Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе

Жданова, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе"

На правах рукописи

Жданова Ольга Юрьевна

АУТОАНТИТЕЛА К МОДИФИЦИРОВАННЫМ ЛИПОПРОТЕИНАМ ЧЕЛОВЕКА И ИХ РОЛЬ В АТЕРОГЕНЕЗЕ

Специальность 03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в отделе биохимии Государственного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург (директор — академик РАМН Ткаченко Борис Иванович).

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Денисенко Александр Дорофеевич \

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Кокряков Владимир Николаевич

доктор медицинских наук,

профессор Галебская Людвига Вячеславовна

Ведущее учреждение: Институт кардиологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится 2005 г. в «..7/» ч.

на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д.69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12.

Автореферат разослан г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д 001.022.03 доктор биологических наук, профессор

Пучкова Л. В.

но

M6>?e<f¿L

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов патогенеза атеросклероза по-прежнему остаётся актуальной проблемой современной науки, в связи с высокой частотой и тяжестью этого заболевания.

Все большее внимание уделяется в последнее время роли иммунных факторов в атерогенезе. Широкое распространение получила аутоиммунная теория патогенеза атеросклероза, в основе которой лежит подкрепленное рядом фактов предположение об аутоантигенности аполи-попротеин (ano) В-содержащих липопротеинов. Предполагается, что аутоантитела вырабатываются в ответ на химическую модификацию липопротеинов, происходящую in vivo.

В крови человека обнаружены гликированные, десиалированные и перекисно-модифицированные липопротеины низкой плотности (ЛГГНП) и аутоантитела (ААТ) к ним. При этом остается неясным, исчерпывается ли список модификаций липопротеинов перечисленными выше, или же в организме человека возможны и другие атерогенные модификации липопротеинов.

В то же время показано, что в крови как здоровых лиц, так и больных ишемической болезнью сердца (ИБС), а также в стенках крупных артерий присутствуют аутоиммунные комплексы, в состав которых входят ano В-содержащие липопротеины, и убедительно продемонстрировано, что такие комплексы способны индуцировать трансформацию макрофагов в пенистые клетки, вызывать повреждение эндотелиальных клеток и увеличивать поступление в интиму артериальной стенки атеро-генных липопротеинов. Однако до сих пор остается невыясненным весь спектр модификаций липопротеинов, приводящих к возникновению аутоиммунного ответа.

Кроме того, до сих пор не выяснена роль аутоантител в атеросклеро-тическом процессе. С одной стороны, сам факт накопления аутоиммунных комплексов липопротеин-антитело в местах поражений сосудистой стенки может свидетельствовать о негативных последствиях образования аутоантител. С другой стороны, есть данные, говорящие о возможной положительной роли аутоантител. Так, иммунизация животных (кроликов или мышей) окисленными ЛПНП приводит к замедлению развития экспериментального атеросклероза, что сопровождалось резким возрастанием в кровотоке титра антител к таким ЛПНП. Изуче ние участия антилипопротеиновых антител в атерогенезе представляется важным для формирования подходов к лечению, профилактике и, возможно, диагностике атеросклероза.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является выявление и характеристика новых типов аутоантител человека, на-

правленных к модифицированным липопротеинам (м-ЛПНП). В связи с этим перед нами стояли следующие практические задачи:

1. Разработка методов обнаружения, количественного определения и выделения в препаративных количествах аутоантител к липопротеинам из плазмы крови человека.

2. Характеристика аутоантител к липопротеинам человека: тип иммуно-

глобулинов, выяснение модификаций липопротеинов, ответственных за развитие аутоиммунного ответа.

3. Изучение связи содержания в крови человека аутоантител к липопротеинам с наличием и выраженностью клинических проявлений атеросклероза.

4. Поиск эпитопов, распознаваемых аутоантителами к липопротеинам, в зоне атеросклеротических поражений аорты человека.

5 Изучение некоторых биологических свойств человеческих аутоантител к липопротеинам: влияние на цитотоксичность модифицированных ЛГТНП и на их захват макрофагами. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Циркулирующие человеческие аутоантитела к липопротеинам пред-

ставляют собой смесь различных по специфичности антител, направленных, по крайней мере, к пяти типам модифицированным ЛПНП. Данные антитела присутствуют у большинства лиц, не зависимо от пола, возраста (в диапазоне 30—80 лет) и наличия клинических проявлений атеросклероза.

2. Изученные модификации липопротеинов потенциально могут быть от-

ветственны за выработку обнаруженных у человека антител, что было продемонстрировано в экспериментах по иммунизации кроликов.

3. В поражённых атеросклерозом участках аорты человека присутству-

ют эпитопы, распознаваемые как человеческими, так и кроличьими антителами к модифицированным ЛПНП, что свидетельствует о существовании in vivo естественного лиганда для этих антител.

4. Специфичность аутоантител к модифицированным ЛПНП (как че-

ловеческих, так и кроличьих) обусловлена преимущественно типом модификации антигена, а не природой белка.

5. Концентрация свободных циркулирующих аутоантител к ЛПНП в крови не является диагностическим маркером атеросклероза.

6. Человеческие аутоантитела к модифицированным ЛПНП способны

модулировать биологические свойства этих ЛПНП, такие как цитотоксичность и способность индуцировать накопление эфиров холестерина в макрофагах.

Научная новизна работы. Впервые было показано наличие у человека циркулирующих аутоантител к ацетилированным, малеилированным, кротонированным и N-гомоцистеиноированным ЛПНП. Охарактеризованы специфичность я иммуноглобулиновый состав данных антител.

Продемонстрирована способность кротонированных ЛПНП вызывать у кроликов выработку специфических антител.

В стенке аорты иммуногистохимическими методами обнаружены отложения ацетилированных и малеилированных белков. Показано, что в интиме аорты с атеросклеротическими поражениями присутствуют антитела, распознающие ацетилированные и малеилированные ЛПНП.

Впервые показано, что у пациентов с клиническими появлениями атеросклероза, несмотря на повышенное содержание в плазме аутоиммунных комплексов «липопротеин-антитело» и модифицированных липопротеинов, концентрация антилипопротеиновых аутоантител в целом ниже, чем у практически здоровых лиц.

Выявлен цитотоксический эффект аутоантител к МДА-ЛПНП. Установлено, что человеческие аутоантитела подавляют захват модифицированных ЛПНП макрофагами.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты, полученные в данной работе, указывают на возможность образования in vivo различных форм модифицированных ЛПНП и открывают перспективу для исследования участия таких липопротеинов в атеросклеротическом процессе.

Разработана тест-система для количественного определения уровня аутоантител к м-ЛПНП в крови человека и предложена методика препаративного выделения таких антител с помощью аффинной хроматографии. Получены антисыворотки кролика с высоким содержанием специфических антител, направленных к исследованным типам м-ЛПНП. Как кроличьи гипериммунные сыворотки, так и человеческие аутоантитела, специфичные к модифицированным ЛПНП, могут быть использованы для иммуногистохимического обнаружения атерогеш гых модификаций белков.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 работ (из них 1 статья). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на симпозиуме «Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза» (Москва, 2000), на научной конференции, посвященной 110-летию института экспериментальной медицины «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины» (Санкт-Петербург, 2000), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001), на XIII Липидном Симпозиуме (Leipzig, 2002), на 8ой Конференции Скандинавского Атеросклеротического общества (Copenhagen, 2002), на конференции молодых учёных «Актуальные вопросы клинической i: экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2003), на Международной научно-практической конференции молодых учёных «Вчеш май-бутнього» (Одесса, 2003), на Юбилейной научной конференции молодых учёных северо-западного региона (Санкт-Петербург, 2004).

Работа поддержана грантами РФФИ 01-04-48023, 04-04-48068.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунком и 10 таблицами. Библиографический список использованной литературы содержит 207 источников.

Личный вклад. Соискателем были осуществлены химические модификации белков; разработана тест-система (на основе твёрдофазного иммуноферментного анализа) для количественного определения уровня аутоантител к м-ЛПНП в крови и проанализированы образцы плазмы пациентов; получены гипериммунные сыворотки кроликов; выделены человеческие и кроличьи антитела к м-ЛПНП с помощью аффинной хроматографии; проанализированы активность и специфичность антител к м-ЛПНП кролика и человека; приготовлены конъюгаты антител с пероксидазой хрена д ля иммуногистохимических исследований; определено содержание в крови окисленных ЛПНП и холестерина иммунных комплексов у пациентов; проведена статистическая обработка результатов. Опыты по изучению цитотоксичности аутоантител и по их влиянию на захват м-ЛПНП макрофагами, а также по обнаружению эпитопов в стенке аорты были выполнены при участии соискателя.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Пациенты и образцы плазмы крови.

Было обследовано 116 человек обоего пола, из них 72 пациента с ише-мической болезнью сердца и другими клиническими появлениями атеросклероза и 44 практически здоровых лиц Кровь у обследумых пациентов забиралась натощак и плазма хранилась до использования при -20°С.

За помощь при составлении групп обследуемых лиц приношу глубокую благодарность сотруднице отдела биохимии, д б н Н.Г. Никульчевой. Выделение ЛПНП человека.

ЛПНП выделяли из плазмы донора методом ступенчатого ультра-центри-фугирования я градиенте плотности №Вг (с!=1.021-1.055 г/мл). Полученную фракцию диализовали против 0.01 М фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с рН 7 4, содержащего 0.04% ЭДТА. Содержание белка в ЛПНП анализировали по методу Лоури в модификации Марквелла (Магк\уе11 М.А.К. е1а1., 1978). Химическая модификация ЛПНП.

Окисление ЛПНП: нативные ЛПНП инкубировали при +37°С в присутствии 5мМ Си504 в течение 18 часов. Процесс окисления останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 1ммоль/л.

Модификация малоновым диальдегидом: к Л ПНП добавляли свежеприготовленный 0.5М водный раствор малонового диальденида (МДА) в соотношении 6.6 мкл/мг белка и инкубировали 1 час при комнатной

темепературе. По окончании модификации здесь и далее ЛПНП диали-зовали против ФСБ. Степень модификации здесь и далее (кроме N-ro-моцистеинирования) оценивали по убыли поверхностных NH2-rpynn белка (Fields R., 1972).

Ацетилирование и малеилирование: к ЛПНП добавляли уксусный ангидрид (3 мкл/мг белка) или мелко растёртый малеиновый ангидрид (0.5 мг/мг белка) и инкубировали 1 час при комнатной температуре; рН реакционной среды поддерживали в пределах 7—8 с помощью 1М NaOH.

Карбамоилирование, кротонирование, обработка гексаналем и уксусным альдегидом ЛПНП: к ЛПНП добавляли, соответственно, KCNO (3 мг/мг белка) в виде 0.2 М раствора, кротоновый альдегид (1.4 мкл/мг белка), гексаналь (1.8 мкл/мг белка, предварительно растворяли в этаноле 1:10) или уксусный альдегид (0.8 мкл/мг белка). Смесь выдерживали в течение ночи при комнатной температуре.

N-гомоцистеинирование ЛПНП: к ЛПНП в 0.01М ФСБ (рН 8.4) добавляли гидрохлорид тиолактона DL-гомоцистеина (5 мг/мг белка) и выдерживали в течение ночи при комнатной температуре (White F.H., 1972). В данном случае для оценки степени модификации определяли содержание поверхностных SH-групп белка (Habeeb A.F.S.A., 1972).

Малонирование ЛПНП: к Л ПН П добавлял и предварителы ю разведённый в ацетоне (1:10) дихлорангидрид малоновой кислоты (20 мкл/мг белка) и инкубировали 1 час при комнатной температуре; рН реакционной среды поддерживали в пределах 7—8 с помощью 1М NaOH.

Модификацию бычего или человеческого сывороточного альбумина (БСА или ЧСА) всеми указанными способами проводили по аналогичным методикам.

