Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Автоматизация исследования генома человека: центрифужный экстрактор плазмидной ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Автоматизация исследования генома человека: центрифужный экстрактор плазмидной ДНК"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биологии гена

На правах рукописи УДК 577.113.083

МЯКИШЕВ Максим Викторович

АВТОМАТИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА:

ЦЕНТРИФУЖНЫЙ ЭКСТРАКТОР ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

(специальность 03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в группе инструментальных методов исследования Института биологии гена РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик РАН Г.П.Георгиев

кандидат биологических наук Д.Р.Бериташвили

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор А.П.Рысков кандидат химических наук Г.Е.Позмогова.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

РАН.

Защита состоится "_"_ 1994 года в_часов на заседании

Специализированного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул.Вавилова 34/5.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института молекулярной биологии РАН.

Автореферат разослан "_"_ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета . кандидат фарм. наук

Л.С.Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

В молекулярной биологии.за последнее десятилетие наметилась определенная тенденция к экстенсивному накоплению фактического материала. При этом методы, разработанные сравнительно давно: выделение плазмидной ДНК, секвенирование ДНК и амплификация фрагментов ДНК при помоши PCR не заменяются новыми, но претерпевают ряд несущественных модификаций и используются для получения все возрастающего потока фактического материала - нуклеотидных последовательностей, генетических карт, охарактеризованных генов и диагностических зондов.

Увеличение производительности научного труда при анализе генетической информации стало возможным благодаря развитию как сети научных лабораторий, так и множества компаний, производящих ферменты, наборы реактивов и оборудование для проведения молекулярно-биологических исследований.

Повышенный интерес научных, коммерческих и политических структур к генетическим исследованиям вообще и к программе "Геном человека" в частности обусловлен надеждой на получение решений важнейших медицинских и ссльс ко-хозяйственных проблем.

В области автоматизации анализа генетической информации уже достигнут ряд существенных успехов: разработаны автоматические секвенаторы ДНК, термоциклеры для проведения PCR, автоматические спектрофотометры для анализа результатов PCR, быстро развиваются методы ДНК-диагностики при помоши PCR.

При этом собственно выделение и подготовка ДНК к анализу эстается самым трудоемким, медленным этапом исследований.

Роботизированные станции для подготовки проб ДНК не нашли широкого применения вследствие своей дороговизны и :ложности технического обслуживания.

Частичным решением проблемы стали коммерчески доетупные таборы для выделения ДНК, позволившие стандартизацией эучного труда компенсировать отсутствие автоматизации.

Таким образом, автоматизация процесса выделегшя ДНК Н тродготовки ее к последующему анализу является необходимым

условием ускореного продвижения в процессе изучения структурной организации генома.

Цель работы.

1. Создание биохимической и механической концепции автоматического экстрактора плазмидной ДНК.

2. Разработка новой методики для выделения плазмидной ДНК. Создание экспериментальных моделей автоматического экстрактора плазмидной ДНК и поэтапная проверка конструкции.

3. Совершенствование и оптимизация биохимических регламентов и технических параметров автомата.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработана самая быстрая на настоящий момент методика (20мин.) выделения чистой ДНК в нативной форме для рестрикционного анализа и других ферментативных реакций в молекулярном клонировании.

Разработана самая быстрая и принципиально новая методика -7 мин. - экстракции чистой денатурированной плазмидной ДНК непосредственно из бактериальной культуры для секвенирования по Сенгеру.

Обе методики могут быть применены в ручном и автоматическом варианте, причем ни на одном из этапов не требуется визуального контроля за разделением фаз.

Разработан принципиально новый центрифужный прибор, отличающихся от всех предшествующих тем, что весь цикл выделения плазмидной ДНК проводится автоматически внутри ротора оригинальной конструкции, причем реагенты добавляются и распределяются между множеством ячеек поровну непосредственно во время вращения.

