Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование атомно-силовой микроскопии для определения белков в сверхнизких концентрациях

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование атомно-силовой микроскопии для определения белков в сверхнизких концентрациях"

На правах рукописи

/СйЦ/

Шумов Иван Дмитриевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В СВЕРХНИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ

03.01.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 1 ноя 2013

Москва-2013

005539415

005539415

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Иванов Юрий Дмитриевич

Официальные оппоненты: Соколов Николай Николаевич

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, заведующий лабораторией

Рубцова Майя Юрьевна

кандидат химических наук, доцент, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, химический факультет, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится «12» декабря 2013г. в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН

Автореферат разослан « » ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Согласно оценкам, в плазме крови человека может содержаться порядка 5 млн [Snyder, 2011] типов белков, основной вклад в которые вносят низкокопийные белки с концентрацией ниже 10'15 М. Эти белки могут являться потенциальными маркерами различных патологических состояний человека, в том числе социально значимых заболеваний, таких, как ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009], онкологические заболевания [Dexlin-Melby et al., 2011; Rissin et al., 2010]. Некоторые из этих белков уже используются как онкомаркеры для диагностики. На ранних стадиях развития этих заболеваний белки-маркеры присутствуют в крови в концентрациях ниже 10~'2М. В [Rissin et al., 2010] приведены оценки, согласно которым для диагностики онкологических [Dexlin-Melby et al., 2011] и ранних стадий вирусных заболеваний (ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009]) концентрационный предел обнаружения (DL) диагностических методов также должен быть ниже 10"15 М. Стандартные диагностикумы, базирующиеся на методе иммуноферментного анализа (ИФА), не позволяют регистрировать белки при концентрации ниже 10"13М [Archakov et al., 2009]. Очевидно, что такой чувствительности недостаточно для обнаружения низкокопийных белков-маркеров, концентрация которых в крови ниже 10"12 М.

В последнее время были разработаны молекулярные детекторы, обладающие высокой чувствительностью и позволяющие исследовать свойства единичных молекул белков. Такая высокая чувствительность молекулярных детекторов достигается за счет малого размера чувствительного элемента, сопоставимого с размером белковых молекул. Среди этих детекторов можно выделить электрические детекторы на основе нанопроволок (НП-детекторы) [Ivanov et al., 2012; Vu et al., 2012; Tian et al., 2011; Stem et al., 2007; Zheng et al., 2005] и наномеханические на основе атомно-силового микроскопа (АСМ-детекторы) [Ivanov et al., 2013; Archakov et al., 2009; Huff et al., 2004]. В НП-детекторах в качестве чувствительного элемента выступает нанопроволока из полупроводникового материала, ширина которой составляет 10-100 нм. Белковые молекулы, адсорбирующиеся в процессе анализа на поверхность НП, через которую протекает электрический ток, модулируют проводимость нанопроволоки. Регистрация белковых молекул происходит путем измерения изменения токового сигнала от НП. НП-детекторы позволяют избирательно определять белки при их концентрациях 10"'4 - 10"16 М в растворах и до 10~14 М в

сыворотке крови в реальном времени без использования меток. Тем не менее, проблемы, связанные с сильным влиянием неспецифического связывания нецелевых белков с поверхностью НП и нестабильность характеристик НП в настоящее время существенно ограничивают применение НП-детекторов.

АСМ-детекторы принципиально позволяют регистрировать и визуализировать единичные молекулы белков с субнанометровым разрешением в режиме их счета и проводить измерение размеров и различных физико-химических свойств этих молекул. Принцип действия АСМ-детектора основан на мониторинге сил взаимодействия зонда АСМ с поверхностью подложки и иммобилизованными на ней молекулами. Возможность регистрации единичных молекул белков с помощью АСМ достигается за счет того, что зонд АСМ имеет размер порядка 1 - 10 нм, что сопоставимо с размером белковой молекулы. Поэтому метод АСМ обладает несомненным преимуществом в качестве молекулярного детектора белков.

В протеомных аналитических системах в большинстве случаев используется технология фишинга, при использовании которой молекулы аналита переходят из большого объема анализируемого образца на небольшую поверхность аналитического чипа за счет связывания с этой поверхностью. При этом, как правило, используется обратимое связывание, когда иммобилизованные на поверхности чипа молекулы-зонды обратимо связывают молекулы аналита [Archakov et al., 2009]. При этом чувствительность определения белков при обратимом характере связывания ограничивается значением константы диссоциации комплексов аналита с молекулами-зондами на поверхности чипа (Kd) [Archakov et al., 2009]. В случае использования метода химического АСМ-фишинга молекулы аналита вылавливаются из раствора не на молекулы-зонды, а непосредственно на поверхность химически активированной зоны, которая занимает небольшую часть поверхности АСМ-чипа, и необратимо (ковалентно) связываются с этой поверхностью. При этом дополнительная стадия сенсибилизации поверхности чипа путем иммобилизации на ней молекул-зондов не требуется. В отличие от биоспецифического связывания, в случае химического фишинга максимальное количество центров связывания аналита ограничивается лишь количеством химических групп на поверхности чипа, доступных для химической активации. Ковалентный характер связывания молекул аналита в активированной зоне АСМ-чипа позволяет снять ограничение предела обнаружения определения белков, обусловленное влиянием диссоциации комплексов аналита с молекулами-зондами.

Комбинация метода ACM с методом фишинга позволяет сочетать преимущества двух методов. Разработка комбинированного метода регистрации белка с пределом обнаружения ниже является актуальным направлением

исследований, направленных на создание аналитических систем для протеомики и медицинской диагностики.

Целью настоящей работы является создание высокочувствительного метода регистрации низкокопийных белков на базе АСМ-детектора.

Для достижения поставленной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработка схемы метода химического АСМ-фишинга и подбор экспериментальных условий его реализации.

2. Экспериментальная реализация метода химического фишинга и обнаружение белков в растворах с концентрациями от 10"9 М до 10"17 М.

3. Создание теоретической модели для описания процесса химического фишинга белков при сверхнизких концентрациях.

4. Теоретический анализ параметров фишинга, определяющих концентрационный предел обнаружения белков с помощью предложенного подхода.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод химического АСМ-фишинга позволяет регистрировать белки при сверхнизких концентрациях с пределом обнаружения 10"17М без использования биоспецифических зондов и меток.

2. Метод химического АСМ-фишинга позволяет проводить регистрацию белков при сверхнизких концентрациях за время не более 3 часов.

3. Разработанная трехмерная модель, учитывающая пространственное движение жидкости в условиях принудительного перемешивания, позволяет описать процесс химического фишинга белков при сверхнизких концентрациях.

Научная новизна. Разработан метод химического АСМ-фишинга белков. Для реализации этого метода разработаны АСМ-чипы, на атомарно ровной поверхности которых формируется химически активированная зона малой площади. Неровность поверхности чипа после химической активации составляет ~1 нм, поэтому выловленные белки успешно регистрируются методом АСМ на такой поверхности в режиме их счета. Показано, что химический АСМ-фишинг

может быть использован для регистрации белков в растворе при сверхнизких концентрациях. Предложена теоретическая трехмерная модель, описывающая процесс АСМ-фишинга низкокопийных белков на АСМ-чип. С помощью этой модели показано, что белок может быть зарегистрирован методом химического АСМ-фишинга в растворе при концентрации 10'17М без предварительного концентрирования образца и без использования дополнительных меток.