Получение кроличьих антисывороток к модифицированным ЛПНП.

Кроликов иммунизировали внутрибрюшинно аутологичными модифицированными ЛП дозой 0.5-1 мг белка в полном адьюванте Фрейн-да (1:1 по объёму) 3—6 раз с интервалом 7 дней. Антисыворотку (30—50 мл) отбирали через 5—10 дней после последней иммунизации. Аффинная хроматография (выделение аутоантител к м-ЛПНП).

В качестве аффинного лиганда использовали модифицированный БСА. Для приготовления сорбента применяли CNBr-сефарозу 4В (Pharmacia Fine Chemicals). Модификацию связанного с сефарозой белка проводили согласно описанным выше методикам. На сорбент с модифицированным соответствующим образом БСА наносили освобожден ную от липопротеинов плазму крови человека или антисыворотку кролика, с последующей промывкой колонки 0.01М ФСБ. Элюцию антител проводили 0.1М раствором уксусной кислоты (рН 2.5), содержащей 0.15М NaCl, рН полученной фракции немедленно доводили до 7.4 с помощью 1М раствора NaOH. Для иммуногистохимических исследований

выделенные кроличьи и человеческие антитела к м-ЛПНП были конъю-гированы с пероксидазой хрена (ПХ) (Кэтти Д., Райкундалия И., 1991). Твёрдофазный иммуноферментный анализ.

Анализ активности антител проводился с помощью твердофазного иммуноферментного аналаза с использованием в качестве твердой фазы 96-луночных планшетов для микротитрования (Nunc) высокой сорбцион-ной емкости, содержащие 1 мкг в лунке нативных или модифицированных ЛПНП или альбумина. В качестве блокирующего буфера использовался 0.5% раствор казеина в ФСБ, а проявляющих антител — антитела против IgG или IgM человека, меченые ПХ (Полигност), или же меченые ПХ козьи антитела к IgG кролика (Sigma). В качестве хромогенного субстрата использовали 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Оптическую плотность (ОП) в лунках при 450 нм измеряли на автоматическом ридере ELx-800 (ФинБио). Уровень антител выражали в относительных единицах (отношение значений ОП, полученных для модифицированного и нативного БСА).

Конкурентный анализ. Конкуренция между антигенами. Человеческую плазму или кроличью антисыворотку в соответствующем разведении преинкубировали 1 час в присутствии возрастающих концентраций тестируемых антигенов (0—1000 мкг/мл), после чего вносили в лунки. Все остальные стадии проводили как описано выше.

Конкуреция между человеческими и кроличьими антителами к м-ЛПНП. Человеческую плазму (или аффинно выделенные антитела) преинкубировали с кроличьей антисывороткой в нескольких разведениях. Проявляли с помощью меченых ПХ антител к IgG или IgM человека. Определение содержания окисленных ЛПНП в плазме.

Был использован тестовый набор Oxidized LDL ELISA (Mercodia). Метод основан на «сэндвич»-варианте твёрдофазного иммуноферментного анализа с применением нижних моноклональных антител к окисленным ЛПНП и меченых ПХ антител к ano В. Определение холестерина циркулирующих иммунных комплексов.

Иммунные комплексы (И К) осаждали на холоду с помощью полиэти-ленгликоля (м.в. = 6000). Осадок растворяли в 0.1 мл физиологического раствора, после чего определяли содержание холестерина в образцах с помощью энзиматического колориметрического набора CHOLESTEROL liquicolor (HUMAN) по рекомендованному производителем протоколу. Иммуногистохимический анализ.

Объектом анализа являлись участки аорты с атеросклеротическими поражениями, а также неизмененные участки аорты. Исследуемые образцы представляли собой материал 18 аутопсий (мужчины, средний возраст 55±6 лет), умерших от острой сердечно-сосудистой недостаточности. Исследование проводили на криостатных срезах толщиной 4-6 мкм, которые фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин и промывали в ФСБ (pH 7.4). Для выявления липидов срезы окрашивали Oil red О.

Иммуногистохимическое окрашивание срезов проводили с помощью аффинно выделенных человеческих или кроличьих аутоантител к м-J1ПНП, а также кроличьих антител к апо В человека, конъюгированных с ПХ. В качестве хромогенного субстрата использовали 3,3'-диамино-бензидин. После проведения иммуногистохимической реакции ядра клеток докрашивали гематоксилином. Препараты просматривали и фотографировали в световом микроскопе Axiomat (Opton).

За помощь в выполнении этой части работы приношу глубокую благодарность сотруднику отдела биохимии, д.б.н. П.В. Пигаревскому. Изучение захвата иммунных комплексов м-ЛПНП — ААТ макрофагами.

Свежевыделенные перитонеальные макрофаги, полученные от беспородных белыхмышей-самцов, преинкубировали 20 часов в пластиковых чашках Петри (Falkon) в среде Игла, содержащей 10% FCS (Goldstein et al., 1979). Затем клетки инкубировали 6 часов при +37°С в среде Игла, содержащей 0.5% бычьего сывороточного альбумина, 50 мкг/мл холестерина (ХС) нативных или модифицированных человеческих ЛПНП (свободных или в комплексе с ААТ) и 0.1 мМ 14С-олеиновой кислоты в комплексе с альбумином (удельная радиоактивность 20 000 имп/мин/нмоль). По окон-ча! tии инкубации измеряли включение меченой олеиновой кислоты в эфи-ры холестерина (после тонкослойной хроматографии). Подсчет радиоактивности производили с помощью счетчика RakBeta (LKB). Для изучения влияния аутоантител на захват м-ЛПНП макрофагами были использованы не менее трёх различных пулов ЛПНП и партий аффиш го выделенных ААТ.

Для приготовления комплексов «м-ЛПНП-ААТ» к модифицированным человеческим ЛПНП (обработанным МДА и ацетилированным) добавляли аффинно выделенные человеческие аутоантитела (против МДА- или ацет-ЛПНП, соответственно) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Иммунные комплексы готовили в избытке антигена (молярное отношение 4:1). Перед добавлением к клеткам модифицированные ЛПНП (как свободные, так и в составе ИК) стерилизовали фильтрацией (диаметр пор 0.22 мкм).

Все опыты по изучению захвата м-ЛПНП макрофагами были выполнены совместно с сотрудником отдела биохимии, к.б.н. А.Г. Виноградовым, за что автор приносит ему глубокую благодарность. Изучение цитотоксического эффекта иммунных комплексов «ЛПНП-антитело».

Мышиные перитонеальные макрофаги культивировали в чашках Петри на покровных стеклах в среде Игла, содержащей 5 мг/мл белков сыворотки крови человека, лишенной липопротеидов, с добавлением 50 мкг/мл нативных ЛПНП или окисленных ЛПНП, свободных или в комплексе с аутоантителами (ААТ к МДА-ЛПНП), или с добавлением свободных аутоантител (15 мкг/мл). Цитотоксический эффект липопротеидов оценивали визуально иммуноцитохимическим методом с исполь-

зованием набора APOPTEST-FITC Kit (DAKO). Подсчет апоптозных или некротических клеток проводили в люминесцентном микроскопе при х 400 в 10 полях зрения.

За помощь в выполнении этой части работы приношу глубокую благодарность сотруднице отдела биохимии, к.б.н. А. Н. Восканьянц. Статистическая обработка результатов.

Статистический анализ данных проводился обычными методами вариационной статистики, с использованием t-критерия Стьюдента, в программной среде «Statistica». Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка (М±ш). В некоторых случаях применялись методы непараметрической статистики (тест Манна-Уитни). При анализе корреляций между переменными использован метод простой линейной корреляции (Пирсона).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Обнаружение новых типов аутоантител к модифицированным липопроте-инам в крови человека.

При изучении взаимодействия антител плазмы крови человека с модифицированными in vitro ЛПНП было выявлено более эффективное их связывание с модифицированными малоновым диальдегидом (МДА-), ацетилированными (ацет-), малеилированными (мал-), кротонированными (кротон-), карбамоилированными (карб-) и N-гомоцистеинированными (гомоц-), а также с окисленными ЛПНП (ок-ЛПНП), по сравнению с на-тивными ЛПНП Связывание антител с малонированными, атакже обработанными ацетальдегидом и гексаналем ЛПНП не отличалось от контроля.

Таким образом, помимо уже известных из литературы аутоантител к окисленным и МДА-модифицированным ЛПНП, было показано присутствие в крови человека аутоантител, взаимодействующих по крайней мере с пятью типами модифицированных ЛПНП. Тем не менее, на данном этапе работы не было ясно, обнаружены ли разные по специфичности аутоантитела, или же наблюдалось перекрестное взаимодействие антител одного типа с родственными антигенами.

Для более детальной характеристики специфичности выявленных антител, была изучена способность липопротеинов, модифицированных различным образом, конкурировать между собой за связывание с антителами. Оказалось, что взаимодействие аутоантител с кротонированными ЛПНП ингибировалось только собственным антигеном (т.е. самими кротонированными ЛПНП), но не нативными или модифицированными иным образом ЛПНП (рис. 1а). Аналогичная картина наблюдалась и для аутоанител, взаимодействующих с ацетилированными и малеилированными ЛПНП. Конкурентами за связывание с аутоанти-телами к МДА-ЛПНП выступали только сами МДА-ЛПНП, и, в меньшей степени, ацетилированные ЛПНП.

Тип модификации антигена:

-♦-МДА

• ацетклирование кротоиирование -й- штивный

0.01 0.1 1 10 100 концентрация конкурента (мкг/мл)

Тип модификации антигена:

-♦-МДА

• ацетилированне кротоиирование -0-карбамоялирование -В- гомоцистеиннрование -А- иативный

1 10 100 1000 концентрация конкурента, мкг/мл

Ы »

Й з I *

Ш и

Тш модификации антигена:

-♦-МДА

• ацетилироваиие кротоиирование -6-карбамоилирование -В- гомоцистеииирование -А- иативный

1 10 100 1000 концентрация конкурента, мкг/мл

Рис. 1. Конкуренция различных антигенов за ААТ (^М) к кротон-ЛПНГТ (а), ААТ (1ёМ) к гомоц-ЛПНП (б) и ААТ (ДО) к карб-ЛПНП (в) (данные твердофазного иммуноферментного анализа).

За взаимодействие с аутоантителами к гомоцистеинированным ЛПНП класса IgM конкурировали только сами гомоц-ЛПНП и, в меньшей степени, МДА-ЛПНП и ацет-ЛПНП (рис. 16). Наоборот, способностью ингибировать активность аутоантител к карб-ЛПНП класса IgG обладали все изучаемые антигены, т.е. модифицированные любым способом ЛПНП (но не нативные ЛПНП) (рис. 1в). Полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженные аутоантитела (кроме ААТ к карб-ЛПНП) специфичны к конкретному типу модифицированных ЛПНП.

Таким образом, помимо уже известных в литературе аутоантител человека, направленных к окисленным и МДА-модифицированным ЛПНП, были выявлены ещё четыре новых типа специфических аутоантител к м-ЛПНП.

При изучении иммуноглобулинового состава обнаруженных человеческих ААТ было показано, что основную их часть составляют IgG (8090 %), существенно меньшая доля приходится на IgM (порядка 10 %), а IgA присутствуют в минорном количестве (единицы процентов). Было показано также, что активность взаимодействия антител с м-ЛПНП зависит от степени модификации антигена: эффективность связывания возрастала с увеличением доли поверхностных аминогрупп белка, подвергнутых модификации.

Важно, что при использовании в качестве антигенов модифицированных человеческого и бычьего сывороточного альбумина (ЧСА, БСА) были получены принципиально такие же результаты как и при использовании м-ЛПНП (при изучении эффективности связывания человеческих антител и в опытах по конкурентному анализу специфичности антител). Эти данные свидетельствуют о том, что при распознавании антигена изучаемыми антителами существенное значение имеет не природа белка антигена, но тип его модификации.

Аутоантитела к модифицированным ЛПНП обнаруживались не только в плазме крови человека. В экстракте аорты человека с атеросклеро-тическими поражениями были выявлены антитела, более активно взаимодействующие с МДА-, ацет- и мал-ЛПНП человека, по сравнению с нативными ЛПНП.

Представлялось важным выяснить, обладают ли изучаемые типы модифицированных ЛПНП способностью вызывать выработку специфических антител. Было обнаружено, что иммунизация кроликов ауто-логичными ЛПНП, модифицированными in vitro, приводила к появлению в крови животных высоко титра антител, направленных, соответственно, к МДА-модифицированным, ацетилированным, малеилированным, крото-нированным и гомоцистеинированным ЛПНП. В ходе конкурентного анализа была продемонстрирована очень высокая специфичность полученных кроличьих антител: активность таких антител ингибировалась только собственным антигеном. Важно, что кроличьи антитела распоз-

навали не только модифицированные кроличьи ЛПНП, но и соответствующим образом модифицированные белки иной природы: ЛПНП человека, а также ЧСА и БСА (рис. 2).

МДА-БСА -*- ацет-БСА -А- крогон-БСД

-©-БСА

100 1000 10000 кратность разведения сыворотки

Рис. 2. Взаимодействие антисыворотки кролика к кротон-ЛПНП с модифицированным БСА.

* <

0.0001 0.001 0.01

фактор разведения добавленной сыворотки кролика

антисыворотка кролика к мал-ЛПНП

сыворотка кролика без антител к мал-ЛПНП

Рис. 3. Конкуренция между кроличьими и человеческими антителами к мал-ЛПНП за связывание с антигеном (мал-БСА).

Было показано, что антитела человека и кролика, направленные к одному типу модифицированных Л ПНП, конкурируют между собой за связывание с антигеном (рис. 3). Эти данные могут говорить о том, что кроличьи и человеческие антитела, специфичные к одному типу м-ЛПНП, распознают сходные (если не идентичные) эпитопы модифицированного белка.

Изучение связи уровня в крови аутоантител к модифицированным ЛПНП с клиническими проявлениями атеросклероза.

Был проведён сравнительный анализ средних уровней в крови аутоантител к различным типам модифицированных ЛПНП в группах пациентов с ИБС и практически здоровых лиц. Достоверные различия были выявлены только в случае ААТ (^в) к МДА-ЛПНП (см. табл.). Содержание этих антител у больных оказалось ниже, чем в контрольной группе. Для всех остальных девяти изученных типов аутоантител (против ацет-, мал-, кротон- и гомоц-ЛПНП (иммуноглобулины классов и ^М), а также ААТ (^М) к МДА-ЛПНП), различия не достигали статистической значимости. При этом тенденция к понижению содержания в крови у больных ИБС наблюдалась и для некоторых других типов антител: например, для ААТ (^М) к ацет-ЛПНП (р=0.19) и ААТ (^в) к кротон-Л ПНП (р=0.26). В то же время, в некоторых случаях была обнаружена и обратная тенденция: например, уровень ААТ (^О) к мал-ЛПНП при ИБС был несколько повышен (р=0.34).

Табл. Средние уровни ААТ к м-ЛПНП (М ± ш) у больных ИБС и здоровых лиц.

Тип и класс ААТ ИБС без ИБС

анти-МДА 1.41 ±0.05* (п=56) 1.62±0.08 (П=34)

анти-ацет 1.30±0.06 (п=28) 1.34±0.10 (п=22)

18С анти-мал 3.07±0 26 (п=61) 2.67±0.26 (п=29)

анти-кротон 2 93±0.19 (п=55) 3 28+0.22 (п=30)

анти-гомоц 1.36±0.06 (п=45) 1.42±0.07 (п=30)

анти-МДА 1.83±0.09 (п=61) 1.79±0.08 (п=45)

анти-ацет 2 89+0.15 (п=66) 3.33±0.26 (п=45)

18М анти-мал 2.68±0.12(п=65) 2.79±0.16 (п=44)

анти-кротон 3.74±0.21 (п=69) 3.68±0.21 (п=44)

анти-гомоц 1.51±0.10 (п=36) 1.42+0.07 (п=30)

* р<0.05 по сравнению с контрольной группой (без ИБС)

Аналогичная картина была получена и при анализе уровня ААТ у лиц с более тяжёлым течением ИБС: пациенты, перенесшие инфаркт миокарда (ИМ), имели достоверно пониженное содержание ААТ (^в) к МДА-ЛПНП, по сравнению с лицами без ИБС (1.41±0.06 против 1.64±0.08,р<0.05). Для остальных типов ААТ различия не достигали статистической значимости.

Была изучена также взаимосвязь уровня циркулирующих ААТ к м-ЛПНП с наличием других клинических проявлений атеросклероза. Показано, что у пациентов, имеющих, помимо ИБС, атеросклероз артерий головного мозга, достоверно понижено содержание в крови ААТ (^М) к ацет- и мал-ЛПНП (соответственно, 2.48±0.20 против 3.41±0.28 и 2.30±0.18 против 2.82±0.17, р<0.05). Улиц, страдающих атеросклерозом артерий нижних конечностей, наблюдался достоверно пониженный уровень ААТ (^С) ккротон-ЛПНП (1.78±0.20 против 3.32±0.22,р<0.05).

Таким образом, достоверные различия в уровне ААТ в крови у пациентов с теми или иными клиническими проявлениями атеросклероза, по сравнению с контролем (лица без ИБС), выявлялись лишь в единичных случаях, причём у больных содержание ААТ было пониженным. Для большинства изученных типов ААТ эти различия не достигали статистической достоверности, однако при этом чаще наблюдалась тенденция к уменьшению уровня ААТ при наличии заболевания, хотя в некоторых случаях выявлялась и обратная тенденция.

Полученные данные говорят о слабой взаимосвязи уровня ААТ к м-ЛПНП в крови с наличием клинических проявлений атеросклероза. В связи с этим, представлялось важным выяснить, имеется ли корреляция между содержанием в крови ААТ к м-ЛПНП, с одной стороны, и концентрацией самих модифицированных ЛПНП, а также циркулирующих ЛПНП-содержащих иммунных комплексов, с другой.

Оказалось, что ни содержание циркулирующих окисленных ЛПНП, ни концентрация холестеринсодержащих ИК не коррелирует с уровнем изучаемых аутоантител. Важно, что при этом концентрация в крови окисленных ЛПНП была достоверно выше (49.3+3.8 против 36.2±5.6, р<0.05 по тесту Манна-Уитни), а концентрация холестеринсодержащих ИК — в несколько раз выше (64.6±6.1 мкг/мл против 18.9+2.6 мкг/мл, р<0.001) у больных ИБС, что согласуется и с литературными данными (Уразгильдеева С.А. и соавт., 1997; НоКюе! Р. е1 а1., 2001). Таким образом, отсутствие выраженной взаимосвязи между уровнем ААТ к м-ЛПНП в крови и наличием клинических проявлений атеросклероза согласуется с тем, что не была обнаружена корреляция уровня этих антител с такими маркерами атеросклероза, как концентрация в крови окисленных ЛПНП и холестерина иммунных комплексов.

Обнаружение эпигонов модифицированных ЛПНП в стенке аорты человека.

Для поиска исследуемых типов модифицированных ЛПНП в стенке аорты человека проводилось иммуногистохимическое окрашивание срезов с помощью кроличьих и человеческих антител к МДА-, ацет- и мал-ЛПНП. Модифицированные белки выявлялись во всех типах ате-росклеротических поражений (липидные пятна, липидно-фиброзные и фиброзные бляшки), причём их отложения имели во многом сходный характер.

Наиболее часто встречаемыми, характерными для всех изучаемых типов модифицированных белков, были внеклеточные диффузные их отложения в покрышке и верхних слоях липидно-фиброзных и фиброзных бляшек, особенно — в местах перехода из поражённой интимы нормальную (рис. 4а).

Рис 4. Отложения малеилированных белков (а) и ano В-содержащих липопротеинов (б) в покрышке фиброзной бляшки.

Для МДА-белков можно отметить и более глубокие диффузные внеклеточные отложения, а также их локализацию на волокнистых структурах в поверхностных и более глубоких слоях бляшки. Примечательно, что распределение этих белков было часто сходным с отложением липидов на границе интимы и медии вдоль внутренней эластической мембраны.

Среди внутриклеточных отложений МДА-белков следует отметить их присутствие в цитоплазме макрофагов в глубоких отделах интимы, а также в клетках типа гладкомышечных в поверхностных участках бляшки. Внутриклеточные отложения были характерны и для других типов модифицированных белков.

Характер распределения ano B-содержащих липопротеинов в различных типах поражений был сходен с картиной, полученной для модифицированных белков (рис. 46).

Следует отметить, что эпитопы модифицированных белков были выявлены только в зонах атеросклеротических повреждений, но не в нормальных участках интимы. Эти данные могут говорить о вероятном участии белков, несущих подобные эпитопы, в развитии атеросклеротических поражений.

Важно, что после предварительного промывания образцов ткани в фосфатно-солевом буфере не удавалось обнаружить ни МДА-модифи-цированные, ацетилированные или малеилированные белки, ни ano B-содержащие липопротеины. Этот факт может служит доказательством того, что обнаруживаемые эпитопы принадлежат не структурным, но неким водорастворимым белкам, какими являются, в том числе, и ЛПНП. В пользу предположения о том, что были выявлены именно модифицированные ЛПНП, говорит и солокализация эпитопов, распознаваемых антителами к м-ЛПНП, с отложениями ano В.

Интересно, что в тех зонах, где определялись модифицированные белки, часто одновременно выявлялись и очаги отложений IgG. Солокализация иммуноглобулинов с отложениями модифицированных белков и ano В, в совокупности с фактом обнаружения специфических ААТ к м-ЛПНП в экстрактах аорты, может косвенно свидетельствовать о присутствии в сосудистой стенке иммунных комплексов, содержащих изучаемые типы модифицированных ЛПНП. Биологические эффекты аутоантител к модифицированным ЛПНП.

Было изучено влияние человеческих аутоантител на захват модифицированных ЛПНП макрофагами. Как и ожидалось, модификация ЛПНП (обработка малоноым диальдегидом или ацетилирование) приводила к многократному (в 6—8 раз) увеличению их захвата макрофагами, по сравнению с нативными ЛПНП (р<0.05), что согласуется с хорошо известными литературными данными (Brown М. et al, 1979; Fogelman A.M. et al., 1980).

Добавление в инкубационную среду специфических аутоантител (ААТ к МДА- и ацет-ЛПНП, соответственно) вызывало небольшое (около 20%), но достоверное снижение интенсивности захвата модифицированных ЛПНП (рис. 5). Следует отметить, что активность захвата мЛ ПНП в составе иммунного комплекса оставалась, тем не менее, достаточно высока (в 5—6 раз выше, чем у нативных ЛПНП). Важно, что аутоантитела разной специфичности (к МДА- и ацет- ЛПНП) имели сходный эффект на захват м-ЛПНП (небольшое ингибирование).

0.4

□ без ААТ И+анти-МДА

ЛПНП наг МДА-ЛПНТТ

Рис. 5. Влияние человеческих аутоантител к МДА-ЛПНП на захват модифицированных ЛПНП макрофагами. * р< 0 05 по сравнению с нативными ЛПНП & р< 0.05 по сравнению с МДА-ЛПНП без ААТ.

Ингибирующий эффект аутоантител на захват м-Л ПНП, возможно, объясняется тем, что антитела частично блокируют или экранируют те участки на поверхности модифицированных ЛПНП, которые участвуют в связывании с макрофагальными рецепторами. Экранирующий эффект наиболее вероятен для аутоантител класса ^М, которые являются очень крупными молекулами. Возможно также, что наблюдаемое явление представляло собой результирующий эффект двух разнонаправленных действий (активация захвата за счёт Ис-рецептора и подавление захвата вследствие экранирования).

В опытах с мышиными перитонеальными макрофагами была исследована цитотоксичность окисленных ЛПНП, свободных и в комплексе со специфическими человеческими аутоантителами. Цитотоксическим действием обладали как сами окисленные ЛПНП, так и иммунные комплексы «ЛПНП-ААТ», что хорошо согласуется с литературными данными (Неппквеп Т. е1а1., 1981; Денисенко А.Д., 1991). При этом наблюдалась клеточная гибель как по типу апоптоза, так и по пути некроза (рис. 6). Добавление в инкубационную среду человеческих ААТ, специфичных к МДА-ЛПНП, модулировало цитотоксический эффект окисленных ЛПНП: изменялось как соотношение клеток, вовлечённых в апоптоз и некроз, так и общее количество погибших макрофагов. Выяснилось, что и сами свободные аутоантитела оказывают цитотоксичес-кое действие на клетки, вызывая их гибель по пути некроза или апоптоза.

□ апоптоз И некроз

ок-ЛПНП ок-ЛПНП + ААТ

ААТ

Рис. 6. Количество некротизированных клеток (% от общего числа) при 24-часовой инкубации макрофагов с окисленными ЛПНП, иммунными комплексами «ок-ЛПНП — ААТ», или свободными ААТ.

Заключение

Таким образом, в ходе данного исследования впервые были обнаружены четыре новых типа специфических аутоантител к модифицированным ЛПНП у человека (направленные к ацетилированным, малеи-лированным, кротонированным и 1М-гомоцистинированным ЛПНП). Показано, что исследованные типы модифицированных ЛПНП в принципе могут быть ответственны за выработку таких антител. Кроме того, у человека выявлены эпитопы, распознаваемые антителами к м-ЛПНП в стенке аорты с атеросклеротическими поражениями.

Не обнаружено выраженной взаимосвязи между уровнем ААТ к мЛ П НП в крови и нал ичием клинических проявлений атеросклероза. При этом чаще наблюдалась тенденция к более низкому содержанию аутоантител у больных, что, возможно, связано с большим количеством модифицированных ЛПНП при выраженном атеросклерозе артерий и фиксацией на них антител. Установлено, что антилипопротеиновые ААТ оказывают небольшой ингибирующий эффект на захват модифицированных ЛПНП макрофагами, что также может свидетельствовать об их потенциальном антиатерогенном действии.

В то же время было показано, что ААТ модулируют цитотоксический эффект модифицированных ЛПНП и, кроме того, сами способны вызывать гибель клеток, что говорит уже об их проатерогенных свойствах.

Подводя итоги, можно сказать, что изученные аутоантитела способны модулировать биологические эффекты модифицированных липо-протеинов, и могут обладать как защитными, так и проатерогенными свойствами.

4. ВЫВОДЫ

1. Присутствующие в крови человека аутоантитела к липопротеи-нам представляют собой смесь различных по специфичности антител, направленных, по крайней мере, к пяти типам модифицированных ЛПНП: обработанным малоновым диальдегидом, ацетилированным, малеилированным, кротонированным и М-гомоцистеинированным. Изученные типы антител обнаруживаются у большинства лиц, не зависимо от пола и возраста (в диапазоне 30-80 лет). Данные антитела относятся, в основном, к классам и (с преобладанием ^в), и в незначительной степени — к классу

2. Иммунизация кроликов аутологичными модифицированными ЛПНП приводит к появлению в крови высокого титра специфических антител. Как кроличьи, так и человеческие антитела распознают соответствующим образом модифицированные ЛПНП, а также модифицированные бычий и человеческий сывороточный альбумин.

3. Между содержанием в крови аутоантител к ЛПНП человека и наличием клинических проявлений атеросклероза (ишсмическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, а также атеросклероз артерий головного мозга и нижних конечностей) имеется слабая взаимосвязь, при этом уровень аутоантиател к ЛПНП в целом снижен у пациентов с клиническими появлениями атеросклероза, по сравнению с практически здоровыми лицами.

4. Уровень аутоантител к м-ЛПНП в крови не коррелирует с концентрацией циркулирующих холестеринсодержащих иммунных комплексов и окисленных ЛПНП.

5. В стенке аорты человека, в участках с атеросклеротическими повреждениями, присутствуют эпитопы, распознаваемые специфическими антителами к модифицированным ЛПНП.

6 Человеческие аутоантитела к м-ЛПНП оказывают небольшой ин-гибирующий эффект на захват модифицированных ЛПНП макрофагами, что не вызывает существенного снижения атерогенного потенциала таких липопротеинов.

7. Окисленные ЛПНП, как свободные, так и в комплексе со специфическими человеческими аутоантителами, цитотоксичны по отношению к макрофагам. Аутоантитела изменяют соотношение типов клеточной гибели (апоптоза и некроза), индуцируемой окисленными ЛПНП, а также модулируют выраженность цитотоксического эффекта. Кроме того, сами аутоантитела к МДА-ЛПНП обладают цитотоксиче-ским действием.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. ПигаревскийП.В., СуконинаВ.Е., Соловьёва MA., МиссюльБ.В., Бондарь К.В., Загольская В.Н., Жданова О.Ю., Денисенко А.Д. Аутоантитела к модифицированным липопротеинам у человека при атеро-генезе // Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза: материалы симпозиума — Москва, 1 июня 2000; М., 2000, с.31.

2. СуконинаВ.Е., Пигаревский П.В,СоловьёваМ.А., МиссюльБ.В., Бондарь К.В., Загольская В.Н., Жданова О.Ю. Аутоантитела к модифицированным липопротеинам у человека // Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины: тезисы докладов - Санкт-Петербург, 18-20 декабря 2000; С-Пб, 2000, с.170.

3. Бондарь К.В., Суконина В.Е., Жданова О.Ю. Изучение антигенной специфичности аутоантител к модифицированным липопротеинам у человека. // Дни иммунологии в Санкт — Петербурге. Всероссийская научная конференция с международным участием: тезисы докладов — Санкт-Петербург, 21-24 мая, 2001; С-Пб, 2001, с. 176.

4. Denisenko A.D., Zhdanova O.Y., Vinogradov A.G., Sukonina V.E., Missul B.V., Pigarevsky P.V. Autoimmune response to modified lipoproteins and human atherosclerosis. Abstracts of XIII Lipid Meeting Leipzig, 30.092.10.2002, p. 64.

5.Denisenko A.D., Zdanova O.Yu., Vinogradov A.G., Sukonina V.E., Nikitina E.Yu., Pigarevsky P.V. Antilipoprotein autoantibodies (Aab), lipoproteine-antibody immune complexes (Lp-Ab 1С) and atherosclerosis. Abstracts of 8th Annual Scandinavian Atherosclerosis Conference, 2002, p.78.

6. B.A. Нагорнев, A.H. Восканьянц, А.Г. Виноградов, Жданова О.Ю., А.Д. Денисенко. Цитотоксический эффект липопротеидов низкой плотности. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2003, т. 135, №1, с. 107-109.

7. О.Ю.Жданова, А.Г.Виноградов, А.Н.Восканьянц. Аутоантитела к модифицированным липопротеинам и их влияние на взаимодействие липопротеинов с клетками // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: тезисы докладов - Санкт-Петербург, 2003; С-Пб, 2003, с. 308.

8. Жданова О.Ю., Пигаревский П.В., Филичкин Н.А. Новые типы модифицированных липопротеинов в атерогенезе. // Вчеш майбутньо-го. Международная научно-практическая конференция молодых учёных: тезисы докладов — Одесса, 14—16 октября, 2003; Одесса, 2003, с.4.

9. Жданова О. Ю. Характеристика свободных аутоантител к модифицированным липопротеинам плазмы крови человека. // Юбилейная научная конференция молодых учёных Северо-западного региона (К 60-летию Российской Академии Медицинских Наук): тезисы докладов — Санкт-Петербург, 21-22 октября, 2004; С-Пб, 2004, с. 41.

Подписано в печать 06.05.2005. Гарнитура Newton. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз.

Издательство Санкт-Петербургского института истории РАН «Нестор-История»

Отпечатано в типографии СПбИИ РАН «Нестор-История» 197110 Санкт-Петербург, ул. Петрозаводская, 7 Тел. (812)2351586 nestor_histona@list.ru

- 98 42

РНБ Русский фонд

2006^4 11057

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жданова, Ольга Юрьевна

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна работы.

Теоретическое и практическое значение работы.

Апробация работы.

Личный вклад.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Роль модифицированных ЛПНП в атерогенезе.

2.2. Иммунные факторы в атерогенезе. Роль иммунного ответа на модифицированные ЛПНП в атерогенезе.

2.3. Типы модифицированных ЛПНП, обнаруженные 1N VIVO. иммуногенные эпитопы, возникающие при модификации.

2.3.1. Окислительная модификация ЛПНП.

Перекисно-модифицированные ЛПНП.

Инициаторы перекисного окисления ЛПНП in vivo.

Разнообразие эпитопов, возникающих при перекисной модифиции липопротеинов in vivo.

Изменение химических и физико-химических свойств ЛПНП при перекисном окислении.

Другие механизмы окисления ЛПНП in vivo.

Окисление ЛПНП, индуцированное пероксидазой.

Участие миелопероксидазы в окислении ЛПНП.

2.3.2. Гликированные ЛПНП.

2.3.3. Десиалированные ЛПНП.

2.3.4. Протеолиз ano В.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Пациенты и образцы плазмы крови.

3.2. Выделение ЛПНП человека.

3.3. Химическая модификация ЛПНП.

3.4. Получение кроличьих антисывороток к модифицированным ЛПНП.

3.5. Выделение аутоантител к модифицированным ЛПНП (аффинная хроматография).

3.6. Твердофазный иммуноферментный анализ (т-ИФА).

3.6.1 Анализ активности антител.

Выявление аутоантител плазмы крови человека.

Анализ активности кроличьих антисывороток.

3.6.2. Конкурентный анализ.

Конкуренция между антигенами.

Конкуреция между человеческими и кроличьими антителами к м-ЛПНП.

3.6.3. Определение содержания окисленных ЛПНП в плазме.

3.7. Определение холестерина циркулирующих иммунных комплексов.

3.8. Определение концентрации гомоцистеина в плазме крови человека.

3.9. Иммуногистохимический анализ.

3.10. Получение экстракта стенки аорты человека.

3.11. Изучение захвата иммунных комплексов «м-ЛПНП - ААТ» макрофагами.

3.12. Изучение цитотоксического эффекта иммунных комплексов ЛПНП-антитело.

3.13. Статистическая обработка результатов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Обнаружение и характеристика антилипопротеиновых антител человека.

4.1.1. Поиск модификаций ЛПНП, ответственных за выработку антител.

4.1.2. Влияние степени модификации ЛПНП на эффективность связывания с антителами.

4.1.3. Изучение специфичности человеческих аутоантител к м-ЛПНП.

4.1.4. Взаимодействие ААТ к м-ЛПНП с другими модифицированными белками.

4.1.5. Аутоантитела к м-ЛПНП, выделенные методом аффинной хроматографии.

4.1.6. Аутоантитела из экстрактов аорты человека.

4.2. Кроличьи аутоантитела к модифицированным ЛПНП.

4.3. Уровень циркулирующих ААТ к м-ЛПНП человека и клинические проявления атеросклероза.

4.3.1. Разработка метода определения уровня ААТ.

4.3.2. Содержание аутоантител к м-ЛПНП в крови человека.

4.3.3. Анализ взаимосвязи между содержанием ААТ в крови и клиническими проявлениями атеросклероза.

Частота обнаружения ААТ к м-ЛПНП у человека.

Взаимосвязь уровня ААТ с клиническими проявлениями атеросклероза.

Соотношение уровня ААТ с другими факторами риска ИБС.

Дислипопротеинемия.

Гипертоническая болезнь.

Курение.

Гипергомоцистеинемия.

Содержание в крови окисленных ЛПНП.

Содержание в крови аутоиммунных комплексов ЛПНП-антитело.

4.4. Обнаружение эпитопов модифицированных ЛПНП в стенке аорты человека.

4.5. Биологические эффекты аутоантител к м-ЛПНП.

4.5.1. Влияние ААТ на захват модифицированных ЛПНП макрофагами.

4.5.2. Влияние ААТ на цитотоксичность модифицированных ЛПНП.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе"

Актуальность проблемы

Изучение механизмов патогенеза атеросклероза по-прежнему остаётся актуальной проблемой современной науки, в связи с высокой частотой и тяжестью этого заболевания.

Все большее внимание уделяется в последнее время роли иммунных факторов в атерогенезе. Широкое распространение получила аутоиммунная теория патогенеза атеросклероза, в основе которой лежит подкрепленное рядом фактов предположение об аутоан-тигенности аполипопротеин (ano) В-содержащих липопротеинов. Предполагается, что аутоантитела вырабатываются в ответ на химическую модификацию липопротеинов, происходящую in vivo.

В крови человека обнаружены гликированные, десиалированные и перекисно-мо-дифицированные липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и аутоантитела (ААТ) к ним. При этом остается неясным, исчерпывается ли список модификаций липопротеинов перечисленными выше, или же в организме человека возможны и другие атерогенные модификации липопротеинов.

В то же время показано, что в крови как здоровых лиц, так и больных ишемической болезнью сердца (ИБС), а также в стенках крупных артерий присутствуют аутоиммунные комплексы, в состав которых входят ano В-содержащие липопротеины, и убедительно продемонстрировано, что такие комплексы способны индуцировать трансформацию макрофагов в пенистые клетки, вызывать повреждение эндотелиальных клеток и увеличивать поступление в интиму артериальной стенки атерогенных липопротеинов. Однако до сих пор остается невыясненным весь спектр модификаций липопротеинов, приводящих к возникновению аутоиммунного ответа.

Кроме того, до сих пор не выяснена роль аутоантител в атеросклеротическом процессе. С одной стороны, сам факт накопления аутоиммунных комплексов липопротеин-антитело в местах поражений сосудистой стенки может свидетельствовать о негативных последствиях образования аутоантител. С другой стороны, есть данные, говорящие о возможной положительной роли аутоантител. Так, иммунизация животных (кроликов или мышей) окисленными ЛПНП приводило к замедлению развития экспериментального атеросклероза, что сопровождалось резким возрастанием в кровотоке титра антител к таким ЛПНП. Изучение участия антилипопротеиновых антител в атерогенезе представляется важным для формирования подходов к лечению, профилактике и, возможно, диагностике атеросклероза.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования является выявление и характеристика новых типов аутоантител человека, направленных к модифицированным липопротеинам (м-ЛПНП). В связи с этим перед нами стояли следующие практические задачи:

1) Разработка методов обнаружения, количественного определения и выделения в препаративных количествах аутоантител к липопротеинам из плазмы крови человека.

2) Характеристика аутоантител к липопротеинам человека: тип иммуноглобулинов, выяснение модификаций липопротеинов, ответственных за развитие аутоиммунного ответа.

3) Изучение связи содержания в крови человека аутоантител к липопротеинам с наличием и выраженностью клинических проявлений атеросклероза.

4) Поиск эпитопов, распознаваемых аутоантителами к липопротеинам, в зоне атеро-склеротических поражений аорты человека.

5) Изучение некоторых биологических свойств человеческих аутоантител к липопротеинам: влияние на цитотоксичность модифицированных ЛПНП и на их захват макрофагами.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Циркулирующие человеческие аутоантитела к липопротеинам представляют собой смесь различных по специфичности антител, направленных, по крайней мере, к пяти типам модифицированным ЛПНП. Данные антитела присутствуют у большинства лиц, не зависимо от пола, возраста (в диапазоне 30-80 лет) и наличия клинических проявлений атеросклероза.

2) Изученные модификации липопротеинов потенциально могут быть ответственны за выработку обнаруженных у человека антител, что было продемонстрировано в экспериментах по иммунизации кроликов.

3) В поражённых атеросклерозом участках аорты человека присутствуют эпитопы, распознаваемые как человеческими, так и кроличьими антителами к модифицированным ЛПНП, что свидетельствует о существовании in vivo естественного лиганда для этих антител.

4) Специфичность аутоантител к модифицированным ЛПНП (как человеческих, так и кроличьих) обусловлена преимущественно типом модификации антигена, а не природой белка.

5) Концентрация свободных циркулирующих аутоантител к ЛПНП в крови не является диагностическим маркером атеросклероза.

6) Человеческие аутоантитела к модифицированным ЛПНП способны модулировать биологические свойства этих ЛПНП, такие как цитотоксичность и способность индуцировать накопление эфиров холестерина в макрофагах.

Научная новизна работы

Впервые было показано наличие у человека циркулирующих аутоантител к ацетили-рованным, малеилированным, кротонированным и N-гомоцистеиноированным ЛПНП. Охарактеризованы специфичность и иммуноглобулиновый состав данных антител. Продемонстрирована способность кротонированных ЛПНП вызывать у кроликов выработку специфических антител.

В стенке аорты иммуногистохимическими методами обнаружены отложения ацети-лированных и малеилированных белков. Показано, что в интиме аорты с атеросклероти-ческими поражениями присутствуют антитела, распознающие ацетилированные и малеи-лированные ЛПНП.

Впервые показано, что у пациентов с клиническими появлениями атеросклероза, несмотря на повышенное содержание в плазме аутоиммунных комплексов липопротеин-антитело и модифицированных липопротеинов, концентрация антилипопротеиновых аутоантител в целом ниже, чем у практически здоровых лиц.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты, полученные в данной работе, указывают на возможность образования in vivo различных форм модифицированных ЛПНП и открывают перспективу для исследования участия таких липопротеинов в атеросклеротическом процессе.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на симпозиуме «Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза» (Москва, 2000), на научной конференции, посвященной 110-летию института экспериментальной медицины «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины» (Санкт-Петербург, 2000), на всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2001), на XIII Липидном Симпозиуме (Leipzig, 2002), на 8— Конференции Скандинавского Атеросклеротического общества (Copenhagen, 2002), на конференции молодых учёных «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2003), на Международной научно-практической конференции молодых учёных «Вчеш майбутнього» (Одесса, 2003), на юбилейной научной конференции молодых учёных северо-западного региона (Санкт-Петербург, 2004).

Работа поддержана грантами РФФИ 01-04-48023, 04-04-48068.

Личный вклад

Соискателем были осуществлены химические модификации белков; разработана тест-система (на основе твердофазного иммуноферментного анализа) для количественного определения уровня аутоантител к м-ЛПНП в крови и проанализированы образцы плазмы пациентов; получены гипериммунные сыворотки кроликов; выделены человеческие и кроличьи антитела к м-ЛПНП с помощью аффинной хроматографии; проанализированы активность и специфичность антител к м-ЛПНП кролика и человека; приготовлены конъюгаты антител с пероксидазой хрена для иммуногистохимических исследований; определено содержание в крови окисленных ЛПНП и холестерина иммунных комплексов у пациентов; проведена статистическая обработка результатов. Опыты по изучению цитотоксичности аутоантител и по их влиянию на захват м-ЛПНП макрофагами, а также по обнаружению эпитопов в стенке аорты были выполнены при участии соискателя.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Жданова, Ольга Юрьевна

6. ВЫВОДЫ

1) Присутствующие в крови человека аутоантитела к липопротеинам представляют собой смесь различных по специфичности антител, направленных, по крайней мере, к пяти типам модифицированных ЛПНП: обработанным малоновым диальде-гидом, ацетилированным, малеилированным, кротонированным и ТЧ-гомоцистеи-нированным. Изученные типы антител обнаруживаются у большинства лиц, не зависимо от пола и возраста (в диапазоне 30-80 лет). Данные антитела относятся, в основном, к классам и ^М (с преобладанием и в незначительной степени - к классу ^А.

2) Иммунизация кроликов аутологичными модифицированными ЛПНП приводит к появлению в крови высокого титра специфических антител. Как кроличьи, так и человеческие антитела распознают соответствующим образом модифицированные ЛПНП, а также модифицированные бычий и человеческий сывороточный альбумин.

3) Между содержанием в крови аутоантител к ЛПНП человека и наличием клинических проявлений атеросклероза (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, а также атеросклероз артерий головного мозга и нижних конечностей) имеется слабая взаимосвязь, при этом уровень аутоантиател к ЛПНП в целом снижен у пациентов с клиническими появлениями атеросклероза, по сравнению с практически здоровыми лицами.

4) Уровень аутоантител к м-ЛПНП в крови не коррелирует с концентрацией циркулирующих холестеринсодержащих иммунных комплексов и окисленных ЛПНП.

5) В стенке аорты человека, в участках с атеросклеротическими повреждениями, присутствуют эпитопы, распознаваемые специфическими антителами к модифицированным ЛПНП.

6) Человеческие аутоантитела к м-ЛПНП оказывают небольшой ингибирующий эффект на захват модифицированных ЛПНП макрофагами, что не вызывает существенного снижения атерогенного потенциала таких липопротеинов.

7) Окисленные ЛПНП, как свободные, так и в комплексе со специфическими человеческими аутоантителами, цитотоксичны по отношению к макрофагам. Аутоантитела изменяют соотношение типов клеточной гибели (апоптоза и некроза), индуцируемой окисленными ЛПНП, а также модулируют выраженность цитотоксического эффекта. Кроме того, сами аутоантитела к МДА-ЛПНП обладают цитотоксическим действием.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жданова, Ольга Юрьевна, Санкт-Петербург

1. Арвье Ж., Уильяме А.Ф. (1991) Иммуноаффинная хроматография. // В кн. Антитела: Методы.- М.: Мир, т.1., 287 с.

2. Ашмарин И.П. (1997) Аутоантитела — регуляторы биохимических и физиологических процессов в здоровом организме. Место в филогенезе и среди других эндогенных регуляторов. // Журн. эвол. биохим. физиол., 33(2), 228-233.

3. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль JI.M. (1987) Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой. // Вопр. мед. химии, 33 (1), 118-122.

4. Денисенко А.Д. (1991) Роль аутоиммунных комплексов липопротеид-антитело в обмене липидов и атерогенезе. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Л., 1991 г.

5. Денисенко Т.В. (1990) Гликозилированные липопротеиды как атерогенный фактор при диабете. II Вопр. мед. химии, 2, 5-10.

6. Каленич О.С., Тёртов В.В., Новиков И.Д. (1991) Холестерин циркулирующих иммунных комплексов как биохимический маркер коронарного атеросклероза. // Кардиология, 31(2), 42-44.

7. Климов А.Н. (ред.) (1986) Иммунореактивность и атеросклероз. II Л.: Медицина, 192 с.

8. Климов А.Н., Денисенко А.Д., Белоцерковский М.В. и др. (1994) Криоплазмосорб-ция — метод удаления иммунных комплексов липопротеин-антитело и других ате-рогеных субстанций у больных атеросклерозом. // Вестн. РАМН, 4, 37-42.

9. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. (1999) Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. // С-Петербург: Питер Ком., 512 с.

10. Кэтти Д., Райкундалия И. (1991) Иммуноферментный анализ И В кн.: Антитела: Методы. М.: Мир, т. 2., 384 с.

11. Нагорнев В.А, Восканьянц А.Н., Виноградов А.Г. и др. (2003) Цитотоксический эффект липопротеидов низкой плотности. И Бюлл. эксп. биол. мед., 135(1), 107-109.

12. Полетаев А.Б., Морозов С.Г., Ковалев И.Е. (2002) Регуляторная метасистема. Иммунонейроэндокринная регуляция гомеостаза. ИМ.: Медицина, 168 с.

13. Попов А.В., Виноградов А.Г. (1985) Роль нерегулируемого захвата модифицированных липопротеидов клетками в развитии атеросклероза. // Актуальные проблемы патогенеза атеросклероза /под ред. А.Н. Климова.-Л.: АМН СССР, 48-64.

14. Титов В.Н. (1996) Конформация аполипопротеина В-100, структура и функциональная классификация липопротеидов низкой плотности. // Биохимия, 61(1), 3-23.

15. Туркова Я. (1988) Аффинная хроматография // М.: Мир., 271 с.

16. Ahmed Е., Trifunovic J., Stegmayr В. et al. (1999) Autoantibodies against oxidatively modified LDL do not constitute a risk factor for stroke; a nested case-control study. // Stroke, 30, 2541-2546.

17. Al-Abed Y., Bucala R. (2000) Structure of a synthetic glucose derived advanced glyca-tion end product that is immunologically cross-reactive with its naturally occurring counterparts // Bioconjugate Chem, 11, 39-45.

18. Bakalova R., Zhelev Z., Goudev A. et al. (1999) Serum level of IgG autoantibodies against oxidized low density lipoproteins and lag-phase of serum oxidation in coronary heart disease—inverse correlation. // Gen Physiol Biophys, 18, 87-97.

19. Balada E., Ordi-Ros J., Matas L. et al. (2002) Atherosclerosis and anti-oxidized low density lipoprotein antibodies in an elderly population. // Med Clin (Bare), 119, 161-165.

20. Basta G., Schmidt A.M., De Caterina R. (2004) Advanced glycation end products and vascular inflammation: implications for accelerated atherosclerosis in diabetes. // Cardio-vasc Res, 63, 582-592.

21. Basu S.K., Brown M.S., Ho Y.K. et al. (1979) Degradation of low density lipoprotein dextran sulfate complexes associated with deposition of cholesteryl esters in mouse macrophages. If J Biol Chem, 254, 7141-7146.

22. Baynes J.W., Thorpe S.R. (2000) Glycoxidation and lipoxidation in atherogenesis. // Free Radic Biol Med, 28, 1708-1716.

23. Beaumont J.L., Doucet F., Vivier P. et al. (1988) Immunoglobulin-bound lipoproteins (Ig-Lp) as markers of familial hypercholesterolemia, xanthomatosis and atherosclerosis. /У Atherosclerosis, 22, 67.

24. Belkner J., Wiesner R., Rathman J. et al. (1993) Oxygenation of lipoproteins by mammalian lipoxygenases. IIEur J Biochem, 213, 251-261.

25. Bergmark C., Wu R., de Faire U. et al. (1995) Patients with early-onset peripheral vascular disease have increased levels of autoantibodies against oxidized LDL. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 15, 441-445.

26. Beuge J.A., Aust D.A. (1978) Microsomal lipid peroxidation. // Methods Enzymol. 52, 302-310.

27. Bing H., Wang J.,Zhang Ch. et al. (2004) Positive correlation between oxidized LDL and LDL immune complexes. // Clin Biochem, 37, 72-75.

28. Brett J., Schmidt A.M., Yan S.D., et al. (1993) Survey of the distribution of a newly characterized receptor for advanced glycation end products in tissues. // Am J Pathol, 143, 1699-1712.

29. Brown M.S., Goldstein J.L. (1979) Receptor-mediated endocytosis: Insights from the lipoprotein receptor system. // Proc Natl Acad Sei USA, 76, 3330-3337.

30. Brown M.S., Ho Y.K., Goldstein J.L. (1982) The cholesterol ester cycle in macrophage foam cells Continual hydrolysis and reesteryfication of cytoplasmic cholesteryl esters. // J Biol Chem, 255, 597-603.

31. Bucala R., Makita Z., Koschinsky T. (1993) Lipid advanced glycosylation: pathway for lipid oxidation in vivo. // Proc Natl Acad Sei USA, 90(14), 6434-6438.

32. Carr A.C., Frei B. (2000) The role of natural antioxidants in preserving the biological activity of endothelium-derived nitric oxide. // Free Radic Biol Med. 2000, 28(12), 18061814.

33. Carr A.C., McCall M.R., Frei B. (2000) Oxidation of LDL by myeloperoxidase and Reactive Nitrogen Species!I Arterioscler Thromb Vase Biol, 20, 1716-1723.

34. Chatterjee S., Ghosh N. (1996) Oxidized low density lipoprotein stimulates aortic smooth muscle cell proliferation. II Glycobiology, 6, 303-311.

35. Cohen M.P., Jin Y., Lautenslager G.T. (2004) // Increased plasma glycated low-density lipoprotein concentrations in diabetes: a marker of atherogenic risk. // Diabetes Technol Ther, 6(3), 348-356.

36. Cohen M.P., Lautenslager G., Shea E. (1993) Glycated LDL concentrations in non-diabetic and diabetic subjects measured with monoclonal antibodies reactive with glycated apolipoprotein B epitopes. //Eur J Clin Chem Clin Biochem, 31(11), 707-713.

37. Curtiss L.K., Witztum J.L. (1983) A novel method for generating region-specific monoclonal antibodies to modified proteins. (Application to the identification of human gluc-sylated low density lipoproteins). IIJ Clin Invest, 72, 1427-1438.

38. Cybulsky M.I., Iiyama K., Li H. et al. (2001) A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. IIJ Clin Invest., 107(10), 1255-1262.

39. Donzanti B.A., Yamamoto B.K. (1988) An improved and rapid HPLC-EC method for the isocratic separation of amino acid neurotransmitters from brain tissue and microdialysis perfusates. II Life Sei, 43, 913-922.

40. Dotevall A., Hulthe J., Rosengren A. et al. (2001) Autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein and C-reactive protein are associated with diabetes and myocardial infarction in women. // Clin Sei (Lond), 101, 523-531.

41. Drake T.A., Hannani K., Fei H.H. et al. (1991) Minimally oxidized low-density lipoprotein induces tissue factor expression in cultured human endothelial cells. // Am J Pathol, 138, 601-607.

42. Erkkila A.T., Narvanen O., Lehto S. et al. (2000) Autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein and cardiolipin in patients with coronary heart disease. II Arterioscler Thromb Vase Biol, 20, 204-209.

43. Fan J., Watanabe T. (2003) Inflammatory reactions in the pathogenesis of atherosclerosis II J. Atheroscler Thromb, 10(2), 63-71.

44. Fang J.C., Kinlay S., Behrendt D. et al. (2002) Circulating autoantibodies to oxidized LDL correlate with impaired coronary endothelial function after cardiac transplantation. I I Arterioscler Thromb Vase Biol, 22, 2044-2048.

45. Festa A., Kopp H.P., Schernthaner G. et al. (1998) Autoantibodies to oxidised low density lipoproteins in IDDM are inversely related to metabolic control and microvascular complications. II Diabetologia, 41, 350-356.

46. Fields R. (1972) The rapid determination of amino groups with TNBS. // Methods Enzymol. 25, 464-468.

47. Fogelman A.M., Shechter I., Seager J. et al. (1980) Malondialdehyde alteration of low density lipoproteins leads to cholesteryl ester accumulation in human monocyte-macrophages. // Proc Natl Acad Sei USA, 77, 2214-2218.

48. Fong L.G., Parthasarathy S., Witztum J.L. et al. (1987) Nonenzymatic oxidative cleavage of peptide bonds in apoprotein B-100. H J Lipid Res, 28, 1466-1477.

49. Fredrikson G. N., Hedbland B., Berglund G. et al. (2003) Identification of immune responses against aldehyde-modified peptide sequences in apoB associated with cardiovascular disease. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 23, 872-878.

50. Frostegard J., Wu R., Lemne C. et al. (2003) Circulating oxidized low-density lipoprotein is increased in hypertension. // Clin Sei (Lond), 105, 615-620.

51. Fukumoto M., Shoji T., Emoto M. et al. (2000) Antibodies against oxidized LDL and carotid artery intima-media thickness in a healthy population. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 20, 703-707.

52. George J., Harats D., Bakshi E. et al. (1999) Anti-oxidized low density lipoprotein antibody determination as a predictor of restenosis following percutaneous transluminal coronary angioplasty. II Immunol Lett, 68(2-3), 263-266.

53. Giulivi C., Davies K.J. (1994) Dityrosine: a marker for oxidatively modified proteins and selective proteolysis. // Methods Enzymol, 233,363-371.

54. Goldstein J.L., Ho. Y.K., Basu S.K. et al. (1979) Binding sites on macrophages that mediates uptake and degradation ofacetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. II Proc Natl Acad Sei USA, 1979, 76, 333-342.

55. Gonen B., Cole T., Hahm K.S. (1983) The interaction of carbamylated low-density lipoprotein with cultured cells. Studies with human fibroblasts, rat peritoneal macrophages and human monocyte-derived macrophages. // Biochim Biophys Acta, 754, 201207.

56. Grinshtein N., Bamm V.V., Tsemakhovich V.A. et al. (2003) Mechanism of low-density lipoprotein oxidation by hemoglobin-derived iron. // Biochemistry, 2003, 42(23), 69776685.

57. Habeeb A.F.S.A. (1972) Reaction of protein sulfhydryl groups with Elman's reagent. // Methods Enzymol. 25, 457-464.

58. Hansson G.K. (2001) Immune mechanisms in atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vase Biol., 21, 1876-1890.

59. Hazell L.J., Arnold L., Flowers D. et al. (1996) Presence of hypochlorite-modified proteins in human atherocslerotic lesions. II J Clin Invest, 97, 1535-1544.

60. Hazell L.J., van den Berg J.J. M., Stocker. R. (1994) Oxidation of low-density lipoprotein by hypochlorite causes aggregation that is mediated by modification of lysine residues rather than lipid oxidation. // JBiochem, 302, 297-304.

61. Hazen S.L., Heinecke J.W. (1997) 3-ChIorotyrosine, a specific marker of myeloperoxi-dase-catalyzed oxidation, is markedly elevated in low density lipoprotein isolated from human atherosclerotic intima // J Clin Invest, 99, 2075-2081.

62. Heinecke J.W., Li W., Daehnke H.L. et al. (1993) Dityrosine, a specific marker of oxidation is synthesized by the myeloperoxidase-hydrogen peroxide system of human neutrophils and macrophages. //JBiol Chem, 268, 4069-4077.

63. Holvoet P., Mertens A., Verhamme P, et al. (2001) Circulating oxidized LDL is a useful marker for identifying patients with coronary artery disease. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 21, 844-848.

64. Horkko S., Binder C.J., Shaw P.X. et al. (2000) Immunological responses to oxidized LDL. // Free Radic Biol Med, 28(12), 1771-1779.

65. Horkko S., Bird D.A., Miller E. et al. (1999) Monoclonal autoantibodies specific for oxidized phospholipids or oxidized phospholipid-protein adducts inhibit macrophage uptake of oxidized low-density lipoproteins. 1/ J Clin Invest, 103, 117-128.

66. Hsu R.M., Devaraj S, Jialal I. (1999) Autoantibodies to oxidized low-density lipoprotein in patients with type 2 diabetes mellitus. // Clin Chim Acta, 317,145-150.

67. Huang Y., Song L., Wu S. (2001) Oxidized LDL differentially regulates MMP-1 and TIMP-1 expression in vascular endothelial cells. // Atherosclerosis, 156, 119-125.

68. Inoue T., Uchida T., Kamishirado H. et al. (2001a) Clinical significance of antibody against oxidized low density lipoprotein in patients with atherosclerotic coronary artery disease. II J Am Coll Cardiol, 37, 775-779.

69. Inoue T., Uchida T., Kamishirado H. et al. (2001b) Antibody against oxidized low density lipoprotein may predict progression or regression of atherosclerotic coronary artery disease. II J Am Coll Cardiol, 37(7), 1871-1876.

70. Itabe H. (2003) Oxidized low-density lipoproteins: what is understood and what remains to be clarified. // Biol Pharm Bull, 26(1), 1-9.

71. Itabe H., Yamamoto H., Imanaka T. et al. (1996) Sensitive detection of oxidatively modified low density lipoprotein using a monoclonal antibody. H J Lipid Res, 37(1), 45-53.

72. Itabe H., Yamamoto H., Suzuki M. et al. (1996) Oxidized phosphatidylcholines that modify proteins. Analysis by monoclonal antibody against oxidized low density lipoprotein. // J Biol Chem, 271(52), 33208-3217.

73. Jakubovski H. (2000) Homocysteine thiolactone: metabolic origin and protein homocys-teinylation in humans. // J Nutr, 130, 377S-381S.

74. Jakubovski H. (2002) The determination of homocysteine-thiolactone in biological samples. // Anal Biochem, 308, 112-119.

75. Janero D.R. (1990) Malondialdehyde and tiobarbituricacid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. // Free Radio Biol Med, 9, 515540.

76. Jürgens G, Lang J, Esterbauer H. (1986) Modification of human low-density lipoprotein by the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal. // Biochim Biophys Acta, 875(1), 103-114.

77. Kacharava A.G., Tertov V.V., Orekhov A.N. (1993) Autoantibodies against low-density lipoprotein and atherogenic potential of blood. H Ann Med, 25(6), 551-555.

78. Kalela A., Koivu T.A., Hoyhtya M. et al. (2002) Association of serum MMP-9 with autoantibodies against oxidized LDL. // Atherosclerosis, 160, 161-165.

79. Kalyanaraman B., Darley-Usmar V., Struck A. et al. (1995) Role of apolipoprotein B-de-rived radical and a-tocopheroxyl radical in peroxidase-dependent oxidation of low density lipoprotein. II J Lipid Res, 36, 1037-1045.

80. Karvonen J., Paivansalo M., Kesaniemi Y.A. et al. (2003) Immunoglobulin M type of autoantibodies to oxidized low-density lipoprotein has an inverse relation to carotid artery atherosclerosis. II Circulation, 108, 2107-2112.

81. Kaur K., Salomon R.G., OTSieil J. et al. (1997) Carboxyalkyl)pyrroles in human plasma and oxidized low-density lipoproteins. II Chem Res Toxicol, 10(12), 1387-1396.

82. Kilhovd B.K., Berg T.J., Birkeland K.I., et al. (1999) Serum levels of advanced glycation end products are increased in patients with type 2 diabetes and coronary heart disease. // Diabetes Care, 22, 1543-1548.

83. Klapper M.H., Klotz I.M. (1972) Acylation with dicarboxylic acid anhydrides. 11 Methods Enzymol,25, 531-536.

84. Klimov A.N., Denisenko A.D., Popov A.V. et al. (1985) Lipoprotein-antibody immune complexes. Their catabolism and role in foam cell formation. H Atherosclerosis, 58, 1-15.

85. Klimov A.N., Zubshitsky Yu.N., Nagornev A. (1979) Imuonochemical aspects of atherosclerosis. // Atheroscler Rev, 4, 119-156.

86. Knott H.M., Brown B.E., Davies M.J. et al. (2003) Glycation and glycoxidation of low-density lipoproteins by glucose and low-molecular mass aldehydes. Formation of modified and oxidized particles. // Eur JBiochem, 270, 3572-3582.

87. Korpinen E., Groop P.H., Akerblom H.K. et al. (1997) Immune response to glycated and oxidized LDL in IDDM patients with and without renal disease. // Diabetes Care, 20, 1168-1171.

88. Lahteenmaki T. A., Korpela R., Tikkanen M. J. et al. (1998) Proliferative effects of oxidized low-density lipoprotein on vascular smooth muscle cells: role of dietary habits. // Life Sei, 63, 995-1003.

89. Lehtimaki T., Lehtinen S., Solakivi T. et al. (1999) Autoantibodies against oxidized low density lipoprotein in patients with angiographically verified coronary artery disease. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 19, 23-27.

90. Libby P. (2000) Changing concepts of atherogenesis. // J Intern Med, 247, 349-358.

91. Liu C.S., Lii C.K., Ou C.C. et al.(2000) Autoantibody against oxidized low-density lipoproteins may be enhanced by cigarette smoking. // Chem Biol Interact, 127(2), 125-137.

92. Lopes-Virella M.F., Binzafar N., Rackley S. et al. (1997) The uptake of LDL-IC by human macrophages: predominant involvement of the Fc gamma RI receptor. // Atherosclerosis, 135(2), 161-70.

93. Lopes-Virella M.F., Virella G. (2003) The role of immune and inflammatory processes in the development of macrovascular disease in diabetes. // Front Biosci, 8, 750-768.

94. Lopes-Virella M.F., Virella G., Orchard T.J. et al. (1999) Antibodies to oxidized LDL and LDL-containing immune complexes as risk factors for coronary artery disease in diabetes mellitus. // Clin Immunol, 90(2): 165-172.

95. Lucey M. D., Newkirk M., Neville C. et al. (2000). Association between IgM response to IgG damaged by glyoxidation and disease activity in rheumatoid arthritis. H J Rheumatol, 27, 319-323.

96. Maggi E., Perani G., Falaschi F. et al. (1994) Autoantibodies against oxidised low density lipoproteins in patients with coronary disease. // Presse Med, 23, 1158-1162.

97. Mahley R.W., Innerarity T.L., Weisgraber K.H. et al. (1979) Altered metabolism (in vivo and in vitro) of plasma lipoproteins after selective chemical modification of lysine residues of the apoproteins // J Clin Invest, 64, 743-750.

98. Makimattila S., Luoma J.S., Yla-Herttuala S. et al. (1999) Autoantibodies against oxidized LDL and endothelium-dependent vasodilation in insulin-dependent diabetes mellitus. /7 Atherosclerosis, 147, 115-122.

99. Manson J.J., Mauri C., Ehrenstein M. R. (2005) Natural serum IgM maintains immunological homeostasis and prevents autoimmunity. // Springer Semin Immun, 26, 425-432.

100. Markwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L. et al. (1978) A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. // Anal. Biochem 87, 206-210.

101. Masana L.I., Skaikh M., La Will A.E. et al (1986) Lipid peroxidation of low density lipoprotein by human endothelial cells modified its metabolism in vitro. 11 Rev Espan Fisiol, 42, 99-106.

102. Mcdowell A., Young I.S., Wisdom G.B. (2002) Autoantibodies to malondialdehyde-modified low-density lipoprotein in patients with angiographically confirmed coronary artery disease. II J Pharm Pharmacol, 54, 1651-1657.

103. Meraviglia M.V., Maggi E., Bellomo G. et al. (2002) Autoantibodies against oxidatively modified lipoproteins and progression of carotid restenosis after carotid endarterectomy. II Stroke, 33, 1139-1141.

104. Mironova M., Virella G, Virella-Lowell I. et al. (1997) Anti-modified LDL antibodies and LDL-containing immune complexes in IDDM patients and healthy controls. // Clin Immunol Immunopathol, 85, 73-82.

105. Mironova M.A., Klein R.L., Virella G.T. et al. (2000) Anti-modified LDL antibodies, LDL-containing immune complexes, and susceptibility of LDL to in vitro oxidation in patients with type 2 diabetes. // Diabetes JID, 49, 1033-1041.

106. Monaco C., Crea F., Niccoli G. et al. (2001) Autoantibodies against oxidized low density lipoproteins in patients with stable angina, unstable angina or peripheral vascular disease; pathophysiological implications. II Eur Heart J, 22, 1572-1577.

107. Moro E., Alessandrini P., Zambon C. et al. (1999) Is glycation of low density lipoproteins in patients with Type 2 diabetes mellitus a LDL pre-oxidative condition? // Diabetic Medicine, 16, 663-669.

108. Morton R.E., West G.A., Hoff H.F. (1986) A low density lipoprotein-sized particle isolated from human atherosclerotic lesions is internalized by macrophages via a non-scavenger-receptor mechanism. II J Lipid Res, 27, 1124-1134.

109. Mukhopadhyay C.K., Fox P.L. (1998) Ceruloplasmin copper induces oxidant damage by a redox process utilizing cell-derived superoxide as reductant. // Biochemistry, 37, 14222-14229.

110. Muller K., Hardwick S.J., Marchant C.E. et al. (1996) Cytotoxic and chemotactic potencies of several aldehydic components of oxidised low density lipoprotein for human monocyte-macrophages. // FEBS Lett, 388(2-3), 165-168.

111. Nagai R., Matsumoto K., Ling X. et al. (2000) Glycolaldehyde, a reactive intermediate for advanced glycation end products, plays an important role in the generation of an active ligand for the macrophage scavenger receptor. // Diabetes, 49, 1714-1723.

112. Nagy L., Tontonoz P., Alvarez J.G. et al. (1998) Oxidized LDL regulates macrophage gene expression through ligand activation of PPARg. // Cell;93, 229- 240.

113. Nakamura Y., Horii Y., Nishino T. et al. (1993) Immunochemical localization of advanced glycosylation end products in coronary atheroma and cardiac tissue in diabetes melitus.//Am J Pathol, 143, 1649-1656.

114. Narvanen O., Erkkila A., Yla-Herttuala S. (2001) Evaluation and characterization of EIA measuring autoantibodies against oxidized LDL. // Free Radic Biol Med, 31, 769-777.

115. Neeper M., Schmidt A.M., Brett J. et al. (1992) Cloning and expression of a cell surface receptor for advanced glycosylation endproducts of proteins. II J Biol Chem, 267, 49985004.

116. Odani H., Shinzato T., Matsumoto Y. et al. (1999) Increase in three a,ß -dicarbonyl compound levels in human uremic plasma: speci.c in vivo determination of intermediates in advanced Maillard reaction. // Biochem Biophys Res Commun, 256, 89-93.

117. Ogawa H., Soejima H., Takazoe K. et al. (2001) Increased autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein in coronary circulation in patients with coronary spastic angina. // Angiology, 52, 167-174.

118. Okada M., Miida T., Fujiwara A. et al. (2000) Autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein correlate with Achilles tendon xanthomas. // Clin Chem Lab Med, 38, 501-506.

119. Orekhov A.N., Tertov V.V., Kabakov A.E. et al. (1991) Autoantibodies against modified low density lipoprotein. Nonlipid factor of blood plasma that stimulates foam cell formation. // Arterioscler Thromb, 11(2), 316-326.

120. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin D.N. (1991) Desialylated low density lipoprotein-naturally occurring modified lipoprotein with atherogenic potency. // Atherosclerosi, 86(2-3), 153-161.

121. Orem C., Orem A., Uydu H.A. et al. (2002) The effects of lipid-lowering therapy on low-density lipoprotein auto-antibodies: relationship with low-density lipoprotein oxidation and plasma total antioxidant status. // Cor on Artery Dis, 13, 65-71.

122. Palinski W„ Rosenfeld M.E., Yla"-Herttuala S. et al. (1989). Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo. // Proc Natl AcadSci USA, 86, 1372-1376.

123. Palinski W., Witztum J.L. (2000) Immune responses to oxidative neoepitopes on LDL and phospholipids modulate the development of atherosclerosis. // J Intern Med, 247, 371-380.

124. Palinski W.S., YlS-Herttuala S., Rosenfeld M.E et al. (1990) Antisera and monoclonal antibodies specific for epitopes generated during the oxidative modification of low-density lipoprotein.//Arteriosclerosis,10, 325-335.

125. Panasenko O.M., Evgina S.A., Aidyraliev R.K.et al. (1994) Peroxidation of human blood lipoproteins induced by exogenous hypochlorite or hypochlorite generated in the system of'myeloperoxidase-H202-Cl-.' II Free Radic Biol Med, 16, 143-148.

126. Parthasarathy S., Santanam N., Ramachandran S. et al. (1999) Oxidants and anti oxidants: an appraisal. IIJ lipid Res, 40, 2143-2157.

127. Paulsson G., Zhou X., Torrielli M. et al. (2000) T cell expansions in atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient nice. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 20, 10-17.

128. Pober J.S., Collins T., Gimbrone M.A.Jr. et al. (1983). // Lymphocytes recognize human vascular endothelial and dermal fibroblast la antigens induced by recombinant immune interferon. // Nature, 305, 726-729.

129. Quinn M.T., Parthasarathy S., Fong L.G., Steinberg D. (1987) Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis. // Proc Natl Acad Sei USA, 84(9), 29952998.

130. Radulescu L., Stancu C., Antohe F. (2004) Antibodies against human oxidized low-density lipoprotein (LDL) as markers for human plasma modified lipoproteins. // Med Sei MonitlO, 207-214.

131. Raymond T.L., Reynolds S.A. (1983) Lipoproteins of extravascular space: alterations in low density lipoproteins of interstitial inflammatory fluid. // J Lipid Res, 24, 113-119.

132. Rosenfeld M.E., Palinski W., Yla'-Herttuala S. et al. (1990) Distribution of oxidation specific lipid-protein adducts and apolipoprotein B in atherosclerotic lesions of varying severity from WHHL rabbits. // Arteriosclerosis, 10, 336-349.

133. Roxborough H.E., Young I.S. (1995) Carbamylation of proteins and atherogenesis in renal failure. //Med Hypotheses, 45(2), 125-128.

134. Sakata N., Imanaga Y., Meng J. et al (1999) Increased advanced glycation end products in atherosclerotic lesions of patients with end-stage renal disease. // Atherosclerosis, 142(1), 67-77.

135. Sakata N., Imanaga Y., Meng J., et al. (1998) Immunohistochemical localization of different epitopes of advanced glycation end products in human atherosclerotic lesions. // Atherosclerosis, 141, 61-75.

136. Salmon S., Maziere C., Theron L. et al. (1987) Immunological detection of low-density lipoproteins modified by malondialdehyde in vitro or in vivo. // Biochim Biophys Acta, 920, 215-220.

137. Seifert P.S„ Messner M., Roth I. et al. (1991) Analysis of complement C3 activation products in human atherosclerotic lesions. //Atherosclerosis, 91(1-2), 155-162.

138. Shaw P.X., Horkko S., Tsimikas S. et al. (2001) Human-derived anti-oxidized LDL autoantibody blocks uptake of oxidized LDL by macrophages and localizes to atherosclerotic lesions in vivo. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 21, 1333-1339.

139. Sherer Y., Tenenbaum A., Blank M. et al. (2001a) Autoantibodies to oxidized low-density lipoprotein in coronary artery disease. // Am JHypertens, 14, 149-154.

140. Sherer Y., Tenenbaum A., Praprotnik S. et al. (2001b) Coronary artery disease but not coronary calcification is associated with elevated levels of cardiolipin, beta-2-glycopro-tein-I, and oxidized LDL antibodies. // Cardiology, 95, 20-24.

141. Shoji T., Kimoto E., Shinohara K. et al. (2003) The association of antibodies against oxidized low-density lipoprotein with atherosclerosis in hemodialysis patients. // Kidney Int Suppl, 84 S128-S130.

142. Shoji T., Nishizawa Y., Fukumoto M. et al. (2000) Inverse relationship between circulating low density lipoprotein (oxLDL) and anti-oxLDL antibody levels in healthy subjects. //Atherosclerosis, 148, 171-177.

143. Sims T.J., Rasmussen L.M., Oxlund H. et al. (1996) The role of glycation cross-links in diabetic vascular stiffening. // Diabetologia, 39, 946-951.

144. Smith J.B., Interman C.M., Silver M.J. (1976) Malondialdehyde formation as an indicator of prostaglandin formation by human platelets. // J Lab Clin Med, 88, 167-172.

145. Sobenin I.A., Tertov V.V., Orekhov A.N. (1994) Characterization of chemical composition of native and modified low density lipoprotein occurring in the blood of diabetic patients. // IntAngiol, 13(1), 78-83.

146. Stark G.R. (1972,) Modification of proteins with cyanate. // Methods Enzymol. 25, 579584.

147. Steinerova A., Racek J., Stozicky F. et al. (2001) Antibodies against oxidized LDL theory and clinical use. //Physiol Res, 50, 131-141.

148. Stemme S., Faber B., Holm J. et al. (1995). T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein. // Proc Natl Acad Sei USA, 92, 3893-3897.

149. Swets B.P., Brouwer D.A., Tervaert J.W. (2001) Patients with systemic vasculitis have increased levels of autoantibodies against oxidized LDL. // Clin Exp Immunol, 124, 163167.

150. Szondy E., Horvath M., Mezey Z. et al. (1983) Free and complexed anti-lipoprotein antibodies in vascular disease. // Atherosclerosis, 49, 69-77.

151. Tanaga K., Bujo H., Inoue M., et al. (2002) Increased circulating malondialdehyde-modi-fied LDL levels in patients with coronary artery diseases and their association with peak sizes of LDL particles. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 22, 662-666.

152. Tertov V. V., Kaplun V.V., Sobenin I.A. et al. (2002) Human plasma trans-sialidase causes atherogenic modification of low density lipoprotein II Atherosclerosis, 159,103115.

153. Tertov V. V., Sobenin I. A., Orekhov A. N. et al. (1996) Characteristics of low density lipoprotein isolated from circulating immune complexes. II Atherosclerosis, 122, 191199.

154. Tertov V.V., Kaplun V.V., Dvoryantsev S.N. et al. (1995) Apolipoprotein B-bound lipids as a marker for evaluation of low density lipoprotein oxidation in vivo. // Biochem Bio-phys Res Commun, 214, 608-613.

155. Tinahones F.J., Gomez-Zumaquero J.M., Garrido-Sanchez L et al. (2005) Influence of age and sex on levels on anti-oxidized LDL antibodies and anti-oxidized LDL immune complexes in the general population. //J Lipid Res,46(3), 452-457.

156. Tornvall P., Waeg G., Nilsson J. et al. (2003) Autoantibodies against modified low-density lipoproteins in coronary artery disease. II Atherosclerosis, 167, 347-353.

157. Toshima S., Hasegawa A., Kurabayashi M. et al. (2000) Circulating oxidized low density lipoprotein levels. A biochemical risk marker for coronary heart disease. // Arterioscler Thromb Vase Biol, 20(10), 2243-2247.

158. Turk Z., Ljubic S., Turk N. et al. (2001) Detection of autoantibodies against advanced glycation endproducts and AGE-immune complexes in serum of patients with diabetes mellitus. // Clin ChimActa, 303, 105-115.

159. Turk Z., Skrabolo Z. (1987) The cell interactive properties of glucosylated very-low-density lipoproteins. // Cell Mol Biol, 33, 345-354.

160. Uchida K., Stadtman E.R. (1993) Covalent attachment of 4-hydroxynonenal to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. //J Biol Chem, 268, 6388-6393.

161. Vasquez-Vivar J., Kalyanaraman B., Martasek P. et al. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. (1998) // Proc Natl Acad Sei USA, 95, 9220-9225.

162. Vay D., Vidali M., Allochis G. et al. (2000) Antibodies against advanced glycation end product N-epsilon-(carboxymethyl)lysine in healthy controls and diabetic patients. // Dia-betologia, 43, 1385-1388.

163. Virella G., Atchley D., Koskinen S. et al. (2002) Proatherogenic and proinflammatory properties of immune complexes prepared with purified human oxLDL antibodies and human oxLDL. // Clin Immunol, 105, 81-92.

164. Virella G., Koskinen S., Krings G. et al. (2000) Immunochemical characterization of purified human oxidized low-density lipoprotein antibodies. // Clin Immunol, 95, 135144.

165. Virella G., Thorpe S.R., Alderson N.L. et al. (2003) Autoimmune response to advanced glycosylation end-products of human LDL H J Lipid Res, 44, 487-493.

166. Virella G., Thorpe S.R., Alderson N.L. et al. (2004) Definition of the immunogenic forms of modified human LDL recognized by human autoantibodies and by rabbit hyperimmune antibodies. // J Lipid Res, 45(10), 1859-1867.

167. White F.H. (1972) Thiolation//Methods Enzymol. 25, 541-546.

168. Wieland E., Parthasarathy S., Steinberg D. (1993) Peroxidase-dependent, metal independent oxidation of low density lipoprotein in vitro: a model for in vivo oxidation? Proc Natl Acad Sei USA, 90, 5929-5933.

169. Witztum J.L., Fisher M., Pietro T. et al. (1982a) Non-enzymatic glycation of low-density lipoproteins accelerates its catabolism in guinea pigs. // Diabetes, 31, 1029-1032.

170. Witztum J.L., Mahoney E.M., Branks M.J. et al. (1982b) Nonenzymatic glucosylation of low-density lipoprotein alters its biologic activity. // Diabetes, 31(4 Pt 1), 283-291.

171. Witztum J.L., Steinbrecher U.P., Kesaniemi Y.A. et al. (1984) Autoantibodies to glycosi-lated proteins in the plasma of patients with diabetes mellitus. // Proc Natl Acad Sei USA, 81, 3204-3208.

172. Wu L., Fan J., Matsumoto S. et al. (2000) Induction and regulation of matrix metalloproteinase-12 by cytokines and CD40 signalling in monocyte/macrophages. // Biochem Biophys res Commun, 269, 808-815.

173. Wu R., de Faire U., Lemne C. et al. (1999) Autoantibodies to OxLDL are decreased in individuals with borderline hypertension. // Hypertension, 33, 53-59.

174. Wu R., Nityanand S., Berglund L. et al. (1997) Antibodies against cardiolipin and oxida-tively modified LDL in 50-year-old men predict myocardial infarction. II Arterioscler Thromb Vase Biol, 17, 3159-3163.

175. Yasunobu Y., Hayashi K., Shingu T. et al. (2001) Coronary atherosclerosis and oxidative stress as reflected by autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein and oxys-terols. // Atherosclerosis, 155, 445-453.

176. Yla-Herttuala S. (1998) Is oxidized low- density lipoprotein present in vivo? // Curr Opin Lipidol, 9(4), 337-344.

177. Yla-Herttuala S., Palinski W., Butler S.W. (1994) Rabbit and human atherosclerotic lesions contain IgG that recognizes epitopes of oxidized LDL. Arterioscler Thromb, 14(1), 32-40.

178. Yla-Herttuala S., Palinski W., Rosenfeld M.E. et al. (1989) Evidence for the presence of oxidatively modified low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man. 1/J Clin Invest, 84, 1086-1095.

179. Yuang X.M., Li W., Olsson A.G. et al. (1997) The toxicity to macrophages of oxidized low-density lipoprotein is mediated through lysosomal damage. // Atherosclerosis, 13, 153-161.

180. Ziouzenkova O., Sevanian A. (2000) Oxidative modification of low-density lipoprotein (LDL) in HD patients: role in electronegative LDL formation. // Blood Purif 18, 169176.

Информация о работе

Жданова, Ольга Юрьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жданова, Ольга Юрьевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Жданова, Ольга Юрьевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жданова, Ольга Юрьевна, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аутоантитела к модифицированным липопротеинам человека и их роль в атерогенезе
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия