Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ауторегуляция роста и развития метанокисляющих бактерий

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ауторегуляция роста и развития метанокисляющих бактерий"

Всесоюзный научно-нсследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

На правах рукописи УДК: 576.8(043.3).

БАБУСЕНКО ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

АУТОРЕГУЛЯЦИЯ РОСТА й РАЗВИТИЯ МЕТАНОКИОЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в Московском химико-технологическом институте им. Д. И. Менделеева, в Институте микробиологии РАН,

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Н. Б. Градова; доктор биологических наук Г. И. Эль-Регистан.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И. Н. Позмогова; кандидат биологических наук Н. Г. Старостина.

Ведущая организация! Волгоградский филиал ВНИИсинтезбелок.

Защита состоится _^ 1992 г.

в тУ^ час на заседании Специализированного Совета Д 098.09.01. во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу; 125299, г. Москва, ул. Клады Цеткин, 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского про-ектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан, &. 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И. И. ГУСЕВА

'ящп тглг'

■¿¿¡¿ртъций

~ а -

ВВЕДЕН а У

ft дозтолвдо п!е"я гагшю'гаасягагд) ¿этгорш яь5<«гс*) обю.псм ¡тэасгздш хго<иг»даваивз какробчологоп, баоигмтш и бллехкологов« •о связано как с гкодэгоюскоя роли этой групгш бакпврял, таи к взрйтяч !фа;ггит-:иС]Ж5 ксшльзо»а;и"ем в йетппншлог.':.;. "»гэиотра^кш бахтерки представши- фгоисдапгчоскя и тзнсияо--чссяя обосойлепную 1у/аау нгкрооргаяияков, гпособных ттольза-ггь г.отзн л кзчзстго ядиястазаного псточякгса угдзрода и георгин л1Ьспу, 1взз). ргспрос-грашошость в ириродгшх сродэх и ушпеъчъ-

»?.:г>':аюго-йиоз|а:.:гчэс»й сгоаствэ котэнотро^ов олрлдоляуг гасгвзннуо роль в бшсшггэзв органического вздрстпз (Мзлашэнко с зет., 1078), а татао и образовании сероводорода в сластога'х вз-х но^тпнш Е'встор.тл.г'рнй'! « результате трс4'лчэск1сс скпзва. !«отаа-лстщге и суль^тггасетэдашшавзцп: бактерий <Галуясо, 1ЙЮ). !'з~ ваккслязащга бшстеряи рассматрггоастся как да репе ¡стихав сбизкт я производства кккройноя биоиассы на природоом гаяз с цагью ш-чотш кормовых добавок, биологически активных геЕрсгз (¡ид^та а1. ,1еа1); да» использования с целью сгаияния концентрации капа в воздухе и ужэпьцания взрывоопасной ситуации п каггаз (Нэе-ров, 1033); а также в состава техногенных биоценозов, с цзльи зишэния нефтеотдачи пластом (Галушко, 1980).

В последшга года получовы экспериментальные дашь®, существо рзсипфяициз лредставдония о фгаиолого -бшшмлеских и таксо-шческюс оссбзпнсетях метапепрофов <Гальчввко с соавт., 1886). жотрп на пирокоз развитие оиотсгнологичесяих работ э области ¡данип и освоения опытко-промишлоипоа технологии получения бно--:сы мотаяотрофов на природасн газе, до настоящего щютая в пол-I роро пе шя1шш условия, аОвст&тпшщт стабильность локаза-ш ш роста при горетдическом и непрерывном культиякрованш, ) связано с недостаточной изучснмостш раконог.'врностел роста и шигмя о'гга бактерий.

Б оов^ааяной теоретической кикробкология раара:»отапа котрп-!, в соответствии с которой развшзоыпаяся ¡шерионая культура :сматриаавтся как самсрогужуемая система, ф/нкипшшропанш ш-ош определяется ко тшш иааелетазм вяеиядаг условии, но и вли-ш зугорэгуд.ггоршк кот;«5олигов, шгг-^юдирупцк* скорость рос-га таппость раЯШП'Я культуры (Даю!««,, 1981 ).

В литературе описаны мемйранотропнш ауторогуляторы, принимающие участка в процессах роста, развития культур и ди|форенцигцни микробных клеток, которые, названы факторами а (Эль-Рогистан, 3S33)

Целью нэстояирй работы явилось изучение роста мэтанскисляхядх ЙЗКТерИЙ" Methylococcus capsulatus ВСБ-874 И рОЛИ ШКбрЗНОТрОШШХ ауторзгулягорных факторов в рззв.ггии и цигодиффэрешдеров!® мэтано-трофных бактерий.

В задачи работы вхоруло:

1. Исслэдовать кинетику роста' иетаиокислякилс бактерия м. capsulars 'ВСБ-874 в периодической и вопрерывном режимах культиви[>0ва-ния, а такие в условиях лимитирования роста различными факторами среда.

2. Выявить наличие ауто рвгулятсрноа: системы, пгиючавдзя иемб-ранотрошые кетаЛолггы типа факторов d,

3. Исследовать участно шмбрзшпрошшх ауторегуляторов в яро-дассах роста и развития иотпноккслягацих бшгторий м.capsulatus, уровень иг накопления при периодическом и хемостатном культнвиро-вачт бактерии.

4. Выделить меийранотрогшиэ ауторагулягорние факторы, скнто-• зируемые м. с «psuiatus, и определить их химическую природу.

Научная гошшз;

Впервые; показано участие в регуляции роста и развития котан-акисляюдих бактерий м- capful atus впэклвточныг нетлбранотропнше метаболитов, физиологическое действие которых аналогично действию факторов dj и 4г, выдплошш ранее у микроорганизмов других сяс-тематические гругет.

Установ.соно. что факторы и синтезируются культурой м. capsulatus па всох фазах ео роста, составляя единую с'истому регуляции физиологической активности моток, функционально зашекму! от уровня ауторегуляторов в культуре .и физйсо-химичоскик условий ерзды. ' ' ■

Показано, что биолог-глоссой фуншдися факгора культуры к capsulatus- ЯВЛЯЮТСЯ рогуДОДИ» СТЮроСТИ роста КУЛЬТУРЫ И • ИНДУКЦИЯ образования анабиотических цистоподобных форн. Установлено, что фактор <1А . для тетанотрофов, иредеггавлпот собой сшсь

двух изомеров лакшна хр»ск;;я;ювтоиовой кислоты к по химическому составу отличается от а,, ранее выделенных из микроорга -

низмов других сигтиашретр i*t-yjro.'

БИирШО BLiiirJiBOH углтии культивирования частой культуры М caps' о', s tys BCB-W74 (.шрг/г.здзшк кислородом, азотом, фосфорли),

при которых развитие культур завершается формированием цистоподоб-вых каэток.

Биологическая активность фактора а2 метанокисляюцих бактерия, представленного свободными жирными кислотами, определяется преимущественно действием ненасыщенных жирных кислот и заключается в регуляции автолититсскж процессов микробных клеток. По химическому составу фзктор d2 аналогичен этому типу аугорегуляторов микроорганизмов других систематических групп.

■ Практическая значимость работы:

Изучены закономерности роста чистой культуры промышленного штамма M.capsuiatus ВСБ-874 при периодическом и непрерывном культивировании.

