Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C"

На правах рукописи 004609696

Французов Павел Александрович

АТОМНО-СИЛОВЫЕ ЧИПЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРОВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ ВИС

03.01.04. Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

3 0 СЕН ?ото

Москва-2010

004609696

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Иванов Юрий Дмитриевич

доктор биологических наук Шумянцева Виктория Васильевна

кандидат химических наук Рубцова Майя Юрьевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский

Государственный Медицинский Университет Росздрава

Защита состоится «21» октября 2010г. в 1230 часов на заседании Диссертационного совета Д.001.010.01 при ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10.

Автореферат разослан «2.0 »С£луТ9бр2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Карпова Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Создание диагностических систем нового поколения является одним из приоритетных направлений современных медицинских исследований. Настоящая диссертационная работа посвящена созданию высокочувствительного молекулярного детектора на базе АСМ для выявления маркеров вирусных частиц гепатитов В и С в сыворотке крови.

Актуальность диагностики вирусных гепатитов В и С обусловлена широкой распространенностью этих заболеваний и их ростом в последние годы. Высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени, частое поражение лиц молодого возраста также обуславливают повышенное внимание к вирусным гепатитам, важность подбора рациональных методов диагностики, лечения и профилактики.

В настоящее время основными методами детекции серологических маркеров заболеваний вирусными гепатитами являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы зарекомендовали себя как высокоспецифичные и чувствительные. Однако, диагностика инфекционных заболеваний на ранних стадиях (на которых не проявляются клинические симптомы заболевания) с помощью тест-систем на основе этих методов является недостаточно эффективной. В частности, чувствительность метода ПЦР очень высока - порядка нескольких копий нуклеиновой кислоты. Но существует следующее ограничение - при помощи ПЦР возможно детектировать только нуклеиновые кислоты, но не белки, в то время как многие маркеры инфекционных заболеваний имеют белковую природу. Также на результаты ПЦР существенное влияние оказывает высокая вероятность контаминации образцов, что часто приводит к ложноположительным результатам. Существенным недостатком методов белковой диагностики (к которым относится ИФА), является предел чувствительности: концентрационный барьер для обнаружения и идентификации белковых молекул в биологическом материале, существующий в протеомике, ограничен 10"12 М (Archakov A.I. et al., 2007). Такое ограничение традиционных методик медицинской белковой диагностики приводит к тому, что в настоящее время в диагностике используется лишь 10-20% потенциально значимых диагностических белковых маркеров, что в свою очередь сдерживает создание ранних диагностикумов, основанных на использовании маркерных белков.

Дальнейшее успешное развитие медицинской диагностики и диагностики вирусных гепатитов в частности требует разработки и внедрения методик, обладающих возможностями выявления и идентификации белков и их комплексов в многокомпонентном биологическом материале в диапазоне концентраций ниже 10"'2 М. Подходы, позволяющие решать эти задачи, основаны на использовании методов регистрации и идентификации единичных молекул с помощью молекулярных детекторов (Archakov A.I. et al., 2007). Используемый в настоящей работе метод АСМ предоставляет принципиальную возможность регистрировать и визуализировать отдельные белковые молекулы с субнанометровым

разрешением, а это - прямой путь к обнаружению биомаркеров на ранних стадиях заболеваний.

Молекулярный детектор на базе АСМ основан на мониторинге силы взаимодействия зонда микроскопа с молекулами, иммобилизованными на атомарно-гладкой поверхности подложки ACM (Ivanov Yu.D. et al., 2003). При сканировании зондом вдоль такой поверхности измеряется высота молекул и их комплексов. Высота АСМ-изображений белкового комплекса, как правило, превышает высоту составляющих его изолированных молекул белков (Kuznetsov V.Yu. et al., 2004; Kuznetsov V.Yu. et al., 2002), что позволяет их различать.

Для создания диагностического устройства на базе АСМ необходима комбинация метода АСМ-регистрации в режиме счета отдельных молекул с методами биоспецифического фишинга (вылавливание биомолекул из раствора за счет их специфического связывания с молекулами-зондами, иммобилизованными на подложке АСМ). В настоящей работе комбинация АСМ/биоспецифический фишинг была использована для вьмвления серологических белковых маркеров вирусных гепатитов В и С - поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и кор-антигена вируса гепатита С (HCVcoreAg).

Схема детекции серологических маркеров гепатитов В и С с помощью метода АСМ включает два этапа: на первом этапе проводится биоспецифический фишинг, для чего биологический микрочип (АСМ-чип), представляющий собой атомарно ровную подложку с монослоем иммобилизованных макромолекул-зондов, инкубируется в биологическом растворе, содержащем маркеры гепатитов В и С; на втором этапе проводится подсчет образовавшихся иммунокомплексов на поверхности АСМ-чипа с помощью АСМ.

Цель работы - разработка методики выявления в сыворотке крови людей маркеров заболеваний вирусными гепатитами В и С: HBsAg и HCVcoreAg на основе АСМ-чипов. Задачи работы:

1. Подбор условий иммобилизации МКА против HBsAg и HCVcoreAg на подложку АСМ;

2. АСМ-визуализация иммобилизованных антител, определение их высоты и плотности иммобилизации на поверхности АСМ-чипа;

3. Разработка методики биоспецифического АСМ-фишинга для детекции HBsAg и HCVcoreAg с помощью АСМ-чипов;

4. АСМ-визуализация, определение высоты и количества иммунокомплексов анти-HBsAg/HBsAg и анти-HCVcoreAg/HCVcoreAg на поверхности АСМ-чипа;

5. Адаптация методики АСМ/биоспецифического фишинга для определения биологических маркеров вирусов гепатитов В и С в сыворотках крови больных людей с помощью метода АСМ;

6. Анализ сывороток, положительных и отрицательных (по данным ИФА и ПЦР) по содержанию биомаркеров вирусных гепатитов, с помощью разработанной методики на основе АСМ-чипов.

Научная новизна работы. Впервые разработана и реализована методика ковалентной иммобилизации МКА на подложку АСМ. Показано, что в результате иммобилизации образуется монослой антител, сохраняющих биологическую активность. Показано, что комбинация методов АСМ-регистрации и биоспецифического фишинга может применяться для выявления биологических маркеров вирусных гепатитов В и С в растворах и сыворотках крови людей. Получены изображения HBsAg, HCVcoreAg, антител против этих антигенов и иммунокомплексов. Впервые осуществлена АСМ-детекция серологических маркеров вирусов гепатитов В и С - HBsAg и HCVcoreAg - в сыворотках крови людей с помощью разработанных АСМ-чипов.

Научно-практическая ценность работы.

Показана возможность выявления серологических маркеров вирусов гепатитов В и С в сыворотках крови людей с помощью разработанных АСМ-чипов. Разработанная методика биоспецифического фишинга в комбинации с прямым подсчетом белковых комплексов с помощью молекулярного детектора на базе АСМ может служить основой для создания высокочувствительных диагностических систем нового поколения. Данный подход может быть использован в протеомике и медицинской диагностике для выявления других белков в многокомпонентном растворе.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на VII Всероссийской конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем» (Ершово, Московская область, 2005 г.), Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006 г.), 4-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), Втором международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech 09 (Москва, 2009 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 9 публикаций в сборниках материалов научных конференций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания аппаратуры и методик исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 104 страницы машинописного текста, 6 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 105 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТ

Аппаратура и методики исследования.

Использованные реактивы. Для приготовления растворов использовали дистиллированную воду, дополнительно очищенную на деионизующей установке "Milli-Q" (Millipore, США). Для приготовления растворов использовали следующие реактивы: КН2РО4 (х.ч.), КОН (Х.Ч.), толуол (х.ч.), этанол 96% (Реахим, Россия), EDC и NHS (Sigma США), концентрат ФСБ-Т (Вектор-БЕСТ, Россия). Для модификации поверхности слюды использовали APTES (Sigma, США). Для изготовления подложек АСМ-чипов использовали пластины слюды (muscovite grade V-4, 25 * 75 мм) (SPI, США). Химическую модификацию слюды проводили в атмосфере APTES в течение 15 мин с последующей отмывкой в этаноле.

Исследуемые биологические объекты: очищенный HBsAg (Aldevron, США); мышиные МКА против HBsAg (клон NF5, аффинно очищенные до 96%, НИИ Иммунологии МЗ РФ); рекомбинантный HCVcoreAg (любезно предоставлен О.Н. Ястребовой, Вектор-Бест, Россия); мышиные МКА против HCVcoreAg (клон 1Е5, Virogen, США).

Исследуемые сыворотки крови людей были получены с Кафедры Инфекционных болезней у детей РГМУ, ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, МНИИЭМ им. Габричевского. Все сыворотки были предварительно протестированы на содержание маркеров вирусных гепатитов: HBsAg, антител против ВГС (методом ИФА), РНК ВГС (методом ПЦР).

Нековалентная иммобилизация белков на подложки АСМ. 2 мкл раствора соответствующего белка (HBsAg, HCVcoreAg, МКА против HBsAg, МКА против HCVcoreAg) с концентрацией 1 мкмоль/л в 50 мМ КФБ, рН=7,4 наносили на поверхность свежесколотой слюды, инкубировали 3 мин (25°С), далее подложку отмывали в потоке деионизованной воды в течение 10 с и высушивали в потоке воздуха.

Ковалентная иммобилизация МКА на модифицированную APTES поверхность слюды. Растворы EDC и NHS готовили и отфильтровывали непосредственно перед проведением эксперимента. 2 мкл раствора белка (с необходимой концентрацией в 50 мМ КФБ) смешивали с 4 мкл водного раствора EDC (0,4 моль/л) и 4 мкл водного раствора NHS (0,1 моль/л). Полученную смесь (2 мкл на одну точку) немедленно наносили на поверхность силанизированной слюды и инкубировали 2 мин при комнатной температуре. После инкубации слюду отмывали 2 раза по 20 мин на шейкере (37 °С, 600 об./мин) и высушивали в потоке воздуха.

