Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые штаммы-деструкторы 2,4,5-Т гамма-подкласса протеобактерий

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новые штаммы-деструкторы 2,4,5-Т гамма-подкласса протеобактерий"

На правах рукописи

I 4054622

ЯСАКОВ ТИМУР РАМИЛЕВИЧ

НОВЫЕ ШТАММЫ-ДЕСТРУКТОРЫ 2,4,5-Т ГАММА-ПОДКЛАССА ПРОТЕОБАКТЕРИЙ

03.02.03 - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2011

4854622

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Маркушева Татьяна Вячеславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Вахитов Венер Абсатарович доктор биологических наук, профессор Янгуразова Земфира Ахметовна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Пермского научного центра Уральского отделения РАН

Защита состоится ч/^х^ое^сс^ 2011 г. в часов на заседании

Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Лукманова К. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что микроорганизмы играют важную роль в вовлечении чужеродных производных в обмен веществ. В современной биосфере микробы способны осуществлять деструкцию значительного числа химических субстанций и поэтому их использование лежит в основе экологически выгодных способов очистки окружающей среды.

Достаточно часто для целевой конверсии синтетических органических соединений применяются бактерии. Это связано с тем, что одной из важных особенностей бактерий является их высокая генетическая пластичность и, как следствие, высокая приспособляемость к изменяющимся условиям окружающей среды. Благодаря такой приспособляемости бактерии приобретают возможность использовать в качестве источников питания и энергии разнообразные производные, в том числе токсичные по отношению к про- и эукариотам.

Существенную часть загрязнителей окружающей среды составляют пестициды, среди которых особое распространение получили производные ароматических галогенидов. В настоящее время Агентство по защите окружающей среды США (ШЕРЛ) включило 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) в группу веществ токсичных и ассоциированных с риском для здоровья человека. Более опасным соединением является 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т). Отмечено, что гербициды 2,4-Д и 2,4,5-Т имеют тенденцию к накоплению в тканях, способны к кумулятивному токсическому воздействию на теплокровные организмы [Карамова Л.М., 2002]. Одной из причин такого положения является наличие в молекулах 2,4-Д и 2,4,5Т галогенуглеродной связи, которая трудно расщепляется в клетках живых систем.

Следует отметить, что поиск и изучение новых культур, способных осуществлять деструкцию галогенсодержащих ароматических соединений, представляется важным не только в прикладном своем значении в плане

использования деструкторов для конверсии гербицидов, но и вносят вклад в понимание вопросов организации генетических систем, контролирующих процессы ассимиляции ксенобиотиков в техносфере. Результаты исследований в этой области вносят вклад в понимание вопросов направления эволюции бактерий в техносфере - одного из фундаментальных направлений современной биологии. Цель исследования

Выделение и идентификация новых бактериальных штаммов-деструкторов 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты.

Задачи исследования:

1. Выделить и идентифицировать штаммы-деструкторы 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты из смешанных микробных популяций техногенной экосистемы;

2. Получить количественные и качественные характеристики процессов конверсии 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты выделенными штаммами бактерий;

3. Исследовать пути метаболизма молекул 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты у выделенных бактериальных штаммов-деструкторов;

4. Сравнить генетические системы контроля метаболизма 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммов-деструкторов с известными генетическими кластерами.

Научная новизна исследования

Выделены новые бактериальные штаммы-деструкторы 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты. Согласно результатам исследования культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков, анализу последовательностей гена 16S рРНК и белковых профилей штаммов-деструкторов было установлено, что штаммы могут быть классифицированы как Stenotrophomonas sp., Pseudomonas kilonensis 34T, Xanthomonas sp. 33DCP.

Показано, что штаммы Stenotrophomonas sp., Pseudomonas kilonensis 34T и Xanthomonas sp. 33DCP способны использовать 2,4,5-T в качестве единственного источника углерода и энергии. В ходе работы было установлено, что штаммы осуществляют деструкцию гербицида с образованием феноксиуксусной кислоты. Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР-анализа с применением системы олигонуклеотидных праймеров установлено, что кластеры генетического контроля катаболизма 2,4,5-Т штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP имеют отличия от известных кластеров tfd- и //¿-генов штаммов Cupriavidus necator JMP134 и Burkholderia cepacia АС1100. Практическая значимость работы

В результате проведенных работ выделены новые природные штаммы-деструкторы 2,4,5-Т Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP. Раскрыты особенности катаболизма пестицида 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммов, заключающиеся в том, что интермедиатами конверсии 2,4,5-Т являются феноксиуксусная кислота и 2-гексеналь. Установлено, что детерминанты конверсии 2,4,5-Т расположены на плазмидах Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т vi Xanthomonas sp. 33DCP. Результаты работы открывают возможности использования штаммов-деструкторов 2,4,5-Т и их генетических элементов для разработки методов очистки окружающей среды нового поколения. Последовательности генов 16S рРНК штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP депонированы в международную базу данных GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022). Положения, выносимые на защиту

1. В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют микроорганизмы-деструкторы 2,4,5-Т.

2. Деструкторами 2,4,5-Т являются представители родов Stenotrophomonas, Pseudomonas я Xanthomonas.

3. Ассимиляция 2,4,5-Т у деструкторов происходит с образованием феноксиуксусной кислоты и 2-гексеналя.

4. Бактерии-деструкторы 2,4,5-Т имеют оригинальные генетические кластеры, контролирующие катаболизм 2,4,5-Т.

5. Детерминанты, контролирующие катаболизм 2,4,5-Т в клетках бактерий, располагаются на плазмидах.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работ II, IV, V и VI Молодежных школ-конференций с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006, 2008, 2009, 2010), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва, 2010) и Международной научной конференции «Биотехнология начала Ш тысячелетия» (Саранск, 2010). Публикации

Результаты работы изложены в 13 печатных работах, в том числе 5 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, приложения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 32 рисунка и 7 таблиц. Библиография включает 158 наименований, из них 13 отечественных и 145 зарубежных. Благодарности

Автор выражает благодарность рук. Лаборатории физ.-хим. методов анализа биополимеров ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Гарафутдинову P.P. за помощь в получении АСМ-изображений клеток бактерий. Также автор признателен к.б.н. E.H. Ильиной (НИИ ФХМ) и А.Д. Бордовской за содействие при получении белковых профилей клеток бактерий. Автор благодарит коллектив и рук. Лаборатории вирусов микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН к.б.н. A.B. Летарова за помощь в идентификации штаммов.

За любезно предоставленные штаммы бактерий автор искренне признателен профессору Kazuhito Itoh (Shimane University, Япония).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Объектами исследования являлись природные штаммы бактерий Síenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP, выделенные из смешанных микробных популяций почв Северного промышленного узла города Уфы. Штамм Burkholderia sp. M38-VN3-2W, выделенный из загрязненных почв Вьетнама [Huong N.L. et al., 2007], для сравнения генов бактерий был любезно предоставлен профессором Itoh (Shimane University, Япония).

Получение чистых культур штаммов-деструкторов проводили по методу Коха [Теппер Е.З. и др., 1976]. Рост культур осуществляли в жидкой питательной среде в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115120 об/мин. Контроль биомассы осуществлялся по изменению оптической плотности клеточной суспензии (ОД590) с использованием фотоколориметра КФК-2 при длине волны 590 нм и чувствительности равной 2. Анализ содержания 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты в культуральной жидкости проводили согласно руководству «Методы определения микроколичеств пестицидов» (1984). Идентификацию продуктов метаболизма 2,4,5-Т осуществляли на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360.

Фотографические изображения колоний были получены с помощью фотоаппарата Canon S3 IS в режимах макросъемки в проходящем и отраженном свете. Визуализацию клеток осуществляли с помощью атомно-силовой микроскопии (ACM) [Bolshakova A.V. et al., 2004] на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия). Сканирование вели в контактном режиме по методу постоянной силы с использованием кантилеверов CSG01 фирмы NT-MDT с радиусом кривизны зонда 10 нм.

Изображения получены с помощью двухпроходной методики съемки. В качестве подложки использовали слюду типа мусковит.

Идентификацию культур проводили согласно принципам фенотипической дифференциации бактерий 9-го издания руководства «Определитель бактерий Берджи» (1997), а также на основе принципов молекулярного типирования по последовательности гена 16S рРНК и протеомного фингерпринтинга. ДНК-матрицы для ПЦР-реакций получали по методике N.L. Huong с коллегами [Huong N.L. et al., 2007] с незначительными модификациями. Амплификацию гена 16S рРНК проводили с помощью ПЦР с использованием амплификатора Bio-Rad MJMini и универсальных для большинства прокариот олигонуклеотидных праймеров [Edwards U. et al., 1989]. Полученные последовательности были клонированы в составе вектора pGEM-TEasy (Promega) в клетках штамма E.coli z85. Определение последовательности гена 16S рРНК производили с применением секвенатора Avant 3150 Applied Biosystems со стандартным набором реактивов согласно рекомендациям производителя. Протеомные профили (протеомный фингерпринтинг) штаммов получены с помощью времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Broker Daltonic, Германия) с последующим анализом данных с помощью программного пакета Biotyper 2.0 [Seng P. et al., 2009; Szabados F. et. al., 2010]. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z (отношение массы к заряду) от 2000 до 20000.

Амплификацию гена tftA исследуемых штаммов проводили по методу, предложенному N.L. Huong с коллегами с использованием ДНК штамма Burkholderia sp. M38-VN3-2W в качестве положительного контроля [Huong N.L. et al., 2007].

Анализ последовательностей, гомологичных tfd-генам, проводили с помощью дот-блот гибридизации препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. Для этого выделяли плазмиду pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 методом щелочного лизиса с небольшими модификациями [Маниатис Т. и др., 1984]. Препарат меченой плазмиды pJP4 получали методом замещения

нуклеотидов с использованием набора Nick Translation System (Promega, США) согласно рекомендациям производителя.

Плазмидный статус штаммов определялся с применением метода щелочного лизиса с небольшими модификациями [Маниатис Т. и др., 1984]. Фракционирование препаратов ДНК осуществляли путем горизонтального гель-электрофореза в 1%-м агарозном геле по стандартной методике [Маниатис Т. и др., 1984]. Фракционирование проводили в камере для Bio-Rad Wide mini-sub Cell GT при напряжении электрического поля 6 В/см 25В в течение 30-60 мин. По окончании электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидиума в концентрации 0,5 мкг/мл. После окрашивания гель просматривали в проходящем УФ-свете и фотографировали через оранжевый светофильтр с помощью фотоаппарата Canon S3 IS. Ферментативный гидролиз препаратов плазмид и последующий анализ фрагментов ДНК (ПДРФ-анализ) проводили по стандартной методике согласно рекомендациям производителя (Fermentas, Литовская Республика).

Элиминацию плазмид проводили согласно стандартной методике с небольшими модификациями [Герхард Ф., 1990]. Вначале проводили подбор оптимальной концентрации элиминирующего агента (бромистый этидий или акридиновый оранжевый). Культуры выдерживали в течение ночи при температуре +30°С. Затем отбирали образец, в котором появлялась едва заметная мутность, и высевали его аликвоту на мясопептонный агар (МПА), после чего проверяли отдельные колонии на потерю функций, определяемых плазмидами. Для подтверждения потери плазмид проводили выделение и анализ плазмидной ДНК по вышеописанной методике.

Определение чувствительности исследуемых штаммов к антибиотикам проводилась методом диффузии в агаре с применением дисков [Лабинская A.C., 1978].

Все эксперименты проведены не менее чем в трех повторах. Достоверность ветвления филогенетических деревьев последовательностей гена 16S рРНК просчитывалась в формате программы MEGA4.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Выделение изолятов из образцов почвенной биоты

Из образцов почвенной биоты Северного промышленного узла города Уфы на селективных средах нами были выделены изоляты, способные к росту в условиях использования 2,4,5 -Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Эти изоляты были обозначены следующим образом: ЗЗТ, 34Т, ЗЗБСР и идентифицированы в дальнейшем как Stenotrophomonas ер. ЗЗТ, Р. кИопетгв 34Т и ХаЫЪотопаз ер. ЗЗОСР, соответственно.

Идентификация изолятов

Идентификацию изолятов проводили по совокупности культурально-морфологических, морфометрических, физиолого-биохимических признаков и результатов молекулярного типирования.

Морфометрические особенности выделенных бактерий

Основные морфометрические характеристики микробных клеток были получены с использованием метода АСМ-микроскопии.

V, «—! 'III.....

ДМш! ¡11111111

Рисунок 1 - АСМ-изображения клеток штаммов Леио/гор/гоотоиж ер. ЗЗТ (А), Р. \ilonensis 34Т (Б) и ХаМУютопаз эр. ЗЗБСР (В). Условные обозначения: 1 -жгутики, 2 - клетки.

На АСМ-изображениях штамма Я/еио/гор/юмоио? ер. ЗЗТ были видны

клетки палочковидной формы (Рис. 1А). Размер клеток составлял 0,6-1,0 х 2,54,0 мкм. Клетки были прямыми и изогнутыми, имели один или несколько жгутиков. Расположение жгутиков - полярное.

Клетки другого штамма, Р. кйопетгз 34Т, были видны в скоплениях, размер клеток составлял 1,0-2,0 х 0,3-0,5 мкм, клетки имели жгутики (Рис. 1Б).

Клетки штамма Хап1котопа.ч ер. ЗЗОСР, имели палочковидную неизогнутую форму, размер клеток составлял 1,8-2,0 х 0,4-0,5 мкм (Рис. 1В). Жгутики отсутствовали. Результаты исследования морфометрических особенностей представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Морфометрические характеристики выделенных бактерий

№ Культура Форма клеток Размер клеток, мкм Наличие и расположение жгутиков

1. ^Иепо1горкотопаЕ эр. ЗЗТ палочковидная 0,6-1,0x2,5-4,0 присутствуют, расп. полярное

2. Р$еис1отопа$ кИопет1з 34Т палочковидная 1,0-2,0x0,3-0,5 присутствуют

3. ХапАютопаъ ер. ЗЗБСР палочковидная 1,8-2,0x0,4-0,5 отсутствуют

Идентификация штаммов Лгио/лорЛоиюилю ер. ЗЗТ, Р. кИопст'к 34Т и ХапИготопая ер. ЗЗПСР с помощью анализа последовательностей генов 168 рРНК и нротеомного фингерпринтинга

На основании филогенетического анализа последовательности 16Б рРНК было показано, что штамм Бгепо^орЬотопсхв Бр. ЗЗТ является представителем филогенетического кластера, образованного разными представителями рода $1епо1гор1потопаз (Рис. 2). Уровень сходства гена 16Б рРНК штамма ЗЗТ и изученных ранее различных видов $1епо1гофотопа5 составлял 98 - 99%, что свидетельствовало в пользу того, что штамм 81епо1горЬотопа$ $р. ЗЗТ является представителем рода &епо1горкотопа$. При этом наиболее близкими видами являются $1епо1горкотопав таИорЫИа ЬМЮ 95 8Т и БЫпо1горкотопан а/гкае 1Жт 22072.

Согласно АСМ-изображениям (Рис. 1А, табл. 1) у клеток штамма ЗЗТ обнаружено наличие двух полярно расположенных жгутиков, в то время как для вида $1еп(Лгоркотопа.ч таНорЫИа характерно перитрихиальное жгутикование, что соответствует Определителю бактерий Берджи. Принимая во внимание указанные факты, следует сделать заключение о том, что штамм 81гпо1горкотопах вр. ЗЗТ не может быть классифицирован как 81епо1горЬотопах таНорЫИа и близкий к нему $1епо1гор\готопаа а/гкае.

-Ki] Afanifcomonas arboricola IMG 747T Xanthomonas hortorum IMG 733T ® Xanthomonas bromi LMG 947T Xanthomonas pisi IMG 84 7T

__ юс Xanthomonas cassavae LMG 673T

Xanthomonas vesicatoria IMG 91 ¡T Xanthomonas Cucurbitae LUGT 62 Xanthomonas Cynarae DSM 16794T —Xanthomonas populi LMG 5743T

-Stenotrophomonas rhaophila LMG 22075T

-St. aadaminiphUa IMG 22073T

----Stenotrophomonas humi LMG 239S9T

♦ (HQ877451)

Stenotrophomonas maltophilia LMG 958T ---Stenotrophomonas africae LMG22072

i—Xanthomonas populi LMG 5743-T Xanthomonas vesicatoria LMG 91 IT —Xanthomonas theicola LMG 8684T Xanthomonas Cucurbitae LMG T Xanthomonas Cynarae DSM 16794 Xanthomonas campestris 568-T iXanthomonas vasicola LMG 736T Pseudomonas cissicola LMG 2167T Xanthomonas codiaei LMG 8678T Xanthomonas axonopodis LMG S38T

- ♦ 33DCP (HQ891021)

--Xanthomonassacchari LMG 47IT

- Xanthomonas albilineans LMG 494-T

-Xanthomonas campestris LMG 876 -Xanthomonas melonis LMG 8670T -Xanthomonas hyacinthi LMG 739T

I-лапо

ЧГХа'

5т[|—

57I-X

_90i— Pseudomonas corrugata DSM 7228T Pseudomonas kiionensis DSM 13647T Pseudomonas thivervalensis CFBP J126IT ♦ 34T (HQ891022)

-Ps. fredenksb ergensis DSM13022T

Pseudomonas congelans DSM 14939T

dl

100' Pseudomonas tremae CFBP 611 IT Pseudomonas chlororaphis DSM 19603T

Pseudomonas chlororaphis DSM6698

jm,Pseudomonas cedrina CFML 96-lffST "i Pseudomonas cedrina DSM 14938T

CPseudomonas mohnii lpA-2T - Pseudomonas moorei DSM 12647T

0.005

Рисунок 2 - Филогенетическое положение штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ (A), Xanthomonas sp. 33DCP (Б) и Pseudomonas kiionensis 34T (В) по последовательности гена 16S рРНК.

Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap''-анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

В ходе протеомного анализа было установлено, что штамм

Stenotrophomonas sp. ЗЗТ близок к штамму Stenotrophomonas sp. 109 Neb28

NFI. Логарифмический показатель вероятности идентификации, составляющий

2,005, убедительно подтверждает достоверность процедуры идентификации и

означает, что штамм Stenotrophomonas sp. ЗЗТ следует идентифицировать как

Stenotrophomonas sp. ЗЗТ.

Согласно результатам анализа филогенетического положения штамма

34Т установлено, что он принадлежит филогенетически гетерогенному роду

Pseudomonas. Уровень гомологии последовательности гена 16S рРНК штамма

Pseudomonas kiionensis 34Т и близких ему видов превышал 99% (Рис. 2).

Наиболее близкими к нему видами являются Pseudomonas thivervalensis CFBP

11261Т, Pseudomonas corrugata DSM 7228T и Pseudomonas kilonensis DSM 13547T.

Анализ профиля белковых масс данного штамма выявил его наибольшее сходство с профилем штамма Pseudomonas kilonensis DSM 13647Т НАМ с логарифмическим показателем вероятности идентификации 2,045, что подтверждает достоверность идентификации этого штамма. На основании этих данных штамм 34Т был идентифицирован как Pseudomonas kilonensis 34Т.

Сравнительный анализ последовательности гена 16S рРНК штамма 33DCP позволил установить, что штамм Xanthomonas sp. 33DCP принадлежит к филогенетическому кластеру, образованному представителями рода Xanthomonas. Уровень сходства последовательностей 16S рДНК изучаемого штамма и различных видов рода Xanthomonas составлял более 99%. На основании этих данных штамм Xanthomonas sp. 33DCP является представителем ром Xanthomonas.

Согласно результатам сравнительного анализа белковых профилей штамм 33DCP не был достоверно близок ни с одним бактериальным штаммом. Возможной причиной этого является отсутствие в базе данных информации по этому виду бактерий.

Динамика конверсии молекул 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммами 33T,34T и 33DCP в периодической культуре

Исследование динамики роста выделенных штаммов показало, что накопление биомассы штамма Stenotrophomonas sp. ЗЗТ начиналось без выраженной лаг-фазы и продолжалось в течение 8 суток (Рис. 3). За это время культура утилизировала более 60% 2,4,5-Т. В период 3-5 суток инкубации отмечена слабо выраженная стационарная фаза, совпадающая по времени с уменьшением уровня деградации 2,4,5-Т. После 5-х суток показатель плотности вновь повышался. На восьмые сутки с наступлением фазы стационарного роста, и далее следовала фаза отмирания.

Из приведенного выше следует, что для культуры Stenotrophomonas sp. ЗЗТ наблюдалось явление диауксии.

Рисунок 3 - Динамика утилизации молекул 2,4,5-Т штаммами Stenotrophomonas sp. ЗЗТ (А), Pseudomonas kilonensis 34Т (Б) и Xanthomonas sp. 33DCP (В) и накопление биомассы в периодической культуре.

Условные обозначения: -■- концентрация 2,4,5-Т, -х- - OD - оптическая плотность ОП590.

Из рисунка 3 видно, что для культуры 34Т также отмечено отсутствие

лаг-фазы. Фаза логарифмического роста Pseudomonas kilonensis 34Т занимала около трех суток. Об этом свидетельствует возрастающий показатель значения оптической плотности, достигающий значения 0,77 ОЕ. В это же время происходил активный процесс деструкции 2,4,5-Т: штамм утилизировал более 37,8% субстрата. Далее, почти на протяжении 3 суток, следовала фаза стационарного роста. Деградация 2,4,5-Т проходила постепенно: в течение 9 суток было утилизировано 59,7% ксенобиотика. Аналогичную ситуацию -короткую лаг-фазу, наблюдали М. Shourian с коллегами в исследованиях процессов деградации фенола у штамма Pseudomonas sp. SA01 [Shourian M. et al., 2009].

Из рисунка 3 видно, что у штамма Xanthomonas sp. 33DCP присутствует выраженный период лаг-фазы. Длительность лаг-фазы составила 1 сутки, по

завершении которых культура 33DCP переходила в фазу экспоненциального роста. Длительность наибольшей активности утилизации субстрата составляла около 5 суток. Фаза экспоненциального роста продолжалась до 7 суток, по завершении которых наступала фаза отмирания. За это время культура утилизировала 57,29% 2,4,5-Т.

Приведенные данные показывают, что выделенные природные штаммы -Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanihomonas sp. 33DCP способны к деградации 2,4,5-Т и их следует отнести к штаммам-деструкторам галогенидов ароматических кислот.

Анализ этапов катаболизма 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты выделенных штаммов

Из таблицы 2 видно, что интермедиаты, накопленные в ходе культивирования выделенных штаммов с использованием 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии, были идентифицированы с использованием хроматомасс-спектрометрии как феноксиуксусная кислота и 2-гексеналь.

Таблица 2 - Идентификация метаболитов 2,4,5-Т штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanihomonas sp. 33DCP

№ Интермедиат Основные пики в масс-спектре m/z, % Наименование

1. о—СН2—СООСНз О JVf 166 (50), 107 (120), 77 (80) феноксиуксусная кислота, метиловый эфир

2. сон О У? 98 (5), 83 (30), 69 (70), 57(100), 44 (50) 2-гексеналь

Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что выделенные штаммы осуществляют дехлорирование ароматического кольца до его разрыва (Рис. 4). Обсуждая полученные данные, следует отметить, что к настоящему моменту на примере штамма Burkholderia cepacia AC 1100 достаточно подробно описан (хлор)гидрохиноновый путь метаболизма 2,4,5-Т. Реакции дегалогенирования и разрыва ароматического кольца у Burkholderia cepacia

AC 1100 проходят после отрыва остатка уксусной кислоты [Daubaras D.L. et al., 1995; Zaborina О. et al., 1998].

Рисунок 4 - Этапы метаболизма 2,4,5-Т штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP.

Условные обозначения: I - 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота; II - феноксиуксусная кислота; III - 2-гексеналь.

Вместе с тем, ранее было обнаружено, что на ранних этапах метаболизма

хлорфенолов возможно дегалогенирование их молекул. Так, Apajalahti и Salkinoja-Salonen показали полное дегалогенирование тетрахлоргидрохинона до разрыва ароматического кольца [Apajalahti J.H.A., Salkinoja-Salonen М., 1987]. Впоследствии были описаны варианты дегалогенирования с заменой атомов СГ на ОЕГ-группу, или на атом Н+ [Fetzner S., Lingens F., 1994]. А. Markus с соавторами обнаружили штамм Pseudomonas sp. CBS3, осуществляющий разрыв ароматического кольца 3,4-дигидроксифеноксиуксусной кислоты до отрыва остатка уксусной кислоты [Markus А. et al, 1984]. Полученные нами результаты указывают на наличие оригинального метаболического пути деградации 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты у выделенных штаммов, ключевыми этапами которого является дехлорирование молекул 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты с образованием феноксиуксусной кислоты и 2-гексеналя.

Сравнительный анализ генетических структур, контролирующих деструкцию 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты в геномах штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP

В ряде работ было установлено, что генетический контроль (хлор)гидрохинонового пути метаболизма 2,4,5-Т осуществляют tft-тетл [Xun L., Wagnon К.В., 1995; Hübner А. et al., 1998]. В частности, кластер tftAB кодирует 2,4,5-Т-оксигеназу, который катализирует первую реакцию метаболизма 2,4,5-Т с образованием 2,4,5-трихлорфенола. Контроль деструкции

2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты осуществляют ¿/¿/-гены. При этом показано, что фермент 2,4-Д/а-кетоглутарат диоксигеназа контролирует деструкцию 2,4,5-Т до 2,4,5-трихлорфенола [Fukumori F., Hausinger R.P., 1993]. Принимая во внимание указанное выше, для выявления генетических структур, детерминирующих деструкцию 2,4,5-Т у выделенных штаммов, была использована система праймеров для идентификации гена tftA и ДНК-ДНК гибридизация с плазмидой pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 для идентификации гена tfdA.

Из рисунка 5 видно, что в результате проведенных исследований специфические ПЦР-продукты не были выявлены, что указывает на отсутствие последовательности гена tftA штамма Burkholderia cepacia АС 1100 в геномах Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP (Рис. 5).

Рисунок 5 - Электрофоретический анализ ПЦР-10тпнпродуктов гомологов гена tftA штамма

Burkholderia cepacia АС 1100 у штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р kilonensis 34Т, Xanthomonas sp. 33DCP. 1,5 т.п.н. *Условные обозначения: 1 - маркер (Fermentas), 2 -

положительный контроль - штамм Barkholderia sp. М38-VN3-2W, 3 - штамм Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, 4 - штамм 500 п.н.—*р. kilonensis 34Т, 5 -штамм Xanthomonas sp. 33DCP, 6 -

отрицательный контроль (матрица - mQ).

Далее нами была проведена дот-блот гибридизация препаратов геномной ДНК исследуемых штаммов и плазмиды pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134. Результаты исследований позволили сделать вывод об отсутствии гомологии ДНК Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP с модельной плазмидой pJP4.

Таким образом, на основе результатов ПЦР-анализа и ДНК-ДНК гибридизации можно сделать заключение о том, что в геномах штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP отсутствуют кластеры, содержащие гены tfdA и tftA, характерные для других

представителей гамма-подкласса протеобактерий и кодирующие 2,4-Д/а-кетоглутарат диоксигеназу и субъединицу 2,4,5-Т-оксигеназы.

Определение плазмидного статуса штаммов Я1епо(горкот<тск ер. ЗЗТ, Р. кНопетй 34Т и ХаМНотопаъ «р. ЗЗБСР

С целью исследования возможности локализации кластеров генов деградации 2,4,5-Т на плазмидах штаммов-деструкторов был проведен анализ плазмидного статуса исследуемых штаммов. На рисунке 6 изображена электрофореграмма плазмидной ДНК штаммов ЗгепоЬгорУютопаъ Бр. ЗЗТ, Р. кПопепт 34Т и ХаЫИотопаз Бр. ЗЗБСР.

12 3 4

Рисунок 6 - Электрофореграмма плазмидной ДНК штаммов ЪгепоггорЬотопаз Бр. ЗЗТ, Р. кйопея^ 34Т и ХаМкотопси ер. ЗЗОСР.

Условные обозначения: 1 - \IHimЯН, 2 - препарат плазмиды штамма ХапЛотопая эр. ЗЗОСР; 3 - препарат плазмиды штамма Р. Ыопетн 34Т; 4 - препарат плазмиды штамма 5гепо^оркотопаз ер. ЗЗТ.

По результатам электрофоретического анализа можно придти к заключению о том, что все штаммы 81епо1горкотопаз зр. ЗЗТ, Р. кИопет1з 34Т и ХапЛотопав эр. ЗЗОСР обладают плазмидами, которые были обозначены нами как рБТЗЗТ, рРК34Т и рХБЗЗ, соответственно. С помощью ПДРФ-анализа было установлено, что размер плазмид рБТЗЗТ штамма 81епоКорЪотопа$ эр. и рРК34Т штамма Р. кИопетгя 34Т ЗЗТ составляет около 27 т.п.н., а плазмиды рХ833 штаммаХаЫкотопая Бр. ЗЗБСР около 46 т.п.н.

Локализация генов деградации 2,4,5-Т и чувствительности к антибиотикам у штаммов 8(епо(горЬотопа$ «р. ЗЗТ, Р. кйопет'т 34Т и ХапОютопаь «р. ЗЗБСР

Для локализации кластера генов, детерминирующих деградацию 2,4,5-Т, а также детерминант чувствительности к антибиотикам у штаммов

23130 п.н.—

9416 п. а-И

6557 п.н.-►

4361 п.н.-

2322 п.н.-►

2027 п.н._

Леиоггор/гомояда ер. ЗЗТ, Р. \dlonensis 34Т и Хаыкотопаз Бр. ЗЗБСР нами был использован метод элиминации плазмид. Результаты представлены в таблице 3. Таблица 3 - Идентификация генотипов штаммов 81епо&ор\готопав эр. ЗЗТ, Р.

№ Штамм Плазмида (Pi) Генотип

Pl+ Pl-

1. Stenotrophomonas sp. ЗЗТ pST33T tft+ kanr, catr tf- kanr, cats

2. Pseudomonas kilonensis 34Т pPK34T tft+ kanr, tetr, cat8 tr kan5, tets, cat3

3. Xanthomonas sp. 33DCP pXS33 tft+ kanr, tetr, catr tft" kanr, tef, catr

Условные обозначения: кап - канамицин, tet - тетрациклин, cat - хлорамфеникол; tft -2,4,5-Т;

г - резистентность, s - сенситивность; + - наличие генов катаболизма ксенобиотика, — отсутствие генов катаболизма ксенобиотика;

По результатам исследования показано, что бесплазмидные клетки штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, P. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP теряют способность использовать 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Также было выяснено, что плазмида pST33T штамма Stenotrophomonas sp. ЗЗТ несет детерминанты резистентности к хлорамфениколу, плазмида рРК34Т штамма P. kilonensis 34Т - детерминанты резистентности к канамицину и тетрациклину, а плазмида pXS33 штамма Xanthomonas sp. 33DCP определяет устойчивость к тетрациклину.

По результатам проведенного анализа на примере штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, P. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP можно сделать вывод о том, что гены деградации 2,4,5-Т могут иметь нлазмидную локализацию.

выводы

1. Из образцов почвенной биоты Северного промышленного узла г. Уфы выделены новые штаммы-деструкторы 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP. Штаммы являются представителями гамма-подкласса протеобактерий.

2. Ассимиляция 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты у штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP происходит с образованием феноксиуксусной кислоты и 2-гексеналя.

3. В клетках штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP имеются плазмиды, несущие генетические кластеры контроля катаболизма 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты и детерминанты резистентности к антибиотикам.

4. В геномах штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP отсутствуют последовательности, гомологичные известным генам tfdA и tftA, детерминирующим катаболизм 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты.

Практические рекомендации

1. Выделенные в данной работе штаммы-деструкторы Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP могут быть рекомендованы для использования в разработках методов ремедиации окружающей среды.

2. Генетические ресурсы штаммов-деструкторов могут быть использованы в технологиях дизайна новых штаммов с заданными свойствами in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Маркушева Т.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Журенко Е.Ю. Биоразнообразие бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - № 3(23). - Приложение 2. ч. II. - С. 342.

2. Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р.. Жарикова Н.В., Коробов В.В. Бактерии рода Pseudomonas как деструкторы хлорароматических веществ // Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - Москва, 2008. - С. 1.

3. Анисимова Л.Г., Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р. Биопрепарат для ремедиации среды от хлорароматических соединений и пестицидов // Материалы Российского молодежного Инновационного конвента. -Москва, 2008.-С. 150-151.

4. Анисимова Л.А., Ясаков Т.Р.. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Бактериальные штаммы для ремедиации почв, загрязненных органическими токсикантами // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям». - Москва, 2008. - С. 8-9.

5. Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В. Биоразнообразие бактерий-деструкторов хлорированных феноксикислот // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - № 6. - С. 121-123.

6. Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В. Анализ бактерий-деструкторов техногенной экосистемы // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - № 10. - С. 444-445.

7. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р.. Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Молекулярно-биологический подход при изучении

бактерий-деструкторов хлорароматических соединений // Аграрная Россия. - 2009. - № S. - С. 119.

8. Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р.. Маркушева Т.В. Анализ состава интермедиатов биоконверсии хлорароматических производных // Аграрная Россия. - 2009. - № S. - С. 121.

9. Ясаков Т.Р.. Анисимова Л.Г., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В., Коробов В.В., Жарикова Н.В. Особенности скрининга бактериальных деструкторов ксенобиотиков // Аграрная Россия. - 2009. - № S. - С. 135.

10. Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Жарикова Н.В. Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Маркушева T.B. Stenotrophomonas sp. ЗЗТ - деструктор пестицида 2,4,5-Т // Материалы V молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 2009. - С. 147.

11. Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Половинкина А.Ю., Маркушева T.B. Pseudomonas kilonensis 34Т -новый штамм-деструктор 2,4,5-Т // Сборник тезисов Международной научной конференции «Биотехнология начала Щ тысячелетия». -Саранск, 2010. - С. 89.

12. Ясаков Т.Р.. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В. Новый бактериальный деструктор хлорфеноксиалкановых кислот из рода Xanthomonas // Материалы VI молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 2010. - С. 93.

13. Ясаков Т.Р.. Коробов В.В., Жарикова Н.В., Мавлявиева Р.Р., Анисимова Л.Г. Анализ антагонистических свойств бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот // Материалы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010».-Москва, 2010.-С. 193-194.

Подписано в печать 25.01.11 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 467. Гарнитура «ТшевКелуКотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ясаков, Тимур Рамилевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Минерализация синтетических соединений у представителей 11 гамма-подкласса протеобактерий

1.1.1. Бактерии-деструкторы рода Pseudomonas

1.1.2. Бактерии-деструкторы рода Stenotrophomonas 16 1.1.3 Бактерии-деструкторы рода Xanthomonas

1.2. Метаболические пути деградации 2,4-Д и 2,4,5-Т

1.3. Генетические кластеры, контролирующие деградацию 2,4-Д и 31 2,4,5-Т

1.3.1. Генетические кластеры, контролирующие деградацию 2,4-Д

1.3.2. Генетические кластеры, контролирующие деградацию 2,4,5-Т

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Получение чистых культур штаммов-деструкторов

2.3. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет

2.4. Определение количеств 2,4,5-Т в культуральной жидкости

2.5. Идентификация продуктов метаболизма 2,4,5-Т

2.6. Идентификация штаммов

2.6.1. Морфологические особенности колоний штаммов ЗЗТ, 34Т и 42 ЗЗБСР

2.6.2. Классификация штаммов по физиолого-биохимическим 42 признакам

2.6.3. Определение морфометрических характеристик клеток штаммов 42 2.6.4 Амплификация, секвенирование и анализ последовательностей 43 генов 16Б рРНК

2.6.5. Получение профилей белковых масс

2.7. Амплификация гена //Ы в клетках исследуемых штаммов

2.8. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре

2.8.1. Получение радиоактивного зонда методом замещения 47 нуклеотидов

2.8.2. Иммобилизация плазмидной ДНК на нитроцеллюлозном 47 фильтре

2.8.3. Дот-блот гибридизация препаратов ДНК на нитроцеллюлозном 48 фильтре

2.9. Выделение плазмидной ДНК

2.10. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле

2.11. Гидролиз препаратов плазмидной ДНК рестриктазами и 49 определение размеров фрагментов ДНК

2.12. Элиминация плазмид, индуцированная акридиновым оранжевым

2.13. Определение устойчивости бактерий к антибиотикам

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение изолятов из образцов почвенной биоты

3.2. Определение филогенетического положения штаммов 51 ЗЗТ, 34Т и ЗЗБСР

3.3. Динамика конверсии молекул 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммами 81епоггоркотопа8 эр. ЗЗТ, Р. кйопепш 34Т и ХаЫкотопаБ ер. ЗЗБСР в периодической культуре

3.4. Анализ интермедиатов катаболизма 2,4,5- 74 трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммов Згепо^орЬотопаз Бр. ЗЗТ,

Р. кИопепзгэ 34Т \iXanihomonas эр. ЗЗБСР

3.5. Сравнительный анализ генетических структур, контролирующих 77 деструкцию 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты в клетках штаммов 31епо1горкотопаз эр. ЗЗТ,Р. кИопетгя 34Т и ХаЫкотопай Бр. ЗЗБСР

3.6. Определение плазмидного статуса штаммов 81епо1торкотопав эр. 83 ЗЗТ, Р. кИопет'ш 34Т иХаМкотопаэ эр. ЗЗОСР

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые штаммы-деструкторы 2,4,5-Т гамма-подкласса протеобактерий"

Актуальность проблемы

Микробная деградация ксенобиотиков играет важную роль в вовлечении чужеродных производных в обмен веществ в современной биосфере. Известно, что микроорганизмы способны осуществлять деструкцию значительного числа химических субстанций и поэтому их использование лежит в основе наиболее экологически выгодных способов очистки окружающей среды.

Достаточно часто для целевой конверсии синтетических органических соединений применяются бактерии. Это связано с тем, что одной из особенностей бактерий является их высокая генетическая пластичность и, как следствие, высокая приспособляемость к изменяющимся условиям окружающей среды. Благодаря такой приспособляемости клетки приобретают способность использовать в качестве источников питания и энергии разнообразные производные, в том числе токсичные по отношению к про- и эукариотам.

Существенную часть группы загрязнителей окружающей среды составляют пестициды, нефтепродукты, промышленные растворители, полихлорированные бифенилы, диоксины и фураны, взрывчатые вещества, бромистые горючие ретарданты. Среди пестицидов особое распространение получили производные ароматических галогенидов. Вместе с тем, в настоящее время Агентство по защите окружающей среды США (118ЕРА) включило 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) в группу веществ токсичных и ассоциированных с риском для здоровья человека. Более опасным соединением является 2,4,5-трихлорфеноксуксусная кислота (2,4,5Т). 2,4-Д и 2,4,5-Т имеют тенденцию к накоплению в тканях, способны к кумулятивному токсическому воздействию на теплокровные организмы [Карамова Л.М., 2002].

Поиск новых культур, способных осуществлять деструкцию галогенсодержащих ароматических соединений, представляется важным как в прикладном своем значении в плане подбора деструкторов для целевой конверсии гербицидов, так и с точки зрения исследования эволюции прокариот в техносфере.

Целью настоящей работы являлось выделение и идентификация новых бактериальных штаммов-деструкторов 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты.

Задачи:

1. Выделить и идентифицировать штаммы-деструкторы 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты из смешанных микробных популяций техногенной экосистемы;

2. Получить количественные и качественные характеристики процессов конверсии 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты выделенными штаммами бактерий;

3. Исследовать пути метаболизма молекул 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты у выделенных бактериальных штаммов-деструкторов;

4. Сравнить генетические системы контроля метаболизма 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммов-деструкторов с известными генетическими кластерами.

Объекты исследований

Объектами исследования являлись природные штаммы бактерий, выделенные из смешанных микробных популяций почв Северного промышленного узла города Уфы.

Научная новизна исследования

Выделены новые бактериальные штаммы-деструкторы 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты. Согласно результатам исследования культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков, анализу последовательностей гена 16S рРНК и белковых профилей штаммов-деструкторов было установлено, что штаммы могут быть классифицированы как Stenotrophomonas sp., Pseudomonas kilonensis 34T, Xanthomonas sp. 7

33DCP. Показано, что штаммы Stenotrophomonas sp., Pseudomonas kilonensis 34T и Xanthomonas sp. 33DCP способны использовать 2,4,5-T в качестве единственного источника углерода и энергии. В ходе работы было установлено, что штаммы осуществляют деструкцию гербицида с образованием феноксиуксусной кислоты. Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР-анализа с применением системы олигонуклеотидных праймеров установлено, что кластеры генетического контроля катаболизма 2,4,5-Т штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP имеют отличия от известных кластеров tfd- и tft-генов штаммов Cupriavidus necator JMP134 и Burkholderia cepacia АС1100. Практическая значимость работы

В результате проведенных работ выделены новые природные штаммы-деструкторы 2,4,5-Т Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP. Раскрыты особенности катаболизма пестицида 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммов, заключающиеся в том, что интермедиатами конверсии 2,4,5-Т являются феноксиуксусная кислота и 2-гексеналь. Установлено, что детерминанты конверсии 2,4,5-Т расположены на плазмидах Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP. Результаты работы открывают возможности использования штаммов-деструкторов 2,4,5-Т и их генетических элементов для разработки методов очистки окружающей среды нового поколения. Последовательности генов 16S рРНК штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP депонированы в международную базу данных GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022).

Положения, выносимые на защиту

1. В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют микроорганизмы-деструкторы 2,4,5-Т.

2. Деструкторами 2,4,5-Т являются представители родов

Stenotrophomonas, Pseudomonas и Xanthomonas.

3. Ассимиляция 2,4,5-Т у деструкторов происходит с образованием феноксиуксусной кислоты и 2-гексеналя.

4. Бактерии-деструкторы 2,4,5-Т имеют оригинальные генетические кластеры, контролирующие катаболизм 2,4,5-Т.

5. Детерминанты, контролирующие катаболизм 2,4,5-Т в клетках бактерий, располагаются на плазмидах.

Апробация работы.

Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работ И, IV, V и VI Молодежных школ-конференций с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006, 2008, 2009, 2010), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва, 2010) и Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010).

Гранты

Работа была проведена при поддержке гранта Программы Президиума-РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов». Публикации

Результаты работы изложены в 13 печатных работах, в том числе 5 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ. Структура и объем работы

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Диссертация изложена на 119 страницах, содержит 32 рисунка и 7 таблиц. Библиография включает 158 наименований, из них 13 отечественных и 145 зарубежных. Благодарности

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ясаков, Тимур Рамилевич

выводы

1. Из образцов почвенной биоты Северного промышленного узла г. Уфы выделены новые штаммы-деструкторы 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP. Штаммы являются представителями гамма-подкласса протеобактерий.

2. Ассимиляция 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты у штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP происходит с образованием феноксиуксусной кислоты и 2-гексеналя.

3. В клетках штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP имеются плазмиды, несущие генетические кластеры контроля катаболизма 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты и детерминанты резистентности к антибиотикам.

4. В геномах штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP отсутствуют последовательности, гомологичные известным генам tfdA и tftA, детерминирующим катаболизм 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современная практическая деятельность человека характеризуется постоянным поступлением в окружающую среду разнообразных синтетических соединений, которые большинство живых систем не способно вовлекать в обмен веществ.

Одним из опасных загрязнителей среды является 2,4,5-трихлорфеноксуксусная кислота (2,4,5-Т), долгое время используемая в качестве гербицида. Установлено, что 2,4,5-Т имеет тенденцию к накоплению в тканях, способна к кумулятивному токсическому воздействию на теплокровные организмы [Карамова Л.М., 2002]. Одной из причин такого положения является наличие в молекулах 2,4,5-Т галогенуглеродной связи, которая трудно расщепляется в клетках живых систем.

Вместе с тем, в ряде исследований показано, что в составе антропогенных экотопов обнаруживаются микроорганизмы способные ассимилировать ксенобиотики. В настоящее время изучение свойств деструкторов* прежде всего связано с тем, что результаты работ в этой области открывают перспективы их применения в разработках экологически выгодных способов очистки окружающей среды нового поколения.

Следует отметить, что поиск микробных культур, способных осуществлять деструкцию галогенсодержащих ароматических соединений, представляется важным не только в прикладном своем значении - в плане использования деструкторов для целевой конверсии гербицидов, но и с точки зрения исследования особенностей эволюции прокариот в техносфере.

В связи с этим микробная деградация ксенобиотиков в настоящее время активно изучается [Dong X. et al., 2008, Gallego A. et al., 2008, Gren I. et al., 2009, Jesús A.G. et al., 2009].

Целью настоящей работы являлось выделение и идентификация и изучение свойств новых бактериальных штаммов-деструкторов 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты.

В ходе выполнения работы из образцов почвенной биоты. Северного промышленного узла города Уфы на селективных средах нами были выделены бактерии, способные к росту в условиях использования 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Эти изоляты были идентифицированы в дальнейшем как Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP.

Идентификацию изолятов проводили по совокупности культурально-морфологических, морфометрических, физиолого-биохимических признаков и данных молекулярного типирования.

На АСМ-изображениях штамма Stenotrophomonas sp. ЗЗТ были видны палочковидные прямые и изогнутые клетки (0,6-1,0 х 2,5-4,0 мкм), имеющие один или несколько полярно расположенных жгутиков. Клетки другого штамма, Pseudomonas kilonensis 34Т, были видны в скоплениях, имели жгутики, размер клеток варьировал в пределах 1,0-2,0 х 0,3-0,5 мкм. Клетки' штамма Xanthomonas sp. 33DCP имели палочковидную неизогнутую форму (1,8-2,0 х 0,4-0,5 мкм), жгутики отсутствовали.

На основании филогенетического анализа последовательности 16S рРНК было показано, что уровень сходства гена 16S рРНК штамма7 Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и изученных ранее видов Stenotrophomonas составлял 98-99%, при этом наиболее близкими видами являются Stenotrophomonas maltophilia LMG 95 8Т и Stenotrophomonas africae LMG 22072.

Однако, принимая во внимание то, что согласно АСМ-изображениям у клеток штамма Stenotrophomonas sp. ЗЗТ было обнаружено наличие двух полярно расположенных жгутиков, в то время как в соответствии с Определителем бактерий Берджи для вида Stenotrophomonas maltophilia характерно перитрихиальное жгутикование, было сделано заключение о том, что штамм Stenotrophomonas sp. ЗЗТ не может быть классифицирован как Stenotrophomonas maltophilia и близкий к нему Stenotrophomonas africae.

В ходе последующего протеомного анализа было установлено, что штамм Stenotrophomonas sp. ЗЗТ близок к штамму Stenotrophomonas sp. 109Neb28 NFI. Логарифмический показатель вероятности идентификации составил 2,005, что убедительно подтверждает достоверность процедуры идентификации и означает, что штамм Stenotrophomonas sp. ЗЗТ следует идентифицировать как Stenotrophomonas sp. ЗЗТ.

Согласно результатам анализа филогенетического положения уровень гомологии последовательности гена 16S рРНК штамма Pseudomonas kilonensis 34Т и близких ему видов превышал 99%. Наиболее близкими к нему видами являются Pseudomonas thivervalensis CFBP 1126 IT, Pseudomonas corrugata DSM 7228T и Pseudomonas kilonensis DSM 13647T.

Анализ профиля белковых масс данного штамма выявил его наибольшее сходство с профилем штамма Pseudomonas kilonensis DSM 13647Т НАМ с логарифмическим показателем вероятности идентификации-2,045, что подтверждает достоверность идентификации этого штамма. На основании этих данных штамм был идентифицирован как Pseudomonas; kilonensis 34Т.

Сравнительный анализ последовательности гена 16S рРНК позволил установить, что уровень сходства последовательностей 16S рДНК Xanthomonas sp. 33DCP и различных видов рода Xanthomonas составлял более 99%.

Согласно результатам сравнительного анализа белковых профилей штамм Xanthomonas sp. 33DCP не был достоверно близок ни с одним бактериальным штаммом. Возможной причиной этого является отсутствие в базе данных информации по этому виду бактерий.

Исследование динамики роста выделенных культур показало, что накопление биомассы штамма Stenotrophomonas sp. ЗЗТ начиналось без выраженной лаг-фазы и продолжалось в течение 8 суток. За это время культура утилизировала более 60% 2,4,5-Т. В период 3-5 суток инкубации отмечена слабо выраженная стационарная фаза, совпадающая по времени с уменьшением уровня деградации 2,4,5-Т. После 5-х суток показатель плотности вновь повышался. Рост биомассы штамма прекращался на восьмые сутки с наступлением фазы стационарного роста, и далее следовала фаза отмирания. Таким образом, для культуры Stenotrophomonas sp. ЗЗТ отмечено отсутствие лаг-фазы и явление диауксии.

Фаза логарифмического роста штамма Pseudomonas kilonensis 34Т занимала около трех суток. Об этом свидетельствует возрастающий показатель значения оптической плотности, достигший 0,77 ОЕ. Далее, почти на протяжении 3 суток, следовала фаза стационарного роста. Деградация? 2,4,5-Т проходила постепенно, в течение 9 суток было утилизировано более 59,7% ксенобиотика. Длительность лаг-фазы составила 1 сутки, по завершении которых культура 33DCP переходила в фазу экспоненциального роста, продолжавшуюся до 7 суток, по завершении' которых наступала фаза отмирания. За это время культура утилизировала 57,29% 2,4,5-Т.

Приведенные данные показывают, что выделенные природные штаммы - Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP способны к деградации 2,4,5-Т и их следует отнести к штаммам-деструкторам галогенидов ароматических кислот.

На следующем этапе работ в качестве интермедиатов процессов конверсии 2,4,5-Т Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP были идентифицированы феноксиуксусная кислота и 2-гексеналь. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что штаммы Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP осуществляют дехлорирование ароматического кольца до его разрыва и указывают на наличие оригинального метаболического пути деградации 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты у вновь выделенных природных штаммов.

На основе результатов ПЦР-анализа и ДНК-ДНК гибридизации было сделано заключение о том, что в геномах штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP отсутствуют кластеры, содержащие гены tfdA и tftA, характерные для других представителей гамма-подкласса протеобактерий и кодирующие 2,4-Д/а-кетоглутарат диоксигеназу и субъединицу 2,4,5-Т-оксигеназы.

С целью исследования вопроса о локализации кластеров генов деградации 2,4,5-Т на плазмидах штаммов-деструкторов был проведен анализ плазмидного статуса Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP.

По результатам электрофоретического анализа было сделано заключение о том, что штаммы Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Pseudomonas kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP обладают плазмидами, которые были' обозначены нами как pST33T, рРК34Т и pXS33, соответственно. Размер плазмид pST33T штамма Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и рРК34Т штамма Pseudomonas kilonensis 34Т составляет около 27 т.п.н., а плазмиды pXS33 штамма Xanthomonas sp. 33DCP — около 46 т.п.н.

С использованием метода элиминации плазмид показано, что генетические детерминанты деградации 2,4,5-Т у исследуемых штаммов могут иметь плазмидную локализацию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ясаков, Тимур Рамилевич, Уфа

1. Баранова И.П, Заславская П.Л, Егоров Н.С. Некоторые данные о культурально-морфологических особенностях форм диссоциации низинобразующего стрептококка // Антибиотики и химиотерапия. — 1995.-Т. 40.-№4. -С. 3-7.

2. Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. - 394с.

3. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д, Краев A.A. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. — 1990. — С. 218.

4. Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Под ред. A.A. Баева. М.: Мир, 1984. - 480с.

5. Медико-биологические последствия диоксинов / под ред. Карамовой Л.М. 2002. - 248 С. - Уфа.

6. Методы общей бактериологии: в 3-х т. / Под. ред. Ф. Герхарда и др. — М.: Мир, 1990.

7. Методы определения микроколичеств пестицидов / под ред. М.А. Клисенко М.: Медицина, 1984. - 256с.

8. Определитель бактерий Берджи // Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. — 1997. С. 104.

9. Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. — 2007.

10. Соляникова И.П. Организация биодеградативных путей у родококков // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. 2007.

11. Теппер Е.З, Шильникова В.К, Переверзева Г.И. Практикум помикробиологии // под ред. Н.С. Егорова. — М.: МГУ, 1976. 307с.

12. Фирсов Н.Н. Микробиология: словарь терминов. М.: Дрофа, 2005. — 256с.

13. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций // КМАХ. 2000. - Т. 2. - №3. - С. 82-95.

14. Anzai Y., Kim Н., Park J-Y., Wakabayashi H. and Oyaizu H. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. — 2000. V. 50. - P. 1563-1589.

15. Apajalahti J.H.A., Salkinoja-Salonen M. Complete Dechlorination of Tetrachlorohydroquinone by Cell Extracts of Pentachlorophenol-Induced Rhodococcus chlorophenolicus II Journal of bacteriology. 1987. — V. 169. -№. 11.-P. 5125-5130.

16. Arensdorf J.J., Focht D.D. A meta Cleavage Pathway for 4-Chlorobenzoate an Intermediate in the Metabolism of 4-Chlorobiphenyl by Pseudomonas cepacia PI66 // Applied and environmental microbiology. 1995. - V. 61. -V. 2.-P. 443-447.

17. Balajee S, Mahadevan A. Dissimilation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid by Azotobacter chroococcum II Xenobiotica. 1990. - V. 20(6). - P. 607617.

18. Baelum J., Nicolaisen M.H., Holben W.E. , Strobel B.W, Senrensen J. and Jacobsen C.S. Direct analysis of tfdA gene expression by indigenous bacteria in phenoxy acid amended agricultural soil // The ISME Journal. — 2008.-V. 2.-P. 677-687.

19. Batisson I., Pesce S., Besse-Hoggan P., Sancelme M. and Bohatier J. Isolation and Characterization of Diuron-degrading Bacteria from Lotie Surface // Water Microbial Ecology. 2007. - V. 54. - P. 761-770.

20. Binks P.R., Nickiin S., Neil C.B. Degradation of hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX) by Stenotrophomonas maltophilia PB1 // Applied and Environmental Microbiology. 1995. - V. 61(4). -P. 1318-1322.

21. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., and Yaminsky I.V. Microbial Surfaces Investigated Using Atomic Force Microscopy // Biotechnol. Prog. 2004. -V. 20.-P. 1615-1622.

22. Bruckmann M., Blasco R., Timmis K.N., and Pieper D.H. Detoxification of Protoanemonin by Dienelactone Hydrolase // J Bacteriol. 1998. - V. 180(2).-P. 400-402.

23. Cavalca L., Hartmann A., Rouard N. and Soulas G. Diversity of tfdC genes: distribution and polymorphism among 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrading soil bacteria // FEMS Microbiology Ecology. 1999. - V. 29. -№1. - P. 45-58.

24. Chen Y.M., Lin T.F., Huang C., Lin J.C., Hsieh F.M. Degradation of phenol and TCE using suspended and chitosan-bead immobilized Pseudomonas putida IIJ Hazard Mater. 2007. - V. 148(3). - P. 660-670.

25. Choi N.C., Choi J.W., Kim S.Bi, Kim D.J. Modeling of growth kinetics for Pseudomonas putida during toluene degradation // Appl Microbiol Biotechnol. — 2008: — V. 81(1).-P. 135-141.

26. Daubaras D.L., Hershberger C. D., Kitano K., and Chakrabarty A. M. Sequence Analysis of a Gene Cluster Involved in Metabolism, of 2,4,5

27. Trichlorophenoxyacetic Acid by Burkholderia cepacia AC 1100 // Applied and Environmental Microbiology. 1995. - V. 61. - №4. - P. 1279-1289.

28. De Souza M.L., Seffernick J., Martinez B., Sadowsky M.J., and Wackett L.P. The Atrazine Catabolism Genes atzABC Are Widespread and Highly Conserved // J Bacteriol. 1998. - V. 180. - №7. - P. 1951-1954. (a).

29. De Souza M.L., Sadowsky M.J., and Wackett L.P. Atrazine Chlorohydrolase from Pseudomonas sp. Strain ADP: Gene Sequence, Enzyme Purification, and Protein Characterization // Journal of bacteriology. 1996. -V. 178. -№16. - P. 4894-4900. (6).

30. Don R.H., Pemberton J.M. Genetic and Physical Map of the 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmid pJP4 // Journal of bacteriology. 1985.-V. 161.-№1.-P. 466-468.

31. Dong X., Hong Q., Li L., Li S. Characterization of a p-nitrophenol degrading bacterium Pseudomonas sp. PDS-7 and cloning of degradation relevant genes // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2008. - V. 48(11). - P. 14861492.

32. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids. Res. 1989. -V. 17.-P. 7843-7853.

33. El-Deeb A.B. Catabolic plasmid-mediated heavy metal resistance in herbicide diuron-degrading Pseudomonas species // Journal of Microbiology and Biotechnology. 2001. - V. 11(1). - P. 7-12.

34. Farrell A, Quilty B. Degradation of mono-chlorophenols by a mixed microbial community via a meta- cleavage pathway // Biodégradation. — 1999.-V. 10.-P. 353-362.

35. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evolution. 1985. - V. 39. - P. 783-791.

36. Fetzner S, Lingens F. Bacterial degalogenases: biochemestry, genetics, and biotechnological applications // Microbiol. Rev. 1994. - V. 58. - №4. -P. 641-685.

37. Fukumori F. and Hausinger R.P. Purification and Characterization of 4-Dichlorophenoxyacetate/a-Ketoglutarate Dioxygenase // Journal of biological chemistry. 1993. -V. 268. -№32. - P. 24311-24317.

38. Garcia-Gonzalez V, Govantes F, Shaw L.J, Burns R.G. and Santero E. Nitrogen control of atrazine utilization in Pseudomonas sp strain ADP // Applied and environmental microbiology. 2003. - V. 69 (12). - P. 69876993.

39. Gisi M.R. and Xun L. Characterization of Chlorophenol 4-Monooxygenase (TftD) and NADH:Flavin Adenine Dinucleotide Oxidoreductase (TfiC) of Burkholderia cepacia AC1100 // Journal of bacteriology. 2003. - V. 185. - №9. - P. 2786-2792.

40. Haizhen W.U., Wei C., Wang Y., He Q., Liang S. Degradation of o-chloronitrobenzene as the sole carbon and nitrogen sources by Pseudomonas putida OCNB-1 // Journal of Environmental Sciences. — 2009. V. 21. - Iss. 1. - P. 89-95.

41. Hauben L., Vauterin L., Moore E.R.B., Hoste B., Swings J. Genomic diversity of the genus Stenotrophomonas II International Journal of Systematic Bacteriology. 1999. - V. 49. - P. 1749-1760.

42. Hoffmann D., Kleinsteuber S., Miiller R.H. and Babel W. A transposon encoding the complete 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation: pathway in the alkalitolerant strain Delftia: acidovorans P4a // Microbiology. 2003. - V. 149 ■ -P. 2545-2556.

43. Hogan D.A., Buckley D.H., Nakatsu G.H., Schmidt T.M., Hausinger R.P. Distribution of the tfdA gene in soil bacteria that do not degrade 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) // Microb. Ecol. 1997. - V. 34. -№ 2. - P. 90-96.

44. Hollender J., Dott W., Hopp J. Regulation of Chloro- and Methylphenol Degradation In Comamonas testosteroni JH5 // Applied and environmental microbiology. 1994. - V. 60. - №7. - P. 2330-2338.

45. Hollender J., Hopp J., Dott W. Degradation of 4-Chlorophenol via the meta Cleavage Pathway by Comamonas testosteroni JH5 // Applied and environmental microbiology. 1997. - V. 63. - №11. - P. 4567-4572.

46. Hu X., Fukutani A., Liu X., Kimbara K., Kawai F. Isolation of bacteria-able to grow on both polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol (PPG) and their PEG/PPG dehydrogenases // Appl Microbiol Biotechnol. -2007. V. 73. - P. 1407-1413.

47. Huong N.L., Itoh K., Suyama K. Diversity of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid Degrading bacteria in Vietnamese Soils // Microbes Environ. - 2007. - V. 22. - №3. - P. 243256. (a)

48. Itoh K., Kanda R., Sumita Y., Kim H., Kamagata Y., Suyama K., Yamamoto H., Hausinger R.P., and Tiedje J.M. tfdA-Like Genes in 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degrading Bacteria Belonging to the

49. Bradyrhizobium-Agromonas-Nitrobacter-Afipia Cluster in Proteobacteria

50. Applied and environmental microbiology. 2002. - V. 68. - №7. - P. 3449-3454.

51. Jia Y., Yin H., Ye J.S., Peng H., He B.Y., Qin H.M., Zhang N., Qiang J: Characteristics and pathway of naphthalene degradation by Pseudomonas sp. N7// Huan Jing Ke Xue. 2008. - V. 29(3). - P. 756-762. .

52. Kaparullina E., Doronina N., Chistyakova T., Trotsenko Y. Stenotrophomonas chelatiphaga sp. nov., a new aerobic EDTA-degrading bacterium // Syst Appl Microbiol. 2009. - V. 32(3). - P. 157-162.

53. Kaparullina E.N., Fedorov D.N, Doronina N.V., and. Trotsenko Yu.A. System of Oligonucleotide Primers for Detection and Amplification of the emoA Gene Encoding Bacterial Ethylenediaminetetraacetate

54. Monooxygenase // Applied Biochemistry and Microbiology. 2008. - V. 45.-V. 4.-P. 361-365.

55. Kaphammer B. and Olsen R.H. Cloning and Characterization of tfdS, the Repressor-Activator Gene of tfdB, from the 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Catabolic Plasmid pJP4 // Journal of bacteriology. 1990. - V. 172. -№ 10.-P. 5856-5862.

56. Kaphammer B., Kukor J.J., and Olsen R.H. Regulation of tfdCDEF by tfdR of the 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Degradation Plasmid pJP4 // Journal of bacteriology. 1990. - V. 172. - №5. - P. 2280-2286.

57. Kay S., Bonas U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant // Curr Opin Microbiol. 2009. - V. 12(1). - P. 37-43.

58. Kawai F. Microbial degradation of poly ethers // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. - V. 58. - P. 30-38.

59. Kim S., Bae W., Hwang J., Park JI Aerobic TCE degradation by encapsulated" toluene-oxidizing bacteria, Pseudomonas putida and Bacillus spp. // Water Sci Technol. 2010: - V.62(9). - P. 1991-1997.

60. Krumme M.L, Timmis K.N, and Dwyer D.F. Degradation of Trichloroethylene by Pseudomonas cepacia G4 and the Constitutive Mutant Strain G4 5223 PR1 in Aquifer Microcosms // applied and environmental microbiology. 1993. -V. 59. -№8. -P. 2746-2749.

61. Ledger T, Pieper D. H, and Gonzalez B. Chlorophenol Hydroxylases Encoded by Plasmid pJP4 Differentially Contribute to Chlorophenoxyacetic Acid Degradation // Applied and environmental microbiology. 2006. - V. 72. - №4. - P. 2783-2792.

62. Lee E.Y, Jun Y.S, Cho K.S, Ryu H.W. Degradation characteristics of toluene, benzene, ethylbenzene, and xylene by Stenotrophomonas maltophilia T3-c // J Air Waste Manag Assoc. 2002. - V. 52(4). - P. 400-406.

63. Lee M.-S, Chang H.-W, Kahng H.-Y, So J.-S, and Oh K.-H. Biological Removal of Explosive 2,4,6-Trinitrotoluene by Stenotrophomonas sp. OK-5 in Bench-scale Bioreactors // Biotechnol. Bioprocess Eng. 2002. - V. 7. -P. 105-111.

64. Lee B.-U, Cho Y.-S, Park S.-C, Oh K.-H. Enhanced Degradation of TNT by Genome-Shuffled Stenotrophomonas maltophilia OK-5 // Curr Microbiol. 2009. - V. 59. - P. 346-351.

65. Li Q., Wang X., Yin G., Gai Z., Tang H., Ma C., Deng Z.5 Xu P. New metabolites in dibenzofuran cometabolic degradation by a biphenyl-cultivated Pseudomonas putida strain B6-2 // Environ Sci Technol. 2009. -V. 43(22).-P. 8635-8642.

66. Louie T.M., Webster C.M., and, Xun L. Genetic and Biochemical Characterization of a 2,4,6-Trichlorophenol Degradation Pathway in Ralstonia eutropha JMP134 // Journal of bacteriology. 2002. - V. 184. -№13.-P. 3492-3500.

67. Mai P., Stig O., Jacobsen J.A. Mineralization and co-metabolic degradation of phenoxyalkanoic acid herbicides by a pure bacterial culture isolated from an aquifer // Appl Microbiol Biotechnol. 2001. - V. 56. - P. 486490.

68. Mandelbaum R.T., Allan D.L., and Wackett L.P. Isolation and Characterization of a Pseudomonas sp. That Mineralizes the s-Triazine Herbicide Atrazine // Applied and environmental microbiology. 1995. -V. 61.-№4. -P. 1451-1457.

69. Markus A., Klages U., Krauss S., Lingens F. Oxidation and dehalogenation of 4-chlorophenolacetate by a two-component enzyme system from Pseudomonas sp. strain CBS3 // J. Bacteriol. 1984. - V. 160. - P. 618621.

70. Marecik R, Kroliczak P., Czaczyk K., Bialas W., Olejnik A., Cyplik P. Atrazine degradation by aerobic microorganisms isolated from the rhizosphere of sweet flag (Acorus calamus L.) // Biodégradation. 2008. -V. 19.-P. 293-301.

71. Martinez B., Tomkins J., Wackett L.P., Wing R., and Sadowsky M.J. Complete Nucleotide Sequence and Organization of the Atrazine Catabolic Plasmid pADP-1 from Pseudomonas sp. Strain ADP // Journal of bacteriology.-2001.-V. 183.-№19.-P. 5684-5697.

72. Matrubutham U., Harker A R Analysis of duplicated gene sequences associated with tfdR and tfdS in Alcaligenes eutrophus JMP134 // J Bacteriol. 1994. -V. 176. -№8. - P. 2348-2353.

73. McGhee I., Burns R.G. Biodegradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA) in contaminated soil // Applied Soil Ecology. 1995. - V. 2(3). - P. 143-154.

74. McGowan C., Fulthorpe R., Wright A., and Tiedje J.M. Evidence for Interspecies Gene Transfer in the Evolution of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Degraders // Applied and Environmental microbiology. 1998. - V. 4.-№10.-P. 4089-4092.

75. McGuinness M. and Dowling D. Plant-Associated Bacterial Degradation of Toxic Organic Compounds in Soil // Int. J. Environ. Res. Public Health.- 2009. V. 6. - P. 2226-2247.

76. Nayak A.S., Yeeranagouda Y., Lee K., Karegoudar T.B. Metabolism of acenaphthylene via 1,2-dihydroxynaphthalene and catechol by Stenotrophomonas sp. RMSK // Biodegradation. 2009. - P. 9271-9281.

77. Parameswarappa S., Karigar C., Nagenahalli M. Degradation of ethylbenzene by free and immobilized Pseudomonas fluorescens-CS2 II Biodégradation. 2008. - V. 19(1).-P. 137-144.

78. Pathak H., Kantharia D., Malpani A., Madamwar D. Naphthalene degradation by Pseudomonas sp. HOB1 : in vitro studies and assessment of naphthalene degradation efficiency in simulated microcosms // J Hazard Mater. -2009. V. 166(2-3).-P. 1466-1473.

79. Peix A., Ramirez-Bahena M.H., Velazquez E. Historical evolution and current status of the taxonomy of genus Pseudomonas II Infect Genet Evol. 2009. - V. 9(6). - P. 1132-1147.

80. Puntus I.F., Filonov A.E., Akhmetov L.I., Karpov A.V., Boronin A.M. Phenanthrene degradation by bacteria of the genera Pseudomonas and Burkholderia in model soil systems // Mikrobiologiia. — 2008. V. 77(1). -P. 11-20.

81. Jayachandran V.P., Kunhi A.A. Degradation of 3-chlorobenzoate and phenol singly and in mixture by a mixed culture of two ortho-pathway-following Pseudomonas strains // J Ind Microbiol Biotechnol. 2009. - V. 36(2).-P. 219-227.

82. Qureshi A., Verma V., Kapley A. and Purohit H J. Degradation of 4-nitroaniline by Stenotrophomonas strain HPC 135 // International Biodeterioration & Biodégradation. 2007. - V. 60(4). - P. 215-218.

83. Rein' A., Fernqvist MM., Mayer P., Trapp S., Bittens M., Karlson U.G. Degradation of PCB congeners by bacterial strains // Appl Microbiol Biotechnol. 2007. - V. 77(2). - P. 469-481.

84. Rice J.F., Menn F.-M., Hay A.G., Sanseverino J. and Sayler G.S. Natural selection for 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid mineralizing bacteria in agent orange contaminated soil // Biodégradation. — 2005. — V. 16. — P. 501-512.

85. Roscetto E., Rocco F., Carlomagno M.S., Casalino M., Colonna B., Zarrilli R., Di Nocera P.P. PCR-based rapid genotyping of Stenotrophomonas maltophilia isolates BMC Microbiology. 2008. - V. 8. - P. 202.,

86. Rosenbluth M.J., Lam W.A., and Fletcher D.A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability // Biophysical Journal. 2006. - V. 90. - P. 2994-3003:

87. Ryan R.P., Monchy S., Cardinale M., Taghavi S., Crossman L., Avison M.B., Berg G., Van der Lelie D., Dow J.M. The versatility and adaptation of bacteria from the genus Stenotrophomonas II Nature Reviews Microbiology. 2009. - V. 7. - P. 514-525.

88. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. -1987.-V. 4.-P. 406-425.

89. Salvadori L, Di Gioia D, Fava F, Barberio C. Degradation of Low-Ethoxylated Nonylphenols by a Stenotrophomonas Strain and Development of New Phylogenetic Probes for Stenotrophomonas spp. Detection. // Current microbiology. 2006. - V.52. - P. 13-20.

90. Santacruz G, Bandala E.R., Torres L.G. Chlorinated pesticides (2,4-D and DDT) biodégradation at high concentrations using immobilized Pseudomonas fluorescens II J Environ Sci Health B. 2005. - V. 40(4). -P. 571-583.

91. Seibert V, Thiel M, Hinne I.-S. and Schlômann M. Characterization of a gene cluster encoding the maleylacetate reductase from Ralstonia eutropha 335T, an enzyme recruited for growth with 4-fluorobenzoate // Microbiology. 2004. - V., 150. - P. 463-472.

92. Shimojo M, Kawakami M. and Amada K. Analysis of genes encoding the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degrading enzyme from Sphingomonas agrestis 58-1 II Journal of Bioscience and Bioengineering. 2009. - V. 108.-№1.-P. 56-59:

93. Soares A., Guieysse B., Delgado O., Mattiasson B. Aerobic biodégradation of nonylphenol by cold-adapted bacteria // Biotechnology. Letters. 2003. -V. 25.-P. 731-738.

94. Sondossi M., Sylvestre M., and Ahmad D. Effects of Chlorobenzoate Transformation on the Pseudomonas testosteroni Biphenyl and Chlorobiphenyl Degradation Pathway // Applied and environmental microbiology. 1992. - V. 58. - №. 2. - P. 485-495.

95. Song H., Liu Y., Xu W., Zeng G., Aibibu N., Xu L., Chen B. Simultaneous Cr(VI) reduction and phenol degradation in pure cultures of Pseudomonas aeruginosa CCTCC AB91095 // Bioresour Technol. 2009. - V. 100(21). -P. 5079-5084.

96. Spasenovski T., Carroll M.P., Payne M.S., Bruce K.D. Molecular analysis of diversity within the genus Pseudomonas in the lungs of cystic fibrosis patients // Diagn Microbiol Infect Dis. 2009. - V. 63(3). - P. 261-267.

97. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - V. 44. - № 4. -P. 846-849.

98. Stackebrandt E., Murray R.G.E., and Triiper H.G. Proteobacteria classis nov. a Name for the Phylogenetic Taxon That Includes the "Purple Bacteria and Their Relatives" // Int. Journal of Systematic Bacteriology. -1988. -V. 38. -№3. P. 321-325.

99. Suwa Y., Wright A.D, Fukimori F. Nummy K.A., Hausinger R.P, Holben W.E., and Forney L.J. Characterization of a Chromosomally Encoded 2,4

100. Dichlorophenoxyacetic Acid/a Ketoglutarate Dioxygenase from Burkholderia sp. Strain RASC // Applied and environmental microbiology. 1996. - V. 62. - №7. - P. 2464-2469.

101. Szabados F., Woloszyn J., Richter C., Kaase M. and' Gatermann S.G. A Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics)-based score cut-off of actually 2 is superior to molecular Staphylococcus aureus identification // J Med Microbiol. 2010. - V. 59. - P. 787-790.

102. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. - V. 24. - P. 1596-1599.

103. Tamura K., Nei M., Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method // Proceedings of the National Academy of Sciences (USA). 2004. - V. 101. - P. 1103011035.

104. Winker S., Woese C.R. A definition of the domains Archaea, Bacteria and Eucarya in terms of small subunit ribosomal RNA characteristics // Syst Appl Microbiol. 1991. -V. 14(4). - P. 305-310.

105. Woese C.R., Kandier O., and Wheelis M.L. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya //

106. Proc. Nati. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 87. - P. 4576-4579.

107. Xie N., Tang H., Feng J., Tao F., Ma C. and Xu P. Characterization of benzoate degradation by newly isolated bacterium Pseudomonas sp. XP-M2 // Biochemical Engineering Journal. 2009. - V. 46(1). - P. 79-82.

108. Xun L. and Wagnon K.B. Purification and Properties of Component B of 2,4,5-Trichlorophenoxyacetate Oxygenase from Pseudomonas cepacia AC 1100 // Applied and Environmental Microbiology. 1995. - V. 61. -№9.-P. 3499-3502.

109. Xun L. and Webster C.M. A Monooxygenase Catalyzes Sequential Dechlorinations of 2,4,6-Trichlorophenol by Oxidative and Hydrolytic Reactions // The journal of biological chemistry. — 2004. — V. 279 — №8. — P. 6696-6700.

110. Yamamoto S., Kasai H., Arnold D.L., Jackson R.W., Vivian A. and Harayama S. Phylogeny of the genus Pseudomonas: intrageneric structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes // Microbiology. 2000. - V. 146. - P. 2385-2394.

111. Ye J., Su L.-H., Chen C.-L., Hu S., Wang J., Yu J. and Chiu C.-H. Analysis of pSC138, the multidrug resistance plasmid of Salmonella enterica serotype Choleraesuis SC-B67 // Plasmid. — 2010. — V. 65. — P. 132-140.

112. Zeng S.Y, Hu J, Huang G.X, He C.Z. Identification of a hrp-associated gene hpaB in the role of pathogenicity of Xanthomonas oryzae pv. oryzae I I Wei Sheng Wu Xue Bao. 2007. - V. 47(3). - P. 402-406.