Предложена биологическая модель регуляции роста квтанокислш-¡щи бактерия в периодическом. и непрерывном условиях культивирования, учитывающая действие факторов d1 и которая объясняет закономерности роста и развития ПрОМЫШВНПОГО лтамма M.capsuiatus ВСБ-874. Полученные данные показывают принципиальную возможность направленного воздействии на развивающуюся культуру для обестче-нш! стабильных показателей роста посредством изменения соотношения авторегуляторов в культуре.

Разработаны условия культивирования M.capsuiatus в непрерывном рзжюде, способствующие оптимальному формированию покоящихся цнетоподобных клеток, что может быть использовано для консервации нузеаных и промышленных штаммов иетанотрофов, а такш при получении 'стандартизированного шокулята в промышленных условиях.

Показана принципиальная возможность получения Бвтолизатов биомассы M.capsuiatus ВСБ-874 с использованием в качестве индуктора автолиза фактора d2 или его химического аналога.

АлообЕзщ работы: материалы работы доложены и обсувдены на Всесоюзных конференциях; "Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов" (Рига, 1987), "Биофизика микробных популяция" (Красноярск, 1087), "Регуляция микробного метаболизма" (Пущим, ТШЭ), "Лимитирование и ингибировашга роста микроорганизмов" (Иущино, 1С83). на межреспубликанской конференции "Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов" (Ташкент, 1989), на it Международной молодежной школе "Мшсробиалыша синтез биологически активных вецеств и жх. применение" (Варна, 1990).

П.Убдюсещ.;и: по материалам диссетрация слуб.яичоиано 2 паучпиз статьи и Б тезисов докладов.

Объем и структура Ш'Ш'М'- дасшргзшя соопш из прядения.

сЗаора лгтврэтури, опксашш сбъахпш и кэто^зв асслэдэвгилл, гши-K-ciii-H зксшр^стгшдиг: результатов и оборарпяя, шзодет. Га-бота кзлоызва па 157 страницах, яашаоиизного текста к кллюстрщхз-вэва&з таблична и 28 расуняа«а. Б.«йхюграф;-ш ишпаот 203 нззиг-шш раа'ог, из ню; 137 на иностр-чксьнс языках.

ЭКСШЖУ.ШАЛЫШ ЧАСТЬ. Объекты к методы нссдбдованиА. Основной объект исследования - про-КЬЕПЛСННЫЙ штамм мотаиокисляших б^етврвш Mathy!ocoocus capsulattre ВСБ-Р74 (коллекция ИШИскнпгезбелок), а так»® «золят культуры из йоршнгеров ОГО' (Спотльм Яр). Бактерия шрзщкзали в гориодочэскоа культура и при непрерывном культивирована» в рению х&хостата, издавая В форленте-р "Biotock" (V.-2 Л) КЯК "Blo-enginer-ring" <\'=7 Л) азтаяо-воздушиую смесь в обюмном сэотногэоиа 1:3 па кяиергшяоЛ' cjX3jp (Гальчзнко а соавт., 1975), при t=40-iI°C и рН Б,0. Рост культуры определяли по оптической плотности клэточнея суспензии на сгзэктрофотоиетро "sp&cor-d" при 6Ш им и Басовым методом на мембранных фИДЬТрЭХ "Synpor". ЗЙИКроСКОПИЧвСКИв НабЛЭДЭНЛЯ проводили па микроскопа ИБИ-15 в фзвовом контрасте, а также на электронной микроскопа "JEM-100C" (Япония) при ускоряющем напряжении 80 Й И фИК-' !ЦШ клеток ПО катоду (Ryter ot al. . 19S8). ЭНДОГОННОО ДЫХаЕКЗ клеток определяли на полярографо "lp-7" с кислородной ячейкой Кларка. Препараты изолированных мембран Micrococcus lysodeietlcus получали.по методу (Гельман с соавт., 1963). Внеклэточный белок определяли с Скуратовым реактивом (Racusen, 1961). Агагаяый азот в инкубационной средэ - с тринитросульфобензойиой кислотой по методу (Fields, 1971). Жирные кислоты идентифицировали методом ЛЯХ на хроматографе "Pay 104" модель 64 (Англия). Хромзто-масс-сшктромет-рический анализ - на хром-массе HP-3985 фирмы "Hewlett-Packard" (США) (Осипов с соавт.,1985). Математическую обработку результатов проводили методом стандартных квадратичных отклонений. Достоверность данных определяли с помощью критерия Стьвдэнта (Гордон, Форд, 1976).

ХАРАКТЕРИСТИКИ РОСТА МЕШОКИОЛЯЮЩИХ

БАКТЕРИЙ M.CAPSULATUS ВСБ-874.

Рост культуры М. tapsvil atus ИЗуЧЭЛЙ КЭК ПрИ ШрИОДИЧЭСКОМ ТЗК И непрерывном режимах культивирования. В периодическом режима в рткрытой системе роет ЧИСТОЙ культуры М.eapsulatus описывался классической кривой роста. Максимальная концентрация биомассы дости-

- ? -

г ала 7 г/л к 50 часу, культивирования. В зкспонекщгалыгаа фазг» клэ-гки представлены моло- и диплококками с с1=0,9-1,0 мкя,

В стационарной фазе культура представлана в основном коноко-кками увеличенных размеров с гетерогенвоа то плотности цитоплазма. '{арэз 60-85 ч наблюдался спонтаяныа автолиз культуры. В непрерывном режиш культивирования накогатшльз процесс проводили три постепенно увеличивающейся скорости протека - Д=0,05-0,21 ч-1 з течений 80-85 ч. Стабильный процесс культивирования при Д=0,2 ч-^ тозшлял достигать максимальной кошдзнтрации биомассы 12 г/л. Чз-ззз Б6 ч непрерывного культивирования было отаечено развит»© конта-я-ширугаэа бактериальной юоерофлору, при этом догдапгроэзЕга основ-юго продуцента сохранялось на уровне 93-353. Отрицательного влия-шя сопутсгаукзея мюерефлоры не от?тзно.

Одгзко, иск в лабораторных, так и в огьггао-премьшвнных уело-)члх были Шйвлзни трудности обеспечения в хемостатз стабильного гаста культуры кзк в период пакошаяия,. так и непрерывной проли^з->эдгд при со&здака а опродатанзм? регдашатвих продолах рвгули-•уеиых пэраатроз ькегкаа среди: рН,'1°, кекцзнтряцкз гзотз, фос-юро, сн4. со2 з отщця'зва газ«, скорости протока, Нестабильность :уаьтимфОЕ5ПЕл в.чрльчлась либо в слонтзнвом автолизе культуры в оч'зняз периода какпгигзип!, либо постоянным сшшзнжи концентрации издюси а зшт "л п?р',:ол. й случае спонтанного автолиза культуры, пстуда в иепрзрыззг.н рвшга при Д---0.2 ч"*1, резкое свяаэниэ коз-энтрзшш бкокассы хпррлирсвало с изшйеамем морфологии илэтох: рзеблздзл;х оданочяыо кокки, иногда агглшзраты люток гетерогенных о размеру (<т--Э,3-1,9 мкм). Автолиз клеток сопровождался даношкн! ультуры, а также снижением потребляемого кислорода, азота и со в гаодаюм г.тхэ.

При другом тага нестабильности продасса отмечалось нзрув;си;к •ггаа делечугл клсток, что сопрововдалось сниювиод скорости ростз, хпэттеч з:ош?)нтрашл биомасса активности г.кизледаия штаяа кдзт-'ни. /лтадо!» кэтгок нз яэбл далось. При ьтом резко изменялась >рФология «лоте шягшшсь подэлшзася лотки р«шшшг раз--'ров <с1=(),5-0,7 кпг«) с [езко шшаонио* стогхшш спетсире лшлжин. г.сло таких ¡ш'пж иьр,>стадс (наблюдс-н;»; до ? суток рягга) и пра и'.:■!.>~итсл ско1х- :\'х потока культура шчпиакась. В ешциальнп про-■■гриноа серии сдан»» б»ии ьдощрюгт* иольтш вк.-.ся«'и'я прлшм чпаг^.ьтоп; роста луд! к'урм. Пройодголы«* !и;елодп,".;пи*п кс.к.'^ик, ■о .'Ж'.онем'о кошиндодо источник:^ углерода .• азот;) и; и сихра-Ш'И рН с1<:Т!'м )» ф»шг»л.-<гичоски!Г п,' ^дшшк на »«.¡(ушрсмшо тпмлт

клеток. Изменение pH среди в физиологических пределах при стандартной подаче источников питания также не вызывало автолиза клэток. Снижение pH среда приводило к образованию частью клеток популяции рефрактилышх фор! с измененным морфофизиологичаским состоянием и снижением или отсутствием репродуктивной способности.

При исследовании такого "фактора риска" как бактериофаги было показано, что в автолизирующейся культуре но обнаруживалось наличие вирулентного фага (капельный метод тестирования). Систематические анализы на выявили также индуцироваиил профагов.

Обобщение результатов проведенных исследований дало основание предположить, что нестабильность роста м. cap^.uLatus ВСБ-874 в режиме хемостата может определяться нарушенном регуляции синтеза мвибранотропяых ауторегуляторных факторов.

ИЗУЧЕНИЕ АУТОРЕГУЖГОРНИ ФАКТОРОВ dj И d2 В КУЛЬТУРЕ м. capsulatus.

К числу внеклеточных метаболитов мембрэнотрошюго типа действия отнесены ауторегуляторные факторы d <д!ф}о£внциации), которые, изменяя структурное и функциональное состояние мембран клеток, влинот на физиологическое состояние микроорганизмов <Эль-Реги стан, 1988).

Вполне логичным било предположить, что дисбаланс- в культуре м. capsulatum факторов ci, кюг быть причиной нестабильности про-цзсса культивирования дззпшх бактерий. Поэтому горвоочередной задачей было выяснение Bcírpoca обладает .та изучаемая культура, ауто-регуляцдай такого типа дэгитвия.

При выделении и очистки факторов d использовались следующие биологические теста: I). Изкзнгэкие интенсивности дыхания интактных кдоток и изолированных мзмОряя (показатель юзмбрзнотрогаого действия). 2).Изменение скорости роста пролиферируюгой культуры проду-цэнта (интегральный показатель метаболической активности клеток).

3).Индукция автолиза клоток (бюлозичоская активность фактора d,,).

4).Индукция перехода вагт-тотизшл клеток в гипсметяболичосков или аяэбиотаиоское состояние (биологическая активность фактора dt).

Основываясь на дашш* о лшофияыюг «рироде комбранотропа-ых ауторогуляторов (Светличный с соавт., 1988), их выделяли из 100 л культуральпсй ВДЦКОСТЯ (Ю1) м. er.psuJ atUE экстракцией в-бутиловыи спиртом (2:1, об/об). Бутиловый икстракт упаривали ¡та роторном ис-иэршик» в вакууме. Раздеданиз фактора <а на фракции соответствующих активностей dj и <nfí проводили в йифазной система растворителей

- у -

1лороформ-метанол-вода <2:2:1, об/об>. Хлороформонно-спиртовда фракции содержали недалярнда соединения, тогда как водно-метаноль-ныв - более полярние. .

При исследовании полученных препаратов на клетки культуры в диапазоне концентрация от 5 до 40 мкл/нл показано усиленно эндогенного дыхания клеток при низких концентрациях фактора, до 10 шел/ мл, а при более высоких - ингибированив как дьиаыия клеток м. сараи! , так и зкзогекно стимулируемого (НАДН и малэтом) дыхания изолированных мембран м. 1 уьос1е1с1лсиа (рисЛ), что явилось доказательством наличия в обеих фракциях метаболитов, обладающее момбра-нотропнш типом действия. Как ввдно из рис.Г исслздуемью фракции проявляли активность не только в отношении глоток иродугрнта, на и других метавокисляюших бактерия, тагам образом, ко • обладая родю-и видосдацифичностью. Однако чувствительность тест-объектов к одной и той же дозе вносимого препарата различна. При проведении дальнейших работ то очистка и изучению факторов и за I единиц их акгивности было нриаягго количество препарата, ингибируюдее эндогенное дыхание клеток фазы линейного роста продуцента на БОЖ.

При-определении специфической биологической активности полученных препаратов было показано, что действием фактора ^ обладала водно-штанольная фракция, внесение которой в концентрации Б-8 ед/ мл в суспензию клеток фазы- лшойного роста штата ВСБ-874 и других метанокисляющих бакгерий приводило к образованию специфических цистопод!обных форм. Подученные рефрактильные клетки сохраняли клэ-.точную цэлостность в течение длительного времени даже в условиях, благоприятствуют!« автолизу (1=18-20аС, в жидкой среде роста). При высеве суспензии клеток, содержащей рефрактильяыз формы на твердуо питательную среду после 2-х месяцев хранения ее при комнатной температуре число жизнеспособных клеток составило (37 - 1,2) Ю5 кл/ мл, в контрольном варианте их число не превышало (22 -

1,7) 1С? кл/мл. В контроле при микроскопировании наблюдался массовый лизис клеток матанотрофа.

Определение биологической акдаигасти хлорофоршнно-егшрговоя фракции выявило, что в ней содержатся метаболяш, обладающий активностью фактора «т.. Вгюсйнш этой фратцш в культуру м. сараша-

.любой фазы роста в количествах 2-8 ел/мл индуцировало автолиз клеток (микроскопический наблюдения).

Таким обрааом, обнаруненшэ зф^еюи »лилиия виделояних препа ратов на физапл<я'мчг*сл№ щмцрссы ¡слеток: и каодкрорлниых ' нейтрал, 1Г(И!Г,о,|цйл' отлести т к группе ком-^занагрошшх г.уто]огулиторшх

концэнтрация колцзнтрзциг

пропарата, >л;сл/кл пропарата, ки/ыя

Ткс.1. Шзшагаз водао-спиртовой (А) и хларофоргонно-сппртоЕог (Б) фракция, БЭДОЛОКЕЫХ ИЗ К!? Н. capsnlatus На ЭНДОГВН-нос дыхзнкэ гелотгас (О,ЯМ фосфатный буфор рН 5,7)

I- М. capsul atus; й- Met hyi ог/опат mcthanlca; 3- !teth> ■

lositiU'i .spc- ium; 4- изолированные И-ЭйбрЗКЫ Micrococcus

1 ysodei с tic.

факторов типа <ix и dg. раноп выявленных для микробных культур разного систематического положения (Эль-Рзгистзн, 1983).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЖК ТЕСКОЙ ПРИРОД!« БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ФАКТОРА ¿t и. capsulaTus.

Очистку и вшрленке атстшчюго начала фактора проводили методом колоночной хрочзю|-р.1фи2 на сшккагелэ с последовательной злвцязй хлорофосом, аг.от'оном и метанолом, и послсдугсш тонкослойной хроматографией (1С},) на силикатом в систечз растворителей (пб/об): хлорофорк-мэтанол-уксузягт кжлота-дкэтилоБый эфкр (35:5: 5:4!i). Нз каждом этапа шдучаоида фракции препаратов подвергались бко.гопмоскожу т&стирсФэни-о согласно прзшнтнм критериям. Установлено, что искомеж типом дгайггпшя обладала адетоковая фрагсция (ко-ло.'/о'й'зя хромэтшргфкя),. получавшая при,р->:;долсч;!я "сырого* пропарата фактор? d <но.Щ:0--с.!гарге^ая фрзкшэт). Прг даллейпем разделе-

- ir -

пи.згоа фрзкцжи методом ТСХ было выгголэно шесть фракций, которш 5ыли тзкиэ исследованы ва биологическую активность. Специфической Ьгологическоа активностью - способностью к индухции образования »фрактальных клеток обладала фракция с Rf=0,67. Поело рэхронатог-эафии полученная хроматографичзски индивидуальная фракция фактора обладала всеми свойствами ранее описанных ауторегуляторов этого гипа. В концентрациях 7-40 мхг/мл препарат шгийировал эндогенное эыханда клеток M.capsuiatus, а также егшулируеиоэ НАДН и налатом тыханет изолированных кочйран M.iysodeicticus. Степень ингиЗирова-шя дыхания увеличивалась при возрастании концентрации вносимого зактора, снижении рН среда и развивалась во времени (аналогично фиши ва рис.1). Выдавшая индивидуальная фракция факторз м.

:apsulatus EQ ОбЛаДЭЛЭ рОДО- И ВВДОСПЗЦИфИЧНОСТЬП В 0ТН0Ш9НИИ Дру-

~лх матанксислявЕзв бактеркз, но степень воздействия на'клетки быка различной.

При дополнительном внесения препарата фактора ut (0,3-1,0 ед/ и) з культуру, находящуюся в фазо зкепокопциалыюго роста была таэчева задержка роста кикробноз популяции с послздлкззя реверси-¡а ростовых процессов. При повышении дозы вносимого препарата врэ-!Я задержи роста увеличивалось (рлс.2). Из полученных данных о заключить, что выделенные внеклзточиыэ метаболггш обладают юстиятиЗирувцеа активностью.

В дозах 10-50 «кг/ил фактор at индуцировал образований рэф-¡актаяышх анабиотических форм n.caps.uiatus, которыз была анало-1пны формам, образующимся под влиянием "сырого" препарата фактора t. Они облздали свойствами, характерными анабиотическим формам икроорганизмов: отсутствие»* экспериментально определяемой мотябо-ичоскоа активности (дохатае клеток), повшенжгл степени их свото-реломлония и уменьгенизм размеров вследствни обезвоживания клото-ного протопласта, допшавь» сохранением низвеспособности, хзрзк-ярпыма особенности«« их ультраструктурноа организации, отличт.т т шготативньпе клеток.

Таким образам, рвфрзкташше клетки, образовать которых ш-уцируется дэйстптам фактора , ишно отнести к циепхподобным знэ-яотаческйя формам, опредзляюидам сохранения вида бактерия в неблзго-риятвых для роста условиях.

Характер ВЛИЯНИЯ фаЗП'Ора ti^ Н. capsui i-í us T['-] КЛв'ПГИ 'лКа.ЯОГ'ЛЧ--

ш действие ауторз гули торов этого та па pauc i вщздонпьнг аз других, рунп бактерий, позволяют полагать одк01яшост1. кохт'.азмз их моле-Дофалго вьаимодойстъкя с моморзкок: сшсобнс-сгь

ОП " 0,3 •-

0,25-0,2 •

0,15

0,1 •• 0,05 ■

5.7 IX 15 19

—♦ t i i i -I-

49 53 57 время культивирования , ч

Рис.2. Действия различных концентраций препарата фактора на рост культуры M.eapsulatus

1- контроль, Z- 0,3 ед/мд, 3- 0,5 ед/кл, 4-1,0 од/мл.

- структуру лишдяой фазы кзмбрзны, увеличивая оз микровязкость (Ка-прельянц'с созв., 1987).

Определенна структуры фактора с^ f основанное на результатах хромато-кагс-сганстроме-рического анализа, показало, что в состав активного качала .хрсазтогрэфически индивидуальной фракции фактора dt н.с.чр;-.и1:входит два ввтрствэ. Машинная идентификация этих веществ но библиотекам truev и mbs на дисках не удалась. По времени удзркявания эта вззветва сходятся в г-Зласти линейных с жирных кислот. св ircuiiSîiyîiKitKOii-л..,яых кисло г или дезоксишнтоз. Масс-фрагмеЕтадиаянш: анагш гяяеял, что и спектрах обоих соединений имеются оо'ада . иоек, характерные дтя ссарйэиовьос кислот (ионы 117, 129, 135, КБ) .и гздрлгкегсы группы (ион joî). Это свидетельствует о ток. что длея^е рг-асчл-ва явлнотся родственными изомерами 7ЛА молзкудзкас, чс&аь&вю струш урдш раздуши. Строение

'еосиздуойгЛ долежат -до.иэча ?.С1 совпадает. Нз основании каталога яззямиого îk:îick4 но -хфпж* ф;ктг®дта1вш ко..такул (под действием 3'::î'.j], (ih::orc удара - 70 -jB> кжма щйщкитюъ строоние их ко.«; У.ул; cui.Kotii:;caçiî дзе£Кз йззс -еллстрев. этих соеда®ний.

245 т— 231 (IMC) НО—j—~j—CHL,—I—0-CIL,-L-C--CH—-j-COOH (TMC)

-*--► ICß -»¿J. О QJJ

M =378 (TMC)

Наиболее близкая версия, предложенная ЭВМ при идентафинацаа - ото лантоны шнтоновыл кислот. Они имоит многие из ионов, содвркащихся в спиртах определяемых вещзств, а именно: 103, 117, 129, 131,133, 147. 217, 245, 235. Вероятной структурой фактора аг является лак-тон 3-дезоксишнтоиовой кислоты <М=378, IMG). HO'CHjJl

^HJL-DU

Таким образом, проведенные исследования показали, что химическая природа фактора d1 культуры м. capsuiatus отличается от таковой , бактерий Pseudomonas carboxydcf I a va JJ Bacillus cereus. СЭМ

факт обнаружения различий в химической структуре соединений,' обладающих однотипным биологическим действием, является очень интересным. Работы но окончательной, идентификации хияичзскоа структуры фактора dj M.c&f.bui.ïtus, а также определение природа факторов dt других микроорганизмов представляются нам весьма значимыми.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ФАКТОРА d2 м. capsui.atus.

Полученная методом колоночной хроматографии на силикагвлв хлороформвнная фракция, содержащая относительно недалярвые липида, была подвергнута дальнейшему разделению методом препаративной ТСХ В системе (об/об): гексан-диэтиловыа зфир-уксусная кислота (75:25: I). В данной система растворителей было получено пять фракций. При сравнении биологической активности липидов отдельных фракций установлено, что искомым действием на клетки баотзриг м. capsuiatus обладала фракция свободных жирных кислот (СЖК) (табл.1), как по способности юггибировать даханио клеток, так и индуцировать их автолиз. Внасепио этой фракции в количестве 2 ед/мл вызывало. 70Х-1ШЯ лизис клеток чернз 6 ч. Ешэ болов сильное действие оказывала фракция СЕК при концентрации 4 ел/мл. Практически полный лизис культу-ры йаступал черзз 3 ч поело внесения .штидов в суспсшзию клоток.

Подученные данные позволили сдолг/гь im-ka\, что ауюжпчтакиа.

Таблжр I.

Каменею» интеназзЕоста эндогенного дыхэшш м.сарзы&ъиз под дэгствтам фракция энстрапзллшлярных липвдоэ.

мм Фракция (501 х? (Скорость потребления киcлopQдa*tx, ОП клэточ-|

МКЛ/ИЛ) |Г; |- ной сусгтзь" I

| (контроль опыт ЗИИ (% К^

1 Оо/ШН контролю) (

1 1 гМ О^мин | % к контроле 1 1

I даглицэ рида 10,12 ( 0,93 0,88 | 02,5 1 88 1

2 невдзнтифи~| | I 1

дарованная |0,16| 0,90 1,08 | 120,0 92 !

3 жирные | | 1 1

кислоты |0,3?[ 0,98 0,42 | 43,8 55 |

А навдзнтифи-1 | 1 1

дарованная |0,49| 0,87 0,81 | 83,5 87 |

Б триглицори-|0,47| 0,92 1.03 | 112,0 .88 |

да | | 1 1

хз вдэнтификацив пятен на хронэтограиме проводили по аналогии с кг

коно-, да- и триглицэролеатов; »о данные подучены полярографическим методом: измерения проводами

через 3 мин после внесения препарата в ячейку; »со оигичоскую плотность клеточной суспензии определяли через 3 ч после внесения в культуру препарата.

действие фа1гтора определяет фракция свободных жирных кислот, что согласуется с рзноо полученными данными по иослодованюо факторов с12 бактеркй р. елгьохуйогхал-а и в. с-г-си«--., а тагов дрожжей ию-с!о5рог1а1ип! ютюда^г (Э;,'.'. -Тшистан, 1988).

Исследуемая фракция (Ж фзктора , такие как и "сырой" препарат этого ауторегуляюра, з шшких концентрациях стимулировала, а в высоких - ингибировэля даханиэ клеток кродуцзгггэ. Степень ин-гв&фоваиия дахания хлаток и окетдазной активности изолированных шкбран и. 1уб<хз<?1 киои* возрастала при увеличении концэнтрации вносимой фракции, сяяжзяи-л рН инкубационной срады, уменьшении биологического материала в измерительной ячейке, рззвипэлазь во вре-кетга, э татей» ъгхжоля от фкзгологичзскогб возраста культуры Гипс. 3,-1).

§ Ut

Pf

о

M

б

GO

20

10 30 50

копцэзпрагая фактора с<г, ¡ms/nj Рис.З. Влияние фракция CSK фактора da Н. capsulatum ЕЭ ДЫХаНКЭ клэтон продуцента в зависимости от физиологического состояния (pH 5,6): I- фаза экспоненциального роста, 2- фаза линзазого роста.

5 16 25 ' " концентрация фактора d2, мкл/ия Рис.4. ВЛКЯНЙЭ фракции С!КК

фЗКГОра dg M. capsutat.us КЗ ,ЦЦ~

хзниз изолированных мйнбрзн

И. lysodelcticus ПРИ ОКИСЛЭЯИИ

НАДН (I) и «алята (2) (0.2М фосфатный буфер, pH 5,7).

Газохронэтографичесюга анализ ко»топонтного состава фракция СЯК фактора d3, ныдэлошгсй из ЮН при стабильном культивировании м. capsuiatus в режиме хекостата, позволил определить в ней спектр «тарных кислот с чотньи и нечетный числом атоков углерода от с13 до с1в, насыщенных, моно- и полиданасыденных. Преобладающими являлись пальмитиновая и пальииголвияовэя кислоты, содержание которых достигало 36% и 25%, соответственно, (тзбл.2). При биологическом тестировании коммерческих препаратов индивидуальных жирных кислот, входящих в состав фактора в дотакируших количествах, было установлено, что физиологическое действие этого ауторзгуляторз определяется пенэсыцеянышг япфпыми кислогаии (табл.З). В нодальных опытах было показано, что олеиновая и пальчитолеиповзя кислоты вызывали активный ЗВ'ГОЛИЗ ¡слеток культуры M. capsulatus любой фазы роста. Лизирущео действие пальчитияовой кислоты было вырзетно слэбсо. В присутствии олзиновоа кислоты, вносияпа в суспензию клз-гок в кснцэнггргпии 600-1200 сМ/мл, ужо чзрзз I ч инкубирования 1аблэдался интенсивный автолш клэтск (70$), ко+орлз. достигал практически 100% при ушлиадетю npsteeraí гапчгбкровавптп до í ч.

Кап уже откопалось, при культавгровгиет шгшшюлявдтс бактз-яя как в лзбораторлит условиях (в ЭТЦ пнстиггута ВНИйсгепдабогок)« гак и в' опьггао-хфомкяиюншх условиях в ршкж» хекостата, дрстаточ-

Таблица 2.

Ширвокислотныа состав внеклзточншс лкпидрв культуры м. capsuiatus в режиме звмостата.

| Нультивированиз в аппарате |

I "Biotecjc" j V=32 М"*(0ШГ, СввТЛЬШ Яр)}

Кислоты 1-:--:--■-1

| Содержания Ш (%) |

l I стабильный 1 реши 1 в условиях 1 лизиса I стабильный 1 режим. ■■• ........ 1 в условии лизиса

10:0 1 | I 0,2 0,3

11:0 i | 1 ' - 0.2 |

12:0 1 0,63 | 0,22 | 0,9 0,7 |

13:0 1 . 3.07 | 0,75 I 0,8 . 0.4 |

14:0 I 1.45 | 1,59 | 2,2 2,3 |

14:1 . | 2,32 | 2,97 1 7.8 9,3 |

15:0 . | 2,70 I 4,18 1 0,3 0,8 |

15:1 | ' СЛ. | [ сл. 0,8 |

18:0 j за,75 | 29,21 | 41,4 34,3 |

16:1 | 24,37 I 15,71 | 29,7 16,2 |

17:0 i | 0,38 | - 1 сл. СЛ. I

16; 2 | 3,19 I 6,75 | 3,1 2,7 |

17:1 | 0,39 | \ сл. 1.8 |

18:0 | 6,59 | 4,54 | 3.8 2,4 |

18:1 f 1 8,12 | 6,88 1 1.4 7,8 |

18:2 I 6,51 I 8,87 I 5.2 9,4 |

18:3 1 ,1.77 | 15.51 I 3.6 10,6 |

18:4 1 3,76 1 ,2,82 j |

Екенай. Б0'43® 59,47% 51,СОХ 59.60Ж

" - " кислота не обнаружена

"сл." кислота обнаружена в следовых количествах (менее 0,012)

но часто и без вадимьи внешних причин, наблюдала» спонтанный лизис ¡слиток растущих культур. Мы нродаоложили, что эндогенной причиной этого явлшшл может быть повышение удельной кошртрацяи фактора а. (дисбаланс Сравнительный анализ спектра жирных кислот

фактора <!а стабильно растущей гемостатзой культуры и лизирукэдйся культур, выракршаа на ОПУ Светлого Яра и ЭТЦ института ИШсилтез-белок, , показал, что в поелодлих случаях набладалось уволичояиэ удельного содержания вноклоточшл ненасыщенных отрпих кислот (фактора аг) (табл.2). Сбрзцэот па собя вникание тот факт, что увеличение об~ой суммы ненасыщенных гщрных кислот в варианте автолизирую-г?з2ся культуры по сравнению со стабильно растущая по имеет ' -липой-ног зависимости с возрастанием активности фактора Однако, полученный факт объясним при учета данных, свидетольотвупцих р более сильном дестабилизирукпои действии па кекбрацу паликензеьщонных Е1фпьк кислот по сравнения с ионоЕенасыденньки. Как следуот из табл.2 в варианте .шзируюггзйся культуры появляется в значитолшо^ количестве с1ц пол5шенаськ,еяные кислоты. Таким образок, причиной нестабильности проетводствэ био?<вссы на грградном газе, связанной С ЛИЗИСОМ, клеток хомбстатной КуЛЬТурЫ М. сарк^аЪи:;,. исчвт быть дисбаланс фзкторои в сторону повышения активности фактора ¿г.

. Пропзденпья исслэдования позволили заключить, что зкетрадал-лшярнш лишцдо, видэлденыв штанотрофом в прогосоо развития в кя— кубациошгув среду, включают соединения, обладают» ауторогулятор-льд» воздействием. Обоснованность данного вывода была экспериментально продемонстрирована в лабораторных условиях при искусственном изменении баланса факторов дополнительный внс-сепие« фактора

а в растущую культуру м. с яр-, и! дъиг. Единственным изгоняемым параметром условий культивирования было изяэшниз концонтрации аугоре-гуляторз. При индукции автолиза ктаток фазы линейного роста через & ч после внесения фактора п в концентрациях I, 2 и 4 ед/мл в инкубационной среде было обнаружено растворимого белка, соответственно:'!,^-, 3,40; 3,80 мг/мл (в контрольном варианте - 0,15 мг/:ял). Дальнейшее повыжониз концентрации вносимого ауторегулятора существенно не ускоряло процесс деградации клвток.

Были проведены допэлттголышо исследования, результаты которых могут быть исшльзовзиы пяя решения ряда прикладных задач, в частности, получения автолизагов бактериальной биомассц с долью повышения усвояемости микробного кормового белка. Для индукции автолиза был использован химический аналог фаеторз (Эль-Рзгистзн о соавт., 1386). Яндуцировашшй автолиз проводами в клеточных, суспензиях высокой плотности {ЛСИ-ПО г/л). В этом случае помимо ' ин-дуцнругаого дояствия химического аналога дополнительное вли.тйкз на цропос с т.е.т автолитичосюю ферменты, а также фатегор а,а, освобоя-дщупиася из автолкзирувдяся клепта. В цгллг. определог-пет оптеюль-

Ш

них условий протекания автолиза исслэдовалось влияние вз процесс анесенш аналога в хонцэнтрадиях 8, 8. 4, 2 и I вд/ш. Исааздовэ-но влинше рН среда, с далью выбора оптимальных значений для действия ферментов клеточного аатолитичвского комплекса (протеаз и шнтидаз), так как качество целевого продукта оценивалось по количеству реализованного из клеток растворимого белка и аминокислот. Максимальный выход белка достигался при добавлении в культуру дуктора в ковцэнтрации 2-4 ед/мл. Оптшальная концэнтрация индуктора для выхода свободных аминокислот составляла 4-6 ед/мл (табл. 4). Из данных, представленных в таблица очевидно, что нансймалыш выход белка при автолизе культуры M.capsui&tus в периодических условиях наблюдался в вариантах с использованием аналога фактора <з£ в количествах 4-в ед/мл при рН 8,5.

Выязлшвое влишпз ОйК на дьгхааш клеток, а такш проязлэнда активности комплекса автолэтичоскет фориоетов в завискиости от кон-дезтрации СШК в бактериальной суспензии ве противоречат имеющимся в литератур© даньчд! о влиянии СЩ и еэезсышэннш: жкршх кислот на степень нодсостеости клзточшх ЫОИбраН (Ar&kl. Rifklnd. 1031, F.28 et aV. ; leal). '

РОСТ КУЛЬТУРЫ м. capsijlatus В УСЛОВИЯХ ЙШИИРОШШЯ

гдадашми источника»! пйташм.

Получению результаты образовашш анабиотических рофрактаяь-ных фора м. capsuiatus под деаствизм акзогенно виосшого фактора , выделанного из культура бактерия, дало основанкэ предполсЕшь, что шрзход Е&гетатквяьк клоток в анабиотические покоящиеся фор?,»л при естественно:.! развитии культуры возшюя в результате создания условий, обесшчивакэдщ макс^альыш биосинтез и глглшность фактора Поэтому сладувдой задачей наиих иссладованиз было шучзниэ влияния различных лиштарукда факторов на разв;гтз мзтзвотрофов в условиях хешртата и обрзговавиэ рйфрактальиых форд, такш образом, доказательство образования нокоыаихся клоток в естественных • циклах развития бактериальных культур.

Пщ ¡шшш вдкяння азрашч на кроцзсс образования рьфракти-дъвых покошшхся .фора к 40 ч роста после засова уровень кислорода з среде сштзился с БОЖ от насыщения до IX. К 92 ч роста наблюдали, srra 60S клеток популяции обладала рефрактильностыз, характерной Фор«, полученных под действием экзогепно вноси?,юго фактора сц.

ВЛВДЦШ. дшэткташщ источником азота. В отличия от контрольной нульщ¡а, 1'До ь условиях непрерывною роста подана ы.зота осу-

Таблица а.

В-шгнт жирных гагслот вз эндогештоа ,га-газнга КЛТГОК культуры M.capsulatus.

КоглрПТрлШйЯ

кислота

{piS/MT^

ßJiaE3"0 ГЛЗТОК (Б Я К кскггролр ЧГ>рГЗ 3 мин ПОС.РЭ ВПОСЗЯИЯ КИСЛОТЫ)

I надьтгт- I пгшдгаг- [ стззрино- | силковая ( Í нозая J o.íüscíooan | вал ■ | j

?л ?Ш 1ГХ)

Í

Uni; нга

ПО ПО

РЧ

!

150

¡

120 ПО ISO

160

!

Тте?лща i.

ЧЦЗЭТрг'Ж!! ГГД-ПЛСрЭ M p!¡ СрЗД,' ПЯ РСЛ?р^ГЧШ1Г гжкяслзт ( чг/ги) при итажю {вредя о ч).

Ништипртт.ч I ищцктор-?, |-ол/н-

pH ерш;!

Í л i 6 я

ñ 8

i Í Г) t г с; ! '.О ¡

t 1 б 0 Л 0 к

! I.аз 1 1,15 ! 1.02 J

1 2,80 • ! 3.45 i 2,50 1

1 3,45 1 4.40 j 3,80 J

1 3,70 1 3,80 i 4.ГО 1

1 з.по . 1 3,00 1 3,40' 1

1 2 ,'М ' ' 2,65 ¡ i.гл !

! з m. и п о г: и a jot м

i . XJ-7 1 J,?2 • 1 2,00 1 i t

1 1 2.70 ! 4,40 1 ~ 1 1 5,60 1

1 3,30 1 3,40 ! s,ob ¡

! 3,00 1 3.30 1 3,10 1

1 ■ 2,90 1 3.20 J <-« -in t ! j

В, 5

2,00 3,10 5, СО 7,05 0,20 0,00

1,80 (5,10

.то.оо

7,50 3,50

дасгаииясь в виде ва-ного раствора ын^он, которые одновременно выполнял рсиь тктрушэю агента, в оцьгпшх варианта! при выходе культур на стабильный рзашм роста тигруидиа агент меняли на &%-ВЫЛ раствор Ыаок. Через 18 ч культивирования посла исключения подачи азота Б культуре наблюдали появление единичных рефрактилишх клеток, а посла 24 ч роста около 70Я клаток приобретали устойчивую рефракташюсть.

Аналогичные данные были получены при изучении влияния содер-ЛШЩШ Фо<;Фора в среде на образованна покоящихся ферм м. ca.psuii.tus. Шслэ начала стабияьного роста культуры из состава питательное среда исключали фосфаты. Через 18 ч отмечалось появление первых единичных клеток со светлыми включениями. В течений последующих 20 ч ку-кьтшкроваяия около 70-7535 клэтек популяции было представлено рефрактилълши нэделящишея формами.

Через 3 мое. хранения таких культур (алшшота адльтур, лимитировавши либо по ог, либо но м, лиЗо по р) при ъ=+4°С число жизнеспособных клаток составляло от 60 до 1Ь% от числа жизнеспособных бактерий при стабильной культивировании.

Ранее было установлено, что изменение соотношения суп и нако-пяэние восстановителя в клетках шриодаческих культур бактерия (Эль-Рогистан, 1983) иошт вызывать усиление биосинтеза фактора и приводить к индукции образования ноксшдхсн кедалядихся форм, или форм г'ипомвтаболичвекю со сниженной потенцией к делению, В наош исследованиях было впервые показано, что в условиях хемостат-ного культивирования при исчерпании или снижении концентрации кислорода, азота шш фосфора в среде культура приобретает способность к формированию анабиотических покоящихся клеток. Особо следует подчеркнуть, что при этом имеет значение как повышение абсолютного количэства фактора ^, так и изкэненда соотношения факторов . а таюке фдаико-зшшгазекда условия среда, влияющие на проявление активности фактора ^ (табл.5).

1ак лимишрованш по кислороду, способствовало как валовому увеличению факторз в культуре, так и повышению соотношения с!й. В условиях лшш-ирозания азотом наблюдался саыцй высокий по сравнению с контролем уровень синтеза фактора <а1. В условиях лдаи-•шрованин фосфором валовый уровень фактора ^ на маня-лая, но за сйт резкого снишния содержания фактора с1£ отношенда "а . по сравнению с контролем, увеличивалось в 2 раза, что объясняет наб-лдаёиое .активное образончнвз цистоподобшх рофракгдйышх форм до 60-70.!) от обшто числа клоток, и отсутстше этих форм ь стабильно

растущих контрольных культурах.

Таблица 5.

Активность факторов <1( и <*г. выделенных из т

КОТЗЯОТрОфа М. сярьиХаО.т., при рЗГШГпт лдалти- ' руюших факторах ртстз.

Варианта Содоржанта фактора АСВ,

опыта в КЖ, ед/л Г/Л рН

контроль 11,5 17,0 0,7 9,0 5.8

условия НИЗКОЙ

аэрации (1% от

насыщения) 14,3 12,5 1,15 3.3 5,0

условия лимити-

рования азотам

(N=10 МГ/НЛ) 2«, 8 20,0 1.3 4.0 5,8

условия лигекти-

рования фосфоро»

(Р~Г2,5 мг/кл) IIЛ 9.9 1,12 ■2,5 5,2

ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ АГГОРЕГУЛНЮПШХ ФАКТОРОВ Ичг В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ КУЛЬОТЦ м. CA.rsut.ATus.

Для подгвервдзния рэгуляторноа роли факторов и <)2 и выполняемой ими функции шпуляционнопо сигнала были рровздэны исслэдо-вякия по изучению изменения нонцэнтрации ауторэгуляторов па протя-мзяии онтогенетического развития горкодической культуры м. сарз«1л-145., з также культур, растущих в рекимэ хемостата.

Нч рис.5 представлены рззультзта изменения количества внекю-точяих факторов ■11 и а в процессе развития периодической культуры, которые показывают, что факторы и в КЖ присутствуют на в сох стадиях. Отчетливо выявляются дам максимума накопления ауторэгуляторов: первый - в лаг-фазе и второй - при шреходз культуры к стационарной фазе роста, что- коррелирует с получении® ранее данными по изучены» дин&чгоки накопления факторов и &г култургки р.еаг-boxyti.ifl.ava £1 О. спгвив (СЕОТЛИЧЕШ С. С03ВТ. , 1988).

• 2ü -

Bio. Б . Динамика мэшнешш активности внеклеточных кембра-нотрошшх факторов 'Ц и л2 иетанокислящих бак-ториis .capsulatum.

i

Оссбма интерес предстааиио выяснэпш балансовых соотношяяа

фСиПХфОЙ d, И da При НОЯрс1[Ш1ШЫ КМЬТТДарОВЗГЗО! П. caps ui at, nu ВСБ-871. При cKojwcTfi протеза Д=0,2 ч достигалась ьаксйааляая коя-фитршря daostaccii. Культура кагшиаась ь хоровом ыорфофиааологк-часкнв состояния. пснуляцил гошшннэ по рутщ <J-ü,f/-l,o шса» « J 4»>шис- слюгсшш bajri -иазрш. При ухбвш»шя

скореега piiissat\K:i8« до Д-0,1 «г* отшчэлсль ухудшил« яор*«.к>гк~ • •аского соотсяиш &я<.1нотр:4оь, ужля^шалась гет^югсшосгь попу-

1п ртг к:у;гл Ь,С-П,12 ч пг.щпх п*1г>т.хлгяжз* гр.'.-з;,'.'*: •■.-гпзи ~ пг чг^л, » а::с-:о

Г/и.Ч Г.}-.: с;г:рсг:п- г.ротитм гл ч'"*

гчгсгь ютурзгсяпость 150117 лп^м га рзгпр? к-эток ;<!--•(!,Г-ЕД "V!),. ¥ Т5сгл х/атох отючалэсь гайр'.тгппго пкпзрзгп»

Г5СЬ ЗГрт-Г21П'Л чзгтк КЛЗТОХ И ОСЭД'И:КЭ ПуЛЛУГ«. КСЛГ'^СЯГД ЛРЧ-{»задних кптгсс йало па згозяз 1С?. - -

Анаязифуи результата, толупящ.» 'прл о5р;.бот?"> сбрзгллзв, йгятыа га аптарзтсг. прч яязрпрйслрг? тфог^сгаз ку.ш:гокрст>ш<1 (таг'.1.6), слздуот сггугггь: кр'.т оптк^зльнсм ре«;:-:? по изрз::з1ру чзтгзгя&сги плота бхонясса сссгпйгтга»? фзкгоров р~ятто 0,4 .

Зго :.:э есотпспэп:::) ^уторзгулятрроя 0,3-0,П гяр-пг'ппяо дял фаза окспяпнцяпльаого 'рост ЕТ?р-'.».тгсзскоа культур катмготрофа. Пгл гг^-эз-т'пзг скорости протеин, у.чзнкгзяик ягя в 1,6-5,0

ргза, из?*>ряэтс;! состасгзгтсэ С-ггсроч от галггнги 0,9 до 3,0.

Таблица а.

Даппг'шз яззсолязякя факторов я <1, культурой

М. С»рзи1 а<!и<г (В Э^ППТЦЭХ аКТТТШГОСТП ЯЭ Л).

Показатель | Перждегезсгаа процесс | Нвпрермптиа протес |

|лзг--фзза| экспо- |стащга~ |Д-0,1ч"1 ¡Д-О.гч^ ¡Д-О.йбт11

| | дента | пар | | | |

^ | 13,5 | 0,5 | 10,0 | 15,2 | 4,1 | 9,3 | аа | 12,0 | Г,О | 17,0 | 17,0 | 10,0 | 4,6 | | Г,12 | 0,5 | 0,9 | 0,89 | 0,39 | 2,0 |

-----:-(---

Анализ полученных результатов позволяет заключить, что как скорость роста гориодических культур к их развития, так и стабильность процессов непрерывного культивирования матанотрафов контролируется не только собственным уровнем эндогенных зуторегулягоркых мембранотропных факторов и <з2, по и кх определенным балансовом соотношением. Следует особо отметать, что влияние эуторегулягоров, безусловно, связано с изменением внапних условна культивирования, влмгаздп: как не их биосинтез, так и на активность. .

вывода.

X. Вшрвые показано, что в процессе роста и развитая м. capsuiatua й трдадачяском и непрерывном режимах бактерии синтезируют и экск-рэгируот в инкубационную среду ауторегулоторные иембранотропнда факторы d1 i] d2, тип действия которых аналогичен таковому, обнаруженных parteo для* другиг групп микроорганизмов.

2. Установлено, что факторы dt и d2 м.capsuiatus не обладает1 вида-специфичностью по отаовению к другим родам ивтанокисдящих бактерий: фактор dj вызывает переход вегетативных клаток м. capsuiatus в пшоштаболическое ш анабиотическое состояние. Последнее сопровождается образовавши цистоподсбных рефракгаяъных покоящихся фори бактерий.. Биологическое действие фактора а2 M.capsuiatus заключается в регуляции автолитических процессов клеток.

3. На основащш изучения роста штбнохислявдих бакториа M.capsuia-tus БСБ-й/4 при дариодичвском и непрерывном культивировании в асептических условиях показано, что одной из причин наблюдаемого спонтанного изменения скорости роста культуры является измененк» уровня ыембранотролвых ауторегулягорных факторов,, обусловленных условиями 'культивирования, в частности, лимитироваяшм 02, n и Р.

4. Изучала химическая природа факторов ^ и <¡2 м. capsuiatus и установлено, что фактор м. capsuiatua отличается от факторов dt бак-териг f.carboxydofXava И B.cereus. На ОСНОВЭШШ ДЗНПЫХ хрОИЗТ-МаСС-сдактрюмегрии показано, что активное начало фактора а м. eapsuiatus представлено сшсш двух изомеров дезоксипантоновой кислота. Фактор аг н. capsula tus представлен еушоа свсбодаых шрных кислот. Биологическая активность его определяется преимущественно действием "знасьчденных иирных кислот.

о. На ш.лоаании динамики синтеза внеклеточных ауторюгуляторов dt и а, шюрвые показано, что их р-вгуляторное влияние на культуру м. сар-iuiati;^, растущую в периодическом или в хемостатном режимах основано на их кооперативном действии, рвзультат которого зависит но только от уровня факторов в культуре, но и их соотношения - d1 ,'6. В условиях и1ш'ш-прошшлзиного производства гапрша (ЦПУ Оват-лонрсного завода БВК) показано, что одной из причин спонтанного автолиза "ультурм'м. capsuiatus является дисбаланс факторов при значыолыюм повышении фактора d и увеличении в нем содзрка-:¡¡hí полинонасцщрнпы! жирных кислот.

'/■ Опрюделоиы условия роста M.capEui.atus » хемосгатных Культурах, ¡¡¡«подшпке к ш{х>хо,ду со ЧК.% кло'шк бакчерив из веттзтмвного состояния И ЦИСЮЛ'ОДООЫА) фирхы. что янляотся основой дли j ¡заработки

режимов, обЭспэ'чивзэдиг даггельиоо храненкэ даотшого материала. 8. Опрэдалйны условия индуцированного автолиза ¡udtok культуры м. capsuiatus под дояствивм фактора da иди ого хиуичоского аналога, что является осповоа для разработки рзкгаоп полу чти» я автолизатоп

НГССробНОЙ ОИОМЗССЫ.

Г. Л.Н.Зорина, Е.С.Бзбусешсо, Т.О.Лкнуов, Л.А.Горскзя, "Хкмичесяйй состав биомассы кэтапотрофт»'* бзктор;га". Вссгспзпая конференция "СоБрзкоплле проблемы бксггоглслопя тсроорг^яжш.з", тезисы докладов. Гига, 13G7, -с. 14.

2. В.П.Зобшяга, Э.Я./гпгров, Е.С.Бзбусошсо, П.С.Тврот?, И.Л.Буторовл,

3.М.Блохияз. "Состав биоюнозов в провесах па природном гэзо", Всесоюзная конференция "Биофизика кккробннг популяция", тпзисы докладов. Красноярск, 1987, с. 12-13.

3. Е.С.Еобусэнко, И.Б.Грздовэ, Г.И.Эль-РЪпкггап, Л.Л.Шптамна, А. Н.Козлова, С.А.Злацвв. '"Бко ."огкчэскга функции нпсклпочшя ауторо -гулягоряых факторов dt И Лг культя И M»t Чу) <лоее-.ж esp-.uJ *tue". ^»республиканская конференция "Биология, хультивировацко и биотехнология микроорганизмов", трзиси докладов. Гапкпят. 1ШЭ, с.5.

4. Е.С.Бгбусгэнко, Н.Б.Градовэ, Г.И.аль-Рвгистаи, Л.11.Козлова, Г.А.Осипов, С.Л.Завцэв. " Образование шгеклэточпгас тйранотропных ауторогуляторпых фатпров и чг в процзееэ роста мотанокислпкячзя бактерии (foUiyiococcus capsuiatus". Всесоюзная конференция "Рзгу-ляция микробного катаболизма", тезисы докладов. Пурто, 1339, с.8. Б. Е.С.Вабусэнко, Н.Б.Грздовэ, Г.И.Эль-Рзпгстзн, Р.Р.Гзязов. "Ятгл-кио лкмотирушс« факторов за рост и развитиз гзтэкогагаляхщоя бактерии Mothyloiocous capsul *tue". Всесоюзная КОНфврОЯЦИЯ "ЛПШГГКрО-ванио и ияттЯнропшнгз роста микроорганизмов", тозкеп докладов. Пущина, 1389, с. IO-IT.

G. Е.'С.БзЯугеико, Р.Р.Гаязсв, Г.И.Зль-Рзгисглн, Й.ВЛ'радовэ. "Га намика ауторвгуляторгмх факторов dt и аг в исфиодичрскоа культуре MeUiylc-coccus caps'jJ alus". БИОТОЛТГОЛОТИЯ, 1931, Н Б, С. 20-28. 7. Е.С.Бабусошсп, Г.И.Эль-Вэгистзн, Н.Б.Грэиша, АЛ.Козлпвз. Г.Л. Остов. "Исследование кшбранотропга.« ауторогудяторньчг фмеггрп и^таноют-лгадюс бактерий". Успехи ззгоия, Г8Э1, Т.ОП. В.IT, q.2302--2373.

СПИСОК ПУбЛШСДЩШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