Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа"

На правах рукописи

Кайшева Анна Леонидовна

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ЧИПАХ АТОМНО-СИЛОВОГО МИКРОСКОПА

03.01.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 НОЯ 2010

Москва-2010

004612016

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Иванов Юрий Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Соколов Николай Николаевич

доктор биологических наук, Карягина Анна Станиславовна

Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Защита состоится «25» ноября 2010г. в_часов на заседании Диссертационного

совета Д 001.010.01 при ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Мосхва, ул. Погодинская, д.Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д.Ю.

Автореферат разослан «_»_2010г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Карпова Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Одним из приоритетных направлений в современной биохимии является создание эффективных аналитических методов для протеомного анализа, главная задача которых заключается в обнаружении и инвентаризации белков организма, исследовании их структуры, функций, выявлении белковых взаимодействий. Решение данной задачи позволит создать новые системы диагностики заболеваний и их лечения. Стандартные методы современного протеомного анализа базируются на разделении многокомпонентных белковых смесей с помощью хроматографии, электрофореза в комбинации с масс-спекгрометрическими методами (МС) идентификации белков. При несомненном достоинстве стандартного МС-анализа в плане быстродействия и достоверности идентификации белковых молекул, он обладает существенными ограничениями применения, обусловленными низкой концентрационной чувствительностью анализа на уровне 10"8" 10"® М и высоким динамическим диапазоном содержания белков в биологическом материале. В то же время подавляющее количество функциональных белков, в том числе биомаркеры таких социально-значимых заболеваний, как вирусные гепатиты В и С, онкомаркеры и др., присутствуют в плазме крови в области концентраций 10"1Э М и менее.

Один из путей преодоления такого методологического ограничения концентрационной чувствительности анализа заключается в использовании биомолекулярных детекторов, которые позволяют регистрировать единичные молекулы и их комплексы и теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности. К биомолекулярным детекторам относятся детекторы на базе нанотехпологических устройств, таких как атомно-силовые микроскопы (АСМ), нанопроводные детекторы, нанопоры и ряд других детекторов. Уникальная чувствительность АСМ-детекторов позволяет визуализировать отдельные молекулы белков и подсчитывать их количество. При использования АСМ в качестве биомолекулярного детектора необходимо применение специальных чипов, позволяющих сконцентрировать биологические макромолекулы апалита из большого объема инкубационного раствора на ограниченной поверхности чипа. Исследуемые белковые объекты могут быть сконцентрированы на поверхности чипа как за счет физической или химической адсорбции, так и за счет биоспецифических взаимодействий (АСМ-биоспецифический фитинг).

Однако на практике ограничение применения нанодетекторов на базе АСМ заключается в том, что несмотря на возможность визуализации отдельных белковых молекул на поверхности чипа, такие детекторы не способны идентифицировать их, что особенно важно в исследовании сложных белковых смесей, в том числе биологического материала. Поэтому разработка метода анализа, дополняющего возможности метода АСМ, представляется актуальной задачей. На сегодняшний день единственным протеомным методом, позволяющим однозначно и достоверно идентифицировать белковые молекулы, является МС-анализ. В диссертационной работе разработан подход, объединяющий высокую чувствительность метода АСМ и достоверную МС-идентификацию для детекции белков и их комплексов из раствора аналита.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в масс-спектрометрической идентификации белков и белковых комплексов, выявленных в биоматериале с помощью атомно-силовой микроскопии.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработана схема МС-идентификации белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;

2. Разработаны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации;

3. Проведена МС-идентификация модельных белков на поверхности АСМ-чипа;

4. Проведена МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из многокомпонентной смеси (сыворотки крови).

Научная новизна работы.

В диссертации разработана схема, позволяющая проводить МС-вдентификацию белков и белковых комплексов, выловленных из раствора или многокомпонентной смеси на поверхности АСМ-чипа. Для этого были подобраны оптимальные условия подготовки образцов, в том числе режим проведения гидролиза (температурный режим, влажность, состав трипсинолитической смеси, время трипсинолиза) белковых молекул, ковалентно и нековалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа. Особенность настоящей работы заключалась в том, что по сравнению со стандартными протеомными протоколами ферментативного гидролиза подготовка образцов для МС-анализа проводилась не в растворе, а на ограниченной площади

поверхности чипа. Разработанная схема позволила эффективно провести МС-анапиз и идентифицировать на поверхности АСМ-чипа как отдельные белки, так и белковые комплексы. МС-анализ протсотипических пептидов исследуемых белков проводился с использованием двух типов ионизации (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, MALDI и электроспрейная ионизация, ESI) и двух типов детекторов (времяпролетного и типа ионная ловушка). Разработанная схема сопряжения АСМ-биоспецифического фишинга и МС была успешно апробирована для детекции белковых маркеров вирусного гепатита С (ВГС) (HCVcoreAg и Е2) в образцах сыворотки крови.

Практическая значимость работы.

Результаты данной работы могут служить основой для создания высокочувствительных протеомных методов без использования меток и дополнительных процедур подготовки образцов для обнаружения белков, находящихся в биологическом материале в низкой концентрации на уровне 10"13 М и ниже, в том числе в сыворотке крови. Предложен подход на основе атомно-силовой микроскопии и масс-спекгрометрии, который позволит выявлять и идентифицировать белковые маркеры вируса гепатита С в сыворотке крови человека.

Подход может быть использован в разработках, направленных на создание новых диагностических чипов, поиск биомаркеров широкого диапазона социально-значимых заболеваний.

Апробация работы.

Основные результаты исследования были представлены на «1-м, 2-м Международном форуме по нанотехнологиям» (Москва, 2008-2009); «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Амстердам, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Сидней, 2010.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ: 2 статьи в российских научных журналах и 5 публикаций в докладах российских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения,

выводов и списка литературы. Работа изложена на 104 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами, список литературы состоит из 159 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

АСМ-чипы.

В экспериментальной части работы использовались два типа АСМ-чипов. С помощью первого типа проводилась МС-идентификация модельных белков на их поверхности. Эти чипы представляли собой подложки с химически активированной поверхностью, на которую были ковалентно выловлены исследуемые молекулы (с помощью химического фишинга). Второй тип АСМ-чипов использовался для МС-идентификации на их поверхности белков, биоспецифически выловленных из раствора аналита. На поверхности данных чипов в рабочих зонах предварительно были иммобилизованы биологические зонды. В качестве биологических зондов использовались моноклональные антитела против маркерных белков вирусных гепатитов В и С (ВГВ и ВГС) или аптамеры против белка GP120 и тромбина. Для процедуры биоспецифического фишинга чипы с ковалентно иммобилизованными молекулами-зондами инкубировались в растворе аналита, содержащий только детектируемый белок, либо образцы сыворотки крови. В процессе инкубации происходило биоспецифическое связывание детектируемых белковых молекул с молекулами-зондами на поверхности АСМ-подложки (рис. 1). После процедуры биоспецифического фишинга чипы были охарактеризованы с помощью А СМ, при этом число комплексов, зарегистрированных и подсчитанных на поверхности АСМ-чипа, представлялось в виде числа визуализированных объектов в зоне его активации (рис. 1).

Качество поверхности чипов и эффективность формирования объектов на их поверхности (белков или белковых комплексов) тестировалось методом АСМ в лаборатории нанобиотехнологии ИБМХ РАМН. Характеристики, полученные в АСМ-исследовании, приведены в таблице 1.

МОЛЕКУЛЫ-ЗОНДЫ

ИНКУБАЦИЯ В РАСТВОРЕ

ПРОМЫВКА ОТ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ

АСМ-СКАНкРОВАНИЕ

БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ

MALDI-MS: -MALDI-TOF (ВпЖег)

UC-ESI-MS/MS: - LCIMSO Trap XCT Utoa (Asilert)

Рис. I. Схема АСМ-МС-анализа белков, выловленных на молекулы-зонды, иммобилизованные на поверхности АСМ-чипа, за счет биоспецифических взаимодействий.

MC-анализ (MALD1 и EST) проводился на поверхности АСМ-чипа после стадии отмывки от неспецифически сорбированных молекул в рабочей зоне чипа и подготовки образца.

Препараты белков и реактивы.

Для выполнения задачи MC-идентификации модельных белков, ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов первого типа, в работе были использованы: авидин (Agilent, США), HSA (Agilent, США), Р450 ВМЗ (любезно предоставленный профессором A.B. Мунро, Манчестерский университет, Великобритания), тромбин (Sigma, США), a-FP и анти-a-FP (USBio, США);

Для выполнения задачи МС-идептификации белков на поверхности АСМ-чипов второго типа, биоспецифически выловленных из раствора аналита, в качестве молекул-зондов использовались моноклональные антитела (МКА): анти-HCVcore (Virogen, США), анти-HBVcore (НИИ молекулярной диагностики, Москва), анти-HBsAg (Aidevron, США), в качестве молекул-мишени: HBVcoreAg, HCVcoreAg (Virogen, США) и HBsAg (Aidevron, США), GP120 (Sigma, США), тропонин (USBio, США).

Кроме того, в работе использовались следующие вещества: ацетонитрил, изопропанол, муравьиная кислота, дистиллированная вода (Merck, США), трифторуксусная кислота (ТФУ), бикарбонат аммония (Sigma, США), а-циано-4-

гидроксикоричная кислота (НССА), дигидроксибензойная кислота (DHB) (Bruker Daltonics, Германия), трипсин (Promega, США).

Образцы сывороток крови для АСМ-исследования были предоставлены Кафедрой инфекционных болезней у детей РГМУ, ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, МНИИЭМ им. Габричевского. Наличие частиц вируса гепатита С (HCV) в образцах сывороток крови подтверждалось с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-системы "Амплисенс HCV Монитор" (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва).

Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа.

На поверхность АСМ-чипа с иммобилизованными молекулами-зондами наносилась трипсинолитическая смесь, содержащая буферный раствор 150 мМ NH4HCO3, ацетонитрил, 0,5 М гуанидин гидрохлорид, глицерол (рН 7,4). Затем к буферному раствору добавлялось 0,5 мкл раствора свиного модифицированного трипсина с концентрацией ОД мкМ. АСМ-чип инкубировался во влажной среде в течение 2 часов при постоянной температуре 45°С, на его поверхность снова добавлялось 0,5 мкл раствора трипсина (0,1 мкМ), и инкубация продолжалась еще 12 часов. Трипсинолитическая смесь смывалась с поверхности АСМ-чипа раствором элюции объемом 10 мкл, содержащим 70% ацетонитрил в 0,7% трифторуксусной кислоте (ТФУ). Полученный таким образом с поверхности АСМ-чипа гидролизат высушивался в вакуумном испарителе при 45°С и 4200 об./мин. Далее пептидная смесь растворялась в 10 мкл 5% раствора муравьиной кислоты или в 10 мкл 0,7% раствора ТФУ для проведения последующего МС-анализа.

При проведении МС-анализа с MALDI-ткпои ионизации подготовка образцов осуществлялась следующим образом. Пробы, растворенные в 0,7% растворе ТФУ объемом 10 мкл, концентрировались и обессоливались с использованием микронаконечников ZipTip С18 (Millipore, США) в соответствии с протоколом производителя и смешивались с насыщенным раствором матрицы, содержащей НССА или DHB в 50% ацетонитриле с 0,7% ТФУ. Полученную смесь наносили на MALDI-мтжнъ размера МТР.

При проведении МС-анализа с ¿¿'/-типом ионизации подготовка образцов проходила следующим образом. Пробы, растворенные в 5% растворе муравьиной кислоты, наносились на чип Chip Cube (Agilent) с интегрированной обратнофазной колонкой Zorbax (40 нл Trap 75 мкм*43 мм, 5 мкм, C-18SB-ZX). Загрузка 1 мкл пробы

проводилась в течение 6 мин при скорости потока 3000 мкл/мин в изократическом растворе С (5% ацетонитрил и 0,1% раствор муравьиной кислоты); каждый образец анализировался не менее 3 раз. Элюция пептидов с хромато графической колонки осуществлялась в градиенте растворов А (водный раствор 0,1% муравьиной кислоты) и Б (80% раствор ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте) при скорости потока 0,3 мкл/мин в течение 80 мин по следующей схеме: 0 мин - 5% раствор Б, 45 мин - 45% раствор Б, 60 мин - 100%, 75 мин - 5% раствор Б.

Масс-сп ектпометпический анализ.

MALDl-TOF-MC-аиялт белков на поверхности АСМ-чипа.

Масс-спектрометрический анализ выполнялся на времяпролетных масс-спектрометрах Bruker Microflex (Bruker Daltonics, Германия) и Autoflex Щ (Bruker Daltonics, Германия), оснащенных азотным лазером с длиной волны излучения Х=337 нм и лазерной системой Smartbeam, соответственно. МС-анализ проводился в режиме электростатического отражателя (рефлектрона) с напряжением 17 кВ, время задержки импульса составляло 200 не. Накопление спектра происходило за 3000 лазерных импульсов. Калибровка масс-спектрометра осуществлялась с использованием белковых стандартов («Peptide Calibration Standard» и «Protein Calibration Standard II», Bruker Daltonics, Германия).

Анализ и идентификация полученных масс-спектров проводилась с помощью программного обеспечения flexAnalysis версии 2.0 (Bruker Daltonics, Германия) и Mascot Daemon (Matrix Science, London, UK) со следующими параметрами поиска: библиотека данных NCBI или MSDB, число пропущенных сайтов гидролиза не более 2, точность измерения моноизотопных масс менее 100 ррт, при этом учитывались возможное окисление метионинов и модификация цистеинов акриламидом, вероятность определения белка составляла более 95%.

ESi-Trap-MC-апалчз белков на поверхности АСМ-чипа.

Масс-спектрометрический тавдемный анализ белков проводился на хромато-масс-спектрометрической системе типа ионной ловушки LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent, США), оснащенной электроспрейным интерфейсом chip-£S7-online.

Ионизация осуществлялась при температуре капилляра 180°С, напряжение на капилляре составляло 1,8 кВ. Скорость потока осушающего газа в масс-спектрометре составляла 3,5 л/мин. Значение параметра числа накопленных ионов в ловушке

задавался равным 50000 ионов в 1 мс. Детекция ионов в ионной ловушке проводилась в режиме £S7-положительной ионизации в диапазоне m/z=400-1250 с массой оптимизации ловушки m/z=800, МС/МС-фрагментация ионов - в диапазоне m/z=200-1350.

Данные МС- и МС/МС-спектров обрабатывались с использованием программы Data Analysis версии 3.3 (Bruker Daltonics, Германия) с установленным пороговым значением интенсивности пиков 1 х104. Идентификация пептидов и белков проводилась с помощью программного пакета Mascot Server (Matrix Science, London, UK) со следующими параметрами поиска: библиотека данных NCBI или MSDB, использованный фермент - трипсин, число пропущенных сайтов гидролиза не более 1, вероятное зарядовое состояние пептида +1,+2,+3, возможные модификации пептидов - окисленный метионин, точность определения массы иона-предшественника 200 ррт, точность определения массы дочерних ионов 300 ррт, вероятность определения белка составляла более 95%, минимальное число уникальных пептидов, соответствующих одному белку, - 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

МС-идентификация белков, выловленных с помощью химического фитинга на поверхность АСМ-чипа первого типа ид раствора аналита.

На данном этапе экспериментальной работы были получены МС-спектры для модельных белков, химически иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов из раствора аналита. Диапазон концентраций исследуемых белков в растворе аналита для авидина, HSA, анти-aFP составлял 10"М0'9 М, тропошша, aFP и Р450 ВМЗ - 10'6-10"8 М.

МС-анализ проводился для 6 типов белков, различных по своему происхождению, молекулярной массе, количеству сайтов трипсинолиза и их пространственной доступности, которые были ковалентно иммобилизованы на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита. В данных экспериментах использовались АСМ-чипы, которые содержали рабочую и контрольную зоны. Рабочая зона являлась химически активированной областью поверхности АСМ-чипа, на которой происходил химический фишинг модельных белков; контрольной зоной являлась химически неактивная область поверхности чипа. Подсчет визуализированных выловленных молекул регистрировали с помощью АСМ. Экспериментальные данные АСМ-

анализа, полученные для вышеперечисленных модельных белков, а именно число молекул, выловленных на поверхности рабочей зоны АСМ-чипа, представлены в таблице 1. В колонке «концентрация белковых молекул в растворе» таблицы 1 приведены данные для минимально зарегистрированной концентрации соответствующего белка в растворе аналита.

Масс-спектрометрический анализ образцов проводили с использованием MALDI- и £57-типов ионизации.

На рисунке 2 представлены тандемные спектры фрагментации белка авидина, полученные с химически активированной рабочей зоны АСМ-чипа после инкубации в соответствующем растворе авидина с концентрацией 10"9 М. Анализ этих спектров позволил достоверно идентифицировать авидин (Gallus Gallus) по двум его протеотипическим пептидам: SSVNDIGDDWK (m/z=618,6) и VGINIFTR (m/z=460,4).

ИНТЕНСИВНОСТЬ

интжсивность

S.

№¿.4

%

713.3

291 4M СМ

г

Ж

% % V/ V

Й1Ш«

V, V 4J V V V-

«и 1«» на» лл

Б 4 ИНТЕНСИВНОСТЬ

Х1! 5 4611.4

4

3 I

2 I 460.9

1 0 J jljW

ИНТЕНСИВНОСТЬ

tu. «MS2(46M, Э5 J-35.4r*i

1 423.2 %

«

к Ü чшг

о 53S.4

■iidulln ll|L „ТГ, 414 «>»•' , ,15fV

12» 143* ISM mtz

Рис. 2. Тандемные масс-спектры пептидов авидина: (A) SSVNDIGDDWK (m/z=618,4), (Б) VGINIFTR (m/z-460,4). Экспериментальные условия: измерения были проведены на масс-спектрометре LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent).

Результаты АСМ-МС-анализа вышеперечисленных б типов белков представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, число молекул, зарегистрированных в рабочей зоне АСМ-чипа для всех представленных белков, составило молекул. Минимально

зарегистрированная концентрация модельных белков в инкубационном растворе была при этом достаточно низкой ~ 10"8-10"9 М.

Таблица 1. Белки, масс-спектрометрически идентифищрованные с поверхности АСМ-чипа.

Исследуемые объекты Число молекул, выловленных на АСМ-чипе Концентрация белковых молекул в растворе, М

1. Авидин 2,0х108 ю-*

2.HSA 1,7x10* 10"*

3. Тропошш 1,8x10" 10'8

4. a-FP 8,0x107 ю-8

5. анти-a-FP 3,4x10" 10"'J

6.Р450ВМЗ 1,3x10s ю-*

Таким образом, МС-анализ позволил идентифицировать белки, обнаруженные с помощью АСМ. На основании полученных данных была выявлена зависимость между числом идентифицированных протеотипических пептидов на поверхности АСМ-чипа и содержанием искомого белка в растворе аналита. Такая зависимость, например, для белков Р450 ВМЗ и HSA, ковалентно иммобилизованных на химически активированной поверхности АСМ-чипа, приведена на рисунке 3.

Как видно на рисунке 3, чем выше концентрация белка в растворе аналита (-I0"6 М), тем большее число пептидов удается достоверно идентифицировать как в случае MALDI-ЪЛС, так и £5/-МС-анализа. Значительных различий между числом идентифицированных пептидов в диапазоне концентраций 10~6-10"9 М среди анализируемых белков в растворе аналита не наблюдалось.

5 -j^t-'-^-'-^-'-'---^-- :

Рис. 3. Зависимости числа идентифицированных пептидов молекул аналита от концентрации белка в инкубационном растворе. (А) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометрах с MALDI-типом ионизации Bruker MicroJJex (Bruker Daltonics, Германия) и Autoflex 111 (Bruker Daltonics, Германия); (Б) - анализ смеси пептидов модельных белков HSA, ВМЗ на масс-спектрометре с ESI-типом ионизации LC/MSD TrapXCT Ultra (Agilent, США).

Полученные результаты позволили заключить, что АСМ-МС (MALDI и EST) позволяет выявлять и идентифицировать ковалснтно выловленные из раствора аналита на поверхности АСМ-чипа белковые молекулы, различные по своим физико-химическим свойствам.

В то же время, в контрольной зоне АСМ-чипа (неактивированной) после его инкубации в растворе аналита, методом АСМ не зарегистрировано наличия на поверхности чипа объектов, соответствующих по высоте белковым молекулам. МС-анализ также не выявил объектов белковой природы. Таким образом экспериментально было доказано, что АСМ адекватно регистрирует искомые объекты - белковые молекулы аналита.

МС-идептнфикация белков, биоспецифическн выловленных на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита.

Следующим этапом данной работы стала отработка схемы комбинации АСМ-МС для идентификации белков, выловленных из раствора за счет биоспефических взаимодействий.

Экспериментальная часть данного раздела подразумевала проведение двух этапов анализа. На первом этапе необходимо было провести МС-идентификацию ковалентно иммобилизованных на АСМ-чипе белковых молекул-зондов, на втором этапе -

белков-мишеней, выловленных на соответствующие молекулы-партнеры из раствора или из образцов сыворотки крови за счет биоспецифических взаимодействий. Для этого был проведен МС-анализ ковалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипов МКА против маркерных белков ВГС и ВГВ: анти-HCVcore, NF5, NE3 и NE2. Для этих белков в настоящей работе впервые были получены тандемные спектры фрагментации и спектры пептидных карт. По данным АСМ-анализа антитела были иммобилизованы монослоем без образования агрегатов, МС-анализ подтвердил их наличие на поверхности АСМ-чипа. При использовании аптамеров в качестве молекул-зондов МС-идентификация АСМ-визуализированных на поверхности АСМ-чипа объектов не проводилась. На втором этапе экспериментальной части данного раздела анализировались АСМ-чипы с биоспецифически выловленными молекулами после инкубации в растворах аналита. Модельные растворы содержали детектируемые белки-мишени в концентрационном диапазоне 10'8'10"п M. АСМ-анализ показал формирование белковых комплексов в рабочей зоне АСМ-чипа при АСМ-биоспецифическом фишинге соответствующих 5 белковых пар. Данные АСМ-анализа, а именно число комплексов, зарегистрированных на АСМ-чипе, представлены в таблице 2.

Таблица 2. MALDI- и ESl-MC-идентифшация белковых комплексов в рабочей зоне АСМ-чипа с использованием биоспецифического фишинга.

Исследуемые объекты

Иммобилизовании е молекулы-зонды Молекулы аналита Число комплексов, зарегистрированных на АСМ-чипе Концентрация белковых молекул аналита в растворе, M

1. Аптамер GP120 1,2* 107 ю-"

2. Анти-HCVcore HCVcoreAg 3,8*107 ю-10

3. Анти-HBs HBsAg 6,0* 107 Ю-9

4. Анти-HBVcore HBVcoreAg 5,0*106 Ю-9

5. Аптамер Тромбин 1,8*107 10"8

Как видно из таблицы 2, число сформированных комплексов для исследуемых молекул аналита составляло порядка 106-107 как в случае белковых молекул-зондов, так и в случае использования аптамеров в качестве зондов. В контрольной химически неактивированной зоне АСМ-чипа после инкубации в растворе аналита не

наблюдалось неспецифической сорбции белковых молекул. Результаты МС-идентификации этих АСМ-чипов приведены в таблице 2.

На рисунке 4 приведены тандемные спектры фрагментации для GP120, биоспецифически выловленного на соответствующий аптамер. Особенностью данной белок-аптамерной пары «СР120-аптамер», где в качестве молекул-зондов использовались аптамеры, а в качестве молекул аналита белок GP120, являлось то, что технически такая схема с использованием аптамера была реализована в настоящей работе впервые. Для комбинации АСМ-биоспецифического фишинга и MC-идентификации удалось идентифицировать GP120 по двум его протеотипическим пептидам AFYA GDIIGDIRQA Y (m/z=559,4) и NEQDVLALDK (m/z=573,5), представленным в виде тандемных спектров фрагментации на рисунке 4. На примере этой белковой пары была продемонстрирована возможность повышения чувствительности АСМ-МС-анализа на 2 порядка до 10'" М по сравнению с чувствительностью стандартных протеомных подходов без предварительного АСМ-фишинга (Küster В. Et а!., 1998; Archakov A.I. et al., 2007).

икш-сивность

1 0i

интенсивность

Ь6 27S.1

да Мк

Ь6 360.1 и Ь9

499.7

385.6 I I

к . 1 „ 1 ,, , , .

200 400 m/z 200 400 "lfl

Рис. 4. Тандемные масс-спектры пептидов GP12Q: (A) AFYAGDIIGDIRQAY (m/z=559,4), (Б) NEQDVLALDK (m/z=573,5). Экспериментальные условия: измерения были проведены на масс-спектрометре LC/MSD Trap ХСТ Ultra (Agilent).

Результаты МС-анализа белков, биоспецифически выловленных на иммобилизованные МКА, представлены на рисунке 5. МС-идентификация белок-белковых комплексов на поверхности АСМ-чипа была продемонстрирована на примере пары «aнти-HCVcore¡m-HCVcoгeAg». В данном случае в рабочей зоне чипа были ковалентно иммобилизованы антитела - анти-НСУсоге^.

МС-анализ спектров АСМ-визуализированных объектов в рабочей зоне поверхности чипа позволил идентифицировать анти-НО/соге по 10 пептидам:

13

1УР1ЮС0СК (т/г=990,5), ШБААБРАРтК (т/г= 1243,8), РКОУЬТШТРК (т/2=1325.8), АР() УУТП'РРКЩШ К (т/2=1798Д), 5КШ,т/7/2£> \VLNGK (т/г=1854,8), ЕРКСПП^ШРАРКК (т/г=1906,8), 8У8Е1Р1МНС20\У1К0КЕРК (т/г=2275,1), РКАвР^АОРШтСТРР/ИРР (т/г=2452,0) (рис. 5А). МС-анализ поверхности контрольной неактивированной зоны не выявил присутствия па пей объектов белковой природы.

ИНТЕНСИВНОСТЬ

ИНТЕНСИВНОСТЬ

1000

1500

2000

m/z

Рис. 5. (А) Масс-спектр трипсинолизованных объектов рабочей зоны АСМ-чипа с анти-НСУсоге,„; (Б) масс-спектр рекомбинантного HCVcoreAg; (В) масс-спектр рабочей зоны АСМ-чипа с анти-НСУсогещ после инкубации в растворе рекомбинантного HCVcoreAg (С=Ш10 М). Экспериментальные условия: измерения были проведены на МАЬБ1-ТОР масс-спектрометре Мкго/1ех (Вгикег).

Примечания: 1 цифрами указаны идентифицированные фрагменты белка; 2 ♦ -идентифицированные фрагменты для анти-НСУсоге1т;3 Ж - идентифицированные фрагменты для HCVcoreAg.

МС-анализ АСМ-чипов с иммобилизованными молекулами анти-ПСУсогс1т после инкубации в растворе рекомбинантного HCVcoreAg с концентрацией КГ10 М

позволил идентифицировать как анти-НСУсогс, так и НСУсогсЛ§ (рис. 5 Б,В)- В результате МС-анализа рабочей зшш АСМ-чипа были выявлеш>1 следующие пептиды, соответствующие анти-НСУсоге: У№ЛЛ ГРА Р1ЕК (т/г=1243,8), РКПУШТЬТРК (т/г=1325,8), УМ5ААЕРАР1ЕКтК (т/г=1673,8), тКТКаЯРКАОРдАОР (^=1812,0), $УЗЕ1Р1МП0,и \VLNGK (т/г=1854,8), ЕР КС К УЫЯАА ЕРА [ЧЕК (т/г=1906,8), а также пептиды, соответствующие НСУсогеАЕ: 8ТЫРКР()К (т/г=899,51), \iSTNPKPQK (т/г=1030,58), ОРШОУПАТЯ (т/2=1082,075), РР0СС01УСС тЬРЯ (т/г=1629,82), ТЪЕ!и>()Р/1аС,Н()Р1РК (т/г=1793,8600), 1{Р()ОУКЕРССС()1УСОУ¥иРЯ (т/г=2353,23).

Для белковой пары «анти-НСУсогсш,-НС\'согсА§» была выявлена зависимость между числом идентифицированных протеотипических пептидов и концентрацией исследуемых белков-мишеней в инкубационном растворе. Аналогично ранее полученным результатам для химического фишинга, в случае высокого содержания молекул белка-мишени в растворе (~10"8 М) удалось достоверно идентифицировать большее число пептидов как в случае МАЮ!-, так и £Х/-МС-анализа по сравнению с низким содержанием белка-мишени в растворе аналита (рис. 6).

Рис. 6. Зависимости числа идентифицироваиных пептидов HCVcoreAg от концентрации белка в инкубационном растворе на масс-спектрометрах с MALDI-типом ионизации Autoflex III (Bruker Daltonics, Германия) и ESI-типом ионизации LC/MSD TrapXCT Ultra (Agilent, США).

