 1.79 ±0.02 4 28.4 46.7

Arthrobacter s p. В107 1.8 + 0.03 2.01 ±0.03 4 30.3 43.1

Cellulomonas sp. P27 0.8 + 0.04 0.84 ±0.03 4 67.0 97.0

Cellulomonas sp. P28 0.6 + 0.07 0.64 + 0.03 4 70.0 66.0

Flavobacterium sp. G14 3.3 + 0.09 3.40 ±0.04 4 0 7.0

Microbacterium sp. P26 1.1+0.05 3.24±0.01 4 38.7 68.7

Pseudomonas sp. B2 4.0 ± 0.06 3.96 ±0.02 4 5.4 10.0

Pseudomonas sp. B7 2.7 + 0.03 1.60 + 0.01 4 9.3 14.0

Pseudomonas sp. В 8 1.6 + 0.06 1.69 + 0.02 4 48.0 64.0

Pseudomonas sp. P22 0.7 + 0.05 0.87 + 0.05 4 72.0 74.0

Pseudomonas sp. P23 0.3 ±0.08 0.36 + 0.01 4 70.6 84.0

Rhodococcus sp. G10 2.9 ±0.01 2.69 ±0.05 4 10.0 13.0

Rhodococcus sp. P2kr 3.1+0.05 3.8 ± 0.04 4 2.0 12.0

Rhodococcus sp. PI 2 0 0 4 0 6.0

2 3.6 3.0

Rhodococcus sp. P13 0.2 + 0,09 0.4 + 0.04 4 1.4 2.2

2 3.0 4.0

Rhodococcus sp. P20 0.2 ± 0.07 0.5+0.04 4 0 2.0

2 3.0 4.6

Rhodococcus sp. P25** 1.2 ±0.02 0.52 ±0.07 4 67.0 29.0

Rhodococcus sp. SN31 0.8 ± 0.04 1.22 ±0.04 4 3.7 9.0

III группа (осуществляют окисление орто-хлорированного кольца)

Comamonas sp. S211 0 0 4 16.4 18.6

Microbacterium sp. B51 0 0 4 88.0 92.7

Pseudomonas sp. G12 0 0 4 84.0 85.5

Rhodococcus sp. DB 11 О 0 4 9.5 33.0

Примечание: * % от теоретически возможного, ** к 5 часам инкубации штамма Р25

с 2,4'диХБ было отмечено: ГОФДК - ОПт=1.1,4ХБК - 73.8%.

Штаммы III группы - Rhodococcus sp. DB 11 и Comamonas sp. S211 в присутствии 2,4'диХБ аккумулировали около 33 и 18.6% 4ХБК, соответственно, а штаммы Pseudomonas sp. G12 и Microbacterium sp. В51 - около 90% этого продукта, накопления продуктов лгеота-расщеплсния 2,4'диХБ не было зафиксировано (табл. 4). Таким образом, можно предположить, что эти штаммы атакуют только ор/ио-хлорированное кольцо молекулы 2,4'диХБ.

2.2. Биодеградативные особенности штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В51

Штамм R. ruber Р25 (=ИЭГМ 896) является активным деструктором орто-, napa-замещенных хлорированных бифенилов. При деструкции 2моноХБ в среде наблюдалось накопление 8-С1 ГОФДК (Атац=395 нм) и 2ХБК, а при деструкции 4моноХБ - 10-С1 ГОФДК (Хтац=434 нм) и 4ХБК. В процессе деградации 4моноХБ к 24 часам было отмечено снижение содержания 4ХБК в среде с 66% до 41%. При культивировании штамма Р25 с 2,2'диХБ не была обнаружена ГОФДК, но в среде аккумулировались свободные ионы хлора и 2ХБК (около 14% от теоретически возможного, за 24 часа). При разложении 4,4'диХБ было отмечено накопление в среде 3,10-диС1 ГОФДК (Хшах=434 нм) и увеличение концентрации 4ХБК в течение первых 24 часов до 68% с последующим снижением в 5.5 раза. Установлено, что при деструкции 2,4'диХБ штамм R. ruber Р25 предпочтительнее окислял орто-хлорированное кольцо молекулы хлорбифенила (табл. 4), при деструкции 2,4,2'триХБ - ди(орто-яаря)-хлорированное кольцо, а при разложении 2,4,4'триХБ - моно(л«ря)-хлорированное кольцо. Изучена способность штамма R. ruber Р25 использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 2-, 4моноХБ и 2,4'диХБ (рис. 9). Кроме того, штамм эффективно утилизировал образующиеся в процессе разложения 2ХБК и 4ХБК (рис. 10).

КОЕ/мл

1,Е+09 -

1,Е+07

1.Е+05

15 20

суткн

Рис. 9. Рост R. ruber V25 на бифениле (/) и его хлорированных производных: 2 - 2-моноХБ, 5-4-моноХБ, 4 - 2,4'диХБ.

1 ,К+04

Рис. 10. Рост R. ruber P2S на бензойной кислоте (1) и ее хлорпроизводных: КОЕ при росте на 2ХБК (2), 4ХБК (3), 2ДХБК (4)- СГ при росте на 2ХБК (5), 4ХБК (б), 2,4ХБК (7); концентрация ХБК при росте на 2ХБК (S) и 4ХБК (9).

R. ruber P25 содержит три плазмиды, размером -110 т.п.н. (рР25-1), -90 т.п.н. (рР25-2) и -80 т.п.н. (рР25~3) (рис. 11 А). Для доказательства плазмидной локализации генов, ответственных за разложение бифенила, нафталина и ХБК, проведены эксперименты по элиминации плазмид. При скрининге клонов, утративших способность к росту на одном или нескольких субстратах, обнаружено отсутствие одной или нескольких плазмид (рис. 11 Б). Клоны с фенотипом биф~наф~2ХБК~4ХБК~ характеризовались отсутствием плазмид, у клонов с фенотипом биф"наф+2ХБК~4ХБК- было зафиксировано наличие плазмиды рР25-3 (-80 т.п.н.), а у клонов, утративших способность к росту только на ХБК, отсутствовала плазмида рР25-1 (-110 т.п.н.). Таким образом, нами сделано предположение о плазмидной локализации генетических детерминантов, контролирующих деградацию бифенила, нафталина и ХБК у штамма R. ruber Р25.

Рис. 11 (А). Электрофореграмма плазмидных ДНК: 1 - рР25-(1-3); 2 - X-HindlU («Силекс», Россия); 3 -рКЗТ1 (110 т.п.н.); 4 - NAH7 (83 т.п.н.).

Рис. 11 (Б). Скрининг клонов R. ruber Р25 с различным фенотипом на наличие плазмидной ДНК:

1 - биф+наф+ХБКГ (рР25-2, рР25-3);

2 - биф~наф+ХБК~ (рР25-3); 3 биф~наф~ХБК~ (элиминант); 4 - X-Hindlll («Силекс», Россия); 5 - NAH7 (83 т.п.н.).

Результаты изучения деструкции моно(ди)хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51 приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 5. Деструкция хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51

ПХБ Концентрация ПХБ (мг/л) Время инкубации (час) Концентрация СГ (мг/л) Хлорбензойная кислота ГОФДК

Положение хлора Концентрация ^-тах (нм) оп

мг/л %*

2ХБ 94.25 0 н.о. 2 - - 395 -

5 56.60+0.02 72.3 -

24 11.82+0.01 15.1 <0.1

4ХБ 94.25 0 н.о. 4 - - 434 -

5 31.11+0.08 39.7 <0.1

24 28.31±0.05 36.0 <0.1

2,2'ХБ 22.3 0 - 2 - - - -

5 3.8±0.05 14.13+0.03 90.3 -

24 6.3+0.08 1.65±0.02 10.6 -

4,4'ХБ 22.3 0 - 4 - - 432 0

5 - 3.59±0.01 23.0 0.36 ±0.0

24 - 12.69±0.06 81.1 0.95 ±0.0

Примечание: «н.о.» - не определяли, « - » - не обнаружено, * % от теоретически возможного.

Штамм Microbacterium sp. B51 осуществлял практически 100% деструкцию диХБ (2,2'-, 2,4'- и 4,4'диХБ). Аккумуляция в среде 2ХБК и 4ХБК при деструкции 2,2'- и 2,4'диХБ, соответственно, свидетельствовала о предпочтительной атаке штаммом орто-хлорированного кольца этих соединений (табл. 4, 5). Microbacterium sp. В51 утилизировал 2ХБК, продукт разложения 2моноХБ и 2,2'диХБ, и трансформировал 4,4'диХБ через стадию образования 3,10-диС1 ГОФДК до 4ХБК (табл. 5). Полученные данные позволяют предположить, что штамм В51 способен окислять орто- и пара-хлорированные кольца молекул ПХБ. Таким образом, Microbacterium sp. В51 по своим деградативным свойствам близок к известному штамму-деструктору ПХБ Burkholderia sp. LB400 (Seeger et al., 1995, 1999; Seah et al., 2000), но, в отличие от штамма LB400, способен деградировать 4,4'диХБ и осуществлять полную утилизацию 2моноХБ и 2,2'диХБ.

Было также установлено, что штамм В51 способен активно разлагать 2моноХБ в условиях модельной почвенной системы. Анализ динамики изменения концентрации 2моноХБ показал, что основное снижение количества субстрата (до 98%) происходило в течение первых 24 часов инкубирования. Увеличение количества жизнеспособных клеток штамма в течение эксперимента на три порядка по сравнению с контролем свидетельствовало об использовании 2моноХБ в качестве ростового субстрата.

2.3. Разнообразие генов, кодирующих а-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, исследуемых бактерий-деструкторов

Проведен скрининг 24 штаммов-деструкторов бифенила, на наличие в их геноме нуклеотидных последовательностей, кодирующих а-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000). Амплифицируемые участки ДНК соответствуют правой части генов а-субъединиц терминальных оксигеназ, включающей каталитический центр (Zielinski et al., 2002). С ДНК четырнадцати штаммов был получен ПЦР-продукт ожидаемого размера, около 500 п.н. В то же время с ДНК ряда деструкторов бифенила/ПХБ, в том числе активных штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В51, отсутствовала специфичная амплификация. Несмотря на сформировавшуюся в процессе эволюции специализацию ферментов по отношению к конкретным субстратам, наблюдается перекрывание спектров окисляемых соединений даже для диоксигеназ, относящихся к разным подсемействам (Barriault, Sylvestre, 1999; Raschke et al, 2001). С другой стороны, известны бактерии родов Sphingomonas, Bacillus, Rhodococcus, осуществляющие деструкцию бифенила с помощью бифенил 2,3-диоксигеназ, существенно отличающихся от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ и сходных с фенантрен и нафталин диоксигеназами бактерий-деструкторов ПАУ (Romine et al., 1999; Mukeijee-Dhar et al., 2005; Taguchi et al., 2007; Yang et al., 2007). Полученные данные свидетельствуют об отличии ключевых ферментов деструкции бифенила исследованных нами активных бактерий от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ.

По результатам гидролиза ампликонов эндонуклеазами рестрикции Hha\ и НаеШ бактерии рода Pseudomonas были выделены в отдельную группу, бактерии порядка Actinomycetales можно подразделить на три группы (рис. 12). К первой группе относятся Rhodococcus sp. PI, Р12, Р13, Р20, утилизирующие бифенил/ХБ, нафталин, бензол, толуол. Штамм Rhodococcus sp. GIO (вторая группа)

осуществляет трансформацию бифенила/ХБ и растет на бензоле и толуоле. В третью группу вошли штаммы АпНюЬасгег Бр. Р24а, Се11и1отопаз ер. Р28, ]атЬас1ег ер. Р27а и Р9, способные к слабому росту на бифениле.

п.н.

Грамотрицательные бактерии

(Б)

Грамотрицательные I II III бактерии

Рис. 12. Электрофореграммы рестрикционных фрагментов, полученных при обработке ампликонов эндонуклеазами Hhal (А) и Нае III (Б):

Rhodococcus sp. (штаммы: J — PI, 4 — Р12, 5 - Р13, 6 - Р20, 7 - G10), Janibacter sp. (штаммы: 8 - P9, 9 - P27a), 72 - Arthrobacter sp. P24a, 13 - Cellulomonas sp. P28, Pseudomonas sp. (штаммы: 14 - S9, 15 - S13, 16 - S210, 17 - S211, 18 - S212); 2, 19 - Rhodococcus sp. P20 (ампликон, не обработанный эндонуклеазой); 1, 10, 20 -маркер 100-1000 п.н. («Силекс», Россия); 11 - маркер pUC19 ДНК/ Msp\ («Силекс», Россия).

Анализируемые участки генов бактерий рода Rhodococcus существенно отличались от гомологичных генов бактерий рода Pseudomonas (рис. 13). Участки ДНК штаммов Rhodococcus sp. PI, Р12 и Р13 были на 98-99% сходны с генами, кодирующими а-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназ, известного деструктора ПХБ Rhodococcus sp. RHA1 и разлагающего бифенил R. opacus BIE-20. Амплифицированный фрагмент ДНК Rhodococcus sp. G10 на 98% сходен с геном а-субъединицы гидроксилирующей диоксигеназы деструктора толуола Arthrobacter sp. 3YC3. У бактерий родов Janibacter и Arthrobacter обнаружены уникальные нуклеотидные последовательности, отличающиеся от генов, кодирующих большие субъединицы известных гидроксилирующих диоксигеназ как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (рис. 13).

Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем, контролирующих ключевые процессы деструкции ароматических углеводородов, бактерий-деструкторов бифенила из техногеннозагрязненных почв Прикамья.

(1.7 0.6 0.5 0.4 0J

Pseudomonas sp. B2A (AJ544518) Pseudomonas sp. S13 (FJ752168) Pseudomonas sp. S210 (FJ7S21G9) Pseudomonas sp. S9 (FJ752172) Pseudomonas sp. S212 (FJ752170) Pseudomonas sp. B4 (U95054) l00. Burkholderia xenovorans LS400 (M86384)

T Ralstonla eutmpha H850 (AJ544525) i(nt | Pseudomonas sp. Cam-1 (AY027651) P. pseudoatcaligenes KF707 (M83673)

_Rhodococcus sp. M5 (U27591)

I oo | Rhodococcus sp. G10 M Arthrobactersp. 3YC3 (DQ336942) Rhodococcus sp. BHA1 (D32142) »I Rhodococcus opacus 6IE-20 (AJ544524) 2if Rhodococcus sp. P12 (FJ7S5412) ,3J Rhodococcus sp. P13 (FJ752171)

| Rhodococcus sp. P1 {FJ752167)__

— Janlbacter sp. P27a | Arthrobsctersp. P24a I III

iooi -'—| Janlbacter sp. P9__l

Рис. 13. Дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных исследуемым участкам генов а-субъединиц подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ.

3. Природные и геиетически-модифицироваиные бактерии-деструкторы хлорбензойных кислот

Более 20 бактерий-деструкторов хлорбензойных кислот (2-, 3-, 4- и 2,4ХБК) были выделены из почв и грунтов, загрязненных отходами производства галогенсодержащих соединений (г. Пермь). Подробно нами были исследованы шесть штаммов-деструкторов 4ХБК, которые на основании филогенетических и фенотипических особенностей были идентифицированы как Arthrobacter sp. Н4, Н5, Micrococcus sp. G120, G126, Pseudomonas sp. G107, H2.

3.1. Генетические системы, контролирующие дехлорирование 4ХБК, бактерий рода Arthrobacter

Данные ДНК-типирования двух исследованных артробактерий, штаммов Н4 и Н5, показали их идентичность. Наибольший уровень сходства (99%) ген 16S рРНК штамма Н4 имеет с типовым штаммом A. globiformis М23411т. Штаммы Arthrobacter sp. Н4 и Н5 эффективно растут на 4ХБК, используя данное соединение в качестве единственного источника углерода и энергии, способны к росту на высоких концентрациях хлорбензоата - до 3 г/л. Параметры роста артробактерий сопоставимы с таковыми хорошо изученного штамма-деструктора 4ХБК A. globiformis КЗТ1 (Зайцев, Карасевич, 1981). Анализ метаболитов при культивировании штаммов Н4 и Н5 на 4ХБК показал наличие в среде инкубирования интермедиатов - ПГБК, ПКК и ионов хлора. На основании полученных результатов и анализа литературных данных было сделано предположение, что штаммы Н4, Н5, как и штамм КЗТ1, осуществляет дегалогенирование 4ХБК до расщепления ароматического кольца (Зайцев,

Карасевич, 1981). Описан механизм первичной атаки на молекулу 4ХБК -гидролитическое дегалогенирование (Elsner et ai, 1991). Эту реакцию катализирует трехкомпонентная 4ХБК-дегалогеназа, включающая 4-хлорбензоат-КоА-лигазу (FcbA), 4-хлорбензоил-КоА-дегалогеназу (FcbB) и 4-гидроксибензоат:КоА-тиозстеразу (FcbC).

Ранее нами было показано, что у штамма A. globiformis КЗТ1 реакция дегалогенирования 4ХБК контролируется генами, расположенными в плазмиде (рКЗТ1) размером -110 т.п.н. Гены, ответственные за дальнейший метаболизм иара-гидроксибензойной кислоты, находятся в хромосоме (Zaitzev et ai, 1991). У Arthrobacter sp. H4 и Н5, выделенных из техногенных почв (г. Пермь), плазмидные ДНК не были обнаружены. Можно предположить, что генетические детерминанты, контролирующие весь путь разложения 4ХБК, у этих штаммов располагаются в хромосоме.

Клонирование и изучение fcb-генов A. slobiformis КЗТ1. В клетках Е. coli JM109 на мультикопийном векторе pUC19 была сконструирована клонотека 5аи5Л-фрагментов тотальной ДНК (обогащенной плазмидной ДНК) штамма A. globiformis КЗТ1. При анализе Арг-клонов E.coli JM109 обнаружен рекомбинантный штамм, содержащий плазмиду рСАЗП, которая придавала клеткам Е. coli способность к дехлорированию 4ХБК. Анализ с использованием метода ТСХ показал, что ПГБК является единственным продуктом конверсии 4ХБК клетками Е. coli. Таким образом, в составе рСАЗП были клонированы fcb-гены, кодирующие 4-хлорбензоат-4-гидроксилазу (дегалогеназу). На основе рестрикционного анализа плазмиды рСАЗП и ее делеционных производных, а также анализа полипептидов, синтезированных в мини-клетках Е. coli на матрицах полученных рекомбинантных плазмид была построена физическая карта клонированного фрагмента ДНК (7612 т.п.н.), определена последовательность расположения генов, кодирующих полипептиды с Мг=57, 31 и 17 кДа. Показано, что все 3 гена fcbAl(A), fcbA2(B), fcbA3(C) требуются для сохранения 4ХБК+ фенотипа. В дальнейшем, данные о наличии трех структурных генов, определяющих дегалогеназную активность, были подтверждены и дополнены, когда была определена и проанализирована нуклеотидная последовательность ДНК, клонированная в составе плазмиды рСАЗП (номер в GenBank AF304300). Основываясь на результатах анализа нуклеотидных последовательностей и литературных данных (Babbitt et al., 1992; Schmitz et al., 1992), было сделано заключение, что проклонированные нами гены fcb объединены в структурный оперон с тремя открытыми трансляционными рамками, кодирующими полипептиды в следующем порядке: 4ХБК-КоА-лигаза, 4ХБК-КоА-дегалогеназа и 4ХБК-КоА-тиоэстераза.

3.2. /сб-Гены бактерий-деструкторов 4ХБК из техногеннозагрязненных почв (г. Пермь)

На основе нуклеотидных последовательностей fcb-генов штаммов A. globiformis КЗТ1 (GenBank AF304300) и Arthrobacter sp. SU (GenBank M93187) были разработаны праймеры, при использовании которых возможна амплификация участков ДНК, содержащих гены fcb к и fcbü (Rodrigues et ai, 2001). Методом ПЦР нами были исследованы выделенные бактерии-деструкторы 4ХБК на наличие в геноме fcb-генов. С ДНК штаммов Arthrobacter sp. Н4, Н5, Micrococcus sp. G120 были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера -589 п.н. (fcbА) и 598 п.н. (fcbB) (рис. 14А). Полученные результаты позволяют

сделать предположение о наличии у этих штаммов генов, контролирующих дегалогенирование 4ХБК. /cb-Гены были также обнаружены у штамма R. ruber Р25 (рис. 14Б), деструктора ХБ/4ХБК (см. раздел 2.2.).

1 2 3 4 5 А Б

Рис. 14. Электрофореграммы продуктов амплификации fcb-генов штаммов-деструкторов 4ХБК: (A) Arthrobacter sp. Н4 (2 - fcbA, 6 - fcbB), Micrococcus sp. G126 (3-fcbA, 7 -fcbB), Micrococcus sp. G120 (4 -fcbA, 8 -fcbB), Arthrobacter sp. H5 (5 -fcbA, 9 - fcbB), 1, 10 - маркер IX («Sigma», Германия), 11- отрицательный контроль; (Б) А. globiformis КЗТ1 (1 -fcbA, 4 -fcbB), R. ruber P25 (2 - fcbA, 5-fcbB), 3 - маркер 1000 п.н. («Силекс», Россия).

Анализ нуклеотидных последовательностей генов fcbA и fcbB штамма Arthrobacter sp. Н4 показал 100% сходство с гомологичными последовательностями большинства бактерий рода Arthrobacter. Уровень сходства участка гена fcbA штамма R. ruber Р25 с генами, кодирующими 4-хлоробензоат-КоА-лигазу, бактерий A. globiformis КЗТ1, A. ramosus FG1, Arthrobacter sp. SU, Arthrobacter sp. TM1 составил 98-99%; с гомологичным геном Arthrobacter sp. FHP1 - 95%. Обнаружено 98-99% сходство участка гена fcbB штамма R. ruber Р25 с гомологичными нуклеотидными последовательностями бактерий рода Arthrobacter. В литературе не описано фактов присутствия/сй-генов у природных бактерий рода Rhodococcus. Следует отметить, что штамм R. ruber Р25, способный полностью разлагать 4ХБ/4ХБК, и деструкторы 4ХБК рода Arthrobacter (штаммы Н4, Н5), выделены из одних и тех же почв, загрязненных отходами производства галогенированных соединений (г. Пермь). Известно, что гены, контролирующие деструкцию 4ХБК, могут входить в состав плазмид и транспозонов (Zaitsev et al., 1991; Peel, Wyndham, 1999), кроме того, fcb-гены бактерий рода Arthrobacter успешно экспрессируются в клетках бактерий рода Rhodococcus (Rodrigues et al, 2006). Таким образом, не исключена возможность горизонтального переноса кластера генов fcb между бактериями почвенной экосистемы, находящейся под высоким селективным давлением галогенсодержащих поллютантов.

3.3. оЛЬ-Гены, контролирующие окислительное дегалогенирование ор/ио-замещенных хлорбензоатов, Pseudomonas aeruginosa 142

Другим механизмом первичной атаки хлорбензойных кислот является окислительное дегалогенирование, описанное для ряда бактерий-деструкторов 2ХБК, 2,4диХБК и 2,5диХБК рода Pseudomonas, в том числе Р. aeruginosa 142 (рис. 15). В нашей работе были клонированы и охарактеризованы ohb-гены,

контролирующие отщепление галогена из о/дао-положения до расщепления ароматического кольца, штамма деструктора 2ХБК и 2,4диХБК Р. aeruginosa 142 (Романов и др., 1993). На основе вектора широкого круга хозяев pSP329 в клетках Е. coli DH5aF была создана клонотека генов тотальной ДНК Р. aeruginosa 142, среди 3700 клонов которой обнаружены 2 клона, осуществляющие превращение 2ХБК в катехол и 2,4диХБК - в 4-хлоркатехол. На основании полученных результатов был сделан вывод, что в рекомбинантных плазмидах pOD33 и pOD22, содержащихся в этих клонах, присутствуют ohb-тен ы орто-галобензоат 1,2-диоксигеназы (ОГБД) (рис. 15).

Oxidized

- Oxidized -Reductase

Oxidized Ferredoxin

X Fell

A-c

COOH

2IÍ4"

NADH + H'-V Reduced -^t J-Reduced-^ ^Reducedq/

Y FAOorFMN Y [2Fe-2Sl ]f Rieske pFe-2S] y orffto-CBA

OhbA (ß subunit) OhbB (a subunit)

C02 + СГ

I „

Spontaneous

Catechol

Рис. 15. Молекулярный механизм окислительного о/юто-дегалогенирования хлорбензоатов, описанный для P. aeruginosa 142 (Romanov and Hausinger, 1994).

Плазмида pOD33, содержащая вставку ДНК около 6 т.п.н. и стабильно поддерживающаяся в клетках Е. coli, была использована для дальнейших исследований. Путем субклонирования плазмиды pOD33 с применением экзонуклеазы Bal31 была получена плазмида рЕ43 с размером вставки ДНК 3.7 т.п.н., проявляющая наибольший уровень экспрессии о/гб-гснов в клетках Е. coli, которая была трансформирована в клетки P. putida mt-2 (штамм РВ2440) (Bagdasarian et al., 1981). Рекомбинантный штамм P. putida PB2440(pE43) приобрел новые свойства: рос на 2ХБК как единственном источнике углерода и энергии при концентрации субстрата до 2 мМ. В опытах с отмытыми клетками была показана способность штамма окислять дихлорированные субстраты - 2,4диХБК, 2,5диХБК и 2,6диХБК.

Определена нуклеотидная последовательность вставки ДНК плазмиды pOD33 размером 6052 п.н. (GenBank AF121970). Обнаружены 6 открытых рамок считывания, в том числе генов ohbB, ohbA, кодирующих большую и малую субъединицы терминальной диоксигеназы, соответственно (рис. 16). Кроме того, обнаружен регуляторный ген ohbR, транслируемый им белок относится к регуляторным белкам IclR-типа (Donald et al., 1996). Интересен факт, что орто-галобензоат 1,2-диоксигеназная активность проявлялась в отсутствие генов, кодирующих ферредоксин и редуктазу, предполагается, что терминальная оксигеназа ОГБД использует электрон-транспортную систему, синтезируемую различными бактериями-хозяевами. Терминальная оксигеназа, кодируемая генами ohbB и ohbA, образует отдельный филогенетический кластер, который включает ароматические оксигеназы нетипичной структурно-функциональной организации и отличающиеся от других членов семейства ароматических диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000).