Научно-практическая значимость работы. Предложенная теоретическая модель позволяет определить значения основных параметров, влияющих на чувствительность метода химического АСМ-фишинга. Результаты теоретического моделирования позволят в дальнейшем определять параметры фишинга на стадии планирования эксперимента. Разработанный метод химического АСМ-фишинга может являться основой для создания сверхвысокочувствительных аналитических систем для протеомики.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VIII Национальной конференции «Рентгеновское, синхотронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (Москва, 2011), Одиннадцатом ежегодном международном конгрессе Организации «Протеом человека» (США, Бостон, 2012), 55-й Научной конференции МФТИ (Москва, 2012), Пятом Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз Россия 2012» (Тверь, 2012), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013), весеннем финале конкурса «УМНИК» РАН (Москва, 2013).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из которых 2 статьи в ведущих журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных и теоретических исследований и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 18 схем и рисунков. Библиографический список включает 182 источника, из них 20 источников отечественной литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методики исследования

Химически активированная зона на поверхности АСМ-чипа формируется путем модификации малого по площади участка этой поверхности химическим агентом - бифункциональным кросслинкером. Одна из двух активных групп кросслинкера связывается с поверхностью чипа в процессе активации, другая активная группа кросслинкера реагирует с молекулой белка в процессе фишинга. Таким образом, в результате белковая молекула оказывается ковалентно связанной с активированной поверхностью АСМ-чипа и может быть зарегистрирована методом АСМ. Данные АСМ-сканирования автоматически обрабатываются. В результате обработки АСМ-изображений выводятся данные о количестве зарегистрированных объектов, приходящихся на единицу площади сканирования. Далее эти данные могут быть экстраполированы на всю поверхность активированной зоны.

Использованные реактивы.

Для химической активации поверхности АСМ-чипа использовались бифункциональные кросслинкеры: дисукцинимидилкарбонат (DSC) ("Sigma", США), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP) ("Pierce", США). В экспериментах использовались высокоочищенные белки ("Sigma"): авидин яичного белка и пероксидаза хрена (ПХ). Прочие реактивы: Диметилсульфоксид (ДМСО), калия дигидрофосфат ("Sigma"), калия гидроокись, этанол ("Реахим", Россия), эмульген 913 ("KaoAtlas", Япония). В качестве подложки для АСМ-чипа использовалась слюда ("SPI", США). Деионизованная вода, использованная в работе, была очищена при помощи установки Millipore Simplicity UV (Франция), снабженной фильтром тонкой очистки с диаметром пор 1 нм. Все буферные растворы, органические растворители и вода, использованные в экспериментах, не содержали частиц размером более 1 нм, что контролировалось с использованием АСМ. Эксперименты выполнены в чистых помещениях класса "С" с 20-кратным воздухообменом. Степень очистки воздуха в этих помещениях составляет 99,99%, что достигается за счет использования НЕРА-фильтров. Содержание частиц в воздухе помещений класса "С" не превышает 3,5x105 частиц/1 м3 для частиц размером более 0,5 мкм и 2000 частиц/1 м3 для частиц размером более 5 мкм.

Методика подготовки АСМ-чипов для химического АСМ-фишинга. Для

изготовления АСМ-чипов, используемых для фишинга белков, в настоящей работе использовалась слюда сорта мусковит, модифицированная 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) в соответствии с [Иванов и др., 2009]. Площадь АСМ-чипов, использованных в экспериментах, составляла 112,5 мм2 (7,5x15 мм).

Активированная зона формировалась путем модификации небольшого (площадью 5=0,4 мм2) участка аминосиланизированной поверхности АСМ-чипа кросс-линкером, в результате которой на поверхности активированной зоны образовывались сукцинимидные группы, способные связывать белок [Hermanson, 2008]. В случае фишинга авидина в качестве кросс-линкера использовался дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), в случае фишинга ПХ - дисукцинимидилкарбонат (DSC).

Для создания на поверхности АСМ-чипа активированной зоны готовили 1,2 мМ сток-раствор кросс-линкера в смеси ДМСО:ЕЮН (1:1). Сток-раствор смешивали с 50 мМ фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) (pH 7,4) в соотношении 1:1. Капля полученного раствора немедленно наносилась на поверхность АСМ-чипа, после чего чип выдерживался 10 минут при комнатной температуре во влажной камере. После завершения этого процесса производилась однократная отмывка АСМ-чипа в 1 мл 50% этанола в течение 10 мин. Далее АСМ-чип высушивался в потоке сухого азота и немедленно использовался для фишинга белка.

Необратимый химический фишинг очищенных белков на АСМ-чипы при концентрациях от 10"9 M до 10"15 М. Процедура АСМ-химического фишинга белков на поверхность активированной зоны АСМ-чипов базируется на вылавливании молекул белков из анализируемого раствора на поверхность АСМ-чипа с последующим концентрированием этих молекул в маленькой химически активированной зоне на этой поверхности [Ivanov et al., 2013].

В качестве модельных белков для проведения необратимого АСМ-фишинга были выбраны два различных по физико-химическим свойствам белка: авидин и пероксидаза хрена (ПХ), так как эти белки хорошо изучены и описаны в литературе [Green, 1963, 1975; Shannon et al., 1966; Davies et al., 1981; Veitch, 2004]. АСМ-чип с активированной раствором кросслинкера зоной инкубировали в растворе очищенного белка (авидина или ПХ) во вращающейся полипропиленовой кювете при следующих условиях: объем раствора белка V=\ мл; концентрация раствора (С0) от 10"9 до 10"15 М; температура инкубации

25°С; время инкубации (t) от 20 до 180 мин; частота вращения кюветы 900 об/мин; диаметр кюветы 9 мм. Минимальное значение времени инкубации обусловлено тем, что при времени инкубации менее 20 мин количество зарегистрированных частиц было сравнимо с величиной относительной погрешности определения числа выловленных белков. Максимальное время инкубации (180 мин) обусловлено ограничением, связанным с протеканием в процессе инкубации побочной реакции гидролиза сукцинимидных групп на поверхности активированной зоны АСМ-чипа [Mattson et al., 1993].

Необратимый химический фишииг очищенного белка ПХ на АСМ-чипы при концентрации 10"17 М. Фишинг ПХ из раствора с концентрацией Со=10*17М проводился в два этапа. На первом этапе исследуемый раствор (Г=500 мл) высушивали с помощью лиофильной сушки (Christ Alpha 1-4 LSC, Германия). Далее лиофилизованный образец переводили в объем К =50 мл. Таким образом, анализируемый раствор белка был сконцентрирован до Co*=10"16M. На втором этапе АСМ-чипы с активированной зоной инкубировались в 50 мл этого концентрированного раствора белка в течение t=3 ч во вращающейся с частотой 750 об/мин кювете.

После завершения инкубации в растворе белка проводилась отмывка поверхности АСМ-чипа в 1 мл 0,01% раствора Emuigen 913 в течение 10 мин при 40°С. Далее следовала трехкратная отмывка в 1 мл деионизованной воды в течение 15 мин при 25°С и сушка АСМ-чипа на воздухе при комнатной температуре. Контрольные эксперименты проводили по. процедуре, описанной выше, но для инкубации использовали раствор, не содержащий белок.

Получение АСМ-изображений. АСМ-визуализация исследуемых объектов проводилась с помощью атомно-силовых микроскопов Dimension 3100 (Veeco, США) и NTEGRA Prima (NT-MDT, Россия) с использованием кантилеверов NSG 10 с золотым отражающим слоем, имеющие радиус кривизны 10 нм, константу жесткости 5,5 - 22,5 Н/м, резонансную частоту 190 - 325 кГц. АСМ-сканирование производилось на воздухе в прерывисто-контактном режиме. Число сканов в каждой зоне было не менее 16 при размере каждого скана 5x5 мкм с разрешением 256x256 точек (шаг сканирования 20 нм, частота сканирования 1,2 Гц). Таким образом, общая площадь сканирования составляла не менее Ssai„=400 мкм2.

Обработка АСМ-изображений производилась при помощи программного обеспечения обработки данных АСМ (ПО одАСМ, Роспатент, per. номер №2010613458, 26 мая 2010), разработанного в ИБМХ РАМН. Это ПО выделяет

объекты на импортированном АСМ-изображении в соответствии с заданным пользователем диапазоном высот объектов, подсчитывает число этих объектов и ранжирует их по высотам. Высота регистрируемых объектов служила основным критерием размеров белков. Высоты белковых молекул определялись как высоты соответствующих максимумов распределения их изображений по размерам:

p(h)= ЛУ^'МООУО, где N™ — число визуализированных объектов, имеющих высоту h, N — общее число визуализированных объектов. Статистическая обработка полученных данных для построения распределений частиц по размерам производилась при помощи ПО Microsoft Excel 2007.

Сканирование АСМ-чипов в контрольных экспериментах показало, что содержание неспецифических объектов с высотой h> 1 нм в активированной зоне не превышало Nfa'=500 объектов/400 мкм2. Аналогичные результаты (N/"'=500 объектов/400 мкм2) были получены при сканировании контрольных зон АСМ-чипов, в качестве которых были использованы участки неактивированной поверхности АСМ-чипов. Каждое измерение проводили не менее трех раз. Валидацию метода АСМ-фишинга проводили путем масс-спектрометрического анализа объектов, выловленных на поверхность активированной зоны АСМ-чипа.

Теоретическое моделирование процесса химического АСМ-фишинга. Химический фишинг модельных белков из растворов на поверхность АСМ-чипов проводился при интенсивном перемешивании с целью интенсификации процесса.

Для теоретического описания процесса химического АСМ-фишинга белковых молекул на поверхность активированной зоны АСМ-чипа использовалась численная модель на основе системы уравнений Навье - Стокса, позволяющая учитывать влияние структуры гидродинамических потоков на скорость доставки молекул белка к поверхности чипа, включающая следующие уравнения:

1. Уравнение неразрывности потока [Лойцянский, 1978]: др(их-и,) | dp(uy-uv) | дри2 _0 дх ду dz '

где р - плотность раствора белка, принятая равной 1000 кг/м3; их, иу, о,— проекции скорости и потока жидкости на координатные оси х, у, z; их, и у-

проекции вектора скорости и , связанной с вращением кюветы, на координатные осих и у.

2. Уравнение переноса белковых молекул [Даничев и др., 2006; Патанкар, 1984]:

+ div[pC(u - г/)] - dh{pDcJJ gradC] = 0,

где С - концентрация раствора белка; t - время инкубации; Д,/у - эффективный коэффициент диффузии белка, определяемый по формуле Defj=D + D,. Здесь D-коэффициент молекулярной диффузии белка в растворе, D, - коэффициент турбулентной диффузии. Этот коэффициент при расчетах был принят численно равным турбулентной вязкости из следующих соображений. В условиях эксперимента (кинематическая вязкость раствора v=10"6 м2/с, скорость перемешивания (а) 900 и 750 об/мин) значение числа Рейнольдса для системы, определяемое из соотношения Ke=nd2/v [Wu, Patterson, 1989; Danichev et al., 2005], составило Re=1300 и Re=8000 для кювет с диаметром d=9 мм (для кюветы объемом 1 мл) и d=ll мм (для кюветы объемом 50 мл) соответственно. При таких значениях числа Рейнольдса величина турбулентной вязкости среды v, в системе сравнима с величиной кинематической вязкости v [Лапин и др., 2004]. Так как коэффициент турбулентной диффузии и турбулентная вязкость являются величинами одного порядка [Левич, 1959], значение D, было принято равным D,~~v,~\О"6 м2/с.

3. Уравнения Эйлера-Стокса (аналогично [Даничев и др., 2006]):

дриг dp{u-ux)v^ др{р -и )vx dpv v. ,. , _ . дР

н—-^-^н-------v =div{/Nux)--;

dt дх ду dz дх

дриу | др(ох-их)оу | др(иу-иу)иу | 8poyuz )-—;

dt дх ду dz " ду

dpvz | dp{v,-ux)v: { dp(py -иу)и: | dpul ) дР^

dt дх ду dz dz

где Р - поле давления потока в рассматриваемой точке; ¡1 - динамическая вязкость раствора белка, принятая равной 10"3 кг/(м * с).

4. Уравнение сохранения числа белковых молекул, составленное на основе уравнения, приведенного в [Пригожин, 1966]:

Ns(t) = NA[C0V-\C{t)dV],

г

где С0 - начальная концентрация раствора аналита; NA - число Авогадро, A',i=6,02xl023 моль"1; V - объем раствора белка.

При построении модели необратимого АСМ-фишинга были приняты следующие допущения: связывание молекулы белка с поверхностью активированной зоны АСМ-чипа происходит необратимо; молекулы белка не связываются со стенками кюветы; отсутствует энергетический барьер химической реакции необратимого ковалентного связывания белка с активными группами поверхности в активированной зоне АСМ-чипа; в связи с низкой концентрацией раствора его вязкость не меняется с уменьшением количества белка в процессе фишинга. Для моделирования процесса АСМ-НФЛи белка система уравнений Навье-Стокса была решена со следующими граничными условиями: конвективная составляющая скорости потока на всех твердых поверхностях, включая стенки кюветы, равна нулю: и — и= 0 (¿7 - скорость движения стенок кюветы); в соответствии с принятыми допущениями молекулы белка не связываются со стенками кюветы и с поверхностью АСМ-чипа за

дС .

исключением активированном зоны: — = 0; в приповерхностном слое

дп

активированной зоны АСМ-чипа выловленные молекулы не мешают вылавливанию следующих: С = 0.

При этом также было введено начальное условие: С(/ = 0) = С0

При построении модели биоспецифического АСМ-фишинга (АСМ-НФК) были приняты те же допущения, что и в случае АСМ-НФхки, за исключением допущения о характере связывания белка в рабочей (активированной) зоне. В случае АСМ-НФ5С было принято, что связывание молекул белка с поверхностью рабочей зоны АСМ-чипа происходит необратимо, причем скорость связывания определяется локальной константой к.

При моделировании процесса АСМ-НФгс белка граничное условие для

рабочей зоны АСМ-чипа имело вид: Э— = кС, где к - локальная реакционная

дп

способность рабочей зоны АСМ-чипа, определяемая как /с=копС$. В последнем соотношении коп - константа скорости образования комплекса вылавливаемого белка с иммобилизованной на поверхности рабочей зоны молекулой-зондом, м3/с; С$ - плотность иммобилизации молекул-зондов на поверхности рабочей зоны АСМ-чипа, то есть число молекул-зондов, приходящееся на единицу площади поверхности рабочей зоны (1/м2).

Расчетные параметры моделируемых систем приведены в таблице 1.

№ п.п. Объем кюветы V, мл Диаметр кюветы (1, мм Высота кюветы, мм Частота вращения кюветы, об/мин Площадь активированной зоны чипа Число узлов сетки Число конечных элементов

1 1 9 16 900 0,4 мм2 3570 2848

2 50 27,1 86 750 0,4 мм2 6990 6088

3 1 9 16 900 1000 мкм2 3570 2848

4 50 27,1 86 750 1000 мкм2 16010 14480

5 10 14 63,18 750 104 мкм2 13830 12568

'Размеры АСМ-чипа в случаях 1-4 были одинаковы и составляли 7,5x15x0,25 мм, площадь наибольшей грани чипа составляла £„<,.,„= 112,5 мм2. В случае 5 размеры чипа были 7x15x0,25 мм.