Создание центрифужного экстрактора плазмидной ДНК позволило автоматизировать самый трудоемкий этап в процессе анализа генетической информации.

Центрифужный экстрактор плазмидной ДНК может послужить прототипом при разработке нового семейства центрифужных автоматов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот из различных объектов, а также других биохимических и

химических операций. Наиболее перспективными представляются следующие применения для центрифужного экстрактора: экстракция ДНК и РНК из крови и других биологических жидкостей и тканей для медицинской диагностики, экстракция космидной ДНК для картирования генома, выделение и очистка фрагментов ДНК из гелей, выделение и очистка индивидуальных белков из акриламидного геля для секвенирования.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на семинаре ИМБ АН СССР "Автоматизация секвенирования ДНК и приготовления проб", 1989;

на школе по молекулярной биологии, Секция Биофизики, Нарва, 1990;

на I всесоюзной конференции "Геном человека" Переславль-Залесский, 1990;

на школа по биофизике ВТИНТ, Харьков, 1991;

на семинаре Лаборатории организации генома ИБГ РАН, г.Москва, 1994

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литратуры. Она изложена на 100 страницах, содержит 27 рисунков, библиографический список из 90 названий. Обзор литературы посвящен двум темам: "Методы выделения ДНК" и "Центрифужные автоматы в биохимии".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В настоящее время известно множество методик, ^позволяющих выделять плазмидную ДНК высокого качества для секвенирования, рестрикции, трансфекции и клонирования. Однако все ныне существующие методики представляются весьма проблематичными с точки зрения их автоматизации, поскольку подразумевают визуальный контроль за разделением фаз.

К настоящему времени разработан ряд роботизированных станций, решающих проблему выделения ДНК путем копирования движений человека, но этот подход дорог и неэффективен.

До настоящего времени создан ряд центрифужных приборов для спектрометрического анализа крови, использующих концепцию автоматического проведения биохимических реакций внутри ячеистого ротора сложной формы, однако данный принцип никогда не применялся для автоматического выделения и очистки веществ.

В нашей работе концепция центрифужного прибора, содержащего ячеистый ротор сложной формы была применена для создания центрифужного автоматического экстрактора плазмидной ДНК.

Разработка методики выделения плазмидной ДНК в нативной форме.

Для выделения чистой плазмидной ДНК на центрифужном экстракторе нами была разработана новая ускоренная методика. Чтобы обеспечить надежность обработки образцов после щелочного лизиса мы применили новый подход: соосаждения кристаллов неорганической соли (КСЮ4 ) на частицах клеточного дебриса. Из полученного таким путем клеточного лизата плазмидная ДНК сорбируется на силикагель в присутствии гуанидина, затем промывается спиртом и элюируется водой. Сделанный нами выбор силикагеля (Silica фирмы Sigma) и оптимизированные условия позволяют выделять более чем за 20 минут плазмидную ДНК высокого качества пригодную для рестрикции и рестрикционного анализа и других ферментативных реакций в молекулярном клонировании с воспроизводимо высоким выходом.

Традиционные подходы.

Недостаток традиционных подходов к выделению плазмиды состоит в том, что многие манипуляции приходится контролировать визуально. Так, например, большинство используемых в практике методик выделения плазмиды берет начало с щелочного лизиса, и заканчивается осаждением спиртом. Не затронуть белкового осадка в первом случае и не выбросить ДНК во втором является предметом специального навыка.

Развивая прибор для автоматического, выделения ДНК мы столкнулись с проблемой низкой воспроизводимости методик, если они не контролируются визуально. Решение проблемы

заключалось в том, чтобы разработать биохимическую методику, которая позволяла бы обходиться:

1) без визуального контроля над разделением фаз

2) без осаждений спиртом.

Актуальность избранной темы подкрепляется тем, что с каждым годом на научном рынке появляется все больше разнообразных наборов для выделения плазмидной ДНК.