В контрольной серии экспериментов анализировались АСМ-чипы, содержащие 2

контрольные зоны. Первая контрольная зона не включала иммобилизованные

15

молекулы-зонды, на поверхности второй контрольной зоны были иммобилизованы МКА против другого белка - поверхностного антигена ВГВ (HBsAg). МС-анализ не выявил наличия детектируемых белковых молекул HCVcoreAg, что соответствует данным АСМ-регистрации, которая также не зафиксировала формирования объектов, соответствующих белковым молекулам в первой контрольной зоне и белковым комплексам во второй контрольной зоне АСМ-чипа.

МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа. биоспеннфически выловленных из образцов сыворотки крови.

Следующим этапом исследования стала адаптация АСМ-МС-метода для выявления и идентификации белков вирусных частиц HCV в сыворотке человека. В данном разделе проводился МС-анализ белков с поверхности АСМ-чипов после инкубации в растворах образцов сыворотки крови, положительных и отрицательных на наличие РНК вируса гепатита С по данным ПЦР анализа. В качестве молекул-зондов, иммобилизованных в рабочей зоне АСМ-чипа, выступали МКА против HCVcoreAg.

С целью выяснения вклада неспецифической сорбции компонентов сыворотки крови в формирование объектов на поверхности АСМ-чипа были проведены контрольные эксперименты. В первой серии экспериментов АСМ-чип, не содержащий анти-HCVcorejn,, инкубировали в образце сыворотки человека положительной на наличие ВГС. МС-анализ таких чипов подтвердил данные АСМ и не выявил наличия объектов белковой природы. Вторая серия контрольных экспериментов проводилась для АСМ-чипов, содержащих иммобилизованные молекулы-зонды aHTH-HCVcoreim после его инкубации в образце сыворотки крови человека отрицательной на наличие ВГС, с целью обнаружения перекрестной специфичности моноклональных анти-HCVcore с компонентами сыворотки крови. В результате этого контрольного эксперимента также не удалось МС-идентифицировать белковые молекулы (Kaysheva A.L., Ivanov Yu. D., 2010).

Таким образом, МС-анализ АСМ-чипов после контрольных экспериментов не выявил неспецифической сорбции на поверхности АСМ-чипа компонентов сыворотки крови и сорбции на иммобилизованные моноклональные антитела за счет перекрестной реактивности для образцов сывороток крови, что доказывает специфичность АСМ-анализа.

Было проанализировано 28 АСМ-чипов, инкубированных в растворах образцов сыворотки крови, 14 из которых содержали и 14 - не содержали частицы НСУ.

В результате Л//1Ы)/-Т01'-МС-анализа 9 АСМ-чипов после инкубации в растворе образцов сыворотки крови положительных на наличие частиц ПСУ по данным ПЦР была идентифицирована преимущественно 2§К7КЗ_9НЕРС-изоформа HCVcoreAg, гомологичность выявленных изоформ кор-антигена НСУ составила 90-96%.

В результате АСМ-МС-анализа с А/Л1£)/-типом ионизации было обнаружено, что наиболее часто в результате идентификации встречались следующие пептиды в составе HCVcoreAg: в 7 образцах сыворотки крови встретились т/г=899,5 2-ЛСП'ШРР-9 и т/г=1030,5 \-MSTNPKPQK-9, в 6 образцах - т/г=1158,8 1-МБШРКРдККАО, т/?=1 529,8 \-MSTNPKPQKKTNR-n, т/г=1629,8 24-FPGGGe^KGGraLPД-39, в 5 образцах - т/г=1003,6 \d-KTNRNTNR-\l и т/г=1468,7 \02-GSRPSlVGPTDPRR-U4, в 4 образцах - т/г=900,5 44-Ю УРА ТРК-51. Анализ положения в аминокислотной последовательности НСУсогеА£ этих наиболее часто идентифицируемых пептидов показал, что все они принадлежат к консервативным областям HCVcoreAg (рис. 7). Литературные данные указывают на то, что HCVcoгeAg является достаточно консервативным белком, степень идентичности аминокислотных остатков которого составляет около 85,3%, при этом наиболее высококонсервативными его участками являются: гидрофобный домен, включающий аминокислотные остатки (а.о.) 24-39, кластеры 2-23, 39-74 а.о. и 101-121 а.о. (ВикЬ а1., 1993).

Экспериментальные данные позволили выявить неравномерную частоту встречаемости пептидов HCVcoгeAg среди МС-цдентифицированных белков, выявленных в различных образцах сыворотки крови, содержащих НСУ (рис. 7). Данная информация может быть полезна для проведения диагностических анализов на основе масс-спектрометрии.

0.7 0?

Р \ZKFPGGGQiyGGVYLLPRR

0.8 1 0.7

41 &РР1_СУИА7Р КТЗЁПБОРЙв КТОР/РКЛЯО РЕСКАУУАОРС

81 УР\Л/Р!.УСМЕС ЮЛШЛ/ИЗР ЖБЙРБУУСРТ DPRRRSRNLG

0.6

121 КУЮТЬТССР А01_МСУ1Р1Л/ САР1.ССААЯА 1АНСУ1М,ЕО 161 СУЫУАТСЫЬР ССРРЗ^ЬЬА ШЗО-ИРАв А

Рис. 7. Схематическое изображение частоты встречаемости пептидов QS У7 УЗ_9НЕРС в образцах сыворотки крови.

Примечание: 1 - жирным шрифтом выделены высококонсервативные участки аминокислотной последовательности ()8У7УЗ, 2 — фигурными скобками с цифрами указаны наиболее часто идентифицируемые пептиды в сыворотке и частота их встречаемости МС-анализе белков с поверхности АСМ-чипов, инкубированных в различных образцах сыворотки крови.

В ряде случаев в МС-спектрах белков, биосцецифически выловленных на поверхность рабочей зоны АСМ-чипов после инкубации в растворе образцов сыворотки крови, помимо детектируемого белкового маркера ВГС - НСУсогеА§, был выявлен другой белковый маркер - поверхностный гликопротеин Е2. Соответствующие данному гликопротеиду пептиды представлены на масс-спектре, приведенном на рисунке 8. Идентификация данного вирусного белка (Е2), входящего в состав частиц НСУ, повышает достоверность результатов АСМ-МС-анализа.

ИНТЕНСИВНОСТЬ

хЮ"

1482.4

i i 5 s

X?, ю ?! «N

■

1000 1500 2000 2500 miz

Рис. 8. Масс-спектр рабочей зоны АСМ-чипа с анти-HCVcore¡m после инкубации в

сыворотке, содержащей вирусные частицы гепатита С, экспериментальные условия: измерения были проведены на AÍALDI-TOF-масс-спектрометре Microflex (Bruker).

Примечание: /. А - идентифицированные фрагменты для HCVcoreAg; 2. ♦ -фрагменты гликопротеина Е2.

МС-анализ с применением электроспрейного типа ионизации (£57) АСМ-чипов после инкубации в растворах образцов сыворотки крови также позволил идентифицировать маркерный белок HCV - HCVcoreAg - на поверхности АСМ-чипа. Полученные результаты АСМ-МС-анализа с двумя различными типами ионизации образцов хорошо согласуются между собой.

В результате анализа тандемных спектров, полученных с поверхности АСМ-чипов после инкубации в растворах образцов сыворотки крови, также был идентифицирован HCVcoreAg по двум его протеотипическим пептидам: RPQDVKFPTGGQIVGGVYLLPR (m/z=799,7) и RPQDVKFPSGGQIVGGVYLLPR (m/z=795,0) (рис. 9).

Следует отметить, что те же пептиды были идентифицированы и при ES/-MC/MC-анализе рекомбинантного HCVcoreAg из раствора.

ИНТЕНСИВНОСТЬ

-якгшяи

ИНТЕНСИВНОСТЬ

gjvflilplR

ЪА

+MS2(799.8], 3Mmin 13776

Ь20" 1063.6

М2** 655.3

У7 y9

817/4 bIT" sps

У5

у10 086«

уз

385.<V4 692i3 TE2.3I

М С ЛАО i 1 I

мз-*

оовл J

ув !ыэ'

6Г4.6 1007

U.

Ш

ИНТЕНСИВНОСТЬ

6Г

ИНТЕНСИВНОСТЬ

ЫЗ- +MS2(795.5), 355mhl 999.5

Л/с. 9. ESl-MCJMC-спектр гидролизованных объектов с поверхности АСМ-наночипа с иммобилизованным анти-HCVcoreAg после инкубации в растворе образца сыворотки крови. (А) пептид HCVcoreAg RPQDVKFPTGGQIVGGVYLLPR (m/z=799,8); (Б) пептид HCVcoreAg RPQDVKFPSGGQIVGGVYLLPR (m/z=795,5). Экспериментальные условия: измерения были проведены на масс-спектрометре LC/MSD TrapXCT Ultra (Agilent).

Таким образом, МС-анализ с МАЬИ1- и £5/-типами ионизации с использованием АСМ-биоспецифического фипшнга позволяют проводить успешную идентификацию белков на поверхности АСМ-чипа после его инкубации в растворе многокомпонентной смеси - сыворотке крови.

Выводы:

1. Разработана схема МС-анализа белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;

2. Подобраны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации с использованием МАЬВ1- и £57-типов ионизации;

3. Проведена МС-идентификация 11 типов белков на поверхности АСМ-чипов: в том числе 6 типов белков, выловленных на поверхность .АСМ-чипа с помощью химического фишинга и 5 типов белков, выловленных за счет биоспецифического взаимодействия на соответствующие молекулы-зонды, иммобилизованные на АСМ-чипе;

4. Проведен МС-анализ белка СР120, биоспецифически выловленного из раствора аналита на аптамер, иммобилизованный на поверхности АСМ-чипа. Схема АСМ-МС-анализа с использованием аптамера к СР120 в качестве биологического зонда была реализована впервые;

5. Разработанная схема АСМ-МС-анализа апробирована для выявления белкового маркера заболевания гепатита С НСУсогеА§ из сыворотки крови. Проведена МС-идентификация белков НСУсогеАд и Е2 на поверхности АСМ-чипов, биоспецифически выловленных на иммобилизованные анти-НСУсоге из образцов сыворотки крови, содержащей частицы НСУ.

Публикации

1. Иванов Ю.Д., Иванов А.В., Кайшева А.Л., Згода В.Г., Козин С., Уи Бон Уа Г., Усанов С.А., Арчаков А.И. Продуктивные и непродуктивные комплексы в цитохром Р450-содержащих системах. // Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55, №3. - С. 310330.

la. Ivanov Yu.D., Ivanova A.V., Kaysheva A.L., Zgoda V.G., Gaston Hui-Bon-Hoab, Usanov S.A., Archakova A.I. Productive and non-productive complexes in cytochrome i'450-containing systems. H Biochemistry (Moscow) Supplemented series B: Biomedical Chemistry. - 2009. - Vol.3, № 2. - P. 183-197.

2. Кайшева А.Л., Плешакова Т.О., Французов П.А., Иванов Ю.Д., Згода В.Г., Зибров. B.C., Крохин Н.В., Ястребова О.В., Конев В.А., Учайкин В.Ф., Арчаков А.И. Визуализиция и идентификация вирусных частиц гепатита С при помощи атомно-силовой микроскопии, сопряженной с масс-спектрометрией. // Биомедицинская химия.-2010.-Т. 56,№ 1.-С. 26-39.

2а. Kaysheva A.L., Ivanov Yu.D., Zgoda V.G., Frantsuzov P.A., Pleshakova Т.О., Krokhin N. V., Ziborov V.S., Archakov A.I. Visualization and Identification of Hepatitis С Viral Particles by Atomic Force Microscopy Combined with MS/MS Analysis. // Biochemistry (Moscow) Supplemented series B: Biomedical Chemistry. - 2010. - Vol. 4, №1- P. 16-25.

3. Кайшева А.Л., Французов П.А., Плешакова Т.О. Иванов Ю.Д. Згода В.Г. Зибров В. С., Крохн Н.В., Арчаков А.И. Идентификация белков и вирусных частиц с помощью комбинации атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии. // Сборник тезисов докладов участников Первого международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech 08. - Москва. — 3-5 декабря2008.-С. 896.

4. Ivanov Y.D., Pleshakova Т.О., Nikitina S.E., Ivanov A.V., Kaysheva A.L., Frantsuzov P.A., Archakov A.I.. Nanobiochips for Proteomics and Diagnostics. // Материалы международной конференции HUPO 7th Annual World Congress. - Amsterdam, Netherlands. - August, 16-20. - 2008. - URL: http://hupo.org/meetings/congress/77

5. Иванов Ю.Д., Плешакова Т.О., Никитина С.Е., Кайшева А.Л., Французов П.А., Иванов А.В., Арчаков А.И. Нанобиология для диагностики. // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, Россия. -11-15 мая 2008.-С.306.

6. Kaysheva A.L., Frantsuzov Р.А., Pleshakova Т.О., Ivanov Yu.D., Zgoda V.G., Ziborov V.S., Krokhin N.V., Archakov A.I. Combination of atomic force microscopy with mass spectrometry for identification of proteins and viral particles. // Сборник материалов международной конференции The Second Nanotechnology International Forum. -October, 6-8. - 2009. - Moscow, Russia. - P.896-897.

7. Kaysheva A.L., Ivanov Yu.D., Zgoda V.G., Frantsuzov P.A., Pleshakova Т.О., Krokhin N.V., Archakov A.I. Combination of AFM fishing and MS for identification of

HCV proteins in serum. // Сборник материалов международной конференции HUPO 9th Annual World Congress. - Sydney, Australia. - September, 19-23. - 2010. - P.227.

Финансирование работы

Проведенные исследования поддержаны финансированием из научных контрактов в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» № 02.552.11.7060, в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 02.740.11.0791, гранта РФФИ .09-04-12113-офи_м.

Список сокращений

ВГС - вирусный гепатит С

HBsAg -поверхностный антиген вируса гепатита В

HCVcoreAg - нуклеокапсидный белок вируса гепатита С

a-FP - альфа-фетапротеин

ВМЗ - флавоцитохром Р450 (Bacillus megaterium)

GP120- оболочечный гликопротеин 120 вируса иммунодефицита человека

МКА - моноклональные антитела

HCV - вирус гепатита С

ПЦР - полимеразная цепная реакция

АСМ - атомно-силовая микроскопия, атомно-силовой микроскоп MC - масс-спектрометрия, масс-спектрометр

MALDI (matrix assisted laser desorption and ionization) - лазерная ионизация с участием матрицы

ESI - electro spray ionization - электроспрейный тип ионизации

ТФУ - трифторуксусная кислота

НССА - а-циано-4-гидроксикоричная кислота

DHB - дигидроксибензойная кислота

Подписано в печать: 21.10.2010

Заказ № 4349 Тираж - 70 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кайшева, Анна Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий

1.2 Характеристика вируса гепатита С

1.2.1 Методы диагностики гепатита С

1.2.2 Серологические белковые маркеры гепатита С

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 АСМ-чипы

2.2 Препараты белков и реактивы

2.3 АСМ-анализ

2.4 Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа

2.5 Масс-спектрометрический анализ

2.5.1 МАЛДИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа

2.5.2 ЭСИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 МС-идентификация белков, выловленных с помощью 35 «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита

3.2 МС-идентификация белков, биоспецифически выловленных 44 на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита

3.3 МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, 60 биоспецифически выловленных из образцов сыворотки крови

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа"

Актуальность.

На сегодняшний день протеомика решает широкий спектр фундаментальных и прикладных задач в науке. Протеомные методы лежат в основе фундаментальных исследований белок-белковых взаимодействий, что важно в выявлении потенциальных белковых партнеров в каскадах клеточных сигнальных путей и в мультиферментных комплексах. К прикладным протеомным исследованиям относят поиск новых лекарственных мишеней, выявление маркерных белков различных заболеваний, развитие методов персонифицированной медицины. Одним из приоритетных направлений в современной биохимии является создание эффективных аналитических методов для протеомного анализа, главная задача которых заключается в обнаружении и инвентаризации белков организма, исследовании их структуры, функций, выявлении белковых взаимодействий.

Решение данной задачи позволит создать новые системы диагностики заболеваний и их лечения. Стандартные методы современного протеомного анализа базируются на разделении многокомпонентных белковых смесей с помощью хроматографии, электрофореза в комбинации с масс-спектрометрическими методами (МС) идентификации белков. При несомненном достоинстве стандартного МС-анализа в плане быстродействия и достоверности идентификации белковых молекул, он обладает существенными ограничениями применения, обусловленными низкой о о концентрационной чувствительностью анализа на уровне 10" -10" Ми высоким динамическим диапазоном содержания белков в биологическом материале. В то же время подавляющее количество функциональных белков, в том числе биомаркеры таких социально-значимых заболеваний, как вирусные гепатиты В и С, онкомаркеры и др., присутствуют в плазме крови 1 в области концентраций 10" Ми менее [1,2].

Один из путей преодоления такого методологического ограничения концентрационной чувствительности анализа заключается в использовании биомолекулярных детекторов, которые позволяют регистрировать единичные молекулы и их комплексы и теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности. К биомолекулярным детекторам относятся детекторы на базе нанотехнологических устройств, таких как атомно-силовые микроскопы (АСМ), нанопроводные детекторы, нанопоры и ряд других детекторов. Уникальная чувствительность АСМ-детекторов позволяет визуализировать отдельные молекулы, белков, и подсчитывать их количество. При использовании АСМ1 в, качестве биомолекулярного детектора необходимо- применение1 специальных, чипов, позволяющих сконцентрировать биологические макромолекулы аналита из большого объема инкубационного раствора на ограниченной1 поверхности- чипа. Исследуемые белковые объекты могут быть сконцентрированы на поверхности чипа как за счет физической или химической адсорбции, так и за счет биоспецифических взаимодействий' (АСМ-биоспецифический фишинг).

Однако на практике ограничение применения нанодетекторов на базе АСМ заключается в том, что, несмотря на. возможность визуализации отдельных белковых молекул на поверхности чипа, такие детекторы не способны идентифицировать их, что особенно важно в. исследовании, сложных белковых смесей, в том числе биологического материала. Поэтому разработка метода анализа, дополняющего возможности метода АСМ, представляется актуальной задачей. На сегодняшний5 день единственным протеомным методом, позволяющим однозначно и достоверно идентифицировать белковые молекулы, является * МС-анализ. В диссертационной работе разработан подход, объединяющий высокую чувствительность метода АСМ и достоверную МС-идентификацию для детекции белков и их комплексов из раствора-аналита.

Цель работы состояла в масс-спектрометрической идентификации белков и белковых комплексов, выявленных в биоматериале с помощью атомно-силовой микроскопии.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработка схемы МС-идентификации белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с . помощью химического или. биоспецифического фишинга;

2. Подбор условий- ферментативного-гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации;

3. Проведение МС-идентификации модельных белков на поверхности АСМ-чипа;

4. Проведение МС-идентификации белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из многокомпонентной смеси (сыворотки крови).

Научная-новизна работы.

В диссертации разработана схема, позволяющая проводить МС-идентификацию белков и белковых комплексов, выловленных из раствора или многокомпонентной смеси на поверхности АСМ-чипа. Для этого были подобраны оптимальные условия подготовки образцов, в том числе режим проведения гидролиза (температурный режим, влажность, состав трипсинолитической смеси, время трипсинолиза) белковых молекул, ковалентно. и нековалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа. Особенность настоящей работы заключалась в том, что- по сравнению1 со стандартными протеомными протоколами ферментативного гидролиза подготовка образцов для МС-анализа проводилась не в растворе, а на ограниченной площади поверхности чипа. Разработанная схема позволила эффективно провести МС-анализ и идентифицировать на поверхности АСМ-чипа как отдельные белки, так и белковые комплексы. МС-анализ протеотипических пептидов исследуемых белков проводился с использованием двух типов ионизации (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ и электр оспрейная ионизация, ЭСИ) и двух типов детекторов (времяпролетного и типа ионная ловушка). Разработанная схема сопряжения АСМ-биоспецифического фишинга и МС была успешно апробирована для детекции белковых маркеров вирусного гепатита С (ВГС) (НСУсогеА§ и Е2) в образцах сыворотки крови.

Научно-практическая ценность работы.

Результаты данной работы могут служить основой для создания высокочувствительных протеомных методов без использования меток и* дополнительных процедур подготовки образцов- для обнаружения белков, находящихся в биологическом материале в низкой концентрации на1 уровне 10"13 М и ниже, в том числе в сыворотке крови. Предложен подход на основе атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии, который позволит выявлять и идентифицировать белковые маркеры вируса гепатита С в сыворотке крови человека.

АСМ-МС подход может быть использован в разработках, направленных на создание новых диагностических чипов, поиск биомаркеров широкого диапазона социально-значимых заболеваний.

Апробация работы.

Основные результаты исследования были представлены на «1-м, 2-м Международном форуме по нанотехнологиям» (Москва, 2008-2009); «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Амстердам, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Сидней, 2010.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 104 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами, список литературы состоит из 159 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кайшева, Анна Леонидовна

выводы

1. Разработана схема МС-анализа белков, выловленных на поверхность

АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;

2. Подобраны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации с использованием МАЛДИ- и ЭСЯ-типов ионизации;

3. Проведена МС-идентификация 11 типов белков на поверхности АСМ-чипов: в том числе 6 типов белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического фишинга и 5 типов белков, выловленных за счет биоспецифического взаимодействия на соответствующие молекулы-зонды, иммобилизованные на АСМ-чипе;

4. Проведен МС-анализ белка §р120, биоспецифически выловленного из раствора аналита на аптамер, иммобилизованный на поверхности АСМ-чипа. Схема АСМ-МС-анализа с использованием аптамера к §р120 в качестве биологического зонда была реализована впервые;

5. Разработанная схема АСМ-МС-анализа апробирована для выявления белкового маркера заболевания гепатита С НСУсогеА§ из сыворотки крови. Проведена МС-идентификация белков НСУсогеА§ и Е2 на поверхности АСМ-чипов, биоспецифически выловленных на иммобилизованные анти-НСУсоге из образцов сыворотки крови, содержащей частицы НСУ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современный подход к решению проблемы низкой концентрационной чувствительности аналитических систем, используемых в протеомике, заключается в использовании молекулярных детекторов, таких как атомно-силовой микроскоп, позволяющих регистрировать единичные белковые молекулы, в комбинации с биоспецифическим фишингом молекул-аналита. В связи с тем, что молекулярные детекторы не имеют ограничений по чувствительности и, теоретически, могут использоваться для регистрации низкокопийных белков (например, белковых маркеров гепатита С) в сыворотке человека [2]. Масс-спектрометрический анализ важен для идентификации визуализированных белковых объектов на поверхности АСМ-чипа, выяснения вклада неспецифической сорбции* при исследовании сложных смесей, таких как сыворотка крови.

Показано, что АСМ-МС подход., может применяться- для выявления и идентификации белков из раствора на примере 6 модельных белков, отличных по своим физико-химическим свойствам и происхождению.

Данная работа дает возможность создания высокочувствительных протеомных методов для обнаружения маркерных белков в низкой концентрации в биологическом* материале, в том числе в сыворотке крови без использования флуоресцентных или радиоактивных меток. Показано, АСМ-МС анализ с использованием ЭСИ и МАЛДИ типов ионизации белков и белковых комплексов может осуществляться* и в сложных смесях (сыворотка крови). Предложенный подход был успешно апробирован при выявлении и идентификации белковых маркеров вируса гепатита С (НСУсогеА§) в сыворотке крови. Было установлено, что пептиды консервативных участков аминокислотной последовательности кор-антигена идентифицировались с высокой частотой, в отличии от пептидов^ вариабельных участков.

В дальнейшем этот подход может быть использован в разработках, направленных на создание диагностических систем, в поиске биомаркеров социально-значимых заболеваний. Другая область применения АСМ-МС подхода - использование для протеомных исследований. В этом случае, атомно-силовая микроскопия и масс-спектрометрия помогут распознать те виды белков, которые присутствуют в низкой концентрации в сыворотке человека, но еще не идентифицированы стандартными протеомными методами в связи с недостаточной концентрационной чувствительностью.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Проведенные исследования поддержаны финансированием из научных контрактов в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» № 02.552.11.7060, в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 02.740.11.0791, гранта РФФИ 09-04-12113-офим.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю V заведующему лабораторией нанобиотехнологии ИБМХ РАМН, доктору биологических наук Юрию Дмитриевичу Иванову за предоставление темы для настоящей работы, помощь и поддержку при ее выполнении.

Выражаю глубокую признательность коллективу лаборатории нанобиотехнологии и системной биологии, заведующему лаборатории системной биологии кандидату биологических наук Згоде Виктору Гавриловичу за полезные рекомендации и помощь в проведении4 экспериментов.

Особо благодарю заведующего кафедрой инфекционных болезней у детей РГМУ, академика РАМН В.Ф. Учайкина, а также сотрудников кафедры к.м.н. В.А. Конева и д.м.н. О.Б. Ковалева за предоставление сывороток крови для анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кайшева, Анна Леонидовна, Москва

1. Zhou Y., Wang Y., Kovacs M., Jin J., Zhang J. Microglial activation induced by neurodegeneration: a proteomic analysis // Mol. Cell. Proteomics. — 2005. — 4. -P.1471-1479.

2. Archakov A.I., Ivanov Yu.D. Analytical nanobiotechnology for medicine diagnostics // Mol BioSyst. 2007. - 3. - P.336-342.

3. Archakov A.I., Ivanov Yu.D., Lisitsa A.Y., Zgoda V.G. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // J. Proteomics. 2007. - 7. - P.4-9.

4. Reinders J., Lewandrowski U., Moebius J., Wagner Y., Sickmann A. Challenges in mass spectrometry-based proteomics // J. Proteomics. 2004. - 12. -P.3686-3703.

5. Guetens G., Van Cauwenberghe K., De Boeck G., Maes R., Tjaden U.R., van der Greef J., Highley M., van Oosterom A.T., de Bruijn E.A. Nanotechnology in bioclinical analysis // J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 2000. - 739. - P. 139150.

6. Chen L., Fatima S., Peng J., Leng X. SELDI protein chip technology for the detection of serum biomarkers for liver disease // Protein. Pept. Lett. 2009. -16(5). -P.467-472.

7. Arroyo C.M., Broomfield C.A., Hackley B.E. Jr. The role of interleukin-6 (IL-6) in human sulfur mustard (HD) toxicology // Intern. J. Toxicol — 2001. 20. -P.281-296.

8. Zhao X.s Shippy S.A. Competitive immunoassay for microliter protein samples with magnetic beads and near-infrared fluorescence detection // Anal. Chem. — 2004. — 76. P.1871-1876.

9. Léonard J.-F., Courcol M. and Gautier J.-C. Optimization of SELDI for Biomarker Detection in Plasma // Methods Mol. Biol. 2011. - 691. - P.351-368.

10. Peter J., Unverzagt C., Krogh T.N., Vorm O., Hoesel W. Identification of precursor forms of free prostate-specific antigen in serum of prostate cancer patients by immunosorption and mass spectrometry // Cancer Res. 2001. - 61. — P.957-962.

11. Villanueva J., Philip J., Entenberg D., Chaparro C.A. Serum peptide profiling by magnetic particle-assisted, automated sample processing and MALDI-TOF mass spectrometry II Anal. Chem. 2004. - 76. - P. 1560-1570. '

12. Sandhu A., Handa H., Abe M. Synthesis and applications of magnetic nanoparticles for biorecognition and point of care medical diagnostics // Nanotechnology. 2010. -21(44).

13. Villanueva J., Lawlor K., Toledo-Crow R., Tempst P. Automated serum peptide profiling. Protein // Nat. Protoc. 2006. - 1(2). - P.880-891.

14. Petricoin E. F., Liotta L. A. Mass Spectrometry-based Diagnostics: The Upcoming Revolution in Disease Detection // Clinical Chemistry — 2003. 49. -P.533-534.

15. Guerrier L., Righetti P.G., Boschetti E. Reduction of dynamic protein concentration range of biological extracts for the discovery of low-abundance proteins by means of hexapeptide ligand,library // Nature Protocols. 2008. — 3 -P.883-890.

16. Niesen M.L., Savitski M.M., Zubarev R.A. Extent of modifications in human proteome samples and their effect on dynamic range of analysis in- shotgun proteomics // Mol Cell. Proteomics. 2006. - 5. - P.2384-2391.

17. Anderson N.L., Anderson- N.G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects // Molt Cell Proteomics. 2002. - 1. - P.845-867.

18. Ivanov Yu.D., Govorun V.M., Bykov V.A., Archakov A.I. Nanotechnology in proteomics II J. Proteomics. 2006. - 6. - P. 1399-1414.

19. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of head to bacteriophage T4 // Nature. 1970. - 227. - P.680-685.

20. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins HJBC. 1975. - 250. - P.4007^021.

21. Wu T., Malinverni J., Ruiz N., Kim S., Silhavy T.J. and Kahne D. Identification of a Multicomponent Complex Required for Outer Membrane Biogenesis in Escherichia coli H Cell. 2005. - 121. - P.235-245. ,<

22. Pietrogrande M.C., Marchetti N., Dondi F., Righetti P.G. Spot overlapping in two-dimensional Polyacrylamide gel electrophoresis separations: A statistical study of complex protein maps // Electrophoresis. 2002. - 23. - P.283-291.

23. Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains // Proteomics. 2002. - 2. - P.3-10.

24. Kossowska B., Dudka I., Gancarz R., Antonowicz-Juchniewicz J. Proteomic analysis of protein profiles in some pathological stages of the human organism // Postepy Hig MedDosw. 2009. - 63. - P.549-563.

25. Anderson N.L., Anderson N.G. High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins // PNAS. 1977. - 74. - P.5421-5425.

26. Cutler P. Protein arrays: the current state-of-the-art // Proteomics. 2003. -3. -P.3-18.

27. Mauri P., Scigelova M. Multidimensional protein identification technology for clinical proteomic analysis // Clin. Chem. Lab. Med. 2009. - 47. - P.636-646.

28. Jenkins R.E., Pennington S. Arrays for protein expression profiling: Towards a viable alternative to two-dimensional gel electrophoresis? // J. Proteomics. 2001. l.-P.13-19.

29. Nomura F. Clinical proteomics in laboratory medicine // Rinsho Byori. 2006.- 54. -P.413-420.

30. Mijatovic D., Eijkel J.C., den Berg A. Technologies for nanofluidic systems: top-down vs. bottom-up // RSC Lab. Chip. 2005 - 5 - P.492-500.

31. Pieper R., Su Q., Gatlin C.L., Huang S.T., Anderson N.L., Steiner S. Multicomponent immunoaffinity subtraction chromatography: An innovative step towards a comprehensive survey of the human plasma proteome // J. Proteomics.2003. 3. - P.422-432.

32. Echan L.A, Tang H.-Y., Ali-Khan N., Lee K., David W. SpeicherDepletion of multiple high-abundance proteins improves protein profiling capacities of human serum and plasma // J. Proteomics. — 2005. 13. - P.3292-3303.

33. Lueking A., Possling A., Huber O., Beveridge A., Horn M., Eickhoff H., Schuchardt J, Lehrach H., Cahill D.J. A Nonredundant Human Protein Chip for Antibody Screening and Serum Profiling // Mol. Cell. Proteomics. 2003. - 2. -P.1342-1349.

34. Rai A.J. Abundant protein' depletion in search of biomarkers // Med. Sci. (Paris). — 2007. 1. - P.5-8.

35. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins //Proteomics. 2009. - 9. - P.1326-1343.

36. Zhu H., Snyder M. Protein chip technology // Curr. Opin. Chem. Biol 2003.- 7. P.55-63.

37. Zhu H., Snyder M. Protein arrays and microarrays // Curr. Opin. Chem. Biol -2001. 5. - P.40-45.

38. Lee K.-B., Park S.-J. Protein Nanoarrays Generated By Dip-Pen Nanolithography // Science. 2002. - 295. - P. 1702-1705.

39. Agarwal G., Naik R.R. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Nickel by Electrochemical Dip Pen Nanolithography // JACS. 2003. - 125. - P. 74087412.

40. Jwa-Min N., Sang Woo H. Bioactive Protein Nanoarrays on Nickel Oxide Surfaces Formed by Dip-Pen Nanolithography // Angew. Chem. Int. Edit. 2003.- 43. P.1246-1249.

41. Minsu L., Dong-Ku K. Protein nanoarray on Prolinker surface constructed by atomic force microscopy dip-pen nanolithography for analysis of protein interaction // J. Proteomics. 2006. - 6. - P. 1094-1103.

42. Schweitzer B., Kingsmore S.F. Measuring proteins on microarrays // Curr. Opin. Biotechnol 2002. - 13. - P. 14-19.

43. Arntz Y., Lang H.P., Zhang J., Hunziker P., Ramseyer J.P., Meyer E., Hegner M. and Gerber Ch. Label-free protein assay based on a nanomechanical cantilever array // Nanotechnol. 2003. - 14. - P.89-90.

44. Ji H.F., Yang X. Molecular recognition of biowarfare agents using micromechanical sensors // Expert Rev. Mol. Diagn. 2004. - 4. - P.859-866.

45. Mukhopadhyay R., Sumbayev V.V. Cantilever Sensor for Nanomechanical Detection of Specific Protein Conformations // Nano Letters. 2005. -5. -P.2385-2388.

46. Huber, F., Hegner M. Label free analysis of transcription factors using microcantilever arrays // Biosens. Bioelectron. 2006. - 21. - P. 1599-1605.

47. Backmann N., Zahnd C., et al. A label-free immunosensor array using single-chain antibody fragments // PNAS. 2005. - 102. - P. 14587-14592.

48. Tian F., Hansen K. M. Dynamic Microcantilever Sensors for Discerning Biomolecular Interactions // Anal. Chem. 2005. - 77. - P.1601-1606.

49. Braun T., Backmann N., Vogtli M., Bietsch A., Engel A., Lang H.-P., Gerber C. and Hegner M. Conformational Change of Bacteriorhodopsin Quantitatively Monitored by Microcantilever Sensors // Biophys. J. 2006. - 90. - P.2970-2977.

50. Thompson J.B., Hansma H.G., Hansma P.K., Plaxco K.W. The backbone conformational entropy of protein folding: experimental measures from atomic force microscopy // JMB. 2002. - 322. - P.645-652.

51. Ng S.P; Randies L.G., Clarke J. Single molecule studies of protein folding using atomic force microscopy // Meth. Mol. Biol. 2007. - 350. - P. 139-167.

52. Best R.B., Clarke J. What can atomic force microscopy tell us about protein folding? // Chem Commun (Camb). 2002. - 7. - P. 183-192.

53. MacBeath G., Koehler A.N., Schreiber S.L. Printing small molecules as microarrays and detecting protein-ligand interactions // J ACS. 1999. - 121. -P.7967-7968.

54. El Kirat K., Morandat S., Dufrene Y.F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy // Biochim. Biophys. Acta. 2009. - 1798. -P.750-765.

55. Stephan, H., Horst V. Covalent attachment of functionalized lipid bilayers to planar waveguides for measuring protein binding to biomimetic membranes // Prot. Sci. 1995. - 4. - P.2532-2544.

56. Rich R.L., Day Y.S.N. Higb-Resolution and High-Throughput Protocols for Measuring Drug/Human Serum^ Albumin Interactions Using BIACORE // Analyt. Biochem. 2001. - 296(2). - P. 197-207.

57. Templin M.F., Stoll D., Schrenk M., Traub P.C., Vohringer C.F., Joos T.O. Protein microarray technology // Trends Biotechnol: 2002. - 20. - P. 160-166.

58. Zhu H., Klemic J.F., Chang S., Bertone P., Casamayor A., Klemic K.G., Smith D., Gerstein M., Reed M.A., Snyder M. Analysis of yeast protein kinases using protein chips // Nat. Gen. 2000. - 26. - P.283-289.

59. Kim J., Junkin M., Kim D.-H., Kwon S., Shin Y. S., Wong P.K., Gale B.K. Applications, techniques, and microfluidic interfacing for nanoscale biosensing // Microfluid. Nanofluid. 2009. - 7. - P. 149-167.

60. Gymara M.J., Ercilla G. Assessment of synthetic peptides for hepatitis A diagnosis using biosensor technology // J. Immunol. Meth. 2000. - 246. - P.13-24.

61. Baldini F., Carloni A., Giannetti A.m, Porro G., Trono C. A new optical platform for biosensing based on fluorescence anisotropy // Anal. Bioanal. Chem. -2008.- 391. -P.1837-1844.

62. Ivanov Yu.D., Govorun V.M., Bykov V.A., Archakov A.I. Nanotechnology in proteomics // J. Proteomics. 2006. - 6. - P.1399-1414.

63. Homola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - 377. - P.528-539.

64. Breitenstein M, Hôlzel R, Bier FF. Immobilization of different biomolecules by atomic force microscopy II J. Nanobiotech. -2010. 8. - P. 10-17.

65. Tang Q., Shi S.Q., Zhou L. Nanofabrication with atomic force microscopy // J. Nanosci. Nanotechnol. 2004. - 4(8). - P.948-963.

66. Abgrall P., Gué A.-M. Lab-on-chip technologies: making a microfluidic network and coupling it into a complete microsystem // J. Micromech. Microeng — 2007.-. 17.-P. 15-25.

67. Hinterdorfer P., Dufrene Y.F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy // Nat. Meth. 2006. - 3. -P.347-355.

68. Pawlak M., Schick E., Bopp M.A., Schneider M.J., Oroszlan P., Ehrat M. Zeptosens' protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis // J. Proteomics. 2002. - 2. - P.383-393.

69. Chilkoti A., Boland T., Ratner B.D. and Stayton P.S. The relationship between ligand-binding thermodynamics and protein-ligand interaction forces measured by atomic force microscopy // Biophys. J. 1995. - 69. -P. 2125-2130.

70. Hinterdorfer P., Dufrene Y.F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy // Nat. Methods.- 2006. 3. -P.347-355.

71. Frank I., Hofbauer F. Single-molecule mechanics: Breaking bonds at a stretch //Nat. Chemistry. 2009. - 1.-P.180-181.

72. Bentzen E., Wright D.W., Crowe J.E. Nanoscale tools for rapid and sensitive diagnosis of viruses // Future Virology. 2006. - 1. - P.769-781.

73. Kuznetsov Y.G., McPherson A. Nano-fibers produced by viral infection of amoeba visualized by-atomic force microscopy// Biopolymers. 2010.

74. Nettikadan S.R., Johnson J.C., Mosher C., Henderson E. Virus particle detection by solid phase immunocapture and atomic force microscopy // BBRC. -2003 .-311.- P.540-545.

75. Gaczynska M., Osmulski P. A. AFM of biological complexes: What can we learn? // COCIS. 2008. - 13. - 351-367.

76. Allen S., Chen X. D. Detection of Antigen-Antibody Binding Events with the Atomic Force Microscope // Biochemistry. 1997. - 36. - P.7457-7463.

77. Breitenstein M., Holzel R., Bier F.F. Immobilization of different biomolecules by atomic force microscopy // J Nanobiotechnology. — 2010. — 8. -P. 10-17.

78. Johnson J.C., Nettikadan S.R., Vengasandra S.G., Henderson E. Analysis of solid-phase immobilized antibodies by atomic force microscopy // J. Biochem. Biophys. Meth. 2004. - 59(2). - P167-180.

79. Polishchuk V.P., Tyvonchik T.P., Boiko A.L. Use of atomic force microscopy to study the morphology and structure of virusis // Mikrobiol. Z. -2000. 62. - P.40-43.

80. Salgia R. Expression of the focal adhesion protein paxillin in lung cancer and its relation to cell motility // Oncogene. 1999. - 18. - P. 67-77.

81. Cross S., Jin Y.-S., Rao J., Gimzewski J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients // Nature Nanotech. 2007. - 13. - P.33-37.

82. Guresh S., Spatz J., Mills J.P., Micoulet A., Dao M., Lim C. T., Beil M., Seufferlein T. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria II Acta Biomater. 2005. - 1. - P. 15-30.

83. Suresh S. Nanomedicine: elastic clues in cancer detection // Nat. Nanotechnol. 2007. - 2. - P.748-749.

84. Gan Y. Atomic and subnanometer resolution in ambient conditions by atomic force microscopy // Surface Science Reports. — 2009. 64. - P.99-121.

85. Casuso I., Scheming S. Automated setpoint adjustment for biological contact mode atomic force microscopy imaging // Nanotech. J.- 2010.-21 (3).

86. Perez R., Garcia R., Schwarz U. High-resolution noncontact atomic force microscopy // Nanotech. J. 2009. - 20 (26) - P.264001-264021.

87. MacBeath G., Koehler A.N., Schreiber S.L. Printing small molecules as microarrays and detecting protein-ligand interactions // JACS. — 1999. 121. -P.7967-7968.

88. Radke K.M., Nettikadan S.R., Johnson J.C., Vengasandra S.G., Henderson E. ViriChip enhances reverse transcriptase polymerase chain reaction in biological fluids and environmental*samples // Anal. Biochem. 2004. - 330. - P.350-352.

89. Henderson E. BioForce Nanosciences // Nanomed. — 2007. 2. - P.391-396.

90. Allen S., Chen X. D. Detection of Antigen-Antibody Binding Events with the Atomic Force Microscope // Biochemistry. 1997. - 36. - P.7457-7463.

91. Shepard C., Finelli L., Alter M. Global epidemiology of hepatitis C virus infection // Lancet Infect. Dis.- 5. P.558-567.

92. Wong T., Lee S.S. Hepatitis C: a review for primary care physicians // CMAJ. 2006. - 174. - P.649-659.

93. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F.} Irvine B., et al. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series ofsubtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region // J. Gen. Virol. — 1993. -74. -P.2391-2399.

94. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science. 1989. - 244. -P.359-362.

95. Alberti A.L. Prevalence of liver disease in a population of asymptomatic persons with hepatitis C virus infection // Hepatology. 2002. - 36. - P. 195-200.

96. Walker C.M. Adaptive immunity to the hepatitis C virus // Adv. Virus Res. -2010. 78. - P.43-86.

97. Szalay F. Hepatitis C virus infection and hepatocarcinogenesis // Orv Hetil. -2010.-151-P.1524-1529.

98. Wilkins T., Malcolm J.K., Raina D., Schade R.R. Hepatitis C: diagnosis and treatment // Am. Fam. Physician.- 2010. -81(11). P. 1351-1357.

99. Alberti A.L. Prevalence of liver disease in a population of asymptomatic persons with hepatitis C virus infection // Hepatology. 2002 - 36. - P. 195-200.

100. Di Bisceglie A.M. Natural history of hepatitis C: Its impact on clinical management // Hepatology. 2000. - 31. - P. 1014-1018.

101. Seeff L.B. Natural history of hepatitis C // Hepatology. -1997. 26. - P.21 -28.

102. Glick M. Treating asymptomatic patients // J. Am. Dent. Assoc. 2005. -136(12).-P.1632-1634.

103. Ogata N.3 Alter H.J., Miller R.H., Purcell R.H. Nucleotide sequence and mutation rate of the H strain of hepatitis C virus // PNAS. 1991. - 88. - P.3392-3396.

104. Prince A.M., Huima-Byron T., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral Hepatitis. 2007. - 3. - P. 11-17.

105. Alter M.J. Epidemiology of hepatitis C in the West // Semin. Liver Dis. -1996.- 15.-P.5-14.

106. Courouce A.M., Bouchardeau F., Girault A., Le Marrec N. Significance of NS3 and NS5 antigens in screening for HCV antibody // Lancet. 1994. - 343. -P.853-854.

107. Kobayashi M., Tanaka E., Matsumoto A., Yoshizawa K. Clinical application of hepatitis C virus core protein in early diagnosis of acute hepatitis C II J. Gastroenterology. — 1998. — 33. — P.508-511.

108. Kapprell H.P., Michel. G., Hampl H. Demonstration of specific detection of anti-HCV IgM core antibodies // J. Virol. Methods. 1996. - 59. - P.121-126.

109. Lau G.K., Lesniewski R., Johnson R.G., Davis G.L. Immunoglobulin M and A antibodies to hepatitis С core antigen in chronic hepatitis С virus infection // J. Med. Virol. 1994. - 44. - P. 1-4.

110. Martinelli A.L., Brown D., Braun H.-B. Quantitative assessment of hepatitis С virus RNA and IgM antibodies to hepatitis С core in chronic hepatitis С И J. Hepatol. 1996. - 24. -P.21-26.

111. Афанасьев А.Ю. Индикация антител к вирусу гепатита С с разделением на классы IgM и lgG и ее клиническое значение // Клинич. лаб. Диагностика. 1996. - 2. - С.43-44.

112. Caruntu F.A., Benea L. Acute hepatitis С virus infection: Diagnosis, pathogenesis, treatment// J. Gastrointestin. Liver Dis. 2006. - 15(3)-. — P.249-256.

113. Zaaijer H.L., Cuypers H.T., Reesink H.W., Winkel I.N., Gerken G., Lelie P.N. Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis -С virus // Lancet. 1993. - 341. - P.722-724.

114. Hijikata M., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., and Shimotohno K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis IIPNAS. 1991. - 1. - P. 5547-5551.

115. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products // Journal of Am. Soc. Microbiol. 1993 - 67. - P.1385-1395.

116. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates' collected worldwide // PNAS. 1993. - 90. P.8234-8238.

117. Hussy P., Langen H., Mous J., Jacobsen H. Hepatitis C virus core protein: Carboxy-terminal boundaries of two processed species suggest cleavage by a signal peptide peptidase // Virology. 1996. - 224. - P.93-104.

118. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.-S., Zhu-N., Michael L. Homotypic Interaction and Multimerization of Hepatitis C Virus Core Protein // Virology. -1996.-218.-P.43-51.

119. Nolandt O., Kern V., Muller H., Pfaff E., Theilmann L., Welkerl R. and Krausslich H.-G. Analysis of hepatitis C virus core protein interaction domains // J. Gen. Virol 1997. - 78. - P. 1331-1340.

120. Yan B.-S., Tam M.H., Syu W.-Jr. Self-association of the C-terminal domain of the hepatitis C virus core protein // FEBS. 2004. - 258. - P.100-106.

121. Miller R.H., Purcell R.H.Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups // PNAS. 1990. - 87. - P.2057-2061.

122. Collett M.S., Larson R., Belzer S.K., Retzel E. Characterization of bovine viral proteins // Virology. 1988. - 165. -P.200-208.

123. Reed K.E., Rice C.M. Overview of hepatitis C virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties // Current topics in microbiology and immunology. — 2000. -242. — P.55-84.

124. Dubuisson J., Rice C.M. Hepatitis C virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin // J. Virol. — 1996. 70. - P.778-786.

125. Matsuura Y., Suzuki T., Suzuki R., Sato M., Aizaki H., Saito I., Miyamura T. Processing of El and E2 glycoproteins of hepatitis C virus expressed in mammalian and insect cells // J. Virol- 1994. 205. - P.141-150.

126. Reed K.E., Rice C.M. Overview of hepatitis C virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties // Curr. Top Microbiol. Immunol. -2000.-242.-P.55-84.

127. Op De Beeck A., Cocquerel L., Dubuisson J. Biogenesis of hepatitis C virus envelope glycoproteins // J. Gen. Virol 2001. - 82. - P.2589-2595.

128. De Beeck A.O., Dubuisson J. Topology of hepatitis C virus envelope

129. Glycoproteins // Rev. Med. Virol. 2003. - 13. - P.233-241.

130. McCaffrey K., Gouklani H., Boo I., Poumbourios P., Drummer H.E. The variable regions of Hepatitis C Virus glycoprotein E2 have an essential structural role in glycoprotein assembly and virion infectivity // J. Gen. Virol. 2010.

131. Cividini A., Rebucci C., Silini E., Mondelli M.U. Is the natural history of hepatitis C virus carriers with normal aminotransferase really benign? // Gastroenterology. -2001. 121. - P. 1526-1527.