Дискретизация моделируемой области производилась с помощью контрольных объемов, полученных на основе конечно-элементного разбиения [Патанкар 1984]. Одним из важных свойств метода контрольного объема является то, что в нем заложено точное интегральное сохранение таких величин, как масса, количество движения и энергия на любой группе контрольных объемов и, следовательно, на всей расчетной области. Это свойство проявляется при любом числе узловых точек, а не только в предельном случае очень большого их числа. Таким образом, даже решение на грубой сетке удовлетворяет точным интегральным балансам.

По предложенной модели проведены расчеты числа молекул, необратимо выловленных на поверхность активированной зоны при АСМ-НФ^,,, в зависимости от времени инкубации при параметрах: начальная концентрация белка от 10"9 до 10"17М, максимальное время фишинга (=3 ч, объем раствора образца К=1 мл и 50 мл. При расчетах скорость вращения измерительной кюветы, принималась 900 об/мин или 750 об/мин в случае фишинга из 1 мл или 10 и 50 мл соответственно (таблица 1).

Общая площадь чипа при расчетах соответствовала экспериментальной и составляла 112,5 мм2 (7,5x15 мм). Площадь активированной зоны 15=0,4 мм2 чипа также соответствовала экспериментальной. Выбор для расчетов площади активированной зоны 5=1000 мкм2 обусловлен тем, что это минимальное значение, которое можно получить с использованием робота ВюГогсе ЫапоАггауег ("ВюГогсе Капозиепсев", США). Выбор для расчетов параметра

величины объема 50 мл определяется тем, что такой объем биоматериала обычно используется для проведения АСМ-фишинга в случае анализа белков с концентрацией С0 < 10~16 М.

Расчеты проведены с использованием пакета ОШЯ-ЗМ (атт. пасп. №271 Ростехнадзора ФГУ НТЦ по ЯРБ от 18.02.2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Необратимый АСМ-фишинг очищенных белков.

(А) (Б)

(Г)

Рис.1. АСМ-изображения поверхности АСМ-чипа после инкубации в растворе авидина при различных значениях времени инкубации (/) и концентраций раствора белка (Со): (А) /=10 мин, Q=10"9M, (Б) /=60 мин, Со=10"9М; (В) /=20 мин, Со=10-'3М, (Г) /=60 мин, Со=10"'3М (Г). Экспериментальные условия: объем раствора V=\ мл, площадь активированной зоны 5=0,4 мм2, площадь скана 25 мкм2.

При проведении АСМ-измерений с использованием зондов с радиусом кривизны ~10 нм обычно наблюдается некоторое увеличение латеральных размеров АСМ-изображений при неизменной величине их высоты. Это может быть связано с латеральным уширением при измерении стандартным АСМ-зондом, а также с возможным влиянием погрешности, обусловленной влиянием поверхности на агрегацию белка [Kim, Yoon, 2002]. Отсутствие информации о

I!

конкретном вкладе этих явлений в увеличение латеральных размеров объектов не позволяло использовать эту информацию в оценке количества белка. Поэтому использовался общепринятый критерий оценки размеров белка на основании величин высот изображений. На рисунке 1 (А - Г) представлены полученные АСМ-изображения чипа после инкубации в растворе авидина при концентрациях (С0) 10"9 и 10"13М.

При анализе полученных АСМ-изображений молекул авидина путем подсчета числа зарегистрированных объектов при помощи ПО одАСМ было обнаружено, что количество зарегистрированных объектов остается на одном уровне с увеличением времени инкубации для всего исследуемого диапазона концентраций авидина, что свидетельствует о достижении насыщения поверхности активированной зоны выловленными молекулами белка за время ¿<1 часа. Количество авидина, выловленного из 1мл раствора с Св=10~9М, достигает максимального значения ~2х104 молекул/400мкм2 (400 мкм2 -площадь АСМ-сканирования). Было также обнаружено, что с понижением концентрации раствора аналита изменяется характер распределения АСМ-зарегистрированных объектов по высотам. На рисунке 2 представлены распределения по высотам р(к) АСМ-изображений молекул авидина, выловленных в процессе АСМ-НФЛ„, при С0 10"9 и 10"ЬМ.

Высота, нм

Рис. 2. Распределение р(к) АСМ-изображений выловленных молекул авидина по высотам при различных концентрациях белка в растворе (Со). Экспериментальные условия: Со=10"9М (■) и Со=10"13 М ( •), объем раствора У= 1мл, площадь активированной зоны 5=0,4 мм2.

Из рисунка 2 видно, что в случае фишинга белка из раствора с Со=10"9М молекулы имели характеристическую высоту, соответствующую максимуму плотности распределения по высотам с величиной /гт(и=1,8±0,1 нм. Эти результаты хорошо согласуются со значениями высот других белков со сходной молекулярной массой, таких, как d-b5 (M,.=50 кДа [Calabro et al., 1976]; /W=l,8±0,l нм [Kuznetsov et al, 2004]) и d-Fp (M,=78 кДа; hmax=2,3 ± 0,2 нм [Kuznetsov et al., 2004]). Из рисунка 2 также видно, что при уменьшении С0 до 10"13М высота выловленных объектов становится меньше, hmax= 1,2±0,1 нм. Полученные данные можно объяснить следующим образом. Известно, что в растворе авидин является тетрамером с молекулярной массой Мг=68 кДа [Green, 1963, 1975]. При снижении начальной концентрации раствора аналита часть тетрамеров авидина диссоциирует за счет смещения динамического равновесия в сторону образования мономеров. Поэтому характеристическая высота полученных АСМ-изображений также уменьшается. Таким образом, корректный эксперимент по подсчету частиц, выловленных на АСМ-чип, в случае анализа растворов авидина может проводиться в диапазоне объемных концентраций только при С0>Ю"иМ. АСМ-НФ^ белка в диапазоне более низких концентраций следует проводить с использованием белка, существующего в растворе в виде мономеров.

При С0 в диапазоне от 10"13 M до 10"17 M в экспериментах был использован другой белок, а именно ПХ, так как этот белок в растворе существует только в виде мономера [Haifeng et al., 2008]. На рисунке 3 представлена зависимость плотности распределения АСМ-изображений выловленных молекул ПХ по высотам p(h) для случаев фишинга ПХ при С0=Ю~13 и 10"15 М.

Из рисунка 3 видно, что максимум распределения р(И) не зависит от начальной концентрации раствора ПХ в диапазоне С0 от 10"13 M до 10"17М и составляет (1,6±0,1)нм. Полученное значение несколько ниже размера молекулы белка ПХ, приведенного в [Davies et al., 1981; Ayasaka et al., 1989], что, по-видимому, связано с деформацией молекул белка под действием зонда. В то же время, данное значение высоты молекулы ПХ (Мг=44 кДа [Haifeng et al., 2008]) хорошо согласуется с величинами высот молекул мономеров других, сходных по молекулярной массе белков (CYP450 11А1, hmax= 1,6±0,2нм, Мг=46 кДа [Haniu et al., 1982]; адренодоксинредуктаза, hmax= 1,8 ± 0,2 нм [Ivanov et al., 2011], Mr=54 кДа [Chu and Kimura 1973]; путидаредоксинредуктаза, h„,ax= 1,8 ± 0,2 нм [Kuznetsov et al., 2002] , Mr=45,6 кДа [Unger et al., 1986]).

Высота, нм

Рис. 3. Распределение p(h) АСМ-изображений выловленных молекул ПХ по высотам при различных концентрациях белка в растворе (Со). Экспериментальные условия: Со=10"|3М (■) и Со=10"15 М ( • ), объем раствора V—1 мл, площадь активной зоны S=0,4 мм2.

При фишинге ПХ было обнаружено, что с уменьшением концентрации раствора аналита число зарегистрированных объектов уменьшается. На рисунке 4 представлены АСМ-изображения чипа после инкубации в растворе ПХ при С0=Ю~13 М и временах инкубации (/) 1, 2 и 3 ч.

Обработка полученных АСМ-изображений путем подсчета числа зарегистрированных объектов при помощи ПО одАСМ показала, что с увеличением времени инкубации от 1 до 3 часов число выловленных объектов в пределах погрешности не изменяется. В случае химического фишинга ПХ из 1 мл раствора с Со=10"'3 М максимальное количество зарегистрированных молекул белка составляет ~4х103 молекул/400 мкм2. Это значение определяло емкость чипа для молекул ПХ. Расхождение в насыщении поверхности АСМ-чипа для молекул двух типов белков, авидина и ПХ, по-видимому, обусловлено различной эффективностью ковалентного связывания молекул с поверхностью АСМ-чипа при одинаковых экспериментальных условиях в связи с их различным зарядовым состоянием, определяемым pl белков. Эта величина составляет: pl (авидина) =10,5 [Green 1963] и pl (ПХ)=7,2 [Xialing et al., 2009]. Было получено, что в случае фишинга ПХ из объема 1 мл при количество зарегистрированных белка составляло ~103 молекул/400 мкм2, то есть с понижением концентрации ПХ количество выловленных молекул уменьшается.

(Б)

Рис.4. АСМ-изображения поверхности АСМ-чипа после

инкубации в растворе ПХ при различных значениях времени инкубации (?). (А) / = 1 ч, (Б) г = 2 ч и (В) / = 3 ч. Экспериментальные условия: начальная концентрация ПХ

Со = 10"13 М, объем раствора V = 1 мл, площадь активированной зоны 5 = 0,4 мм2, площадь скана 25 мкм2

При АСМ-НФЛ-Ш, из I мл раствора ПХ с С0=Ю~17М, сконцентрированного до 10""5 М, не удалось зарегистрировать белок, при пороге чувствительности АСМ-детектирования (шуме АСМ-детектирования) 500 частиц/400 мкм2, так как количество белка, выловленного при АСМ-фишинге, должно быть прямо пропорционально объему раствора аналита [АгсИакоу е1 а1., 2007, 2009], что подтверждается теоретическими расчетами. Действительно, в результате фишинга ПХ из 500 мл раствора аналита с Со=10"17М, сконцентрированного методом лиофильной сушки до 10"1бМ, при времени инкубации (I) 3 ч, на площади 400 мкм2 было зарегистрировано -2600 молекул. При этом среднее количество объектов, зарегистрированных на поверхности контрольных зон, составляло также 500 частиц/400 мкм2. АСМ-изображения участков активированной и контрольной зон после фишинга ПХ из 50 мл сконцентрированного до 10~16 М раствора представлены на рисунке 5.

На рисунке 6 приведены расчетные зависимости числа выловленных молекул на поверхность активированной зоны АСМ-чипа от времени инкубации при различных концентрациях раствора аналита. Теоретические расчеты

показали, что количество выловленных молекул возрастает с увеличением концентрации белка.

(А) (Б)

Рис. 5. АСМ-изображения поверхности АСМ-чипа после инкубации в растворе ПХ. (А) — рабочая зона АСМ-чипа, (Б) — контрольная зона АСМ-чипа. Начальная концентрация раствора белка С0 = 10"17М, начальный объем V = 500 мл; раствор сконцентрирован до Со = 10"'бМ лиофилизацией до конечного объема раствора для фишинга 50 мл. Экспериментальные условия: площадь активированной зоны 5 = 0,4 мм2, время инкубации ( = 3ч, площадь скана 25 мкм2.

Таким образом, использование метода химического АСМ-фишинга позволяет регистрировать белок при концентрации £>1,=10"17М.

Следует отметить, что, по данным расчетов зависимости числа выловленных молекул от времени инкубации, подробно описанных в [1уапоу ег а1., 2013], при объеме раствора аналита У= 1 мл, более 90% белковых молекул вылавливается на начальном этапе фишинга, за время менее 1 ч после начала фишинга (£=1000 с=17 мин), по прошествии которого число выловленных молекул изменяется незначительно. Как показали экспериментальные данные, зарегистрированное число выловленных белковых молекул мало изменяется в течение промежутка времени инкубации от 1 до 3 ч. Этот факт подтверждает вывод предложенной модели химического АСМ-фишинга о том, что время эффективного фишинга достаточно небольшое, £<1 часа.

Сравнение расчетных и экспериментальных данных для количества выловленных молекул ПХ при различных концентрациях показало, что при Со=10"13 М, С0=10"15 М и Со=10"17М, количество выловленного белка уменьшалось с уменьшением концентрации, как и показали теоретические

(А)

(Б)

Рис. 6. Расчетные зависимости числа выловленных молекул белка (ЛУ на поверхность активированной зоны АСМ-чипа от времени инкубации (/) при различных значениях концентраций раствора анапита (Со). Расчетные параметры: площадь активированной зоны 5=0,4 мм2; С„=10"|5М- 10"|7М; объем раствора У= 1 мл (А) и У=50 мл (Б). На

основном поле графиков показаны начальные участки зависимостей при /=0____1 ООО с.

На вставках показаны зависимости при /=0.... 10800 с.

расчеты. Отметим при этом, что число экспериментально зарегистрированных молекул ПХ при Со=10"13 М меньше рассчитанного. Это можно объяснить тем,

что поверхность используемого нами АСМ-чипа имеет ограниченную емкость, то есть в активированной зоне может разместиться конечное число молекул белка ^тахЕХР=4х\03 молекул/400 мкм (как было показано в эксперименте с ПХ при Со=10"13М). Поэтому при фишинге белков из раствора высокой концентрации происходит насыщение по количеству выловленных молекул на поверхности активированной зоны чипа, что и наблюдается в эксперименте для концентрации 10"13 М, как отмечалось выше.

В случае фишинга авидина при СЙ=10"13М уменьшение числа зарегистрированных выловленных молекул белка связано с уменьшением высоты их АСМ-изображений из-за диссоциации авидина при этой концентрации, в результате чего было затруднительно зарегистрировать все выловленные молекулы этого белка на площади сканирования. Результаты расчета числа выловленных молекул от времени проведения фишинга при варьировании параметра объема раствора аналита представлены на рисунке 7.

1, с

Рис. 7. Расчетные зависимости числа выловленных молекул белка Л^У^ои на поверхность активированной зоны АСМ-чипа при различных значениях объема раствора аналита (У) и концентраций раствора аналита (Со). Расчетные параметры: У= 1 мл, У=50 мл; начальная концентрация раствора белка 10"13 М , 10"15 М, 10"'7М; площадь активированной зоны 5=0,4 мкм2, площадь сканирования &«и=400 мкм2. На вставке показано увеличенное изображение начального участка зависимостей. Емкость поверхности соответствует экспериментальной, Лг/'"Ы7>=2х104 частиц/400 мкм2. Теоретически рассчитанное число выловленных молекул на площади сканирования составляет 1/1000 всех выловленных молекул.

Как видно из рисунка 7, в случае объема аналита У=\ мл на поверхность активированной зоны (площадью 5=0,4 мм2) за время фишинга /=3 ч должны вылавливаться практически все молекулы, присутствующие в растворе N¡-N3'"'. Величина при объеме раствора белка У= 1 мл составляет

6х105 молекул при Со=10"15 М и 6*103 молекул при С0=Ю"17М. Однако в случае фишинга из объема У=50 мл при тех же условиях вылавливается лишь N„=0,ббх молекул, N5"" при У= 50 мл и Со=10~17 М составляет ЗхЮ5 молекул.

Таким образом, использование большего объема раствора аналита (Г=50 мл) приводит к увеличению общего числа выловленных молекул вследствие увеличения числа молекул, присутствующих в системе [АгсЬакоу е1 а1., 2009], что и было получено в наших экспериментах.

10'

ю'

ю;

Г

и ю14 г"

ю'

-с0 = 10 М; в = 1000 мкм -С0 = 10""М; Э = 1000 мкм2 -С0 = 10"15М; Э = 0,4 мм2 -С =10"17М; 5 = 0,4 мм2

2000

4000

6000 1, С

8000

Рис.8. Расчетные зависимости числа выловленных молекул белка ¿УХ'У&им на поверхность активированной зоны АСМ-чипа при различных значениях площади активированной зоны (5) и концентраций раствора аналита (Со). Расчетные 5=0,4 мм2, 5=1000 мкм2; Со=10"|5М, Св=10"17 М; объем раствора У=1 мл, площадь сканирования 5^=400 мкм2.

На рисунке 8 представлены результаты моделирования процесса АСМ-НФхим при различных значениях площади активированной зоны. Как видно из этого рисунка, при уменьшении площади активированной зоны возрастает число молекул белка, регистрируемых детектором на площади сканирования. Так, при использовании площади активированной зоны ,5=1000 мкм2 при С0=Ю"17М на 400 мкм2 поверхности активированной зоны приходится 2400 выловленных частиц при уровне шума АСМ-регистрации N/"'=500 объектов/400 мкм2. Это

предоставляет принципиальную возможность определять белки в 1 мл раствора с концентрацией Со=10"17М без их концентрирования. Таким образом, уменьшение площади активированной зоны может использоваться для повышения чувствительности метода АСМ-фишинга.

Результаты моделирования процесса АСМ-НФяс показали, что число вылавливаемых молекул возрастает в случае перехода от биоспецифического фишинга к химическому фишингу. Низкая эффективность биоспецифического фишинга можно объяснить наличием энергетического барьера реакции биоспецифического связывания молекул аналита с молекулами-зондами, иммобилизованными на поверхности. Наличие этого барьера обусловлено действием электростатических, стерических, ориентационных и других факторов. Так, по результатам расчетов, при переходе от биоспецифического фишинга авидина с использованием молекул биотина к химическому фишингу чувствительность детекции авидина в растворе может повышаться на два порядка.

выводы

1. Разработан метод химического АСМ-фишинга, который позволяет обнаруживать белки в сверхнизких концентрациях.

2. Метод химического АСМ-фишинга позволил экспериментально зарегистрировать белок пероксидазу хрена в 10"17М растворе при объеме раствора аналита 500 мл и площади активированной зоны 0,4 мм2.

3. Время регистрации методом химического АСМ-фишинга пероксидазы хрена в диапазоне сверхнизких концентраций составляло не более 3 часов при экспериментально подобранных параметрах фишинга.

4. Создана теоретическая трехмерная модель, учитывающая влияние структуры гидродинамических потоков в условиях принудительного перемешивания на скорость доставки белковых молекул к поверхности АСМ-чипа. Эта модель корректно описывает процесс химического фишинга белков на поверхность АСМ-чипа из их растворов при сверхнизких концентрациях. Проведен теоретический анализ параметров фишинга, определяющих концентрационный предел обнаружения белка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ivanov Yu.D., Danichev V.V., Pleshakova Т.О., Shumov I.D., Ziborov V.S., Krokhin N.V., Zagumenniy M.N., Ustinov V.S., Smirnov L.P., Shironin A.V., Archakov A.I. Irreversible Chemical AFM-Based Fishing for Detection of Low-Copied Proteins. //Biochemistry (Moscow) Suppl. Series B: Biomedical Chemistry. 2013. V.7(l). P. 46-61.

2. Шумов И.Д., Иванов Ю.Д., Даничев B.B., Плешакова Т.О., Крохин Н.В., Зиборов B.C., Арчаков А.И. «Комбинация необратимого АСМ-фишинга с масс-спектрометрией для детекции низкокопийных белков». //Материалы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 19-22 марта 2013. С. 276-277.

3. Шумов И.Д. «Разработка метода АСМ-фишинга для высокочувствительного протеомного анализа». //Весенний финал «У.М.Н.И.К.» РАН. Сборник тезисов. Москва, 14 марта 2013. С. 86-88.

4. Ivanov Yu.D., Pleshakova Т.О., Kozlov A.F., Malsagova K.A., Krohin N.V., Shumyantseva V.V., Shumov I.D., Popov V.P., Naumova O.V., Fomin B.I., Nasimov D.A., Aseev A.L., Archakov A.I. SOI nanowire for the high-sensitive detection of HBsAg and a-fetoprotein. //Lab Chip. 2012. V. 12. P. 5104-5111. (Impact Factor 5.7).

5. Мальсагова K.A., Иванов Ю.Д., Плешакова Т.О., Козлов А.Ф., Крохин Н.В., Шумов И.Д., Попов В.П., Наумова О.В., Асеев A.JL, Арчаков А.И. «Нанопроводный биосенсор для высокочувствительной детекции HBsAg и alfa-фетопротеина». //Материалы Пятого Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых «Симбиоз Россия 2012». Тверь, 3-8 декабря 2012. С. 170-171.

6. Шумов И.Д., Иванов Ю.Д., Даничев В.В., Плешакова Т.О., Зиборов B.C., Арчаков А.И. «Химический АСМ-фишинг белков в сверхнизких концентрациях». //Труды 55-й научной конференции МФТИ. Нано-, био-, информационные и когнитивные технологии. Москва-Долгопрудный-Жуковский, 19-25 ноября 2012. С. 10-11.

7. Ivanov Yu.D., Shumov I.D., Archakov A.I. "Irreversible AFM-fishing for the detection of low-copied proteins". //11th Annual world congress "HUPO 2012". HUPO Congress final program. USA, Boston, September 9-14 2012. P. 287.

8. Иванов Ю.Д., Шумов И.Д., Плешакова Т.О., Крохин Н.В., Широнин A.B., Даничев В.В., Загуменный М.Н., Устинов B.C., Смирнов Л.П., Зиборов

B.C., Арчаков А.И. «Необратимый химический АСМ-фишинг для детекции низкокопийных белков». //Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва, 20-22 марта 2012. С. 205.

9. Шумов И.Д., Иванов Ю.Д., Даничев В.В., Плешакова Т.О., Зиборов B.C., Крохин Н.В., Загуменный М.Н., Устинов B.C., Смирнов Л.П., Арчаков А.И. «Необратимый АСМ-фишинг белков». //Материалы VIII Национальной конференции «Рентгеновское, синхотронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии». Москва, 14-18 ноября 2011. С. 95.

Использованные сокращения:

DL - предел обнаружения;

DSC - дисукцинимидилкарбонат;

DSP - дитиобис (сукцинимидил пропионат);

pi- изоэлектрическая точка;

АПТЭС - 3-аминопропилтриэтоксисилан;

АСМ - атомно-силовая микроскопия;

АСМ-детектор - детектор на базе атомно-силового микроскопа;

АСМ-НФ_уц„ - химический необратимый АСМ-фишинг;

АСМ-НФгс - биоспецифический необратимый АСМ-фишинг;

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека;

ДМСО -диметилсульфоксид;

ИФА - иммуноферментный анализ;

НП - нанопроволока;

ПО - программное обеспечение;

ПО одАСМ - программное обеспечение обработки данных АСМ.

ПХ - пероксидаза хрена;

ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор.

Заказ N° 13-Р/11/2013 Подписано в печать 07.11.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

(¡V ^ 000 "Дифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru ; е-тай: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шумов, Иван Дмитриевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ В.Н.ОРЕХОВИЧА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

МЕДИЦИНСКИХ НАУК

04201365327

На правах рукописи

Шумов Иван Дмитриевич

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В СВЕРХНИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ

Специальность 03.01.04. Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор Ю.Д. Иванов

Москва, 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение 4

2. Обзор литературы 9

2.1 Аналитические наносистемы в протеомике 9

2.2 Факторы, влияющие на чувствительность аналитических наносистем 10

2.3 Способы функционализации поверхности АСМ-чипов для детекции белков

19

2.4 Кинетические параметры фишинга 22

2.5 Характеристика использованных белковых объектов 33

2.6 Математические модели вылавливания белков на поверхность чипов 34

3. Методики исследования 41

3.1 Использованные реактивы 41

3.2 ACM Veeco Dimension 3100 и зондовая нанолаборатория NTEGRA 42

3.3 Получение АСМ-изображений 43

3.4 Обработка АСМ-изображений 43

3.5 Методика подготовки АСМ-чипов для химического АСМ-фишинга 44

3.6 Необратимый химический фишинг модельных белков на АСМ-чипы при концентрациях от 10~9 М до 10*15 М 49

3.7 Необратимый химический фишинг модельного белка ПХ на АСМ-чипы при концентрации 10'17 М 50

3.8 Теоретическое моделирование процесса химического АСМ-фишинга 51

4. Результаты и обсуждение 55 4.1. Результаты экспериментов по необратимому АСМ-фишингу и их обсуждение 55

4.2. Результаты моделирования процесса химического фишинга и обсуждение

65

4.3. Анализ возможностей повышения чувствительности метода АСМ-фишинга

71

4.4. Сравнение эффективности химического и биоспецифического фишинга 76

4.5. Теоретическая оценка возможности сопряжения метода химического АСМ-фишинга с масс-спектрометрией и теоретического предела обнаружения белков АСМ/МС методом 79

5. Заключение 83

6. Выводы 86

7. Финансирование работ 87

8. Использованные сокращения 88

9. Литература 90

10. Благодарности 107

1. Введение

Актуальность исследования. Согласно оценкам, в плазме крови человека может содержаться порядка 5 млн [Snyder, 2011] типов белков, основной вклад в которые вносят низкокопийные белки с концентрацией ниже 10'15 М. Эти белки могут являться потенциальными маркерами различных патологических состояний человека, в том числе социально значимых заболеваний, таких, как ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009], онкологические заболевания [Dexlin-Melby et al., 2011; Rissin et al., 2010]. Некоторые из этих белков уже используются как онкомаркеры для диагностики. На ранних стадиях развития этих заболеваний белки-маркеры присутствуют в крови в концентрациях ниже 10"12М. В [Rissin et al., 2010] приведены оценки, согласно которым для диагностики онкологических [Dexlin-Melby et al., 2011] и ранних стадий вирусных заболеваний (ВИЧ и гепатит С [Archakov et al., 2009]) концентрационный предел обнаружения (DL) диагностических методов также должен быть ниже 10",5М. Стандартные диагностикумы, базирующиеся на методе иммуноферментного анализа (ИФА), не позволяют регистрировать белки при концентрации ниже 10"13М [Archakov et al., 2009]. Очевидно, что такой чувствительности недостаточно для обнаружения низкокопийных белков-маркеров, концентрация которых в крови ниже 10"12 М.

В последнее время были разработаны молекулярные детекторы, обладающие высокой чувствительностью и позволяющие исследовать свойства единичных молекул белков. Такая высокая чувствительность молекулярных детекторов достигается за счет малого размера чувствительного элемента, сопоставимого с размером белковых молекул. Среди этих детекторов можно выделить электрические детекторы на основе нанопроволок (НП-детекторы) [Ivanov et al., 2012; Vu et al., 2012; Tian et al., 2011; Stern et al., 2007; Zheng et al., 2005] и наномеханические на основе атомно-силового микроскопа (АСМ-детекторы) [Ivanov et al., 2013; Archakov et al., 2009; Ramanaviciene et al., 2006; Huff et al., 2004]. В НП-детекторах в качестве чувствительного элемента выступает нанопроволока из полупроводникового материала, ширина которой составляет 10100 нм. Белковые молекулы, адсорбирующиеся в процессе анализа на поверхность НП, через которую протекает электрический ток, модулируют проводимость

нанопроволоки. Регистрация белковых молекул происходит путем измерения

4

изменения токового сигнала от НП. НП-детекторы позволяют избирательно регистрировать белки при их концентрациях 10"14 - 10"16 М в растворах и до 10"14 М в сыворотке крови в реальном времени без использования меток. Тем не менее, проблемы, связанные с сильным влиянием неспецифического связывания нецелевых белков с поверхностью НП и нестабильность характеристик НП в настоящее время существенно ограничивают применение НП-детекторов.

АСМ-детекторы принципиально позволяют регистрировать и визуализировать единичные молекулы белков с субнанометровым разрешением в режиме их счета и проводить измерение размеров и различных физико-химических свойств этих молекул. Принцип действия АСМ-детектора основан на мониторинге сил взаимодействия зонда АСМ с поверхностью подложки и иммобилизованными на ней молекулами. Возможность регистрации единичных молекул белков с помощью АСМ достигается за счет того, что зонд АСМ имеет размер порядка 1-10 нм, что сопоставимо с размером белковой молекулы. Поэтому метод АСМ обладает несомненным преимуществом в качестве молекулярного детектора белков.

В протеомных аналитических системах в большинстве случаев используется технология фишинга, при использовании которой молекулы аналита переходят из большого объема анализируемого образца на небольшую поверхность аналитического чипа за счет связывания с этой поверхностью. При этом, как правило, используется обратимое связывание, когда иммобилизованные на поверхности чипа молекулы-зонды обратимо связывают молекулы аналита [Archakov et al., 2009]. При этом предел обнаружения белков при обратимом характере связывания ограничивается значением константы диссоциации комплексов аналита с молекулами-зондами на поверхности чипа (kj) [Archakov et al., 2009]. В случае использования метода химического АСМ-фишинга молекулы аналита вылавливаются из раствора не на молекулы-зонды, а непосредственно на поверхность химически активированной зоны, которая занимает небольшую часть поверхности АСМ-чипа, и необратимо (ковалентно) связываются с этой поверхностью. При этом дополнительная стадия сенсибилизации поверхности чипа путем иммобилизации на ней молекул-зондов не требуется. В отличие от биоспецифического связывания, в случае химического фишинга максимальное количество центров связывания аналита ограничивается лишь количеством

химических групп на поверхности чипа, доступных для химической активации. Ковалентный характер связывания молекул аналита в активированной зоне АСМ-чипа позволяет снять ограничение предела обнаружения белков, обусловленное влиянием диссоциации комплексов аналита с молекулами-зондами.

Комбинация метода АСМ с методом фишинга позволяет сочетать преимущества двух методов. Разработка комбинированного метода регистрации белка с пределом обнаружения ниже является актуальным направлением

исследований, направленных на создание аналитических систем для протеомики и медицинской диагностики.

Целью настоящей работы является создание высокочувствительного метода регистрации низкокопийных белков на базе АСМ-детектора.

Для достижения поставленной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработка схемы метода химического АСМ-фишинга и подбор экспериментальных условий его реализации.

2. Экспериментальная реализация метода химического фишинга и обнаружение белков в растворах с концентрациями от 10'9 М до 10"17 М.

3. Создание теоретической модели для описания процесса химического фишинга белков при сверхнизких концентрациях.

4. Теоретический анализ параметров фишинга, определяющих концентрационный предел обнаружения белков с помощью предложенного подхода.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод химического АСМ-фишинга позволяет регистрировать белки при

17

сверхнизких концентрациях с пределом обнаружения 10" М без использования биоспецифических зондов и меток.

2. Метод химического АСМ-фишинга позволяет проводить регистрацию белков при сверхнизких концентрациях за время не более 3 часов.

3. Разработанная трехмерная модель, учитывающая пространственное движение жидкости в условиях принудительного перемешивания, позволяет

описать процесс химического фишинга белков при сверхнизких концентрациях.

Научная новизна. Разработан метод химического АСМ-фишинга белков. Для реализации этого метода разработаны АСМ-чипы, на атомарно ровной поверхности которых формируется химически активированная зона малой площади. Неровность поверхности чипа после химической активации составляет ~1 нм, поэтому выловленные белки успешно регистрируются методом АСМ на такой поверхности в режиме их счета. Показано, что химический АСМ-фишинг может быть использован для регистрации белков в растворе при сверхнизких концентрациях. Предложена теоретическая трехмерная модель, описывающая процесс АСМ-фишинга низкокопийных белков на АСМ-чип. С помощью этой модели показано, что белок может быть зарегистрирован методом химического

17

АСМ-фишинга в растворе при концентрации Ю М без предварительного концентрирования образца и без использования дополнительных меток.

Научно-практическая значимость работы. Предложенная теоретическая модель позволяет определить значения основных параметров, влияющих на чувствительность метода химического АСМ-фишинга. Результаты теоретического моделирования позволят в дальнейшем определять параметры фишинга на стадии планирования эксперимента. Разработанный метод химического АСМ-фишинга может являться основой для создания сверхвысокочувствительных аналитических систем для протеомики.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VIII Национальной конференции «Рентгеновское, синхотронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (Москва, 2011), Одиннадцатом ежегодном международном конгрессе Организации «Протеом человека» (США, Бостон, 2012), 55-й Научной конференции МФТИ (Москва, 2012), Пятом Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз Россия 2012» (Тверь, 2012), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы

7

развития» (Москва, 2013), весеннем финале конкурса «УМНИК» РАН (Москва, 2013).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из которых 2 статьи в ведущих журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных и теоретических исследований и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 18 рисунков. Библиографический список включает 182 источника, из них 20 источников отечественной литературы.

Во введении сформулированы актуальность темы исследования, цели и задачи исследования, научная новизна и научно-практическая значимость выполненной работы.

В первой главе проведен критический анализ литературных данных по возможностям современных высокочувствительных методов детектирования белков с помощью аналитических наносистем. Проанализированы параметры этих наносистем, определяющие эффективность вылавливания белков из анализируемых образцов и предел обнаружения этих белков. Проведен анализ теоретических моделей, используемых для описания процессов связывания белков с поверхностью чипов аналитических систем.

Вторая глава посвящена описанию методик экспериментального исследования процесса химического АСМ-фишинга. Также в этой главе сформулирована численная модель химического АСМ-фишинга.

В третьей главе приведены и обсуждены результаты экспериментального исследования химического АСМ-фишинга модельных белков и приведено сравнение результатов моделирования с экспериментальными данными. Приведены теоретические обоснования более высокой чувствительности химического фишинга по сравнению с биоспецифическим фишингом. Дано теоретическое обоснование принципиальной возможности масс-спектрометрической идентификации белков, выловленных при химическом

фишинге на поверхность АСМ-чипа, при концентрации этих белков 10"17 М.

8

2. Обзор литературы

2.1 Аналитические наносистемы в протеомике

Развитие методов аналитической протеомики является важной задачей. Эти методы основаны на использовании различных способов регистрации белков: оптико-биосенсорных с использованием принципа поверхностного плазмонного резонанса [Myszka et al., 1998; Schuck, 1996] и резонансного зеркала [Dmitriev et al., 2002; Ivanov et al., 1997, 1999; 2000, 2002, 2001; 2003, 2008; Koval et al., 1999; Семенова и др., 2001; Раченкова и др., 2005], оптических флуоресцентных [Zubtsov et al., 2006, 2007], механических микрокантилеверных [Мс Kendry et al., 2002; Shekhawat et al., 2006; Wu et al., 2001; Arntz et al., 2003; Yin et al., 2013], магнитоэлектрических [Gaster et al., 2011], пьезоэлектрических [Lee et al., 2012; Barak-Shinar et al., 2000; Encarnacao et al., 2008], электрических с использованием нанопор [Siwy et al., 2005; Kowalczyk et al., 2011] и т.д. Достигнутый предел обнаружения белков для большинства перечисленных выше стандартных методов, как правило, не превышает 10'13М [Archakov et al., 2006, 2009; Garbis et al., 2005]. Однако, такой чувствительности недостаточно для обнаружения низкокопийных белков, присутствующие в биологическом материале в низких (10"12-10"14 М) и сверхнизких (10"15-10'24 М) концентрациях. Согласно оценкам, в плазме крови человека может содержаться 2-5 млн [Archakov et al., 2009; Snyder, 2011] типов белков, основной вклад в которые вносят низкокопийные белки с концентрацией ниже 10"12 М. Эти белки могут являться биомаркерами различных патологических состояний человека, в том числе, социально значимых заболеваний, например, гепатита С (HCVcoreAg) [Иванов и др., 2006; Кайшева и др., 2010], онкозаболеваний (SMAD-2) [Dexlin-Melby et al., 2011] и др. Таким образом, обнаружение белков в диапазоне концентраций ниже 10'12М исключительно важно как для решения фундаментальных задач протеомики, так и для создания новых высокочувствительных аналитических и диагностических систем. Разработка новых подходов к регистрации белка с концентрационным пределом обнаружения ниже 10"12М является прогрессивным направлением в области протеомного анализа и медицинской диагностики [Archakov et al., 2009].

Эффективным способом повышения чувствительности детекции белков до 1

уровня <10' M является использование аналитических наносистем. В этих системах высокая чувствительность достигается за счет использования нанодетекторов, размер чувствительного элемента которых соизмерим с размером белковой молекулы, находящимся в диапазоне от 1 до 10 нм. Таким нанодетектором, в частности, является АСМ. Как было показано в ряде работ, АСМ позволяет осуществлять регистрацию не только вирусных частиц (как, например, вирусных частиц гепатита С [Кайшева и др., 2010], вирус Е17 [Yoo et al., 2006], бактериофага Fd, парвовируса собаки, коксаки вируса [Nettikadan et al., 2003; Malkin et al., 1999-2003; Plomp et al., 2002; Trindade et al., 2007], но и отдельных биологических макромолекул: белков [Ricci, Braga, 2003], нуклеиновых кислот [Лиманская, Лиманский, 2006].

2.2 Факторы, влияющие на чувствительность аналитических паносистем 2.2.1 Концентрирование молекул аналита на поверхности аналитического чипа Действие большинства аналитических наносистем основано на технологии связывания молекул аналита с поверхностью детектора или подложки [Archakov et al., 2007]. При переходе из раствора образца на поверхность детектора молекулы аналита концентрируются на этой поверхности. Для оценки эффективности такого концентрирования аналита вводится фактор концентрирования (F) [Archakov et al., 2009; Ivanov et al., 2013]. При условии, что все молекулы аналита (N0), присутствующие в исследуемом объеме образца (V), могут быть выловлены и прочно связаны с поверхностью наночипа площадью S (при этом концентрация молекул белка на поверхности наночипа будет равна Cs), F может быть представлен как:

F = (1.1),

Со

N

где С0 = —— - начальная объемная концентрация белка в растворе до начала VNA

фишинга; с<. =——- - концентрация молекул белка в объеме

s S х hx Na

приповерхностного слоя, S и h - соответственно, площадь и высота слоя молекул белка, выловленных на поверхность наночипа, NA — число Авогадро.

Уравнение (1.1) может быть представлено в более простом виде:

F = (1-2).

sxh

Таким образом, значение фактора концентрирования прямо пропорционально объему анализируемого раствора и обратно пропорционально площади поверхности чипа.

Из уравнения 1.2 следует, что f может достигать величины порядка 108 при следующих условиях: высота слоя выло