Плазмиды продолжают оставаться наиболее широко используемым вектором для клонирования, поскольку позволяют начав с одной молекулы фрагмента ДНК наработать 1012 ее копий, что составляет несколько микрограмм - количество, легко детектируемое стандартными методам!.

Аналогичный подход (удваивание числа копий ДНК в каждом цикле) используется при амплификации ДНК in vitro методом PCR. Однако до самого последнего времени не найдено приемлемого способа полностью заменить клонирование фрагментов ДНК в бактериях методикой, основанной на PCR. Тем не менее, PCR может быть использован для того, чтобы избежать процесса выращивания бактериальной культуры и выделения плазмиды. При этом одиночная колония, содержащая рекомбинантную плазмиду, переносится с чашки непосредственно в пробирку, где клонированный фрагмент амплифицируется при помощи PCR без какой-либо предварительной обработки.

Привлекательность данного подхода ограничена тем фактом, что степень амплификации достигаемая при обычном PCR составляет 106-10s, в то время как обычный метод выращивания и выделения плазмиды дает Ю12 копий фрагмента. К тому же PCR остается дорогостоящим методом. Следовательно, выращивание и выделение плазмиды в настоящее время является необходимым для клонирования генов в повседневной практике, несмотря на удобство применения PCR на отдельных этапах.

Требования к качеству плазмидной ДНК.

Требования к качеству плазмидной ДНК определяются использованием ее в ферментативных реакциях: в первую очередь при рестрикционном анализе и секвенировании. Плазмида должна присутствовать в растворе в высоких концентрациях (0.2-1.0 мкг/мкл) в недеградированной форме. Кроме того плазмида

должна быть очишена от других биополимеров: бактериальной ДНК и РНК, белков и углеводов.

Классический щелочной лизис.

С тех пор как Бирнбойм й Доли предложили щелочной лизис с последующим высаливанием белков, не было предложено лучшего способа для удаления бактериальной ДНК из раствора. Согласно Бирнбойму и Доли бактерии лизируются детергентом (БОБ) и щелочью (ЫаОН), при этом все нуклеиновые кислоты и белки растворяются и денатурируются. , Последующее добавление солевого буфера (КАс) приводит к нейтрализации раствора и вызывает осаждение КАс в комплексе с бактериальной ДНК и клеточным дебрисом. РНК также частично удаляется из раствора вследствие деградации в щелочных условиях и осаждения. Большая часть плазмиды быстро ренатурирует благодаря суперскрученности и остается в растворе. Тем не менее в ныне используемых методиках серьезной проблемой является полное удаление клеточного дебриса из-за того, что плотность дебриса близка к плотности супернатанта и его рыхлый осадок имеет тенденцию плавать в растворе. Используемое в практике продолжительное центрифугирование при 10-14 тыс. об/мин не полностью решает проблему.

В случае, если проба все же будет загрязнена компонентами клеточного дебриса, такими, как геномная ДНК и белки, получаются низкокачественные секвенирующие автографы и ингибируется рестрикция. Обычно при выделении стараются избежать интенсивного перемешивания, которое ведет к поломке геномной ДНК и, следовательно, мешает ее осаждению. Кроме того на макро-уровне интенсивное перемешивание разбивает сформированный осадок в крошку и мешает последующему отбору очищенного супернатанта.

Одно из лучших решений этой проблемы воплощено в коммерческом продукте фирмы Вю101. Фирма прилагает к набору так называемый спин-фильтр производства МШроге (или мелкопористую капроновую ткань) для дополнительной очистки супернатанта фильтрованием. Другое решение проблемы контаминации геномной ДНК описано Бирбоймом. Оно состоит в том, что выделенный препарат ДНК подвергается повторной

шелочной обработке и примесь денатурированной геномной ДНК высаживается в комплексе с БОБ и КАс.

В нашей работе мы разработали альтернативный подход, заключающийся в добавлении №СЮ4 к суспензии клеточного дебриса непосредственно после КАс. Осаждение тяжелых кристаллов неорганической соли КС104 на частицах дебриса позволяет полностью осадить его центрифугированием, Благодаря этому усовершенствованию супернатант содержащий плазмилу можно легко отобрать пипеткой.

Сорбция ДНК на стекле.

Традиционный подход включает последовательность чередующихся фенольных экстракций и спиртовых осаждений, причем каждый из этих шагов является иотенниалышм источником потери ДНК. Чтобы предотврати» возможные потери требуется специальный визуальный контроль за разделением фаз. Помимо этого традиционный подход использует продолжительные центрифугирования при 10 ООО g и инкубацию спиртового раствора ДНК при -20°С.

Очень привлекательный подход заключается в связывании ДНК с сорбентом. В этом случае операция встряхивания образил с фенолом заменяется манипулированием с водной суспензией сорбента, примеси удаляются промывкой. Сорбция ДНК происходит либо в суспензии, либо путем пропускания рлетпорп через сорбционнуга колонку. При этом за процессом виделеиия не требуется визуального контроля ни на одном из этапов. Разделение фаз может быть осуществлено центрифугированием или фильтрованием и поэтому легко поддается автоматизации.

Сорбенты для выделения ДНК представлены двумя реооднмми типами: обратнофазовые сорбенты и сорбенты на основе стекла или ^модифицированного силикагеля. К перпому типу принадлежит широко используемый сорбент фирмы Обратнофазовые сорбенты позволяют получать ДНК высокого качества, но сам принцип обратнофазовой очистки накладывает то ограничение, что ДНК элюируется в растворе соли (¡.25 М) ИЛИ спирта, и поэтому для получения концентрированного полного раствора ДНК требуется дополнительное спиртовое осаждение.

Напротив, сорбенты на основе стекла высвобождают ДНК при пониженных концентрациях соли, поэтому не требуется дополнительной обработки образца.

Выбор сорбента.

Значение выбора сорбента, как оказалось, играет исключительно важную роль. Вообще говоря, большинство стеклянных поверхностей и немодифицироанных силикагелей способно связывать ДНК при высоких концентрациях соли и высвобождать ее в низкосолевых условиях.

При выборе сорбента нами были применены три критерия:

1)выход ДНК,

2)качество ДНК, то есть способность сорбента избирательно экстрагировать плазмидную ДНК из смеси нуклеиновых кислот,

3)доступность сорбента из рассчета стоимости на одно выделение.

Нами был испытан ряд сорбентов, обозначенных в Таблице 1. жирным шрифтом. Для каждого из сорбентов была подобрана оптимальная концентрация, при которой выход плазмиды максимален.

Таблица 1. Использование для выделе1шя ДНК сорбентов на

основе стекла или силикагеля.

Сорбент Фирма-произво дитель, кат.№ Вид ДНК Ссылка

Glassmilk, Glassfog Biol 01 #3113 Плазмидная ДНК

S il ¡си Sigma #S5631 Геномная ДНК [Boom 90]

Плазмидная ДНК [Myakishev 94]

Diàtùnious Earth Sigma # DS384 Геномная ДНК [Boom 90]

Плазмидная ДНК [Carter 93]

Sephaglas Pharmacia М13 ДНК, геномная ДНК [Nagabhu shan 93]

|USBioclean USB фрагменты ДНК

Сорбент Фирма-произво дитель, кат.№ Вид ДНК Ссылка

Quiaprep Quiagen Плазмидная ДНК

Elu-Quik glass suspension Schleicher & Schuell Плазмидная ДНК, геномная ДНК

Молотое боросиликатное стекло геномная ДНК {Bush 91]

Magic and Wisard resins Promega Плазмидная ДНК, геномная ДНК, e.t.c

IsoGene Perkin Elmer #L228-0440 Плазмидная ДНК, фрагменты ДНК

Молотые сцинтилляцион иые флаконы ДНК всех размеров [Vogelstein 79]

Стеклянный порошок, обработанный HNOj Плазмидная ДНК [Davis S6]

Ground GF/A filters Whatman #1820024 Плазмидная ДНК [Marko 821

GF/C М13 DNA [Kristensen 87]

[Boom 90] Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L. et al., - J. Clin. Microbiol., 1990, v. 23, No. 3, pp. 4 95-503.