В составе клонированной вставки была обнаружена открытая рамка считывания ORF5 (ohbC); функция транслируемого полипептида массой 48969 Да

неизвестна (рис. 17). оАЬ-Гены фланкированы Ш396-подобными инсерционными последовательностями, в состав транспозона входили гены tnpA и top, кодирующие транспозазу А и топоизомеразу ИИ, соответственно. Кроме того, было обнаружено, что весь «о/гб-регион» ограничен инвертированными повторами размером 14 п.н. в позициях (56 - 69) и (5984-5997) (GenBank AF121970).

pOD22 Ohb*

О О g О

СО UJ UJ СО

Р/ас

и со о .смр я А с со и со 0_ CLUjX^tO^C ^ CD®

LliLI

1aSiiM!

Sa/31 (500?;

Smal

45.247D 25,6940

6 <563 <645 2361 -

ß-ISP 20.253D

2783 g313 3354

a-JSP 46,2430

оhbR ohbA

ohbß 48.969D

39,715D

«640 4731 5747

X-

pOD33 Ohb*

p33E10 Ohb+ p33K21 Ohb* pE43 Ohb* p33G1 Ohb" pE33-1 Ohtr рКЗЗНТ Ohb-p33C7 Ohb" pK33A16 Ohb-pK33A20 Ohb-

Рис. 16. Физическая карта и организация ohb- локусов в составе рекомбинантных плазмид pOD22 и pOD33. Плазмиды рКЗЗА16, рКЗЗН7 и рКЗЗА20 были сконструированы на основе вектора BlueScript; для других вариантов использовали вектор pSP329. Фенотипы указаны справа от названия плазмид. Локализация и ориентация ORF1 (top), ORF2 (ohbR), ORF3 (ohbA), ORF4 (ohbB), 0RF5 (ohbQ, ORF6 (tnpA) показана в нижней части рисунка, там же указаны молекулярные массы соответствующих полипептидов.

1 2 3 4 5 6

-66

-45 -36

Рис. 17. Авторадиограмма [358]метионин-меченных полипептидов, синтезируемых в миниклетках Е. coli X 925, содержащих рекомбинантные -29 плазмиды. Дорожки: /, pSP329; 2,pOD33;

3, рЗЗК21; 4, pOD22; 5, рЕ43; 6,рЕЗЗ-1. Стандарты молекулярных масс (SDS-7; «Sigma»): бычий сывороточный альбумин (66.2 kDa), овальбумин (45 kDa),

глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (36 kDa), карбоангидраза (29 kDa), трипсиноген (24 kDa), ингибитор трипсина (20.1 kDa), and к-лактальбумин (14.2 kDa).

-14.2

3.4. Конструирование метаболических путей деструкции хлорароматических соединений в клетках бактерий

3.4.1. Клонирование и экспрессия fcb-гсчов в составе рекомбинантной плазмиды в клетках Р. pulida

На основе вектора с широким кругом бактерий-хозяев pRK415 (Кееп,1988) нами была сконструирована рекомбинантная плазмида рРСЗ, содержащая fcb-гены. Из клеток рекомбинантного штамма Е. coli JM109(pPC3) плазмида была мобилизована в клетки штамма Р. putida K36R (Rif), способного к полному окислению яяря-гидроксибензойной кислоты (ПГБК), но не 4ХБК (Карасевич, Зайцев, 1984). Эксперименты по выращиванию в СГ-свободной среде в присутствии возрастающих концентраций 4ХБК показали, что за 48 часов роста рекомбинантный штамм Р. putida K36R(pPC3) полностью дехлорирует 3.5 г/л субстрата в сравнении с 1.5 г/л в случае родительского штамма КЗТ1. Таким образом, внесение fcb-генов в штамм, утилизирующий ПГБК, привело к образованию гибридного пути деградации 4ХБК путем вертикального наращивания предсуществовавшего пути.

Путем пересевов рекомбинантного штамма Р. putida K36R(pPC3) на среды с постепенно повышающимися концентрациями 4ХБК (от 1 до 10 г/л) были получены варианты, характеризующиеся суперэкспрессией fcb-генов. Наиболее эффективное фенотипическое выражение функции дехлорирования наблюдалось у штамма K36R(pPC3-10), адаптированного к росту на 10 г/л 4ХБК, который полностью минерализовал до 6 г/л 4ХБК при росте в минеральной среде. Все штаммы, адаптированные к высоким концентрациям 4ХБК, характеризовались более высокой степенью стабильности поддержания плазмиды в клетках по сравнению с исходным штаммом K36R(pPC3). Рестрикционный анализ плазмид из всех адаптированных вариантов штамма K36R(pPC3) выявил во всех случаях наличие делеции размером 3 т.п.н. в векторной части плазмиды рРСЗ. Основываясь на этом факте, можно предположить, что повышение стабильности плазмид в клетках адаптированных штаммов связано со структурными изменениями исходной рекомбинантной плазмиды рРСЗ.

3.4.2. Конструирование рекомбинантного штамма, содержащего fcb-тты в хромосоме Р. putida

Реальный путь достижения генетической стабильности - интеграция желаемого гена в хромосому реципиента. С этой целью нами были проведены эксперименты по конструированию штамма, содержащего fcb-текы в хромосоме Р. putida K36R. На основе вектора pDK8, содержащего модифицированный транспозон Tn5-K2GA(Tcr), была сконструирована плазмида pCDK4, содержащая /сб-гены, которая была мобилизована в клетки Р. putida K36R. При селекции трансконьюгантов на среде, содержащей тетрациклин и 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии, был получен рекомбинантный штамм K36R::Tn5-K2GA[Tcr/c6Al,A2,A3], характеризовавшийся высокой стабильностью признака 4ХБК+. Сравнительный анализ эффективности деградации 4ХБК полученного штамма и плазмидных вариантов штамма K3-6R показал, что за 20 суток штамм полностью утилизирует до 4 г/л 4ХБК. Эта величина сравнима с таковой для штамма K36R(pPC3), но много ниже для адаптированных вариантов последнего.

Таким образом, введение генов дехлорирования в хромосому, с одной стороны, приводило к стабилизации проявления функции. С другой стороны, плазмидные варианты штамма P. putida K36R обладали более высокой эффективностью дехлорирования 4ХБК, так как в хромосоме /cb-гены находились в единственной копии.

3.4.3. Штаммы-деструкторы ПХБ, сконструированные при использовании fcb- и оА6-генов

Описано большое количество бактерий-деструкторов, осуществляющих разложение различных конгенеров ПХБ, и наиболее изученными из них являются штаммы Burkholderia xenavorans LB400 и Rhodococcus sp. RHA1 (Chain et al., 2006; McLeod et al., 2006). Однако подавляющее большинство деструкторов ПХБ, в том числе и вышеперечисленные, в процессе разложения этих токсикантов аккумулируют хлорбензоаты. Для создания рекомбинантного пути полной утилизации орто- и пара-ХБ были использованы ohb и fcb гены (рис. 18), контролирующие орто- и лдря-дегалогенирование хлорбензоатов (см. разделы 3.1. и 3.3.).

Preexisting

metabolic

pathways

Рис. 18. Рекомбинантиые пути деградации 2ХБК (вверху) и 4ХБК (внизу), конструированные путем наращивания предсуществовавших путей окисления (хлор)бифенилов, ормо-гидроксибензоата, катехола и пентадиена с использованием дегалогеназных генов оНЬЛВ и/сЬАВС. Показано анаэробное дехлорирование Арохлора, в результате которого аккумулируются, в основном, орто- и пара-замещенные ХБ (слева) и метаболизм 2ХБ и 4ХБ через о/даго-ХБ-ГОФДК и яярд-ХБ-ГОФДК, соответственно, которые трансформируются в ХБК и пентадиен {цит. по Нгу\упа а а1., 1999).

Первоначально были проведены эксперименты по созданию модифицированных путей полной утилизации моноХБ путем добавления генов дегалогенирования оИЬ и }сЬ в составе рекомбинантных плазмид в штамм-деструктор хлорбифенилов Сотатопав 1е$1о51егом УР44 (Мальцева е! а1., 1999). Рекомбинантиые штаммы С. 1езШ1егом УР44, содержащие о/гЬ и /сб гены приобретали способность расти на 2ХБК, 2моноХБ и 4ХБК, 4моноХБ, соответственно, при концентрации 10 мМ каждого из субстратов (Нгумгаа е/ а1., 1999). Аналогичные эксперименты были проведены с использованием штамма Rhodococcus ер. RHA1 в качестве реципиента генов /сЬ (плазмиды pRHD34)•.

сконструированный штамм приобретал способность к росту на 4ХБК и 4моноХБ (Rodrigues et al, 2001).

Рекомбинантные штаммы В. xenovorans LB400 (pR041, ohb) и Rhodococcus sp. RHA1 (pRHD34,/cb) были исследованы в модельных почвенных экспериментах при деструкции коммерческой смеси ПХБ «Aroclor 1242». После 30 дней инкубирования количество ПХБ-конгенеров сократилось на 57%, при этом рекомбинантные бактерии стабильно сохранялись в загрязненной ПХБ почве в течение всего эксперимента (Rodrigues et al., 2006).

Таким образом, использование клонированных генов раннего дегалогенирования при создании бактерий с новыми метаболическими характеристиками, существенными при разложении хлорароматических ксенобиотиков, имеет фундаментальное и практическое значение.

4. Природные и модельные ассоциации бактерий, перспективные для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды

4.1. Нафталинметаболизирующие ассоциации бактерий, выделенные

из техногеннозасоленных почв

Из почв района солеразработок методом накопительного культивирования получены две ассоциации бактерий, способные расти на нафталине в присутствии повышенной солености среды: ассоциация SMB1 - до 80 г/л NaCl, ассоциация SMB3 - до 90 г/л NaCl.

4.1.1. Характеристика нафталинметаболизирующих ассоциаций

Ассоциация бактерий SMB1. При росте ассоциации SMB1 на агаризованной минеральной среде в парах нафталина наблюдалось формирование биопленки на агаре при содержании хлорида натрия до 140 г/л (табл. 6). В то же время, рост ассоциации в жидкой минеральной среде на нафталине как единственном источнике углерода и энергии был зафиксирован при содержании соли не более 80 г/л. Наибольшие показатели роста сообщества были установлены в отсутствие NaCl в среде культивирования (ОП54о=0.66 о.е.), в присутствии 50, 70 и 80 г/л NaCl оптическая плотность культуры уменьшалась и достигала 0.25, 0.19 и 0.11 о.е., соответственно.

Таблица 6. Рост ассоциации 8МВ1 и индивидуальных штаммов на агаризованной среде в присутствии разных концентраций хлорида натрия

Штамм Минеральная среда с нафталином, NaCl (г/л) Полноценная среда, NaCl (г/л)

0 30 70 100 140 0 30 60 120 180 240 290

Arthrobacter sp. SMB11 + + + - - + + + + - - -

Arthrobacter sp. SMB145 + + + - - + + + + - - -

Brevibacterium perntense SMB14 + + + + - - -

Chromohalobacter sp. SMB17 - + + + + ± ±

Ассоциация SMB1* + + + + + + + + + + ± ±

Примечание. «+» - рост (колонии размером 1-3 мм); «±» - слабый рост (колонии размером менее 1 мм); «-» - отсутствие роста бактерий. *Рост фиксировался по образованию биопленки на агаризованной среде. При росте на полноценной среде в присутствии 240 г/л и 290 г/л №0 присутствовали только колонии штамма СЬготоМкзЬаМег 5р. БМВ 17.

Галотолерантные штаммы Arthrobacter sp. SMB11 и Arthrobacter sp. SMB145 филогенетически близки (99.7% сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК) к A. crystallopoietes (см. раздел 1.1). Штаммы росли на нафталине, салицилате и ацетате (интермедиаты деструкции нафталина), а также бензойной и иара-гидроксибензойной кислотах.

Грамположительный штамм SMB14 (=ВКМ Ас-2280т =LMG 22207) на основании результатов изучения генотипических, хемотаксономических и морфо-физиологических характеристик был валидно описан как новый вид Brevibacteriiun pernease. Штамм рос на бензойной, ифа-гидроксибензойной кислотах и ацетате как единственном источнике углерода и энергии, а также на полноценной среде Раймонда без NaCl в среде культивирования и при концентрации соли до 120 г/л (табл. 6).

Штамм SMB17 - умеренно галофильная бактерия семейства Halomonadaceae, растет на средах при 30-290 г/л NaCL и не растет в отсутствии соли (табл. 6). Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (около 1470 п.н.) показал, что штамм входит в филогенетический кластер, включающий представителей рода Chromohalobacter, и наиболее близок (более 99% сходства 16S рРНК генов) к С. canadensis АТСС 43984т, С. beijerinckii АТСС 19372т и С. japónicas СЕСТ 7219т. Штамм растет на бензойной, иора-гидроксибензойной кислотах и ацетате.

Ассоциаиия бактерий SMB3. Изучение влияния солености среды на рост консорциума SMB3 в минеральной среде Раймонда с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии показало, что максимальные значения оптической плотности культуры наблюдаются при 30 г/л NaCl и в отсутствие соли. Увеличение концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 90 г/л приводило к снижению показателей ростовых характеристик. При более высоких концентрациях соли увеличения оптической плотности не зафиксировано (рис. 19). Из исследуемой ассоциации выделено семь штаммов бактерий (табл. 7), отличающиеся между собой и от выделенных ранее из района солеразработок бактерий по фенотипическим и генотипическим характеристикам (REP-, ВОХ-ПЦР и ARDRA).

ОГК

50 100 150 200 250 300

Часы

Рис. 19. Рост ассоциации вМВЗ в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях №С1 (г/л). I - без соли, 2-30,3- 60, 4-75,5 - 90.

В состав ассоциации входят Лйси/ососа« ер. 5МВ37 и Rhodococcus зр. БМВ38 -деструкторы нафталина (см. раздел 1.2.), а также штаммы, не деградирующие данное соединение (бактерии-спутники) (табл. 7), характеристики которых приводятся ниже.

Таблица 7. Рост бактерий из ассоциации БМВЗ на полноценной и минеральной (с нафталином) средах в присутствии разных концентраций №С1 (г/л)

Штамм Полноценная среда * Мине] с нас >альная среда )талином**

0 30 80 100 170 300 0 75 90

Halomonas sp. SMB31 Arthrobacter sp. SMB32 Microbacterium sp. SMB33 «Thalassospira permensis» SMB34 Salinicola socius SMB35 Rhodococcus sp. SMB37 Rhodococcus sp. SMB38 +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + ++ +++ + + ++ ++ + + +++ +++ + +++ +

Примечание. * рост на полноценной агаризованной среде Раймонда, ** рост в жидкой минеральной среде Раймонда с нафталином, «-» - нет роста, «+» - «+++» -активность роста.

Штамм Halomonas sp. SMB31, согласно филогенетическому анализу (lóSpPHK), наиболее близок к Halomonas taeanensis (уровень сходства 99.8%) и характеризуется фенотипическими признаками, свойственными роду.

Штамм SMB35 образует периферическую ветвь в филогенетическом кластере, включающем роды Halomonas, Cobetia и Chromohalobacter. Уровни сходства 16S рРНК гена штамма SMB35 и видов рода Halomonas - в пределах 90.6% - 95.1%. Наиболее высокие величины сходства (95.0-95.1%) обнаружены с тремя видами рода Halomonas - Н. pacifica, Н. taeanensis и Н. ventosae. Штамм SMB35 отличается также от видов Halomonas sensu stricto и близкородственных видов Halomonas, а также от представителей других родов семейства Halomonadaceae по фенотипическим характеристикам (подвижность и характер расположения жгутиков, диапазон концентраций NaCl, при которых возможен рост, способность гидролизовать крахмал, желатину, твин 80, мочевину). На основании вышеперечисленных характеристик, а также отличий по содержанию Г+Ц-пар в ДНК, штамм SMB35 (=ВКМ B-2397T=DSM 19940т) валидно описан в качестве нового рода и вида Salinicola socius в семействе Halomonadaceae.

Штамм SMB34 (сем. Rhodospirillaceae) является аэробом, хемоорганотрофом, клетки - изогнутые палочки, подвижные (один полярный жгутик). Оксидазо- и каталазоположительные. Штамм растет как в отсутствии NaCl, так и при высокой солености среды культивирования (до 80 г/л соли). Филогенетический анализ (16S рРНК) показал, что штамм группируется с представителями рода Thalassospira и имеет наиболее высокий уровень сходства гена 16S рРНК (99.5%) с Т. xiamenensis М-5Т. Уровень сходства с типовым штаммом типового вида рода Thalassospira (Т. lucentensis QMT2T) - 96.6%. Состав жирных кислот SMB34 и референтных штаммов оказался близким, преобладали Сшсо7, С,б:о, Сию. C[6:ic07c, С17:0 cyclo. Однако у штамма SMB34 дополнительно выявлены iso-C15:0 и anteiso-C15:0, не обнаруженные у близкородственных видов. Уровень ДНК-ДНК сходства между штаммом SMB34 и типовыми штаммами (Т. xiamenensis М-5Т , Т. tepidiphila 1-1Вт и Т. profundimaris WP0211T) не

превышает 50%. Основываясь на перечисленных выше данных, штамм SMB34 (=ВКМ В-2527т =NBRC 106175т) отнесен к новому виду «Тhalassospirapermensis».

Штаммы SMB32 и SMB33 на основании филогенетического анализа и ряда фенотипических признаков на данном этапе исследований определены как Arthrobacter sp. (группа «Л. nicoíianae») и Microbacterium sp., соответственно. Штаммы являются компонентами нафталинметаболизирующего консорциума SMB3, способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии интермедиаты деструкции нафталина - салицилат и гентизат.

Галотолерантные штаммы Rhodococcus sp. SMB37, Rhodococcus sp. SMB38, Arthrobacter sp. SMB32 и Microbacterium sp. SMB33 способны к росту на полноценной среде Раймонда без и в присутствии NaCl до 100 г/л, a «Thalassospira permensis» SMB34 растет при концентрации соли до 80 г/л в среде культивирования (табл. 7). Умереннно галофильные, согласно классификации Кашнера (Кашнер, 1981; Ventosa et al., 1998), штаммы SMB31 и SMB35 (сем. Halomonadaceae) растут на полноценной среде Раймонда при 30 - 300 г/л NaCl; оптимальный рост - при 30-100 г/л NaCl в среде культивирования.

Штаммы Halomonas sp. SMB31 и Salinicola socius SMB35 при росте в минеральной среде Раймонда с глюкозой в качестве субстрата в условиях высокой осмолярности среды (50, 100 г/л NaCl) внутриклеточно накапливали эктоин и глутамат. В клетках S. socius при росте в присутствии 100 г/л NaCl был дополнительно обнаружен гидроксиэктоин. Полученные результаты о качественном составе осмопротекторов представителей семейства Halomonadaceae согласуются с литературными данными (Calderón et al., 2004; Vargas et al., 2006).

4.1.2. Промкооперация в нафталинметаболизирукнцем консорциуме бактерий SMB3

Поскольку бактерии-спутники консорциума SMB3 способны расти на интермедиатах катаболизма нафталина (салицилате, гентизате, ацетате), было проведено исследование влияния промежуточных метаболитов деструкции нафталина на структуру консорциума, используя метод ДГГЭ и подсчет КОЕ. Установлено, что культивирование консорциума на ацетате, салицилате и гентизате приводит к элиминации ряда бактерий, в то время как при инкубировании с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии состав стабильно сохраняется. Наблюдаемое уменьшение биоразнообразия консорциума SMB3 при смене источника углерода и энергии (нафталина на промежуточные продукты его метаболизма) можно объяснить сокращением звеньев трофической цепи, что ведет к конкуренции между бактериальными популяциями, трансформирующими одинаковый субстрат. Полученные результаты доказывают, что в ассоциации присутствуют сформированные трофические связи, в которых каждый член сообщества занимает определенную экологическую нишу.

Изучены кинетические параметры роста модельных смешанных культур на нафталине в условиях высокой солености среды. В экспериментах были использованы родококки - деструкторы нафталина SMB37 и SMB38, умеренно галофильный штамм Halomonas sp. SMB31 в следующих вариантах: штаммы SMB37 и SMB31 (/); штаммы SMB38 и SMB31 (//); штаммы SMB37, SMB38 и SMB31 (///). Контроль качественного состава смешанных культур бактерий осуществляли методом ДГГЭ. Результаты электрофореза подтверждают данные, полученные на основе макроморфологических свойств бактерий (подсчет КОЕ).

Показано, что умеренно галофильная бактерия НаЪтопавър. 5МВ31 сохраняется в составе смешанных культур при культивировании на нафталине и, более того, способна к эффективному росту (рис. 20 А,Б). При совместном культивировании штаммов-деструкторов с умеренно галофильной культурой На1отопав Бр. 8МВ31 значительно сокращается /а^-период и увеличивается удельная скорость роста Шойососст ер. 8МВ38, а также увеличивается количество клеток Шос1осасси$ эр. 8МВ37 (рис. 20 В).

I вариант Я вариант

111 вариант

КОВмл 1,00ЕЮ9

1.00&08

1.00&07

1.00&06

1.0ОЕ+О5

1.0ОЕ+О4

1,ООЬОЗ

-эмвзв

-ЭМВЗ! -БМВЗв

200 300

400 500 Часы

Рис. 20. Рост модельных ассоциаций и индивидуальных штаммов-деструкторов в среде Раймонда на нафталине в присутствии 70 г/л №С1. Не заштрихованные маркеры индивидуальные бактерии,

заштрихованные маркеры - штаммы в составе ассоциаций.

Результаты модельных экспериментов, демонстрирующие наличие взаимовыгодных отношений между деструкторами и бактериями-спутниками в искусственно созданных ассоциациях, могут быть спроецированы как на отношения организмов в полученных нами путем селекции консорциумах (8МВ1, БМВЗ), так и на отношения в микробиоценозах природных и техногенных экосистем. По всей вероятности, описанные выше взаимодействия между бактериями в условиях высокой осмолярности среды связаны с обменом осмопротекторными соединениями между членами микробных сообществ (консорциумов). Способность синтезировать осмолиты была нами выявлена у умеренно галофильных бактерий сем. На1отопас1асеае (см. раздел 4.1.1.) и галотолерантных бактерий из ассоциаций БМВ1, БМВЗ (см. раздел 1.5.).

4.2. Двухкомпонснтная бактериальная ассоциация, осуществляющая полную деструкцию 2,4'-дихлорбифенила

Штамм-деструктор хлорбифенилов М1сгоЬас1егшт ер. В51 не осуществляет полную утилизацию 2,4'диХБ, а разлагает его до 4ХБК (см. раздел 2.1, табл. 4). Для дополнения полного пути разложения 2,4'диХБ, утилизации хлорбензоата (рис. 21), был использован штамм-деструктор 4ХБК АпкгоЬас1ег $ р. Н5 (см. раздел 3). При совместном культивировании штаммов МкгоЬас1епит Бр. В51 и АгЛгоЬас1ег ер. Н5 полная деструкция 2,4'диХБ и 4ХБК осуществлялась за 58 часов. О минерализации 2,4'диХБ данной двухкомпонентной культурой свидетельствует и накопление в культуральной жидкости свободных ионов хлора: к 82 часам их количество составило 100% от теоретически возможного.

Рис. 21. Деструкция 2,4'-дихлорбифенила двухкомпонентной бактериальной ассоциацией: I - рост МкгоЬааепит Бр. В51; 2 - рост АгЛгоЬааег Бр. Н5; 3 - СГ; 4 - 4ХБК; 5 -СГ (без внесения АпкгоЬааег Бр. Н5); б -4ХБК (без внесения АяИгоЬааег ер. Н5). Стрелкой указан момент внесения штамма Н5.

час

Деструкция 2,4'диХБ сопровождалась интенсивным ростом бактерий, о чем свидетельствует увеличение КОЕ штамма В51 на два порядка, а штамма Н5 - на три порядка. На основании полученных результатов можно сказать, что созданная нами двухкомпонентная ассоциация осуществляет деструкцию 2,4'диХБ эффективнее, чем описанные ранее смешанные культуры (Бауа е1 а!., 1994, 1996; РоПаи'йсе а а1., 1998). Одним из важных моментов, влияющих на активность деградации токсикантов, являются особенности взаимодействия бактерий в ассоциации фауеу, 0'Тоо1е, 2000; СЫ&1еп5сп е! а1, 2002). Анализ параметров роста штаммов В51 и Н5 при совместном культивировании на 2,4'диХБ выявил отсутствие антагонистического действия штаммов друг на друга.

Таким образом, на примере изучения экспериментально созданной ассоциации штаммов М1сгоЬас1егшт ер. В51 и Ап1\гоЬас1ег Бр. Н5 показана возможность создания комбинаций бактерий-деструкторов, которые могли бы служить основой при создании биопрепаратов, использующихся для ремедиации объектов окружающей среды от устойчивых токсичных поллютантов -полихлорированных бифенилов.

Заключение

КОЕ/мл

способностью используемых организмов к полной деградации целевых токсикантов или их разложения до менее токсичных интермедиатов (утилизируемых основной массой участников микробиоценозов), так и активностью создаваемых биопрепаратов (технологий) в широком диапазоне физико-химических условий. В результате скрининга более 500 штаммов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и

полихлорированных бифенилов, были выявлены и детально охарактеризованы бактерии различных эволюционных групп, способные разлагать токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40°С), солености (до 80-90 г/л NaCl) и pH среды (от 5 до 9). В их числе протеобактерии (Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), актинобактерии (Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces), спорообразующие бактерии семейства Bacillaceae (Bacillus, Paenibacillus).

При исследовании галотолерантных нафталинметаболизирующих бактериальных консорциумов, выделенных из техногеннозасоленных почв, было продемонстрировано наличие протокооперативных отношений между их компонентами (бактериями-деструкторами ПАУ и бактериями-спутниками). Показано положительное влияние умеренно галофильных бактерий семейства Halomonadaceae (постоянных членов данных консорциумов), синтезирующих осмопротекторные соединения, на процесс разложения ПАУ в условиях повышения солености среды. Полученные результаты, несомненно, внесут существенный вклад в стратегии усовершенствования методов биоремедиации засоленных экосистем.