Получение комплексов HCVcoreAg и HBsAg с антителами против них на поверхности АСМ-чипа. АСМ-чип с иммобилизованными МКА инкубировали в микропробирке, с раствором соответствующего антигена (V=l мл, Т=25 °С, C(HCVcoreAg)

=10"9 М, C(HBsAg) =10"8 М). Затем АСМ-чип отмывали в воде на шейкере (37°С, 600 об./мин 2 раза по 20 мин.) и высушивали в потоке воздуха.

Фишннг HBsAg н HCVcoreAg в сыворотках крови людей. Исследуемую сыворотку (Юмкл) разбавляли в 100 раз раствором ФСБ-Т. Далее АСМ-чип с иммобилизованными МКА инкубировали в микропробирке с разбавленной сывороткой (30 мин, шейкер 600 об/мин, 37 °С). После инкубации АСМ-чип отмывали в ФСБ-Т (2 раза по 30 мин, шейкер 600 об/мин, 37 °С) и в деионизованной воде (30 мин, шейкер 600 об/мин, 37 "С), высушивали в потоке воздуха. АСМ-измерения проводили на атомно-силовом микроскопе Solver Р47Н или зондовой нанолаборатории NTEGRA Prima (NT-MDT, Россия). Для АСМ-визуапизации исследуемых объектов использовались кремниевые микрозонды NSG 10 (NT-MDT, Россия).

Получение АСМ-изображешш. АСМ-измерения производили в воздушной среде в прерывисто-контактном режиме. Амплитуда свободных колебаний кантилевера в воздухе лежала в пределах 50-100 нм, автоматически поддерживаемая амплитуда колебаний кантилевера в подведенном к поверхности состоянии (параметр SetPoint) устанавливалась на уровне 60-70% от амплитуды свободных колебаний кантилевера в воздухе. Размеры сканов составляли 5x5 мкм, с разрешением 256x256 точек. Количество полученных сканов для каждого образца составляло не менее 10.

Обработка АСМ-изображепий. Обработка сигнала, перевод его в цифровой вид, и формирование изображений производилось с помощью ПО "Nova" (NT-MDT). Результаты измерений приведены в настоящей работе в виде двумерных изображений, на которых светлые участки поверхности соответствуют возвышениям рельефа, а тёмные - углублениям. Обработка полученных сканов и измерение высот визуализированных объектов производилось с помощью разработанного в ИБМХ РАМН ПО "GRF". Статистическая обработка полученных данных производилась с помощью ПО Microsoft Excel и включала в себя построение распределения полученных объектов по высотам и вычисление параметров описательной статистики. При построении распределений полученных объектов по высотам учитывалось не менее 1000 объектов для каждого типа частиц.

При анализе АСМ-изображений в качестве измеряемого параметра использовалась высота объектов. На основании результатов измерения высот бьши построены графики плотностей распределения объектов на поверхности АСМ-чипа по высотам. Распределение объектов, визуализированных АСМ по высотам p(h) было выражено как

p(h)=(Ni/N)*100% (1)

где Nh - количество объектов с высотой h, и N— общее количество объектов.

Выявление маркера вирусного непатита С.

Иммобилизация МКА против HCVcoreAg на подложку АСМ.

Процедура биоспецифического фишинга с помощью АСМ-чипов основана на вылавливании, концентрировании и регистрации комплексообразования между молекулами-зондами, иммобилизованными на подложке АСМ (в данном случае МКА против HCVcoreAg), и молекулами-мишенями в растворе (в данном случае HCVcoreAg). Поэтому, для эффективной процедуры биоспецифического фишинга поверхностная концентрация антител на подложке должна быть максимальной. С другой стороны, не менее важным представляется получение монослоя ковалентно иммобилизованных антител на подложке, так как при иммобилизации белка в несколько слоев возможно появление объектов с большими высотами (агрегатов), которые могут внести погрешность при последующей обработке данных. Кроме того, иммобилизация антител в несколько слоев приводит к экранированию антиген-связывающих участков (Fab-фрагментов) молекул антител, лежащих в нижних слоях. Для формирования монослоя антител с высокой плотностью на поверхности АСМ-чипа была проведена серия экспериментов, в которой варьировалась концентрация моноклональных антител в буферном иммобилизационном растворе.

В экспериментальной серии использовались следующие конечные (с учетом разбавления) концентрации антител: 1x10"6 М, 1x10"7 М, 5х10"8 М, 2x10"8 М, 5x10"® М. Из полученных данных АСМ-сканирования была вычислена поверхностная концентрация иммобилизованных антител для каждого случая (см. рис. 1). Как видно из рис. 1 максимальная поверхностная концентрация иммобилизованных антител (36 молекул/мкм2) достигается при использовании иммобилизационного раствора с концентрацией антител 2хЮ"8 М. В то же время при более высоких концентрациях антител в иммобилизационных растворах (5x10'8 М, 1 х 10"7 М и lxlO"6 М соответственно) регистрируется уменьшение поверхностной плотности иммобилизованных антител (27 молекул/мкм2, 10 молекул/мкм2, 9 молекул/мкм2). Этот факт можно объяснить образованием на подложке АСМ агрегатов антител, которые диссоциируют при отмывке, а также возможной иммобилизацией нескольких слоев белка.

На основании полученных результатов в дальнейших экспериментах, для формирования монослоя антител на поверхности АСМ-чипа была выбрана концентрация антител против HCVcoreAg в иммобилизационном растворе равная 2х10"8 М. АСМ-изображение МКА против HCVcoreAg, ковалентно иммобилизованных на поверхности силанизированной слюды представлено на рис. 2 (а). На рис. 2 (б) представлено распределение молекул антител по высотам. Высота максимума этого распределения составила 1,6 ± 0,2 нм. Эти данные хорошо согласуются с результатами исследований других авторов, например, в работе

(Thomson N.H., 2005) измеренная высота иммуноглобулинов класса G (IgG) составила от 1,5 до 2,5 нм.

Рис. 1 Зависимость поверхностной концентрации иммобилизованных антител против HCVcoreAg от концентрации их в иммобилизационном растворе.

а) б)

Рис. 2 а) АСМ - изображение МКА против HCVcoreAg, ковалентпо иммобилизованных на поверхности силанизированной слюды; б) обработка АСМ-данных: распределение молекул МКА по высотам.

Детекция HCVcoreAg в растворе

Для оценки высоты молекул детектируемого HCVcoreAg была проведена визуализация этого белка, нековалентно иммобилизованного на поверхности слюды. Обработка АСМ-данных показала, что величина максимума распределения мономеров НСУсогеА§ по высотам составляет 1,8±0,2 нм.

Получение комплексов HCVcoreAg/anti-HCVcore на поверхности АСМ-чипа проводилось методом фишинга по процедуре, описанной выше. Изображение поверхности АСМ-чипа в

зоне с иммобилизованными антителами против HCVcoreAg (рабочей зоне) после инкубации в растворе рекомбинантного HCVcoreAg (С=10"9 моль/л) и распределение объектов на поверхности по высотам представлено на рис. 3 (а, б).

Ш11 6

4

2

i о

3 П|П

Б 3

1 2

1 1

В 0

m

К

§ 15

А1

\ 2

/

2 4

Высот 11. км

б)

Высот», нм

в) г)

Рис. 3 а) АСМ-изображеиие поверхности слюды с иммобилизованными МКА против HCVcoreAg после инкубации в растворе HCVcoreAg (Iff9 М), б) обработка АСМ-данных: распределение молекул по высотам в зоне с иммобилизованными анти-HCVcoreAg (!) в сравнении с распределением анти-HCVcoreAg (2). (в, г) контрольный эксперимент: в) АСМ-изображение поверхности слюды с иммобилизованными МКА против HBsAg после инкубации в растворе HCVcoreAg (Iff9 М); г) обработка АСМ-данных: распределение частиц по высотам в зоне с иммобилизованными анти-HBsAg (I) в сравнении с распределением анти-HBsAg (2).

На рисунке видны образовавшиеся в ходе инкубации в растворе антигена дополнительные объекты с высотами 3-7 нм.

В качестве контрольного эксперимента была просканирована зона с иммобилизоваными антителами против HBsAg на том же АСМ-чипе (контрольная зона 1). АСМ-изображение и распределение объектов на поверхности по высотам представлено на рис. 3 (в, г). Как видно на рис. 3 (в), рельеф поверхности АСМ-чипа в контрольной зоне 1 после инкубации в растворе HCVcoreAg в целом повторяет рельеф поверхности до инкубации (см. рис. 2 (а)): присутствует большое количество близколежащих объектов с высотами, не превышающими 2 нм, при этом частиц большего размера практически не наблюдается. Визуальная оценка АСМ-сканов подтверждается полученным распределением объектов на поверхности АСМ-чипа по высотам (рис. 3 (г)), которое имеет один максимум (1.8 ± 0,2) нм, это значение совпадает в пределах погрешности со значением максимума распределения молекул антител против HCVcoreAg (1.6±0.2) нм. Таким образом, к иммунокомплексам анти-HCVcore/HCVcoreAg можно отнести появившиеся после инкубации в растворе HCVcoreAg в рабочей зоне АСМ-чипа объекты с высотами 3-7 нм.

АСМ-сканирование поверхности чипа в зоне, где не были иммобилизованы антитела (контрольная зона 2), показало, что количество частиц в этой зоне не превышало 1 на 1 мкм2, а их размеры не превышали 3 нм.

Таким образом, было показано, что иммобилизованные на АСМ-чипе МКА сохраняют свою активность и способны образовывать комплексы с антигеном из раствора.

