Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунологические и биохимические факторы в формировании окислительного стресса при атерогенезе
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Иммунологические и биохимические факторы в формировании окислительного стресса при атерогенезе"
ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федера
4859304
У V
ЛОЖКИН АНДРЕЙ ПЕТРОВИЧ
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ В ФОРМИРОВАНИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ АТЕРОГЕНЕЗЕ
03,01.04 - биохимия
I о НОЯ 2011
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Казань-2011
4859304
Работа выполнена на кафедре микробиологии ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет"
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,
академик АН РТ Ильинская Ольга Николаевна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Черепнев Георгий Викторович
доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашивовна
Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики
КНЦ РАН, г. Казань
Защита диссертации состоится «24» ноября 2011 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211. Факс 8(843)238-71-21, 233-78-40. E-mail: lozhkinandrey@gmail.com
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при ФГАОУВПО "Казанском (Приволжском) Федеральном университете"
Автореферат разослан октября 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
Актуальность работы. Атросклероз, представленный в форме цереброваскулярных и коронарно-артериальных заболеваний - лидирующая причина смертности взрослого населения в мире [Murray, Lopez, 1997, Okrainec et al., 2004]. Только в 2005 году от сердечнососудистых заболеваний (ССЗ) в США погибло 864500 человек, что составило примерно 35,2% от общего количества смертей. К этому числу относятся 151000 смертей от инфаркта миокарда и 143000 смертей от ишемического инсульта. [Lloyd et al., 2009].
В связи с тем, что атеросклероз является основной причиной ишемической болезни сердца и цереброваскулярной болезни, не только профилактика и лечение, но и своевременная диагностика данного заболевания представляют собой актуальную проблему. Существует множество определений атеросклероза, но большинство из них сходятся в одном - атеросклероз связан с патологическими процессами, происходящими в стенке сосуда, в которых участвуют несколько типов клеток, неотъемлемой частью атерогенеза также является процесс воспаления. Именно на воспалительный ответ указал в своем определении автор наиболее современной гипотезы атеросклероза - Рассел Росс: "Атерогенез -повреждение эндотелия, приводящее к воспалительному и фибропролиферативному ответам, переходящим в патологический процесс" [Ross, 1993]. В свою очередь Шварц с соавторами в своем определении атеросклероза достаточно полно описали типы клеток, участвующих в атерогенезе: "Атеросклероз - хроническое заболевание, вызванное повреждением стенок артерий в процессе воспаления и отложениями, состоящими из жировой и фиброзной ткани. В развитие заболевания вовлечено несколько типов клеток, в частности клетки гладкой мускулатуры, макрофаги, Т-лимфоциты и тромбоциты" [Schwartz et al., 1993].
Повышенный уровень генерации активных форм кислорода (АФК) в стенке сосуда признан тремя доминирующими гипотезами атерогенеза как один стартовых механизмов, запускающих цепь событий, приводящих к формированию атеросклеротических повреждений сосудов.
Согласно модификационной гипотезе, перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот в составе липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), инициированное активными формами кислорода, представляет собой отправную точку атерогенеза [Jialal, 1998]. Окислительно-модифицированные ЛПНП представляют собой один из типов аутоантигенов, обнаруженных в атеросклеротических бляшках [Nilsson, Hansson, 2008]. Модификации ЛПНП, вызванные окислением, приводят к высвобождению фосфолипидов и пероксидов липидов, которые вызывают иммунный ответ у окружающих клеток [Glass, Witztum, 2001].
Гипотеза о митохондриальной дисфукции базируется на утверждении, что увеличенная генерация активных форм кислорода митохондриями ответственна состояние эндотелиальной дисфункции, потерю способности релаксации [Wenzel et al., 2008] и развитие воспаления в стенке сосуда,
ведущего к возникновению сердечнососудистых заболеваний [Ballinger, 2005].
В стенке сосуда присутствуют разнообразные ферментные системы, участвующие в генерации АФК, среди них NAD(P)H - оксидаза, ксантин оксидаза, мономерная форма эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), цитохром Р-450, липоксигеназа, циклооксигеназа, а также митохондриальная электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) [Li, Shah, 2004]. Внимание исследователей сконцентрировано на NAD(P)H оксидазе как основном регуляторе редокс состояния сосудов и миокарда [Griendling et al, 2000]. Наиболее активная NAD(P)H оксидаза обнаружена у клеток иммунной системы [Babior, 2004] нейтрофилов [Batot et al, 1995], эозинофилов, моноцитов и макрофагов [Segal et al., 1981]. Показано, что повышенный уровень таких хемокинов, как МСР-1 и MIP-1, в сыворотке крови пациентов с нестабильной и стабильной стенокардией ассоциирован со сниженной концентрацией антиоксидантов и усиленным перекисным окислением липидов, предполагая наличие окислительного стресса [Aukrust et al, 2001].В свете данных о неоспоримой роли активированных клеток иммунной системы, в частности макрофагов, и окислительного стресса в развитии атеросклероза и сопутствующих ему осложнений, представляется весьма перспективным установление механизмов, лежащих в основе усиления экспрессии хемокинов, приводящих к активации и хемотаксису иммунных клеток, участвующих в генерации АФК.
Целью данной работы явился анализ вовлеченности биохимических и иммунологических процессов в формирование окислительного стресса при атерогенезе.
Ставились следующие задачи:
1. Выявить генерацию АФК методом спинового зондирования образцов атеросклеротических бляшек, оценить в исследуемых клинических образцах вклад реакции Фентона в окислительный стресс.
2. Определить методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой количественное содержание Са, Р, Cu, Fe, Zn, Мп в образцах атеросклеротических бляшек, оценить степень кальцификации образцов и выявить корреляцию между данными параметрами.
3. Идентифицировать методом ЭПР наличие ионов Мп2+в образцах атеросклеротических бляшек с органоминерапьным агрегатом и в образцах, не содержащих кальцифицированного матрикса.
4. Установить зависимость синтеза гормонов лептина и инсулина, а также хемокинов МСР-1, RANTES, КС, MIP-1 от наличия и активации рецептора CD40 в плазме мышей линии C57BL/6.
5. Определить влияние введения анти-С040 активирующего антитела мышам линии C57BL/6 на продукцию хемокина МСР-1 и фосфорилирование провоспалительной р38 и антивоспалительной ERK киназ в перитонеальных макрофагах.
6. Выявить изменение синтеза хемокина МСР-1 в Т-клетках, выделенных из селезенки мышей, после активации рецептора CD40.
Научная новизна. Методом ЭПР-спектроскопии с применением методики спинового зондирования выявлена генерация АФК и протекание реакции Фентона в образцах атеросклеротических бляшек. Методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой определено содержание ряда элементов, установлена статистически значимая корреляция между концентрацией ионов марганца и степенью кальцификации, также W-диапазоне ЭПР обнаружен сигнал комплексов двухвалентного марганца образцах атеросклеротических бляшек и зафиксировано заметное различие формы линии ЭПР сигналов этого элемента в кальцифицированных тканях и образцах без минеральных отложений.
В ходе работы показаны возможные механизмы формирования окислительного стресса при активации рецептора CD40. Полученные нами данные о снижении продукции лептина жировой тканью, активированной агонистом CD40, согласуются с современными представлениями об иммунологической основе метаболических заболеваний. Кроме того выявлены зависимости концентраций ряда цитокинов, в том числе МСР-1, одного из наиболее значимых проатерогенных факторов, от дефицита и активации рецептора CD40. Установлено, что активация этого рецептора приводит к провоспалитеньному ответу макрофагов и усилениюими синтеза МСР-1.
Практическая значимость. Показанная в работе обратная взаимосвязь между концентрацией ионов марганца и степенью кальцификации в образцах атеросклеротических бляшек может послужить основой для разработки методов диагностики минерализации стенки сосуда.
Примененнаянами модель атерогенеза у мышей, индуцированная диетой без генетических модификаций путей метаболизма ЛПНП, наиболее близка современной статистике, согласно которой гипергликимия и гиперхолестеринемия представляют собой одни из самых распространенных факторов риска развития сердечнососудистых заболеваний. Это позволяет нам полагать, что закономерности, установленные в процессе наших /и vivo исследований на мышах, могут быть значимы в отношении человека. Установленная нами взаимосвязь между активацией рецептора CD40, усилением синтеза одного из наиболее перспективных предикторов нестабильности атеросклератических бляшек, МСР-1, и фосфорилированием провоспалительной киназы р38 может послужить основой для разработки стратегии создания молекулярных лекарственных препаратов. Согласно новаторским работам блокада фосфорилирования ряда провоспалительных киназ на модели мышей уже зарекомендовала себя как действенное средство замедления развития атеросклероза.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ 1.15.56 «Механизмы регуляции функциональной активности клеток» при поддержке АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (2.1.1/920), государственного контракта №02.740.11.0391, гранта РФФИ 09-02-97017, совместного гранта Министерства образования и науки
Российской Федерации и Германской службы академических обменов «Михаил Ломоносов II».
Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. ЭПР-спектроскопию проводили в отделе ЭПР спектроскопии под руководством д.ф.-м.н, профессора Силкина Н.И., масс-спектрометрию - в лаборатории д.ф.-м.н, профессора Гильмутдинова А.Х. при участии к.ф.-м.н. Волошина A.B. отдела аналитической спектроскопии Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов Приволжского федерального округа. Иммунологические исследования осуществляли в исследовательской группе доктора Андреаса Цирлика, отделение кардиологии клиники университета Альберта-Людвига, (Freiburg-im-Breisgau, Germany).
Положения, выносимые на защиту:
1. С применением метода электронного парамагнитного резонанса выявлено, что в образцах атеросклеротических бляшках протекает окислительный стресс, в который вносит вклад реакция Фентона.
2. Активация рецептора CD40 в мышах линии C57BL/6 приводит к увеличению концентрации хемокина МСР-1 в плазме и перитонеальной жидкости, нокаут гена рецептора CD40 вызывает снижение синтеза МСР-1 и не повлияет на концентрацию инсулина в плазме.
3. Введение активирующего анти-С040 антитела мышам линии C57BL/6 приводит к фосфорилированию провоспалительной киназы р38 перитонеальных макрофагов, но не к фосфорилированию киназы ERK.
4. Содержание общего марганца достоверно снижается с возрастанием степени кальцификации образцов атеросклеротических бляшек, спектр ЭПР двухвалентного марганца наблюдается в образцах атеросклеротических бляшек, но не интактной аорты.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XIV международной конференции «Ферменты микроорганизмов в биотехнологии и медицине» (Казань, 2009), ежегодной научно-практической конференции и выставке "Инновации РАН 2010" (Казань, 2001), семинаре стипендиатов совместных программ Минобрнауки РФ и Германской службы академических обменов (ДААД) "Михаил Ломоносов" и "Иммануил Кант" (Москва, 2011), а также на итоговых конференциях КГУ (2008-2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 4 статьи в центральных отечественных и зарубежных рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 17 рисунков. Цитируемая литература включает 226 источника, из них 218 иностранных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Биологические образцы
1.1.1. Атероскперотические бляшки. Двадцать образцов стенки аорты, содержащей атеросклеротическое повреждение, получены в результате постмортальной экспертизы согласно требованиям Этического Комитета Межрегионального Клинико-Диагностического Центра (Казань). Образцы промывали физиологическим раствором и лиофшшзировали (Р=10-5мбар, Т=-50°С).
1.1.2. Подопытные животные. В работе использованы линейные мыши C57BL/6 для получения образцов плазмы, жировой ткани, спленоцитов и перитониальных макрофангов. Плазма крови мышей, нокаутированных по гену рецептора CD40, и мышей контрольной группы C57BL/6, содержавшихся в течение 29 недель на стандартном корме (СК), и диете с высоким содержанием жиров (ВСЖ) (Specialty Feeds) была предоставлена Backer Heart Research Institute, Мельбурн, Австралия. Проанализировано по 20 образцов в четырех группах:
1.2. Физико-химические методы
1.2.1. Определение активных форм кислорода методом ЭПР. Для определения уровня АФК использован спиновый зонд - циклический гидроксиламин М-(1-гидрокси-2,2,6,6-тетраметиллипередин-4-ил-)-2-метилпропанамид гидрохлорид (ТМТН). Образец бляшки 0,07 г гомогенизировали на диспергаторе ULTRA-TURRAX® Tube Drive (IKA). В исследуемый раствор вносили 1мМ ТМТН, спектры ЭПР регистрировали в спектрометре ESP-300 (Bruker) при комнатной температуре (~25°С), мощности СВЧ излучения 50 мВт, на частоте 9,8 ГГц, амплитуде высокочастотной модуляции 0,5 Гаусс, применяя капилляры объемом 25мкл (Sigma).
1.2.2. Выявление участия в реакции Фентона металлов с переменной валентностью в составе атеросклеротической бляшки. Реакция Фентона приводит к генерации гидроксильного радикала из перекиси водорода под действием металлов с переменной валентностью. Участие в ней присутствующих в образцах атеросклеротической бляшки металлов с переменной валентностью устанавливали методом ЭПР по образованию продукта реакции, инициированной внесением 1мМ Н202-
1.2.3. Количественное определение содержания элементов в атеросклеротической бляшке. Определение элементов проводили в соответствии со стандартами РФ согласно методическим указаниям (МУК 4.1.1483-03). Измерения осуществляли на масс-спектрометре Elan DRC II (PerkinElmer), образцы предварительно подвергали микроволновой подготовке в системе MWS-3 (Berghof) при температуре 150°С, в присутствии азотной кислоты (1 мл) и бидистиллированной воды (4 мл). Содержание элементов рассчитывали в мкг, относя к сухому весу образца атеросклеротической бляшки.
1.2.4. Обнаружение парамагнитных центров двухвалентного марганца в образцах атеросклеротических бляшек методом ЭПР. Образцы размером 0,3*0,3х2мм были исследованы на спектрометре Elexsys 680 (Bruker) с использованием стационарного режима при гелиевых температурах в W-диапазоне (93,5 ГГц).
1.3. Фгаиолого-биохимические методы
1.3.1. Стимуляция мышей фактором некроза опухолей ТНФ-альфа. Две группы мышей линии C57BL/6 содержали 17 недель на нормальной диете СК, и диете с высоким содержанием жиров ВСЖ. Далее мышам в брюшную полость вводили 200нг мышиного ТНФ-альфа, после чего животные были разделены на 4 группы по 10 в каждой, двум из четырех групп вводили ЮОмкг активирующего aiiTH-CD40 антитела и инкубировали 4 часа.
1.3.2. Получение образцов плазмы мышей. Мышей анестезировали введением в брюшную полость 200 мкл 2,2,2 - трибромэтанола. Дополнительно вводили 10 единиц гепарина чтобы предотвратить тромбообразование. Далее мышь фиксировали на препарационном столике, вскрывали грудную клетку и забирали 500-800 мкл крови из правого желудочка сердца. Отобранную кровь помешали в эппендорф с 20 мкл 0,5М ЭДТА и центрифугировали для отделения плазмы 5000 об/мин 5 мин, плазму переносили в новый эппендорф и хранили до исследования при -80°С.
1.3.3. Смыв перитонеальных макрофагов. В нижнюю часть брюшной полости мышам вводили 2 мл тиогликолата, и инкубировали 4 часа. Далее мыши подвергались эвтаназии с применением углекислого газа и декапитации. В брюшную полость вводили 6 мл RPMI 1640, для достижения наилучшего смешения брюшную полость пальпировали в течение Зх минут. Суспензию, отобранную из брюшной полости, центрифугировали 5000 об/мин 5 мин, супернатант переносили в отдельный эппендорф. Осадок и супернатант хранили при -80°С.
1.3.4. Цитометрия с использованием иммобилизованных на частицах антител (Cytometric bead array analysis, СБА). Для определения концентрации цитокинов и хемокинов в плазме крови и супернатантах асептического перитонита, а также для установления уровня фосфорилирования киназ в лизатах перитонеальных макрофагов нами был применен метод СВА. Для анализа ряда цитокинов, IFN-y, 1L-6, IL-10, IL-12, МСР-1, TNF-a, применяли BD Cytometric Bead Array Mouse Inflammation Kit. Концентрации хемокинов анализировали с применением Mouse/Rat Soluble ProteinMaster Buffer Kit, Mouse КС Flex Set, Mouse RANTES Flex Set и Mouse MlP-la Flex Set. Измерение концентраций фосфорилированных киназ осуществляли с применением Cell Signaling Master Buffer Kit, Phospho p38 (T180/Y182) Flex Set и Phospho ERK1/2 (T202/Y204) Flex Set. Каждый из перечисленных Flex Set китов содержит соответствующие захватывающие гранулы, конъюгированный с РЕ детектирующий реагент и стандарт. Анализ образцов проводили на цитометре BD FACScalibur (BD Bioscience), оснащенном 488нм аргон-ионным лазером и 635нм красным диодным
лазером. При анализе результатов использованы программные пакеты FlowJo 7.5 и GraphPad Prism 5.
1.3.5. Анализ концентрации сывороточного амилоида А, лептина, инсулина в плазме мышей. Для анализа концентрации сывороточного амилоида А в образцах плазмы крови мышей, применяли Phase range mouse SAA ELISA kit (Invitrogen). Для определения концентрации лептина в образцах плазмы крови мышей, применяли Mouse Leptin DuoSet ELISA Development kit (R&D Systems). Концентрацию инсулина анализировали, применяя Mercodia mouse insulin ELISA kit (Mercodia). Киты применлись согласно инструкциям производителей. Измерения проводили с применением спектрофотометра SpectraMax plus (Molecular Devices), оснащенного плэйтридером при 450 мкм. Для анализа результатов использованы программные пакеты GraphPad Prism 5 и SoftMax Pro 5.2
1.3.6. Активация Т-кпеток, изолированных из селезенок мышей. Мыши линии C57BL/6, содержавшиеся 20 недель на CK и ВСЖ, были умерщвлены с применением углекислого газа и декапитированы. Селезенки мышей были извлечены в асептических условиях и помещены в чашки петри с 15 мл охлажденного до 4°С фосатного буфера. Надрезанная селезенка помещалась между двух стекол, спленоциты высвобождались легкими сдавливанием. Суспензию, содержащую спленоциты, фильтровали, трижды центрифугировали при 1500g 10 мин (4°С), осадок ресуспендировали в 1 мл среды DMEM. Далее производился подсчет клеток в камере Ньюбауэра.
Негативную селекцию Т-клеток производили с применением Dynal Mouse Т cell Negative Isolation Kit (Invitrogen) согласно инструкции производителя. Для проверки чистоты и анализа популяционной принадлежности изолированных Т-клеток, применяли проточную цитометрию с флуоресцентно-меченными анти- CD3, CD4, CD8 антителами и изотопическими контролями к ним. В 50 мкл суспензии клеток вносили по 1 мкл флуоресцентно-меченных антител, или их изотипов, инкубировали 15 мин в темноте на льду и вносили 500мкл BD CellFix буфера для фиксации клеток. Анализ проводили на проточном цитометре BD FACScalibur (BD Bioscience), оснащенном 488нм аргон-ионным лазером и 635нм красным диодным лазером. При анализе результатов применен программный пакет FlowJo 7.5
1.3.7. Активация жировой ткани мышей. Мыши линии C57BL/6, содержавшиеся 20 недель на CK и ВСЖ, были умерщвлены с применением углекислого газа и декапитированы. Жировые ладушки были извлечены в асептических условиях и помещены в маленькие чашки Петри с 5 мл охлажденной до 4°С среды DMEM, содержащей 3% фетальной телячьей сыворотки и 0,5% пенициллина и 0,5% стрептомицина. Стерильным скальпелем произведены множественные надрезы, далее фрагменты ткани подвергались ресуспендированию пипетированием, крупные фрагменты были удалены. Для активации клеток жировой ткани, планшеты для культивирования были покрыты 5мкг/мл анти-С040 активирующего антитела. Через семь дней после начала инкубации, супернатанты были
отобраны, центрифугированы при 15000g 10 минут 4°С, концентрации лептина исследованы методом ELISA, как описано ранее.
1.4. Статистическая обработка результатов для каждого метода описана в соответствующем разделе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Окислительный стресс в клинических образцах стенок сосудов
В стенке сосуда присутствуют разнообразные ферментные системы, учавствующие в генерации АФК, среди которых NAD(P)H - оксидаза, ксантин оксидаза, мономерная форма эндотелиальной NO-синтазы, цитохром Р-450, липоксигеназа, циклооксигеназа [Li, Shah, 2004]. Однако исследователи преполагают, что четыре из них вносят наибольший вклад: NAD(P)H — оксидаза, неспаренная форма эндотелиальной NO-синтазы, ксантин оксидаза [Li, Shah, 2004]. Можно предполагать, что активность этих ферментных систем в совокупности со снижением активности системы антиоксидантной защиты приводит к увеличению уровня АФК в стенке сосуда и способствует атерогенезу. В результате анализа кинетических кривых накопления нитроксильного радикала в атеросклеротических бляшках, нами обнаружено, что все образцы атеросклеротических бляшек, полученных в результате постмортальной экспертизы, обладают активностью, связанной с генерацией АФК (рис. 1). Установлено, что в большинстве образцов окисление зонда происходит в меньшей степени, чем в системе ксантин/ксантиноксидаза. Однако в трех образцах отмечена более высокая степень образования радикала ТМТ", близкая к соответствующему показателю для реакции ксантин/ксантиноксидаза. Окисление зонда в образце интактной аорты находилось на существенно болеее низком уровне по сравнению с образцами бляшек.
При рассмотрении роли супероксид дисмутаз (СОД) Farad и Didion констатируют, что данных о функциональной активности СОД в стенке кровеносных сосудов очень мало [Faraci, Didion, 2004]. Логично было бы предположить, что активность таких антиоксидантных ферментов как СОД 1 и 3 типа, должна была бы снижать уровень образования АФК и соответствнно замедлять развитие атеросклеротического повреждения сосуда. Однако показано, что увеличенная экспрессия СОД 1 не влияла на атерогенез, у мышей на диете с высоким содержанием жиров [Tribble et al., 1997] или АроЕ"'" мышей [Yang et al., 2004]. В то же время деффицит СОД 3 так же не произвел никакого эффекта на атерогенез у АроЕ"'" мышей [Sentman, Brannstorm, 2001]. Особое внимание в литературе уделяется марганцевой супероксид дисмутазе. Хотя ее количество составляет лишь 212% от суммарного количества СОД в стенке сосуда [Faraci, Didion, 2004], недавние исследования показали неоспоримую роль митохондриального белка СОД 2 в развитии атеросклероза [Madamanchi, Runge, 2007]. Возрастные мыши с генотипом MnSOD+" фенотипически показали
значительное нарушение вазорелаксации, высокий уровень образования АФК в митохондриях и нарушение митохондриальной ДНК [Wenzel et al., 2008].
800 .
з
es ^_✓
¿r
m 400 H с
<D
'S
200 -
-Í--3E~
100
200
300
I
400
-1—
500
800
Time (s)
Рис. 1. Динамика накопления нитроксильного радикала. А - ксантиноксидазная реакция в фосфатном буфере. Б - в гомогенатах образцов бляшек. В - в гомогенатеобразцаинтактной аорты. Спектры ЭПР записывались в Х-диапазоне при комнатной температуре.
Гидроксильный радикал (НО") - крайне реактивная АФК, образующаяся в реакциях Фентона и Хабер-Вайсса при взаимодействии пероксида водорода переходными металлами [Вепоу, 2001]. Реакционная смесь, содержащая соль двухвалентного железа и пероксид водорода, традиционно используется для генерации гвдроксильного радикала в реакции Фентона. Для моделирования реакции Фентона в раствор ТМТН в фосфатном буфере был введен пероксид водорода в концентрации 1мМ, в нашем случае некоторое количество железа, достаточное для инициации реакции находилось в фосфатном буфере. В результате было зарегистрировано достаточно быстрое образование радикала ТМТ* (рис. 2.6). Десфероксамин, связывая ионы железа в фосфатном буфере, минимизировал протекание реакции Фентона и снижал окисление ТМТН (рис. 2.в).
,__ ЮГс
Рис. 2. Спектры ЭПР нитроксильного радикала ТМТ-, образующегося в результате окисления спинового зонда ТМТН под влиянием гидроксильного радикала, генерируемого в реакции Фентона. А - контроль, спиновый зонд ТМТН в фосфатном буфере (1мМ). Б - спиновый зонд в буфере при внесении 1мМ Н2О2. В - спиновый зонд в буфере при внесении 1мМ Н2Ог и ЗмМ десфероксамина. Г - спиновый зонд в гомогенатс образца бляшки. Д - спиновый зонд в гомогенате образца бляшки при внесении 1мМ Н2О2. Е - спиновый зонд в гомогенате образца бляшки при внесении ЗмМ десфероксамина. Спектры записаны через 20 минут после введения зонда в реакционную смесь.
Внесение пероксида водорода в гомогенат атеросклеротических бляшек приводило к значительному увеличению интенсивности сигнала ЭПР зонда ТМТН, что свидетельствует об инициации реакции Фентона металлами с переменной валентностью в восстановленной форме, находящимися в бляшке (рис. 2.а). Полученнные данные убедительно свидетельствуют о возможности протекания реакции Фентона в образцах атеросклеротических бляшек. При внесении десфероксамина в гомогенат образца бляшки наблюдалось некоторое снижение интенсивности окисления зонда, что свидетельствуют в пользу вклада реакции Фентона в оксилительный стресс в бляшке (Рис. 2.е), однако вероятно присутствие иных металлов с переменной валентностью, которые наравне с железом участвуют в реакции Фентона. Так не только для железа, но и для меди показана проатерогенная роль [Stadler et al., 2004; Brewer, 2007; Watt et al., 2006], которая возможно связана с участием в реакции Фентона [Watt et al., 2006]
2.2. Определение содержания элементов в образцах стенок сосудов и корреляционный анализ
В современной литературе имеются данные об изменении концентрации некоторых элементов в атерогенезе: стенка сосуда человека с атеросклеротическим повреждением содержит больше кальция, фосфора, меди, железа, цинка, чем стенка здорового сосуда [Peltomaa et al., 1991;
Stadler et al., 2004, 2008]. В семи образцах стенок аорты с атеросклеротическим повреждением и трех стенок интактных сосудов методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой было проведено исследование содержания ряда элементов (табл. La) и проведен корреляционный анализ между ними (табл. 1.6). Все аутопсийные образцы значительно отличались по степени кальцификации (отношение Са/Р находилось в диапазоне от 0.3 до 3.5). Данное обстоятельство позволило провести корреляционный анализ изменения содержания элементов в зависимости от Са/Р.
Таблица 1.
Анализ Zn, Си, Fe, Mn, Ca и Р, в образцах атерокслеротических бляшек и стенок интактных сосудов: (А) Содержание исследованных элементов, (Б) Матрица коэффициентов ранговой корреляции Спирмена между парами исследованных элементов.
Эле Диапазон значений,
мент мкг/r образца
Максимальное Минимальное
Zn 141.9 ±2.1 20.3* 0.5
Cu 6_J3± 0,08 0Л2± 0.01
Fe 9fi.22± 0.48 1.76± 0.08
Mn 0.767± 0.035 O.lO&fc 0.002
Ca 132430.8±2781.0 429.8±5.6
P 53035.4±530.4 695.3±15J
Zn Cu Fe Mn Ca P Ca/P
Zn -0.15 0.26 -0.29 0.85 0.63 0.58
Cu -0.15 -0.39 0.15 -0.55 -0.55 -0.17
Fe 0 26 -0.39 0.09 0.36 0.65 -0.13
Mn -0.29 0.15 0.09 -0.41 0.10 -0.72
Ca 0.85 -0.55 0.36 -0.41 0.71 0.64
P 0.63 -0.55 0.65 0.10 0.71 -0.04
Ca/P 0.58 -0.17 -0.13 -0.72 0.64 -0.04
А Б
На сегодняшний день в литературе значительное внимание уделяется металлам - цинку, железу, меди - содержащимся в стенках кровеносных сосудов, имеющих атеросклеротические повреждения. Так, для цинка установлен антиатерогенный эффект [Ren et al., 2005, 2006; Watt et al., 2006; Giacconi et al., 2007; Zago, Oteiza, 2001]. Считается, что цинк защищает мембраны от окисления, индуцированного железом, замещая его из отрицательно заряженных сайтов связывания [Zago, Oteiza, 2001]. Также предполагается, что высокий уровень цинка стабилизирует структуру бляшки, предохраняя ее от разрушения и последующего повреждения тканей [Stadler et al., 2008]. Возможно, антиатерогенная роль цинка связана с антивоспалительными и антипролиферативными свойствами цинка как кофактора ряда ферментов [Watt et ai, 2006]. Нами не обнаружено какой-либо корреляции между содержанием цинка и железа (табл. 1.6). Это согласуются с результатами, полученными Stadler с соавторами [Stadler et al., 2008] и свидетельствует в пользу дискуссионное™ гипотезы [Zago, Oteiza, 2001] о взаимосязи антиатерогенной роль цинка и его способности замещать железо. Полученные нами данные свидетельствуют о наличии корреляции содержания цинка и кальция (табл. 1.6). Ранее методом ЭПР было
обнаружено, что образцы максимально кальцифицированной бляшки содержат в своем составе гидроксиапатит [Абдульянов с соавт., 2008]. Наблюдаемая корреляция, вероятно, объясняется тем, что именно гидроксиапатит сорбирует цинк [Ьее ег а!., 2005].
Единственным из исследованных элементов, содержание которого коррелирует с Са/Р, оказался марганец (рис. 3). Нами установлено, что его уровень достоверно снижается с возрастанием степени кальцификации (табл. 1.6).
а
Сз 19
Рис. 3. Корреляция марганца и степени кальцификации.
Предположим, что марганец так или иначе может попадать в очаг кальцификации и удерживаться в органоминеральном матриксе. Эти соображения имеют под собой почву, поскольку известно, что кристаллические фосфаты кальция способны сорбировать ионы переходных металлов (в том числе ионы марганца) [Matsunaga ег а1„ 2008]. Таким образом, для подтверждения данной гипотезы принципиально установить, в каком окружении находятся ионы марганца в кальцифицированных тканях атеросклеротических бляшек: попадают ли они в органоминеральный агрегат или же находятся преимущественно в тех же комплексах, что и в здоровой ткани. С этой целью образцы стенок аорты были исследованы с помощью высокочастотного ЭПР с использованием методики детектирования электронного спиновго эха. В ходе исследования из кальцифицированных образцов отбирались пробы органоминерального агрегата и пробы, не содержащие кальцифицированного матрикса (рис. 4). Для сравнения были также исследованы образцы интактных стенок аорты.
Сравнение спектров исследованных образцов (рис. 4) выявило заметное различие формы линии ЭПР сигналов двухвалентного марганца для кальцифицированного образца и образцов без минеральных отложений. Более того, в двух исследованных образцах интактной аорты спектр двухвалентного марганца практически не наблюдался. Предположительно, полученные данные говорят о различном окружении ионов Мп2+ в указанных образцах. Кроме того, согласно литературе, в здоровой клетке основная доля
марганца содержится в биологических комплексах [Culotta et al., 2006], где он может иметь валентность 3+ (электронная конфигурация d4) либо испытывать дипольное взаимодействие со стороны находящихся в непосредственной близости парамагнитных центров (например, олигомерных ферментах). Этим можно объяснить отмеченную для интактных образцов крайне низкую интенсивность сигнала двухвалентного марганца. Кроме того, после облучения кальцифицированных образцов рентгеновскими лучами, в пробах органоминерального матрикса наблюдался сигнал радикала СО/' характерного для минеральной части кальцифицированных бляшек (рис. 5).
,(M'VrV'\ , В,
' », WyV г
Рис. 4. Нормированные спектры ЭПР образцов стенок аорты (не подвергавшихся облучению), полученные с помощью методики детектирования электронного спинового эха в \У-диапазоне при Т=17,5К. А — проба образца бляшки, содержащая минерализованный матрикс, Б — проба того же образца, не содержащая следов кальцификации, В, Г — образцы интактных стенок аорты.
3.30 3.35 3.40 Магнитное поле (Тл)
Рис. 5. Спектр ЭПР парамагнитных центров
двухвалентного марганца в образцах атеросклеротических бляшек. Т=50К, ^-диапазон (93.5 ГГц). Параметры сверхтонкой структуры марганца А=9,05 мТл.
3.30 3.35 3.40
Магнитное попе, Тл
Полученные предварительные результаты можно рассматривать как косвенное подтверждение гипотезы о том, что в кальцифицированной стенке сосуда марганец может быть тем или иным образом интегрирован в органоминеральный матрикс.
23. Иммунологические аргументы участия CD40-CD40L в формировании окислительного стресса в атерогенезе
Мы показали, что окислительный стресс в атеросклеротических бляшках может быть связан с неферментативными механизмами при участии металлов с переходной валентностью, содержащихся в стенках сосуда с атеросклеротическим повреждением. Здесь мы обсудим источники и иммунологические аспекты возможных механизмов реализации окислительного стресса в атерогенезе.
В качестве атерогенной нами выбрана модель метаболического синдрома (MC) у мышей, которая ведет к развитию патологии в связи с особенностями питания, в отличие от моделей генетических модификаций, как LDLR" и АроЕ"'". Данные модели генно-нокаутированных мышей с недостатком LDLR и АроЕ не воспроизводят всех свойств атеросклеротических бляшек и пригодны в первую очередь для исследования функций специфических генов на ранних стадиях атерогенеза [Lucas, Greave, 2001]. Диета с высоким содержанием жиров, или как назвали ее Lucas и Greave, "диета западного типа", содержит 21% жиров и 0,2% холестерина [Lucas, Greave, 2001]. На наш взгляд данная модель более приближена к медицинской практике, поскольку гипергликимия и гиперхолестеринемия -два основополагающих фактора метаболического синдрома, зачастую сопутствуют атерогенезу и стоят первыми в списке признанных факторов риска развития ССЗ [Stamler et al., 1993]. Мышей C57BL/6 содержали на стандартизованной диете ВСЖ для развития атеросклероза, индуцированного метаболическим синдромом, контрольная группа мышей росла на нормальной диете. О развитии ССЗ у мышей, содержавшихся на диете с высоким содержанием жиров, свидетельствует повышенная концентрация сывороточного амилоида A (CAA) (рис. 6), детектированного нами в плазме мышей методом ELISA, которая в норме у этих животных не превышает 20 мкг/мл. CAA имеет непосредственную взаимосвязь с атерогенезом и представляет собой высокочусвтвительный маркер ССЗ в частности ишемической болезни сердца (ИБС) [Johnson et al., 2004].
ví
i'.V.V."
Рис. 6. Концентрация сывороточного амилоида А в плазме мышей линии С57ВЬ/б. А -Контрольная группа мышей, СК. В - Группа мышей с дефицитом СЭ40, СК. С - Контрольная группа мышей, ВСЖ. Б - Группа мышей с дефицитом С040, ВСЖ.
CD40 рецептор экспрессируется значительным количеством клеток -участников атеросклеротического процесса, среди которых Б-клетки [van Kooten, 2000], моноциты и макрофаги, тромбоциты [Schonbeck et al., 2000], клетки эндотелия (ЭК) и гладкомышечные клетки (ГМК) [Mach et ah, 1997], мастоциты [Tpurnilhac et al., 2006], дендритные клетки, фибробласты [Phipps, 2000], нейтрофилы [Cella et al., 1997], Т-клетки [Yang, Wilson 1996]. Однако этот же рецептор экспрессируют адипоциты, что играет ключевую роль в адипогенезе и приобретении жировой тканью иммунной функции [Missou et al, 2010]. Система CD40 рецептор-лиганд влияет на воспаление за счет производства цитокинов и активации ряда транскрипционных факторов [Mach et al., 1997]. Стимуляция CD40 лигандом типичных резидентных клеток атеросклеротических бляшек, таких как ЭК, макрофаги, ГМК, приводила к экспрессии различных медиаторов воспаления, хемокинов, молекул адгезии, прокоагулянтов и матриксных метаплопротеиназ, способствуя проатерогенному состоянию [Mach et al., 1997]. Причастность взаимодействия рецептора CD40 со своим лигандом к атерогенезу была неоднократно продемонстрирована в различных работах. Кроме того, показано, что взаимодействие рецептора с лигандом вызывало продукцию АФК тромбоцитами и клетками эндотелия [Urbich et al., 2002], что деактивировало eNOS, приводило к эндотелиальной дисфункции [Cipollone et al., 2005, Aggarwal et al., 2004]. Инкубация с рекомбинантным CD40L индуцировала генерацию АФК тромбоцитами [Chakrabarti et al., 2005], эндотелиальными клетками [Chakrabarti et al., 2007] и нейтрофилами [Vanichakarn et al., 2008]. В то же время в плазме пациентов с метаболическим синдромом показано повышенное содержание растворимого CD40L [Angelico et al., 2006], поэтому данный лиганд может быть рассмотрен как связующее звено между атеросклерозом и метаболическим синдромом [Lee et al., 2006].
Ввиду того, что продемонстрирована непосредственная взаимосвязь CD40-CD40L и генерации АФК, данное взаимодействие рассмотрено нами в качестве модулятора иммунологических процессов при метаболическом синдроме, альтернативно ведущих к окислительному стрессу в атерогенезе.
Можно выделить два механизма, посредствам которых метаболический синдром мог бы инициировать окислительный стресс проатерогенного характера.
2.3.1 Влияние рецептора CD40 на синтез инсулина и лептина
Показано, что гиперхолестеринемия [Shimizu et al., ¡994, Ohara et al., 1993] и избыточное содержание лептина в крови [Bouloumie et al., 1999] неизбежно ведут к усилению генерации АФК клетками эндотелия. Данное событие ссылает нас к теории митохондриальной дисфункции, ключевым событием в которой является усиленный синтез АФК митохондриальной ЭТЦ эндотелия, который ведет через состояние митохондриальной дисфункции к эндотелиальной дисфункции, возрастающей проницаемости эндотелия для ЛПНП и нарушению вазомоторной фукции сосуда [Wenzel et al., 2008]. В то же время повышенные концентрации ЛПНП и ряда других
маркеров окислительного стресса обнаружены при диабете [Patrono, Fitzgerald, 1997]. Наше исследование показало, что в плазме мышей, рацион которых был представлен диетой с высоким содержанием жиров, наблюдались повышенные концентрации инсулина (рис. 7) и лептина (рис. 8), в сравнении с контрольной группой.
II
X
х.
«■ О <3
V- <ь
Рис. 7. Концентрации инсулина в плазме мышей линии С57ВЬ/б. А -Контрольная группа мышей, СК. В -Группа мышей с дефицитом С040, СК. С - Контрольная группа мышей, ВСЖ. О -Группа мышей с дефицитом С040, ВСЖ
Рис. 8. Концентрации лептина в плазме мышей линии С57ВЬ/6. А -Контрольная группа мышей, СК. В -Группа мышей с дефицитом С040, СК. С - Контрольная группа мышей, ВСЖ. О -Группа мышей с дефицитом С040, ВСЖ
Однако нокаут С040 никак не повлиял на синтез инсулина вне зависимости от диеты, что позволяет нам утверждать об отсутствии связи между синтезом данного гормона и сигнальных путей, активируемых данным рецептором (рис. 7). Что касается лептина, картина представляется весьма неоднозначной. Нокаут С040 приводил к увеличению концентрации лептина в плазме животных на диете ВСЖ (рис. 8), в то время как у нокаутных мышей на СК диете наблюдалось снижение концентрации гормона. Одновременное введение агониста С040 и Т№-а не повлияло на синтез гормона вне зависимости от диеты (рис. 9).
1S-,
I
Рис. 9. Концентрация лептина в плазме мышей линии С57В176 после инъекции ЮТ-а. 1 -11-6, 2 - 1И0, 3 - МСР-1. А-Контрольная группа мышей, СК. В - Группа мышей с инъекцией агониста С040, СК. С Контрольная группа мышей, ВСЖ. Э - Группа мышей с инъекцией агониста С040, ВСЖ.
Стимуляция жировой ткани активирующим анти-С040 антителом вела к заметному снижению продукции лептина в случае обеих диет (рис. 10).
Рис. 10. Концентрация лептина, продуцируемого жировой тканью, выделенной из мышей линии С57В176 после 48 часовой инкубации. А Жировая ткань выделена из мышей на СК, инкубировалась с контрольным изотопом В - Жировая ткань
выделена измышей на СК, инкубировалась с СЭ40 агонистом. С -Жировая ткань выделена из мышей на ВСЖ, инкубировалась с контрольным изотопом ^О. О - Жировая ткань выделена из мышей на ВСЖ, инкубировалась с С040 агонистом.
Вероятно, активация рецептора С040 не связана либо отрицательно коррелирует с развитием эндотелиальной дисфункции, опосредованным активацией генерации АФК ЭК в ответ на высокие концентрации глюкозы и лептина в крови.
2.3.2. Зависимость концентрации хемокинов в плазме мышей от дефицита и активации рецептора СБ40
Второй возможный механизм взаимосвязи МС. и окислительного стресса - усиленная выработка хемокинов и цитокинов вследствие сопутствующего метаболическому синдрому хронического системного воспаления. Развитие системного воспаления у мышей на ВСЖ подтверждает повышенный уровень в плазме животных сывороточного амилоида А (рис. 6), дефицит интересующего нас рецептора СБ40 не повлиял на выработку данного белка.
Такие факторы иммунной системы, как хемокины и цитокины активируют иммунные клетки, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, профессиональные функции которых связаны с генерацией АФК, в результате чего преактивированные лейкоциты могут адгезироваться на эндотелии и проникать в интиму, где вырабатывают АФК, модифицируя ЛПНП. Было показано, что лигирование СИ40 приводит к выработке цитокинов и привлечению моноцитов в интиму [МасЬ ег а1 1998], а повышенный уровень таких хемокинов, как МСР-1 и М1Р-1, в сыворотке крови пациентов с нестабильной и стабильной стенокардией ассоциирован со сниженной концентрацией антиоксидантов и усиленным перекисным окислением липидов, предполагая наличие окислительного стресса [Аикгив! е/ а!., 2001]. Следует также отметить, что ЭК экспрессируют молекулы адгезии УСАМ-1 и 1САМ также в ответ на активацию С040 [Кагтапп е/ а1., 1995].
1.5-1
1.0-
ш с
0.5-
0.0-1
1
-1———|—
-оксидазы макрофагов и нейтрофилов — мощнейшее антибактериальное оружие, АФК, генерируемые эозинофилами служат организму в борьбе с эндопаразитами [С^йпап е/ а!., 1989]. Ряд авторов рассматривает ЫАО(Р)Н-оксидазы как один из главнейших источников АФК в атеросклеротических бляшках [8р1екегшапп е/ а/., 2003], и наиболее активными ферментами обладают перечисленные иммунные клетки [ВаШ1 е/ а/., 1995]. В отношении данного механизма активация С040 более релевантна, что подтвердают результаты наших экспериментов. Так нами выявлена определенная концентрационная зависимость МСР-1 в плазме животных от рецептора СВ40. Нокаут гена рецептора приводил к снижению концентрации МСР-1 плазме мышей (рис. 11), что согласуется со сниженными концентрациями провоспалительных цитокинов, IЬ-б, ГЬ-12. Концентрации ТНБ
-сх, №N-7, М1Р-1 оказалась ниже детектируемого уровня. В то же время активация рецептора агонистом сопровождалась повышением концентрации МСР-1 и ТКР-а без изменения 1Ь-6,1Ь-12 (рис. 12). Показано, что данный хемокин не только активирует хемотаксис моноцитов, но и активирует генерацию АФК этим типом клеток [Аикп^ еГ а!., 2001].
_ 40
Е
Рис.11. Концентрации цитокинов в плазме мышей линии C57BL/6. 1 - IL-6, 2 - ILIO, 3 - IL-12, 4 - МСР-1, 5 - RANTES, 6 - КС. А - Контрольная группа мышей, CK. В -Группа мышей с дефицитом CD40, CK. С - Контрольная группа мышей, ВСЖ. D - Группа мышей с дефицитом CD40, ВСЖ.
Полученные данные не несут какой-либо информации о взаимосвязи активации СБ40 рецептора и модуляции синтеза М1Р-1, поскольку концентрация данного хемокина в образцах плазмы крови как ноакутированных по гену рецептора СБ40 мышей, так и мышей, которым
был введен агонист рецептора, находилась за пределами нижнего уровня детекции метода СВА (рис. 11,12). Ни нокаутирование гена рецептора С040, ни его активация не оказали влияние на синтез цитокина КС. Неоднозначными оказались результаты для поскольку и нокаут и
активация СБ 40 сопровождались повышением концентрации этого хемокина.
V- Я} О о
Рис. 12. Концетрации цитокинов в плазме мышейлинии C57BL/6 после инъекции TNF-a, 1 - IL-6, 2 - IL-10, 3 - IL-12, 4 - МСР-1, 5 - ТНФ-альфа, 6 - RANTES, 7 - КС. А-Контрольная группа мышей, CK. В - Группа мышей с инъекцией агониста CD40, CK. С-Контрольная группа мышей, ВСЖ. D - Группа мышей с инъекцией агониста CD40, ВСЖ.
2.3.3. Влияние активации рецептора CD40 на синтез МСР-1 перитониальными макрофагами и Т-клетками
Макрофаги и Т-клетки представляются одними из главных участников атеросклеротического процесса. Накопление макрофагов и Т-клеток а также их взаимодействие играет ключевую роль в развитии заболевания [Lucas, Greave, 2001]. Поэтому влияние лигирования CD40 на синтез хемокинов данными типами клеток нами будет рассмотрено подробнее.
Для извлечения макрофагов мы применили метод перитонеального лаважа. Показано, что у макрофагов CD40 может быть связан с передачей как про- так и антивоспалительного сигнала в зависимости оттого, какая киназа фосфорилируется. Так при инфекции лейшманиоза фосфорилирование киназы р38 вело к проинфламаторному ответу макрофагов, в то время как фосфорилирование ERK-1/2 - к антиинфламаторному. Данный процесс регулируется привлечением различных TRAF [Rub et al., 2009]. Результат наших исследований показал, что связывание CD40 рецептора агонистом на фоне цитокинового шторма в значительной степени увеличивала фосфорилирование р38 в независимости от диеты, в то время, как фосфорилирование ERK1/2 находитлось на низком уровне и не отличалось от такового в контроле (рис- 13).
20000-,
Рис. 13. Уровень фосфорилирования киназ 1 - ERK, 2 - р38 в лизатах перитонеальных макрофагов мышей линии C57BL/6 после инъекции TNF-a. А-Контрольная группа мышей, CK. В - Группа мышей с инъекциейагониста CD40, CK. С -Контрольная группа мышей, ВСЖ. D - Группа мышей с инъекциейагониста CD40, ВСЖ.
Об активации провоспалительного пути также говорит увеличенное содержание IL-6 в супернатантах перитониальных макрофагов мышей после инъекции агонистом. Кроме того введение мышам агониста CD40 приводило к усилению синтеза МСР-1 макрофагами, о чем говорит повышенный уровень хемокина в супернатантах перитонеального лаважа (Рис. 14). Вероятно, макрофаги в определенной степени ответственны за повышение концентрации МСР-1 в плазме животных при активации CD40.
CD40 рецептор АПК представляет собой сильный костимулирующий сигнал [Nilsson, Hansson, 2008]. Также известно, что CD40L+ Т-клетки через CD40-CD40L контакты способны усиливать активацию тромбоцитов при этом, Т-клетки усиливают экспрессию RANTES, что способствует привлечению самих Т-клеток и их адгезии на клетках эндотелия [Danese et al., 2004]. Однако Т-лимфоциты продуцируют не только лиганд, но и рецептор CD40 [Yang, Wilson, 1996]. Поэтому в следующем эксперименте мы исследовали влияние костимуляции CD40, CD3, CD28 на синтез МСР-1 Т-клетками, выделенными из селезенок мышей на ВСЖ и CK диетах (Рис. 15.).
Рис. 14. Концентрации цитокинов в супернатантах перитонеальных макрофагов мышей линии С57В1У6 после инъекции ТОР-а. ! - 2 - 1Ь-1О, 3 - МСР-1. А -Контрольная группа мышей, СК. В - Группа мышей с инъекцией агониста С040, СК. С -Контрольная группа мышей, ВСЖ.О - Группа мышей с инъекцией агониста С040, ВСЖ.
1.0 0.8 £ 0.6 г 0.4 0.20.0-
Рис. 15. Концентрации цитокинов в культуральной жидкости после семидневной инкубации Т-лимфоцитов. 1 - 3 - МСР-1, Т-лимфоциты, активированные анти-СОЗ и анти-С028 активирующими антителами. 2 - ШЫ-у, 4 - МСР-1, Т-лимфоциты, контроль. А - Т-лимфоциты выделены из мышей на СК. В - Т-лимфоциты выделены из мышей на СК и активированы агонистом С040. С - Т-лимфоциты выделены из мышей на ВСЖ. О -Т-лимфоциты выделены из мышей на ВСЖи активированы агонистом С040.
Результат эксперимента показал, что совместная стимуляция Т-клеток агонистом СЮ40, анти-СОЗ и анти- СБ 28 активирующими антителами привела вне зависимости от диеты к антивоспалительному сигналу, который проявлялся в снижении синтеза ГРИ-у, вероятно были активированы Т-регуляторные клетки. Однако никакой модуляции синтеза МСР-1 активирующими антителами обнаружено не было. Вероятно, экспрессия МСР-1 Т-лимфоцитами связана с активацией С040Ь.
Итак, полученные нами данные позволяют сделать заключение, что генерация АФК в атеросклеротических бляшках значительно превышает таковую в стенке интактного сосуда, а формирование окислительного стресса, присутствующего в атеросклеротических бляшках, связано не только с ферментативными механизмами, но и со свободнорадикальными реакциями с участием металлов с переменной валентностью.
Проведенные нами исследования показали статистически значимое снижение содержания марганца, сопряженное с ростом степени кальцификации, при этом были выявлены косвенные свидетельства попадания ионов двухвалентного марганца в минерализованный матрикс. На основании представленных результатов можно выдвинуть гипотезу о наличии взаимосвязи между процессом кальцификации стенки сосуда и распределением марганца в тканях, подверженных атеросклеротическим повреждениям. Полученные данные также позволяют рассматривать ЭПР-детектируемый марганец как потенциальный маркер атерогенеза. Однако, необходимо обратить внимание на то, что стенка сосуда с атеросклеротическим повреждением отличается от здоровой низким содержанием общего марганца и наличием Мп2+, четко детектируемым методом ЭПР. Мы полагаем, что эти приоритетные данные, не имеющие на сегодняшний день аналогов в современной литературе, могут внести вклад в понимание механизмов кальцификации и найти практическое применение в медицине.
Мы установили, что концентрация инсулина в плазме подопытных животных не зависела от СЭ40, в то время, как получены дискуссионные данные относительно влияния СЭ40 на синтез лептина. В данной работе не обнаружено зависимости синтеза КС от состояния рецептора С040, неоднозначные данные получены относительно ЯАМТЕЭ. Однако мы наглядно продемонстрировали, что концентрация МСР-1, хемокина, которому наиболее часто приписывается проатерогенная функция, в том числе связанная с активацией генерации АФК моноцитами, находится в зависимости от состояния рецептора СБ40. Так, в плазме генно-нокаутированных животных, не способных к экспрессии рецептора, обнаруживалась сниженная по сравнению с контрольной группой животных концентрация данного хемокина. Активация же рецептора приводила к фосфорилированию провоспалительной киназы р38 макрофагов и увеличению концентрации МСР-1 в плазме животных и супернатанте перетониальных макрфагов. Полученные нами данные позволяют предположить, что сигнальный путь С040-СЭ40Ь может влиять на состояние окислительного стресса в стенке сосуда посредствам усиления синтеза цитокина МСР-1.
Таким образом, результаты наших исследований позволяют охарактеризовать формирование окислительного стресса в стенке сосуда, сопряженного с атерогенезом, как комплексный многостадийный процесс, включающий ряд как биохимических, так и иммунологических факторов.
выводы
1. Установлено протекание реакции Фентона и ее вклад в окислительный стресс в клинических образцах стенок сосудов человека с атеросклеротическими повреждениями.
2. Определено количественное содержание Са, Р, Си, Fe, Zn, Мп в образцах атеросклеротических бляшек, и показано, что из исследованных элементов только содержание марганца имеет обратную корреляцию со степенью кальцификации.
3. Спектры ЭПР двухвалентно гомарганца исследованных кальцифицированных образцов и образцов без минеральных отложений имеют выраженные различия, при этом в образцах интакгной аорты спектр двухвалентного марганца не наблюдается.
4. Дефицит рецептора CD40 не влияет на синтез инсулина и приводит к увеличению концентрации лептина в плазме животных, содержащихся на диете с высоким содержанием жиров, и снижению его концентрации у животных на стандартной диете; активация рецептора не влияла на продукцию лептина в плазме и снижала его синтез в жировой ткани.
5. Нокаут гена рецептора CD40 приводит к снижению, а активация рецептора - к увеличению концентрации МСР-1 плазме мышей. Дефицит рецептора и его активация не изменяют синтез КС и увеличивают уровень RANTES.
6. Активация рецептора CD40 сопровождается фосфорилированием киназы р38 и усилением синтеза МСР-1 перитонеальными макрофагами и не влияет на синтез МСР-1 Т-клетками, выделенными из селезенки мышей.
Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК
1. Lozhkin, A. Manganese as a potential marker of atherogenesis / A. Lozhkin, T. Biktagirov, V. Abdul'yanov, A. Voloshin, N. Silkin, R. Khairullin, M. Salakhov, O. Ilinskaya H Dokl. Biochem. Biophys. - 2010. - V.434. - P.254-256.
2. Lozhkin, A- Manganese in atherogenesis: detection, origin, and a role / A. Lozhkin, T. Biktagirov, V. Abdul'yanov, O. Gorshkov, E. Timonina, G. Mamin, S. Orlinskii, N. Silkin, V. Chernov, R. Khairullin, M. Salakhov, O. Ilinskaya // Biomed. Chem. (Moscow). - 2011. - V. 5. - P. 158-162.
3. Hilgendorf, I. The oral spleen tyrosine kinase inhibitor fostamatinib attenuates inflammation and atherogenesis in low-density lipoprotein receptor-deficient mice / I. Hilgendorf, S. Eisele, I. Remer, J. Schmitz, K. Zeschky, C. Colberg, P. Stachon, D. Wolf , F. Willecke, M. Buchner, K. Zirlik, A. Ortiz-Rodriguez, A. Lozhkin, N. Hoppe, C. von zur Muhlen, A. zur Hausen, C. Bode, A. Zirlik II Atheroscler. Thromb Vase Biol. - 2011. - V.31. - P. 1991-1999.
4. Willecke, F. Cannabinoid receptor 2 signaling does not modulate atherogenesis in mice / F. Willecke, K. Zeschky, A. Ortiz Rodriguez, C. Colberg,
V. Auwarter, S. Kneisel, M. Hutter, A. Lozhkin, N. Hoppe, D. Wolf, C. von zur Muhlen, M. Moser, I. Hilgendorf, C. Bode, A. Zirlik // Plos One - 2011. - V.6. -el9405.
Другие публикации по теме диссертации
5. Lozhkin, A. The presence of manganese cations in the sample of human atheromatous plaque / A.P. Lozhkin, N.I. Silkin, O.N. Ilinskaya, R.P. Naumova // Abstracts of the XIV International Conference Devoted to the 20th Anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen university «Microbial enzymes in biotechnology and medicine».- Kazan, 2009,- P. 42.
6. Ложкин, А.П. Анализ содержания марганца в атеросклеротической бляшке как основа определения стадий атерогенеза / А.П. Ложкин, Т.Б. Биктагиров, Е.В. Тимонина, В.А. Абдульянов, А.В. Волошин, Н.И. Силкин, Р.Н. Хайруллин, М.Х. Сапахов, О.Н. Ильинская // Материалы ежегодной научно-практической конференции "Инновации РАН 2010". - Казань, 2010 - С.227-230.
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., проф. Ильинской Ольге Николаевне за ценные идеи и советы в процессе выполнения диссертационной работы, а также д.ф.-м.н., проф. Силкину Николаю Ивановичу за проведение экспериментов по ЭПР-спектроскопии, обсуждение и интерпретацию результатов.
Благодарность выражается докторам Андреасу Цирлику и Деннису Вульфу (Universitats klinikum, Albert-Ludwig-Universitat Freiburg, Deutchland), за предоставление экспериментального оборудования для выполнения научно-исследовательской работы в рамках проекта «Михаил Ломоносов II». Автор выражает благодарность д.б.н, проф. Наумовой Римме Павловне за пробуждение интереса к науке; к.ф.-м.н. Волошину Александру Викторовичу за проведение масс-спекрометрических экспериментов, а также Биктагирову Тимуру Булатовичу, Тимониной Елене Владимировне и Родионову Александру Александровичу за помощь в работе над диссертацией.
Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: Казань, 420008, ул. Кремлевская, 18, Казанский университет, отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне.
Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207
Тел: 272-74-59, 541-76-41,541-76-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 18.10.2011 г. Печ.л.1,6 Заказ МК-7071. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ложкин, Андрей Петрович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Атеросклероз как многофакторное заболевание.
1.2. Основные стадии атерогенеза.
1.2.1. Инициация атеросклеротического повреждения.
1.2.2. Инфильтрация моноцитов.
1.2.3. Прогрессия.
1.2.4. Разрыв бляшки.
1.3. Гипотезы происхождения атеросклероза.
1.3.1. Модификационная гипотеза.
1.3.2. Аутоиммунная гипотеза.
1.3.3. Гипотеза митохондриальной дисфункции.
1.3.4. Инфекционная гипотеза.
1.4. Аутоиммунная сторона атеросклероза.
1.4.1. Атеросклероз как аутоиммунное заболевание.
1.4.2. Аутоантигены, обнаруженные в атеросклеротических бляшках.
1.4.2.1. Липопротеины низкой плотности.
1.4.2.2. Белки теплового шока.
1.4.2.3. Фрагменты, экспрессируемые погибающими клетками.
1.4.3. Врожденный иммунитет в атерогенезе.
1.4.3.1. Скевинджер рецепторы.
1.4.3.2. Toll-like рецепторы.
1.4.4. Приобретенный иммунитет в развитии атеросклероза.
1.4.5. CD40-CD40L взаимодействие и его роль в атерогенезе.
1.5. Окислительный стресс в атерогенезе.
1.5.1. Основные типы активных форм кислорода и их функции в клетке.
1.5.2. Окислительный стресс в кардиологии.
1.5.3. Генерация АФК NAD(P)H оксидазами, ксантин оксидазами, NO-синтазами.
1.5.4. Продукция АФК митохондриальной ЭТЦ.
1.5.5. Сигнальные функции АФК в клетках эндотелия.
1.5.6. Факторы иммунной системы в формировании окислительного стресса.
1.5.7. Антиоксидантная система.
1.5.8. Супероскид дисмутазы в стенке сосуда.
1.6. Биомаркеры нестабильности и разрушения атеросклеротической бляшки.
1.6.1. Маркеры острой фазы воспаления.
1.6.1.1. С-реактивный белок.
1.6.1.2. Сывороточный амилоид А.
1.6.2. Цитокины и хемокины.
1.6.2.1. Интерлейкин-6.
1.6.2.2. Интерлейкин-18.
1.6.2.3. Моноцитарный хемоаттрактивный белок-1.
1.6.3. Плацентарный ростовой фактор.
1.6.4. Окисленные липопротеины низкой плотности:.
1.6.5. Факторы антиоксидантной системы.
1.6.5.1. Глутатион пероксидаза 2.
1.6.5.2. Супероксид дисмутаза.
1.6.6. Миелопероксидаза.
1.6.7. Матриксные металлопротеиназы.
1.6.8. Растворимый СБ40Ь.
1.7. Железо, медь, цинк в стенке сосуда, про- и антиатерогенные функции ионов металлов.
1.8. Физико-химические и молекулярные механизмы кальцификации стенки сосуда.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Биологические образцы.
2.1.1. Атеросклеротические бляшки.
2.1.2. Подопытные животные.
2.2. Физико-химические методы.
2.2.1. Приготовление базового раствора зонда ТМТН.
2.2.2. Определение активных форм кислорода в стенках аорты методом ЭПР.
2.2.3. Выявление участия в реакции Фентона металлов с переменной валентностью в составе атеросклеротической-бляшки.
2.2.4. Ксантиноксидазная реакция.
2.2.5. Количественное определение содержания элементов в атеросклеротической бляшке.
2.2.6. Обнаружение парамагнитных центров двухвалентного марганца в образцах атеросклеротических бляшек.
2.3. Физиолого-биохимические методы.
2.3.1. Стимуляция мышей фактором некроза опухолей ТНФ-альфа.
2.3.2. Получение образцов плазмы мышей.
2.3.3. Смыв перитонеальных макрофагов.•.
2.3.4. Цитометрия с использованием иммобилизованных на частицах антител (Cytometric bead array analysis, СВА).68-'
2.3.5. Анализ содержания цитокинов.
2.3.6. Определение концентрации хемокинов.
2.3.7. Количественный анализ фосфорилированных киназ.
2.3.8. Определение общего содержания белка в образцах лизатов клеток.
2.3.9. Анализ концентрации сывороточного амилоида А.
2.3.10. Определение концентрации лептина в плазме мышей.
2.3.11. Анализ концентрации инсулина в плазме крови мышей.
2.4. Методы работы с клетками и тканями мышей.
2.4.1. Выделение спленоцитов.
2.4.2. Негативная селекция Т-клеток.
2.4.3. Анализ чистоты и популяционной принадлежности Т-клеток.
2.4.4. Активация Т-клеток.
2.4.5. Активация клеток жировой ткани мышей:.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. Содержание элементов в образцах стенок сосудов.
3.1.1. Содержание ряда элементов и корреляционный анализ1.
3.1.2. Обнаружение комплексов двухвалентного марганца методом высокочастотного ЭПР.78«
3.2. Продукция АФК в образцах стенок сосудов.:.
3.2.1. Анализ данных динамики накопления нитроксильного радикала.
3.2.2. Окислительный стресс в образцах стенок сосудов.
3.2.3. Протекание реакции Фентона в атеросклеротических бляшках.
3.3. Иммунологические аргументы участия CD40-CD40L в формировании окислительного стресса в атерогенезе.
3.3.1. Измерение синтеза цитокинов, в плазме мышей с дефицитом рецептора CD40.
3.3.2. Модуляция синтеза цитокинов введением анти-С активирующего антитела.
3.3.3. Провоспалительный ответ перитонеальных макрофагов.
3.3.3.1. Изменение уровня фосфорилирования киназ ERK и р38 перитонеальных макрофагов.
3.3.3.2. Концентрации цитокинов в супернатантах перитонеальных макрофагов.
3.3.4. Влияние дефицита рецептора CD40 на концентрацию инсулина в плазме мышей.
3.3.5. Определение зависимости синтеза лептина от состояния рецептора CD40.
3.3.5.1. Изменение концентрации лептина в плазме мышей при дефиците CD40.
3.3.5.2. Влияние введения мышам агониста CD40 на концентрацию лептина в плазме.
3.3.5.3. Модуляция продукции лептина жировой тканью при активации CD40.
3.3.6. Продукция цитокинов Т-клетками, выделенными из селезенок
C57BL/6 мышей.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
4.1. Окислительный стресс в стенке сосуда.
4.2. Иммунологические аспекты возможных механизмов реализации окислительного стресса в атерогенезе.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунологические и биохимические факторы в формировании окислительного стресса при атерогенезе"
Актуальность работы. Атеросклероз, представленный в форме цереброваскулярных и коронарно-артериальных заболеваний — лидирующая причина смертности взрослого населения в мире [Murray, Lopez, 1997, Okrainec et al, 2004]. Только в 2005 году от сердечнососудистых заболеваний в США погибло 864500 человек, что составило примерно 35,2% от общего количества смертей. К этому числу относятся 151000 смертей от инфаркта миокарда и 143000 смертей от ишемического инсульта. [Lloyd et al., 2009].
В связи с тем, что атеросклероз является основной причиной ишемической болезни сердца и цереброваскулярной болезни, не только профилактика и лечение, но и своевременная диагностика данного заболевания представляют собой актуальную проблему. Существует множество определений атеросклероза, но большинство из них сходятся в одном - атеросклероз связан с патологическими процессами, происходящими в стенке сосуда, в которых участвуют несколько типов клеток, неотъемлемой частью атерогенеза также является процесс воспаления. Именно на воспалительный ответ указал в своем определении автор наиболее современной гипотезы атеросклероза - Рассел Росс: "Атерогенез -повреждение эндотелия, приводящее к воспалительному и фибропролиферативному ответам, переходящим в патологический процесс" [Ross, 1993]. В свою очередь Шварц с соавторами в своем определении атеросклероза достаточно полно описали типы клеток, участвующих в атерогенезе: "Атеросклероз - хроническое заболевание, вызванное повреждением стенок артерий в процессе воспаления и отложениями, состоящими из жировой и фиброзной ткани. В развитие заболевания вовлечено несколько типов клеток, в частности клетки гладкой мускулатуры, макрофаги, Т-лимфоциты и тромбоциты" [Schwartz et al., 1993].
Повышенный уровень генерации активных форм кислорода в стенке сосуда признан тремя доминирующими гипотезами атерогенеза как один из I стартовых механизмов, запускающих цепь событий, приводящих к i формированию атеросклеротических повреждений сосудов.
Согласно модификационной гипотезе, перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот в составе липопротеинов низкой плотности, инициированное свободными радикалами кислорода, представляет собой отправную точку атерогенеза [Jialal, 1998]. Окислительно-модифицированные ЛПНП представляют собой один из типов аутоантигенов, обнаруженных в атеросклеротических бляшках [Nilsson, Hansson, 2008]. Модификации ЛПНП, вызванные окислением, приводят к высвобождению фосфолипидов и пероксидов липидов, которые вызывают иммунный ответ у окружающих клеток [Glass, Witztum, 2001]. Гипотеза о митохондриальной дисфункции базируется на утверждении, что увеличенная генерация активных форм кислорода митохондриями ответственна состояние эндотелиальной дисфункции, потерю способности релаксации [Wenzel et al., 2008] и развитие воспаления в стенке сосуда, ведущего к возникновению сердечнососудистых заболеваний [Ballinger, 2005].
В стенке сосуда присутствуют разнообразные ферментные системы, участвующие в генерации АФК, среди них NAD(P)H — оксидаза, ксантин оксидаза, мономерная форма эндотелиальной NO-синтазы, цитохром Р-450, липоксигеназа, циклооксигеназа, а также ферментные комплексы митохондриальной электрон-транспортной цепи [Li, Shah, 2004]. Внимание исследователей сконцентрировано на NAD(P)H оксидазе как основном регуляторе редокс состояния сосудов и миокарда [Griendling et al., 2000]. Наиболее активная NAD(P)H оксидаза обнаружена у клеток иммунной системы [Babior, 2004]: нейтрофилов [Batot et al., 1995], эозинофилов, моноцитов и макрофагов [Segal et al., 1981]. Показано, что повышенный уровень таких хемокинов, как МСР-1 и MIP-1, в сыворотке крови пациентов с нестабильной и стабильной стенокардией ассоциирован со сниженной концентрацией антиоксидантов и усиленным перекисным окислением липидов, предполагая наличие окислительного стресса [Aukrust et al., 2001]. 9
В свете данных о неоспоримой роли активированных клеток иммунной системы, в частности макрофагов, и окислительного стресса в развитии атеросклероза и сопутствующих ему осложнений, представляется весьма перспективным установление механизмов, лежащих в основе усиления экспрессии хемокинов, приводящих к активации и хемотаксису иммунных клеток, участвующих в генерации АФК.
Целью данной работы явился анализ вовлеченности биохимических и иммунологических процессов в формирование окислительного стресса при атерогенезе. Ставились следующие задачи:
1. Выявить генерацию АФК методом спинового зондирования образцов атеросклеротических бляшек, оценить в исследуемых клинических образцах вклад реакции Фентона в окислительный стресс.
2. Определить методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой количественное содержание Са, Р, Си, Бе, Ъп, Мп в образцах атеросклеротических бляшек, оценить степень кальцификации образцов и выявить корреляцию между данными параметрами.
3. Идентифицировать методом ЭПР наличие ионов Мп2+ в образцах атеросклеротических бляшек с органоминеральным агрегатом и в образцах, не содержащих кальцифицированного матрикса.
4. Установить зависимость синтеза-гормонов лептина и инсулина, а также хемокинов МСР-1, Б^АЫТЕБ, КС, М1Р-1 в плазме мышей линии С57ВЬ/6 от наличия и активации рецептора С040.
5. Определить влияние введения анти-СБ40 активирующего антитела мышам линии С57ВЪ/6 на продукцию хемокина МСР-1 и фосфорилирование провоспалительной р38 и антивоспалительной БЫК киназ в перитонеальных макрофагах.
6. Выявить изменение синтеза хемокина МСР-1 в Т-клетках, выделенных из селезенки мышей, после активации рецептора С040.
Научная новизна. Методом ЭПР-спектроскопии с применением методики спинового зондирования выявлена генерация АФК и протекание
10 реакции Фентона в образцах атеросклеротических бляшек. Методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой определено содержание ряда элементов, установлена статистически значимая корреляция между концентрацией ионов марганца и степенью кальцификации, также W-диапазоне ЭПР обнаружен сигнал комплексов двухвалентного марганца образцах атеросклеротических бляшек и зафиксировано заметное различие формы линии ЭПР сигналов этого элемента в кальцифицированных тканях и образцах без минеральных отложений.
В ходе работы показаны возможные механизмы формирования окислительного стресса при активации рецептора CD40. Полученные нами данные о снижении продукции лептина жировой тканью, активированной агонистом CD40, согласуются с современными представлениями об иммунологической основе метаболических заболеваний. Кроме того выявлены зависимости концентраций ряда цитокинов, в том числе МСР-1, одного из наиболее значимых проатерогенных факторов, от дефицита и активации рецептора CD40. Установлено, что активация этого рецептора приводит к провоспалительному ответу макрофагов и усилениюими синтеза МСР-1.
Практическая значимость. Показанная в работе обратная взаимосвязь между концентрацией ионов марганца и степенью кальцификации в образцах атеросклеротических бляшек может послужить основой для разработки методов диагностики минерализации стенки сосуда.
Примененная нами модель атерогенеза у мышей, индуцированная диетой без генетических модификаций путей метаболизма ЛПНП, наиболее близка современной статистике, согласно которой гипергликимия и гиперхолестеринемия представляют собой одни из самых распространенных факторов риска развития сердечнососудистых заболеваний (ССЗ). Это позволяет нам полагать, что закономерности, установленные в процессе наших in vivo исследований на мышах, могут быть значимы в отношении человека. Установленная нами взаимосвязь между активацией рецептора
11
CD40, усилением синтеза одного из наиболее перспективных предикторов нестабильности атеросклератических бляшек, MCP-1, и фосфорилированием провоспалительной киназы р38 может послужить основой- для разработки стратегии создания молекулярных лекарственных препаратов. Согласно новаторским работам блокада фосфорилирования ряда провоспалительных киназ на модели мышей уже зарекомендовала себя как действенное средство замедления развития атеросклероза.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в. исследования; Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ 1.15.56 «Механизмы регуляции функциональной активности клеток» при поддержке АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (2Л .1/920), государственного контракта №02.740.11.0391, гранта РФФИ 09-02-97017,совместного гранта Министерства образования и- науки Российской Федерации- и Германской службы академических обменов «Михаил Ломоносов И».
Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. ЭПР-спектроскопию проводили в отделе ЭПР спектроскопии под руководством д.ф.-м.н, профессора Силкина Н:И., масс-спектрометрию — в лаборатории д.ф.-м.н, профессора Гильмутдинова А.Х. при участии к.ф.-м.н. Волошина A.B. отдела аналитической спектроскопии Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов Приволжского федерального округа. Иммунологические исследования осуществляли в исследовательской группе доктора Андреаса Цирлика, отделение кардиологии клиники университета Альберта-Людвига, (Freiburg-im-Breisgau, Germany).
Положения, выносимые на защиту:
1. С применением метода электронного парамагнитного резонанса выявлено, что в образцах атеросклеротических бляшках протекает окислительный стресс, в который вносит вклад реакция Фентона.
12
1. Активация рецептора С040 в мышах линии С57В1У6 приводит к увеличению концентрации хемокина МСР-1 в плазме и перитонеальной жидкости, нокаут гена рецептора СБ40 вызывает снижение синтеза МСР-1 и не влияет на концентрацию инсулина в плазме.
3. Введение активирующего анти-С040 антитела мышам линии С57ВЬ/6 приводит к фосфорилированию провоспалительной киназы р38 перитонеальных макрофагов, но не к фосфорилированию киназы ЕМС.
4. Содержание общего марганца достоверно снижается с возрастанием степени кальцификации образцов атеросклеротических бляшек, спектр ЭПР двухвалентного марганца- наблюдается в образцах атеросклеротических бляшек, но не интактной аорты.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XIV международной конференции "Ферменты микроорганизмов в биотехнологии и медицине" (Казань, 2009), ежегодной научно-практической конференции и выставке "Инновации РАН 2010" (Казань, 2001), семинаре стипендиатов совместных программ Минобрнауки РФ и Германской службы академических обменов (ДААД) "Михаил Ломоносов" и "Иммануил Кант" (Москва, 2011), а также на итоговых конференциях КГУ (2008-2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 17 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 270 источников; из них 264 на иностранном языке.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ложкин, Андрей Петрович
выводы
1. Установлено протекание реакции Фентона и ее вклад в окислительный стресс в клинических образцах стенок сосудов человека с атеросклеротическими повреждениями.
2. Определено количественное содержание Са, Р, Си, Бе, Мп в образцах атеросклеротических бляшек, и показано, что из исследованных элементов только содержание марганца имеет обратную коррелирляцию со степенью кальцификации.
3. Спектры ЭПР двухвалентного марганца исследованных кальцифицированных образцов и образцов без минеральных отложений имеют выраженные различия, при этом в образцах интактной аорты спектр двухвалентного марганца не наблюдается.
4. Дефицит рецептора СБ40 не влияет на синтез инсулина, приводит к увеличению концентрации лептина в плазме животных, содержащихся на диете с высоким содержанием жиров, и снижению его концентрации у животных на стандартной диете; активация рецептора не влияла на продукцию лептина в плазме и снижала его синтез в жировой ткани.
5. Нокаут гена рецептора С040 приводит к снижению, а активация рецептора - к увеличению концентрации. МСР-1 в плазме мышей. Дефицит рецептора и его активация не изменяют синтез КС и увеличивают уровень ЯАКТЕ8.
6. Активация рецептора СЭ40 сопровождается фосфорилированием киназы р38 и усилением синтеза МСР-1 перитонеальными макрофагами и не влияет на синтез МСР-1 Т-клетками, выделенными из селезенки мышей.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., проф. Ильинской Ольге Николаевне за ценные идеи и советы в процессе выполнения диссертационной работы, а также д.ф.-м.н., проф. Силкину Николаю Ивановичу за проведение экспериментов по ЭПР-спектроскопии, обсуждение и интерпретацию результатов.
Благодарность выражается докторам Андреасу Цирлику и Деннису Вульфу (Universitats klinikum, Albert-Ludwig-Universitat Freiburg, Deutchland), за предоставление экспериментального оборудования для выполнения научно-исследовательской работы в рамках проекта «Михаил Ломоносов II». Автор выражает благодарность д.б.н, проф. Наумовой Римме Павловне за пробуждение интереса к науке; к.ф.-м.н. Волошину Александру Викторовичу за проведение масс-спекрометрических экспериментов, а также Биктагирову Тимуру Булатовичу, Тимониной Елене Владимировне и Родионову Александру Александровичу за помощь в работе над диссертацией.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Роль АФК в атерогенезе
Окислительный стресс пронизывает все этапы атерогенеза и хорошо согласуется с тремя доминирующими гипотезами атерогенеза. Нами получены результаты, которые не противоречат ни одной из гипотез.
Согласно гипотезе митохондриальной дисфункции, именно избыток активных форм кислорода, генерируемых митохондриями, являются причиной порочного круга, состоящего из усиливающих друг в друга состояний митохондриальной и эндотелиальной дисфункции, приводящих к увеличению проницаемости эндотелия для липопротеинов низкой плотности, проникновению последних в интиму сосуда, снижению способности сосуда к релаксации.
В модификационной гипотезе АФК также занимают центральное положение, поскольку участвуют в инициирующем атерогенез событии — окислительной модификации липопротеинов низкой плотности, способствующей накоплению макрофагов в интиме и формированию тучных клеток - ключевых признаков стадии "жировых полосок".
Аутоиммунная гипотеза тоже не обходится без обсуждения АФК, и это на наш взгляд закономерно, ведь активные формы кислорода это не только значимый фактор иммунитета, но и, в виду того, что ряд иммунных клеток обладает ферментными системами, генерирующими активные формы кислорода, неизбежное следствие активации иммунной системы.
Учитывая тот факт, что современный взгляд на атеросклероз представляет данное заболевание многофакторным, мы считаем, что три представленные взгляда на развитие атеросклероза не являются взаимоисключающими. Скорее, их нужно рассматривать как взаимодополняющие: в таком случае роль окислительного стресса в атерогенезе представляется комплексной и многогранной, включающей как биохимические, так и иммунологические механизмы. Действительно, до недавнего времени активным формам кислорода приписывалось
107 исключительно пагубное влияние на состояние стенки сосуда, сейчас же накапливается все больше доказательств, свидетельствующих, что АФК не как это полагалось раньше токсические субпродукты клеточного дыхания, но и сигнальные молекулы эндотелиальных клеток сосуда, имеющие большое значение. Известно, что низкие концентрации пероксида водорода способствуют выполнению функции расслабления стенки сосуда клеткам гладкой мускулатуры, в то время как избыток супероксид радикала нарушает функционирование ГМК, связывая признанный вазодилятирующий фактор ЭК — оксид азота. ЭТЦ митохондрий - ключевой источник АФК в эндотелиальных клетках, поэтому продукция АФК в митохондриях находится под строгим' контролем посредствам ряда механизмов. Функционирование митохондриальных АФК как сигнальных молекул вовлечено в регуляцию тонуса сосуда, адаптивные изменения в ответ на механические стимулы, ответ сосуда на гипоксию-реперфузию. Эксцессивная генерация АФК ведет к нарушению нормального выполнения ими сигнальной функции, в результате наблюдается митохондриальная дисфункция, вносящая вклад в патогенез, сердечнососудистых заболеваний. АФК выполняют важную, иммунную- функцию в- борьбе с инородными микро- и макроорганизмами. Взаимосвязь АФК с иммунитетом чрезвычайно сложна, поскольку АФК представляют собой причину и следствие активации иммунной системы. Так супероксид радикал генерируется как клетками иммунной системы, макрофагами, эозинофилами, нейтрофилами, так и другими типами клеток, ЭК, ГМК, в ответ на стимулы, экспрессируемые иммунными клетками. В то же время АФК активируют NF-kB, что ведет к усилению иммунного ответа, так образуется порочный круг.
В первой части данной работы мы показали, что генерация АФК в атеросклеротических бляшках значительно превышает таковую в стенке интактного сосуда и наглядно продемонстрировали, что формирование окислительного стресса, присутствующего в атеросклеротических бляшках, связано не только с ферментативными механизмами, но и со
108 свободнорадикальными реакциями с участием металлов с переменной валентностью.
Взаимосвязь процесса кальцификации стенки сосуда и содержания марганца
Проведенные нами исследования показали статистически значимое снижение содержания марганца, сопряженное с ростом степени кальцификации, при этом были выявлены косвенные свидетельства попадания ионов двухвалентного марганца в минерализованный матрикс. На основании представленных результатов можно выдвинуть гипотезу о наличии взаимосвязи между процессом кальцификации стенки сосуда и распределением марганца в тканях, подверженных атеросклеротическим повреждениям. Полученные данные также позволяют рассматривать ЭПР-детектируемый марганец как потенциальный маркер атерогенеза. Однако, необходимо обратить внимание на то, что стенка сосуда с атеросклеротическим повреждением отличается от здоровой низким содержанием общего марганца и наличием Мп , четко детектируемым методом ЭПР. Мы полагаем, что эти приоритетные данные, не имеющие на сегодняшний день аналогов в современной литературе; могут внести вклад в понимание механизмов кальцификации и найти практическое применение в медицине.
Вклад сигнального пути СВ40- СВ40Ь в окислительный стресс при атерогенезе
Вторая часть наших исследований посвящена взаимосвязи состояния метаболического синдрома с формированием окислительного стресса и участию рецептора СБ40 в данном процессе. Выбранная нами модель развития метаболического синдрома, индуцированного "диетой западного типа" хорошо согласуется с такими факторами риска развития ССЗ, как гипергликимия вследствие инсулиновой резистентности, которая тесно связана с диабетом второго типа, гиперхолестеринемия вследствие инсулиновой резистентности, связанная с ожирением. Гипергликимия и 1 109 высокий уровень лептина в крови считаются активаторами генерации активных форм кислорода клетками эндотелия, что ссылает нас к возможности развития эндотелиальной дисфункции — одного из стартовых механизмов атерогенеза. Мы показали, что концентрация инсулина в плазме подопытных животных не зависела от С040, в то время как активация этого рецептора у клеток жировой ткани приводила к благоприятному эффекту в виде снижения синтеза лептина.
Метаболический синдром также может влиять на развитие окислительного стресса в атерогенезе вследствие свойственного для МС приобретения жировой тканью иммунной функции и развитию хронического системного воспаления-с экспрессией цитокинов и хемокинов, что ведет к активации клеток иммунной системы, в том числе и моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов, чья профессиональная функция - продукция АФК. В данной работе не обнаружено зависимости синтеза КС, М1Р-1 от состояния рецептора С040, неоднозначные данные получены относительно ЯАЫТЕ8. .Однако мы продемонстрировали, что концентрация* МСР-1, хемокина, которому наиболее часто приписывается проатерогенная функция, находится в зависимости от состояния рецептора СБ40. Так, в плазме генно-нокаутированных животных, не способных к экспрессии рецептора, мы обнаружили сниженную по сравнению с контрольной группой животных концентрацию данного хемокина. Активация же рецептора приводила к фосфорилированию провоспалительной киназы р38 макрофагов и увеличению концентрации МСР-1 в. плазме животных и супернатанте перетониальных макрфагов.
Таким образом, результаты наших исследований позволяют охарактеризовать формирование окислительного стресса в стенке сосуда, сопряженного с атерогенезом, как комплексный многостадийный процесс, включающий ряд как биохимических, так и иммунологических факторов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ложкин, Андрей Петрович, Казань
1. Abumrad; N. Membrane proteins implicated in longchain fatty acid uptake by mammalian cells: CD36, FATP and FABPm Text. / N. Abumrad, C Coburn, A. Ibrahimi // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1441. - P.4-13.
2. Aggarwal, A. Soluble CD40 ligand is an early initiator of inflammation after coronary intervention Text. / A. Aggarwal, A. Blum, D.J. Schneider, B.E. Sobel, H.L. Dauerman // Coron. Artery Dis. - 2004. - V.15. -P.471-475.
3. André, P. Platelet-derived CD40L: the switch-hitting player of cardiovascular disease Text. / L. Nannizzi-Alaimo, S.K. Prasad, D.R. Phillips // Circulation. 2002. - V. 106. - P.896-899.
4. Asea, A. Chaperokine-induced signal transduction pathways Text. / A. Asea // Exerc. Immunol. Rev. 2003. - Y.9. - P.25-33.
5. Babior, B.M. NADPH oxidase Text. / B.M. Babior // Curr. Opin. Immunol. 2004. - V. 16. - P.42-47.
6. Baggiolini, M. Interleukin-8 and related chemotactic cytokines: CXC and CC chemokines Text. / M. Baggiolini, B. Dewald, B. Moser // Adv. Immunol. 1994. - V.55. - P.97-179.
7. Ballinger, SW. Mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease Text. / S.W. Ballinger // Free. Radic. Biol. Med. 2005. - V.38. - P. 1278-1295.
8. Barczyk, M. Integrins Text. / M. Barczyk, S. Carracedo, D. Gullberg // Cell Tissue Res. 2010. - V.339. - P.269-280 *
9. Barwey, J.A. Active oxygen species and the functions of phagocytic leukocytes Text. / J.A. Badwey, M.L. Karnovsky // Annu. Rev. Biochem. 1980.- V.49. — P.695-726.
10. Bason, C. Interaction of antibodies against cytomegalovirus with heat shock protein 60 in pathogenesis of atherosclerosis Text. / C. Bason, R. Corrocher, C. Lunardi // Lancet. 2003. - V.362. - P.1971-1977.
11. Batot, G. Characterization of neutrophil NADPH oxidase activity reconstituted in a cell-free assay using specific monoclonal antibodies raised against cytochrome b558 Text. / G. Batot, C. Martel, N. Capdeville, F. Wientjes,
12. F. Morel // Eur. J. Biochem. 1995. - V.234 - P.208-215.
13. Beckman, J.S. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly Text. / J.S. Beckman, W.H. Koppenol // Am. J. Physiol. 1996.- V.271. -P.C1424-C1437.
14. Benov, L. How superoxide radical damages cells Text. / L. Benov // Protoplasma. 2000. - V.217. - P.33-36.
15. Berger, M. A nuclear microscopy study of trace elements Ca, Fe, Zn and Cu in atherosclerosis Text. / M. Berger, E. Rubinraut, I. Barshack, A. Roth,
16. G. Keren, J. George // Atherosclerosis. 2004. - V. 175(2). - P.229-234.
17. Berliner, J.A. The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis Text. / J.A. Berliner, J.W. Heinecke // Free. Radic. Biol. Med. 1996. - V.20. -P.707-727.
18. Bishop, G.M. Zinc stimulates the production of toxic Reactive Oxygen Species (ROS) and inhibits glutathione reductase in astrocytes Text. / G.M. Bishop, R. Dringen, S.R. Robinson // Free. Radic. Biol. Med. 2007. - V.42. -P. 1222-1230.
19. Blasi, F. Detection of Chlamydia pneumoniae but not Helicobacter pylori in atherosclerotic plaques of aortic aneurysms (abstract) Text. / F. Blasi, F. Denti, M. Erba // J. Clin. Microb. 1996. - V.34. - P.2766-2769.
20. Bouloumie, A. Leptin induces oxidative stress in human endothelial cells Text. / A. Bouloumie, T. Marumo, M. Lafontan, R. Busse // FASEB J. -1999. V.13. - P.1231-1238.
21. Beutler, B. Inferences, questions and possibilities in Toll-like receptorsignaling Text. / B. Beutler // Nature. 2004. - V.430 - P.257-63.116
22. Brewer, G. J. Iron and Copper Toxicity in Diseases of Aging, Particularly Atherosclerosis and Alzheimer's Disease Text. / G. J. Brewer // Exper. Biol, and Med. 2007. - V.232. - P.323-335.
23. Brookes, P.S. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle Text. I P.S. Brookes, Y.Yoon, J.L. Robotham, M.W. Anders, S.S. Sheu // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. -2004. -V.287. -P.C817-C833.
24. Brown, MS. Lipoprotein metabolism in the macrophage -implications for cholesterol deposition in atherosclerosis Text. / M.S. Brown, J.L. Goldstein // Annu. Rev. Biochem. 1983. - V.52. - P.223-261.
25. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism Text. / M. Brownlee // Diabetes. 2005. - V.54. - P. 1615-1625.
26. Cadenas, E. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging Text. / E. Cadenas, K.J. Davies // Free Radic. Biol. Med. 2000. -V.29 - P.222—230.
27. Chang, M.K. Apoptotic cells with oxidation-specific epitopes are immunogenic and proinflammatory Text. / M.K. Chang, C.J. Binder, Y.I. Miller, G. Subbanagounder, G.J. Silverman, J.A. Berliner, J.L. Witztum // J. Exp. Med. -2004. V.200. - P. 1359-1370.
28. Chakrabarti, S. CD40 ligand influences platelet' release of reactive oxygen intermediates Text. / S. Chakrabarti, S. Varghese, O. Vitseva, K. Tanriverdi, J.E. Freedman // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005. - V.25. -P.2428-2434
29. Chakrabarti, S. CD40-40L signaling in vascular inflammation Text. / S. Chakrabarti, P. Blair, J.E. Freedman // J. Biol. Chem. 2007. - V.282. -P.18307-18317.
30. Chandel, N.S., Cellular oxygen sensing by mitochondria: old questions, new insight V / N.S. Chandel, P.T. Schumacker // J. Appl. Physiol. -2000. V.88. — P.1880-1889.
31. Cheng, G. Homologs of gp91phox: cloning and tissue expression of Nox 3, Nox4, and Nox5 Text. / G. Cheng, Z. Cao, X. Xu, E.G. van Meir, J.D. Lambeth // Gene. 2001. - V.269. - P. 131-140.
32. Clinton, S.K. Cytokines and growth factors in atherogenesis Text. / S.K. Clinton, P. Libby // Arch. Path. Lab. Med. 1992. - V.l 16. - P.1292-1300:
33. Coffman, R.L. Antibody to interleukin-5 inhibits helminth-induced eosinophilia in mice Text. / R.L. Coffman, B.W.P. Seymour, S. Hudak, J. Jackson, D. Rennick // Science. 1989. - V.245. -P.308-310.
34. Culotta, V. C. Activation of superoxide dismutases: Putting the metal to the pedal Text. / V. C. Culotta, M. Yang, T. V. O'Halloran // Biochimica et Biophysica Acta. 2006. - V.1763. - P.747-758.
35. Davenport, P. The role of interleukin-4 and interleukin-12 in the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice Text. / P. Davenport, P.G. Tipping // Am. J. Pathol. 2003. - V.l 63. - P. 1117-1125.
36. Demer, L.L. Nanoscale Architecture in Atherosclerotic Calcification Text. / L.L. Demer, A.P. Sage, Y. Tintut // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2008. — V.28. -P.1882-1884
37. Eckart, R.E. Matrix metalloproteinases in patients with* myocardial infarction and percutaneous revascularization Text. / R.E. Eckart, C.F. Uyehara, E.A. Shry, J.L. Furgerson, R.A. Krasuski // J. Interv. Cardiol; 2004 - V.17. -P.27-31.
38. Edféldt, K. Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions: a possible pathway for plaque activation Text. / K. Edfeldt, J; Swedenborg, O.K. Hansson, Z.Q. Yan // Circulation: 2002. - V.105. - P.l 1581161.
39. Egashira, K. Molecular mechanisms mediating inflammation in vascular disease: special reference to monocyte chemoattractant protein-1 Text. / K. Egashira// Hypertensiom 2003; - V.41î. - P;834-84K
40. Elhage, R. Reduced atherosclerosis m interleukin-18 deficient apolipoprotein E-knockout mice Text. / R. Elhage, J. Jawien, M. Rudling, H.G. Ljunggren, K. Takeda, S. Akira, F. Bayard, G.K. Hansson // Cardiovasc. Res. -2003. V.59. - P.234-240.
41. Esterbauer, H. The role of lipid peroxidation and antioxidants in the oxidative-modification of LDL Text. / H. Esterbauer, J. Gebicki, H. Puhl, G. Jurgens // Free Radie. Biol. Med. 1992. - V. 13. - P.341-390.
42. Ewence, A. Calcium Phosphate Crystals Induce Cell Death in Human Vascular Smooth Muscle Cells: A Potential Mechanism in Atherosclerotic Plaque Destabilization Text. / A. E. Ewence, M. Bootman, H. L. Roderick, J. N. Skepper,
43. G. McCarthy, M. Epple, M. Neumann, C. M. Shanahan, D. Proudfoot // Circ. Res — 2008. V.103. - P.e28-e34
44. Falk, E. Coronary plaque disruption Text. / E. Falk, P.K. Shah, V. Fuster // Circulation. 1992. - V.95. - P.657-671.
45. Faraci, F.M. Vascular protection: superoxide dismutase isoforms in the vessel wall Text. / F.M. Faraci, S.P. Didion // Atherioscler. Thromb. Vase. Biol. 2008. - V.24. - P.1367-1373.
46. Felty, Q. Estrogen-induced mitochondrial reactive oxygen species as signal-transducing messengers Text. / Q. Felty, W.C. Xiong, D. Sun, S. Sarkar, K.P. Singh, J. Parkash, D. Roy // Biochemistry. 2005. - V.44. - P.6900-6909.
47. Fong, I.W. Rabbit model for Chlamydia pneumoniae infection Text. /1. W. Fong, B. Chiu, E. Viira // J. Clin. Microb. 1997. - V.35. - P.48-52.
48. Frostegard, J. Induction,of T cell activation by oxidized low density lipoprotein Text. / J. Frostegard, R. Wu, R. Giscombe, G. Holm, A.K. Lefvert, J. Nilsson // Arterioscler. Thromb. 1992. - V. 12. - P.461-467.
49. Gabay, C. Acute-phase proteins and other systemic response to inflammation Text. / C. Gabay, I. Kushner // N. Engl. J. Med. 1999. - V.340. -P.448-454.
50. Galis, Z.S. Increased expression- of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques Text. / Z.S. Galis, G.K. Sukhova, M.W. Lark, P. Libby // J. Clin. Invest. 1994. -V.94.-P:2493-2503.
51. Glass, C.K. Atherosclerosis: the road ahead Text. / C.K. Glass, J.L. Witztum // Cell. -2001. -V. 104. -P.503-516.
52. Gracie, J.A. Interleukin-18 Text. / J.A. Gracie, S.E. Robertson, I.B.
53. Mclnnes // J. Leukoc. Biol. 2003. - V.73. - P.213-224.122
54. Gray, M. Apoptotic cells protect mice from autoimmune inflammation by the induction of regulatory B cells Text. / M. Gray, K. Miles, D. Salter, D. Gray, J. Savill // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - V.104. -P. 14080-14085.
55. Greaves, D.R. Thematic review series: the immune system and atherogenesis. Recent insights into the biology of macrophage scavenger receptors Text. / D.R. Greaves, S. Gordon // J. Lipid. Res. 2005. - V.46. - P. 11-20.
56. Griendling, K.K. Redox control of vascular smooth muscle proliferation Text. / K.K. Griendling, M. Ushio-Fukai // J. Lab. Clin. Med. -1998.-V.132.-P.9-15.
57. Griendling, K.K. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease Text. / K.K. Griendling, D. Sorescu, M. Ushio-Fukai // Circ. Res. -2000. V.86. - P.494-501
58. Guido, S. Inflammation- and Atherosclerosis Novel Insights Into Plaque Formation and Destabilization Text. / S. Guido, M. Bendszus // Stroke. -2006. V. 37. - P.1923-1932.
59. Halliwell, B. Free radicals in biology and medicine Text. / B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge // Oxford University Press. 2006. - P.272.
60. Han, D. Voltage-dependent anion channels control the release of the superoxide anion from mitochondria to cytosol Text. / D. Han, F. Antunes, R. Canali, D. Rettori, F. Cadenas // J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P.5557-5563.
61. Hansson, G.K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease Text. / G.K. Hansson //N. Engl. J. Med. -2005. V.352. -P.1685-1695.
62. Hansson, G.K. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword Text. / G.K. Hansson, P. Libby // Nat. Rev. Immunol. 2006. — V.6. -P.508-519.
63. Hawkins, C.L. Oxidative damage to collagen and related substrates by metal ion / hydrogen peroxide systems: random attack or site-specific damage? Text. / C.L. Hawkins, MJ. Davies // Biochim. Biophys. Acta. 1997. - V.1360. -P.84 -96.
64. Heeschen, C. CAPTURE Study Investigators. Soluble CD40 ligand in acute coronary syndromes Text. / C. Heeschen, S. Dimmeier, C.W. Hamm, MJ'. van den Brand, E. Boersma, A.M. Zeiher, M.L. Simoons // N. Engl. J. Med. -2003. V.348. - P. 1104-1 111.
65. Heistad, R. Oxidative Stress and Vascular Disease Text. / R. Heistad // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006. - V.26. - P.689-695.
66. Heitzer, T. Endothelial dysfunction, oxidative stress and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease Text. / T. Heitzer, T. Schlinzig, K. Krohn, T. Meinertz, T. Miinzel // Circulation. 2001. - V.104. -P.2673-2678.
67. Henn, V. CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction of endothelial cells Text. / V. Henn, J.R. Slupsky, M. Gräfe, I. Anagnostopoulos, R. Förster, G. Müller-Berghaus, R.A. Kroczek // Nature. 1998. - V.391. -P.591-594.
68. Hennig, B. Antiatherogenic properties of zinc: Implications in endothelial cell metabolism Text. / B. Hennig, M. Toborek and C.J. Mcclain // Nutrition. 1996. -V. 12. - P.711-717.
69. Hennig, B. Zinc nutrition and apoptosis of vascular endothelial cells: implications in atherosclerosis Text. / B. Henneg, P. Meerarani, P. Ramadass, M. Toborek, A. Malecki, R. Slim, C.J. McClain // Nutrition. 1999. - V.15. - P.744-748.
70. Heumüller, S. Apocynin is not an inhibitor of vascular NADPH oxidases but an antioxidant Text. / S. Heumuller, S. Wind, E. Barbosa-Sicard, H.H.H.W. Schmidt, R. Busse, K. Schröder, R.P. Brandes // Hypertension. 2008. — V.51. -P.211-217
71. Hoebe, K. The interface between innate and adaptive immunity Text. / K. Hoebe, E. Janssen, B. Beutler // Nat. Immunol. 2004. - V.5. - P.971-974.
72. Huber, S.A. Interleukin-6 exacerbates early atherosclerosis in mice Text. / S.A. Huber, P. Sakkinen, D. Conze, N. Hardin, R. Tracy // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999. - V.19. - P.2364 -2367.
73. Hughes, S. The effect of zinc supplementation in humans on plasma lipids, antioxidant status and thrombogenesis Text. / S.Hughes, S. Samman // J. Am. Coll. Nutr. 2006. - V.25. - P.285-291.
74. Iyer, S. Role of placenta growth factor in cardiovascular health Text. / S. Iyer, K.R. Acharya // Trends Cardiovasc. Med. 2002. - V.12. - P.128 -134.
75. Jessup, W. Lipid oxidation in atherogenesis: an overview Text. / W. Jessup, L. Kritharides, R. Stacker // Biochem. Soc. Trans. 2004. - V.32. - P. 134 -138
76. Jialal, I. Evolving lipoprotein risk factors: lipoprotein(a) and oxidized low-density lipoprotein Text. / I. Jialal // Clin. Chem 1998. - V. 44. - P. 18271832.
77. Johnson, R.C. Vascular Calcification: Pathobiological Mechanisms and Clinical Implications Text. / R. C. Johnson, J. A. Leopold, J. Loscalzo // Circ. Res. 2006. -V.99 - P. 1044-1059.
78. Jonasson, L. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque Text. / L. Jonasson, J. Holm, O. Skalli, G. Bondjers, G.K. Hansson // Arteriosclerosis. 1986. — V.6. -P.131-138.
79. Jones, C.B. Matrix metalloproteinases: a review of their structure and role in acute coronary syndrome Text. / C.B. Jones, D.C. Sane, D.M. Herrington // Cardiovasc. Res. 2003. - V.59 - P.812- 823.
80. Kawaguchi, H. Band neutrophil count and the presence and severity of coronary atherosclerosis Text. / H. Kawaguchi, T. Mori, T. Kawano, S. Kono // Am. Heart. J. 1996. - V. 132. - P.9-12.
81. Koenig, W. Biomarkers of atherosclerotic plaque instability and rupture Text. / W. Koenig, N. Khuseyinova // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2007.-V.27. -P.T5-26.
82. Lackner, K.J. Atherosclerosis, oxidative- stress and- glutathione peroxidase-1: a new kid on the block Text. / K.J. Lackner, S. Blankenberg // Ital. Heart. J: 2004. - V.5. - P: 169-172.
83. Lamb, D.J. Molecular mimicry in atherosclerosis: a role for heat shock proteins in immunization Text. / D.J. Lamb, W. El-Sankary, G.A. Ferns // Atherosclerosis. 2003. - V. 167. - P; 177-185:
84. Lee, J.S. Modulation of monocyte chemokine production and; nuclear factor kappa B activity by oxidants Text. / J.S. Lee, S.S. Kahlon, R. Culbreth, A.D. Cooper Jr. // J. Interferon. Cytokine Res. 1999. - V.19; - P.761-767.
85. Lee, Y.J. Sorption mechanisms of zinc on hydroxy apatite: systematic uptake studies and EXAFS spectroscopy analysis Text. / Y.J. Lee, E.J. Elzinga, R.J. Reeder // Environ. Sei. Technol. 2005. - V.39. - P.4042-4048.
86. Leitinger, N. Oxidized phospholipids as modulators of inflammation in atherosclerosis Text. / N. Leitinger // Curr. Opin. Lipidol. 2003. - V.14 -P.421-430.
87. Li, D. LOX-1, an oxidized LDL endothelial receptor, induces CD40/CD40L signaling in human coronary artery endothelial cells Text. / D. Li, L. Liu, H. Chen, T. Sawamura, J.L. Mehta // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2003 -V.23.-P.816-821.
88. Li, J.M. Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology Text. / J.M. Li, A.M. Shah // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2004. - V.287. - P.R1014-R1030.
89. Liu, Y. Mitochondrial sources of H202 generation play a key role in flow mediated dilation in human coronary resistance arteries Text. / Y. Liu, H. Zhao, H. Li, B. Kalyanaraman, A.C. Nicolosi, D.D. Gutterman // Circ. Res. -2003. V.93. - P.573-580.
90. Lucas, A. D. Atherosclerosis: role of chemokines and macrophages Text. / A.D. Lucas, D. R. Greaves // Expert Rev. Mol. Med. 2001. - P. 1-18.
91. Luster, A.D. Chemokines: chemotactic cytokines that mediate inflammation Text. / A.D. Luster // N. Engl. J. Med. 1998. - V.338. - P.436-445.
92. Mach, F. CD40 signaling in vascular cells: a key role in atherosclerosis? Text. / F. Mach, U. Schonbeck, P. Libby // Atherosclerosis. -1998a. V. 137. - P.S89-S95
93. Mach, F. The role of chemokines in atherosclerosis Text. / F. Mach // Curr. Atheroscler. Rep. 2001. - V.3. - P.243-251.
94. Mach, F. Reduction of atherosclerosis in mice by inhibition of CD40 signalling Text. / F. Mach, U. Schonbeck, G.K. Sukhova, E. Atkinson, P. Libby / Nature. 1998b. - V.394. - P.200 -203.
95. Mahmoudi, M. DNA damage and repair in atherosclerosis Text. / M. Mahmoudi, J. Mercer, M. Bennett // Cardiovasc. Res. 2006 - V.71. - P.259-68.
96. Maier, W. Inflammatory markers at the site of ruptured plaque in acute myocardial infarction: locally increased interleukin-6 and serum amyloid A but decreased C-reactive protein Text. / W. Maier, L.A. Altwegg, R. Corti, S.129
97. Gay, M. Hersberger, F.E. Maly, G. Sutsch, M. Roffi, M. Neidhart, F.R. Eberli, F.C. Tanner, S. Gobbi, A. von Eckardstein, T.F. Luscher // Circulation. 2005. -V.l 11. —P.1355-1361.
98. Marian, A. Biomarkers of cardiac disease/Text. / A. Marian, V. Nambi'// Expert Rev. Mol. Diagn. — 2004. — V.4. P; 1-11.
99. Mathur, R.K. Reciprocal GD40 signals through p38MAPK and ERK-1/2 induce counteracting .immune responses Text. // R.K. Mathur, A. Awasthi, P. Wadhone, B. Ramanamurthy, B. Saha // Nat. Med. 2004. V. 10. -P.540-544.
100. Matsunaga, K. Theoretical? trend- of ion-v exchange, ability with divalent cations in hydroxyapatite Text. / K. Matsunaga, H. Iriamori, H. Murata // Phys Rev B. 2008. - V.78 -094101
101. McCord, J.M. Oxygen-derived free radicals in post -ischaemic tissue injury Text.:/ JiM^ McCord// N. Eng: Ji Med: 1985. - V.312. - Prl;59-163:
102. Melov, S.A. novel neurological phenotype in mice lacking mitochondrial manganese superoxide dismutase Text. / S.A. Melov, J.A.
103. Schneider, BJ. Day, D. Hinerfeld, P. Coskun, S.S. Mirra // Nat. Genet. 1998. V.18. - P.159-163.
104. Metzler, B. Activation of heat shock transcription factor 1 in atherosclerosis Text. / B. Metzler, R. Abia, M. Ahmad // J. Pathol. 2003. -V.162. — P.1669-1676.
105. Miura, H. Role for hydrogen peroxide in flow-induced dilation of human coronary arterioles Text. / H. Miura, JJ. Bosnjak, G. Ning, T. Saito, M. Miura, D.D. Gutterman // Circ. Res. 2003. - V.92. - P.e3 l-e40.
106. Mody, N. Oxidative stress modulates osteoblastic differentiation of vascular and bone cells Text. / N. Mody, F. Parhami, T. A. Sarafian, L. L. Demer // Free Radie Biol Med. 2001. - V.31. -P.509-519.
107. Morre, S.A. Microorganisms in the aetiology of atherosclerosis Text. / S.A. Morre, W. Stooker, W.K. Lagrand, A.J.C. van den Brule, H.W.M. Niessen // J. Clin. Pathol. 2000. - V.53. - P.647-654.
108. Muhlestein, J. Infection with Chlamydia pneumoniae accelerates the development of atherosclerosis and treatment with azithromycin prevents it in a rabbit model Text. / J. Muhlestein, J.L. Anderson, E.H. Hammond // Circulation -1998. V.97. — P.633-636.
109. Mullick, A.E. Modulation of atherosclerosis in mice by Toll-like receptor 2 Text. / A.E. Mullick, P.S. Tobias, L.K. Curtiss // J. Clin. Invest. -2005. V.115. - P.3149-3156.
110. Murray, C.J. Global mortality, disability, and the contribution of risk factors: Global Burden of Disease Study Text. / C.J. Murray, A.D. Lopez // Lancet. 1997. - V.349. - P. 1436-1442.
111. Madamanchi, N. R. Mytochondrial disfunction in atherosclerosis Text. / N. R. Madamanchi, M. S. Runge // Circulation. 2007. - V.1'00. - P.460-473.
112. Nagy, L. Oxidized LDL regulates macrophage gene expression through ligand activation of PPARgamma Text. / L. Nagy, P. Tontonoz, J.G. Alvarez, H. Chen, R.M-. Evans // Cell. 1998. - V.93. - P.229-240.
113. Nicholls, S.J. Myeloperoxidase and cardiovascular disease Text. / S.J. Nicholls, S.L. Hazen // Arterioscler. Thromb: Vase. Biol. 2005. - V.25. -P.l 102-1 111.
114. Nilsson, J. Immunomodulation of atherosclerosis: implications for vaccine development Text. / J. Nilsson, G.K. Hansson, P.K. Shah // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2005. V.25. - P. 18-28
115. Nilsson, J. Autoimmunity in atherosclerosis: a protective response losing control? Text. / J. Nilsson, G. K. Hansson // J. Int. Med. 2008. - V.263. -P.464^478
116. Ohara, Y. Hypercholesterolemia increases endothelial superoxide anion production Text. / Y. Ohara, T.E. Peterson, D.G. Harrison // J. Glin. Invest. -1993. V.91. - P.2546-2551.
117. Ohashi, M:. MnSOD deficiency increases endothelial dysfunction in ApoE-deficient mice Text. / M. Ohashi, M.S. Rurige, P.M. Faraci, D.D. 1 leistad // Arterioscler. Thromb. Vase; Biol. 2006; - V.26. - P.2331-2336.
118. Okrainec, K. Coronary artery disease in the developing world Text. / K. Okrainec, D;K. Baneijee, M.J.: Eisenberg // Am: Heart J; 2004. - V.148. -P.7-15.
119. Oury, T. D. Extracellular superoxide dismutase: A regulator-of nitric oxide bioavailability Text. / T.D. Oury, B.J. Day, J.D. Crapo. // Lab Invest. -1996. V.75. -P.617-636.
120. Padilla, G. Periodontal; pathogens in atheromatous plaques isolated from patients with chronic periodontitis Text. / C. Padilla, O. Lobos, E. Hubert, C. Gonzales, S: Matus, Mi Pereira // J; Periodont; Res. 2006. - V.41. - P.350-353;
121. Palinski, W. Immune responses to oxidative neoepitopes on LDL and phospholipids modulate, the development of atherosclerosis Text. / W. Palinski, J.L. Witztum // J. Intern. Med. 2000; - V.247. - P.371-380.
122. Parissis, J.T. Serum profiles of C-C chemokines in acute myocardialinfarction: possible implication in postinfarction left ventricular remodeling Text.133
123. J.T. Parissis, S. Adamopoulos, K.F. Venetsanou, D.G. Mentzikof, S.M. Karas, D.T. Kremastinos // J. Interferon Cytokine Res. 2002. - V.22. - P.223-229.
124. Patrono, C. Isoprostanes. Potential markers of oxidant stress in atherothrombotic disease Text. / C. Patrono, G. Fitzgerald // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997. - V. 17. - P.2309-15.
125. Pearlstein, D.P. Schumacker PT. Role of mitochondrial oxidant generation in endothelial cell responses to hypoxia Text. / D.P. Pearlstein, M.H. Ali, P.T. Mungai, K.L. Hynes, B.L. Gewertz // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -2002. -V.22. -P.566-573.
126. Peiser, L. Scavenger receptors in innate immunity Text. / L. Peiser, S. Mukhopadhyay, S. Gordon // Curr. Opin. Immunol. 2002. - V.14. - P. 123128.
127. Peltomaa, M. ■ Proton-induced x-ray emission analysis of atherosclerotic plaques of the carotid bifurcation Text. / M. Peltomaa, K. Mattila, J. Wolf, M Hyvonen-Dabek // Biol. Trace. Elem. Res. 1991. - V.34. - P.249-255.
128. Perschinka, H. Cross-reactive B-cell epitopes of microbial and human heat shock protein 60/65 in atherosclerosis Text. / H. Perschinka, M. Mayr, G. Millonig // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003. - V. 23. - P. 10601065.
129. Perry, J.J.P. The structural biochemistry of the superoxide dismutases Text. / J. J. P. Perry, D.S. Shin, E.D. Getzoff, J.A. Tainer // Biochim. Biophys. Acta. 2010. - V. 1804 -P.245-262.
130. Peters, W. Involvement of chemokine receptor 2 and its ligand,monocyte chemoattractant protein-1, in the development of atherosclerosis: lessons134from knockout mice Text. / W. Peters, I.F. Charo // Curr. Opin. Lipidol. 2001. -V. 12.-P. 175-180.
131. Pentaku, A. Role of superoxide dismutase in modification of radiation injury Text. / A. Pentaku // Br. J. Cancer. 1987. - V.55. - P.87-95.
132. Pignatelli, P. gp91phox-dependent expression of platelet CD40 ligand Text. / P. Pignaletti, V. Sanguigni, L. Lenti, D. Ferro, A. Finocchi, P. Rossi, F. Violi // Circulation. 2004. - V.l 10. - P. 1326-1329.
133. Pignatelli, P. Vitamin C inhibits platelet expression of CD40 ligand Text. / P. Pignatelli, V. Sanguignib, S. Giordano, P.E. Lo Cocoa, L. Lentia, F. Violia // Free. Radic. Biol. Med. 2005. - V.38. - V. 1662-1666.
134. Phipps, R.P. Atherosclerosis: The emerging role of inflammation and the CD40-CD40 ligand system Text. / R.P. Phipps // PNAS. 2000. - V.97 -P.6930-6932.
135. Prakken, B. Heat shock protein 60 and adjuvant arthritis: a model for Tregulation in human arthritis Text. / B. Prakken, A. Roord, A. Ronaghy // Sprinter Semin. Immunopathol. 2003. - V.25. - P.47-63.
136. Pflster, G. Detection of HSP60 on the membrane surface of stressed human endothelial cells by atomic force and cofocal microscopy Text. / G. Pfister, C.M. Stroh, H. Perchinka // J. Cell Sei. 2005. - V.l 18. - P. 1587-1594
137. Quintero, M. Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium Text. / M. Quintero, S.L. Colombo, A. Godfrey, S. Moncada // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2006. - V. 103. - P.5379-5384.
138. Ramachandran, A. Mitochondria, nitric oxide, and cardiovascular dysfunction Text. / A. Ramachandran, A.L. Levonen, P.S. Brookes, E. Ceaser, S. Shiva, M.C. Barone, V. Darley-Usmar // Free Radic Biol Med 2002. - V.33. -P. 1465-1474.
139. Rattazzi, M. C-reactive protein and interleukin-6 in vascular disease: culprits or passive bystanders? Text. / M. Rattazzi, M. Puato, E. Faggin, B. Bertipaglia, A. Zambon, P. Pauletto // J. Hypertens. 2003. - V.21. - P. 17871803.
140. Ren, M. Zinc supplementation decreases the development of atherosclerosis in rabbits Text. / M. Ren, R. Rajendran, P. Ning, B. Tan Kwong Huat. O. Choon Nam, F. Watt, A. Jenner, B. Halliwell // Free Radic. Biol. Med. -2006. — V.41. -P.222—225
141. Ritchie, M.E. Nuclear factor-kB is selectively and markedly activated in humans with unstable angina pectoris Text.' / M.E. Ritchie // Circulation. — 1998. — V.98. — P. 1707—13.
142. Rollins, B.J. Recombinant human MCP-l/JE induces Chemotaxis, calcium flux, and the respiratory burst in human monocytes Text. / B.J. Rollins, A. Walz, M: Baggiolini // Blood. 1991. - V.78. - P. 1112-1116.
143. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s Text. / R. Ross //Nature. 1993. - V.362. - P.801-809.
144. Ross, R. Atherosclerosis an inflammatory decease Text. / R. Ross // The New Eng. J. of Med. - 1999. - V.340. - P. 115-126.
145. Rubbo, H. Peroxynitrite-mediated lipid oxidation and nitration: mechanisms and consequences Text. / H. Rubbo, A. Trostchansky, V.B. O'Donnell // Arch. Biochem. Biophys. 2009. - V.484. - P. 167-72.
146. Rus, H.G. Interleukin-6 and interleukin-8 protein and gene expression in human arterial atherosclerotic wall Text. / H.G. Rus, R. Vlaicu, F. Niculescu // Atherosclerosis. 1996. - V.127 - P.263-271.
147. Sahoo, D. The Role of Scavenger Receptors in Signaling, Inflammation, and Atherosclerosis Text. / D. Sahoo, V.A. Drover // ed. S.K. Cheema; Biochemistry of Atherosclerosis Springer: N.Y. - 2006. - P.70-91.
148. Schonbeck, U. CD40 signaling and plaque instability Text. / U. Schonbeck, P. Libby// Circ. Res. -2001. -V.89. -P.1092-1103.
149. Schwartz, C.J. A modern view of atherogenesis Text. / C.J. Schwartz, A J. Valente, E.A. Sprague // The Amer. J. of Cardiol. 1993. - V.71 -P.B9-B14.
150. Segal, A.W. Cytochrome b-245 of neutrophils is also present in human monocytes, macrophages and eosinophils Text. / A.W. Segal, R. Garcia, A.H. Goldstone, A.R. Cross, O.T.G. Jones // Biochem. J. 1981. - V.196. -P.363-367.
151. Shaw, P.X. Natural antibodies with the T15 idiotype may act in atherosclerosis, apoptotic clearance, and protective immunity Text. / P.X. Shaw, S. Horkko, M.K. Chang // J. Clin. Invest. 2000. - V. 105. - P. 1731-1740.
152. Sherer, Y. Mechanisms of disease: atherosclerosis in autoimmune diseases Text. / Y. Sherer, Y. Shoenfeld // Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2006. -V.2.-P. 99-106
153. Shimizu, S. Bradykinin induces generation of reactive oxygen species in bovine aortic endothelial cells Text. / S. Shimizu, M. Ishii, T. Yamamoto, T. Kawanishi, K. Momose, Y. Kuroiwa // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. -1994. V.84. -P.301—314.
154. Spagnoli, L.G. Role of inflammation in atherosclerosis Text. / L.G. Spagnoli, E. Bonanno, G. Sangiorgi, A. Mauriello // J. Nucl. Med. 2007. - V.48. -P.1800-1815.
155. Speer, M; Y. Regulation of cardiovascular calcification Text. / MiY. Speer, C.M. Giachelli // Cardiovascular Pathology — 2004. V.13. - P.63- 70.
156. Stamler, J. Diabetes, other risk factors, and 12-yr cardiovascular mortality for men screened in the Multiple Risk Factor Intervention Trial Text. / J. Stamler, O. Vaccaro, J.D. Neaton, D. Wentworth // Diabetes Care. 1993. - V. 16 - P.434-444.
157. Steinberg, D Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance Text. / D. Steinberg // J. Biol. Chem. 1997. -V.272 - P.20963-20966.
158. Stemme, S. T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein Text. / S. Stemme, B. Faber, J. Holm, O. Wiklund, J.L. Witztum, G.K. Hansson // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1995. -V.92. -P.3893-3897.
159. Stocker, R. Role of oxidative modifications in atherosclerosis Text. / R. Stocker, J.F. Keaney Jr. // Physiol. Rev. 2004. - V.84. - P. 1381-1478.
160. Stokes, K.Y. Hypercholesterolemia promotes inflammation and microvascular dysfunction: role of nitric oxide and superoxide Text. / K.Y. Stokes, D. Cooper, A. Tailor, D.N. Granger // Free. Radie. Biol. Med. 2002. -V.33. -P.1026-1036.
161. Swain, J.A. Prooxidant iron and* copper, with ferroxidase and xanthine oxidase activities in human atherosclerotic material Text. / J.A. Swain, J.M.C. Gutteridge // FEB S Lett. 1995. - V.368. -P.513-515.
162. Tedgui, A. Cytokines in atherosclerosis: pathogenic and regulatory pathways Text. A. Tedgui, Z. Mallat // Physiol. Rev. 2006. - V.86. - P.515-581.
163. Tomazic, B.B. Physicochemical principles of cardiovascular calcification Text. /B.B. Tomazic // Z. Kardiol. 2001. - V.90. - P.68-80.
164. Tournilhac, O. Mast cells in Waldenstrom's macroglobulinemia support lymphoplasmacytic cell growth through CD154/CD40 signaling Text. / O. Tournihac, D.D. Santos, L. Xu, J. Kutok, Y.-T. Tai, S. Le Gouill, L. Catley, Z.139
165. Hunter, A.R. Branagan, J.A. Boyce , N. Munshi, K.C. Anderson, S.P. Treon // Ann. Oncol. 2006. - V.17. - P. 1275-1282.
166. Trillo, A.A. The cell population of aortic fatty streaks in african green monkeys with special reference to granulocytic cells an ultrastructural study Text. / A.A. Trillo // Atherosclerosis 1982. - V.43. - P.259-275.
167. Tsan, M.F. Endogenous ligands of Toll-like receptors Text. / M.F. Tsan, B. Gao // J. Leukoc. Biol. 2004. - V.76. - P.514-519.
168. Tuomainen, T-P. Association between body iron stores and the risk of acute myocardial infarction in 4.men Text. / T-P. Tuomainen, K. Punnonen, K. Nyyssönen, J.T. Salonen// Circulation. 1998. - V.97. -P.1461-1466.
169. Uhlar, C.M. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant Text. / C.M. Uhlar, A.S. Whitehead // Eur. J. Biochem. 1999. - V.265. - P.501—523.
170. Urbich, C. CD40 ligand inhibits endothelial cell migration by increasing production of endothelial reactive oxygen species Text. / C. Urbich, E. Dernbach, A. Aicher, A.Ml Zeiher, S. Dimmeler // Circulation. 2002. - V.106. -P.981-986.
171. Uriu- Adams, J.Y. Copper, oxidative stress, and human health Text. / J.Y. Uriu-Adams, C.L. Keena // Mol. Asp. Med. 2005. - V.26. - P.4-5.
172. Ursini, F. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx): more than an antioxidant enzyme? Text. / F. Ursini, M. Maiorino, A. Roveri // Biomed. Environ. Sei. 1997. - V.10 - P.327-332.
173. Vanichakarn, P. Neutrophil CD40 enhances platelet mediated inflammation Text. / P. Vanichakarn, P. Blair, C. Wu, J.E. Freedman, S. Chakrabarti // Thromb. Res. 2008. - V.122. - P.346-358.
174. Vanhoutte, P.M. Ageing and endothelial dysfunction Text. / P.M. Vanhoutte // Eur. Heart. J. Suppl. 2002. - V.49. - P.A8-A17.
175. Van Eden, W. Heat shock proteins indüce T-cell regulation of chronic inflammation Text. / W. van Eden, R. van der Zee, B. Prakken // Nat. Rev. 2005. - V.5. - P.318-330.
176. Van Eden, W. Immunoregulation of autoimmune diseases Text. / W. van Eden// Hum. Immunol. 2006. - V.67. - P.446^153.
177. Van der Loo, B. Enhanced pcroxynitrite formation is associated with vascular aging Text. / B. van der 1 -oo, R. Labugger, J.N. Skepper, Mi Bachschmid, J. Kilo, J.M. Powell // J. Exp. Med. 2000. - V.192 - P. 1731-1744.
178. Van Kooten, C. Immune regulation by CD40 -CD40-1 interactions -2; Y2K update Text. / C. van Kooten // Front. Biosci. 2000. - V.5. - P.D880-D893.
179. Verma* S. Is C-reactive protein an innocent bystander or proatherogenic culprit? C-reactive protein promotes atherothrombosis Text. / S. Verma, S. Devaraj, I. Jialal // Circulation. 2006. - V.l 13. - P.2135-2150.
180. Viorritto, I.C. Autoimmunity versus tolerance: can dying cells tip the balance? Text. / I.C. Viorritto, N.P. Nikolov, R.M. Siegel // Clin. Immunol. -2007. V.122. - P;125-134.
181. Von Herrath, M.G. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity Text. / M.G. Von Herrath, E.C. Harrison // Nat; Rev. Immunol: 2003. Y.3. P.223 232.
182. Walton, K.A. Specific phospholipid oxidation products inhibit ligand activation of toll-like receptors 4 and 2 Text. / K.A. Walton, A.L. Cole, M. Yeh, G. Subbanagounder, S.R. Krutzik, R.L. Modlin, R.M. Lucas, J. Nakai, E.J. Smart,
183. D.K. Vora, J.A. Berliner // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003. - V.23. -P. 1197-1203.
184. Watson, K.E. TGF-bl and 25-hydroxycholesterol stimulate osteoblast-like vascular cells to calcify Text. / K.E. Watson, K. Bostrom, R. Ravindranath, T. Lam, L.L. Demer // J. Clin. Invest. 1994. - V.93. - P.2106-2113.
185. Watt, F. A nuclear microscopy study of trace elements Ca, Fe, Zn and Cu in atherosclerosis Text. / F. Watt, R. Rajendran, M. Q. Ren, B. K. H. Tan, B. Halliwell // Nucl. Instr. And Meth. In Phys. Res. 2006. - V.249. - P.646-652.
186. Waypa, G.B. Mitochondrial reactive oxygen species trigger calcium increases during hypoxia in pulmonary arterial myocytes Text. / G.B. Waypa, J.P. Marks, M.M. Mack, C. Boriboun, P.T. Mungai, P.T. Schumacker // Circ. Res. -2002. V.91. - P.719-726.
187. Weiss, S. Failure to detect Chlamydia pneumoniae in coronary atheromas of patients undergoing atherectomy Text. / S.M. Weiss, P.M. Roblin, C.A. Gaydos // J. Infect. Dis. 1996. - V. 173. -P.957-962.
188. Wick, G. Autoimmune and inflammatory mechanisms in atherosclerosis Text. / G. Wick, M. Knoflach, Q. Xu // Annu. Rev. Immunol. -2004.-V.22.-P.361-403.
189. Widlansky, M. The clinical implications of endothelial dysfunction Text. / M. Widlansky, N. Gokce, J. Keaney, J. Vita // J. Am. Coll. Cardiol. -V.42.-2003.-P. 1149-1160.t>
190. Wilcox, J.N. Local expression of inflammatory cytokines in human atherosclerotic plaques Text. / J.N. Wilcox, N.A. Nelken, S.R. Coughlin, D. Gordon, T.J. Schall // J. Arterioscler. Thromb. 1994. - V.l -P.S3-S10.
191. Witztum, J.L. Role of oxidized: low density . lipoprotein in atherogenesis V / J.L. Witztum, D: Steinberg // J. Clin. Investig. 1991. - V.88. -P. 1785-1792.
192. Whitman, S.G. Interleukin-18: enhances , atherosclerosis in Apolipoprotein E-/- mice through release of Interferon-y Text. / S.G. Whitman, P. Ravisankar, A. Daugherty // Girc. Res. 2002. - V.90. - P.e34-c38.
193. Yan, Z.Q. Innate immunity, macrophage activation, and, atherosclerosis Text. / Z.Q. Yan, G.K. Hansson // Immunol. Rev. — 2007. -V.219.-P. 187-203.
194. Yang, Y. CD40 ligand-dependent T cell activation: requirement of B7-CD28 signaling through CD40 Text. / Y. Yang, J.M. Wilson // Science -1996. V.273. - P. 1862-1864.
195. Yang, Hi Retardation of atherosclerosis by overexpression of catalase or both Cu/Zn-superoxide dismutase and catalase in mice lacking apolipoprotein E
196. Text. / H. Yang, L.J. Roberts, MJ. Shi, L.C. Zhou, B.R. Ballard, A. Richardson, Z.M. Guo // Circ. Res. -2004. -V.95. -P.l075-1081.
197. Yucel, D. Oxidative / nitrosative stress in chronic heart failure: a critical review Text. / D. Yucel, M. Senes, B.C. Topkaya, Z. Oguzhan // Turkish J. ofBioch. — 2006. V.31. — P.86-95.
198. Zago, M.P. The antioxidant properties of zink: interactions with iron and antioxidants Text. / M.P. Zago, P.I. Oteiza // Free Radic. Biol. Med. 2001. -V.31.-P. 266-274.
199. Zhang, D.X. Mitochondrial reactive oxygen species-mediated signaling in endothelial cells Text. / D.X. Zhang, D.D. Gutterman // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2006. - V.292. - P.H2023-H2031.
200. Zhou, X. Lesion development and response to immunization reveal a complex role for CD4 in atherosclerosis Text. / D.X. Zhang, A.K. Robertson, M. Rudling, P. Parini, G.K. Hansson // Circ. Res. 2005. - V.96. - P.427-34.
201. Зенков, Н.К. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты Текст. / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меныцикова // М. 2001. - 343с.
202. Ланкин В.З. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы Текст. / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Н. Беленков // Кардиология. 2000. - №7. - С.48-62.
203. Ланкин, В.З. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: Pro et contra Текст. / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Н. Беленков // Кардиология 2004. - №2. - С72-81.
204. Кобзарь А.И. Прикладная математическая статистика. Для инженеров и научных работников. Текст. / А.И. Козбань // М.: Физматлит. — 2006.-816с.
- Ложкин, Андрей Петрович
- кандидата биологических наук
- Казань, 2011
- ВАК 03.01.04
- Морфофункциональные изменения щитовидной железы и регионарных лимфатических узлов при различных моделях атерогенеза
- Механизмы атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности карбонильными соединениями
- Оксидативный стресс и система оксида азота при постнатальной адаптации и развития заболеваний у сельскохозяйственных животных
- Активность антиоксидантных ферментов в норме и при окислительном стрессе на примере метаболического синдрома
- Характеристика антиоксидантной системы и содержание стресс-гормонов крови крупного рогатого скота в связи с возрастом и физиологическим состоянием