В результате изучения бактерий-деструкторов бифенила/ПХБ были впервые обнаружены грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение моно(ди)хлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 - орто-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) - (орто)пара-ионоХБ и 2,4'диХБ, характеризующиеся уникальными особенностями утилизации индивидуальных хлорбифенилов и их смесей - как в минеральных средах, так и в модельных почвенных системах. Штаммы могут применяться для восстановления почв, водоемов и деструкции промышленных смесей, содержащих хлорбифенилы (Патент РФ №2262531). Было также показано, что полное разложение 2,4'-дихлорбифенила эффективно осуществляется двухкомпонентным модельным консорциумом, включающим Microbacterium sp. В51 (осуществляет деструкцию 2,4'-дихлорбифенила до 4-хлорбензойной кислоты) и Arthrobacter sp. Н5 (деструктор 4-хлорбензоата). Использование ассоциаций микроорганизмов, содержащих дополняющие друг друга метаболические пути разложения какого-либо субстрата, является одной из стратегий детоксикации сложных органических поллютантов и лежит в основе создании современных биопрепаратов.

Клонирование fcb- и ohb-генов, контролирующих ияра-дегалогенирование 4ХБК и ор/ио-дегалогенирование 2-/2,4ХБК, соответственно, и конструирование рекомбинантных путей полной деградации хлорбензоатов в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. На основе этих генов был создан ряд генетически модифицированных штаммов, осуществляющих эффективную утилизацию opmo-tnapa-хлорбифенилов и коммерческих смесей ПХБ.

У активных бактерий-деструкторов ПАУ и бифенила/ПХБ родов Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus и Pseudomonas были изучены ключевые гены начального этапа разложения этих соединений. Нуклеотидные последовательности этих функциональных генов (nar, bph) включены в международные базы данных GenBank/EMBL/DDBJ. Показано, что у акгинобактерий nar, bph гены характеризуются большим полиморфизмом по сравнению с аналогичными функциональными генами протеобактерий рода Pseudomonas. Накопление информации о структуре генов/оперонов, определяющих ключевые моменты метаболизма токсичных соединений, имеет важное значение для развития системной биологии с целью применения ее достижений в биодеградации (Trigo et al., 2009). Подходы системной биологии, учитывающие в максимальной степени результаты экологических исследований и информацию в сфере геномики, метагеномики, протеомики и метаболомики, являются наиболее перспективными как для понимания молекулярных механизмов биодеградации трудноразлагаемых поллютантов в условиях микробиоценозов, так и для создания биопрепаратов (биотехнологий), активных в определенных биологических и физико-химических условиях, оптимизации протекания биодеградативных процессов.

Проведенные исследования выявили значительный пласт не исследованного ранее микробного разнообразия. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий от ближайших таксонов, обнаружены организмы нового рода и новых видов бактерий, в их числе, характеризующиеся биодеградативными свойствами. Ряд из них (Salinicola socius, Brevibacterium permense, Brevibacterium antiquum и Brevibacterium aurantiacum) валидно описаны в соответствии с международными правилами, описания других («Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov., «Thalassospira permensis» sp. nov.) представлены в настоящее работе. Важным результатом таксономического направления исследований явилось упорядочение таксономической структуры рода Brevibacterium и доказательство наличия среди оранжево-пигментированных организмов нескольких видов внутри этого рода. Обоснование создания нового рода Salinicola для штамма SMB35 из нафталинметаболизирующего консорциума явилось важным этапом в развитии системы классификации филогенетически гетерогенного рода Halomonas и семейства Halomonadaceae в целом. В настоящее время в род Salinicola реклассифицированы некоторые ранее описанные виды родов Halomonas и Chromohalobacter (de la Haba et al., 2009).

ВЫВОДЫ

1. Получены новые сведения о микробном разнообразии биоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Впервые выделены и изучены галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина и фенантрена) родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. Показано, что большинство исследуемых бактерий родов Pseudomonas и Arthrobacter содержат D-плазмиды, контролирующие начальные этапы разложения полиароматических соединений.

способные к росту на нафталине в чистой культуре, но синтезирующие осмопртекторные соединения. Полученные данные свидетельствуют о протокооперативных взаимоотношениях членов нафталинметаболизирующих консорциумов.

3. На основании филогенетической обособленности (16S рРНК ген) и фенотипических отличий бактерий, входящих в нафталинметаболизирующие консорциумы, описаны новый род Salinicola и вид Salinicola socius (семейство Halomonadaceae), а также виды «Thalassospira permensis» sp. nov. (семейство Rhodospirilaceaé), Brevibacterium permease (семейство Brevibacteriaceae) «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov. (семейство Nocardiaceae).

4. Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение моно(ди)хлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 - орто-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ 896) - (ррто)пара- моноХБ и 2,4'диХБ. Обнаружены и исследованы другие бактерии-деструкторы бифенила и хлорбифенилов, характеризующиеся разной степенью деструктивной активности по отношению к ди- и три-(орто- и иара)-хлорбифенилам.

5. Показано, что у актинобактерий (роды Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus) ключевые гены начального этапа разложения нафталина и бифенила характеризуются большим полиморфизмом по сравнению с аналогичными функциональными генами протеобактерий рода Pseudomonas.

6. Клонированы и охарактеризованы /cb-гены Arthrobacter globiformis КЗТ1 и ohb-тены Pseudomonas aeruginosa 142, контролирующие реакции раннего дегалогенирования пара- и орто-хлорбензоатов, соответственно. Впервые в геноме бактерий рода Rhodococcus обнаружены гены, кодирующие компоненты 4-хлорбензоат-дегалогеназы. Выявлен значительный (98-99%) уровень сходства исследуемых участков ДНК штамма R. ruber Р25 с гомологичными (fcb) генами бактерий рода Arthrobacter.

7. Впервые при клонировании /сЬ-гснов в клетки P. putida (ПГБК+) сконструирован рекомбинантный путь утилизации пара-хлорбензоата. Получены рекомбинантные штаммы Р. putida K3-6R(pPC3) и K3-6R::7>í5-K2GA[Tcr/cM7,А2,АЗ], способные расти на 4ХБК как единственном источнике углерода и энергии, характеризующиеся суперэкспрессией и высокой стабильностью/ей-генов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи в журналах

1. Егорова Д.О., Плотникова Е.Г. Грамположительные бактерии-деструкторы хлорированных бифенилов, перспективные для использования при биоремедиации загрязненных почв // Биотехнология. - 2009. - №3. - С. 72-79.

2. Шумкова Е.С., Соляникова И.П., Плотникова Е.Г., Головлева Л.А. Разложение шра-толуата бактерией Rhodococcus ruber Р25 // Микробиология. - 2009. - Т. 78. - №3. -С. 427-429.

3. Yastrebova O.V., Plotnikova E.G., Anan'ina L.N., Demakov V.A. Aerobic spore forming bacteria from the region of salt mining // Russian Journal of Ecology. - 2009. - V. 40. - №7. -P. 516-521.

4. Егорова Д.О., Шумкова Е.Г., Плотникова Е.Г. Разложение моно- и полиароматических соединений новым грамположительным бактериальным штаммом // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2009. - Вып. 10(36). - С. 84-89.

5. Ястребова О.В. Ананьина Л.Н., Пастухова Е.С., Плотникова Е.Г. Разнообразие бактерий, выделенных из района солеразработок месторождения калийных солей Верхнекамья II Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2009. - Вып. 10(36). -С. 124-129.

6. Ястребова О.В., Ананьина JI.H., Плотникова Е.Г. Бактерии рода Bacillus, выделенные из почв района солеразработок // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2008. - Вып. 7. - С. 58-62.

7. Шумкова Е.С., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Скрининг и изучение ключевых генов катаболизма бифенила у бактерий // Вестник Пермского университета. Серия биология. - 2008. - Вып. 7. - С. 53-57.

8. Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г., Гавриш Е.Ю., Демаков В. А., Евтушенко Л.И. Salinicola socius gen. nov., sp. nov. - умеренно галофильная бактерия из ассоциации микроорганизмов, утилизирующей нафталин // Микробиология. - 2007. - Т. 76. ■ № 3. -С. 369-376.

9. Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов рода Arthrobacter // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2007. - Вып.5(10). - С. 100-106.

10. Шумкова Е.С., Лобова И.В., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Изучение генов, контролирующих реакцию дегалогенирования, бактерий-деструкторов 4-хлорбензоата // Вестник Пермского Университета. Серия биология. - 2007. - Вып.5(10). - С. 117-122.

11. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Демаков В.А. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья // Экология. - 2006. - № 4. - С. 261-268.

12. Ананьина Л.Н., Алтынцева О.В., Плотникова Е.Г. Изучение сообщества микроорганизмов, выделенного из района солеразработок // Вестник Пермского университета. Серия биология. - 2005. - Вып. 6. - С. 109-114.

13. Рыбкина Д.О., Гусев В.А., Плотникова Е.Г. Почвенные микроорганизмы-деструкторы, разлагающие широкий спектр соединений техногенного происхождения // Вестник Пермского университета. Серия биология. - 2005. - Вып. 6. - С. 115-122.

14. Гавриш Е.Ю, Краузова В.И., Потехина Н.В., Карасев С.Г., Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Коростелева Л.А., Евтушенко Л.И. Три новых вида бревибактерий -Brevibacterium antiquum sp. nov., Brevibacterium aurantiacum sp. nov. и Brevibacterium permense sp. nov. // Микробиология. - 2004. - В. 73. - №2. - С. 218-225.

15. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г., Дорофеева Л.В., Мироненко Ю.Л., Демаков В.А. Новый аэробный грамположительньш микроорганизм с уникальными свойствами деструкции орто- и лдра-хлорированных бифенилов II Микробиология. - 2003. - Вып. 72. - №6. - С. 759-765.

16. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. Деструкция хлорбензоатов почвенными бактериями // Объединенный научный журнал . - 2003. - №1. - С. 73-82.

17. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Кошелева И.А., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Гавриш Е.Ю., Демаков В.А., Воронин A.M. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок // Микробиология. - 2001. - № 1. - С. 61-69.

18. Tsoi T.V., Plotoikova E.G., Cole J.R., Guerin W.F., Bagdasarian M., Tiedje J.M. Cloning, expression and nucleotide sequence of the Pseudomonas aeruginosa strain 142 ohb genes for oxygenolytic orifto-dehalogenation of halobenzoates // Appl. Environ. Microbiol. -1999. - V.65. - №5. - P. 2151-2162.

19. Tsoi T.V., Plotoikova E.G., Cole J.R., Stoddard J., Tiedje J.M. Engineering coupled reductive ortho- + hydrolytic pera-dechlorination gene system for degradation of ortho-, and

para-substituted and PCBs // In: "Center for Microbial Ecology. Research findings. Fall 1996". Michigan State University, East Lansing, USA. - 1996. - P. 174-177.

20. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Cole J.R., Bagdasarian M., Tiedje J.M. Cloning and expression genes responsible for oxynolytic orrfto-dehalogenation of halobenzoates // In: "Center for Microbial Ecology, Reserch findings. An NSF Science and Technology Center, Michigan State University". East Lansing, USA. - 1993. - P. 263-270.

21. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Bezborodnikov S.G., Zaitsev G.M., Kosheleva I.A., Boronin A.M., Cole J.R., Tiedje J.M. Arthrobacter globiformis KZT-1 fcb genes specifying hydrolytic para-dehalogenation of 4-chlorobenzoate // /n:"Center for Microbial Ecology. Research findings. Fall 1992". Michigan State University, East Lansing, USA. - 1992. - P. 111-113.

22. Zaitsev M.G., Tsoi T.V., Grishenkov V.G., Plotnikova E.G., Boronin A.M. Genetic control of degradation of chlorinated benzoic acids in Arthrobacter globiformis, Corynebacterium sepedonicum and Ps. cepacia strains // FEMS Microbiol. Lett. - 1991. - V. 81. -P. 171-176.

23. Tsoi T.V., Zaitsev G.M., Plotnikova E.G., Kosheleva I.A., Boronin A.M. Cloning and expression of the Arthrobacter globiformis KZT-1 fcb gene encoding dehalogenase (4-chlorobenzoate-hydroxylase) in E.coli // FEMS Microbiol. Lett. - 1991. - V. 81. - P.165-170.

24. Плотникова Е.Г., Цой T.B., Грищенков В.Г., Зайцев Г.М., Нагаева М.В., Воронин A.M. Клонирование генов дегалогеназы штамма Arthrobacter globiformis KZT-1 и конструирование гибридного пути разложения 4-хлорбензойной кислоты в клетках Pseudomonas putida // Генетика. - 1991. - Т. 27. - С. 589-597.

Обзор

25. Solyanikova I.P., Travkin V.M., Plotnikova E.G., Rybkina D.O., Golovleva L.A. Variability of Enzyme System of Nocardioform Bacteria as a Basis of their Metabolic Activity // Journal of Environmental Science and Health, Part B. - 2008. - V.43. - № 3. - P. 241-252.

Патенты

26. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Демаков В.А. Штамм бактерий Rhodococcus ruber - деструктор полихлорированных бифенилов // Патент РФ №2262531. Опубликован 20.10.2005 г. Бюл. №29.

27. Назаров А.В., Плотникова Е.Г., Ананьина JI.H., Демаков В.А. Средство для очистки загрязненных почв от нефти и полициклических ароматических углеводородов в условиях повышенной минерализации среды// Патент РФ №238816. Опубликован 10.05.2010 г.

Учебное пособие

28. Плотникова Е.Г. Методы ДНК-типирования микроорганизмов // В кн. Молекулярная генетика. Под ред. Боронниковой С.В. Перм. ун-т, Пермь. - 2007. -С. 92-101.

Статьи в научных сборниках

29. Плотникова Е.Г, Алтынцева О.В., Егорова Д.О., Демаков В.А. Деструкция полиароматических углеводородов и хлорированных бифенилов почвенными микроорганизмами // В кн.-. МНТЦ. Доклады международного семинара: Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса. -Пермь.-2001.-С. 325-329.

30. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Рыбкина Д.О. Поиск и характеристика активных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Сборник аннотационных отчетов. - Пермь. - 2003. - С. 219-223.

31. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Демаков В.А. Изучение аэробных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // Материалы международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». -Минск. - 2004. - С. 237-238.

32. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г. Восстановление техногенных территорий, загрязненных полихлорированными бифенилами, с использованием микроорганизмов-деструкторов // Материалы международной научно-практической конференция «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем». - Астрахань. - 2004. -С. 64-68.

33. Плотникова Е.Г., Ананьина JI.H., Алтынцева О.В. Природные микробные ассоциации - как основа для биоремедиации загрязненных почв // Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем». - Астрахань. - 2004. - С. 43-46.

34. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О. Разложение полихлорированных бифенилов микроорганизмами // Материалы всероссийской конференции «Экологические проблемы промышленных регионов». - Екатеринбург. - 2004. - С. 354-356.

35. Рыбкина Д.О., Плотникова Е.Г. Исследование способности штаммов-деструкторов бифенила к разложению хлорароматических ксенобиотиков // Материалы международной конференции «Татищевские чтения: Актуальные проблемы науки и практики-2004». -Тальятти. - 2004. - С. 226-230.

36. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Рыбкина Д.О. Поиск и характеристика активных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Сборник аннотационных отчетов. - Пермь. - 2004. - С. 200-203.

37. Алтынцева О.В., Рыбкина Д.О., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г. Грамположительные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв с высокой техногенной нагрузкой. В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: Научно-практические итоги региональных конкурсов РФФИ-Урал в Пермском крае 2004-2006 годов. Пермь, Екатеринбург. - 2007. - С. 179-181.

38. Плотникова Е.Г., Ястребова О.В., Егорова Д.О., Ананьина Л.Н., Шумкова Е.С. Структура и функционирование микробных сообществ района солеразработок (Пермский край). В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: "Результаты научных исследований, полученные за 2007 год». Сборник статей. - Пермь, Екатеринбург. - 2008. - С. 124-127.

39. Плотникова Е.Г., Ананьина Л.Н., Егорова Д.О., Шумкова Е.С., Ястребова О.В. Аэробные бактерии-деструкторы полиароматических соединений, выделенные из техногеннозагрязненных почв // Материалы международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск. - 2008. -С. 17-19.

40. Плотникова Е.Г., Ястребова О.В., Егорова Д.О., Ананьина Л.Н., Шумкова Е.С., Головлева Л.А., Соляникова И.П., Бабошин М.А. Новые биотехнологии реабилитации техногенных территорий Пермского края. В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал: "Результаты научных исследований, полученные за 2007 год». Сборник статей. - Пермь, Екатеринбург. - 2008. - С. 128-131.

Избранные тезисы докладов и стендовых сообщений

41. Tsoi T.V., Plotnikova E.G., Zaitsev G.M., Kosheleva I.A., Grishenkov V.G., Boronin A.M. Construction of the recombinant Pseudomonas putida strains capable of effective degradation of 4-chlorobenzoate and dechlorination of 4-chlorophenol, 4-chloroanilin and their constituent alkylated derivatives // Third international symposium on Pseudomanas. Biology and biotechnology. - Miramare Grignano, Trieste, Italy. -1991. - P. 171.

42. Tsoi Т.У., Plotnikova E.G., Bezborodnikov S.G., Zaitsev G.M., Boronin A.M., Cole J.R., Tiedje J.M. Arthrobacter globiformis strain KZT-1 genes responsible for hydrolytic dehalogenation of 4-chlorobenzoate // ASM conference: "Anaerobic dehalogenation and its environmental implications". - Athens, USA. - 1992. - P. 10.

43. Tsoi T.V., Bezborodnikov S.G., Plotnikova E.G., Cole J.R. The halobenzoate dehalogenation fcb operon of Arthrobacter globiformis strain KZT-1: Organization, expression, regulation and evolution. // 93th general meeting of the ASM. - Atlanta, USA. - 1993. - P. 394.

44. Tsoi Т.V., Plotnikova E.G., Cole J.R., Bagdasarian M., Tiedje J.M. Cloning of Pseudomonas aeruginosa 142 tcb genes responsible for or/Ao-dehalogenation of halobenzoates // 94th ASM general meeting. - Las Vegas, USA. - 1994. - P. 459.

45. Tsoi T.V., Cole J.R., Plotnikova E.G., Hrywna Y., Tiedje J.M. Cloning of Corynebacterium sepedonicum KZ4 rod gene responsible for reductive ortho-degalogenation of halobenzoates and construction of coupled reductive ortho- and hydrolytic para-dechlorination system for degradation of PCBs // 96th ASM general meeting. - New Orleans, USA. - 1996. -P. 419.

46. Plotnikova E.G., Maltseva O.V., Tsoi T.V., Demakov V.A., Tiedje J.M. Isolation and characterization of new PCB-degrading bacteria // International conference on environmental pollution. - Moscow, Russia. - 1998. - P. 351.

47. Алтынцева O.B., Плотникова Е.Г., Демаков B.A. Микробная деструкция полиароматических углеводородов в условиях повышенного засоления среды И 4-й Международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов "Биотехнологии-2000". - Пущино. - 2000. - С. 73.

48. Плотникова Е.Г., Алтынцева О.В., Измалкова Т.Ю., Кошелева И.А., Филонов А.Е. Деструкция полициклических ароматических углеводородов галотолерантными бактериями рода Arthrobacter // V Международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2001». - Пущино. - 2001. -С. 138.

49. Kosheleva I.A., Plotnikova E.G., Altyntseva O.V., Puntus I.F., Filonov A.E., Boronin A.M. Halotolerant microorganisms, degrading polycyclic aromatic hydrocarbons II Organic soil contaminants 2001: SETAC, Europe conference. - Copenhagen, Denmark. - 2001. - P. 122.

50. Алтынцева O.B., Плотникова Е.Г., Кошелева И.А., Евтушенко Л.И., Демаков В.А. Сообщества микроорганизмов и индивидуальные штаммы бактерий, деградирующие полициклические ароматические углеводороды в условиях повышенного содержания хлорида натрия И V Международная конференция "Проблемы загрязнения окружающей среды". - Волгоград-Пермь. - 2001. - С. 53.

51. Gavrish Е., Krausova V., Plotnikova Е., Potekhina N., Evtushenko L. Three new species among Brevibacterium linens-like strains II Xth international congress of bacteriology and applied microbiology. - France, Paris. - 2002. - C. 297.

52. Kosheleva I.A., Akatova E.V., Altyntseva O.V., Plotnikova E.G., Filonov A.E. and Boronin A.M. Microbial community capable of degrading naphthalene under high salt concentration // iat FEMS congress of European microbiologists. - Ljubljana, Slovenia. - 2003. -P. 396.

53. Плотникова Е.Г., Алтынцева O.B., Рыбкина Д.О. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов и хлорированных бифенилов, выделенные из донных отложений, загрязненных отходами химических производств // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ: Матер. Междунар. Байкальского микробиологического симпозиума. - Иркутск. - 2003. - С. 125-126.

54. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О. Бактерии-деструкторы полихлорированных бифенилов, перспективные для биоремедиации загрязненных почв II Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. - 2005. - С. 37-38.

55. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О. Изучение грамположительных бактерий-деструкторов полихлорированных бифенилов // II Международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал». - Пермь-Казань. - 2005. - С. 80.

56. Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Галофильные бактерии сем. Halomononaceae - продуценты внеклеточных гидролитических ферментов // Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -Москва. -2007. - Ч. 2. - С. 39.

57. Плотникова Е.Г., Ананьина Л.Н., Ястребова О.В., Рыбкина Д.О. Разнообразие и функционирование микроорганизмов из техногенных почв солеразработок Верхнекамья //

Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». -Москва. - 2007. - Ч. 2. - С. 135.

58. Шумкова Е.С., Плотникова Е. Г., Соляникова И. П., Егорова Д. О., Головлева Л. А. Разложение пара-замещенных ароматических соединений штаммом Rhodococcus ruber Р25 // Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск. - 2008. - С. 10-11.

59. Назаров A.B., Ананьина JI.H., Ястребова О.В., Плотникова Е.Г. Оценка влияния бактериального консорциума, окисляющего нафталин, на деструкцию углеводородов в нефтезагрязненной дерново-подзолистой почве в условиях засоления // Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск. - 2008. - С. 200-201.

60. Шумкова Е.С., Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. Полиморфизм генов, кодирующих а-субъединицу бифенил 2,3-диоксигеназы, бактерий-деструкторов бифенила и полихлорированных бифенилов // III международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». - Пермь. - 2008. - С. 110-111.

61. Плотникова Е.Г., Ястребова О.В., Ананьина Л.Н. Изучение генов, кодирующих большую субъединицу нафталин 1,2-диоксигеназы, бактерий-деструкторов нафталина // Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва. - 2009. - С. 40.

62. Егорова Д.О., Плотникова Е.Г., Демаков В.А. Биоремедиация почв, загрязненных полихлорированными бифенилами, грамположительными бактериями // Актуальные проблемы микробиологии и биотехнологии: Материалы Международной научной конференции. - Кишинев. - 2009. - С. 24-25.

Список принятых сокращений: ПАУ - полициклические ароматические углеводороды; ПХБ - полихлорированные бифенилы; моноХБ - монохлорбифенил; диХБ -дихлорбифенил; триХБ - трихлорбифенил; ХБК - хлорбензойная кислота; 2,4-Д -2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; ГОФДК - 2-гидрокси-6-оксо-6-фенилгекса-2,4-диеновая кислота; ПГБК - иора-гидроксибензойная кислота; ПКК - протокатеховая кислота; ТСХ - тонкослойная хроматография; ВЭЖХ-высокоэффективная жидкостная хроматография; ГЖХ - газожидкостная хроматография; ОП - оптическая плотность; o.e. -оптические единицы; КОЕ - колониеобразующие единицы; ДГГЭ - денатурирующий градиентный гель электрофорез; НДО - нафталин диоксигеназа; ОГБД - ор/яо-галобензоат 1,2-диоксигеназа; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ARDRA (amplified 16S rDNA restriction analysis) - рестрикционный анализ амплифицированных рибосомальных ДНК.

Подписано в печать 19.05.2010. Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 2. Формат 60x90/16. Набор компьютерный. Заказ № 767/2010.

Отпечатано в типографии ИД "Пресстайм" Адрес: 614025, г. Пермь, ул. Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Плотникова, Елена Генриховна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Бактериальная деструкция полициклических ароматических углеводородов (ПАУ).

1.1. Бактерии-деструкторы ПАУ.

1.2. Метаболические пути деструкции нафталина и фенантрена у бактерий.

1.3. Генетические системы биодеградации ПАУ.

1.4. Микробная деструкция ПАУ в условиях повышенной солености среды.

1.4.1. Галотолерантные/галофильные бактерии-деструкторы ПАУ.

1.4.2. Механизмы галоадаптации у бактерий.

1.4.3. Ассоциации бактерий, осуществляющие разложение ПАУ в условиях повышенной солености среды.

ГЛАВА 2. Бактериальная деструкция бифенила и полихлорированных бифенилов (ПХБ).

2.1. Бактерии-деструкторы бифенила/ПХБ.

2.2. Метаболические пути деструкции бифенила/ПХБ у бактерий.

2.3. Бифенил 2,3-диоксигеназа - ключевой фермент разложения бифенила и хлорированных бифенилов.

2.4. Генетические системы биодеградации бифенила/ПХБ.

ГЛАВА 3. Разложение замещенных бензойных кислот бактериями.

3.1. Бактерии-деструкторы хлорбензойных кислот (ХБК).

3.2. Метаболические пути и генетические системы деструкции ХБК у бактерий.

3.3. Пути метаболизма пирокатехина и (метил)замещенных пирокатехина.

3.4. Генетическое конструирование штаммов-деструкторов ХБК и ПХБ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования.

4.1. Объекты исследования.

4.2. Среды и условия культивирования.

4.3. Накопительные культуры.

4.4. Ростовые характеристики и определение субстратной специфичности бактерий.

4.5. Эксперименты по моделированию смешанных культур.

4.6. Определение таксономического положения бактерий.

4.6.1. Морфологические и физиолого-биохимические признаки.

4.6.2. Методы анализа хемотаксономических признаков.

4.6.3. Молекулярно-генетические методы.

4.7. Денатурирующий градиентный гель электрофорез.

4.8. Плазмиды и определение стабильности признаков биодеградации.

4.9. Определение активностей ферментов биодеградации ПАУ.

4.10. Очистка и характеристика ферментов штамма R. ruber Р25.

4.11. Изучение генов деструкции нафталина, бифенила, ХБК.

4.11.1. Изучение функциональных генов методом ПЦР.

4.11.2. Клонирование и изучение генов деструкции 2ХБК и 4ХБК.

4.12. Аналитические методы.

4.12.1. Изучение бактериальной деструкции ПАУ, ПХБ и ХБК.

4.12.2. Выделение и анализ осмопротекторных соединений.

4.13. Модельные почвенные системы.

4.14. Статистическая обработка.

ГЛАВА 5. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов.

5.1. Бактерии рода Arthrobacter.

5.2. Бактерии родаRhodococcus.

5.3. Спорообразующие бактерии родов Bacillus и Paenibacillus.

5.4. Бактерии рода Pseudomonas.

5.5. Бактерии порядка Actinomycetales, выделенные из почв/грунтов района солеразработок.

5.6. Галотолерантные свойства бактерий-деструкторов ПАУ.

5.7. Бактериальные гены, контролирующие начальные этапы деструкции нафталина.

ГЛАВА 6. Бактерии-деструкторы бифенила и полихлорбифенилов.

6.1. Характеристика бактерий-деструкторов.

6.2. Особенности разложения ароматических соединений штаммами Rhodococcus ruber Р25 и Microbacterium sp. В51.

6.2.1. R. ruber P25 - деструктор opmo-, иора-хлорированных бифенилов.

6.2.2. Деструкция 4-метилбензойной кислоты (МБК) R. ruber Р25, ключевые ферменты катаболизма МБК.

6.2.3. Экстрахромосомальные ДНК штамма R. ruber Р25.

6.2.4. Деструкция ПХБ штаммом Microbacterium sp. В51.

6.3. Разнообразие генов, кодирующих а-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, исследуемых бактерий.

ГЛАВА 7. Природные и генетически-модифицированные бактерии-деструкторы хлорированных бензойных кислот.

7.1. Характеристика бактерий-деструкторов ХБК, изолированных из техногенных почв.

7.2. Генетические системы деградации хлорбензойных кислот.

7.2.1. Гены раннего дегалогенирования 4ХБК бактерий рода Arthrobacter.

7.2.2. /сб-Гены бактерий-деструкторов из техногеннозагрязненных почв.

7.3. ohb-TQны, контролирующие окислительное дегалогенирование орто-замещенных хлорбензоатов, штамма Pseudomonas aeruginosa 142.

7.4. Конструирование метаболических путей деструкции хлорароматических соединений с использованием fcb- и ohb-генов.

7.4.1. Клонирование и экспрессия усб-генов в составе рекомбинантной плазмиды в клетках P. putida, конструирование гибридного пути деградации 4-хлорбензоата.

7.4.2. Конструирование рекомбинантного штамма, содержащего fcb-гены в хромосоме P. putida.

7.4.3. Штаммы-деструкторы ПХБ, сконструированные при использовании fcb- и Ohb-YQUOB.

ГЛАВА 8. Природные и модельные ассоциации бактерий, перспективные для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды.

8.1. Нафталинметаболизирующие ассоциации бактерий, выделенные из техногеннозасоленной почвы.

8.1.1. Характеристика нафталинметаболизирующих ассоциаций.

8.1.2. Изучение взаимовыгодных отношений между бактериями в нафталинметаболизирующих ассоциациях.

8.1.3. Использование бактериального консорциума SMB3 для очистки загрязненных почв.

8.2. Двухкомпонентная бактериальная ассоциация, утилизирующая

2,4'-дихлорбифенил.

ГЛАВА 9. Описание новых таксонов бактерий, изолированных из нафталинметаболизирующих ассоциаций SMB1 и SMB3.

9.1. Новый род и вид Salinicola socius sp. nov., gen. nov.

9.2. Новый вид — «Thalassospirapermensis» sp. nov.

9.3. Новый вид - «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov.

9.4. Новые виды рода Brevibacterium (В. permense sp. nov., B. antiquum sp. nov. и В. aurantiacum sp. nov.), характеризующиеся оранжевой окраской колоний.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика"

Актуальность проблемы. Проблема очистки наземных и водных экосистем, загрязненных токсичными, устойчивыми к разложению и представляющими опасность для здоровья человека химическими соединениями, занимает центральное место в ряду актуальных задач современной экологии. Среди поллютантов, обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, а также тенденцией к биоаккумуляции, наиболее распространенными являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), бифенил и его хлорированные производные (Hall, Grover, 1990; ATSDR, 2000, http://www.atsdr.cdc.gov). ПАУ поступают в окружающую среду с разливами нефти, отходами коксохимических, газоперерабатывающих производств и химических предприятий, образуются при неполном сгорании топлива и бытовых отходов (Seo et al., 2009). Полихлорированные бифенилы (ПХБ) широко применялись в течение нескольких десятилетий при производстве лакокрасочных материалов, пластификаторов, пестицидов, в электротехнической промышленности. В настоящее время производство и использование ПХБ, как особо стойких органических загрязнителей, запрещено Стокгольмской Конвенцией (http://www.unep.org). Наряду с задачами по восстановлению экосистем, загрязненных этой группой токсикантов, остро стоит проблема детоксикации больших объемов невостребованных коммерческих смесей, созданных на основе хлорбифенилов (Васильева, Стрижакова, 2007; Pieper, Seeger, 2008). Биоремедиация почв и других объектов окружающей среды с использованием микроорганизмов-деструкторов (хлор)ароматических соединений имеет ряд известных преимуществ по сравнению с другими методами экобиотехнологии (Sutherland et al., 1995; Pieper, 2005; Cao et al, 2009).

Kanaly, Harayama, 2000; Jones et al., 2003; Reng et al., 2008). Способность к трансформации ПХБ описана для широкого круга бактерий — протеобактерий (Acinetobacter, Alcaligenes, Ciipriavidus, Pseudomonas, Sphingomonas), актинобактерий {Rhodococcus, Arthrobacter), споровых (Bacillaceae■) (Bedard, Haberl, 1990; Furukawa, Fujihara, 2008; Pieper, Senger, 2008). Однако известны лишь единичные штаммы, исключительно представители протеобактерий (Burkholderia, Enterobacter, Pseudomonas и Ralstonia), которые могут полностью разлагать моно- и дихлорбифенилы (Kim, Picardal, 2001; Adebusoye et al., 2008).

Большинство известных штаммов-деструкторов трансформируют ПХБ до соответствующих хлорбензойных кислот (ХБК). Последующие этапы деградации хлорбензоатов в ПХБ-деградирующих микробных системах осуществляют обычно другие группы организмов (Unterman, 1996). Среди них значительная роль принадлежит бактериям, осуществляющим отщепление галогена на первых этапах разложения хлорбензоатов, в результате чего образуются менее токсичные соединения, доступные для использования в качестве субстрата для многих почвенных микроорганизмов (Карасевич, 1982; Schölten et al., 1991; Fetzner, 1998; Field, Sierra-Alvarez, 2008).

Развитие молекулярно-генетических методов и исследования в области структурной и функциональной геномики бактерий-деструкторов способствовало пониманию молекулярных механизмов биодеградации вышеназванных соединений. Показано, что генетические детерминанты (гены/опероны) бактериальной деструкции ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК локализованы в хромосоме и высокомолекулярных плазмидах, и могут присутствовать в клетке в нескольких копиях (Boronin, 1992; Sanseverino et al., 1993; Reineke, 1998; Shimizu et al, 2001; Dennis, Zylstra, 2004; Basta et al., 2005; Chain et al., 2006; Iwasaki et al., 2006). Имеются сведения о горизонтальном переносе генов биодеградации в составе мобильных генетических элементов (плазмид, транспозонов, интегронов), в том числе между бактериями различных филогенетических групп (Fulthorpe, Campbell, 1992; Herrick et al., 1997; Nishi et al., 2000; Gartemann, Eichenlaub, 2001; Habe, Omori, 2003; Reng et al., 2008). Установлена важная роль диоксигеназ на начальных этапах аэробной деструкции ПАУ и бифенила/ПХБ (McKay et al., 1997; Gibson, Parales, 2000; Seeger et al., 2001; Jakoncic et al., 2007; Schuler et al., 2009). Ферменты этой группы способны осуществлять трансформацию многих полиароматических соединений, что определяет их важную роль в развитии различных биотехнологий (Harayama, 1997; Bamforth, Singleton, 2005; Shindo étal., 2007; Cao étal., 2009).

Имеющиеся сведения о микроорганизмах, способных к деструкции полиароматических углеводородов в условиях высокой солености, немногочисленны и касаются, в основном, грамотрицательных или «морских» бактерий родов Pseudomonas, Cycloclasticus, Vibrio, Lutibacterium, Neptunomonas (Dyksterhouse et al., 1995; Geiselbrecht et al., 1998; Hedlund et al, 1999, 2001; Chung, King, 2001; Kasai et al, 2002; Garcya et al2004, 2005; Abed et al., 2006), а также спорообразующих бактерий (Paenibacillus) (Daane et al., 2002). Крайне слабо изучены механизмы адаптации бактерий к таким условиям существования (Roberts, 2005; Oren, 2008), а также взаимодействия внутри микробных сообществ: регуляция их состава, метаболической активности и устойчивости к высокому содержанию солей. До начала наших работ практически отсутствовали сведения о разнообразии и функциональных особенностях грамположительных бактерий - резидентов наземных экосистем, в которых ведущими факторами формирования микробиоценозов являются соленость среды и токсичный поллютант. Все вышесказанное определяет актуальность и перспективность фундаментальных и прикладных исследований в этом направлении.

Основные задачи исследования:

3. Характеристика экологических особенностей и биодеградативного потенциала выделенных бактерий.

4. Изучение разнообразия ключевых генов деструкции нафталина, бифенила/ПХБ и ХБК у бактерий.

6. Выделение и изучение галотолерантных нафталинметаболизирующих консорциумов бактерий.

Научная новизна. Получены новые сведения о разнообразии микробных сообществ, обитающих в условиях повышенной солености, высокого уровня загрязнения среды токсичными поллютантами. Выделено и изучено более 500 штаммов-деструкторов ПАУ, бифенила/ПХБ и ХБК -представителей классов Proteobacteria (роды Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), Actinobacteria {Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces) и семейства Bacillaceae {Bacillus, Paenibacillus). Выявлены бактерии, разлагающие токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40°С), pH среды (от 5 до 9) и при повышенной солености среды (до 90 г/л NaCl). Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 -оршо-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) - (opmó)napa-моноХБ и 2,4'диХБ. Впервые выделены в культуру и охарактеризованы галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ (нафталина и фенантрена), относящиеся к родам Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus, Paenibacillus и Pseudomonas. На основании филогенетической обособленности и фенотипических отличий от ближайших таксонов валидно описаны новый род Salinicola, включающий вид S. socius, а также новые виды рода Brevibacterium — В. permense, В. antiquum и В. aurantiacum', выявлены новые виды «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov., «Thalassospira permensis» sp. nov. и ряд других видов.

Обнаружены и изучены ключевые гены начального этапа разложения бифенила/ПХБ у бактерий-деструкторов родов Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus. Впервые клонированы и изучены fcb-теяы A. globiformis КЗТ1, контролирующие гидролитическое дегалогенирование 4ХБК. Путем клонирования fcb-тенов в клетки P. putida впервые сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК, более эффективный в отношении утилизации субстрата в сравнении с природными штаммами. В результате селекции на высоких концентрациях 4ХБК рекомбинантного штамма P. putida K3-6R (рРСЗ) получены супердеструкторы 4ХБК. Впервые у бактерий рода Rhodococcus обнаружены и охарактеризованы fcb-гены, кодирующие компоненты 4ХБК-дегалогеназы. Клонированы и изучены новые о/¿¿-гены P. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов. o/zö-Гены фланкированы ISJ396-подобными последовательностями, содержащими предполагаемые гены транспозазы А (tnpA) и ДНК топоизомеразы МП {top).

Впервые выделены и исследованы ассоциации бактерий, способные к росту и утилизации нафталина в условиях высокой солености среды (до 8 -9 % NaCl). Показано, что в состав ассоциаций входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные бактерии, не способные к разложению нафталина. Экспериментально подтверждено присутствие протокооперативных взаимоотношений в консорциуме SMB3 между деструкторами нафталина и бактериями-спутниками. Впервые получены данные о положительном влиянии экзогенных осмопротекторных соединений, продуцируемых галофильными/галотолерантными бактериями исследуемых микробных ассоциаций, на разложение ПАУ штаммами-деструкторами в условиях повышенной солености среды. Для представителей рода Rhodococcus (деструкторов нафталина из консорциума SMB3) впервые описана комбинация осмопротекторов: глутамат, эктоин и гидроксиэктоин.

Конструирование рекомбинантного пути полной деградации 4ХБК в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. Полученные рекомбинантные штаммы и плазмиды, содержащие fcb- и о/гб-гены, были использованы в совместных исследованиях в Центре микробной экологии Мичиганского университета (г. Лансинг, США). На основе fcb- и 0/26-генов был создан ряд генноинженерных штаммов, осуществляющих полную утилизацию орто- и иора-хлорбифенилов. Полученные рекомбинантные штаммы-деструкторы хлорированных бензойных кислот и бифенилов могут быть использованы при создании инновационных технологий защиты окружающей среды от токсичных галогенароматических соединений.

Создана обширная рабочая коллекция бактерий-деструкторов (галоген)арома-тических соединений и галотолерантных/галофильных бактерий, доступных для фундаментальных и научно-прикладных исследований специалистами разного профиля. Большинство штаммов включены в фонд Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, ИБФМ, г. Пущино) и Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (ИЭГМ УрО РАН, г. Пермь). Дубликаты типовых штаммов описанных новых видов депонированы в ВКМ и Биологических ресурсных центрах мира (в Германии, Бельгии, Франции, Японии), а также включены в международную поисковую систему 81гатт:Го (http://www.straininfo.net). Сведения о последовательностях генов 16Э рРНК и функциональных генов (/сЬ, окЪ, паг, ЪрК) штаммов-деструкторов включены в вепВапк (Национальный центр биологической информации, США; ncbi.nlm.nih.gov) и сопряженные базы данных (ЕМВЬ, БОВ.!, ЕгТахоп) других стран.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бактерии родов Arthrobacter, Rhodococcus, Bacillus, Paenibacilliis и Pseudomonas преобладают среди культивируемых аэробных галотолерантных бактерий-деструкторов ПАУ из микробиоценозов района разработок Верхнекамского месторождения солей (г. Березники, Пермский край). Бактерии содержат разнообразные генетические детерминанты (D-плазмиды, гены/опероны), контролирующие ключевые этапы разложения нафталина и фенантрена.

2. Полное разложение ряда моно- и дихлорбифенилов (феномен ранее не известный для грамположительных бактерий) осуществляют штаммы Microbacterium sp. В51 [(орто-моно(ди)ХБ] и Rhodococcus ruber Р25 [(орто)пара-моноХБ и 2,4'диХБ]. Другие активные штаммы бактерий характеризуются разной окислительной способностью по отношению к орто-и ияра-хлорированным бифенилам. Бактерии-деструкторы моно(ди)хлорбифенилов, относящиеся к родам Arthrobacter, Rhodococcus, Janibacter и Pseudomonas, содержат структурно различающиеся гены, контролирующие начальный этап разложения бифенила/ПХБ.

3. Впервые клонированы и изучены ^сб-гены A. globiformis КЗТ1, контролирующие реакцию гидролитического дегалогенирования 4ХБК. В клетках P. putida с использованием fcb-генов сконструирован рекомбинантный путь полной деградации 4ХБК и получены супердеструкторы, характеризующиеся высокой стабильностью признака утилизации этого соединения. Клонированы и охарактеризованы новые ohb-гены Р. aeruginosa 142, контролирующие окислительное орто-дегалогенирование 2-/2,4-хлорбензоатов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 307 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц и 60 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, отражающих результаты исследований, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 588 литературных источников, из них 48 на русском и 540 на английском языках. В Приложении приведены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и функциональных генов {fcb, ohb, nar, bph) исследуемых штаммов, депонированных в международной базе данных GenBank.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Плотникова, Елена Генриховна

ВЫВОДЫ

2. Впервые изучены консорциумы бактерий, выделенные из почв/грунтов района солеразработок, способные к росту на нафталине в аэробных условиях при повышенной солености среды (до 8 - 9% NaCl). В состав консорциумов входят галотолерантные бактерии-деструкторы ПАУ порядка Actinomycetales, а также галотолерантные и умеренно галофильные актинобактерии и протеобактерии, не способные к росту на нафталине в чистой культуре, но синтезирующие осмопротекторные соединения. Полученные данные свидетельствуют о протокооперативных взаимоотношениях членов нафталинметаболизирующих консорциумов.

3. На основании филогенетической обособленности (16S рРНК ген) и фенотипических отличий бактерий, входящих в нафталинметаболизирующие консорциумы, описаны новый род Salinicola и вид Salinicola socius (семейство Halomonadaceae), а также виды «Thalassospira permensis» sp. nov. (семейство Rhodospirillaceaé), Brevibacterium permense (семейство Brevibacteriaceae) «Rhodococcus naphthalenivorans» sp. nov. (семейство Nocardiaceae).

4. Впервые описаны грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение моно(ди)хлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 - оргао-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25(=ИЭГМ 896) - (орто)пара-мопоХБ и 2,4'диХБ. Обнаружены и исследованы другие бактерии-деструкторы бифенила и хлорбифенилов, характеризующиеся разной степенью деструктивной активности по отношению к ди- и три-(орто- и яа/?а)-хлорбифенилам.

6. Клонированы и охарактеризованы fcb-геиы A. globiformis КЗТ1 и o/zb-гены Р. aeruginosa 142, контролирующие реакции раннего дегалогенирования пара- и ojcwo-хлорбензоатов, соответственно. Впервые в геноме бактерий рода Rhodococcus обнаружены гены, кодирующие компоненты 4-хлорбензоат-дегалогеназы. Выявлен значительный (98-99%) уровень сходства исследуемых участков ДНК штамма R. ruber Р25 с гомологичными (fcb) генами бактерий рода Arthrobacter.

7. Впервые при клонировании fcb-генов в клетки P. putida (ПГБК+) сконструирован рекомбинантный путь утилизации пара-хлорбензоата. Получены рекомбинантные штаммы Р. putida K3-6R(pPC3) и K3-6R::Tn5-K2GA\TcrfcbAl,A2,A3], способные расти на 4ХБК как единственном источнике углерода и энергии, характеризующиеся суперэкспрессией и высокой стабильностьюусб-генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение микроорганизмов для очистки окружающей среды от токсичных, устойчивых к разложению поллютантов в настоящее время приобретает все большие масштабы. Бактерии рассматриваются как перспективные объекты для создания новых экотехнологий и являются предметом всесторонних исследований. Эффективность методов биоремедиации определяется как способностью используемых организмов к полной деградации целевых токсикантов или их разложения до менее токсичных интермедиатов (утилизируемых основной массой участников микробиоценозов), так и активностью создаваемых биопрепаратов (технологий) в широком диапазоне физико-химических условий. В результате скрининга более 500 штаммов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов и полихлорированных бифенилов были выявлены и детально охарактеризованы бактерии различных эволюционных групп, способные разлагать токсиканты в широком диапазоне температур (от +4 до 40°С), солености (до 80-90 г/л NaCl) и рН среды (от 5 до 9). В их числе протеобактерии (Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium), актинобактерии (Arthrobacter, Brevibacterium, Cellulomonas, Microbacterium, Rhodococcus, Dietzia, Janibacter, Kocuria, Streptomyces), спорообразующие бактерии семейства Bacillaceae (Bacillus, Paenibacillus).

В результате изучения бактерий-деструкторов бифенила/ПХБ были впервые обнаружены грамположительные бактерии, осуществляющие полное разложение моно(ди)хлорбифенилов: Microbacterium sp. В51 - орто-моно(ди)ХБ; Rhodococcus ruber Р25 (=ИЭГМ 896) — (орто)пара-моиоХБ и 2,4'диХБ, характеризующиеся уникальными особенностями утилизации индивидуальных хлорбифенилов и их смесей - как в минеральных средах, так и в модельных почвенных системах. Штаммы могут применяться для восстановления почв, водоемов и деструкции промышленных смесей, содержащих хлорбифенилы (Патент РФ №2262531). Было также показано, что полное разложение 2,4'-дихлорбифенила эффективно осуществляется двухкомпонентным модельным консорциумом, включающим Microbacterium sp. В51 (осуществляет деструкцию 2,4'-дихлорбифенила до 4-хлорбензойной кислоты) и Arthrobacter sp. Н5 (деструктор 4-хлорбензоата). Использование ассоциаций микроорганизмов, содержащих дополняющие друг друга метаболические пути разложения какого-либо субстрата, является одной из стратегий детоксикации сложных органических поллютантов и лежит в основе создания современных биопрепаратов.

Клонирование fcb- и ohb-тенов, контролирующих пара-дегалогенирование 4ХБК и оргао-дегалогенирование 2-/2,4ХБК, соответственно, и конструирование рекомбинантных путей полной деградации хлорбензоатов в клетках P. putida определило новые подходы к созданию штаммов микроорганизмов, способных к эффективной деструкции и/или детоксикации различных ксенобиотиков-поллютантов. На основе этих генов был создан ряд генетически модифицированных штаммов, осуществляющих эффективную утилизацию орото-/«ара-хлорбифенилов и коммерческих смесей ПХБ.

У активных бактерий-деструкторов ПАУ и бифенила/ПХБ родов Arthrobacter, Janibacter, Rhodococcus и Pseudomonas были изучены ключевые гены начального этапа разложения этих соединений. Нуклеотидные последовательности этих функциональных генов (nar, bph) включены в международные базы данных GenBank/EMBL/DDBJ. Показано, что у актинобактерий nar, bph гены характеризуются большим полиморфизмом по сравнению с аналогичными функциональными генами протеобактерий рода Pseudomonas. Накопление информации о структуре генов/оперонов, определяющих ключевые моменты метаболизма токсичных соединений, имеет важное значение для развития системной биологии с целью применения ее достижений в биодеградации (Trigo et al., 2009). Подходы системной биологии, учитывающие в максимальной степени результаты экологических исследований и информацию в сфере геномики, метагеномики, протеомики и метаболомики, являются наиболее перспективными как для понимания молекулярных механизмов биодеградации трудноразлагаемых поллютантов в условиях микробиоценозов, так и для создания биопрепаратов (биотехнологий), активных в определенных биологических и физико-химических условиях, оптимизации протекания биодеградативных процессов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Плотникова, Елена Генриховна, Пермь

1. Алтынцева О.В. Галотолерантные бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов: Диссертация на соискания ученой степени к.б.н. / О.В. Алтынцева Пермь, 2001. - 139 с.

2. Бабошин М.А. Микробная трансформация фенантрена и антрацена / Бабошин М.А., Баскунов Б.П., Филькенштейн З.И. и др. II Микробиология. -2005. Т. 74. - № 3. - С. 357-364.

3. Бабыкин М.М. Плазмиды различных штаммов Pseudomonas spheroids / М. М. Бабыкин, В.В. Зинченко, М.В. Бибиков и др. И Молекулярная генетика микроорганизмов и вирусов. 1984. - № 7. - С. 23-28.

4. Балашова Н.В. Штамм Pseudomonas putida В S3 701 — деструктор фенантрена и нафталина /Н.В. Балашова, И.А. Кошелева, А.Е. Филонов и др. II Микробиология. 1997. - Т. 66. - С. 488-493.

5. Белицкая Е.А., Серебренникова О.В. Углеводородный состав нефтей района Колтогорского прогиба // Электронный журнал «Нефтегазовое дело».- 2008. http://www.ogbus.ru

6. Бердичевская М.В. Особенности физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей / М.В. Бердичевская // Микробиология.- 1989. Т. 58, Вып. 1. - С. 60-65.

7. Воронин A.M. Генетические системы биодеградации: организация и регуляция экспрессии / A.M. Воронин, Т.В. Цой // Микробиология. 1989. -Т. 25, №4. -С. 581-594.

8. Васильева Г. К. Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными бифенилами / Г.К. Васильева, Е.П. Стрижакова // Микробиология. 2007. - Т. 76, № 6. - С. 725-741.

9. Веслополова Е. Ф. Микрометод определения численности колониеобразующих микроорганизмов / Е.Ф. Веслополова // Микробиология.- 1995.-Т. 62.-С. 279-284.

10. Гаузе, Г.Ф. Определитель актиномицетов. /Г.Ф. Гаузе, Т.П. Преображенская, М.А. Свешникова и др. // Под ред. Мишустина Е. Н. М.: -Наука. 1983.-245 с.

11. Доронина Н.В. Органические осмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий / Н.В. Доронина, В.Г. Сахаровский, C.B. Драчук // Микробиология. 1998. - Т. 67, №4. - С. 458-463.

12. Еремченко О.З. Почвенно-экологические условия зоны солеотвалов и адаптация к ним растений / О.З. Еремченко, O.A. Лымарь // Экология. 2007. -№ 1.-С. 18-23.

13. Зайцев Г.М. Утилизация 4-хлорбензойной кислоты штаммом Arthrobacter globiformis / Г.М. Зайцев, Ю.Н. Карасевич // Микробиология. -1981а.-Т. 50.-С. 35-40.

14. Зайцев Г. М. Подготовительный метаболизм 4-хлорбензойной кислоты у Arthrobacter globiformis / Г.М. Зайцев, Ю.Н. Карасевич // Микробиология. -19816.-Т. 50.-С. 423-428.

15. Зайцев Г.М. Подготовительный метаболизм 4-хлорбензойной и 2,4-дихлорбензойной кислот у Corynebacterium sepedonicum / Г.М. Зайцев, Ю.Н. Карасевич // Микробиология. 1985. - Т. 54. - С. 356-361

16. Звягинцева И.С. Влияние солености среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями / И.С. Звягинцева, М.Н. Поглазова,

17. М.Т. Готоева и др. II Микробиология. 2001. - Т. 70, № 6. - С. 759-764.

18. Измалкова Т.Ю. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluorescens / Т.Ю. Измалкова, О.И. Сазонова, С.Л. Соколов и др. // Микробиология. 2005. - Т. 74. -С. 70-78.

19. Ившина И.Б. Бактерии рода Rhodococcus (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразие): Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени д.б.н./ И.Б. Ившина — Пермь, 1997. — 98 с.

20. Карасевич Ю. Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука. 1982. — 144 с.