[Bush 91] Bush, C., Harvey, M., - Clin. Chem, 1991, v. 37, No. 6, 1060.

[Carter 93] Carter, H.J. and Hilton, I.D." (1993) Nucl. Acids Res., 21, No. 4, 1044.

[Davis 86] Davis, L.G., Dibner, M.D., and Battey, J.F., "Methods in Molecular Biology" - Elsevier Science Publishing C.-., Inc., Amsterdam, The Netherlands, 1986, pp. 123-12S.

[Kristensen 87) Kristensen, Т., Voss, H. and Ansorge, K.,-Hucleic Acids Res., 1937, v. 15, Ho. 14, pp. 5507-5515. [Marko 32] Marko, H.A., Chipperfield, R., and Birnboim, H.C. -Anal. Biochem., 1982, v. 121, pp. 382-287.

(riagabhushan 93] Nagabhushan, M., Bowie, L.J. and Sevigny, P., - BioTechniques, 1993, v. 15, No 5, pp. 824-825. [Vogelstein 79] Vogelstein, ' В. and Gillespie, D., Proc.Matl.Acad.3ci USA, 197Э, v. 76, No. 2, pp. 615-519

Основываясь на результатах экспериментов, мы остановили свои выбор на сорбенте Силика фирмы Sigma.

Методики для ручного и автоматического выделения плазмидной

ДНК

Как отмечалось выше, настоящая работа носит методологический характер, и ее основным результатом является разработка новых приборов молекулярно-биологического исследования и методик для их работы. Приведем 2 быстрые методики, разработанные нами для использования в ручном и автоматическом варианте.

Выделение нативной плазмидной ДНК

1. Взять I мл. ночной культуры E.coli, добавить раздельно 50 ласл 2М NaOH и 50 мкл 10% SDS, мягко перемешать, выдержать 3 мин.;

2. добавить 300 мкл ЗМ КАс pH 5, мягко перемешать, выдержать 3 мин.;

3. добавить 1 мл 4M NaCl04, перемешать, центрифугировать 3 мин. при 10 ООО g;

4. к супернатанту добавить 2 мл связывающей суспензии, содержащей 10% силикагеля 5М GuSCN и 5% Тритон и

• перемешивать в течение Зх мин., отиентрифугировать;

5. ресуспендировать силикагель в 1 мл 40% этанола, отцентрифугировать, удалить жидкую фазу;

6. повторить предыдущую операцию;

7. высушить силикагель в открытых пробирках при 65°С 3 мин.;

8. добавить 100 мкл воды, перемешать, элюировать ДНК при 65°С 3 мин.;

9. отцентрифугировать, отобрать супернатант.

Разработка методики выделения денатурированной плазмиды

Денатурированная плазмидная ДНК для ееквенирования может быть экстрагирована непосредственно из бактериальной культуры.

На идею методики выделения денатурированной плазмиды мы натолкнулись, изучая сорбцию ДНК на стекло при различных значешшх рН. Было обнаружено, что в щелочных условиях в высокой соли плазмидная ДНК сорбируется на стекло, в то время как бактериальная ДНК и РНК остаются в растворе.

Этот феномен может объясняться тем, что стекло обладает способностью сорбировать только двухцепочечную ДНК, тогда как однцепочечная ДНК и РНК (а именно в такой форме находится геномная ДНК и РНК в щелочи) на стекло не сорбируется.

Полагаясь на этот эффект мы предложили новую методику выделения денатурированной плазмиды:

1. Бактериальная культура смешивается с гуанидином, щелочью и силикагелем;

2. силикагель собирают центрифугированием или фильтрованием;

3. промывают спиртом;

4. элюируют ДНК водой.

После оптимизации всех параметров была получена методика выделения денатурированной плазмиды (См. "Материалы и методы."), занимающая 7-10 мин. Полученная ДНК мигрирует на агарозном форезе единственной полосой и представлена денатурированной формой плазмиды. Для ее ееквенирования уже не требуется обработка щелочью.

Выделение денатурнрованной плазмидной ДНК.

1. К 1 мл культуры добавить 2.2 мл раствора содержащего 5М ОиЗСЫ и 5% Тритон,

2. добавить 0.25 мл 2М ИаОН,

3. перемешать и выдержать 1 мин,

4. добавить 50 мкл 10% силикагеля в воде,

5. перемешать и выдержать 1 мин, перемешать и осадить силикагель центрифугированием,

6. ресуспендировать силикагель в 1 мл 40% этанола, отцентрифушровать, удалить жидкую фазу,

7. повторить предыдущую операцию,

8. высушить силикагель в открытых пробирках при 65°С 3 мин,

9. добавить 100 мкл воды, перемешать, элюировать ДНК при 65°С 3 мин,

10. отцентрифутировать, отобрать жидкую фазу.

Выявление факторов определяющих чистоту плазмидной ДНК.

Если нарушить оптимальные условия, приведенные в данных методиках, то проба оказывается загрязненной различными примесями как макромолекулярной природы - бактериальной ДНК и РНК, белками, углеводороды, так и низкомолекулярными веществами, из числа использовавшихся при выделении, а именно: БОБ, ОиБСЫ и другими солями, этанолом и силикагелем. Помимо этого плазмида сама по себе может оказаться деградированной или потеряться вовсе. С целью выяснить, какие факторы оказывают влияние на качество ДНК, был выполнен ряд экспериментов, наиболее принципиальные результаты представлены в Таблице 2. и под теми же номерами на следующем за ней рисунке!..

Таблица 2. Влияние состава реагентов на качество выделяемой плазмидной ДНК

Номер пробы 1 2 3 4 5 Нативная 6 Денатуриро ванная 7

культура Е.соИ + + + + + +

2 М МаОН + + + + + + +

10% БОБ + + + + + + 0

ЗМ КАс + + + + + + 0

4М КаСЮ4 + 0 + + + + 0

Связывающая суспензия + + + + + + +

70% спирт + + + 0 0 0 0

40% спирт 0 0 0 + + + +

наличие соли в спирте 0 + + + 0 0 0

вода + + + + + + +

Загрязнения (по результатам электро< юреза)

Бактериальной ДНК 0 + + + 0 0 0

РНК + + + 0 0 + 0

Результаты электрофоретического анализа приведенны на РисЛ. и занесены в таблицу под разделом "Загрязнения бактериальной ДНК и РНК".

Согласно полученым данным присутствие солей в концентрации 50-100 мМ в растворе спирта, используемом для промывки силикагеля, находится в хорошей корелляции с загрязнением прбы бактериальной ДНК (пробы 2, 3, 4). Использование спиртовой промывки при отсутствии соли решает проблему загрязнения проб геномной ДНК. Понижение концентрации спирта в промывочном растворе позволяет удалить РНК из конечного продукта (пробы 4, 5, 7).

Рис.1. Электрофоретический анализ проб плазмидной ДНК, полученных в соответствии с методиками отображенными в таблице 2 под теми же номерами. Проба 5 соостветствует методике выделения плазмидной ДНК в нативной форме. Сравнение проб плазмидной ДНК нанесенных на дорожки 3 и 4 показывает, что понижение концентрации спирта при промывке силикагеля ведет к устранению контаминации РНК в пробе. При этом количество суперскрученной формы плазмиды понижается несущественно. Сравнение проб 4 и 5 показывает, что использование соли при спиртовой промывке силикагеля неприемлемо, так как оно приводит к контаминации пробы бактериальной ДНК.

1 1

start

бактериальь

ДНК

S.C. фор1У плазмиды

- РНК

Рнс.2 Влияние N1! и Си5СЫ в связывающей суспензии ка загрязнение конечного продукта бактериальной РНК. 1 - контрольная X ДНК: 2 -Ои5С» в связ. суспензии (проба 5); 3 - N33 в связ. суспензии (проба 6)

Принципиально

1

— СТАРТ

-л V г ^

- О.С.

- Б.С. форма плазмиды

- РНК

важным оказался также состав связывающей суспензии. Если сорбцию проводить в растворе как это делалось в первых методиках выделенния ДНК на стекле, то выделяется как плазмидная ДНК, так и значительное количество РНК. Замена соли в связывающей суспензии на ОиБСИ позволяет практически полностью удалить РНК из конечного продукта (Ср. пробу 5 и 6 на Табл.2, и Рис.2.)

Оценка качества ДНК, получаемой по разрабатываемым методи кам оценивалась по ее способности участвовать в ферментативных реак- циях: рестрикционном анализе и секвенирова- нии по Сенгеру. ДНК, соответствующая методике выделения плазмидной ДНК в нативной форме, рестрицируется полностью в стандартных условиях (Рис.3.), в то время как

денатурированная ' ДНК к рестрикции не способна вследствие конформационных особенностей.

Рис.3. Оценка качества нативной шшмидной ДНК по способности рестрицпроваться в стандартных условиях.

Проба 5 представляет собой плазмиду в нативной форме, выделенную по стандартной методике (левая дорожка). Большая часть плазмиды представлена суперс крученной формой. Эта же проба, обработанная рестриктазой Eco RI в течение одного часа, представлена единственной полосой (правая дорожка).

Рис.4. Секвеннрование образцов плазмшшой ДНК по Сэнгеру. Фрагмент стандартного радиоавтографа. (Секвеназа, USB, РЗЗ dATP, Обнинск). Нативная плазмида (соответствует пробе 5 в табл.2.) подвергалась обработке щелочью по стандартному протоколу (USB); денатурированная плазмида (проба 7 в табл.2.) пускалась в полимеразную реакцию без предварительной обработки._

выделение выделение

Контроль! Контроль2 денатурир. нативной

формы формы A G С Т A G С Т A G С Т A G С Т

Рис.5. Одна из первых моделей центрифужного экстрактора плазмидной ДНК - СБЕр. Данная модель имела программируемый процессор. Ротор был составлен из концентрических тефлоновых колец с отверстиями, образующими внутренние каналы ячеик.

В процессе экспериментального развития СОЕр концентрическое деление ротора было заменено радиальным с использованием одноразовых пластиковых ячеек, внутри каждой из которых проходит весь цикл выделения пробы.

Рис.6. Последняя модель СБ Ер.

Принцип действия СБ Ер.

СОЕр представляет собой настольную центрифугу, в ротор которой устанавливаются одноразовые пластиковые ячейки. Вручную производится только загрузка бактериальной культуры и выемка пробирок с выделнной плазмидной ДНК. Добавление и

распределение реагентов в ячейках осуществляется при помощи простого дозатора во время вращения ротора.

Рис.7. Одноразовая ятастикопая ячейка центрифужного экстрактора._

Все операции, необходимые для автоматического выполнения приведенных методик, осуществляются путем перемещения реагентов внутри ячеек под влиянием изменения скорости и направления вращения ротора.

выводы.

1. Предложены биохимическая и механическая концепция центрифужного экстрактора плазмиднон ДНК.

2. Разработана самая быстрая на настоящий момент методика выделения чистой плазмиднон ДНК в нативной форме для рестрикционного анализа, рестрикционного анализа и других ферментативных реакций в молекулярном клонировании, занимающая 20 минут и не требующая ни на одной из стадий визуального контроля за разделением фаз.

3. Разработана самая быстрая на настоящий момент методика выделения чистой плазмидной ДНК в денатурированной форме дня секвенирования, занимающая 7-10 минут и не требующая ни на одной из стадий визуального конотроля за разделением фаз.

4. Поэтапно промоделированы все принципиально новые моменты механической концепции центрифужного экстрактора плазмиднон ДНК.

5. На основании экспериментов разработана оптимальная конструкция ячеистого ротора сложной формы. Сконструированы 2 модели центрифужного экстрактора плазмидной ДНК. Оптимизированы биохимические регламенты и технические параметры автомата.

Заключение.

В заключение автор хотел бы выразить свою благодарность за научную, тех!шческую и моральную поддержку в ходе выполнения работы Геннадию Яковлечу Соловьеву, Марксу Веножинскису, Александру Краеву, Армену Акопяну,. Анне Щенннковой, Гаджи Шайхаеву, Светлане Малаховой, Юлию Розенбергу, Адексанлру Колесникову, Алексею Жигулину, Сергею Королеву, Алск.сдцлру Гаврюшкину, Анатолию Бердашкевичу, Вадиму Юферову, Джозефу Атику, Марку де Гроту, Стиву Лигглу, Юрию Злобинскому, Жа!гу Гелиптеру и другим научным, административным и техническим сотрудникам и соавторам из Института биологии гена. Института молекулярной биологии. Центра "Биоинженерия", Института обшей генетики п Рокфеллеровского У1шверситета.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях и докладах:

1. Бериташвили Д.Р., Мякишев М.В., Ершов Г.М., Капанадзе Г.И. п Георгиев Г.П., "Центробежный автомат для подготовки проб ДНК к секвешфованшо", Экспонат -ВДНХ СССР, 1990, №030600046.

2. Гросс В.Н., Мякишев М.В., Бериташвили Д.Р. и Георгиев Г.П., "Устройство для нанесения проб на гель при электрофорезе", Авторское свидетельство СССР, №1581015, приоритет от 14.11.1988,

3. Гросс В.Н., Мякишев М.В., Бериташвили Д.Р. и Георгиев Г.П., "Способ нанесения проб на гель при электрофорезе", Авторское свидетельство СССР, № 1581014, приоритет от 14.11.1988.

4. Бериташвили Д.Р., Мякишев М.В., Гросс В.Н. "Автоматизация сскиенпроваиия ДНК и приготовления проб" семинар ИМБ АН СССР И секции "Приборы и реактивы" программы "Геном человека" ГКНТ СССР, 1989.

5. Мякишев М.В, "Автоматизация секвенирования ДНК. Новые методы исследования генома человека." Секция Биофизики, Школа По Молекулярной биологии, Нарва, 1990.

6. Бериташвили Д.Р., Мякишев М.В., Ершов Г.М., Капанадзе Г.И. И Георгиев Г.П. "Автоматы для выделения и очистки ДНК из рапичних объектов" докл. I всесоюзная конференция "Геном человека" сборник докладов - Научный Совет "Геном человека", Москва, 1990, стр 17-18.

7. Мякишев М.В. "Автоматическое выделение и секвенированне ДНК" Школа по биофизике ВТИНТ, Харьков, 1991.

8. Бериташвили Д.Р., Мякишев М.В., Ершов Г.М., Капанадзе Г.И. И Геортев Г.П."Устройство для приготовления проб ДНК" Заявка на патент, Гос.рег.№ 5029795, Приоритет от 27 февраля 1992.

9. Бериташвили Д.Р., Мякишев М.В., Ершов Г.М. и Геортев Г.П. "Устройство для приготовления равных доз" Заявка на патент, Гос.рег.№ 5029630, Приоритет от 27 февраля 1992.

10. Myakishev M.V., Kapanadzc G.I., Shaikhayev G.O., Malakliova S.I., Georgiev G.P. & Beritashvili D.R. "Plasmid Minipreps: Improved