Детекция HCVcoreAg в сыворотках крови людей

Перед тем, как приступить к выявлению маркеров вирусных гепатитов В и С в сыворотках крови, были выполнены контрольные эксперименты по визуализации поверхности АСМ-чипа после инкубации в сыворотке крови, не содержащей HBsAg и HCVcoreAg. Целью этих экспериментов было подобрать условия отмывки АСМ-чипов от неспецифически связавшихся компонентов сыворотки крови. Сыворотка крови человека содержит в своем составе большое количество компонентов (например, мажорные белки сыворотки -альбумины, глобулины, фибриноген, липопротеиды). Поэтому процедура инкубации АСМ-чипа в сыворотке крови включала разведение сыворотки с целью уменьшения концентрации компонентов, обладающих высокой адгезией к подложке.

В процессе контрольного эксперимента силанизированная слюда инкубировалась в сыворотке крови человека и далее отмывалась в воде. АСМ-сканирование показало, что после инкубации, на поверхности АСМ-подложки имеются объекты, высотой не превышающие 5 нм в небольшом количестве - 0,5-1,0 частиц на 1 мкм2. Принимая во внимание факт, что количество учитываемых объектов, используемое нами при построении

распределений частиц по высотам, составляло не менее 1 ООО и поверхностная концентрация молекул была не менее 30 на 1 мкм2, при обработке результатов мы можем пренебречь погрешностью подсчета объектов, вносимую неспецифически связавшимися с поверхностью АСМ-чипа компонентами сыворотки.

Анализ сывороток крови на содержание HCVcoreAg с помощью АСМ-чипов.

Для анализа были выбраны положительные и отрицательные по содержанию РНК ВГС сыворотки, согласно данным ПЦР. Наличие РНК ВГС в сыворотке крови больных предполагает активную репликацию вируса в клетках печени, а, следовательно, продукцию и выделение в кровь вирусных частиц и белков ВГС, в т.ч. НСУсогеА§. Всего была протестирована 41 сыворотка, из которых 32 положительные и 9 отрицательные по содержанию РНК ВГС (согласно данным ПЦР).

В качестве примера на рис. 4 (а) представлено изображение АСМ-чипа с иммобилизованными МКА после инкубации в контрольной сыворотке крови, не содержащей HCYcoreAg. Обработка АСМ-данных (рис. 4 (б)) показала, что относительное содержание объектов с размерами более 5 нм (линия отсечения) на поверхности АСМ-чипа составляет 1,67 % для данной сыворотки.

Высота, нм

а)

Рис. 4 а) Изображение поверхности АСМ-чипа (зона с иммобилизованными анти-НСУсогеАпосле его инкубации в сыворотке, не содержащей HCVcoreAg; б) обработка АСМ-данных: распределение объектов по высотам.(------) -линия отсечения.

Изображение АСМ-чипа с иммобилизованными МКА после инкубации в положительной сыворотке крови (содержащей HCVcoreAg) и результаты обработки АСМ-данных представлены на рис. 5 (а, б). На АСМ-скане (рис. 5 (а)) на поверхности АСМ-чипа регистрируются образовавшиеся в процессе инкубации в сыворотке дополнительные объекты с высотами 5 нм (линия отсечения) и более, соответствующие комплексам иммобилизованных МКА против HCVcoreAg с HCVcoreAg - содержащими частицами, находящимися в сыворотке крови больных. Относительное содержание этих объектов на

поверхности АСМ-чипа составляет 17,46% для данной сыворотки, что на порядок больше, чем в контрольном эксперименте, упомянутом выше.

Высота, нм

а) б)

Рис. 5 а) Изображение поверхности АСМ-чипа (зона с иммобилизованными анти-HCVcoreAg антителами) после его uHKyßaiiuu в сыворотке, содержащей HCVcoreAg; б)обработка АСМ-данных: распределение объектов по высотам. (--..--) — линия отсечения.

Следует отметить, что высоты образовавшихся комплексов МКА против HCVcoreAg с HCVcoreAg - содержащими частицами для различных сывороток колебались от 5 нм до 35 нм. В то же время, модельный эксперимент показал, что высоты комплексов анти-HCVcore/HCVcoreAg составляют 3-7 нм. Повышение максимальной высоты иммунных комплексов, полученных при инкубации АСМ-чипа в сыворотке по сравнению с высотой комплексов, полученных при инкубации в растворе, можно объяснить следующим образом: HCVcoreAg в крови больных зачастую может находиться в комплексе с белками и липопротеинами (Kanto Т. et а!., 1994), кроме того, в крови больных вирусным гепатитом С присутствуют нуклеокапсиды ВГС, окруженные HCVcoreAg (Prince A.M. et al., 1996); такие комплексы, содержащие в своем составе HCVcoreAg, очевидно, имеют размеры, превышающие размеры агрегатов рекомбияантного HCVcoreAg.

В связи с тем, что при визуализации иммобилизованных антител против HCVcoreAg большинство объектов (> 90%) лежат в пределах высот 1 -3 нм, а объекты с высотами более 5 нм полностью отсутствуют, порог высоты для отнесения каждого объекта к образовавшимся комплексам анти-HCVcoreAg/HCVcoreAg (линия отсечения) был выбран на уровне, равном 5

Результаты анализа сывороток на наличие HCVcoreAg показали, что для 9 сывороток, не

содержащих HCVcoreAg согласно данным ПЦР, относительное содержание объектов с

высотами >5 нм на АСМ-чипе составило 1,67-8,80%. В то же время, для сывороток,

11

содержащих HCVcoreAg согласно данным ПЦР, относительное содержание объектов с высотами >5 нм на АСМ-чипе составило 0,61-36,1%.

В настоящей работе для выбора порога отнесения сывороток к положительным или отрицательным по содержанию HCVcoreAg был использован метод ROC-анализа (Zweig М.Н. et а!., 1993). Полученная ROC-кривая представлена на рис. 6.

Рис. 6 ROC-кривая для теста сыворотки крови на содержание HCVcoreAg на основе АСМ. Se - чувствительность теста, Sp - специфичность теста.

о (1.1 0.1 од м üs, »л ел 0,9 j l-Sp

В табл. 1 приводится фрагмент массива точек «чувствительность-специфичность» в зависимости от уровня отсечения (порогового значения для отнесения исследуемой сыворотки к отрицательным или положительным по содержанию HCVcoreAg).

Из представленных в таблице 1 данных видно, что порогом отсечения, обеспечивающим максимальную суммарную чувствительность и специфичность теста (т.е. минимальное количество ошибок I и II рода), является значение 5%. По-видимому, это значение можно принять оптимальным и использовать его в качестве критерия отнесения сыворотки к положительным по содержанию HCVcoreAg.

Исходя из принятого нами критерия отнесения сыворотки к положительным по содержанию HCVcoreAg, можно сделать вывод, что совпадение данных АСМ-тестирования с данными ПЦР и ИФА составляет 77,8% (7 из 9 сывороток) для отрицательных сывороток и 75,0% (24 из 32 сывороток) для положительных сывороток (см. Табл. 2).

Наличие двух ложноположительных (по сравнению с методом ПЦР, используемым в данной работе в качестве стандартного) результатов детекции HCVcoreAg в сыворотке крови с помощью методики на основе АСМ-чипов можно объяснить высокой аналитической чувствительностью метода АСМ, регистрирующего белковые комплексы в режиме их счета (Archakov A.I, et al., 2009). Наличие 8 ложноотрицательных результатов может быть объяснено следующим образом. Только 132 аминокислотных остатка из 191 (69,1 %) в последовательности кор-белка ВГС являются инвариантными у всех генотипов ВГС (Bukh J., et al., 1994), причем на участке 1-80 а.о. (участок, распознаваемый использованными в работе

моноклональными антителами 1Е5) находится 13 вариабельных позиций. Возможные аминокислотные замены в вариабельных участках последовательности HCVcoreAg могут приводить к снижению специфичности связывания используемых в настоящей работе моноклональных антител с HCVcoreAg и, как следствие, появлению ложноотрицательных результатов.

Таблица 1. Чувствительность (Бе) и специфичность (3р) АСМ-методики анализа сыворотки крови на содержание HCVcoreAg.

Таблица 2. Сравнение данных по детекции HCVcoreAg в сыворотках крови, полученных с помощью метода АСМ и метода ПЦР.

Порог отсечения (содержание частиц высотой >5 им, %) Se Sp Se+Sp

0 1 0 1

1 0,97 0 0,97

2 0,88 0,11 0,99

3 0,81 0,33 1,14

4 0,75 0,44 1,19

5 0,75 0,78 1,53

6 0,66 0,78 1,44

7 0,5 0,78 1,28

8 0,44 0,89 1,33

9 0,41 1 1,41

10 0,34 1 1,34

ПЦР

АСМ + -

+ 24 2

- 8 7

Выявление маркепа вирусного гепатита В.

Иммобилизация МКА против HBsAg на подложку АСМ.

Иммобилизация МКА против HBsAg на аминомодифицированную поверхность проводилась по методике, описанной выше. Использовавшиеся в данной работе антитела против HBsAg принадлежат к тому же субклассу, что и использовавшиеся антитела против HCVcoreAg (мышиные IgG 2а), структурное различие между ними существует только в небольшом антиген-связывающем участке. Исходя из этого, концентрация антител против HBsAg для ковалентной иммобилизации на поверхность АСМ-чипа была выбрана равной оптимальной концентрации антител против HCVcoreAg в иммобилизационном растворе, определенной ранее (2x10'8 М).

Анализ АСМ-изображения МКА против HBsAg, ковалентно иммобилизованных на

поверхности АСМ-чипа (рис. 7 (а)), показывает присутствие на поверхности объектов,

лежащих близко друг к другу и имеющих сходную высоту. Результаты обработки АСМ-

13

данных показали, что высота максимума распределения антител по высотам составила 1,6 ± 0,2 нм (рис. 7 (б)).

Рис. 7 а) АСМ - изображение МКА против HBsAg, ковалеитно иммобилизованных на поверхности силанизированной слюды; б) обработка АСМ-данных: распределение молекул МКА по высотам.

Детекция HBsAg в растворе

Для оценки высоты молекул детектируемого HBsAg была проведена визуализация этого белка, нековалентно иммобилизованного на поверхности слюды. Результаты обработки АСМ-данных показали, что величина максимума распределения мономеров HBsAg по высотам составляет 2,4±0,2 нм.

Получение комплексов HBsAg/anti-HBsAg на поверхности АСМ-чипа проводилось методом фишинга по процедуре, описанной выше. На рис. 8 (а) представлено полученное изображение поверхности АСМ-чипа с иммобилизованными анти-HBsAg после процедуры фишинга. В зоне с иммобилизованными антителами после инкубации АСМ-чипа в растворе HBsAg регистрируются дополнительные объекты с высотами более 3 нм (3-8 нм), что превосходит высоту антител (1,6 ± 0,2 нм) и HBsAg (2,4 ± 0,4 нм). В качестве контрольного эксперимента была просканирована зона на том же самом АСМ-чипе, в которой были иммобилизованы антитела против HCVcoreAg (контрольная зона 1). Визуальная оценка АСМ-изображений после процедуры фишинга (рис. 8 (в)) показала, что общий рельеф поверхности АСМ-чипа в контрольной зоне 1 сходен с рельефом поверхности с иммобилизованными антителами до инкубации АСМ-чипа в растворе антигена. Распределение визуализированных объектов по высотам имеет 1 максимум в районе 1,8 ± 0,2 нм (рис. 8 (г)). Это значение совпадает в пределах погрешности со значением максимума распределения антител против HCVcoreAg по высотам (1.6±0.2 нм).

АСМ-сканирование поверхности чипа в зоне, где не были иммобилизованы антитела (контрольная зона 2), показало ровную поверхность; количество частиц в этой зоне не превышало 0,5-1 на 1 мкм2, размеры частиц не превышали 3 нм.

3 4 5 6 Высота, нм

о

№

\\

I ...X...................

2 [1ш

Высота, нм

в)

Г)

Рис. 8 а) АСМ-изображение поверхности слюды с иммобилизованными МКА против НВ$А% после инкубации в растворе НВяА§ (Ш8 М), б) обработка АСМ-данных: распределение частиц по высотам в зоне с иммобшшзованными анти-НВ$А% (2) в сравнении с распределением aнmu-HBsAg (1). (в, г) контрольный эксперимент: в) АСМ-изображение поверхности слюды с иммобилизованными МКА против HCVcoreAg после инкубации в растворе HBsAg (.10"8 М); г) обработка АСМ-данных: распределение частиц по высотамв зоне с иммобилизованными aнmu-HCVcoreAg (2) в сравнении с распределением анти-НСУсогеАё (1).

Детекция HBsAg в сыворотках крови людей

Для анализа были выбраны сыворотки, положительные и отрицательные по содержанию HBsAg согласно данным ИФА. Всего было протестировано 35 сывороток, из которых 26 положительные и 9 отрицательные по содержанию HBsAg (согласно данным ИФА).

В качестве примера на рис. 9 (а) представлено изображение АСМ-чипа с иммобилизованными МКА против HBsAg после инкубации в контрольной сыворотке крови, не содержащей HBsAg. АСМ-сканирование показало наличие на поверхности небольшого количества образовавшихся в процессе инкубации в сыворотке дополнительных объектов с высотами 5 нм (линия отсечения) и более. Обработка АСМ-данных показала, что относительное содержание этих объектов на поверхности АСМ-чипа составляет 1,9 % для данной сыворотки.

На изображении АСМ-чипа с иммобилизованными МКА после инкубации в сыворотке крови, содержащей НВзА§ (рис. 10 (а)) видно наличие на поверхности АСМ-чипа образовавшихся в процессе инкубации в сыворотке дополнительных объектов с высотами 5 нм (линия отсечения) и более, соответствующих комплексам иммобилизованных МКА против HBsAg с HBsAg-coдepжaщими частицами, находящимися в сыворотке крови больных. Анализ АСМ-данных (рис. 10(6)) показал, что относительное содержание этих объектов на поверхности АСМ-чипа составляет 8,9 % для данной сыворотки. Размеры этих объектов колебались от 5 до 40 нм, что превышает размеры комплексов aнти-HBsAg/HBsAg, полученные в эксперименте с раствором рекомбинантного белка (2,4 ± 0,4 нм). Это можно объяснить возможностью наличия полноразмерных вирусных частиц в сыворотке

а)

б)

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

д

/ \ !

\

\ !

\ \

....../ ......... гтгН1тттт+т1 тгг

2 4

Высота, нм

Рис. 9 а) Изображение поверхности АСМ-чипа (зона с иммобилизованными aнmu-HBsAg антителами) после его инкубации в сыворотке, не содержащей НВзА§; б) обработка АСМ-данных: распределение объектов по высотам. (------) -линия отсечения.

крови больных гепатитом В и поверхностным расположение HBsAg в составе вирусной частицы. Таким образом, можно предположить, что часть зарегистрированных на поверхности АСМ-чипа комплексов может представлять собой комплексы МКА против HBsAg с вирионами ВГВ.

В связи с тем, что при визуализации иммобилизованных антител против HBsAg большинство объектов (> 90%) лежат в пределах высот 1 -3 нм, а объекты с высотами более 5 нм полностью отсутствуют, порог высоты для отнесения каждого объекта к образовавшимся комплексам aнти-HBsAg/HBsAg (линия отсечения) был выбран на уровне, равном 5 нм, как и в случае с HCVcoreAg.

Результаты анализа сывороток на наличие HBsAg показали, что для 9 сывороток, не содержащих HBsAg согласно данным ИФА, относительное содержание объектов с высотами >5 нм на АСМ-чипе составило 0-9%. В то же время, для сывороток, содержащих HBsAg по данным ИФА, относительное содержание объектов с высотами >5 нм на АСМ-чипе составило 2,9-60%. Также как в случае детекции HCVcoreAg в сыворотках крови людей, для выбора порога отнесения сывороток к положительным или отрицательным по содержанию HBsAg был использован метод ЯОС-анализа. Полученная ЯОС-кривая представлена на рис.

Фрагмент массива точек «чувствительность-специфичность» в зависимости от уровня отсечения (порогового значения для отнесения исследуемой сыворотки к отрицательным или положительным по содержанию HBsAg) приведен в табл. 3.

а) б) Рис. 10 а) Изображение поверхности АСМ-чипа (зона с иммобилизованными анти-НВ$А% антителами) после его инкубации в сыворотке, содержащей HBsAg; б) обработка АСМ-данных: распределение объектов по высотам. (------■)— линия отсечения.

1

0,9 0,8 0," 0,6 и 0,5 0,4 0J 0.3 ол о

о 0,1 ОД 0,3 0,4 0.5 0,6 О,: 0,8 0,9 1 _1-Sp

Рис. 11 ROC-кривая для теста сыворотки крови на содержание HBsAg на основе АСМ.

Se - чувствительность теста, Sp - специфичность теста.

Из представленных в таблице данных видно, что порогом отсечения, обеспечивающим максимальную суммарную чувствительность и специфичность теста (т.е. минимальное количество ошибок I и И рода), является значение 3%. По-видимому, это значение следует принять оптимальным и использовать его в качестве критерия отнесения сыворотки к положительным по содержанию HBsAg.

На основании принятого в настоящей работе критерия отнесения сыворотки к положительным по содержанию HBsAg, можно сделать вывод, что совпадение данных АСМ-тестирования с данными метода ИФА составляет 66,7 % (6 сывороток из 9) для отрицательных сывороток и 96,1% (25 сывороток из 26) для положительных сывороток (см. Табл. 4). Наличие ложноположительных (по сравнению с методом ИФА) результатов детекции HBsAg , в сыворотке крови с помощью методики на основе АСМ-чипов можно объяснить высокой аналитической чувствительностью метода ACM (Archakov A.I. et al., 2009).

Таблица 3. Чувствительность(Se) и специфичность (Sp) АСМ-методики.

Таблица 4. Сравнение данных по детекции HBsAg в сыворотках крови, полученных с помощью метода АСМ и метода ИФА.

Порог отсечения (содержание частиц высотой >5 им, %) Se Sp Se+Sp

0 1 0 1

1 1 0 1

2 1 0,44 1,44

3 0,96 0,67 1,63

4 0,88 0,67 1,55

5 0,81 0,67 1,48

6 0,69 0,78 1,47

7 0,69 0,78 1,47

8 0,62 0,78 1,40

9 0,5 0,89 1,39

10 0,42 1 1,42

ИФА

ACM + -

+ 25 3

- 1 6

выводы

1. АСМ/биоспецифический фишинг может быть использован для детекции биологических маркеров вирусов гепатитов В и С - НВзА§ и HCVcoreAg.

2. Разработан АСМ-чип с иммобилизованными МКА против НВзА§ и против НСУсогеА$ для детекции указанных биологических маркеров вирусов гепатитов. Этот АСМ-чип содержит монослой антител, ковалентно иммобилизованных в определенные зоны на поверхности слюды. Активность иммобилизованных антител подтверждена серией экспериментов в растворах рекомбинантных белков HBsAg и HCVcoreAg.

3. Получены АСМ-изображения HBsAg, HCVcoreAg, МКА против этих антигенов и иммунокомплексов aнти-HBsAg/HBsAg и aнти-HCVcoreAg/HCVcoreAg. Обработка АСМ-изображений показала, что высота иммунокомплексов на поверхности АСМ-чипа превышает высоты соответствующих антител и антигенов.

4. Отработана комбинированная методика АСМ/биоспецифический фишинг для детекции белковых маркеров заболеваний гепатитами В и С в сыворотках крови людей. Проведен анализ тестовых образцов сывороток, положительных и отрицательных по содержанию биомаркеров вирусных гепатитов. Для исследованных образцов сывороток проведено сравнение результатов АСМ-анализа с результатами традиционно используемых методов диагностики (ИФА и ПЦР).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов Ю.Д., Николаева Л.И., Гнеденко О.В., Константинова Н.И., Французов П.А., Светлов С.К., Ковалёв О.Б., Конев В.А., Говорун В.М., Учайкин В.Ф., Арчаков А.И. Выявление комплексов антиген/антитело методом оптического биосенсора и атомно-силовой микроскопии // Сборник докладов II Московского международного Конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. - Москва, Россия. - 10-14 ноября 2003. - С. 38.

2. Арчаков А.И., Иванов Ю.Д., Плешакова Т.О., Светлов С.К., Французов П.А. Атомно-силовая микроскопия для медицинской диагностики // Материалы VII Всероссийской конференции Физикохимия ультрадисперсных (нано)-систем. - Ершово, Московская область, Россия. - 22-24 ноября 2005. - С. 233.

3. Ivanov Yu.D, Ivanov A.V., Gnedenko O.V., Konstantinova N.I., Pleshakova Т.О., Svetlov S.K., Frantsuzov P.A., Archakov A.I. AFM and Optical Biosensor Nanotechnology in Revelation of Protein Complexes // MolecuIar&Cellular Proteomics. Abstracts Volume for HUPO 4th Annual World Congress. - Munich, Germany. - August 29 - September 1,2005. - P. 330.

4. Иванов Ю.Д., Учайкин В.Ф., Плешакова Т.О., Французов П.А., Светлов С.К., Конев

B.А., Ковалев О.Б., Ястребова О.Н., Свешников П.Г., Уланова Т.И., Арчаков А.И. Создание нового поколения био- и иммуносенсоров и биочипов для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний // Физиология и патология иммунной системы. - 2006. - Т. 12, вып. 10.-С. 11-14.

5. Ivanov Yu.D., Pleshakova Т.О., Frantsuzov P.A., Svetlov S.K., Nikolskaya O.S., Nikitina S.Ye., Rachenkova N.I., Moshkovskii S.A., Archakov A.I. Nanotechnology in diagnostics // Moscow International Conference Biotechnology and Medicine. - Moscow, Russia. - March, 14-17, 2006. - P. 20.

6. Ivanov Y.D., Pleshakova Т.О., Frantsuzov P.A., Svetlov S.K., Ivanov A.V., Nikolskaya O.S., Konstantinova N.I., Gnedenko O.V., Moshkovsky S.A., Archakov A.I. Nanochips for diagnostics of diseases // Materials of The 3,d International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine". - Novosibirsk, Russia. - July, 12-16,2006. - P. 12.

7. Иванов Ю.Д., Плешакова Т.О., Французов П.А., Светлов С.К., Никольская О.С., Никитина С.Е., Арчаков А.И. Нанобиочипы для диагностики заболеваний // Материалы Четвертого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развиия». - Москва. - 12-16 марта 2007. - С.32.

8. Ivanov Y.D., Pleshakova Т.О., Nikitina S.E., Ivanov A.V., Kaysheva A.L., Frantsuzov P.A., Archakov A.I. Nanobiochips for Proteomics and Diagnostics // HUPO 7th Annual World Congress. -Amsterdam, Netherlands. - August, 16-20,2008. - URL: http://hupo.org/meetings/congress/77 (дата обращения: 24.08.2010).

9. Иванов Ю.Д., Плешакова Т. О., Никитина С.Е., Кайшева А.Л., Французов П.А., Иванов A.B., Арчаков А.И. Нанобиотехнология для диагностики // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, Россия. - 11-15 мая 2008. -

C. 306.

10. Иванов Ю.Д., Французов П.А., Плешакова Т.О., Зиборов В.С, Светлов С.К., Крохин Н.В., Конев В.А., Ковалев О.Б., Учайкин В.Ф., Ястребова О.Н., Свешников П.Г., Арчаков А.И. Детекция серологических маркеров вирусных гепатитов В и С методом атомно-силовой микроскопии // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55, вып. 6. - С. 689-701.

11. Кайшева А.Л., Французов П.А., Плешакова Т.О. Иванов Ю.Д. Згода В.Г. Зибров В. С., Крохин Н.В., Арчаков А.И. Идентификация белков и вирусных частиц с помощью комбинации атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии // Сборник докладов участников Второго международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech 09. - Москва. - 6-8 октября 2009. - С. 896.

12. Кайшева А.Л., Плешакова Т.О., Французов П.А., Иванов Ю.Д., Згода В.Г., Зибров. B.C., Крохин Н.В., Ястребова О.В., Конев В.А., Учайкин В.Ф., Арчаков А.И. Визуализнция и идентификация вирусных частиц гепатита С при помощи атомно-силовой микроскопии, сопряженной с масс-спектрометрией // Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56, вып. 1. - С. 26-39.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Проведенные исследования поддержаны грантом РФФИ # 09-04-12113-ОФИ, Государственной программой «Протеомика в медицине и биотехнологии», Государственными контрактами № 02.512.11.2176 «Атомно-силовая микроскопия и биосенсоры для диагностики гепатитов В и С»; № 02.552.11.7060 «Проведение поисковых научно-исследовательских работ в области разработки методики измерений по детекции ультранизкокопийных белков посредством атомно-силовой микроскопии и способов ее применения в медицинских исследованиях в центре коллективного пользования научным оборудованием».

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АСМ - атомно-силовая микроскопия, атомно-силовой микроскоп ИФА - иммуноферментный анализ ПЦР - полимеразная цепная реакция HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В HCVcoreAg - кор-антиген вируса гепатита С МКА - моноклональные антитела

Анти-HBsAg- антитела против поверхностного антигена вируса гепатита В Анти-HCVcoreAg - антитела против кор-антигена вируса гепатита С EDC - 1-этил-(3,3-диметил)-аминопропилкарбодиимид NHS - N-гидроксисукцинимид

ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,5% Твина-80

APTES - аминопропилтриэтоксисилан

ВГВ - вирус гепатита В

ВГС - вирус гепатита С

КФБ - калий-фосфатный буферный раствор

IgG - иммуноглобулины класса G

Подписано в печать:

16.09.2010

Заказ № 4117 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Французов, Павел Александрович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус гепатита В

1.2. Лабораторная диагностика вирусного гепатита В

1.3. Вирус гепатита С

1.4. Лабораторная диагностика вирусного гепатита С

1.5. Основы метода АСМ

1.6. Колебательные методики АСМ

1.7. Примеры применения АСМ для исследования 34 биологических объектов

1.8. Способы иммобилизации биологических макромолекул 39 на подложки АСМ

Глава 2. АППАРАТУРА И МЕТОДИКИ 46 ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Использованные реактивы

2.2. Характеристика исследуемых биологических объектов

2.3. АСМ Solver Р47Н и зондовая нанолаборатория NTEGRA

2.4. Получение АСМ-изображений

2.5. Обработка АСМ-изображений

2.6. Методика модификации подложки АСМ

2.7. Методика приготовления образцов

2.7.1. Нековалентная иммобилизация белков на подложки АСМ

2.7.2. Ковалентная иммобилизация моноклональных антител

2.7.3. Получение комплексов HBsAg с антителами против него 54 на поверхности АСМ-чипа

2.7.4. Получение комплексов HCVcoreAg с антителами против 55 него на поверхности АСМ-чипа

2.7.5. Фишинг HBsAg и HCVcoreAg из сывороток крови людей

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выявление маркера вирусного гепатита С

3.1.1. Иммобилизация моноклональных антител против 57 HCVcoreAg на подложку АСМ

3.1.2. Детекция HCVcoreAg в растворе

3.1.3. Детекция HCVcoreAg в сыворотках крови людей

3.1.4. Анализ сывороток крови на содержание HCVcoreAg с 67 помощью АСМ-чипов

3.2. Выявление маркера вирусного гепатита В

3.2.1. Иммобилизация моноклональных антител против HBsAg 76 на подложку АСМ

3.2.2. Детекция HBsAg в растворе

3.2.3. Анализ сывороток крови на содержание HBsAg с 82 помощью АСМ-чипов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Атомно-силовые чипы для выявления маркеров заболеваний вирусными гепатитами B и C"

Актуальность.

Создание диагностических систем нового поколения является одним из приоритетных направлений современных медицинских исследований. Настоящая диссертационная работа посвящена созданию высокочувствительного молекулярного детектора на базе АСМ для выявления маркеров вирусных частиц гепатитов В и С в сыворотке крови.

Актуальность диагностики вирусных гепатитов В и С обусловлена широкой распространенностью этих заболеваний и их ростом в последние годы. Высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени, и частое поражение лиц молодого возраста также обуславливают повышенное внимание к вирусным гепатитам, актуальность и важность подбора рациональных методов диагностики, лечения и профилактики. По данным ВОЗ вирусом гепатита В инфицировано около 2 миллиардов человек в мире, а около 350 миллионов человек имеют хроническую инфекцию. По оценкам, 600 ООО людей ежегодно умирает от острой или хронической формы гепатита В [1]. Вирусом гепатита С инфицировано порядка 170 млн. человек в мире, что составляет около 3% населения Земли [2]. В России в 2000 г. по сравнению с 1998 г. заболеваемость гепатитом В возросла на 15,6 %, гепатитом С — на 45,1% [3].

В настоящее время основными методами детекции серологических маркеров заболеваний вирусными гепатитами являются иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы зарекомендовали себя как высокоспецифичные и чувствительные. Однако, диагностика инфекционных заболеваний на ранних стадиях (на которых не проявляются клинические симптомы заболевания) с помощью тест-систем на основе этих методов является недостаточно эффективной. В частности, чувствительность метода ПЦР очень высока - порядка нескольких копий нуклеиновой кислоты. Но существует следующее ограничение - при помощи

ПЦР возможно детектировать только нуклеиновые кислоты, но не белки, в то время как многие маркеры инфекционных заболеваний имеют белковую природу. Также на результаты ПЦР существенное влияние оказывает высокая вероятность контаминации образцов, что часто приводит к ложноположительным результатам. Существенным недостатком методов белковой диагностики (к которым относится ИФА), является предел чувствительности: концентрационный барьер для обнаружения и идентификации белковых молекул в биологическом материале,

10 существующий в протеомике, ограничен 10" М [4]. Такое ограничение традиционных методик медицинской белковой диагностики приводит к тому, что в настоящее время в диагностике используется лишь 10-20% потенциально значимых диагностических белковых маркеров, что в свою очередь сдерживает создание ранних диагностикумов, основанных на использовании маркерных белков.

Другие методы идентификации белков, которые широко используются в протеомике и медицине также не обладают ' достаточной чувствительностью для детекции биологических объектов, присутствующих в растворах аналита в низких концентрациях. Например, чувствительность комбинации 2В-электрофореза или хроматографии с масс-спектрометрией LC/MS составляет порядка 10'8- Ю"10 М [5].

Таким образом, традиционные методики медицинской диагностики имеют ограничения, связанные, прежде всего, с недостаточной чувствительностью. Это приводит к тому, что в настоящее время в диагностике регистрируется и используется лишь небольшая часть потенциально значимых диагностических белковых маркеров, что в свою очередь сдерживает создание ранних диагностикумов, основанных на использовании маркерных белков.

Дальнейшее успешное развитие медицинской диагностики и диагностики вирусных гепатитов в частности требует разработки и внедрения методик, обладающих возможностями выявления и идентификации белков и их комплексов в многокомпонентном

IО биологическом материале в диапазоне концентраций ниже 10" М. Подходы, позволяющие решать эти задачи, основаны на использовании методов регистрации и идентификации единичных молекул с помощью молекулярных детекторов [4]. Используемый в настоящей работе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) предоставляет принципиальную возможность визуализировать отдельные белковые молекулы, а это - прямой путь к обнаружению биомаркеров на ранних стадиях заболеваний.

Молекулярный детектор на базе АСМ основан на мониторинге силы взаимодействия зонда микроскопа с молекулами, иммобилизованными на атомарно-гладкой поверхности подложки АСМ [6]. При сканировании зондом вдоль такой поверхности измеряется высота молекул и их комплексов. Высота АСМ-изображений белкового комплекса, как правило, превышает высоту составляющих его изолированных молекул белков г [7, 8]. Вертикальное разрешение метода атомно-силовой микроскопии достигает 0,1 нм.

Для создания диагностического устройства на базе АСМ необходима комбинация метода АСМ с методами биоспецифического фишинга (вылавливание биомолекул из раствора за счет специфического связывания с молекулами-зондами, иммобилизованными на подложке АСМ). В настоящей работе эта комбинация была использована для выявления серологических маркеров вирусных гепатитов В и С - поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и кор-антигена вируса гепатита С (HCVcoreAg).

Схема детекции серологических маркеров гепатитов В и С с помощью метода АСМ включает два этапа: на первом этапе проводится биоспецифический фишинг, для чего биологический микрочип (АСМ-чип), представляющий собой атомарно ровную подложку с монослоем иммобилизованных макромолекул-зондов, инкубируется в биологическом растворе, содержащем маркеры-гепатитов В-и С; на втором этапе проводится подсчет образовавшихся иммунокомплексов на поверхности АСМ-чипа с помощью АСМ.

Цель работы - разработка методики выявления в сыворотке крови людей маркеров заболеваний вирусными гепатитами В и С: HBsAg и HCVcoreAg на основе АСМ-чипов.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Подбор условий иммобилизации МКА против HBsAg и HCVcoreAg на подложку АСМ;

2. АСМ-визуализация иммобилизованных антител, определение их высоты и плотности иммобилизации на поверхности АСМ-чипа;

3. Разработка методики биоспецифического АСМ-фишинга для детекции HBsAg и HCVcoreAg с помощью АСМ-чипов;

4. АСМ-визуализация, определение высоты и количества иммунокомплексов анти-HBsAg/HBsAg и анти-HCVcoreAg/HCVcoreAg на поверхности АСМ-чипа;

5. Адаптация методики АСМ/биоспецифического фишинга для определения биологических маркеров вирусов гепатитов В и С в сыворотках крови больных людей с помощью метода АСМ;

6. Анализ сывороток, положительных и отрицательных (по данным ИФА и ПЦР) по содержанию биомаркеров вирусных гепатитов, с помощью разработанной методики на основе АСМ-чипов.

Научная новизна работы.

Впервые разработана и реализована методика ковалентной иммобилизации МКА на подложку АСМ. Показано, что в результате иммобилизации образуется монослой антител, сохраняющих биологическую активность. Показано, что комбинация методов АСМ-регистрации и биоспецифического фишинга может применяться для выявления биологических маркеров вирусных гепатитов В и С в растворах и сыворотках крови людей. Получены изображения HBsAg, HCVcoreAg, антител против этих антигенов и иммунокомплексов. Впервые осуществлена АСМ-детекция серологических маркеров вирусов гепатитов В и С - HBsAg и HCVcoreAg - в сыворотках крови людей с помощью разработанных АСМ-чипов.

Научно-практическая ценность работы.

Показана возможность выявления серологических маркеров вирусов гепатитов В и С в сыворотках крови людей с помощью разработанных АСМ-чипов. Разработанная методика биоспецифического фишинга в комбинации с прямым подсчетом белковых комплексов с помощью молекулярного детектора на базе АСМ может служить основой для создания высокочувствительных диагностических систем нового поколения. Данный подход может быть использован в протеомике и медицинской диагностике для выявления других белков в многокомпонентном растворе.

Апробация работы.

Основные положения диссертации были представлены на VII Всероссийской конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем» (Ершово, Московская область, 2005 г.), Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006 г.), 4-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007 г.), Втором международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech 09 (Москва, 2009 г.)

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания аппаратуры и методик исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Французов, Павел Александрович

выводы

1. АСМ/биоспецифический фишинг может быть использован для детекции биологических маркеров вирусов гепатитов В и С - HBsAg и HCVcoreAg.

2. Разработан АСМ-чип с иммобилизованными МКА против HBsAg и против HCVcoreAg для детекции указанных биологических маркеров вирусов гепатитов. Этот АСМ-чип содержит монослой антител, ковалентно иммобилизованных в определенные зоны на поверхности слюды. Активность иммобилизованных антител подтверждена серией экспериментов в растворах рекомбинантных белков HBsAg и HCVcoreAg.

3. Получены АСМ-изображения HBsAg, HCVcoreAg, МКА против этих антигенов и иммунокомплексов анти-HBsAg/HBsAg и анти-HCVcoreAg/HCVcoreAg. Обработка АСМ-изображений показала, что высота иммунокомплексов на поверхности АСМ-чипа превышает высоты соответствующих антител и антигенов.

4. Отработана методика АСМ/биоспецифический фишинг детекции белковых маркеров заболеваний гепатитами В и С в сыворотках крови людей. Проведен анализ тестовых образцов сывороток, положительных и отрицательных по содержанию биомаркеров вирусных гепатитов. Для исследованных образцов сывороток проведено сравнение результатов АСМ-анализа с результатами традиционно используемых методов диагностики (ИФА и ПЦР).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТ

Проведенные исследования поддержаны грантом РФФИ # 09-04-12113-ОФИ, Государственной программой «Протеомика в медицине и биотехнологии», Государственными контрактами № 02.512.11.2176 «Атомно-силовая микроскопия и биосенсоры для диагностики гепатитов В и С»; № 02.552.11.7060 «Проведение поисковых научно-исследовательских работ в области разработки методики измерений по детекции ультранизкокопийных белков посредством атомно-силовой микроскопии и способов ее применения в медицинских исследованиях в центре коллективного пользования научным оборудованием».

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю -заведующему лабораторией нанобиотехнологии ИБМХ РАМН, доктору биологических наук Юрию Дмитриевичу Иванову за предоставление темы для настоящей работы, помощь и поддержку при ее выполнении.

Особо благодарю заведующего кафедрой инфекционных болезней у детей РГМУ, академика РАМН В.Ф. Учайкина, а также сотрудников кафедры к.м.н. В.А. Конева и д.м.н. О.Б. Ковалева за предоставление сывороток крови для анализа.

Благодарю О.Н. Ястребову за предоставления рекомбинантного белка капсида ВГС для исследований.

Выражаю глубокую признательность коллективу лаборатории нанобиотехнологии ИБМХ РАМН за полезные рекомендации и помощь в проведении экспериментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящей работы являлась разработка методики выявления в сыворотке крови людей маркеров заболеваний вирусными гепатитами В и С на основе метода АСМ. В ходе выполнения работы были реализованы следующие основные этапы:

1. Разработка методики иммобилизации моноклональных антител на поверхность подложки АСМ.

2. Тестирование сформированных АСМ-чипов с использованием растворов рекомбинантных белков HBsAg и HCVcoreAg.

3. Тестирование сформированных АСМ-чипов в образцах сывороток крови людей.

На первом этапе была разработана методика иммобилизации - моноклональных антител против HBsAg и HCVcoreAg на аминомодифицированную поверхность слюдьь на основе использования карбодиимидов. С помощью данной методики были созданы АСМ-чипы с монослоем ковалентно иммобилизованных молекул-зондов (моноклональных антител против HBsAg и HCVcoreAg).

На втором этапе была продемонстрирована возможность выявления HBsAg и HCVcoreAg в растворах с помощью метода АСМ в сочетании с методом биоспецифического фишинга анализируемых белковых молекул на поверхность АСМ-чипа. Возможности метода АСМ позволили регистрировать образование комплексов «антиген-антитело» в режиме счета единичных белковых молекул.

На третьем этапе разработана методика выявления маркеров вирусных гепатитов В и С в сыворотках крови людей на основе разбавления исследуемой сыворотки и отмывки неспецефически связавшихся с поверхностью АСМ-чипа компонентов сыворотки. С использованием данной методики была продемонстрирована возможность определения HBsAg и HCVcoreAg в сыворотках крови людей.

Разработаны критерии отнесения исследуемой сыворотки к положительным или отрицательным по содержанию маркеров вирусных гепатитов - HCVcoreAg и HBsAg. На основании выбранных критериев было произведено тестирование положительных и отрицательных (согласно данным ИФА и ПЦР) по содержанию HBsAg и HCVcoreAg сывороток крови с помощью комбинации методов биоспецифического фишинга и АСМ.

Также было проведено сравнение данных, полученных при помощи метода АСМ в комбинации с методом биоспецифического фишинга с данными традиционных методов исследования (ИФА, ПЦР). Совпадение результатов, полученных с использованием традиционно используемых методов исследования (ИФА, ПЦР) с результатами разработанной методики на основе АСМ составило 75,6% в случае детекции HCVcoreAg и 88,6% в случае детекции HBsAg.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Французов, Павел Александрович, Москва

1. Информационный бюллетень ВОЗ № 204. - 2008.

2. WHO Fact sheet №164. -2008.

3. Шаханина И.Д., Радуто О.И. Вирусные гепатиты в России: официальная статистика и экономические потери // Вирусные гепатиты. -2001.-№6(18).-С. 6-9.

4. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // Proteomics. 2007. - V. 7(1), P. 4-9.

5. Farci P., Alter H.J., Wong D., Miller R.H., Shih J.W., Jett В., Purcell R.H. A long-term study of hepatitis С virus replication in non-A, non-B hepatitis // N. Engl. J. Med. 1991. - V. 325(2). - P. 98-104.

6. Ivanov Yu.D., Gnedenko O.V., Nikolaeva L.I., Konev V.A., Kovalev

7. B., Uchaikin V.F., Govorun V.M., Pokrovsky V.I., Archakov A.I. Detection of hepatitis В virus surface antigen with the use of an optical biosensor// Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2003. - V. 2. - P. 5862.

8. Kuznetsov V.Yu., Ivanov Yu.D., Archakov A.I. Atomic force microscopy revelation of molecular complexes in the multiprotein cytochrome P450 2B4-containing system // Proteomics . 2004 . -V. 4. - P. 2390-2396.

9. Kuznetsov V.Yu., Ivanov Y.D., Bykov V.A., Saunin S.A., Fedorov

10. A., Lemeshko S.V., Hui Bon Hoa G. and Archakov A. I. Atomic force microscopy detection of molecular complexes in multiprotein P450cam containing monooxygenase system // Proteomics . 2002 . - V. 2. - P. 16991705.

11. Glebe D. Recent advances in hepatitis В virus research: a German point of view // World J. Gastroenterol. -2007 . V. 13(1). - P. 8-13.

12. Hsia C.C., Purcell R.H., Farshid M., Lachenbruch P.A., Yu M.Y. Quantification of hepatitis В virus genomes and infectivity in human serum samples // Transfusion . 2006 . - V. 46(10) . -P. 1829-35.

13. Баранов A.A., Каганов B.C., Потапов A.C., Зайнудинов З.М. Хронический гепатит В у детей // Вопросы современной педиатрии . -2002 .-Т. 1, №3 . С. 44-55.

14. Glebe D., Urban S. Viral and cellular determinants involved in hepadnaviral entry // World J. Gastroenterol. 2007. -V. 13(1). - P. 22-38.

15. Dane D. S., Cameron С. H., and Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis // Lancet. -1970.-V. l.-P. 695-698.

16. Heermann K.H., Goldmann U., Schwartz W., Seyffarth Т., Baumgarten H., Gerlich W.H. Large surface proteins of hepatitis В virus containing the pre-s sequence // J. Virol. 1984". - V. 52(2). - P. 396-402.

17. Nordenfelt E. and Kjellen L. Dane particles, DNA polymerase and e-antigen in two distinct categories of hepatitis В antigen carriers // Intervirology. -1975 . V. 5. - P. 225-232.

18. Баранов А.А., Каганов B.C., Учайкин В.Ф. и др. Диагностика и лечение хронических гепатитов С и D у детей // Вопросы современной педиатрии. 2004. - Т. 3, №1 . - С. 16-28.

19. Ильина Е.Н., Фомина Е.Е., Артемов Е.К., Говорун В.М., Иваников И.О., Сюткин В.Е. Хронические вирусные заболевания печени (методическое пособие для врачей). Москва: 2001. - 22 С.

20. Anderson N.L., Anderson N.G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects // Mol. Cell. Proteomics . 2002. - V. 1 (11).-P. 845-867.

21. Grebenchtchikov N., Geurts-Moespot A J., Kroot J J., den Heijer M., Tjalsma H., Swinkels D.W., Sweep F.G. High-sensitive radioimmunoassay for human serum hepcidin // Br. J. Haematol. 2009. - V. 146(3). - P. 317325.

22. Sato K., Okamoto H., Aihara S., Hoshi Y., Tanaka Т., Mishiro S. Demonstration of sugar moiety on the surface of hepatitis С virions recovered from the circulation of infected humans // Virology. 1993. - V. 196. - P. 354-357.

23. Ligler F.S. Perspective on optical biosensors and integrated sensor systems // Anal. Chem. 2009. - V. 81(2). - P. 519-526.

24. Report of a WHO Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium // J. Viral. Hepat. -1999.-V. 6. P. 35—47.

25. Seeff L.B., Hoofnagle J.H. Appendix: The National Institutes of Health Consensus Development Conference. Management of Hepatitis С 2002 // Clin. Liver Dis. 2003. - V. 7. - P. 261-287.

26. Tanaka Т., Kato N., Cho M.J., Sugiyama K., Shimotohno K. Structure of the 3' terminus of the hepatitis С virus genome // J. Virol. 1996. - V. 70(5).-P. 3307-3312.

27. Mizuno M., Yamada G., Tanaka Т., Shimotohno K., Takatani M., Tsuji T. Virion-like structures in HeLa G cells transfected with the full-length sequence of the hepatitis С virus genome 1933-1940 // Gastroenterology. -1995.-V. 109.-P. 1933-1940.

28. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang TJ. Hepatitis С virus structural proteins assemble into viruslike particles in insect cells // J. Virol. -1998.-V. 72.-3827-3836.

29. Yuasa Т., Ishikawa G., Manabe S., Sekiguchi S., Takeuchi K., Miyamura T. The particle size of hepatitis С virus estimated by filtration through microporous regenerated cellulose fibre // J. Gen. Virol. 1991. - V. 72.-P. 2021-2024.

30. Prince A.M., Huima-Byron Т., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral Hepat. 1996. - V. 3(1). - P. 11-17.

31. Ishida S., Kaito M., Kohara M., Tsukiyama-Kohora K., Fujita N., Ikoma J., Adachi Y., Watanabe S. Hepatitis С virus core particle detected by immunoelectron microscopy and optical rotation technique // Hepatol. Res. -2001V. 20(3) .-P. 335-347.

32. Li X., Jeffers L.J., Shao L., Reddy K.R., de Medina M., Scheffel J., Moore В., Schiff E.R. Identification of hepatitis С virus by immunoelectron microscopy // J. Viral Hepat. 1995. - V. 2(5). - P. 227-234.

33. Hijikata M., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., Shimotohno K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis С virus genome by in vitro processing analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V. 88(13).-P. 5547-5551.

34. Yasui К., Wakita Т., Tsukiyama-Kohara К., Funahashi S.I., Ichikawa M., Kajita Т., Moradpour D., Wands J.R., Kohara M. The native form and maturation process of hepatitis С virus core protein // J. Virol. 1998. - V. 72(7).-P. 6048-6055.

35. Lo S.Y., Selby M., Tong M., Ou J.H. Comparative studies of the core gene products of two different hepatitis С virus isolates: two alternative forms determined by a single amino acid substitution // Virology. 1994. - V. 199(1).-P. 124-131.

36. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., Zhu N., Lai M.M. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis С virus core protein // Virology. -1996.-V. 218(1).-P. 43-51.

37. Nolandt O., Kern V., Muller H., Pfaff E., Theilmann L., Welker R., Krausslich H.G. Analysis of hepatitis С virus core protein-interaction domains //J. Gen. Virol.- 1997.-V. 78(6).-P. 1331-1340. :

38. Reed K.E., Rice C.M. Overview of hepatitis С virus genome structure, polyprotein processing, and protein .properties // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000. - V. 242. - P. 55-84.

39. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu J., Hahn Y.S., Rice C.M., Dubuisson J. Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes // J. Virol. 1997. - V. 71(1). - P. 697-704.

40. Liberman E., Fong Y.L., Selby M.J., Choo Q.L., Cousens L., Houghton M., Yen T.S. Activation of the grp78 and grp94 promoters by hepatitis С virus E2 envelope protein // J. Virol. 1999. - V. 73(5). - P. 3718-3722.

41. Kolykhalov A.A., Mihalik K., Feinstone S.M., Rice C.M. Hepatitis С virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo // J. Virol. —2000. V. 74(4). - P. 2046-2051.

42. Gorbalenya A.E., Snijder E.J. Viral cysteine proteinases // Perspect. Drug Discovery Design. 1996. - V. 6, P. 64-86.

43. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., Jacobsen H. Nonstructural protein 3 of the hepatitis С virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions // J. Virol. 1993. - V. 67(7). - P. 3 83 5-3 844:

44. Kim D.W., Gwack Y., Han J.H., Choe J. Towardsidefining a minimal functional domain for NTPase and RNA helicase activities of the hepatitis С virus NS3 protein//Virus Res. 1997.-V. 49(1).-P. 17-25.

45. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Yasargil K., Mous J., Jacobsen H. Substrate determinants for cleavage in cis and in trans by the hepatitis С virusNS3 proteinase//J. Virol.- 1995 .-V. 69(1).-P. 198-205.

46. Gwack Y., Kim D.W., Han J.H., Choe J. DNA helicase activity of the hepatitis С virus nonstructural protein 3'// Eur. J. Biochem. 1997. - V. 250(1).-P. 47-54.

47. Hiigle Т., Fehrmann F., Bieck E., Kohara M., Krausslich H.G., Rice C.M., Blum H.E., Moradpour D. The hepatitis С virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein // Virology.2001.-V. 284(1).-P. 70-81.

48. Kato J., Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S.K., Shiratori Y., Omata M. Hepatitis С virus NS4A and NS4B proteins suppress translation in vivo // J. Med. Virol. 2002. - V. 66(2). - P. 187-199.

49. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The NS5A protein of hepatitis С virus is a zinc metalloprotein // J. Biol. Chem. -2004. -V. 279(47). P. 48576-48587.

50. Behrens S.E., Tomei L., De Francesco R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus // EMBO J. -1996.-V. 15(1).-P. 12-22.

51. Sharma S.D. Hepatitis С virus: Molecular biology & current therapeutic options // Indian J. Med. Res. 2010. - V. 131. - P. 1734.

52. Иванов A.B., Кузякин A.O., Кочетков C.H. Молекулярная биология вируса гепатита С // Успехи биологической химии. 2005. - Т. 45.-С. 37-86.

53. Hsu М., Zhang J., Flint М., Logvinoff С., Cheng-Mayer С., Rice С.М., McKeating J.A. Hepatitis С virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003.-V. 100(12).-P. 7271-7276.

54. Monazahian M., Bohme I., Bonk S., Koch A., Scholz C., Grethe S., Thomssen R. Low density lipoprotein receptor as a candidate receptor for hepatitis С virus // J. Med. Virol. 1999. - V. 57(3). - P. 223-229.

55. Enjoji M., Nakamuta M., Kinukawa N., Sugimoto R., Noguchi K., Tsuruta S., Iwao M., Kotoh K., Iwamoto H., Nawata H. Beta-lipoproteins influence the serum level of hepatitis С virus // Med. Sci. Monit. 2000. - V. 6(5).-P. 841-844.

56. Lin C., Lindenbach B.D., Pragai B.M., McCourt D.W., Rice C.M. Processing in the hepatitis С virus E2-NS2 region: identification of p7 andtwo distinct E2-specific products with different С termini // J. Virol. 1994. -V. 68(8).-P. 5063-5073.

57. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V.G. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins // Proteomics. 2009. - V. 9(5). - P. 13261343.

58. Binning G., Quate C.F., Gerber C. Atomic force microscope // Phys. Rev. Lett. 1986. - V. 56(9). - P. 930-933.

59. Миронов В.Jl. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Н. Новгород: 2004.- 110 С.

60. Garcia R., San Paulo A. Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy // Phys. Rev. B. 1999. -V. 60. - P. 4961 - 4967.

61. San Paulo A., Garcia R. High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes // Biophys. J. 2000: - V. 78(3). - P. 1599-1605.

62. Podesta A., Imperadori L., Colnaghi W., Finzi L., Milani P., Dunlap D. Atomic force microscopy study of DNA deposited on poly 1-ornithine-coated mica // J. Microscopy. 2004. - V. 215. - P. 236-240.

63. Ellis J.S., Abdelhady H.G., Allen S., Davies M.C., Roberts C.J., Tendler S.J.B., Williams P.M. Direct atomic force microscopy observations of monovalent ion induced binding of DNA to mica // J. Microscopy. 2004. -V.215.-P. 297-301.

64. Rippe K., Mucke N., Langowski J. Superhelix dimensions of a 1868 base pair plasmid determined by scanning force microscopy in air and in aqueous solution // Nucl. Acid Res. 1997. - V. 25. - P. 1736-1744.

65. Bayburt Т.Н., Sligar S.G. Single-molecule height measurements on microsomal cytochrome P450 in nanometer-scale phospholipid bilayer disks // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99(10). - P. 6725-6730.

66. Janicievic A., Ristic D., Wyman C. The molecular machines of DNA repair: Scanning force microscopy analysis of their architecture // J. Microsc. 2003. - V. 212. - P. 264-272.

67. Pastre D., Hamon L., Sorel I., Le Cam E., Curmi P.A., Pietrement O. Specific DNA-protein interactions on mica investigated by atomic force microscopy//Langmuir. -2010. -V. 26(4). P. 2618-2623.

68. Butt H.-J., Guckenberger R., Rabe J.P. Quantitative scanning tunneling microscopy and scanning force microscopy of organic materials // Ultramicroscopy. 1992. - V. 46. - P. 375-393.

69. Zhang Y., Sheng S., Shao Z. Imaging Bioological Structures with the Cryo Atomic Force Microscopy // Biophys. J. 1996. - V. 71. - P. 21682176.

70. Thomson N.H. Imaging the substructure of antibodies with tapping-mode AFM in air: the importance of a'water layer on mica// J. Microsc. -2005.-V. 217.-P. 193-199.

71. Moller C., Allen M., Elings V., Engel A., Muller D.J. Tapping-Mode Atomic Force Microscopy Produces Faithful High-Resolution Images of Protein Surfaces // Biophys. J. 1999. - V. 77(2). - P: 1150-1158.

72. Cheung C.L., Hafiier J.H., Lieber C.M., Carbon nanotube atomic force microscopy tips: direct growth by chemical vapor deposition and application to high-resolution imaging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97(8). -P. 3809-3813.

73. Nagao E., Dvorak J.A. An integrated approach to the study of living cells by atomic force microscopy // J. Microsc. 1997. - V. 191. - P.8-19.

74. Nettikadan S.R., Johnson J.C., Mosher C., Henderson E. Virus particle detection by solid phase immunocapture and atomic force microscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2003. V. 311.-P. 540-545.

75. Huff J.L., Lynch M.P., Nettikadan S.R., Johnson J.C., Vengasandra S., Henderson E. Label-free protein and pathogen detection using the atomic force microscope // J. Biomol. Screen. 2004. - V. 9(6). - P. 491-497.

76. Thundat Т., Allison D.P., Warmack R.J., Ferrell T.L. Imaging isolated strands of DNA molecules by atomic force microscopy // Ultramicroscopy. -1992. V. 42-44(Pt. В). - P. 1101-1106.

77. Song Y., Guo C., Sun L., Wei G., Peng C., Wang.L., SunsY., Li Z. Effects of bridge ions, DNA species, and developing temperature on flat-lying DNA monolayers // J. Phys. Chem. B. 2007. - V. 111(2). - P. 461-468.

78. Negishi A., Chen J:, McCarty D.M., Samulski R.J., Liu J., Superfine R. Analysis of the interaction between adeno-associated virus and heparan sulfate using atomic force microscopy // Glycobiology. 2004. - V. 14. - P. 969-977.

79. Wagner P. Immobilization strategies for biological scanning probe microscopy // FEBS Lett. 1998. - V. 430. - P. 112-115.

80. Butt H.J. Measuring local surface charge densities in electrolyte solutions with a scanning force microscope // Biophys. J. 1992. - V. 63. - P. 578-582.

81. Mueller D.J., Amrein M., Engel A. Adsorption of Biological Molecules to a Solid Support for Scanning Probe Microscopy // J. Struct. Biol.-1997.-V. 119.-P. 172-188.

82. Florin E.-L., Moy V.T., Gaub H. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs // Science. 1994. - V. 264. - P. 415-417.

83. Hegner M., Wagner P., Semenza G. Immobilizing DNA on gold via thiol modification for atomic force microscopy imaging in buffer solutions // FEBS Lett. 1993. - V. 336. - P. 452-456.

84. Crampton N., Bonass W.A., Kirkham J., Thomson N.H., Formation of aminosilane-functionalized mica for atomic force microscopy imaging of DNA//Langmuir.-2005. V. 21(17).-P. 7884-7891.

85. Caballero D., Pla-Roca M., Bessueille F., Mills C. A., Samitier J., Errachid A. Atomic Force Microscopy Characterization of a Microcontact Printed, Self-Assembled Thiol.Monolayer for Use in Biosensors // Anal. Lett. 2006. - V. 39(8). - P. 1721 - 1734.

86. Lyubchenko Y., Shlyakhtenko L., Harrington R., Oden P., Lindsay S. Atomic force microscopy of long DNA: imaging in air and under water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 2137 - 2140.

87. Karrash S., Dolder M., Hoh J., Scabert F., Ramsden J.,"Engel A. Covalent binding of biological samples to solid supports for scanning probe microscopy in buffer solution // Biophys. J. 1993. - V. 65. - P. 2437-2446.

88. Vinckier A., Heyvaert I., Dhoore A., McKittrick Т., Vanhaesendonck C., Engelborghs Y., Hellemans L. Immobilizing and imaging microtubules by atomic force microscopy // Ultramicroscopy. 1995. - V. 57. - P. 337-343.

89. Mattson G., Conklin E., Desai S., Nielander G., Savage M.D., Morgensen S. A practical approach to crosslinking // Mol. Biol. Reports. -1993.-V. 17.-P. 167-183.

90. Christopherson C., Kidane Y., Conway В., Krowka J., Sheppard H., Kwok S. PCR-Based Assay To Quantify Human Immunodeficiency Virusit t

91. Type 1 DNA in Peripheral Blood Mononuclear Cells // J. Clin. Microbiol. -2000. V. 38(2). - P. 630-634.

92. Остерман JI.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // М.: Наука.- 1985.-536 С.

93. Hermanson G.T. Bioconjugate Technniques // Academic Press. -1996.-785 P.

94. Methods Guide for IAsys Plus and IAsys Auto+// Affinity sensors . -1996.

95. Zweig M.H., Campbell G. ROC Plots: A Fundamental Evaluation Tool in Clinical Medicine // Clin. Chem. 1993. - V. 39(4). - P. 561-577.

96. Hanley J. A., McNeil В J. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve // Radiology. 1982. - V. 143(1).-P. 29-36.

97. Bukh J., Purcell R.H., Miller N.H. Sequence analysis of the.core gene of 14 hepatitis С virus genotypes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91.-P. 8239-8243. >