21. Карасевич Ю. Н. Утилизация 4-хлорбензойной и 2,4-дихлорбензойной кислот смешанной культурой микроорганизмов / Ю.Н. Карасевич, Г.М. Зайцев // Микробиология. 1984. - Т. 53. - С. 374-380.

22. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Д. Кашнер -М.: Мир, 1981.-365с.

23. Комарова Т.И. Роль низкомолекулярных азотистых соединений в осмотолерантности бактерий родов Rhodococcus и Arthrobacter / Т.И. Комарова, Т.В. Коронелли, Е.А. Тимохина // Микробиология. 2002. -Т. 71, №2.-С. 166-170.

24. Кошелева И.А. Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина / И.А Кошелева, Н.В. Балашова, Т.Ю. Измалкова и др. И Микробиология. 2000. - Т. 69, №4. - С. 783-789.

25. Кузнецов В.Д. Streptomyces albiaxalis sp. nov.; новый деградирующий углеводороды нефти вид термо- и галотолерантных Streptomyces / В.Д. Кузнецов, Т.А. Зайцева, JI.B. Вакуленко и др. II Микробиология. 1992. -Т. 61.-С. 62-67.

26. Куличевская И.С. Окисление углеводородов нефти экстремально галофильными архебактериями / И.С. Куличевская, Е.И. Милехина, И.А. Борзенков и др. II Микробиология. 1991. - Т. 60, - С 860-866.

27. Ленева H.A. Деградация фенантрена и антрацена микроорганизмами рода Rhodococcus / H.A. Ленева, М.П. Коломицева, В.Р. Баскунов, Л.А. Головлева // Прикладная биохимия и микробиология. — 2009. Вып. 45. - № 2. — С. 188-194.

28. Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. -М.: Мир, 1984. С. 480.

29. Матвеева Н.И. Осморегуляция в клетках углеводородокисляющих бактерий из нефтяных месторождений Татарии / Н.И. Матвеева, Ю.А. Николаев, Н.А.Воронина и др. // Микробиология. 1993. - Т. 62, № 5. -С. 835-842.

30. Методы общей бактериологии: Пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт и др. М.: Мир. 1983. - Том 1, 2, 3.

31. Милехина Е.И. Углеводородокисляющая микрофлора заводняемых нефтяных месторождений Татарии с различной минерализацией пластовых вод / Е.И. Милехина, И.А. Борзенков, Ю.М. Миллер и др. II Микробиология. -1991.-Т. 60.-С. 747-755.

32. Милехина Е.И. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий нефтяных месторождений Татарстана / Е.И. Милехина, И.А. Борзенков, И.С. Звягинцева и др. II Микробиология. 1998. - Т. 67. - С. 208-214.

33. Моисеева О.В. Разложение 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата культурой Rhodococcus opacus lcp / O.B. Моисеева, E.B. Линько, Б.П. Баскунов и др. II Микробиология. 1999. - Т. 68. - С. 400-405.

34. Моисеева О.В. Ферменты нового модифицированного орто-пути из Rhodococcus opacus 1СР, утилизирующего 2-хлорфенол / О.В. Моисеева, О.В. Белова, И.П. Соляникова и др. II Биохимия. — 2001. Т. 66, № 5. -С. 678-687.

35. Назина Т.Н. Филогенетическое разнообразие аэробных сапротрофных бактерий из нефтяного месторождения Дацина / Т.Н. Назина, A.A.

36. Григорьян, С. Ян-Фен и др. // Микробиология. 2002. - Т. 71, № 1. - С. 103110.

37. Нестеренко O.A. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / O.A. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. — Киев: Наук. Думка, 1985. -С. 336.

38. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, JI.M. Захарчук и др. М.: Академия, 2005. - С. 608.

39. Определитель бактерий Берджи.: Пер. с англ. / Под. ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.: Мир. 1997. -Том 1, 2.

40. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Дж. Перт. М.: Мир. - 1978. - С. 14-33.

41. Плакунов В.К. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей / В.К. Плакунов, В.Г. Арзуманян, H.A. Воронина и др. И Микробиология. 1999. - Т. 68, № 1. - С. 40-44.

42. Плакунов В.К. Устойчивость нефтеокисляющего микроорганизма, Dietzia sp. к гиперосмотическому шоку в реконструированных биопленках//

43. B.К. Плакунов, М.В. Журина, С.С Беляев // Микробиология. 2008. - Т. 77.1. C. 581-589.

44. Резников A.A. Методы анализа природных вод / A.A. Резников, Е.П. Муликовская, И.Ю. Соколов. М.: Мир. - 1970. - 211 с.

45. Розанова Е.П. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах / Е.П. Розанова, Т.Н. Назина // Микробиология. 1982. -Т. 51.-С. 324-348.

46. Романов В.П. Окислительное дегалогенирование 2-хлор- и 2,4-дихлорбензоатов штаммов Pseudomonas aeruginosa / В.П. Романов, Г.М. Гречкина, В.М. Аданин и др. II Микробиология. 1993. - Т.62. - С. 887895.

47. Смирнов В.В. Бактерии рода Pseudomonas / B.B. Смирнов, Е.А. Киприанова. Киев: Наук, думка, 1990. - С. 234.

48. Соляникова И.П. Организация биодеградативных путей у родококков: Диссертация на соискание ученой степени д.б.н. / И. П. Соляникова. — Пущино, 2007.-С. 245.

49. Хмеленина В.Н. Синтез осмопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами / В.Н. Хмеленина, В.Г. Сахаровский, А.С. Решетников и др. // Микробиология. 2000. - Т. 69, №4. - С. 465-470.

50. Abed R.M. Bacterial diversity of a cyanobacterial mat degrading petroleum compounds at elevated salinities and temperatures / R.M.M. Abed, A.Al-Thukair, D. de Beer // FEMS Microbiol. Ecol. 2006. - V. 57. - P. 290-301.

51. Abraham W.-R. Diversity of biphenyl degraders in a chlorobenzene polluted aquifer / W.-R. Abraham, D.F. Wenderoth, W. GlâBer // Chemosphere- 2005. -V. 58.-P. 529-533.

52. Abramowicz D.A. Aerobic and anaerobic biodégradation of PCBs: a review / D.A. Abramowicz // Crit. Rev. Biotechnol. 1990. - V. 10. - P. 241-251.

53. Adebusoye A.S. Growth on dichlorobiphenyls with chlorine substitution on each ring by bacteria isolated from contaminated African soils / A.S. Adebusoe, F.W. Picardal, M.O. Ilory et al. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 74. -P. 484-492.

54. Aislabie J. Aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from soil near Scott base, Antarctica / J. Aislabie, J. Foght, D. Saul // Polar. Biol. 2000. - V. 23. -P. 183-188.

55. Alquati C. Diversity of naphthalene degrading bacteria from a petroleum contaminated soil / C. Alquati, M. Papacchini, C. Riccardi et al. //Ann. Microbiol. 2005. - V. 55, № 4. - P. 237-242.

56. Alva V.A. Phenol and catechol biodégradation by the haloalkaliphile Halomonas campisalis: influence of pH and salinity / V.A. Alva, B.M. Peyton // Environ. Sei. Technol. 2003. -V. 37. - P. 4397 -4402.

57. Alvarez H.M. Physiological and morphological responses of the soil bacterium Rhodococcus opacus strain PD630 to water stress/ H.M. Alvarez, R.A. Silva, A.C. Cesari et al. II FEMS Microbiol. Ecol. 2004. - V. 50. - P. 7586.

58. Andreoni V. Detection of genes for alkane and naphthalene catabolism in Rhodococcus sp. strain 1BN / V. Andreoni; S. Bernasconi; M. Colombo et al. II Environmental Microbiology. 2000. - V. 2. - P. 572-577.

59. Arahal D.R. Proposal of Cobetia marina gen. nov., comb, nov., within the family Halomonadaceae, to include the species Halomonas marina / D.R. Arahal, A.M. Castillo, W. Ludwig et al. II Syst. Appl. Microbiol. 2002. - V. 25. -P. 207-211.

60. Arahal D.R. The Family Halomonadaceae / D.R. Arahal, A. Ventosa // The Prokaryotes: Chapter 3.3.28 / Eds. Dworkin M. et al. 3rd edn., New York: Springer-Verlag., 2006. - P. 811-835.

61. Arahal R.D. Phylogeny of the family Halomonadaceae based on 23 S and 16S rDNA sequence analyses / R.D. Arahal, W. Ludwig, K.H. Schleifer // Int. J.

62. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. - P. 241-249.

63. Arai H. Two sets of biphenyl and PCB degradation genes on a linear plasmid in Rhodococcus erythropolis TA421 / H. Arai, S. Kosono, K. Taguchi et al. II J. Ferment. Bioeng. 1998. - V. 86. - P.595-599.

64. Arensdorf J.J. Formation of chlorocatechol meta-cleavage products by a pseudomonad during metabolism of monochlorobiphenyls / J.J. Arensdorf, D.D. Focht // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 2884-2889.

65. Arensdorf J.J. A meta cleavage pathway for 4-chlorobenzoate, an intermediate in the metabolism of 4-chlorobiphenyl by Pseudomonas cepacia PI 66 / J.J. Arensdorf, D. D. Focht // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 443447.

66. Armengaud J. Genetic analysis of dioxin dioxygenase of Sphingomonas sp. strain RW1: catabolic genes dispersed on the genome / J. Armengaud, B. Happe, K.N. Timmis // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 3954-3966.

67. Arulazhagan P. Role of a moderately halophilic bacterial consortium in the biodégradation of polyaromatic hydrocarbons / P. Arulazhagan, N. Vasudevan // Marine Pollut. Bullet. 2009. - V. 58. - P. 256-262.

68. Ash C. Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small subunit ribosomal RNA sequences / C. Ash, J.A.E. Farrow, S. Wallbanks h M.D. Collins II Lett. Appl. Microbiol. 1991. -V. 13. - P. 202-206.

69. Ash C. Molecular identification of rRNA group 3 Bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks, and Collins) using a PCR probe test / C. Ash, F.G. Priest, M.D. Collins // Antonie van Leeuwenhoek. 1993. - V. 64. - P. 253-260.

70. Ashok B.T. Isolation and characterization of four polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacteria from soil near an oil refinery / B.T. Ashok, S. Saxena, J. Musarrat // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - V. 21. - P. 246-248.

71. Asturias J.A. Three different 2,3-dihydroxybiphenyl-l,2-dioxygenases in the gram-positive polychlorobiphenyl-degrading Rhodococcus globerulus P6 / J.A. Asturias, K.N. Timmis II J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 4631-4640.

72. Asturias J.A. The evolutionary relationship of biphenyl dioxygenase from gram-positive Rhodococcus globerulus P6 to multicomponent dioxygenases from gram-negative bacteria / J.A. Asturias, E. Diaz, K.N. Timmis // Gene. 1995. -V.156. — P. 11-18.

73. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), http://www. atsdr. cdc.gov

74. Baboshin M.A. Conversion of polycyclic aromatic hydrocarbons by Sphingomonas sp. VKM B-2434 / M.A. Baboshin, V.N Akimov., B.P. Baskunov et al. Il Biodégradation. 2008. - V. 19. - P. 567-576.

75. Bagdasarian M. Specific purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number RSFlOlO-derived vectors, and a host-vector system for cloning in Pseudomonas / M. Bagdasarian, R. Lurz, B. Ruckert et al. II Gene. -1981.-V. 16.-P. 237-247

76. Baggi G. Inhibition by meta-substituted dichlorobenzoates in Alcaligenes denitrificans which grows on 4-chlorobenzoate / G. Baggi, M. Zangrossi // Ann. Microbiol. Enzymol. 1995. - V. 45. - P. 185-189.

77. Baggi G. Degradation of chlorobenzoates in soil suspensions by indigenous populations and a specialized organism: interactions between growth and non-growth substrates / G. Baggi, M. Zangrossi // FEMS Microbiology Ecology. — 1999.-V. 29.-P. 311-318.

78. Baldwin B.R. Broad substrate specificity of naphthalene and biphenyl-utilizing bacteria / B.R. Baldwin, M.B. Mesarch, L. Nies. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V.53. - P. 748.

79. Bamforth S.M. Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons: current knowledge and future directions / S.M. Bamforth, I. Singleton // Chem. Technol. Biotechnol. 2005. - V. 80. - P. 723-736.

80. Barnsley E.A. Bacterial oxidation of naphthalene and phenanthrene /

81. E.A. Barnsley //J. Bacteriol. 1983. - V. 153. - P. 1069-1071.

82. Barnsley E.A. The induction of the enzymes of naphthalene metabolism in Pseudomonas by salicylate and 2-aminobenzoate / E.A. Barnsley // J. Gen. Microbiol. 1975. - V. 88. - P. 193-196.

83. Barriault D. Catalytic activity of Pseudomonas putida strain G7 naphthalene 1,2-dioxygenase on biphenyl / D. Barriault, M. Sylvestre // Int. Biodeterior. Biodegrad. 1999. - V. 44. - P. 33-37.

84. Barriault D. Functionality of biphenyl 2,3-dioxygenase components in naphthalene 1,2-dioxygenase / D. Barriault, M. Sylvestre // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - V.51. - P. 592-597.

85. Bartholomew G. W. Influence of spatial and temporal variations on organic pollutant biodégradation rates in an estuarine environment / G.W. Bartholomew,

86. F.K. Pfaender // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 45. - P. 103-109.

87. Basta T. Structural and replicative diversity of large plasmids from sphingomonads that degrade polycyclic aromatic compounds and xenobiotics / T. Basta, S. Buerger, A. Stolz // Microbiology. 2005. - V.151. - P. 2025-2037.

88. Bastos A.E.R. Salt-tolerant phenol-degrading microorganisms isolated from Amazonian soil samples / A.E.R. Bastos, D.H. Moon, A. Rossi et al. II Arch. Microbiol. 2000. - V. 174. - P.346-352.

89. Becker B. Rapid differentiation of between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates / B. Becker, M.P. Lechevalier, R.E. Gordon et al. II Appl. Microbiol. Biotech. 1964. - V. 12. - P. 421-423.

90. Bedard D.L. Evidence for novel mechanisms of polychlorinated biphenyl metabolism in Alcaligenes eutrophus H850 / D.L. Bedard, M.L. Haberl, R.J. May et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1987. - V. 53. - P. 1103-1112.

91. Bedard D.L. Influence of chlorine substitution pattern on the degradation of polychlorinated biphenyls by eight bacterial strains / D.L. Bedard, M.L. Haberl // Microbial Ecology. 1990. - V. 20. - P. 87-102.

92. Benning M.M. The three-dimensional structure of 4-hydroxybensoyl-CoA thioesterase from Pseudomonas sp. strain CBS-3 / M.M. Benning, G. Wesenberg, R.Q. Liu et al. II J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 3357233579.

93. Berardesco G. Spatial and temporal variation of phenanthrene-degrading bacteria in intertidal sediments / G. Berardesco, S. Dyhrman, E. Gallagher et al. H Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64, №7. - P. 2560-2565.

94. Bhadra B. Brevibacterium oceani sp. nov., isolated from deep-sea sediment of the Chagos Trench, Indian Ocean / B. Bhadra, C. Raghukumar, P.R. Pindi, S. Shivaji / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V. 58. - P. 57-60.

95. Boldrin B. Degradation of phenanthrene, fluorene, fluoronaphthene, and pyrene by a Mycobacterium sp. / B. Boldrin, A. Tiehm, C. Fritzsche // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 1927-1930.

96. Boronin A.M. Diversity of Pseudomonas plasmids: to what extent / A.M. Boronin // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - V. 15. - P. 461-467.

97. Bosch R. Complete nucleotide sequence and evolutionary significance of a chromosomally encoded naphthalene degradation lower pathway from Pseudomonas stutzeri AN10 / R. Bosch, E. Garcia-Valdes, E.R.B. Moore // Gene.2000. — V. 245.-P. 65-74.

98. Bosch R. Genetic characterization and evolutionary implications of a chromosomally encoded naphthalene degradation upper pathway from Pseudomonas stutzeri AN10 / R. Bosch, E. Garcia-Valdes, E.R.B. Moore // Gene.- 1999. V. 236.-P. 149-157.

99. Bosch R. NahW, a novel, inducible salicylate hydroxylase involved in mineralization of naphthalene by Pseudomonas stutzeri AN 10 / R. Bosch, E.R.B. Moore, E. Garcia-Valdes, D.H. Pieper // J. Bacteriol. 1999. - V.181. -P.2315-2322.

100. Bouches M. The microbial fate of polycyclic aromatic hydrocarbons: carbon and oxygen balances for bacterial degradation of model compounds / M. Bouches, D. Blanchet, J.-P. Vandecasteele // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 45. -P. 556-560.

101. Brenner V. Genetic construction of PCB degraders / V. Brenner, J.J. Arensdorf, D.D. Focht II Biodégradation. 1994. - V. 5 - P. 359-377.

102. Briganti F. Purification and catalytic properties of two catechol 1,2-dioxygenase isozymes from benzoate-grown cells of Acinetobacter radioresistens / F. Briganti, E. Pessione, C. Giunta et al II J. Protein Chem. — 2000. -V. 19.-P. 709-716.

103. Briganti F. XAS characterization of the active sites of novel intradiol ring-cleaving dioxygenases: hydroxyquinol and chlorocatechol dioxygenases / F. Briganti, S. Mangani, L. Pedocchi et al II FEBS Letters. 1998. - V. 433. -P. 58-62.

104. Bubinas A. Degradation of naphthalene by thermophilic bacteria via a pathway, through protocatechuic acid / A. Bubinas, G. Giedraityte, L. Kalediene, et al II Cent. Eur. J. Biol. 2008. - V. 3. - P.61-68.

105. Buchan A. Key aromatic-ring cleaving enzyme, protocatecuate-3,4-dioxygenase, in the ecologically important marine Roseobacter lineage /

106. A. Buchan, L.S. Collier, E.L. Neidle, M.N. Moran // Appl. Environ. Microbiol. -2000. V. 66. - P. 4662-4672.

107. Calderon M.I. Complex regulation of the synthesis of the compatible solute1. T*ectoine in the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens DSM 3043 / M.I. Calderon, C. Vargas, F. Rojo et al II Microbiology. 2004. - V. 150. -P. 3051-3063.

108. Camara B. A gene cluster involved in degradation of substituted salicylates via ortho cleavage in Pseudomonas sp. strain MT1 encodes enzymes specifically adapted for transformation of 4-methylcatechol and 3-methylmuconate /

109. B. Camara, P. Bielecki, F. Kaminski et al II J. Bacteriol. 2007. - V. 189. -P. 1664-1674.

110. Cao B. Biodégradation of aromatic compounds: current status and opportunities for biomolecular approaches / B. Cao, K. Nagarajan, K.-C. Loh // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009. - V. 85. - P. 207-228.

111. Cerniglia C.E. Biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons / C.E. Cerniglia//Biodégradation. 1992. - V. 3. - P. 351-368.

112. Cha C.-J. Catechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus rhodochrous N75 capable of metabolizing alkyl-substituted catechols / C.-J. Cha // J. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V. 16. - P. 778-875.

113. Chae J.C. Genetic structure and functional implication of the fcb gene cluster for hydrolytic dechlorination of 4-chlorobenzoate from Pseudomonas sp. DJ-12 / J.C. Chae, Y. Kim, Y.C. Kim et al. II Gene. 2000. - V. 258. - P. 109116.

114. Chae J.C. Identification of genes coding for hydrolytic dehalogenation in the metagenome derived from a denitrifying 4-chlorobenzoate degrading consortium / J.C. Chae, B. Song, G.J. Zylstra // FEMS Mocrobiol. Lett. 2008. - V. 281. -P. 203-209.

115. Chain P.S.G. Inaugural Article: Burkholderia xenovorans LB400 harbors a multi-replicon, 9.73-Mbp genome shaped for versatility / P.S.G. Chain ; V.J. Denef; K.T. Konstantinidis et al. II Proceed. Nat. Acad. Science. 2006. - V. 103. -P. 15280-15287.

116. Chaudhry G.R. Biodégradation of halogenated organic compounds / G.R. Chaudhry, S. Chapalamadugu // Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - P. 59-79.

117. Chen Y. Molecular evidence of genetic modification of Sinorhizobium meliloti: enhanced PCB bioremediation / Y. Chen, A. Adam, O. Toure, S.K. Dutta // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005. -V. 32. - P. 561-566.

118. Chen Y.-G. Arthrobacter halodurans sp. nov., a new halotolerant bacterium isolated from sea water / Y.-G. Chen, S.-K. Tang, Y.-Q. Zhang, Z.-Y. Li, L.-B. Yi, Y.-X. Wang, W.-J. Li, X.-L. Cui // Antonie van Leeuwenhoek. 2009. - V. 96. -P. 63-70.

119. Christensen B. B. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium / B.B. Christensen, J.A. Haagensen, A. Heydorn et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2002.- V. 68. - P. 2495-2502.

120. Colquhoun J. A. Novel rhodococci and other mycolate actinomycetes from the deep sea / J.A. Colquhoun., J. Mexson, M. Goodfellow et al. II Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74. - P. 27-40.

121. Collins M.D. The Genus Brevibacterium / In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, E. N.Y. Stackebrandt (editors), The Prokaryotes, A Handbook on the Biology of Bacteria, Vol. 3, Springer-Verlag, New York. -2006.-P. 1013-1019.

122. Copley S.D. Enzymic dehalogenation of 4-chlorobenzoil coenzyme A in Acinetobacter sp. strain 4-CB1 / S.D. Copley, G.P. Crooks // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58 - P. 1385-1387.

123. Coschigano P.W. Metabolism of both 4-chlorobenzoate and toluene under denitrifying conditions by a constructed bacterial strain / P.W. Coschigano, M.M. Haggblom, L.Y. Young // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. -P. 989-995.

124. Dagher F. Comparative study of five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contaminated soils / F. Dagher, E. Deziel, P. Lirette et al. // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43,. - P. 368-377.

125. Dennis J.J. Complete sequence and genetic organization of pDTGl, the 83 kilobase naphthalene degradation plasmid from Pseudomonas putida strain NCIB 9816-4 / J.J. Dennis, G.J. Zylstra // J. Mol. Biol. -2004. -V. 341. P.753-768.

126. Denome S.A. Metabolism of dibenzothiophene and naphthalene in Pseudomonas strains: complete DNA sequence of an upper naphthalene catabolic pathway / S.A. Denome, D.C Stanley, E.S. Olson et al. II J. Bacteriol. 1993. -V. 175.-P. 6890-6901.

127. Deveryshetty J. Biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas sp. strain PPD: purification and characterization of l-hydroxy-2-naphthoic acid dioxygenase / J. Deveryshetty, P.S. Phale // Microbiology. 2009. - V.155. - P.3083-3091.

128. Di Gioia D. Structures of homologous composite transposons carrying cbaABC genes from Europe and North America / D. DiGioia, M. Peel, F. Fava, R.C. Wyndham // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -V. 64. - P. 1940-1946.

129. Dixon M. The determination of enzyme inhibitor constants / M. Dixon // J. Biochem. 1953. —V. 55. — P. 170-171.

130. Dong X.S. Crystal structure of the terminal oxygenase component of cumene dioxygenase from Pseudomonas fluorescens IP01 / X.S. Dong, S. Fushinobu, E. Fukuda et al. II J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - P. 2483-2490.

131. Dore Y. Naphthalene-utilizing and mercury-resistant bacteria isolated from an acidic environment / Y. Dore, Q.E. Clancy, S.M. Rylee, C.F. Kulpa // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 63. - P. 194-199.

132. Dorn E. Isolation and characterization of a 3-chlorobenzoate degrading pseudomonad / E.M. Dorn, M. Hellwig, W. Reineke // Arch. Microbiol. 1974. -V. 99.-P. 61-70.

133. D'Souza-Ault M.R. Roles of N-Acetylglutaminylglutamine amide and glycine betaine in adaptation of Pseudomonas aeruginosa to osmotic stress / M.R. D'Souza-Ault, L. Tombras Smith, G.M. Smith // Appl. Environ. Microbiol. -1993.-V. 59.-P. 473-478.

134. Dua R.D. Purification and characterization of naphthalene oxygenase from Corynebacterium renale /R.D. Dua, S. Meera // Eur. J. Biochem. 1981. - V. 120. -P. 461-465.

135. DuaM. Biotechnology and bioremediation: successes and limitations / M. Dua , A. Singh, N. Ssethunathan , A. K. Johri // Appl. Microbiol. Biothechnol. -2002. — V. 59.-P. 143-152.

136. Dunn N.W. Transmissible plasmids coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida / N.W. Dunn, I.S. Gunsalus // J. Bacteriol. -1973.-V. 114.-P. 974-980.

137. Dyaz M.P. Isolation and characterization of novel hydrocarbon-degrading euryhaline consortia from crude oil and mangrove sediments / M.P. Dyaz, S.J.W. Grigson, C.J. Peppiatt et al. II Mar. Biotechnol. 2000. - V. 2. - P.522-532.

138. Dyksterhouse S.E. Cycloclasticus pugetii gen. nov., sp. nov., an aromatic hydrocarbon-degrading bacterium from marine sediments / S.E. Dyksterhouse, J.P. Gray, R.P. Herwig et al II Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. - V. 45. - P. 116-123.

139. Earhart C.A. Structure of catechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas arvilla / C.A. Earhart, M.W. Vetting, R. Gosu et al. II Biochem. Biophys. Res. Comm. 2005. - V.338. - P. 198-205.

140. Efroymson R. Biodégradation by an Arthrobacter species of hydrocarbons partitioned into an organic solvent / R. Efroymson, M. Alexander // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - P. 1441-1447.

141. Eisner A. Resolution of 4-chlorobenzoate dehalogenase from Pseudomonas sp. strain CBS3 into three components / A. Eisner, F. Loffler, K. Miyashita et al. Il Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V. 57. - P. 324-326.

142. Emerson D. Haloferax sp. D 1227, a halophilic archaeon capable of growth on aromatic compounds / D. Emerson, S. Chauhan, P. Oriel et al. II Arch. Microbiol. 1994. - V. 161. - P. 445^152.

143. Emerson D. The response of microbial populations from oil-brine contaminated soil to gradients of NaCl and sodium p-toluate in diffusion gradient chamber / D. Emerson, J.A. Breznac // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. - V.23. -P. 285-300.

144. Ensign J.C. A crystalline pigment produced from 2-hydroxypyridine by Arthrobacter crystallopoietes n.sp. J.C. Ensign, S.C. Rittenberg // Arch. Microbiol. 1963.-V. 47.-P. 137-153.

145. Erb R.W. Characterization of a gene cluster from Ralstonia eutropha JMP134 encoding metabolism of 4-methyl-muconolactone / R.W. Erb, K.N. Timmis, D.H. Pieper // Gene. 1998. - V. 206. - P. 53-62.

146. Erickson B.D. Enhanced biodégradation of polychlorinated biphenyls after site-directed mutagenesis of a biphenyl dioxygenase gene / B.D. Erickson, F.J. Mondello // Appl. Environ. Microbiol. 1993. -V. 59. - P. 3858-3862.

147. Euzeby J.P. List of bacterial names with standing in nomenclature / J.P. Euzeby, 2010. http://www.bacterio.cict.fr

148. Evans W.C. Oxidative metabolism of phenanthrene and anthracene by soil pseudomonads: the ring fission mechanism / W.C. Evans, H.N. Fernley E. Griffiths // Biochem. J. 1965. - V. 95. - P. 819-831.

149. Evtushenko L.I. The family Microbacteriaceae / L.I. Evtushenko, M. Takeuchi // The Prokaryotes: an Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community / Eds. Dworkin M. et al. 3rd edn., release 3.14, 31,

150. New York: Springer, 2003. (http://link.springerny.com/link/service/books/10125).

151. Faroon O. Polychlorinated biphenyls. Human health aspects / O. Faroon, L. Keith, C. Smith-Simon, C. De Rosa // Concise international chemical assessment document 55, Geneva: World Health Organization, 2003.

152. FavaF. Degradation and dechlorination of low-chlorinated biphenyls by a three-membered bacterial co-culture / F. Fava, D. Di Gioia, S. Cinti, L. Marchetti, G. Quattroni // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. - V. 41. - P. 117-123.

153. Fava F. Influence of organic and inorganic growth supplements on the aerobic biodégradation of chlorobenzoic acids / F. Fava, P.M. Armenante, D. Kafkewitz, L. Marchetti // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V. 43 -P. 171-177.

154. Feist C.F. Phenol and benzoate metabolism by Pseudomonas putida of tangential pathways / C.F. Feist, G.D. Hegman // J. Bacteriol. 1969. - V. 100. -P. 869-877.

155. Ferraroni M. Crystal structure of 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase from the chlorophenol-utilizing gram-positive Rhodococcus opacus 1CP / M. Ferraroni, I.P. Solyanikova, M.P. Kolomytseva et al. II J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. -P.27646-27655.

156. Fetzner S. Purification and some properties of 2-halobenzoate 1,2-dioxygenase, a two component enzyme system from Pseudomonas cepacia 2CBS / S. Fetzner, R. Müller, F. Lingens // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 279290.

157. Fetzner S. Bacterial dehalogenases: biochemistry, genetics, and biotechnological applications / S. Fetzner, F. Lingens // Microbiol. Rev. 1994. — V. 58.-P. 641-685.

158. Fetzner S. Bacterid dechalogenation / S. Fetzner // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 50. - P. 633-657.

159. Fetzner S. Catabolic linear plasmids / S. Fetzner, S. Kolkenbrock, K. Parschat // In: E. Meinhardt, R. Klassen: Microbial linear plasmids. SpringerVerlag, Berlin. 2007. - P. 64-98.

160. Field J. A. Microbial transformation of chlorinated benzoates / J.A. Field, R. Sierra-Alvarez // Rev. Environ. Sei. Biotechnol. 2008. - V. 7. - P. 191-210.

161. Focht D.D. Genetic exchange in soil between introduced chlorobenzoate degraders and indigenous biphenyl degraders / D.D. Focht, D.B. Searles, S.-C. Koh // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 3910-3913.

162. Francisco P.B. The chlorobenzoate dioxygenase gene of Burkholderia sp. strain NK8 involved in the catabolism of chlorobenzoates / P.B. Francisco, N. Ogawa, K. Suzuki, K. Miyashita// Microbiology. 2001. - V. 147. -P. 121-133.

163. Franzmann P.D. A chemotaxonomic study of members of the family Halomonadaceae / P.D Franzmann., B.J. Tindall // System. Appl. Microbiol. -1990.-V. 13.-P. 142-147.

164. Franzmann P.D. Halomonadaceae fam. nov., a new family of the class Proteobacteria to accommodate the genera Halomonas and Deleya / P.D. Franzmann, U. Wehmeyer, E. Stackebrandt // Syst. Appl. Microbiol. 1988. -V. 11.-P. 16-19.

165. Fuenmayor S.L. A gene cluster encoding conversion of naphthalene to gentisate in Pseudomonas sp. strain U2 / S.L. Fuenmayor, M. Wild, A.L. Boyes, P.A. Williams // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 2522-2530.

166. Fulthorpe R.R. High levels of endemicity of 3-chlorobenzoat-degrading soil bacteria / R.R. Fulthorpe, A.N. Rhodes, J.M. Tiedje // Appl. Environ. Microbiol. -1998. -V. 64. P. 1620-1627.

167. Fulthorpe R.R. A comparison of the ability of forest and agricultural soils to mineralize chlorinated aromatic compounds / R.R. Fulthorpe, L.N. Schofield // Biodégradation. 1999. - V. 10. - P. 235-244.

168. Furukawa K. Biphenyl dioxygenases: functional versatilities and directed evolution / K. Furukawa, H. Suenaga, M. Goto // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. -P. 5189-5196.

169. Furukawa K. Microbial degradation of polychlorinated biphenyls: biochemical and molecular features / K. Furukawa, H. Fujihara // J. Biosci. Bioeng. 2008. - V. 105, № 5. - P. 433-49.

170. Furukawa K. Involvement of plasmids in total degradation of chlorinated biphenyls / K. Furukawa, A.M. Chakrabarty // Appl. Envir. Microbiol. 1982. -V. 44.-P. 619-629.

171. Furukawa K. Metabolism of 2,4,4'-trichlorobiphenyl by Acinetobacter sp. P6 / K. Furukawa, K. Tonomura, A. Kamibayashi // Agric. Biol. Chem. 1979. -V. 43.-P. 1577-1583.

172. Furukawa K. Engineering dioxygenases for efficient degradation of environmental'pollutants / K. Furukawa // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. - V. 11. - P. 244-249.

173. Furusawa Y. Crystal structure of the terminal oxygenase component of biphenyl dioxygenase derived from Rhodococcus sp. strain RHA1 / Furusawa Y., Nagarajan V., Tanokura M. et al. II J. Mol. Biol. 2004. - V. 17. - P. 1041-52.

174. Gakhar L. Structure and increased thermostability of Rhodococcus sp. naphthalene 1,2-dioxygenase / L. Gakhar, Z.A. Malik, C.C.C.R. Allen et al. II J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - P. 7222-7231.

175. Galinski E.A. Isolation and structure determination of a novel compatible solute from the moderately halophilic purple sulfur bacterium Ectothiorhodospira marismortui / E.A. Galinski, A. Oren // Eur. J. Biochem. 1991. - V. 198. -P. 593-598.

176. Galinski E.A. Osmoadaptation in bacteria /E.A. Galinski // Adv. Microb. Physiol. 1995. - V. 37. - P. 273-328.

177. Gan S. Remediation of soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) / S. Gan, E.V. Lau, H.K. Ng // J. Hazard. Mater. 2009. -V. 172.-P. 532-549.

178. Garcya M.T. Halomonas organivorans sp. nov., a moderate halophile able to degrade aromatic compounds / M.T. Garcya, E.'n Mellado, J.C. Ostos et al. I I Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 1723-1728.

179. Garcya M.T. Catabolic versatility of aromatic compound-degrading halophilic bacteria / M.T. Garcya, A. Ventosa, E.'n Mellado // FEMS Microbiol. Ecology. 2005. - V. 54. - P. 97-109.

180. Garriga M. Carnimonas nigrificans gen. nov., sp. nov., a bacterial causative agent for black spot formation on cured meat products / M. Garriga, M.A. Ehrmann, J. Arnau et al. II Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. - V. 48. - P. 677686.

181. Gauthier M.J. Marinobacter hydrocarbonoclasticus gen. nov., sp., a new extremely halotolerant, hydrocarbon-degrading marine bacterium / M.J. Gauthier,

182. B. Lafary, R. Christen, L. Fernandes, M. Aquaviva, P. Bonin, J.C. Bertrand // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. - V.42. - P. 568-576.

183. Gentry T.J. Chlorobenzoate-degrading bacteria in similar pristine soils exhibit different community structures and population dynamics in response to anthropogenic 2-, 3-, and 4-chlorobenzoate levels / T.J. Gentry, G. Wang,

184. C. Rensing, I.L. Pepper // Microbial Ecology. 2004. - V. 48. - P. 90-102.

185. Ghosal D. Gene duplication in haloaromatic degradative plasmids pJP4 and pJP2 / D. Ghosal, In-Soon You. // Can. J. Microbiol. 1988. - V.34. - P. 709-715.

186. Gibson D.T. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology / D.T. Gibson, R.E. Parales // Curr. Opin. Biotechnol. 2000. -V. 11.-P. 236-243.

187. Gibson D.T. Desaturation, dioxygenation, and monooxygenation reactions catalyzed by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain 9816-4 / D.T. Gibson, S.M. Resnick, K. Lee et. al. // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 26152621.

188. Gibson D.T., Subramanian V. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons. Gibson (ed.), Microbial degradation of organic compounds. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. - 1984. - P. 181-152.

189. Gibson D.T. Oxidation of the carcinogens benzoa.pyrene and benzo[a]anthracene to dihydrodiols by a bacterium / D.T. Gibson, M. Vencatanayarana, D.M. Jerina, H. Yagy, H. Yen // Science. 1975. - V.189. -P. 295-297.

190. Gibson J. 4-Hydroxybenzoate-coenzyme A ligase from Rhodopseudomonas palustris: purification, gene sequence, and role in anaerobic degradation / J. Gibson, M. Dispensa, G.C. Fogg , D.T. Evans , C.S. Harwood // J. Bacteriol. -1994.-V. 176.-P. 634-641.

191. Gilbert E.S. Plant compounds that induce polychlorinated biphenyl biodégradation by Arthrobacter sp. strain BIB / E.S. Gilbert, D.E. Crowley // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 1933-1938.

192. Collins, M.D. 2006. The Genus Brevibacterium. In Dworkin, Falkow, Rosenberg, Schleifer and Stackebrandt (Editors), The Prokaryotes, A Handbook on the Biology of Bacteria, Vol. 3, Springer-Verlag, New York, pp. 1013-1019.

193. Gomez-Gil L. Characterization of biphenyl dioxygenase of Pandoraea promenusa B-356 as a potent poly chlorinated biphenyl-degrading enzyme / L. Gomez-Gil, P. Kumar, D. Barriault et al. 11 J. Bacteriol. 2007. - V. 189. -P. 5705-5715.

194. Goncalves E.R. Transcriptomic assessment of isozymes in the biphenyl pathway of Rhodococcus sp. strain RHA1 / E.R. Goncalves, H. Hara, D. Miyazawa et al. I I Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - P. 6183-6193.

195. Goodfellow M. Chemical methods in bacterial systematics / M. Goodfellow, D.E. Minnikin. Academic Press, 1985. - P. 410.

196. Goodfellow M. Rhodococcus aetherivorans sp. nov., a new species of methyl i-butyl ether-degrading actinomycetes / M. Goodfellow, A.L. Jones, L.A. Maldonado et al. II Syst. Appl. Microbiol. 2004. - V. 27. - P. 61-65.

197. Goodfellow M., Maldonado L.A. The Families Dietziaceae, Gordoniaceae, Nocardiaceae and Tsukamurellaceae / In The Prokaryotes, A Handbook on the Biology of Bacteria. Springer-Verlag, New York. 2006. - V. 3. - P. 843-888.

198. Goyal A.K. Molecular cloning of novel genes for polycyclic aromatic degradation from Comamonas testosteroni GZ39 / A.K. Goyal, G.J. Zilstra// Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 230-236.

199. Crawford L. Purification and properties of gentisate 1,2-dioxygenase from Moraxella osloensis /L. Crawford, W. Huttons, J. Chapman / J. Bacteriol. 1975.-V. 121.-P. 794-799.

200. Greene E. A. Composition of soil microbial communities enriched on a mixture of aromatic hydrocarbons / E.A. Greene, J.G. Kay, K. Jaber et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66 - P. 5282-5289.

201. Grimm A.C. NahY, a catabolic plasmid-encoded receptor required for Chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene / A.C. Grimm, C.S. Harwood//J. Bacteriol. 1999. - V. 181.-P. 3310-3316.

202. Grund E. Catabolism of benzoate and monohydroxylated benzoates by Amycolatopsis and Streptomyces spp. / E. Grund, C. Knorr, R. Eichenlaub 11 Appl. Environ. Microbiol. 1990. -V. 56. - P. 1459-1464.

203. Grund E. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rhodococcus sp. strain B4 / E. Grund, B. Denecke, R. Eichenlaub 11 Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 1874-1877.

204. Habe H. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria / H. Habe, T. Omori // Biosci. Biotech. Biochem. 2003. - V. 67. -P. 225-243.

205. Habe H. Degradation of chlorinated dibenzofurans and dibenzo-p-dioxins by two types of bacteria having angular dioxygenases with different features / H. Habe, J.-S. Chung, J.-H. Lee et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V .67. -P. 3610-3617.

206. Haddad S. Cloning and expression of the benzoate dioxygenase genes from Rhodococcus sp. strain 19070 / S. Haddad, D.M. Eby, E.L. Neidle // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 2507-2514.

207. Haddock J. D. Dihydroxylation and dechlorination of chlorinated biphenyls by purified biphenyl 2,3-dioxygenase from Pseudomonas sp. strain LB400 / J.D. Haddock, J.R. Horton, D.T. Gibson // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. -P. 20-26.

208. Häggblom M.M. Microbial breakdown of halogenated aromatic pesticides and related compounds / M.M. Häggblom // FEMS Microbiol. Rev. 1992. -V. 103.-P. 28-72.

209. HaggblomM. Mechanisms of bacterial degradation and transformation of chlorinated monoaromatic compounds / M. Haggblom // J. Basic Microbiol. -1990.-V. 2. — P. 115-141.

210. Hall M. Polycyclic aromatic hydrocarbons: Metabolism, activation and tumor initiation / Hall M., Grover P.L. // Cooper C.S., Grover P.L. (eds): Chemical carcinogenesis and mutagenesis. Berlin: Springer-Verlag. 1990. - V. 1. -P. 327-372.

211. Harayama S. Polycyclic aromatic hydrocarbon biodégradation design / S. Harayama II Curr. Opin. Biotechnol. 1997. - V. 8. - P. 268-273.

212. Harayama S. Bacterial aromatic ring- cleavage enzymes are classified into two different gene families / S. Harayama, M. Rekik // J. Biol. Chem. 1989. -V. 264.-P. 15328-15333.

213. Hardman D.J. Biotransformation of halogenated compounds / D.J. Hardman // Crit. Rev. Biotechnol. 1991. - V. 11. - P. 1-40.

214. Haritash A.K. Biodégradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A review / A.K. Haritash, C.P. Kaushik // J. Hazard. Mater. 2009. - V. 169.-P. 1-15.

215. Harwood C.S. The /?-ketoadipate pathway and the biology of self-identity / C.S. Harwood, R.E. Parales // Annu. Rev. Microbiol. 1996. - V. 50. - P. 553590.

216. Hauschild J.E. Identification of an alternative 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenase in Rhodococcus sp. strain RHA1 and cloning of the gene / J.E. Hauschild, E. Masai, K. Sugiyama et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1996. -V. 62. - P. 2940-2946.

217. Havel J. Total degradation of various chlorobiphenyls by cocultures and in vivo constructed hybrid pseudomonads / J. Havel, W. Reineke // FEMS Microbiol. Lett. 1991. - V. 78. - P. 163-170.

218. Hayaishi O. Nature and mechanism of oxygenases / O. Hayaishi // Science. 1969. - V. 164. - P. 389-396.

219. Hayaishi O. Studies on oxygenases. Pyrocatechase / O. Hayaishi, M. Katagiri, S. Rothberg // J. Biol. Chem. 1957. - V. 229. - P. 905-920.

220. Hayatsu M. Involvement of two plasmids in the degradation of carbaryl by Arthrobacter sp. strain RC100 / M. Hayatsu, M. Hirano h T. Nagata // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65, N. 3. - P. 1015-1019

221. Hedlund B.P. Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a new marine bacterium, Neptunomonas naphthovorans gen. nov., sp. nov. / B.P. Hedlund, A.D. Geiselbrecht, T.J. Bair et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. -P. 251-259.

222. Hedlund B.P. Vibrio cyclotrophicus sp. nov., a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-degrading marine bacterium / B.P. Hedlund, J.T. Staley // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 61-66.

223. Hempel C. Plasmid stability of recombinant Pseudomonas sp. B13 FR1 pFRC20P in continuous culture / C. Hempel, R. W. Erb, W. D. Deckwer, V. Hecht // Biotechnol. Bioengineer. 1998. - V. 57. - P. 62-70.

224. Hernandez B.S. Catabolic characteristics of biphenyl-utilizing isolates which cometabolize PCBs / B.S. Hernandez, J.J. Arensdorf, D.D. Focht // Biodegradation. 1995. - V. 6. - P. 75-82.

225. Hernandez-Raquet G. Molecular diversity studies of bacterial communities of oil polluted microbial mats from the Etang deBerre (France) / G. Hernandez-Raquet, H. Budzinski, P. Caumette et al. II FEMS Microbiol. Ecol. 2006. -V. 58.-P. 550-562.

226. Herrick J.B. Natural horizontal transfer of naphthalene dioxygenase gene between bacteria native to a coal tar-contaminated site / J.B. Herrick, K.G. Stuart

227. Keil, W.C. Ghiorse, E.L. Madsen // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. -P. 2330-2337.

228. Hickey W. J. Degradation of mono-, di-, and trihalogenated benzoic acids by Pseudomonas aeruginosa JB2 / W. J. Hickey, D. D. Focht // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 3842-3850.

229. Hickey W.J. Mineralisation of 2-chloro- and 2,5-dichlorobiphenyl by Pseudomonas sp. strain USR2 / W.J. Hickey, V. Brenner, D.D. Focht // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - V.98. - P. 175-180.

230. Hinteregger C. Halomonas sp., a moderately halophilic strain, for biotreatment of saline phenolic waste-water / C. Hinteregger, F. Streichsbier // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 1099-1102.

231. Hinteregger C. Characterization of isofimctional ring-cleavage enzymes in aniline and 3-chloroaniline degradation by Pseudomonas acidovorans CA28 / C. Hinterregger, M. Loidl, F. Streichsbier // FEMS Microbiol. Lett. 1992. -V. 97.-P. 261-266.

232. Hiros J. Construction of hybrid biphenyl (bph) and toluene (tod) genes for functional analysis of aromatic ring dioxygenases / J. Hiros, A. Suyama, S. Hayashidda, K. Furukawa // Gene. 1994. - V. 138. - P. 27-33.

233. Hollender J. Assessing the microbial activity of soil samples, its nutrient limitation and toxic effects of contaminants using a simple respiration test / J. Hollender, K. Althoff, M. Mundt et al. / Chemosphere. 2003. - V. 53. - P. 269275.

234. Holman H.Y.N. Mineralization of sparsely water-soluble polycyclic aromatic hydrocarbons in a water table fluctuation zone / H.Y.N. Holman, Y.W. Tsang, W.R. Holman // Envir. Sci. Technol. 1999. - V. 33. - P. 1819-1824.

235. Holoman T.R.P. Characterization of defined 2,3,5,6-tetrachlorobiphenyl-ori/zo-dechlorinating microbial community by comparative sequence analysis of genes coding for 16S rRNA / T.R.P. Holoman,

236. M.A. Elberson, L.A. Cutter et al II Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. -P. 3359-3367.

237. Hood M. A. Microbial indicators of oil-rich salt marsh sediments / M.A. Hood, W. S. Bishop, J.R. Bishop et al // Appl. Microbiol. 1975. - V. 30. -P. 982-987.

238. Hrywna Y. Construction and characterization of recombinant bacteria that grow on ortho- and para-substituted chlorobiphenyls / Y. Hrywna, T.V. Tsoi, ON. Maltseva, J.M. Tiedje // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P.2163-2169.

239. Hurtubise Y. Involvement of the terminal oxygenase (3 subunit in the biphenyl dioxygenase reactivity pattern toward chlorobiphenyl / Y. Hurtubise, D. Barriault, M. Sylvestre // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 5828-5835.

240. Ibekwe A.M. Characterization of microbial communities and composition in constructed dairy wetland wastewater effluent / A.M. Ibekwe, C.M. Grieve, S.R. Lyon // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 5060-5069.

241. Imbeault N.Y.R. Steady-state kinetic characterization and crystallization of a polychlorinated biphenyl-transforming dioxygenase / N.Y.R. Imbeault, J.B. Powlowski, C.L. Coibert et al II J. Bio. Chem. 2000. - V. 275. -P. 12430-12437.

242. Imhoff J.F. Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria / J.F. Imhoff// FEMS Microbiol. Rev. 1986. - V. 39. - P. 57-66.

243. Ivanova E.P. Brevibacterium celere sp. nov., isolated from degraded thallus of a brown alga / E.P. Ivanova, R. Christen, Y.V. Alexeeva et al / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 2107-2111.

244. Iwabuchi T. Biochemical and genetic characterization of trans-2-carboxybenzalpyruvate hydratase-aldolase from a phenanthrene-degrading Nocardioides strain / T. Iwabuchi, S. Harayama // J. Bacteriol. 1998. -V. 180.-P. 945-949.

245. Iwai S. Degradation of mono-chlorinated dibenzo-p-dioxins by Janibacter sp. strain YA isolated from river sediment / S. Iwai, A. Yamazoe, R. Takahashi et al. II Current Microbiology. 2005. - V.51. - P. 353-358.

246. Jakoncic J. The catalytic pocket of the ring-hydroxylating dioxygenase from Sphingomonas sp. CHY-1 / J. Jakoncic, Y. Jouanneau, C. Meyer, V. Stojanoff // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - V. 352. - P. 861-866.

247. Jerke K. Comparative analysis of eight Arthrobacter plasmid / K. Jerke, C.H. Nakatsu, F. Beasley, A. Konopka // Plasmids. 2008. - V. 59. - P. 73-85.

248. Jin S. Biodegradation of dibenzofiiran by Janibacter terrae strain XJ-1 / S. Jin, T. Zhu, X. Xu, Y. Xu // Current Microbiology. 2006. - V. 53. - P. 30-36.

249. Jones A.L. Rhodococcus gordoniae sp. nov., an actinomycete isolated from clinical material and phenol-contaminated soil / A.L. 'Jones, J.M. Brown, V. Mishra et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - V. 54. - P. 407-411.

250. Jones R.M. The naphthalene catabolic (nag) genes of Ralstonia sp. strain U2 are an operon that is regulated by NagR, a LysR-type transcriptional regulator / R.M. Jones, B. Britt-Compton, P.A. Williams // J. Bacteriol. -2003. V. 185. -P. 5847-5853.

251. Joon J.H. Halomonas marisflavae sp. nov., a halophilic bacterium isolated from the Yellow Sea in Korea / J.H. Joon, S.H. Choi, K.C. Lee et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 1171 -1177.

252. Jones D. The Genus Arthrobacter / D. Jones, R.M. Keddie // in Dworkin, Falkow, Rosenberg, Schleifer and Stackebrandt (Editors), The Prokaryotes,

253. A Handbook on the Biology of Bacteria, Springer-Verlag, New York. 2006. -V. 3. P. 945-960.

254. Kobama Y. Thalassospira tepidiphila sp. nov., a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacterium isolated from seawater / Kobama Y., Stiknowati L.I., Ueki A. et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V. 58. - P. 711-715.

255. Kalogeris E. Properties of catechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida immobilized in calcium alginate hydrogels / E. Kalogeris, Y. Sanakis, D. Mamma et al. II Enz. Microb. Technol. 2006. - V. 39. -P. 1113-1121.

256. Kampfer P. Janibacter anophelis sp. nov., isolated from the midgut of Anopheles arabiensis / P. Kampfer, O. Terenius, J.M. Lindh et al. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - V. 56. P. 389-392.

257. Kämpfer P. The Family Streptomycetaceae, Part I: Taxonomy. In Dworkin, Falkow, Rosenberg, Schleifer and Stackebrandt (Editors). The Prokaryotes, A Handbook on the Biology of Bacteria, Springer-Verlag, New York // 2006. -Vol. 3.-P. 538-604.

258. Kampfer P. Brevibacterium sandarakinum sp. nov., isolated from a wall of an indoor environment / Kampfer P., Schafer J., Lodders N., Busse H.J. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. - V. 60. P. 909-913.

259. Kanaly R.A. Biodegradation of high-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons by bacteria / R.A. Kanaly, S. Harayama // J. Bacteriol. 2000. -V. 182.-P. 2059-2067.

260. Kanaly R.A. Rapid mineralization of benzoa.pyrene by a microbial consortium growing on diesel fuel / R.A. Kanaly, R. Bartha, K. Watanabe et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 4205-4211.

261. Kasai Y. Bacteria belonging to the genus Cycloclasticus play a primary role in the degradation of aromatic hydrocarbons released in a marine environment /

262. Y. Kasai, K. Kishira, S. Harayama // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. -P. 5625-5633.

263. Kazunga C. Products from the incomplete metabolism of pyrene by polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria / C. Kazunga, M.D. Aitken // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V.66. - P. 1917-1922.

264. Keen N.T. Improved broad-host-range plasmids for DNA cloning in gramnegative bacteria / N.T. Keen, S. Tanaki, D. Kobayashi, D. Trollinger // Gene. -1988.-V. 70.-P. 191-197.

265. Keil H. Degradation of 4-chlorobenzoate by Pseudomonas sp. CBP3: induction of catabolic enzymes / H. Keil, U. Klages, F. Lingens // FEMS Microbiol. Lett. // 1981. V. 10. - P. 213-215.

266. Kelley I. Identification of metabolites from the degradation of fluoranthene by Mycobacterium sp. strain PYR-1 / I. Kelley, G.P. Freeman, F.E. Evans, C.E. Cerniglia // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 800-806.

267. Keuth S. Biodegradation of phenanthrene by Arthrobacterpolychromogenes isolated from a contaminated soil / S. Keuth, J.H. Rehm // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V.34. - P. 804-808.

268. Khmelenina V. N. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs / V. N. Khmelenina, M. G. Kalyuzhnaya, V. G. Sakharovsky et al. II Arch. Microbiol. 1999. - V. 172. - P. 321-329.

269. Kim C.K. Isolation of aromatic hydrocarbon-degrading bacteria and genetic characterization of their plasmid genes / C.K. Kim, J.W. Kim, T.I. Mheen // Kor. J. Microbiol. 1986. - V. 24. - P. 67-72.

270. Kim C.K. Structure of the pcbC gene encoding 2,3-dixydroxybiphenyl dioxygenase of Pseudomonas sp. P20 / C.-K. Kim, E. Kim, J.-C. Chae, Y. Kim // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 226. - P. 15-20.

271. Kim S. A novel bacterium that utilizes monochlorobiphenyls and 4 chlorobenzoate as growth substrates / S. Kim, F. W. Picardal // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 185. - P. 225-229.

272. Kim S. Microbial growth on dichlorobiphenyls chlorinated on both rings as a sole carbon and energy source / S. Kim, F. W. Picardal // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V.64. - P. 1953-1955.

273. Kim D. Functional characterization and molecular modeling of methylcatechol 2,3-dioxygenase from o-xylene-degrading Rhodococcus sp. strain DK17 / D. Kim, J.-C. Chae, J.Y. Jang et al. II Biochem. Biophys. Res. Commun. -2005.-V. 326. P.880-886.

274. Kim Y.M. Synergic degradation of phenanthrene by consortia of newly isolated bacterial strains / Y.M. Kim , C.K. Ahn , S.H. Woo et al. // J. Biotechnol. 2009. - V. 144. - P. 293-29.

275. King J.M.H. Rapid, sensitive, bioluminescent reporter technology for naphthalene exposure and biodégradation / J.M.H. King, P.M. DiGrazia, B. Applegate et al. II Science. 1990. - V. 249. - P. 778-781.

276. Kitagawa W. Cloning and characterization of benzoate catabolic genes in the gram-positive polychlorinated biphenyl dégrader Rhodococcus sp. strain RHA1 / W. Kitagawa, K. Miyauchi, E. Masai, M. Fukuda // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -P. 6598-6606.

277. Kiyohara H. Degradation of phenanthrene through o-phthalate by Aeromonas sp. / H. Kiyohara, K. Nagao, R. Nomi // Agric. Biol. Chem. 1976. -V. 40.-P. 1075-1082.

278. Kiyohara H. The catabolism of phenanthrene and naphthalene by bacteria / H. Kiyohara, K. Nagao // J. Gen. Microbiol. 1978. - V. 105. - P. 69-75.

279. Kiyohara H. Characterization of a phenanthrene degradation plasmid from Alcaligenes faecalis AFK2 / H. Kiyohara, N. Takizawa, H. Date, S. Torigoe, K. Yano // J. Ferment. Bioeng. 1990. - V. 69. - P. 54-56.

280. Klages U. Degradation of 4-chlorobenzoic acid by a Nocardia species / U. Klages, F. Lingens // FEMS Microbiol. Lett. 1979. - V.6. - P. 201-203.

281. Kleinsteuber S. Population dynamics within a microbial consortium during growth on diesel fuel in saline environments / S. Kleinsteuber, V. Riis, I. Fetzer et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - P. 3531-3542.

282. Kobama Y. Thalassospira tepidiphila sp. nov., a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacterium isolated from seawater / Y. Kobama, L.I. Stiknowati, A. Ueki et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V. 58. -P. 711-715.

283. Kobayashi K. Hydrolytic dehalogenation of 4-chlorobenzoic acid by an Acinetobacter sp. / K. Kobayashi, K. Hirayama, S. Tobita // Gen. Appl. Microbiol. 1997. -V. 43. - P. 105-108.

284. Kolar A. B. PCB-degrading potential of aerobic bacteria enriched from marine sediments / A.B. Kolar, D. Hrsak, S. Fingier et al. // Int. Biodeter. Biodegrad. 2007. - V. 60. - P. 16-22.

285. Kuhlmann A.U. Osmotically regulated synthesis of the compatible solute ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. / A.U. Kuhlmann, E. Bremer II Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - P. 772-783.

286. Kuhm A.E. Purification and characterization of dichloromuconate cycloisomerase from Alcaligenes eutrophus JMP134 / A.E. Kuhm, M. Schlömann, H-J. Knackmuss, D.H. Pieper // Biochem. J. 1990. - V. 266. - P. 877-883.

287. Kulakov L.A. Cloning and characterization of a novel c/s-naphthalene dihydrodiol dehydrogenase gene (narB) from Rhodococcus sp. NCIMB12038 / L.A. Kulakov, C.C.C.R. Allen, D.A. Lipscomb et al. // FEMS Microbiol. Lett. -2000.-V. 182.-P. 327-331.

288. Kulakov L.A. Web-type evolution of Rhodococcus gene clusters associated with utilization of naphthalene / L.A. Kulakov, S. Chen, C.C.C.R. Allen et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - P. 1754-1764.

289. Kurkela S. Cloning, nucleotide sequence and characterization of genes encoding naphthalene dioxygenase of Pseudomonas putida strain NCIB9816 / S. Kurkela, H. Lehvaslaiho, E. T. Palva et al. II Gene. 1988. - V. 73. - P. 355362.

290. Kustner D.J. Molecular adaptation of enzymes, metabolic systems and transport systems in halophilic bacteria / D.J. Kustner // FEMS Microbiol. Rev. -1986.-V. 39.-P. 121-127.

291. Laemmli V.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / V.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680685.

292. Larkin M.J. Purification and characterisation of a novel naphthalene dioxygenase from Rhodococcus sp. strain NCIMB 12038 / M.J. Larkin, C.C.R. Allen, L.A. Kulakov et al. II J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 6200-6204.

293. Laurie A. D. The phn genes of Burkholderia sp. strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbon catabolism / A.D. Laurie, G. Lloyd-Jones // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. -P. 531-540.

294. Layton A. C. Construction of a bioluminescent reporter strain to detect polychlorinated biphenyls / A.C. Layton, M. Muccini, M.M. Ghosh, G.S. Sayler // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 5023-5026.

295. Lechevalier M.P. Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance / M.P. Lechevalier // J. Lab. Clin. Med. 1968. - V. 71. - P. 934-944.

296. Lee J-C. Halomonas taeanensis sp. nov., a novel moderately halophilic bacterium isolated from a solar saltern in Korea / J.-C. Lee, C. Jeon, J.-M. Lim et al // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 2027-2032.

297. Leigh M.B. Polychlorinated biphenyl (PCB)-degrading bacteria associated with trees in a PCB-contaminated site / M.B. Leigh, P. Prouzova, M. Mackova et al. / Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V.72. - P. 2331-2342.

298. Leigh M.B. Biphenyl-utilizing bacteria and their functional genes in a pine root zone contaminated with polychlorinated biphenyls (PCBs) / M.B. Leigh, V.H. Pellizari, O. Uhlik et al. / The ISME Journal. 2007. - V. 1. - P. 134-148.

299. Lentzen G. Extremolytes: natural compounds from extremophiles for versatile applications / G. Lentzen, T. Schwarz // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2006.-V. 72.-P. 623-634.

300. Lerbach P.R. Enzyme recruitment in vitro: use of cloned genes to extend the range of haloaromatics degraded by Pseudomonas sp. strain B13 / P.R. Lerbach, J. Zeyer, W. Reineke et al. II J. Bacteriol. 1984. - V. 158. - P. 1025-1032.

301. Li J.-L. Effect of a commercial alcohol ethoxylate surfactant (C1M5E7) on biodégradation of phenanthrene in a saline water medium by Neptunomonas naphthovorans / J.-L. Li, R. Bai I ! Biodegradation. 2005. - V. 16. - P. 57-65.

302. Liu D. Amino acids in positions 48, 52, and 73 differentiate the substrate specificities of the highly homologous chlorocatechol 1,2-dioxygenases CbnA and TcbC / D. Liu, S. Ogawa, N. Senda et al. H J. Bacteriol. 2005. - V. 187. P. 54275436.

303. Liu C. Thalassospira xiamenensis sp. nov. and Thalassospira profundimaris sp. nov. / C. Liu, Y. Wu, L. Li et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. - V. 57. -P.316-320.

304. Lloyd-Jones G. Recombination of the bph (biphenyl) catabolic genes from plasmid pWWIOO and their deletion during growth on benzoate / G. Lloyd-Jones, C. de Jong, R.C. Ogden // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 691-696.

305. Loffler F. Identificacation of 4-chlorobenzoyl-coensyme A as intermediate in the dehalogenation catalyzed by 4-chlorobenzoate dehalogenase from Pseudomonas sp. CBS3 / F. Loffler, R. Muller // FEBS Lett. 1991. - V. 290. -P. 224-226.

306. Loffler F. Dehalogenation of 4-chlorobenzoate by 4-chlorobenzoate dehalogenase from Pseudomonas sp. CBS3: an ATP/coenzyme A dependent reaction / F. Loffler, R. Muller, F. Lingens // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1995.-V. 176. -P. 1106-1111.

307. Lambo A.J. Cometabolic degradation of polychlorinated biphenyls at low temperature by psychrotolerant bacterium Hydrogenophaga sp. IA3-A / A.J. Lambo, T.R. Patel // Curr. Microbiol. 2006. - V. 53. - P. 48-52.

308. Lopez-Lopez A. Thalassospira lucentensis gen. nov., sp. nov., a new marine member of the alpha-Proteobacteria / A. Lopez-Lopez, M. J. Pujalte, S. Benlloch et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. - P. 1277-1283.

309. Maltseva O.V. Degradation of anaerobic reductive dechlorination products of Aroclor 1242 by four aerobic bacteria / O.V. Maltseva, T.V. Tsoi, J.F. Quensen III etal. //Biodegradation. 1999. - V. 10. - P. 363-371.

310. Manoj K. A halotolerant and thermotolerant Bacillus sp. degrades hydrocarbons and produces tensio-active emulsifying agent / K. Manoj, L.V. Sisto

311. Materano, A. Ilzins et al. II J. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 23. - P. 211220.

312. Margesin R. Biodégradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme environments / R. Margesin, F. Schinner // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. -V. 56.-P. 650-663.

313. Marko M. A. A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder / M.A. Marko, R. Chipperfield, H.C. Birnboim // Analit. Biochem. 1982. - V. 121. - P. 382.

314. Marks T.S. The origin of the oxygen incorporated during the dehalogenation/hydroxylation of 4-chlorobenzoate by an Arthrobacter sp. / T.S. Marks, R. Wait, A.R. Smith, A.V. Quirk // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. -V. 124. - P. 669-674.

315. Martin K. Janibacter limosus gen. nov., sp. nov., a new actinomycete with meso-diaminopimelic acid in the cell wall / K. Martin, P. Schumann, F.A. Rainey et al. II Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 529-534.

316. Martinez-Canovas M.J. Halomonas ventosae sp. nov., a moderately halophilic, denitrifying, exopolysaccharide-producing bacterium / M.J. Martinez-Canovas, E. Quesada, I. Llamas et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. -V. 54.-P. 733-777.

317. Martínková L. Biodégradation potential of the genus Rhodococcus / L. Martínková, B. Uhnáková, M. Pátek et al. Il Environ. Int. 2009. - Y. 35. -P. 162-177.

318. Martins L.O. Accumulation of mannosylglycerate and di-wj^o-inositol-phosphate by Pyrococcus furiosus in response to salinity and temperature / L.O. Martins, H. Santos // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 32993303.

319. Masai E. Characterization of biphenyl catabolic genes of gram-positive polychlorinated biphenyl degrader Rhodococcus sp. strain RHA1 / E. Masai, A. Yamada, J. M. Healy et al II Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. -P. 2079-2085.

320. Mata J.A. A detailed phenotypic characterisation of the type strains of Halomonas species / J.A. Mata, J. Martinez-Canovas, E. Quesada et al. II System. Appl. Microbiol. 2002. - V. 25. - P. 360-375.

321. McLeod M.P. The complete genome of Rhodococcus sp. RHA1 provides insights into a catabolic powerhouse / M.P. McLeod, R.L. Warren, W.W. Hsiao et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103.-P.15582-15587.

322. Mellado E. Characterization of the basic replicon of pCMl, a narrow-hostrange plasmid from the moderate halophile Chromohalobacter marismortui / E. Mellado, J.A. Asturias, J.J. Nieto et al II J. Bacteriol. 1995. - V. 177. -P. 3443-3450.

323. Menn F.M. NAH plasmid-mediated catabolism of anthracene and phenanthrene to naphthoic acid / F.M. Menn, B.M. Applegate, G.S. Sayler // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 1938-1942.

324. Merlin C. Organization of the bph gene cluster of transposon Tn4371, encoding enzymes for the degradation of biphenyl and 4-chlorobiphenyl compounds / C. Merlin, D.S Pringael, M. Mergeay, A. Toussaint //Mol. Gen. Genet. 1997. - V. 253. - P. 499-506.

325. Merril C.R. Ultrasensitive stain for proteins in Polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins / C.R. Merril, D. Goldman, S.A. Sedman, M.H. Ebert // Science. 1981. - V. 211. - P. 1437-1438.

326. Mille G. Effect of salinity on petroleum biodégradation / G. Mille, M. Almallah, M. Bianchi et al. II Fresenius J. Anal. Chem. 1991. - V. 339. -P. 788-791.

327. Minai-Tehrani D. Effect of salinity on biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) of heavy crude / D. Minai-Tehrani, S. Minoui, A. Herfatmanesh // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2009. -V. 82. - P. 179-184.

328. Minnikin D.E. Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin-layer chromatographic analysis of whole-cell methanolysates / D.E. Minnikin, L. Alshamaony, M. Goodfellow // J. Gen.Microbiol. 1975. -V. 88. - P. 200-204.

329. Mohn W.W.M. Microbial reductive dehalogenation / W.W. Mohn, J. M. Tiedje // Microbiol. Rev. 1992. - V. 56. - P. 482-507.

330. Mondello, F.J. Cloning and expression in Escherichia coli of Pseudomonas strain LB400 genes encoding polychlorinated biphenyl degradation / F.J. Mondello //J. Bacterid. 1989.-V. 171.-P. 1725-1732.

331. Morawsky B. 2-naphthoate catabolic pathway in Burkholderia strain JT 1500 / B. Morawsky, R.W. Eaton, T. Rossiter, S. Guoping, H. Griengl, D.W. Ribbons // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 115-121.

332. Mouz S. A GntR-like negative regulator of the biphenyl degradation genes of the transposon Tn4371 / S. Mouz, C. Merlin, D. Springael, A. Toussaint // Mol. Gen. Genet. 1999. - V. 262. - P. 790-799.

333. Mukerjee-Dhar G. Degradation of polychlorinated biphenyl by cells of Rhodococcus opacus strain TSP203 immobilized in alginate and in solution / G. Mukerjee-Dhar, M. Shimura, K. Kimbara // Enz. Microb. Technol. 1998. -V. 23.-P. 34-41.

334. Muller R. Enzymatic dehalogenation of 4-chlorobenzoate by extracts from Arthrobacter sp. SU DSH 20407 / R. Muller, R.H. Oltmanns, F. Lingens // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 1988. - V. 369. - P. 567-571.

335. Muller R. Incorporation of lsO. water into 4-hydroxybenzoic acid in the reaction of 4-chlorobenzoate dehalogenase from Pseudomonas sp. CBS3 / R. Muller, J. Thiele, U. Klages, F. Lingens II Biochem. Biophys. Res. Commun. -1984.-V. 124.-P. 178-182.

336. Mumtaz M. Toxicological profile for polycyclic aromatic hydrocarbons / M. Mumtaz // U.S. department of health and human services. 1995. - P. 487.

337. Nagata S. Intracellular changes in ions and organic solutes in halotolerant Brevibacterium sp. strain JCM 6894 after exposure to hyperosmotic shock / S. Nagata, K. Adachi, H. Sano // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 68. -P. 3641-3647.

338. Nakatsu C. Chlorobenzoate catabolic transposon Tn5271 is a composite class I element with flanking class II insertion sequences / C. Nakatsu, J. Ng, R. Singh, N. Straus, C. Wyndham // Microbiology. 1991. - V. 88. - P. 83128316.

339. Nakatsu C. H. The c/s-diol dehydrogenase cbaC gene of Tn5271 is required for growth on 3-chlorobenzoate but not 3,4-dichlorobenzoate / C. H. Nakatsu, M. Providenti, R. C. Wyndham // Gene. 1997. - V. 196. - P. 209-218.

340. Nakayama H. Ectoine, the compatible solute of Halomonas elongata, confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells / H. Nakayama, K. Yoshida, H. Ono et al. II Plant. Physiol. 2000. - V. 122. - P. 1239-1248.

341. Natarajan M.R. Dechlorination of polychlorinated biphenyl congeners by an anaerobic microbial consortium / M.R. Natarajan, W.-M. Wu, J. Nye et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 46. - P. 673-677.

342. Neilson A.H. The biodégradation of halogenated organic compounds /

343. A.H. Neilson // J. Appl. Bacteriol. 1990. - V. 69. - P. 445-470.

344. Nicholson C.A. Aerobic biodégradation of benzene and toluene under hypersaline conditions at the Great Salt Plains, Oklahoma / C.A. Nicholson,

345. B.Z. Fathepure // FEMS Microbiol. Lett. 2005. - V. 245. - P. 257-262.

346. Nicholson C.A. Biodégradation of benzene by halophilic and halotolerant bacteria under aerobic conditions / C.A. Nicholson, B.Z. Fathepure // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 1222-1225.

347. Nishi A. A 90-kilobase conjugative chromosomal element coding for biphenyl and salicylate catabolism in Pseudomonas putida KF715 / A. Nishi, K. Tominaga, K. Furukawa // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1949-1955.

348. Nishimori E. Pseudomonas plecoglossicida sp. nov., the causative agent of bacterial haemorrhagic ascites of ayu, Plecoglossus altivelis / Nishimori E., K. Kita-Tsukamoto, H. Wakabayhi // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. -.V. 50. - P. 83-89.

349. Oda Y. Acquisition of the ability for Rhodopseudomonas palustris to degrade chlorinated benzoic acids as the sole carbon source / Y. Oda, Y.P. de Vries, LJ. Forney, J.C. Gottschal // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. - V. 38.-P. 133-139.

350. Oesterhelt D. Decomposition of halogenated hydrocarbons by halophilic bacteria / D. Oesterhelt, H. Patzelt, B. Kesler // Patent DE19639894 1998.

351. Ohtsubo Y. BphS, a key transcriptional regulator of bph genes involved in polychlorinated biphenyl/biphenyl degradation in Pseudomonas sp. KKS102 /

352. Y. Ohtsubo, M. Delawary, K. Kimbara et al. II Biol. Chem. 2001. - V. 276. -P. 36146-36154.

353. Okamoto T. Zymobacter palmae gen. nov., sp. nov., a new ethanol-fermenting peritrichous bacterium isolated from palm sap / T. Okamoto, H. Taguchi, K. Nakamura et al. II Arch. Microbiol. 1993. - V. 160. - P. 333-337.

354. Ono H. Characterization of biosynthetic enzymes for ectoine as a compatible solute in a moderately halophilic eubacterium, Halomonas elongate / H. Ono, K. Sawada, N. Khunajakr et al. //J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 91-99.

355. Onraedt A. Dynamics and optimal conditions of intracellular ectoine accumulation in Brevibacterium sp. / A. Onraedt, B. Walcarius , W. Soetaert et al. Il Commun. Agric. Appl. Biol. Sci. 2003. - V. 68. - P. 241-246.

356. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism / A. Oren // Microbiol. Molec. Biol. Rev. 1999. - V. 63. - P. 334-348.

357. Oren A. Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations/ A. Oren, P. Gurevich, M. Azachi et al. Il Biodégradation. 1992. V. 3. - P. 387398.

358. Oren A. Microbial life at high salt concentration: phylogenetic and metabolic diversity / A. Oren // Saline Systems. 2008. - V. 4. - P. 1-13.

359. Ornston L.N. The conversion of catechol and protocatechuate to èeta-ketoadipate by Pseudomonas putida. Enzymes of catechol pathway / L.N. Ornston // J. Biol. Chem. 1966. - V. 166. - P. 9-14.

360. Osorio K.R. Arthrobacter rhombi sp. nov., isolated from Greenland halibut (Reinhardtius hippoglossoldes) / K.R. Osorio, J.L. Barja, R.A. Hutson, M.D. Collins II Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - V. 49. - P. 1217-1220.

361. Overhage J. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate / J. Overhage, S. Sielker, S. Homburg, K. Parschat, S. Fetzner // Microbiology. 2005. - V. 151. - P. 491500.

362. Owen R.J. The thermal denaturation of partly purified bacterial deoxyribonucleic acid and its taxonomic applications / R.J. Owen, S.P. Lapage // J. Appl. Bacteriol. 1976. - V. 41. - P. 335-340.

363. Parales R.E. Substrate specificity of naphthalene dioxygenase: effect of specific amino acids at the active site of the enzyme / R.E. Parales, K. Lee, S.M. Resnick et al. II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1641-1649.

364. Parales R. Regioselectivity and enantioselectivity of naphthalene dioxygenase during arene m-dihydroxylation: control by phenylalanine 352 in the a subunit / R. Parales, S.M. Resnick, C.-L. Yu et al. II J. Bacteriol. 2000. -V.182. - P. 5495-5504.

365. Parales R. E. The role of active-site residues in naphthalene dioxygenase / R.E. Parales // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 30. - P. 271-278.

366. Parke D. Application of p-toluidine in chromogenic detection of catechol and protocatechuate, diphenolic intermediates in catabolism of aromatic compounds / D. Parke // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 26942697.

367. Patel T.R. Bacterial cys-dihydrodiol dehydrogenase of Pseudomonas putida /T.R. Patel, D.T. Gibson // J. Bacteriol. 1974. - V. 119. - P. 879-888.

368. Patrauchan M.A. Catabolism of benzoate and phthalate in Rhodococcus sp. strain RHA1: redundancies and convergence / M.A. Patrauchan, C. Florizone, M. Dosanjh et al. II J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - P. 4050-4063.

369. Peloquin L. Cloning and expression of the polychlorinated biphenyl-degradation gene cluster from Arthrobacter M5 and comparison to analogous genes from gram-negative bacteria / L. Peloquin, C.W. Greer // Gene. — 1993. — V. 125.-P. 35-40.

370. Pieper D.H. Aerobic degradation of polychlorinated biphenyls / D.H. Pieper // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 67. - P. 170-191.

371. Pieper D.H. Bacterial metabolism of polychlorinated biphenyls / D.H. Pieper, M. Seeger // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2008. - V. 15. - P. 121— 138.

372. Potrawfke T. Degradation of 1,2,3,4-tetrachlorobenzene by Pseudomonas chlororaphis RW71 / T. Potrawfke, K.N. Timmis, R.M. Wittich // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -V. 64. P. 3798-3806.

373. Prabhu J. Functional expression of the ectoine hydroxylase gene (thpD) from Streptomyces chrysomallus in Halomonas elongate / J. Prabhu, F. Schauwecker, N. Grammel et al. //Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. -P. 3130-3132.

374. Pumphrey G.M. Naphthalene metabolism and growth inhibition by naphthalene in Polaraomonas naphthlenivorans strain CJ2 / G.M. Pumphrey,

375. E.L. Madsen // Microbiology. 2007. - V. 153. - P. 3739-3747.

376. Quesada E. Numerical taxonomy of moderately halophilic gram-negative bacteria from hypersaline soils / E. Quesada, A. Ventosa, F. Rodrigues-Valeraamos-Cormenzana // J. Gen. Microbiol. 1983. - V. 129. - P. 2649-2657.

377. Quesada E. Types and properties of some bacteria isolated from hypersaline soils. / E. Quesada, A. Ventosa, F. Rodrigues-Valera, A. Ramos-Cormenzana // J. Appl. Bacteriol. 1982. - V. 53. - P. 155-161.

378. Radice F. Cloning of the Arthrobacter sp. FG1 dehalogenase genes and construction of hybrid pathways in Pseudomonas putida strains / F. Radice, V. Orlandi, V. Massa et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 75. -P. 1111-1118.

379. Rainey F.A. Dietzia, a new genus including Dietzia maris comb, nov., formerly Rhodococcus maris / Rainey F.A., S. Klatte S., R.M. Kroppenstedt, E. Stackebrandt / Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. - V. 45. - P. 32-36.

380. Raschke H. Biotransformation of various substituted aromatics compounds to chiral dihydrodihydroxy derivatives / H. Raschke, M. Meier, J.G. Burken et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 3333-3339.

381. Reineke W. Microbial degradation of haloaromatics / W. Reineke, H.J. Knackmuss II Ann. Rev. Microbiol. 1988. - V.42. - P. 263-287.

382. Reineke W. Development of hybrid strains for the mineralization of chloroaromatics by patchwork assembly / W. Reineke // Annu. Rev. Microbiol. -1998. V.52. - P. 287-331.

383. Reng R.-H. Microbial biodégradation of polyaromatic hydrocarbons / R.-H. Peng, A.-S. Xiong, Y. Xue et al. IIFEMS Microbiol. Rev. 2008. - V. 32. -P.927-955.

384. Resnick S.M. Diverse reactions catalyzed by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp strain NCIB 9816 / S.M. Resnick, K. Lee, D.T. Gibson // J. Ind. Microbiol. 1996. - V. 17. - P. 438-457.

385. Rheinwald J. A transmissible plasmids controlling camphor oxidation in Pseudomonas putida / J. Rheinwald, A.M. Chakrabarty, I.C. Gunsalus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - V. 70. - P. 885-889.

386. Rhykerd R.L. Influence of salinity on bioremediation of oil in soil / R.L. Rhykerd, R.W. Weaver, K.J. Mclnnes // Environ. Pollut. 1995. - V. 90. -P. 127-130.

387. Roberts M.F. Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms / M.F. Roberts // Saline Systems. 2005. - P. 1-30.

388. Rodrigues J.L. Development of a Rhodococcus recombinant strain for degradation of products from anaerobic dechlorination of PCBs / J.L. Rodrigues , O.V. Maltseva , T.V. Tsoi et al. II Environ. Sci. Technol. 2001. - V. 15. -P. 663-668.

389. Rodrigues J.L. Degradation of Aroclor 1242 dechlorination products in sediments by Burkholderia xenovorans LB400(ohb) and Rhodococcus sp. strain

390. RHAl(/cö) / J.L. Rodrigues, C.A. Kachel, M.R. Aiello et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - P. 2476-2482.

391. Romanov V. Pseudomonas aeruginosa 142 uses a three-component ortho-halobenzoate 1,2-dioxygenase for metabolism of 2,4-dichloro- and 2-chlorobenzoate / V. Romanov, R.P. Hausinger // J. Bacteriol. — 1994. V. 176. -P. 3368-3374.

392. Romine M.F. Complete sequence of a 184-kilobase catabolic plasmid from Sphingomonas aromaticivorans Fl 99 / M.F. Romine, L.C. Stillwell, K.-K Wong et al. II J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 1585-1602.

393. Rossello-Mora R.A. Comparative biochemical and genetic analysis of naphthalene degradation among Pseudomonas stutzeri strains / R.A. Rossello-Mora, J. Laluoat, E. Garoia-Valdes // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. -P. 966-972.

394. Sakai M. Diversity of 2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenase genes in a strong PCB degrader, Rhodococcus sp. strain RHA1 / M. Sakai, E. Masai, H. Asami et al. II J. Biosci. Bioeng. 2002. - V. 93. - P. 421-427.

395. Sayler G.S. Catabolic plasmids of environmental and ecological significance / G.S. Sayler, S.W. Hooper, A.C. Layton, J.M. Henry King // Microb. Ecol. 1990. - V. 19.-P. 1-20.

396. Samanta S.K. Degradation of phenanthrene by different bacteria: evidence for novel transformation sequences involving the formation of 1-naphtol / S.K. Samanta, A.K. Chakrabarti, R.K. Jain // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 53.-P. 98-107.

397. Sánchez-Porro C. Chromohalobacter japonicus sp. nov., a moderately halophilic bacterium isolated from a Japanese salty food / C. Sánchez-Porro,

398. H. Tokunaga, M. Tokunaga, A. Ventosa // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. -V. 57. - P. 2262-2266.

399. Sandu C. Plasmids for nicotine-dependent and -independent gene expression in Arthrobacter nicotinovorans and other arthrobacter species / C. Sandu, C.B. Chiribau , P. Sachelaru, R. Brandsch // Appl. Environ. Microbiol. 2005. -V. 71.-P. 8920-8924.

400. Sanseverino J. Plasmid-mediated mineralization of naphthalene, phenanthrene, and anthracene / J. Sanseverino, B.M. Applegate, J.M.H. King, G.S. Sayler // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 1931-1937.

401. Santos P.M. New broad-host-range promoter probe vectors based on the plasmid RK2 replicon / P.M. Santos, I.D. Bartolo, J.M. Blatny et al. // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 195. - P. 91-96.

402. Savard P. Cloning of Pseudomonas sp. strain CBS3 genes specifying dehalogenation of 4-chlorobenzoate / P. Savard, L. Peloquin, M. Sylvestre // J. Bacteriol. 1986. - V. 168. - P. 81-85.

403. Skerman V.B.D. Approved Lists of Bacterial Names / Skerman V.B.D., V. McGowan, P.H.A. Sneath (editors) // Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. - V. 30. -P. 225-420.

404. Schippers A. Microbacterium oleivorans sp. nov. and Microbacterium hydrocarbonoxydans sp. nov., novel crude-oil-degrading gram-positive bacteria / A. Schippers, K. Bosecker, C. Sproer et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. -V. 55.-P. 655-660.

405. Schleifer K. H. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications / K. H. Schleifer K.H., Kandier O. // Bacteriol. Rev. -1972. V. 36.-P. 407-477.

406. Schmitz A. Cloning and sequence analysis of genes for dehalogenation of 4 chlorobenzoate from Arthrobacter sp. strain SU / A. Schmitz, K.-N. Gartemann, J. Fielder et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 4068-4071.

407. Schneider J. Degradation of pyrene, benza.anthracene and benz[a]pyrene by Mycobacterium sp. strain RJGII-135, isolated from coal gasification site / J. Schneider, R. Grosser, K. Jayasihulu et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1996. -V. 62. - P. 13-19.

408. Schölten J.D. Novel enzymic hydrolytic dehalogenation of a chlorinated aromatic / J.D. Schölten, K.-H. Chang, P.C. Babbit et al. II Science. 1991.-. V. 253.-P. 182-185.

409. Seah S.Y.K. Comparative specificities of two evolutionarily divergent hydrolases involved in microbial degradation of polychlorinated biphenyls / S.Y.K. Seah, G. Labbe, S.R. Kaschebek et al. II J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -P. 1511-1516.

410. Seo J-S. Bacterial degradation of aromatic compounds / J-S. Seo, Y-S. Keum, Q.X. Li // Int. J. Environ. Res. Public. Health. 2009. -V. 6. -P. 278-309.

411. Seeger M. Dehalogenation, denitration, dehydroxylation, and angular attack on substituted biphenyls and related compounds by a biphenyl dioxygenase / M. Seeger, B. Camara, B. Hofer // J. Bacteriol. -2001. V. 183. - P. 3548-3555.

412. Seto M. A novel transformation of polychlorinated biphenyls by Rhodococcus sp. strain RHA1 / M. Seto, K. Kimbara, M. Shimura et al. Il Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 3353-3358.

413. Sevastsyanovich Y.R. Diversity of IncP-9 plasmids of Pseudomonas / Y.R. Sevastsyanovich, R. Krasowiak, L.E.H. Bingle et al. II Microbiology. 2008. -V. 154.-P. 2929-2941.

414. Sharak Genthner B.R. Preliminary characterization of four 2-chlorobenzoate-degrading anaerobic bacterial consortia / B.R. Sharak Genthner, G. Mundfrom, R. Devereux /- Biodégradation. 1999. - V.10. - P. 27-33.

415. Shen X.-H. Functional identification of novel genes involved in the glutathione-independent gentisate pathway in Corynebacterium glutamicum / X.-H. Shen, C.-Y. Jiang, Y. Huang et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71.-P. 3442-3452.

416. Shimao M. Degradation of 4-chlorobenzoate by facultatively alcalophilic Arthrobacter sp. strain SB8 / M. Shimao, S. Onishi, S. Mizumori, N. Kato, C. Sakazawa // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V. 55. - P. 478-482.

417. Shimizu S. Characterisation of the 450-kb linear plasmid in a polychlorinated biphenyl degrader, Rhodococcus sp. strain RHA1 / S. Shimizu,

418. H. Kobayashi, E. Masai, M. Fucuda // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. -P. 2021-2028.

419. Shindo K. Synthesis of highly hydroxylated aromatics by evolved biphenyl dioxygenase and subsequent dihydrodiol dehydrogenase / K. Shindo , Y. Shindo , T. Hasegawa et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 75. - P. 10631069.

420. Shuttlworth K.L. Bacterial degradation of low concentrations of phenanthrene and inhibition by naphthalene / K.L. Shuttlworth, C.E. Cerniglia // Microbial Ecology. 1996. - №31. - P. 305-317.

421. Sierra I. Study of the biodégradation process of polychlorinated biphenyls in liquid medium and soil by a new isolated aerobic bacterium (Janibacter sp.) /

422. Sierra, J.L. Valera, M.L. Marina et al. II Chemosphere. 2003. - Y.53. - P. 609618.

423. Simon M.J. Sequences of genes encoding naphthalene dioxygenase in Pseudomonas putida strains G7 and NCIB9816-4 / M.J. Simon, T.D. Osslund, R. Saunders et al. II Gene. 1993. - V. 127. - P. 31-37.

424. Sisto A. Molecular characterization of bacteria isolated from waste electrical transformer oil / A. Sisto, E. Fusella, H. Urbina et al. II Moscow University Chemistry Bulletin. 2008. - V.63. - P. 120-125.

425. Skerman V.B.D. Approved Lists of Bacterial Names / V.B.D. Skerman, V. McGowan P.H.A. Sneath (editors) // Int. J. Syst. Bacterid. 1980. - V. 30. -P. 225-420.

426. Smith L.T. An osmoregulated dipeptide in stressed Rhizobium meliloti / L.T. Smith, G. M. Smith // J. Bacteriol. 1989 - V. 171. - P. 4714-4717.

427. Smith M.R. The biodégradation of aromatic hydrocarbons by bacteria / M.R. Smith // Biodégradation. 1990. - V. 1. - P. 191-206.

428. Sondossi M. Metabolism of 2,2'- and 3,3'-dihydroxybiphenyl by the biphenyl catabolic pathway of Comamonas testosteroni B-356 / M. Sondossi, D. Barriault, M. Sylvestre // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 70. - P. 174181.

429. Sotsky J.B. Frequency of genes in aromatic and aliphatic hydrocarbon pathways within bacterial populations from Alaskan sediments / J.B. Sotsky, C.W. Greer, R.M. Atlas // Can. J. Microbiol. 1994. - V.40. - P. 981-985.

430. Springael D. Occurrence of Tn43 71-related mobile elements and sequences in (chloro)biphenyl-degrading bacteria / D. Springael, A. Ryngaert, C. Merlin et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 42-50.

431. Stapleton R.D. Biodégradation of aromatic hydrocarbons in an extremely acidic environment / R.D. Stapleton, D.C. Savage, G.S. Sayler et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1998-V. 64 - P. 4180-4184.

432. Stoker G.N. In vivo gene expression systems in prokaryotes. In: Transcription and translation. A practical approach / G.N. Stoker, J.M. Pratt, B. Holland (Hames B.D., Higgins S .J., eds). IRL Press. Oxford-Washington. -1984.-P. 153-177.

433. Stope M.B. Cometabolic ring fission of dibenzofuran by gram-negative and gram-positive biphenyl-utilizing bacteria / M.B. Stope, D. Becher, E. Hammer, F. Schauer// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 59. - P. 62-67.

434. Strachan P.D. Purification and characterization of catechol 1,2-dioxygenase from Rhodococcus rhodochrous NCIMB 13259 and cloning and sequencing of its catA gene / P.D. Strachan, A.A. Freer, C.A. Fewson // Biochem. J. 1998. -V. 333. - P. 741-747.

435. Stringfellow W.T. Comparative physiology of phenanthrene degradation by two dissimilar pseudomonads isolated from a creosol-contaminated soil / W.T. Stringfellow, M.D. Atken // Can. J. Microbiol. 1994. - V. 40. - P. 432-438.

436. Suen W.-T. Isolation and preliminary characterization of the subunits of the terminal component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas putida NCIB 9816-4 / Suen W.-T., Gibson D.T. II J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 58775881.

437. Suenaga H. Directed evolution of biphenyl dioxygenase: emergence of enhanced degradation capacity for benzene, toluene, and alkylbenzenes / H. Suenaga, M. Mitsuoka, Y. Ura et al. II J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -P. 5441-5444.

438. Suenaga H. Alteration of regiospecificity in biphenyl dioxygenase by active-site engineering / H. Suenaga, T. Watanabe, M. Sato et al. II J. Bacteriol. 2002. -V. 184.-P. 3682-3688.

439. Suenaga H. Active-site engineering of biphenyl dioxygenase: effect of substituted amino acids on substrate specificity and regiospecificity / H. Suenaga, M. Goto, K. Furukawa //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 71. -P. 168-176.

440. Suzuki K. Expression of 1,2-halobenzoate dioxygenase genes (<cbdSABC) involved in the degradation of benzoate and 2-halobenzoate in Burkholderia sp. TH2 / K. Suzuki, N. Ogawa, K. Miyashita // Gene. 2001. - V.262. - P.137-145.

441. Sylvestre M. Isolation and preliminary characterization of a 2-chlorobenzoate degrading Pseudomonas / M. Sylvestre, K. Mailhiot, O. Ahmad, R. Masse // Can. J. Microbiol. 1989. - V. 35. - P. 439-443

442. Tagger S. Preliminary study on relationship among strains forming a bacterial community selected on naphthalene from a marine sediment / S. Tagger, N. Truffaut, J. Le Petit // Can. J. Microbiol. 1990. - V. 36. - P. 676-681.

443. Takeda H. Characterization of transcriptional regulatory genes for biphenyl degradation in Rhodococcus sp. strain RHA1 / H. Takeda, A. Yamada, K. Miyauchi et al. II J. Bacteriol. 2004. - V.186. - P. 2134-2146.

444. Takeuchi M. Proposal of the genus Sphingomonas sensu stricto and three new genera, Sphingobium, Novosphingobium and Sphingopyxis, on the basis of phylogenetic and chemotaxonomic analyses / M. Takeuchi, K. Hamana,

445. A. Hiraishi // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001. -V. 51. P. 1405-1417.

446. Takeuchi M. Rhodococcus jostii sp. nov., isolated from a medieval grave / M. Takeuchi, K. Hatano, I. Sedla et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. -V. 52.-P. 409-413

447. Takizawa N. Identification and characterization of genes encoding polycyclic aromatic hydrocarbon dioxygenase in Pseudomonas putida OUS82 / N. Takizawa, N. Kaida, S. Torigoe et al. II J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 24442449.

448. Takizawa N. Nucleotide sequences and characterization of genes encoding naphthalene upper pathway of Pseudomonas aeruginosa PaKl and Pseudomonas putida OUS82 / N. Takizawa, T. Iida, T. Sawada et al. II J. Biosci. Bioeng. 1999. -Y. 87.-P 723-731.

449. Talibart R. Transient accumulation of glycine betaine and dynamics of endogenous osmolytes in salt-stressed cultures of Sinorhizobium meliloti / R. Talibart, M. Jebbar, K. Gouffi et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. -V. 63.-P. 4657^4663.

450. Tarn N.F.Y. Preliminary study on biodégradation of phenanthrene by bacteria isolated from mangrove sediments in Hong-Kong / N.F.Y. Tam, C.L. Guo, W.Y. Yau, Y.S. // Mar. Poll. Bull. 2002. - V. 42. - P. 316-324.

451. Thompson I.P. Response of soil microbial communities to single and multiple doses of an organic pollutant / I.P. Thompson, M.J. Bailey, R.J. Ellis et al. II Soil Biol. Biochem. 1999. - V. 31. - P. 95-105.

452. Timmis K.N. Plasmids in bacteria / K.N. Timmis, P.R. Lehrbach // L. Plenum Press. 1985. - P. 290.

453. Treadway S.L. Isolation and characterization of indene bioconversion genes from Rhodococcus strain 124 / S.L. Treadway, K.S. Yanagimachi, E. Lankenau et al. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 51. - P. 786-793.

454. Trigo A. Systemic approaches to biodégradation / A. Trigo , A. Valencia , I. Cases II FEMS Microbiol. Rev. 2009. - V. 33. - P. 98-108.

455. Tsukiura H. Proceomycin, a new antibiotic / Tsukiura H., M. Okanishi, H. Koshiyama // Journal of Antibiotics (Tokyo). 1964. - V. 17. - P. 223-229.

456. Tropel D. Bacterial transcriptional regulators for degradation pathways of aromatic compounds / D. Tropel, J.R. van der Meer // Microbiol. Mol. Rev. -2004.-V. 68.-P. 474-500.

457. Tros M. E., Schraa G., Zehnder A. Transformation of low concentrations of 3-chlorobenzoate by Pseudomonas sp. strain B13: Kinetics and residual concentrations // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 437-442.

458. Truper H.G. Biosynthesis and fate of compatible solutes in extremely halophilic phototrophic eubacteria / H.G. Truper, E.A. Galinski // FEMS Microbiol. Rev. 1990. - V. 75. - P. 247-254.

459. United State Environmentel Protection Agency. Polycyclic Aromatic Hydrocarbons(PAHs), 2008,http:www.epa.gov/osw/hazard/wastemin/priority.htm

460. Unterman R. A history of PCB biodégradation / R. Unterman // Bioremediation. Principles and Applications / Eds. Crawford R.L., Crawford D.L. 1996.-P. 209-253.

461. Urgun-Demirtas M. 2-chlorobenzoate biodégradation by recombinant Burkholderia cepacia under hypoxioc conditions in a membrane bioreactor / Urgun-Demirtas M, Stark B, Pagilla K. // Wat. Environ. Res. -2005. V. 77. -P. 511-518.

462. Vaillancourt F.H. The mechanism-based inactivation of 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenase by catecholic substrates / F.H. Vaillancourt, G. Labbe, N.M. Droouin et al. II J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. -P. 2019-2027.

463. Vandamme P. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics / P. Vandamme, B. Pot, M. Gillis et al. / Microbiol. Rev. 1996. -V. 60. - P. 407-438. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC239450/pdf/ 600407.pdf

464. Van de Peer Y. TREECON for Windows a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, R. De Wächter // Comput. Appl. Biosci. 1994. -V. 10.-P. 569-570.

465. Van der Meer J.R. Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobiotic compounds / J.R. van der Meer, W.M. de Vos, S. Harayama et al. Il Microbiol. Rev. 1992. - V. 56. - P. 677-694.

466. Vargas C. Ectoines as compatible solutes and carbon and energy sources for the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens / C. Vargas, M. Jebbar, R. Carrasco et al II J. Appl. Microbiol. 2006. - V. 100. - P. 98-107.

467. Ventosa A. Biology of halophilic aerobic bacteria / A. Ventosa, J.N. Joaquhn, A. Oren. // Microbiol. Molec.Biol. Rev. 1998. - V. 2. - P. 504544.

468. Ventosa A. Biotechnological applications and potentialities of halophilic microorganisms / A. Ventosa, J.J. Nieto // J. Microbiol. Biotechnol. 1995. -V. 11.-P. 84-95.

469. Versalovic J. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction / J. Versalovic, M. Schneider, F.J. de Bruijn et al. II Meth. Cell. Mol. Biol. 1994. - V. 5. - P. 25-40.

470. Vezina J. Family shuffling of soil DNA to change the regiospecificity of Burkholderia xenovorans LB400 biphenyl dioxygenase / J. Vezina, D. Barriault, M. Sylvestre // J. Bacteriol. 2007. - V. 189. - P. 779-788.

471. Vreeland R.H. Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria / R.H. Vreeland, C.D. Litchfield, E.L. Martin et al. II Int. J. Syst. Bacteriol. 1980. -V. 30. - P. 485-495.

472. Wagner-Dobler I. Microcosm enrichment of biphenyl-degrading microbial communities from soils and sediments / I. Wagner-Dobler, A. Bennasar, M. Vancanneyt et al II Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64. - P. 3014-3022.

473. Walter U. Degradation of pyrene by Rhodococcus sp. UW1 / U. Walter, M. Beyer, J. Klein, H-J. Rehm // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V.34. -P. 671-676.

474. Wang C.-L. Production of catechol from benzoate by the wild strain Ralstonia species Ba-0323 and characterization of its catechol 1,2-dioxygenase /

475. C.-L. Wang, S. Takenaka, S. Murakami, K. Aoki // Bioci. Biotechnol. Biochem. -2001. V.65. — P.1957-1964.

476. Wang C.-L. Purification and characterization of a novel catechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas aeruginosa with benzoic acid as carbon source / C.-L. Wang, S.-L. You, S.-L. Wang // Process Biochemistry. 2006. -V.41. -P.1594-1601.

477. Ward D.M. Hydrocarbon biodégradation in hypersaline environments /

478. D.M. Ward, T.D. Brock // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 35. - P. 353359.

479. Watanabe T. Versatile transcription of biphenyl catabolic bph operon in Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 / T. Watanabe, R. Inoue, N. Kimura, K. Furukawa // J. Bacteriol. 2000. - V. 275. - P. 31016-31023.

480. Wayne L.G. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics / L.G. Wayne, D.J. Brenner, R.R. Colwell et al. II Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. - V. 37. - P. 463-464.

481. Weinberger M. Plasmid-determined 2-hydroxypyridine utilization by Arthrobacter crystallopoites / M. Weinberger, P.E. Kolenbander // Can. J. Microbiol. 1979. - V.25. - P. 329-334.

482. Williams P.A. Metabolism of naphthalene, 2-methylnaphthalene, salicylate, and benzoate by Pseudomonas PG: tangential pathways / P.A. Williams, F.A. Catteral, K. Murray // J. Bacteriol. 1975. - V. 124. - P. 679-685.

483. Williams W.A. A phylogenetic analysis of aerobic polychlorinated biphenyl-degrading bacteria / W.A. Williams, J.H. Lobos, W.E. Cheetham // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 207-210.

484. Wittich R.M. Growth of the genetically engineered strain Cupriavidus necator RW112 with chlorobenzoates and technical chlorobiphenyls / R.M. Wittich, P. Wolff//Microbiology.-2007.- V. 153.-P. 186-195.

485. Wood T.K. Molecular approaches in bioremediation / T.K. Wood // Curr. Opin. Biotechnol. 2008. - V. 19. - P. 572-578.

486. Yamada A. Two nearly identical aromatic compound hydrolase genes in a strong polychlorinated biphenyl degrader, Rhodococcus sp. strain RHA1 /

487. A. Yamada, H. Kishi, K. Sugiyama et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1998. -V. 64. - P. 2006-2012.

488. Yanish-Perron C. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequence of the M13, pUC18 and pUC19 vectors / C. Yanish-Perron, J. Vieira, C. Messing // Gene. 1985. - V. 33. - P. 103-119.

489. Yang X. Biodegradation of seven polychlorinated biphenyls by a newly isolated aerobic bacterium (Rhodococcus sp. R04) / X. Yang, Y. Sun, S. Qian // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2004. - V. 31. - P. 415-420.

490. Yang X. Characterization and functional analysis of a novel gene cluster involved in biphenyl degradation in Rhodococcus sp. strain R04 / X. Yang, X. Liu, L. Song et al. H J. Appl. Microbiol. 2007. - V. 103. - P. 2214-2224.

491. Yang Y. Metabolism of naphthalene, fluorene and phenanthrene: preliminary characterization of a cloned gene cluster from in Pseudomonas putida NCIB9816 / Y. Yang, R.F. Chen, M.P. Shiaris // J. Bacteriol. 1994. - V.176. -P. 2158-2164.

492. Yen K.M. Genetic of naphthalene catabolism in pseudomonads. CRC / K.M. Yen, C.M. Sedar // Crit. Rev. Microbiol. 1988. - V. 15. - P. 247-268.

493. Yen K.-M., Gunsalus I.C. Plasmid gene organisation: naphthalene/salicylate oxidation. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. - 1982. - Y.19. - 874p.

494. Yi H.-R. Phylogenetic and phenotypic diversity of 4-chlorobenzoate-degrading bacteria isolated from soils / H.-R. Yi, K.-H. Min, C.-K. Kim, J.-O. Ka // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - V. 31. - P. 53-60.

495. Yoon J.-H. Rhodococcus pyridinivorans sp. nov., a pyridine-degrading bacterium / J.-H. Yoon, S.-S. Kang, Y.-G. Cho et al. II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - V. 50. - P. 2173-2180.

496. Yoon Y.-H. Characterization of a new catechol branch of the /?-ketoadipate pathway induced for benzoate degradation in Acinetohacter Iwoffii K24 / Y.-H. Yoon, S.-H. Yun, S.-H. Park et al. H Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - V. 360. - P. 513-519.

497. Yu C.L. Purification, characterization, and crystallization of the components of a biphenyl dioxygenase system from Sphingobium yanoikuyae B1 / C.L. Yu, W. Liu, D.J. Ferraro et al. Il J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V.34. - P.311-324.

498. Zaidi B.R. Factors affecting microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon phenanthrene in the Caribbean coastal water / B.R. Zaidi, S.H. Imam // Marine Poll. Bull. 1999. - V. 38. - P. 737-742.

499. Zhao B. Biodégradation of phenanthrene by a halophilic bacterial consortium under aerobic conditions / B. Zhao, H. Wang, R. Li, X. Mao, R. Li // Curr. Microbiol. 2009. - V. 58. - P. 205-210.

500. Zhilina T.N. Desulfonatronovibrio hydrogenovorans gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, sulfate-reducing bacterium / T.N. Zhilina, G.A. Zavarzin, F.A. Rainey et al. II Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 144-149.

501. Zhou N.-Y. nag Genes Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism / N.-Y. Zhou, S.L. Fuenmayor, P.A. Williams II J. Bacteriol. 2001. -V. 183. - P. 700-708.

502. Zhou L.H. The purification and characterisation of 4-chlorobenzoate: CoA ligase and 4-chlorobenzoyl CoA dehalogenase from Arthrobacter sp strain TM-1 // L.H. Zhou, T.S. Marks, R.P.C. Poh // Biodégradation. 2004. - V. 15. - P. 97109.

503. Zhou H.W. Genetic diversity of dioxygenase genes in polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria isolated from mangrove sediments / H.W. Zhou, C.L. Guo, Y.S. Wong, N. F. Y. Tam // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 262. -P. 148-157.

504. Zhou H.W. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced structural shift of bacterial communities in mangrove sediment / H. W. Zhou, A. H. Y. Wong, R. M.

505. K. Yu, Y. D. Park, Y. S. Wong, N. F. Y. Tam // Microb. Ecol. 2009. - V. 58. -P. 153-160.

506. Zhuang W.-Q. Importance of gram-positive naphthalene-degrading bacteria in oil-contaminated tropical marine sediments / W.-Q. Zhuang, J.-H. Tay, A.M. Maszenan et al. II Lett. Appl. Microbiol. 2003. - V. 36. - P. 251-257.

507. Zielinski M. Pinpointing biphenyl dioxygenase residues that are crucial for substrate interaction / M. Zielinski, S. Kahl, HJ. Hecht, B. Hofer // J. Bacteriol. -2003. V.185. - P. 6976-6980.

508. Zielinski M. The principal determinants for the structure of the substrate-binding pocket are located within a central core of a biphenyl dioxygenase alpha subunit / M. Zielinski, S. Backhaus, B. Hofer // Microbiology. 2002. - V. 148. -P. 2439-2448.

509. Zucolotto V. Catechol biosensing using a nanostructured layer-by-layer film containing Cl-catechol 1,2-dioxygenase / V. Zucolotto, A. P.A. Pinto, T. Tumolo et al. II Biosensors and Bioelectronics. 2006. - V.21. - P. 1320-1326.

Информация о работе

Плотникова, Елена Генриховна
доктора биологических наук
Пермь, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы