Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов

Лапшина, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов"

На правах рукописи

ЛАПШИНА Мария Александровна

АССОЦИАЦИЯ БЕЛКА р53 С ЯДЕРНЫМ МАТРИКСОМ В КЛЕТКАХ РАЗНЫХ ТИПОВ

03.01.04 - биохимия

4845475

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

Нижний Новгород - 2011

4845475

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Института проблем химической физики РАН, г. Черноголовка

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Терентьев Алексей Алексеевич

доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты: Новиков Виктор Владимирович

ГОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского

доктор биологических наук, профессор Бояринова Лариса Валентиновна

ГОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия, г. Нижний Новгород

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «26» мая 2011 г. в «15» часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. Н.И.Лобачевского по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского.

Автореферат разослан << /^»¿£¿¿^¿12011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н., доцент

Копылова С.В.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Опухолевый супрессор - белок р53 - играет ключевую роль в регуляции клеточного ответа на ДНК-повреждающие факторы. Активация белка р53 в ответ на различные виды стресса приводит к остановке пролиферации или апоптозу. Мутации гена р53 обнаруживаются в 50% опухолей, его выключение методом «нокаута» нелетально, но приводит к быстрой гибели организма от спонтанного канцерогенеза, что отражает важную роль р53 в супрессии опухолей. Белок р53 относится к факторам транскрипции, и его основные функции связаны с активацией или супрессией генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и клеточной гибели (Чумаков 2007, Joerger & Fersht 2008). Подобно другим факторам транскрипции, р53 обнаружен в составе белкового остова клеточного ядра - ядерного матрикса (Jiang et al. 2001, Okorokov et al. 2002, Peidis et al. 2011).

Ядерный матрикс (ЯМ) - структура, которая обеспечивает внутриядерное распределение макромолекул и надмолекулярных комплексов и обеспечивает пространственную координацию биохимических процессов, происходящих в клеточном ядре (Rynearson & Sussman 2011). Нарушения структуры ЯМ приводят к возникновению серьезных патологий, и мутации в генах, кодирующих белки ЯМ, связаны с нарушением репарации ДНК, регуляции клеточного роста и дифференцировки клеток. Многие наследственные заболевания (ламинопатии, липодистрофии, мышечные дисплазии, нейродегенеративные заболевания и др.) вызываются мутациями в генах ферментов, структурных белков, транскрипционных факторов, которые входят в состав ядерного матрикса (Broers et al. 2006, Jing et al. 2010, Maraldi et al. 2010). В настоящее время некоторые белки ядерного матрикса применяются в качестве молекулярных маркеров для диагностики опухолей мочевого пузыря, молочной железы и толстой кишки (Smrkolj et al. 2011, Walgenbach-Brunagel et al. 2008).

Несмотря на огромное количество литературы, посвященной структуре и свойствам белка р53, а также структуре и функциям ядерного матрикса, о взаимодействии р53 с ЯМ известно мало. Данные по ассоциации белка р53 с ядерным матриксом немногочисленны и противоречивы (Jiang et al. 2001, Okorokov et al. 2002, Ben-Jehoada et al. 2003). В то же время, механизмы этого взаимодействия исключительно важны, поскольку их нарушения, вызывая изменение субъядерной локализации белка р53, могут привести к подавлению его функций. В связи с этим, настоящая работа посвящена изучению ассоциации белка р53 с ядерным матриксом с применением разных подходов к получению ЯМ из клеток различных типов.

Цель н задачи работы

Целью данной работы является исследование взаимодействия белка р53 с ЯМ в клетках разных типов и анализ матрикссвязанного пула белка р53. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. С применением различных методов получить препараты ЯМ и изучить их структурные особенности.

2. Изучить субъядерную локализацию белка р53 в клетках нескольких линий при использовании разных методов получения ЯМ.

3. Изучить экстрагируемость белка р53 в присутствии слабых растворов щелочи, кислоты и неионного детергента из препаратов ЯМ клеток разных типов.

Научная новизна работы

Показано, что в процессе получения препаратов ядерного матрикса в его структуре могут происходить изменения, которые приводят к его частичному разрушению. Обнаружено, что степень ассоциации р53 с ядерным матриксом зависит от типа клеток. Впервые обнаружена возможность разделения матрикссвязанного пула белка р53 на отдельные субпулы. Показано, что белок р53 в составе ядерного матрикса клеток разных типов представлен гетерогенной группой белковых молекул, которые по-разному экстрагируются из ядерного матрикса растворами щелочи, кислоты и неионным детергентом.

Научно-практическая значимость работы

В связи с важными функциями белка р53 в защите многоклеточного организма от возникновения опухолей, полученные результаты представляют интерес для исследований, посвященных функционированию опухолевого супрессора р53 и регуляции его активности. Вопрос о механизмах, определяющих связь белка р53 с ядерным матриксом, интенсивно исследуется в настоящее время, и результаты работы важны для понимания межмолекулярных взаимодействий, в которых принимает участие р53 в составе ядерного матрикса.

Работа также представляет интерес для исследований в области структуры ядерного матрикса и его роли в регуляции внутриядерных процессов. Полученные в работе данные, показывающие различия в стабильности его структуры в процессе очистки из клеток разных типов, свидетельствуют о необходимости применения нескольких подходов к его получению в ходе изучения внутриядерного распределения белков.

Учитывая большое значение белка р53 и р53-зависимых процессов для противоопухолевой терапии, результаты работы могут быть использованы как для изучения процессов канцерогенеза, так и для разработки подходов к лечению онкологических заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В клетках разных типов степень ассоциации белка р53 с ядерным матриксом различна. В зависимости от типа клеток, белок р53 может обнаруживаться либо исключительно в ядерном матриксе, либо частично присутствовать в матрикснесвязанных фракциях клеточного ядра.

2. Белок р53, связанный с ядерным матриксом, представляет собой гетерогенный пул белковых молекул, для которых характерна разная экстрагируемость в слабых растворах щелочи, кислоты и неионного детергента.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований были представлены в виде устных и стендовых докладов на российских и международных конференциях: «Биология - Наука XXI века» (Пущино, 2003, 2004, 2005), «Молодая наука в классическом университете» (Иваново, 2004), «Cell Signaling World 2006. Signal Transduction Pathways as therapeutic targets» (Luxembourg, 2006), «Conference for young scientists on molecular biology and genetics» (Kiev, 2007), «Современная химическая физика» (Туапсе, 2007) и на конкурсе молодых ученых ИПХФ РАН им. С.М. Батурина (Черноголовка, ИПХФ РАН, 2005).

Публикации

По результатам работы опубликованы 3 статьи и 7 тезисов докладов, список которых приводится в конце реферата.

Личный вклад автора

Автором работы выполнены очистка препаратов ядерного матрикса, очистка РНК, анализ экспрессии мРНК генов-мишеней р53 методом ОТ-ПЦР, электрофорез белков и нуклеиновых кислот, окраска белков, иммуноблотинг, иммунофлуоресцентная микроскопия. Получение клеточных лизатов, ядерных и цитозольных экстрактов были выполнены совместно с Р.И. Папиной (ИПХФ РАН). Очистка ядер из клеток была проведена совместно с И.И. Пархоменко (ИПХФ РАН).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературных источников. Работа изложена на 116 страницах и включает 22 рисунка и 1 таблицу. Список цитируемой литературы содержит 182 источника.

Основное содержание работы

Методы исследования

Эксперименты проводили на клетках нескольких линий: НЕК293 - клетки почечного эпителия эмбрионов человека, трансформированные ДНК аденовируса Ad5, HeLa - аденокарцинома шейки матки человека, MCF7 -аденокарцинома молочной железы человека, COS-7- фибробластоподобные клетки почек африканской зеленой мартышки, трансформированные ДНК вируса SV-40. Все культуры выращивались в атмосфере 5% С02 в среде

DMEM, содержащей либо 10% сыворотку новорожденных телят (РАА Laboratories), либо 10% эмбриональную сыворотку телят (Gibco).

Первичные антитела: поликлональные антитела кролика против белка р53 и поликлональные антитела козы против белка ламина В (Santa Cruz Biotechnology, США). Вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена: антитела козы против кроличьих IgG (Amersham Biosciences, Santa Cruz Biotechnology, США); мышиные антитела против IgG козы, (Amersham Biosciences, Santa Cruz Biotechnology, США). Вторичные антитела, коньюгированные с флуоресцентным красителем Texas Red: мышиные антитела против IgG козы (Santa Cruz Biotechnology, США).

Клеточные лизаты получали гомогенизацией клеток в лизирующем буфере (50 мМ Hepes, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 25 мМ NaF, 10 мкМ ZnCl2, 1% Triton Х-100, 2 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ) на льду с последующим осветлением центрифугированием при 10000 g.

Клеточные ядра очищали гомогенизацией клеток в буфере 0.25 STC (0.25 М сахароза, 50 мМ Трис-HCl (рН 9.0), 5 мМ СаС12, 20 мМ NH4C1, 2 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ), который содержал 0.2% тритон Х-100, с последующим нанесением на буфер I STC (тот же, что и 0.25 STC, но содержащий 1М сахарозу) (Rubin et al. 1976). Затем ядра повторно ресуспендировали в буфере 0.25 STC и очищали через буфер 1 STC. Концентрацию хроматина определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм.

Препараты ЯМ in vitro получали с применением нескольких методов. Для получения ЯМ по методу «DN» (DNase - NaCl) (Staufenbiel & Deppert 1984) очищенные ядра вначале ресуспендировали в нуклеазном буфере (0.25 М сахароза, 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 5 мМ MgCl2, 1 мМ СаС12, 2 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ) до концентрации хроматина 6 мг/мл, добавляли ДНКазу I (SERVA, Германия) до концентрации 250 едениц фермента на 1 мг хроматина и инкубировали 30 мин на льду. После центрифугирования получали нуклеазную матрикснесвязанную фракцию («Н»), Дальнейшую экстракцию матрикснесвязанного хроматина проводили в буфере ТМ (10 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 0.2 мМ MgCl2, 2 мМ ФМСФ, 1 мМ ДТТ), после центрифугирования получали фракцию «ТМ». Затем хроматин экстрагировался раствором 2 М NaCl на буфере ТМ (фракция «ВС»). После отмывки буфером ТМ (фракция «О») получали конечный препарат «ЯМ».

Для получения препаратов ядерного матрикса по методу «DA» (DNase -ammonium sulfate) (Не et al. 1990) хроматин обрабатывался ДНКазой I в указанных выше условиях, а затем в суспензию сразу добавляли 0.25 М (NH4)2S04 для экстракции матрикснесвязанного хроматина. После центрифугирования получали нуклеазно-высокосолевую матрикснесвязанную фракцию («НВС»). После отмывки (фракция «О») получали конечный препарат «ЯМ».

Для получения препаратов ядерного матрикса по методу «ND» (NaCl -DNase) (Berezney & Coffey 1977) очищенные клеточные ядра вначале подвергались высокосолевой экстракции хроматина в 1.5 М NaCl на буфере ТМ. После центрифугирования получали высокосолевую матрикснесвязанную фракцию («ВС»), Затем ядра промывались буфером ТМ (фракция «ТМ») и

обрабатывались ДНКазой I в указанных выше условиях (получали фракцию «Н»). После отмывки буфером ТМ (фракция «О») получали конечный препарат «ЯМ».

Получение ЯМ in situ проводилось по тем же методикам путем последовательной инкубации клеток, выращенных на обработанной 0.01% полилизином стеклянной подложке, соответствующими экстрагирующими растворами. Иммунофлуоресцентная микроскопия проводилась после окрашивания ламина В в образцах. Для этого образцы фиксировали 4% формальдегидом и пермеабилизовали 1% тритоном Х-100, а затем инкубировали в блокирующем буфере, содержащем PBS (137 мМ NaCl, 2.68 мМ КС1 , 4.29 мМ Na2HP04, 1.47 мМ КН2Р04, рН 7.4) и 5% бычий сывороточный альбумин. После блокирования образцы инкубировали с первичными, а затем - вторичными антителами в блокирующем буфере в разведении 1:100. После промывки PBS и водой образцы подсушивали и укладывали на предметные стекла со средой Fluoremount-G (Southern Biotech, США). Микроскопию и фотосъемку проводили на микроскопе Leitz (Германия).

Экстракция матрикссвязанных белков проводилась путем ресуспендирования полученных образцов ЯМ в буфере ТМ, содержащем 0.02 М NaOH, 0.02 М НС1 или 1% тритон Х-100 с последующим перемешиванием в течение 30 мин при +4°С.

Окраску серебром и иммуноблотинг проводили после денатурирующего электрофореза белков в ПААГ. Для окраски серебром гели последовательно фиксировались в растворах 50% метанол/10% уксусная кислота и 5% метанол/7% уксусная кислота, затем вымачивались в растворе 10% глутарового альдегида, промывались водой и вымачивались в растворе аммиачного нитрата серебра (0.5% NH4OH, 0.02 М NaOH, 0.008% AgN03). После промывки водой белковые полосы проявляли в растворе, содержащем 0.8 мМ лимоннокислого натрия и 0.009% формалина, проявление останавливали в растворе, содержащем 0.9 М Na2S203, 0.48 М Na2S03 и 5% уксусную кислоту.

Для иммуноблотинга белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (Amersham Biosciences, Великобритания) в буфере для переноса (25 мМ Трис-НС1, 19.3 мМ глицин, 20% метанол) при +4°С и силе тока в 100 тА. После переноса мембрану инкубировали в блокирующем растворе, который содержал буфер TBST (100 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 0.1% Tween-20), 5% бычий сывороточный альбумин и 0.02% NaN3, далее мембрану инкубировали с первичными антителами в разведении 1:1000, после промывки инкубировали в блокирующем растворе (без 0.02% NaN3), содержащем вторичные антитела в разведении 1:5000. Реакцию хемилюминесценции проводили с использованием смеси ECL- растворов: в 14 мл раствора А (100 мМ Трис-HCl, рН 8.5, 1.25 мМ люминол) добавляли 140 мкл раствора В (0.68 мМ р-кумаровая кислота в DMSO) и 5 мкл 30% Н202. Мембрану инкубировали в реакционной смеси в течение 1 минуты, а затем сигнал экспонировали на рентгеновскую пленку.

Результаты исследования и обсуждение

1. Сравнительный анализ белковых профилей различных препаратов ядерного матрикса

Известно, что белковый состав ЯМ различен в клетках разных типов (Збарский 1988, Rynearson & Sussman 2011). Однако белковый состав ЯМ может зависеть и от метода его получения. В данной работе для изучения ЯМ использовали три подхода к его получению ш vitro, наиболее широко представленные в современной литературе. Основные различия данных методов состоят в режимах солевой экстракции и гидролиза ДНК. На рис. 1 схематично изображены стадии очистки препаратов ЯМ с использованием разных методов, которые условно обозначены «DN», «DA» и «ND» (см. «Методы исследования»). На схеме указаны стадии фракционирования и фракции, получаемые в процессе очистки ЯМ.

Клеточные ядра

"DN" "DA" "ND"

Н ДНКаза I ДНКаза I ВС -»-1.5 М NaCI

ТМ-»-буфер ТМ НВС -—0.25 М (NH^SO. ТМ -»— буфер ТМ

I \ ♦

ВС —2 М NaCI О-*— буфер ТМ Н -*— ДНКаза I

* 4

О буфер ТМ О — буфер ТМ

I I

ям ям ям

Рис. 1. Схема стадий очистки ЯМ с использованием методов «DN», «DA» и «ND».

Сравнение белкового состава различных образцов ЯМ проводили на препаратах, полученных из клеток НеЬа. Для этого белки ЯМ подвергали денатурирующему электрофорезу в полиакриламидном геле с последующей окраской серебром. Для исследования низкомолекулярных белков использовали 10% ГТААГ, который позволяет разделять белки в диапазоне от 14 до 67 кДа, исследование высокомолекулярных белков проводили с помощью 7% ПААГ, который позволяет разделять белки в диапазоне от 67 до 210 кДа. На рис. 2 показаны электрофореграммы белков препаратов ЯМ, которые были получены из ядер клеток НеЬа, при использовании методов «БЫ», «ОА» и «N0».

Из рис. 2 видно, что для всех препаратов ЯМ характерно наличие общих белковых полос. Общие белки находятся, в основном, в области 30 кДа, 40-43 кДа, 67-70 кДа и 200 кДа. Интенсивность окрашивания этих белковых полос в разных препаратах отличается. Помимо общих белков, препараты ЯМ, полученные в различных условиях, содержат так же белки, обнаруживаемые только в определенных препаратах. Препарат ЯМ, очищенный по методу «N0», существенно отличается по белковому составу от препаратов, полученных по методам «ОЫ»и «БА». В препарате ЯМ «N0» более, а в ЯМ «ОЫ» менее чем в других препаратах, выражены белки с молекулярными массами около 12-16

кДа, а также белки в области 30-35 кДа (рис. 2,а). Белок в области 210 кДа в значительной степени окрашивается в препарате ЯМ «DN», а белок с массой около 160 кДа отчетливо виден только в препарате ЯМ «ND» (рис. 2,6).

Хотя в данной работе идентификация белков в гелях не проводилась, есть основания полагать, что полосы в области молекулярных масс от 64 до 74 кДа соответствуют ламинам, в области молекулярных масс от 12 до 25 кДа - HMG белкам, а в области 170 кДа - топоизомеразе II а.

С применением различных подходов к очистке ЯМ ранее также получены препараты с разными белковыми профилями (Kallajoki & Osborn 1994, Wan & Nickerson 1999). Таким образом, полученные нами и литературные данные показывают, что белковый состав ЯМ отличается при использовании разных методов его очистки из одного источника. Различия в белковом составе ЯМ носят как качественный, так и количественный характер.

DN DA ND DN DA ND

210 —

67 —

43 — т л «т 140 —

30 — 1 4 *> $

20 — 14 — ■ Щ 67 — ■ f -

а б

Рис. 2. Результаты разделения белков препаратов ЯМ, очищенных различными методами из ядер клеток НеЬа, в 10% ПААГ (а) и 7% ПААГ (б) с последующей окраской белков серебром. Цифрами указаны молекулярные массы (в кДа) белковых маркеров.

2. Полное связывание ядерного белка р53 с ядерным матриксом клеток

НЕК293

Для изучения степени ассоциации белка р53 с ЯМ сравнивали его содержание в конечных препаратах ЯМ и во фракциях матрикснесвязанного хроматина. Для контроля эффективности разделения матрикссвязанных и матрикснесвязанных макромолекул и целостности ЯМ изучение содержания р53 в различных фракциях хроматина проводилось параллельно с анализом содержания ламина В в тех же фракциях.

На рис. 3 показано содержание ламина В и белка р53 в очищенных клеточных ядрах, растворимых фракциях хроматина и препаратах ЯМ, полученных из клеток НЕК293. При получении ЯМ с использованием 2 М №С1 после гидролиза ДНК (метод «БЫ») ламин В регистрируется в ядрах и в препарате ЯМ (рис. 3,а). Во фракциях матрикснесвязанного хроматина ламин В практически полностью отсутствует. Отсутствие ламина В в растворимых

фракциях хроматина говорит о том, что целостность ЯМ в процессе его очистки хорошо сохраняется.

Распределение белка р53 по фракциям аналогично распределению ламина В. Белок р53 наблюдается во фракции ядер и в ЯМ. Следовательно, ядерный пул белка р53 полностью ассоциирован с ЯМ при использовании данного способа его очистки.

Применение в качестве экстрагирующего агента 0.25 М (МН4)2804 для очистки ЯМ (метод «ЭА») приводит к получению другой картины распределения ламина В и р53. Из рис. Ъ,б видно, что ламин В регистрируется в ядрах и в ЯМ. Однако в значительной мере он присутствует также и во фракциях матрикснесвязанного хроматина - нуклеазно-высокосолевой фракции («НВС») и во фракции отмывки («О»), Распределение белка р53 по фракциям полностью совпадает с распределением ламина В. Так же, как и ламин В, р53 регистрируется в ядрах, ЯМ, нуклеазно-высокосолевой фракции и во фракции отмывки.

Таким образом, при использовании метода «ЭА» для получения ЯМ белок р53 обнаруживается в растворимых фракциях хроматина. В тех же растворимых фракциях обнаруживается ламин В, наличие которого показывает, что структура ЯМ частично дестабилизируется в ходе его очистки. В связи с этим, наличие белка р53 в матрикснесвязанных фракциях нельзя однозначно интерпретировать в пользу существования не связанного с ЯМ р53 в ядрах клеток НЕК293.

Я Н ТМ ВС о ям

я н тмвс о ям

р53

ЗВ Р53

Я НВС О ям

Я НДС 0 ЯМ

щтш _ —,

Рис. 3. Содержание ламина В и белка р53 в очищенных клеточных ядрах («Я»), растворимых фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса («ЯМ»), полученных с применением метода «ОЫ» (а), «ОА» (б) и «N0» (в) из клеток НЕК293.

На рис. 3,6 в показано содержание ламина В и р53 в очищенных клеточных ядрах, растворимых фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса, полученных по методу «N0». Видно, что ламин В регистрируется в ядрах, ЯМ, а также определенная доля белка выходит в высокосолевую фракцию («ВС»).

Применение 1.5 М №С1 до гидролиза ДНК приводит, очевидно, к разрушению ядерной оболочки в связи с тем, что при солюбилизации структурных белков хроматина ядерная ДНК сильно набухает. Подобное явление наблюдалось при микроскопии клеточных ядер после высокосолевой обработки без предварительного гидролиза ДНК (рис. 4).

□ шт

ми

□ №

Рис. 4. Иммунофлуоресцентное окрашивание ламина В в клетках, ядрах и препаратах ядерного матрикса, очищенных in situ из клеток НЕК293. Обозначения: а - ядра в необработанных клетках, б - ядра после очистки, в - ядра после гидролиза ДНК, г - ядра после гидролиза ДНК и высокосолевой экстракции 2 М NaCl, д - ядра после гидролиза ДНК и высокосолевой экстракции 0.25 М (NH4)2S04, е - ядра после высокосолевой экстракции 1.5 М NaCl без предварительной нуклеазной обработки. Указанная шкала соответствует 5 мкм.

Белок р53 при получении ЯМ по методу «ND» наблюдается в тех же фракциях, что и ламин В. Таким образом, р53, независимо от используемого метода очистки ЯМ, обнаруживается в тех же фракциях хроматина, где обнаруживается и структурный компонент ЯМ - ламин В. Полученные результаты показывают, что в клетках НЕК293 весь белковый пул р53 связан с ЯМ, и белок р53 не обнаруживается в матрикснесвязанной форме.

Известно, что в клетках НЕК293, трансформированных ДНК аденовируса, р53 взаимодействует с аденовирусными белками (Moran 1993). Это, в свою очередь, может приводить к изменению субъядерной локализации белка р53. Для характеристики взаимодействия р53 с ЯМ в клетках, не содержащих вирусных белков, было проведено исследование его субъядерной локализации в клетках MCF7.

3. Полное связывание активированного ядерного белка р53 с ядерным матриксом клеток MCF7

Для исследования связывания белка р53 с ЯМ в клетках MCF7 необходимо его накопление в количествах, достаточных для его регистрации. Для накопления р53 проводили обработку клеток MCF7 актиномицином D, который, как известно, активирует р53 (Kastan et al. 1991, Tishler et al. 1993).

Актиномицин Э __

4ч 6ч 8ч 10ч 12ч

Рис. 5. Содержание белка р53 в клетках МСР7 в контроле и через 4, 6, 8, 10 и 12 ч после внесения актиномицина Э в инкубационную среду.

На рис. 5 показано накопление белка р53 в клетках МСТ7 при обработке актиномицином В в концентрации 5 нМ. В контроле р53 практически не обнаруживается в клеточных лизатах. При действии актиномицина О р53 накапливается, и его экспрессия достигает максимума через 8 ч действия актиномицина Э.

На рис. 6 показано содержание ламина В и р53 в очищенных клеточных ядрах, растворимых фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса, полученных из клеток МСТ7. Как видно из рис. 6,а, при использовании метода «0№> ламин В обнаруживается в ядрах и ЯМ, а во фракциях матрикснесвязанного хроматина ламин В практически отсутствует. Внутриядерное распределение р53 совпадает с распределением ламина В.

Я ДТМВСД^ЯМ Я нвс о ям

В-Г^ ~Ш \ Ламин «Ш» —

Рис. 6. Содержание ламина В и белка р53 в очищенных клеточных ядрах («Я»), растворимых фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса («ЯМ»), полученных с применением метода «0№> (а), «ОА» (б) и «ИБ» (в) из клеток МСР7.

При использовании метода «БА» для получения ЯМ наблюдаются определенные отличия в распределении ламина В и р53 во фракциях матрикснесвязанного хроматина между препаратами, полученными на клетках НЕК293 и МСР7. Из рис. 6,6 видно, что оба белка обнаруживаются и в ЯМ, и в матрикснесвязанной нуклеазно-высокосолевой фракции («НВС»), В отличие от препаратов, полученных из клеток НЕК293 (рис. 3,6), ламин В и р53 не обнаруживаются в отмывочной фракции хроматина.

Определенные отличия между клетками этих линий наблюдаются также при сравнении распределения ламина В и р53 в матрикснесвязанных фракциях при получении ЯМ методом «ND». Оба белка содержатся во фракции «ТМ», полученной из клеток MCF7 (рис. 6,в), но не содержатся в этой же фракции из клеток НЕК293 (рис. 3,е).

Несмотря на указанные отличия, внутриядерная локализация белка р53 в клетках MCF7 схожа с распределением р53 в клетках НЕК293. Из рис. 3 и б видно, что в клетках обеих линий белок р53 солокализуется с ламином В. Полученные данные показывают, что в клетках MCF7 весь ядерный пул белка р53 после его активации актиномицином D ассоциирует с ЯМ.

Из литературы известно, что р53 может обнаруживаться как в растворимых матрикснесвязанных фракциях, так и в ЯМ. При использовании метода, сходного с методом «ND» (однако в качестве экстрагирующего агента применялся не NaCl, а 0.25 М (NH^SO^ р53 обнаруживается в высокосолевой фракции и в ЯМ (Jiang et al. 2001), что сходно с нашими результатами (рис. 3,е и 6,в). Однако при получении ЯМ по методу «DN» р53 обнаруживается исключительно в матрикснесвязанной форме (Ben-Jehoada et al. 2003), что существенно отличается от полученных нами результатов (рис. 3,а и 6,а). Эти различия могут быть связаны с применением клеток разных типов - в работе Ben-Jehoada et al. были использованы клетки COS-1. Для исследования возможности присутствия в клеточных ядрах матрикснесвязанного белка р53 был проведен анализ его внутриядерного распределения в схожих клетках линии COS-7.

4. Неполное связывание белка р53 с ядерный матриксом клеток COS-7

Впервые белок с молекулярной массой 53 кДа был обнаружен в составе ЯМ в клетках, трансформированных большим Т-антигеном вируса SV40 (Staufenbiel et al. 1983). В настоящей работе проведено исследование взаимодействия белка р53 с ЯМ в клетках COS-7 (клетки почек африканской зеленой мартышки, трансформированные большим Т-антигеном вируса SV-40). Чтобы исследовать внутриядерное распределение белка р53, мы использовали для очистки ЯМ методы «DN» и «DA». Метод «ND» в дальнейшей работе не применялся в связи очевидным повреждением ядер при солевой экстракции хроматина до нуклеазной обработки.

На рис. 7 представлены результаты проведенного исследования. Видно, что при фракционировании ядер клеток COS-7 ламин В регистрируется только в ядрах и в ЯМ, а во фракциях матрикснесвязанного хроматина он не обнаруживается. При этом в клетках НЕК293 и MCF7 при фракционировании по методу «DA» ламин В обнаруживался в матрикснесвязанных фракциях хроматина (рис. 3,6 и 6,6). По-видимому, ЯМ клеток COS-7 более устойчив к действию сульфата аммония, чем ЯМ других клеток из-за специфичного для каждого типа клеток белкового состава ЯМ, что может приводить к различной прочности белок-белковых взаимодействий.

Я Н TM ВС о ям

я нвс о ям

Я Н TM ВС о ям

я нвс о ям

Р53-

р53-

с*

Рис. 7. Содержание ламина В и белка р53 в очищенных клеточных ядрах («Я»), растворимых фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса («ЯМ»), полученных с применением метода «DN» (а) и «DA» (б) из клеток COS-7.

Белок р53 в ядрах клеток COS-7 регистрируется в препарате ЯМ, а также, в отличие от ламина В, р53 наблюдается в растворимых фракциях. Значительная доля белка р53 экстрагируется в высокосолевую фракцию («ВС» и «НВС»), и небольшая часть - в отмывочную фракцию («О», рис. 1,а). Таким образом, в клетках COS-7 белок р53 присутствует в матрикснесвязанных фракциях хроматина и, одновременно с этим, в этих же фракциях не обнаруживается ламин В. Данная картина внутриядерного распределения р53 существенно отличается от результатов, показанных на рис. 3 и 6. В клетках НЕК293 (рис.3) и MCF7 (рис. 6) р53 всегда солокализуется с ламином В, что говорит о его полной ассоциации с ЯМ. Отсутствие подобной солокализации в клетках COS-7 показывает, что р53 в ядрах этих клеток представлен двумя пулами -матрикссвязанным и матрикснесвязанным.

5. Экстракция белка р53 из ЯМ клеток разных типов слабыми растворами щелочи и кислоты

Из литературных данных известно, что основная часть белков ЯМ экстрагируется слабым раствором NaOH. Это связано с тем, что большая часть белков ЯМ представлена кислыми белками (Збарский 1988). Поскольку щелочная экстракция позволяет выявить щелочелабильные межмолекулярные взаимодействия, она может быть использована и для исследования характера связей, определяющих взаимодействие р53 с ЯМ.

Для всех экспериментов по экстракции матрикссвязанных белков применялись препараты ЯМ, полученные по методу «DN». На рис. 8 показано содержание ламина В и р53 в ЯМ и во фракциях ЯМ, экстрагируемых и не экстрагируемых растворами 0.02 М NaOH и 0.02 М HCl. Из рисунка видно, что ламин В обнаруживается как в щелоче- и кислоторастворимых, так и в щелоче-и кислотонерастворимых фракциях ЯМ. Таким образом, связи между белками ЯМ могут быть как щелоче-, так и кислотолабильными.

Из рис. 8,г-е видно, что белок р53 регистрируется в препарате ЯМ не только в виде полосы в области 53 кДа. Некоторое количество р53 в ЯМ представлено высокомолекулярными формами с массой выше 100 кДа. Эти высокомолекулярные формы белка р53 представлены, по всей видимости,

убиквитинированным р53. Хорошо известно, что белок р53 может подвергаться убиквитинированию с последующей протеасомной деградацией (СоиНэ Й а1. 2009).

Экстракция матрикссвязанных белков из ЯМ слабым раствором щелочи приводит к выходу большей части белка р53 в растворимую фракцию («Щ», рис. 8,д), при этом практически все высокомолекулярные формы белка р53 экстрагируются из ЯМ.

ЯМ Щ ЯМ(Щ) К ЯМ(К)

г д е

Рис. 8. Содержание ламина В (а-в) и белка р53 (г-е) в ЯМ клеток НЕК293 до (а, г) и после экстракции белков ЯМ раствором 0.02 М №ОН (б, д) и 0.02 М НО (в, е). Условные обозначения: «ЯМ» - ядерный матрикс до экстракции, «Щ» - щелочной экстракт белков ЯМ, «ЯМ(Щ)» - щелоченерастворимый ЯМ, «К» - кислотный экстракт ЯМ, «ЯМ(К)» -кислотонерастворимый ЯМ.

Результаты кислотной экстракции белков ЯМ показаны на рис. 8,в и е. Видно, что, как и при щелочной экстракции, часть ламина В экстрагируется из ЯМ кислотой. Из рисунка 8,е видно, что при кислотной экстракции большая часть белка р53 обнаруживается в кислотонерастворимом ЯМ (фракция «ЯМ(К)»), в этой же фракции ЯМ присутствуют высокомолекулярные формы белка р53. Таким образом, высокомолекулярные формы р53 по-разному экстрагируются в слабых растворах щелочи и кислоты. После экстракции в щелочи они преимущественно обнаруживаются в растворимой фракции, а при экстракции в кислоте - преимущественно обнаруживаются в нерастворимом ЯМ.

Данные результаты показывают, что ассоциация белка р53 с ядерным матриксом частично определяется щелочелабильными и, частично,-кислотолабильными взаимодействиями.

Присутствие белка р53 в ЯМ как в щелочерастворимой, так и кислоторастворимой форме, а также то, что высокомолекулярные формы р53 по-разному экстрагируются из ЯМ щелочным и кислым раствором, говорит о том, что белок р53 в составе ЯМ клеток НЕК293 существует в разных формах, то есть матрикссвязанный пул белка р53 не является однородным.

Подобная система экстракции была применена для исследования взаимодействия белка р53 с ЯМ в клетках МСР7 после активации р53 актиномицином О. Результаты исследования эффективности щелочной и кислотной экстракции из ЯМ белка р53, активированного актиномицином О, представлены на рис.9. Видно, что картина распределения ламина В во фракциях ЯМ клеток МСР7 схожа с распределением этого белка в ЯМ клеток НЕК293. Ламин В присутствует во всех фракциях ЯМ, независимо от экстрагирующего реагента (рис. 9,а-в). При экстракции щелочью он частично переходит в растворимую фракцию (фракция «Щ») (рис. 9,6), экстрагирование кислотой так же приводит к его частичному переходу в растворимую фракцию (фракция «К») (рис. 9,б).

Связанный с ЯМ активированный белок р53 при экстракции матрикссвязанных белков 0.02 М ИаОН обнаруживается преимущественно в растворимой фракции (фракция «Щ») (рис. 9,д). В то же время, при экстракции матрикссвязанных белков ЯМ 0.02 М НС1 практически весь р53 остается ассоциированным с матриксом (фракция «ЯМ(К)») и в растворимую фракцию («К») р53 не экстрагируется (рис. 9,е).

Таким образом, в клетках МСР7 наблюдается преимущественно одна форма белка р53, которая экстрагируется щелочью и не экстрагируется кислотой. Поскольку известно, что р53 в данных условиях находится в активном состоянии, можно сделать вывод о том, что активный белок р53 в клетках МСР7 связан с ЯМ щелочелабильными связями.

ЯМ Щ ЯМ(Щ) К ЯМ(К)

Ламин В - ш ** Щ

а б в

ЯМ Щ ЯМ(Щ) К ЯМ(К)

р53—

г д е

Рис. 9. Содержание ламина В (а-в) и белка р53 (г-е) в ЯМ клеток МСР7 до (а, г) и после щелочной (б, д) и кислотной (в, е) экстракции. Условные обозначения те же, что и на рис. 7.

6. Экстракция матрикссвязанного белка р53 неионным детергентом

Использование неионных детергентов для получения препаратов ЯМ может частично дестабилизировать его структуру, и часть белков ЯМ при обработке тритоном Х-100 может обнаруживаться в растворимых фракциях (Збарский 1988). Для исследования роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации

белка р53 с ЯМ была проведена экстракция матрикссвязаниого хроматина тритоном Х-100 с последующим анализом содержания ламина В и р53 в экстрагируемой тритоном Х-100 фракции и в нерастворимом в тритоне Х-100 остаточном матриксе в клетках разных типов.

Ламин В наблюдается в тритонорастворимой фракции ЯМ (фракция «Т») в клетках НЕК293 (рис. 10,о). Таким образом, связи, определяющие взаимодействия между структурными белками ЯМ, частично разрушаются неионным детергентом. Белок р53 устойчив к экстракции неионным детергентом, и, как видно из рис. 10,6, в клетках НЕК293 он полностью ассоциирует с тритоноустойчивым ЯМ (фракция «ЯМ(Т)»).

Т ЯМ(Т)

Ламин В-

яед

р53-

Т ЯМ(Т)

Ламин В-

^ямщ

р53-

в г

^ Т [ ЯМ(Т) Ламин В-»- ЩШ

Рис. 10. Содержание ламина В и белка р53 в тритонорастворимой («Т») и тритоноустойчивой («ЯМ(Т)») фракциях ЯМ клеток НЕК293 (а, б), MCF7 (в, г) и COS-7 (д, е) после экстракции белков ЯМ 1% тритоном Х-100.

Аналогичные результаты по влиянию тритона Х-100 были получены для р53, активированного актиномицином D, в клетках MCF7. Ламин В также частично экстрагируется тритоном Х-100 (рис. 10,б) из ЯМ. Белок р53, как и в клетках НЕК293, не экстрагируется неионным детергентом и после обработки тритоном Х-100 полностью связан с тритоноустойчивым ЯМ клеток MCF7 (рис. 10,г).

Полученные данные показывают, что гидрофобные взаимодействия, разрушаемые неионным детергентом, не вносят существенного вклада в процесс ассоциации белка р53 с ЯМ клеток НЕК293 и MCF7.

На препаратах ЯМ клеток COS-7 были получены противоположные результаты. Из рис. 10,д видно, что экстракция матрикссвязанных белков неионным детергентом не приводит к выходу ламина В в растворимую фракцию. С другой стороны, значительная часть матрикссвязаниого белка р53 экстрагируется неионным детергентом из ЯМ клеток (рис. 10,г). Следовательно, в клетках COS-7 р53 частично связан с ЯМ посредством гидрофобных взаимодействий, либо его связывание с ЯМ опосредуется

р53-

Т ЯМ(Т)

« I

гидрофобным «якорным» белком, чувствительным к действию неионного детергента.

Таким образом, матрикссвязанный белок р53 может быть представлен разными формами. Не только ядерный, но и матрикссвязанный пул молекул белка р53 гетерогенен по составу. Связь белка р53 с ЯМ, в зависимости от типа клеток, может определяться щелочелабильными, кислоталабильными и тритонолабильными взаимодействиями.

Вклад различных взаимодействий в общую картину связывания белка р53 с ЯМ зависит от типа клеток, что проявляется в разной степени ассоциации р53 с ЯМ в клетках НЕК293, MCF7 и COS-7.

7. Гетерогенный состав матрикссвязанного пула белка р53 в клетках различных типов

В результате проведенного исследования показано, что в процессе получения ЯМ в его структуре могут происходить изменения, которые приводят не только к различию в белковом составе отдельных препаратов ЯМ, но и к его частичному разрушению. Как следствие, подобные нарушения структуры ЯМ могут вызывать искажения в картине субъядерной локализации макромолекул.

Контроль целостности ЯМ с применением специфичного маркера - ламина В - позволил выявить разную степень ассоциации белка р53 с ЯМ в клетках разных типов. Действительно, присутствие р53 во фракциях растворимого матрикснесвязанного хроматина не всегда можно интерпретировать как наблюдение матрикснесвязанной формы ядерного пула р53. Присутствие маркерного белка ЯМ ламина В в тех же фракциях хроматина показывает, что р53 обнаруживается в этих фракциях как часть его матрикссвязанного пула.

Разная степень ассоциации белка р53 с ЯМ в клетках разных типов, связана, очевидно, с тем, что в клетках определенного типа экспрессируются определенные белки, с которыми взаимодействует белок р53. Важно отметить, что от типа клеток зависит не только степень ассоциации белка р53 с ЯМ, но и устойчивость самого ЯМ к процедурам экстракции матрикснесвязанного хроматина. Это свидетельствует о серьезных отличиях в белковых составах ядер исследуемых клеток, и различия во взаимодействии макромолекул с ЯМ выглядит в этой связи вполне естественно.

Обнаружена возможность разделения матрикссвязанного пула белка р53 на отдельные субпулы. Оказалось, что р53 в составе ЯМ клеток НЕК293 представлен гетерогенной группой белковых молекул, которые по-разному экстрагируются из ЯМ растворами щелочи и кислоты. Применение подобной экстракции на образцах ЯМ клеток MCF7 после активации р53 актиномицином D показало, что в условиях, когда белковый пул р53 представлен преимущественно его активной формой, в ЯМ обнаруживается преимущественно щелочелабильная кислотоустойчивая форма р53.

кислоторастворимая - могут образоваться по двум механизмам. Во-первых, разные формы белка р53 могут взаимодействовать с разными белками ЯМ. Белок-белковые взаимодействия в разных комплексах по-разному чувствительны к щелочи и кислоте, в связи, с чем в растворе щелочи или кислоты происходит избирательная экстракция одной из форм матрикссвязанного белка р53. Второй механизм образования различных форм белка р53 в составе ЯМ может заключаться в различных посттрансляционных модификациях р53. При этом фосфорилирование и ацетилирование приводит к образованию более кислой формы белка, что может привести к его более эффективной экстракции раствором щелочи. Схематично различные формы матрикссвязанного р53 и их экстрагируемость в растворах щелочи и кислоты представлены на рис. 11.

Щелочная Г / * / 7 т / ~| Кислая экстракция экстракция

ЁЬ

О в

^ р53 ) щ р53

=а ®

Щелочная Г~ / х / ~ / х / " Кислая экстракция экстракция

Рис. 11. Возможные формы матрикссвязанного белка р53. А - Белок р53 может быть связан с ЯМ посредством двух якорных белков, X и У. При действии щелочи нарушаются взаимодействия между р53 и белком У, в результате р53 выходит в растворимую фракцию. Оставшаяся часть р53, связанная с белком X, устойчива к действию щелочи. В результате кислотной экстракции в ЯМ остается р53, связанный с белком У, а комплекс р53-белок X разрушается и р53 экстрагируется из ЯМ. Б - Белок р53 может быть фосфорилирован и ацетилирован в разной степени. Более кислая форма белка р53 может более эффективно экстрагироваться щелочью, а более основная - кислотой.

Роль гидрофобных взаимодействий в ассоциации белка р53 с ЯМ различна для разных типов клеток. Так, в клетках НЕК293 и MCF7 р53 связан с ЯМ связями, стабильными при действии тритона Х-100, а в клетках COS-7 связь р53 с ЯМ частично обусловлена тритонолабильными взаимодействиями.

Таким образом, ассоциация белка р53 с ЯМ имеет сложный характер и определяется различными взаимодействиями. Подобный характер связывания с ЯМ обусловлен, очевидно, тем, что белок р53 является многофункциональным ядерным белком. Помимо указанных выше трансактивирующей и трансрепрессирующей функций, показана ферментативная 3'-5'-экзонуклеазная активность р53 и его прямое участие в репарации ДНК (Mummenbrauer et al. 1996, Gila et al, 2003). Каждая из этих функций предполагает определенный уровень посттрансляционных модификаций р53 и его взаимодействие с

определенными белками ЯМ. В связи с этим, многообразие форм матрикссвязанного р53 может отражать разнообразие его функций.

Выводы

1. Белковый состав препаратов ЯМ зависит от последовательности этапов высокосолевой экстракции и гидролиза ДНК, а также от состава экстрагирующих растворов.

2. При получении ЯМ ламин В может обнаруживаться во фракциях матрикснесвязанного хроматина, что свидетельствует о нарушении структурной целостности ЯМ в процессе его очистки. Получение ЯМ посредством экстракции хроматина хлоридом натрия после гидролиза ДНК способствует сохранению целостности ЯМ.

3. Степень взаимодействия белка р53 с ЯМ зависит от типа клеток. В клетках MCF7 через 8 ч после введения актиномицина D и в клетках НЕК293 белок р53 солокализуется с ламином В. Это показывает, что весь ядерный пул белка р53 связан с ЯМ. В ядрах клеток COS-7 белок р53 присутствует как в матрикссвязанной, так и в матрикснесвязанной форме.

4. В клетках НЕК293 связь белка р53 с ЯМ определяется как щелочелабильными, так и кислотолабильными взаимодействиями. В клетках MCF7 белок р53, активированный актиномицином D, представлен преимущественно щелочелабильной кислотоустойчивой формой.

5. В зависимости от типа клеток, связь белка р53 с ЯМ может определяться взаимодействиями, чувствительными к неионным детергентам. В составе ЯМ клеток НЕК293 и MCF7 белок р53 устойчив к действию тритона X-100. Связь белка р53 с ЯМ в клетках COS-7 частично разрушается при экстракции неионным детергентом.

6. Разная эффективность экстракции белка р53 щелочью, кислотой и неионным детергентом из ЯМ клеток НЕК293, MCF7 и COS-7 показывает, что матрикссвязанный пул белка р53 является гетерогенным, и состав матрикссвязанного пула белка р53 зависит от типа клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Lapshina М.А., Parkhomenko I.I., Terentiev A.A. Two forms of the nuclear matrix bound p53 protein in the HEK293 cells // Annals of the New York Academy of Sciences. 2006. V.1090-A. P. 177-181.

2. Лапшина M.A., Пархоменко И.И., Папина P.M., Терентьев A.A. Содержание ламина В во фракциях хроматина при очистке ядерного матрикса из клеток разных типов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. № 11. С. 515-519.

3. Лапшина М.А., Пархоменко И.И., Терентьев А.А. Локализация белка р53 во фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса клеток различных типов // Вестник ИНГУ. 2011. № 3. С. 100-106.

4. Лапшина М.А., Здобнова Т.А., Пархоменко И.И., Веселов А.П., Терентьев А.А. Сравнительный анализ белковых профилей препаратов ядерного матрикса, полученных в разных условиях // Тезисы Седьмой Пущинской Школы-конференции «Биология - Наука XXI века», 14-18 апреля 2003 г., Пущино, 2003,- С. 346.

5. Лапшина М.А., Здобнова Т.А., Пархоменко И.И., Терентьев А.А. Взаимодействие белка р53 с ядерным матриксом // Тезисы Восьмой Пущинской Школы-конференции «Биология - Наука XXI века», 17-21 мая 2004 г., Пущино,. 2004,- С. 19.

6. Лапшина М.А., Здобнова Т.А., Пархоменко И.И., Терентьев А.А. Две формы матрикс-связанного белка р53 // Тезисы докладов научных конференций фестиваля студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодая наука в классическом университете», 15-17 апреля 2004 г., Иваново, 2004,- С. 16.

7. Лапшина М.А., Пархоменко И.И., Терентьев А.А. Две формы матрикс-связанного белка р53 // Тезисы Девятой международной Пущинской Школы-конференции «Биология - Наука XXI века», 14-18 мая 2005 г., Пущино, 2005,- С. 36.

8. Lapshina М.А., Parkhomenko I.I., Terentiev А.А. Two states of the nuclear matrix-bound p53 in HEK293 cells // Proceeding of Conference «Cell Signaling World 2006. Signal Transduction Pathways as therapeutic targets», Luxembourg, 2006,- P. 452.

9. Lapshina M.A., Parkhomenko I.I., Terentiev A.A. Association of p53 protein with the nuclear matrix in cell of different types // Abstract book of Conference for young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22th, Kiev, 2007.- P. 70.

10. Лапшина M.A., Пархоменко И.И., Папина Р.И., Терентьев А.А. Различная степень ассоциации белка р53 с ядерным матриксом в клетках различных типов // Тезисы докладов XIX Всероссийского симпозиума «Современная химическая физика», 22 сентября -3 октября 2007 г., Туапсе, 2007.- С. 355.

Заказ № 216-1/04/2011 Подписано в печать 13.04.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лапшина, Мария Александровна

Введение.

Литературный обзор.

Глава 1. Структура ядерного матрикса.

1.1. Структурная организация ядерной оболочки.

1.2. Белки ядерного матрикса.

1.3. Ассоциация ДНК с ядерным матриксом: MAR/SAR 14 последовательности.

1.4. Компартменты ядра, связанные с ядерным 16 матриксом: ядрышко, тельца Кахаля,

PML-NB.

Глава 2. Участие ядерного матрикса в регуляции транскрипции.

2.1. Ассоциация транскрибируемой ДНК с ядерным 19 скелетом.

2.2. Взаимодействие факторов транскрипции с ядерным 21 матриксом.

2.3. Проблемы, связанные с получением препаратов 22 ЯМ.

Глава 3. Структура и функции р53.•

3.1. Белок р53 как опухолевый супрессор.

3.2. Структурная организация белка р53.

3.3. Регуляция стабильности белка р53.

3.4. Модификации белка р53.

3.5. Функции белка р53.

Глава 4. Транскрипционный фактор р53 и ядерный матрикс.

4.1. Роль ядерных PML-телец в функционировании р53.

4.2. Взаимодействие белка р53 с ядерным матриксом.

Материалы и методы исследования.

Результаты и обсуждение.

Глава 5. Сравнительная характеристика препаратов ЯМ, полученных в разных условиях.

5.1. Сравнительный анализ белковых профилей 50 различных препаратов ядерного матрикса.

5.2. Сравнительный анализ структурной целостности 52 ЯМ, полученного в различных условиях.

Глава 6. Взаимодействие белка р53 с ядерным матриксом 59 клеток различных типов.

6.1. Полное связывание ядерного белка р53 с ядерным 59 матриксом клеток НЕК293.

6.2. Полное связывание активированного ядерного белка 62 р53 с ядерным матриксом клеток MCF7.

6.3. Неполное связывание белка р53 с ядерным 65 матриксом клеток COS-7.

Глава 7. Разные формы белка р53 в составе ЯМ.

7.1. Экстракция белка р53 из ЯМ клеток НЕК293 81 слабыми растворами щелочи и кислоты.

7.2. Экстракция активированного белка р53 из ЯМ 83 клеток MCF7 слабыми растворами щелочи и кислоты.

7.3. Экстракция матрикссвязанного белка р53 неионным 84 детергентом в разных типах клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов"

Актуальность исследования

В связи со сложной организацией генома и большим количеством структурных элементов и регуляторных факторов, функционирующих в клеточном ядре, субкомпартментализация макромолекул, т.е. их корректная пространственная локализация, является таким же важным биологическим свойством, как и их активность.

Предметом исследования в настоящей работе является ядерный матрикс (ЯМ) — структура, которая обеспечивает пространственную координацию внутриядерных макромолекул, надмолекулярных комплексов и биохимических процессов (Яупеагзоп & Зшбггшп 2011). Одна из важнейших функций ЯМ связана с его участием в процессе транскрипции, и нарушения его структуры приводят к возникновению серьезных патологий. Мутации в белках ЯМ приводят к нарушению репарации ДНК, регуляции клеточного роста и дифференцировки клеток. Многие наследственные заболевания (ламинопатии, липодистрофии, мышечные дисплазии, нейродегенеративные болезни и многие др.) вызываются мутациями в генах некоторых ферментов,, структурных белков и транскрипционных факторов, которые входят в состав ЯМ (Вгоеге е1 а1. 2006, Лгщ е1 а1. 2010, Мага1сН е! а1. 2010). В настоящее время предложено использовать несколько белков ЯМ в качестве молекулярных маркеров для диагностики опухолей мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки и некоторых других органов (\¥а^епЬасЬ-Вгш^е1 е1 а1. 2008).

ЯМ играет особую роль в регуляции активности факторов транскрипции, многие из которых с ним связаны. Одним из транскрипционных факторов, взаимодействующих с ЯМ, является опухолевый супрессор р53. Белок р53 -играет ключевую роль в регуляции клеточного ответа на ДНК-повреждающие факторы. Активация белка р53 в ответ на различные виды стресса приводит к остановке пролиферации или апоптозу. Точечные мутации и делеции гена р53 наблюдаются в 50% случаев злокачественных заболеваний. Белок р53 является фактором транскрипции, основные функции которого связаны с активацией или супрессией генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и клеточной гибели при повреждениях ДНК. Эти функции выполняются посредством активации или подавления транскрипции многочисленных генов-мишеней р53 (Чумаков 2007).

Результаты исследований, посвященных взаимодействию макромолекул с ЯМ, часто противоречивы. Это связано не только с тем, что в разных работах используются различные модельные клеточные системы, но и с тем, что для получения ЯМ разными исследователями применяются разные методы. Это приводит к получению препаратов ЯМ, отличных как по структуре, так и по составу матрикссвязанных белков.

Несмотря на то, что исследований, посвященных структуре и свойствам белка р53, а также структуре и функциям ядерного матрикса достаточно много, о взаимодействии р53 с ЯМ известно очень мало. В то же время, I механизмы этого взаимодействия исключительно важны, поскольку их V нарушение, вызывая изменение субъядерной локализации белка р53, могут привести к подавлению его защитных функций. В связи с тем, что данные по особенностям взаимодействия белка р53 с ядерным матриксом немногочисленны и противоречивы, необходимы исследования механизмов и роли этого взаимодействия в регуляции функций опухолевого супрессора р53.

Цель и задачи работы

Целыо данной работы является исследование взаимодействия белка р53 с ЯМ в клетках разных типов и анализ матрикссвязанного пула белка р53. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. С применением различных методов получить препараты ЯМ и изучить их структурные особенности.

Научная новизна работы

Научно-практическая значимость работы

Работа также представляет интерес для исследований в области структуры ядерного матрикса и его роли в регуляции внутриядерных процессов. Полученные в работе результаты, показывающие различия в стабильности его структуры в процессе очистки из клеток разных типов, свидетельствуют о необходимости применения нескольких подходов к его получению в ходе изучения внутриядерного распределения белков.

Основные положения, выносимые на защиту

Публикации

По результатам работы опубликованы 3 статьи и 7 тезисов докладов, список которых приводится в конце диссертации.

Апробация работы

Личный вклад автора

Автором работы выполнены выделение и очистка препаратов ядерного матрикса, очистка РНК, анализ экспрессии мРНК генов-мишеней р53 методом ОТ-ПЦР, электрофорез белков и нуклеиновых кислот, окраска белков, иммуноблотинг, иммунофлуоресцентная микроскопия. Получение клеточных лизатов, ядерных и цитозольных экстрактов были выполнены совместно с Р.И. Папиной (ИПХФ РАН). Очистка ядер из клеток была проведена совместно с И.И. Пархоменко (ИПХФ РАН).

Литературный обзор Глава 1. Структура ядерного матрикса.

Многие авторы включают в структуру ядерного матрикса различные компоненты в связи с тем, что состав ядерного матрикса зависит от способа его выделения. Химически ядерный матрикс состоит главным образом из кислых негистоновых белков (90-98%), небольшого количества ДНК, РНК, липидов и углеводов. Следует отметить, что в зависимости от концентрации детергента и полноты экстракции содержание компонентов ядерного матрикса может быть различным. Без обработки РНКазой с ядерным матриксом может оставаться связанной до 10-20% РНК клетки, то есть почти вся РНК клеточного ядра, а если не применять ДНКазы и проводить щадящую экстракцию растворами солей, с ядерным матриксом может оставаться связанной и вся ДНК клеточного ядра (Збарский 1988). В большинстве работ под ядерным матриксом понимается внутриядерная сеть фибриллярных и гранулярных компонентов, периферическая ламина с поровыми комплексами и остаточное ядрышко. В других случаях понятие матрикса сужается только до сети внутриядерных структур: ядерная ламина и остаточное ядрышко в таком случае не считаются входящими в его состав (Berezney & Coffey 1977).

В соответствии с широко принятой точкой зрения ядерный матрикс обеспечивает пространственное распределение макромолекул, участвующих в фундаментальных генетических процессах, и играет ключевую роль в экспрессии генов и репликации ДНК. Компоненты ядерного матрикса включают белки ядерных телец, регуляторы клеточного цикла, тканеспецифичные транскрипционные факторы, факторы сплайсинга РНК, а так же ферменты и белки, ответственные за апоптоз (Gajkowska & Wojewodzka 2003).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лапшина, Мария Александровна

Выводы

3. Степень взаимодействия белка р53 с ЯМ зависит от типа клеток. В клетках MCF7 через 8 ч после введения актиномицина Бив клетках НЕК293 белок р53 солокализуется с ламином В. Это показывает, что весь ядерный пул белка р53 связан с ЯМ. В ядрах клеток COS-7 белок р53 присутствует как в матрикссвязанной, так и в матрикснесвязанной форме.

4. В клетках НЕК293 связь белка р53 с ЯМ определяется - как щелочелабильными, так и кислотолабильными взаимодействиями. В клетках MCF7 белок р53, активированный актиномицином D, представлен преимущественно щелочелабильной кислотоустойчивой формой.

5. В зависимости от типа клеток, связь белка р53 с ЯМ- может определяться взаимодействиями, чувствительными к неионным детергентам. В составе ЯМ клеток НЕК293 и MCF7 белок р53 устойчив к действию тритона Х-100. Связь белка р53 с ЯМ в клетках COS-7 частично разрушается при экстракции неионным детергентом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Lapshina M.A., Parkhomenko LI., Terentiev A.A. Two forms of the nuclear matrix bound p53 protein in the HEK293 cells // Annals of the New York Academy of Sciences. 2006. V.1090-A. P. 177-181.

2. Лапшина M.A., Пархоменко И.И., Папина Р.И., Терентьев A.A. Содержание ламина В во фракциях хроматина при очистке ядерного матрикса из клеток разных типов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. № 11. С. 515-519.

3. Лапшина М.А., Пархоменко И.И., Терентьев A.A. Локализация белка р53 во фракциях хроматина и препаратах ядерного матрикса клеток различных типов//Вестник ННГУ. 2011. № 3. С. 100-106.

4. Лапшина М.А., Здобнова Т.А., Пархоменко И.И., Веселов А.П., Терентьев A.A. Сравнительный анализ белковых профилей препаратов ядерного матрикса, полученных в разных условиях // Тезисы Седьмой Пущинской Школы-конференции «Биология - Наука XXI века», 14-18 апреля 2003 г., Пущино, 2003.- С. 346.

5. Лапшина М.А., Здобнова Т.А., Пархоменко И.И., Терентьев A.A. . Взаимодействие белка р53 с ядерным матриксом // Тезисы Восьмой Пущинской Школы-конференции «Биология - Наука XXI века», 17-21 мая 2004 г., Пущино,. 2004.- С. 19.

6. Лапшина М.А., Здобнова Т.А., Пархоменко И.И., Терентьев A.A. Две формы матрикс-связанного белка р53 // Тезисы докладов научных конференций фестиваля студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодая наука в классическом университете», 15-17 апреля 2004 г., Иваново, 2004,- С. 16.

7. Лапшина М.А., Пархоменко И.И., Терентьев A.A. Две формы матрикс-связанного белка р53 // Тезисы Девятой международной Пущинской Школы-конференции «Биология - Наука XXI века», 14-18 мая 2005 г., Пущино, 2005.- С. 36.

8. Lapshina M.A., Parkhomenko I.I., Terentiev A.A. Two states of the nuclear matrix-bound p53 in HEK293 cells // Proceeding of Conference «Cell Signaling World 2006. Signal Transduction Pathways as therapeutic targets», Luxembourg, 2006.- P. 452.

Ю.Лапшина M.A., Пархоменко И.И., Папина Р.И., Терентьев A.A. Различная степень ассоциации белка р53 с ядерным матриксом в клетках различных типов // Тезисы докладов XIX Всероссийского симпозиума «Современная химическая физика», 22 сентября -3 октября 2007 г., Туапсе, 2007.- С. 355.

Заключение

В связи с этим необходимо контролировать целостность ЯМ с применением его специфичных маркеров, белка ламина В. Данный подход позволил обнаружить и доказать разную степень ассоциации белка р53 с ЯМ клеток различных типов. Действительно, присутствие р53 во фракциях растворимого матрикснесвязанного хроматина не всегда можно интерпретировать как наблюдение матрикснесвязанной формы ядерного пула р53. Присутствие маркерного белка ЯМ ламина В в тех же фракциях хроматина показывает, что р53 обнаруживается в этих фракциях как часть его матрикссвязанного пула.

Степень взаимодействия белка р53 с ЯМ различна в клетках разных типов. Это, очевидно, связано с тем, что в клетках определенного типа экспрессируются определенные белки, с которыми взаимодействует белок р53. Важно отметить, что от типа клеток зависит не только степень ассоциации белка р53 с ЯМ, но и устойчивость самого ЯМ к процедурам экстракции матрикснесвязанного хроматина. Это свидетельствует о серьезных отличиях в белковых составах ядер исследуемых клеток, и различия во взаимодействии макромолекул с ЯМ выглядит в этой связи вполне естественно.

Данные результаты показывают, что экстракция белка р53 из ЯМ происходит не случайно, а в соответствии с разными состояниями р53. Две основные формы матрикссвязанного р53 - щелочерастворимая и кислоторастворимая — могут образоваться по двум механизмам. Во-первых, разные формы белка р53 могут взаимодействовать с разными белками ЯМ. Белок-белковые взаимодействия в разных комплексах по-разному чувствительны к щелочи и кислоте, в связи с чем в растворе щелочи или кислоты происходит избирательная экстракция одной из форм матрикссвязанного белка р53. Второй механизм образования различных форм белка р53 в составе ЯМ может заключаться в различных посттрансляционных модификациях р53. При этом фосфорилирование и ацетилирование приводит к образованию более кислой формы белка, что " может привести к его более эффективной экстракции раствором щелочи. Схематично различные формы матрикссвязанного р53 и их экстрагируемость, в растворах щелочи и кислоты представлены на рис.22.

Роль гидрофобных взаимодействий в ассоциации белка р53 с ЯМ различна для разных типов клеток. Так, в клетках НЕК293 и MCF7 р53 связан с ЯМ без участия гидрофобных взаимодействий, а в клетках COS-7 связь р53 с ЯМ частично обусловлена гидрофобными взаимодействиями. Фактически, в клетках COS-7 наблюдается две формы матрикссвязанного белка р53 - экстрагируемая и не экстрагируемая тритоном Х-100.

Таким образом, ассоциация белка р53 с ЯМ имеет довольно сложный характер и определяется различными взаимодействиями. Подобный характер связывания с ЯМ обусловлен, очевидно, тем, что белок р53 является мультифуикциональным ядерным белком. Помимо трансактиваторной и трансрепрессорной функций, р53 обладает ферментативной активностью и участвует в репарации ДНК. Каждая из этих функций предполагает определенный уровень посттрансляционных модификаций и взаимодействие р53 с определенными белками ядра и ЯМ. В связи с этим, многообразие форм матрикссвязанного р53 может отражать многообразие его функций.

Щелочная экстракция

ТЕХ тч-н Кислая экстракция

М 7^7

ТП~ тп.

Рис. 22. Возможные формы матрикссвязанного белка р53.

А. Белок р53 может быть связан с ЯМ посредством двух якорных белков, X и У. При действии щелочи нарушаются взаимодействия между р53 и белком У, в результате р53 выходит в растворимую фракцию. Оставшаяся часть р53, связанная с белком X, устойчива к действию щелочи В результате кислотной экстракции в ЯМ остается р53, связанный с белком У, а комплекс р53-белок X разрушается и р53 экстрагируется из ЯМ.

Б. Белок р53 может быть фосфорилирован и ацетилирован в разной степени. Более кислая форма белка р53 может более эффективно экстрагироваться щелочью, а более основная -кислотой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лапшина, Мария Александровна, Черноголовка

1. Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 253 С.

2. Желтухин А.О., Чумаков П.М. Повседневные и индуцируемые функции гена р53 //Успехи биол. химии. 2010. Т. 50. С. 447-516.

3. Збарский И.Б. Организация клеточного ядра.- М.: Медицина, 1988. 368 С.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.- 480 С.

5. Съяксте Н.И., Съяксте Т.Г. Факторы транскрипции и ядерный матрикс // Молекулярная Биология. 2001. Т.35. № 5. С. 739-749.

6. Чумаков П.М., Иоцова B.C., Георгиев Г.П. Выделение плазмидных клонов, содержащих последоватьельность мРНК для невирусного Т-антигена мыши // Докл. АН СССР. 1982. Т.267. С. 1272-1275.

7. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. 2000. Т.65. № 1. С. 34-47.

8. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме // Успехи биологической химии. 2007. Т. 47. С. 3-52.

9. Alberto M.M., Bareggi R., Bortul R., Grill V., Narducci P., Zweyer M. The nuclear matrix and apoptosis // Histochemistry and Cell Biology. 1997. V.108. P. 1-10.

10. Alvarez J.D., Yasui D.H., Niida H., Joh T., Loh D.Y., Kohwi-Shigematsu T. The MAR-binding protein SATB1 orchestrates temporal and spatial expression of multiple genes during T-cell development // Genes and Development. 2000. V. 14. P. 521-535.

11. Andreeva M., Markova D., Loidl P., Djondjurov L. Intranuclear compartmentalization of transcribed and nontranscribed c-myc sequences in Namalva-S cells // European Journal of Biochemistry. 1992. V.207. P.887-894.

12. Asher G., Reuven N., Shaul Y. 20S proteasomes and protein degradation "by default" // Bioessays. 2006. V. 28. № 8. P. 844-849.

13. Aslanian A., Iaquinta P.J., Verona R., Lees J.A. Repression of the Arf tumor suppressor by E2F3 is required for normal cell cycle kinetics // Genes and Development. 2004. V. 18. № 12. P. 1413-1422.

14. Austin C.A., Fisher L.M. DNA topoisomerases: enzymes that change the shape of DNA // Science Progress. 1990. V.74. P. 147-162.

15. Baker S.J., Markowitz S., Fearon E.R., Willson J.K., Vogelstein B. Suppression of human colorectal carcinoma cell growth by wild-type p53 // Science. 1990. V. 249. № 4971. P. 912-915.

16. Bell S., Klein C., Müller L., Hansen S., Buchner J. p53 contains large unstructured regions in its native state // Journal of Molecular Biology. 2002. V. 322. № 5. P. 917-927.

17. Ben-Yehoyada M., Ben-Dor I., Shaul Y. c-Abl tyrosine kinase selectively regulates p73 nuclear matrix association // The Journal of Biological Chemistry. 2003. V. 278. № 36. P. 34475-34482.

18. Berezney R., Coffey D.S. Nuclear matrix. Isolation and characterization of a framework structure from rat liver nuclei // The Journal of Cell Biology. 1977. V.73.P. 616-637.

19. Bode J., Kohwi Y., Dickinson L., Joh T., Klehr D., Mielke C., Kohwi-Shigematsu T. Biological significance of unwinding capability of nuclear matrix-associating DNAs // Sceince. 1992. V.255. P. 195-197.

20. Bosman F.T. The nuclear matrix in pathology // Virchows Archiv. 1999. V.435. P. 391-399.

21. Boulikas T. Chromatin domains and prediction of MAR sequences // International Revews on Cytology. 1995. V. 162. P. 279-388.

22. Broers J.L.V., Ramaekers F.C.S., Bonne G., Yaour B., Hutchison C.J. Nuclear Lamins: Laminopathies and their role in premature ageing //

23. Physiological Reviews. 2006. V. 86. P. 967-1008.

24. Brohawn S.G., Partridge J.R., Whittle J.R., Schwartz T.U. The nuclear pore complex has entered the atomic age // Structure. 2009. V. 17. P. 1156-1168.

25. Brooks C.L., Gu W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond // Molecular Cell. 2006. V. 21. № 3. P. 307-315.

26. Chamberland H., Lafontaine J.G. Localization of snRNP antigens in nucleolus-associated bodies: Study of plant interphase nuclei by confocal and electron microscopy // Chromosoma. 1993. V. 102. P. 220-226.

27. Chen C.Y., Oliner J.D., Zhan Q., Fornace A.J., Vogelstein B., Kastan M.B. Interactions between p53 and MDM2 in a mammalian cell cycle checkpoint pathway // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1994. V. 91. № 7. P. 2684-2688.

28. Chehab N.H., Malikzay A., Stavridi E.S., Halazonetis T.D. Phosphorilation of Ser-20 mediates stabilization of human p53 in response to DNA damage // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1999. P. 13777-13782. t

29. Cockerill P.N., Yuen M.H., Garrard W.T. The enhancer of the immunoglobulin heavy chain locus is flanked by presumptive chromosomal loop anchorage elements // The Journal of Biological Chemistry. 1987. V. 262. № 11. p. 5394-5397.

30. Coutts A.S., Adams C.J., La Thangue N.B. p53 ubiquitination by Mdm2: a never ending tail? // DNA Repair (Amst). 2009. V. 8. № 4. P. 483-490.

31. D'Angelo M.A., Hetzer M.W. Structure, dynamics and function of nuclear pore complexes // Trends in Cell Biology. 2008. V. 18. P. 456-466.

32. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A., Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1 // Science. 1994. V. 265. № 5178. P. 1582-1584.

33. Dawson R., Mtiller L., Dehner A., Klein C., Kessler H., Buchner J. The N-terminal domain of p53 is natively unfolded // J Mol Biol. 2003. V. 332. № 5. P. 1131-1141.

34. Deepesh N.D. Protein constitution of the chromosome axis // Chromosoma. 2002. V. 111. P. 69-79.

35. Deppert W., Haug M. Evidence for free and metabolically stable p53 protein in nuclear subfractions of simian virus 40-transformed cells // Molecular and Cellular Biology. 1986. V. 6. № 6. P. 2233-2240.

36. Dickinson P.A. tissue-specific MAR/SAR DNA-binding protein with unusual binding site recognition // Cell. 1999. V. 70. P. 631-645.

37. Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mamalian nuclei // Nucleic Acids Research. 1983. Y. 11. P. 1475-1489.

38. Diller L., Kassel J., Nelson C.E., Gryka M.A., Litwak G., Gebhardt M., Bressac B., Ozturk M., Baker S.J., Vogelstein B. p53 functions as a cell cycle control protein in osteosarcomas // Molecular and Cellular Biology. 1990. V. 10. № 11. P. 5772-5781.

39. Donehower L.A., Harvey M., Slagle B.L., McArthur M.J., Montgomery C.A., Butel J.S., Bradley A. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours // Nature. 1992. V. 356. № 6366. P. 215-221.

40. Dorner D., Gotzmann J., Foisner R. Nucleoplasmic lamins and their interaction partners, LAP2a,Rb, and BAF, in transcriptional regulation // FEBS J. 2007. V. 274. P. 1362-1373.

41. Edwards S.J., Hananeia L., Eccles M.R., Zhang Y.F., Braithwaite A.W. The proline-rich region of mouse p53 influences transactivation and apoptosis but is largely dispensable for these functions // Oncogene. 2003. V. 22. P. 4517-4523.

42. Eliyahu D., Goldfinger N., Pinhasi-Kimhi O., Shaulsky G., Skurnik Y., Arai N., Rotter V., Oren M. Meth A fibrosarcoma cells express two transforming mutant p53 species // Oncogene. 1988. V. 3. № 3. P. 313-321.

43. Eliyahu D., Michalovitz D., Eliyahu S., Pinhasi-Kimhi O., Oren M. Wildtype p53 can inhibit oncogene-mediated focus formation // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1989. V. 86. № 22. P. 8763-8767.

44. Everett R.D., Meredith M., Orr A., Cross A., Kathoria M., Parkinson J. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein // EMBO Journal. 1997. V. 16. P. 566-577.

45. Fogal V., Gostissa M., Sandy P., Zacchi P., Sternsdorf T., Jensen K., Pandolfi P. P., Will H.,Chneider C., Sal G. D. Regulation of p53 activity in nuclear bodies by a specific PML isoform // EMBO Journal. 2000. V. 19. P. 6185-6195.

46. Fridkin A., Penkner A., Jantsch V., Gruenbaum Y. SUN-domain and KASH-domain proteins during development, meiosis and disease // Cellular and Molecular Life Sciences. 2009. V. 66. P. 1518-1533.

47. Gajkowska B., Wojewodzka U. A new look at the cellular scaffold by embedment-free electron microscopy method // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2003. V. 7. № 3. P. 258-264.

48. Gerner C., Holzmann K., Grimm R., Sauerman G. Similarity between nuclear matrix proteins of various cells revealed by an improved isolation method // The Journal of Biological Chemistry. 1998. V. 71. № 3. P. 363374.

49. Gemer C., Sauerman G. Nuclear matrix proteins specific for subtypes of human hematopoietic cells // Journal of Cellular Biochemistry. 1999. V. 72. № 4. P. 470-482.

50. Gottifredi V., Prives C. P53 and PML: new partners in tumor suppression // Trends in Cell Biology. 2001. V. 11. № 5. P. 184-187.

51. Gottlieb T.M., Oren M. p53 and apoptosis // Seminars In Cancer Biology. 1998. V. 8. №5. P. 359-368.

52. Gruenbaum Y., Wilson K.L , Harel A., Goldberg M., Cohen M. Review: nuclear lamins-structural proteins with fundamental functions // Journal of Structural Biology. 2000. V. 129. P. 313-323.

53. Gu W., Roeder R.G. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain // Cell. 1997. V. 90. P. 595-606.

54. Hancock R. Internal organisation of the nucleus: assembly of compartments by macromolecular crowding and the nuclear matrix model // Biology of The Cell. 2004. V. 96. № 8. P. 595-601.

55. Harms K., Nozell S., Chen X. The common and distinct target genes of the p53 family transcription factors // Cellular and Molecular Life Sciences. 2004. V. 61. № 7-8. P. 822-842.

56. Hart C.M., Laemmli U.K. Facilitation of chromatin dynamics by SARs // Current Opinion in Genetics and Development. 1998. V. 8. № 5. P. 519-525.

57. Haupt Y., Maya R., Kazaz A., Oren M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53 //Nature. 1997. V. 387. № 6630. P. 296-299.

58. He D., Nickerson J.A., Penman S. Core filaments of the nuclear matrix // The Journal of Cell Biology. 1990. V. 110, P. 569-580.

59. Heessen S., Fornerod M. The inner nuclear envelope as a transcription factor resting place // The EMBO Reports. 2007. V. 8. P. 914-919.

60. Hodge L.D., Mancini P., Davis F.M., Heywood P. Nuclear matrix of HeLa S3 cells // The Journal of Cell Biology. 1977. V. 72. P. 194-208.

61. Hoffmann J.F.-X., Laroche T., Brand A., Gasser S.M. RAP-1 factor is necessary for DNA loop formation in vitro at the silent mating type locus HML // Cell. 1989. V. 57. P. 725-737.

62. Hofmann T.G., Will H. Body language: the function of PML nuclear bodies in apoptosis regulation // Cell Death and Differentiation. 2003. V.10. P. 1290-1299.

63. Honda R., Tanaka H., Yasuda H. Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53 // FEBS Lett. 1997. V. 420. JVs 1. P. 25-27.

64. Horn H.F., Vousden K.H. Coping with stress: multiple ways to activate p53 // Oncogene. 2007. V. 26. № 9. P. 1306-13016.

65. Hupp T.R., Meek D.V., Midgley C.A., Lane D.P. Regulation of the specific DNA binding function of p53 // Cell. 1992. V. 71. P. 875-886.

66. Jackson D.A., Cook P.R. Transcription occurs at a nuclear skeleton // EMBO Journal. 1985. V. 4. P. 919-925.

67. Jenkins J.R., Rudge K., Currie G.A. Cellular immortalization by a cDNA clone encoding the transformation-associated phosphoprotein p53 // Nature. 1984. V. 312. № 5995. P. 651-654.

68. Jenkins J.R., Rudge K., Chumakov P., Currie G.A. The cellular oncogene p53 can be activated by mutagenesis // Nature. 1985. V. 317. № 6040. P. 816-818.

69. Jiang M., Axe T., Holgate R., Rubbi C.P., Okorokov A.L., Mee T., Milner J. P53 binds the nuclear matrix in normal cells: binding involves the proline-rich domain of p53 and increases following genotoxic stress // Oncogene. 2001. V. 20. P. 5449-5458.

70. Jin Y., Lee H., Zeng S.X., Dai M.S., Lu H. MDM2 promotes p21wafl/cipl proteasomal turnover independently of ubiquitylation // EMBO Journal. 2003. V. 22. № 23. P. 6365-6377.

71. Jing G-J., Xu Dong-Hui, Shi Song-Lin, Li Qi-Fu, Wang San-Ying, Wu Fu-Yun, Kong Hai-Yan Aberrant expression of nuclear matrix proteins during HMBA-induced differentiation of gastric cancer cells // World J Gastroenterol. 2010. V. 16. № 17. P. 2176-2182.

72. Kallajoki M., Osborn M. Gel electrophoretic analysis ofnuclear matrix fractions isolated from different human cell lines // Electrophoresis. 1994. V. 15. №3-4. P. 520-528.

73. Kamijo T., Zindy F., Roussel M.F., Quelle D.E., Downing J.R., Ashmun R.A., Grosveld G., Sherr C.J. Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product pl9ARF // Cell. 1997. V. 91. №5. P. 649-659.

74. Kamijo T., Weber J.D., Zambetti G., Zindy F., Roussel M.F., Sherr C.J. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1998. V. 95. № 14. P. 8292-8297.

75. Kastan M.B., Onyekwere O., Sidransky D., Vogelstein B., Craig R.W. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage // Cancer Research. 1991. V. 51. P. 6304-6311.

76. Kaufmann S.H., Okret S., Wikstrom A.C., Gustafsson J.A., Shaper J.H. Binding of the glucocorticoid receptor to the rat liver nuclear matrix. The role of disulfide bond formation // The Journal of Biological Chemistry. 1986. V. 261. №26. P. 11962-11967.

77. Khodarev N.N., Votrin I.I., Debov S.S. Inhibition of chromatin autolysis in the process of isolating and incubating rat liver cell nuclei // Vopr. Med. Khim. 1981. V. 27. P. 538-544.

78. Ko L.J., Prives C. p53: puzzle and paradigm // Genes and Development. 1996. V. 10. № 9. P. 1054-1072.

79. Koken M.H.M., Linares-Cruz G., Quignon F., Viron A., Chelbi-Alix M.K., Sobczak-The'pot J., Juhlin L., Degos L., Calvo F.3 de The' H. The PML growth-suppressor has an altered expression in human oncogenesis // Oncogene. 1995. V. 10. P. 1315-1324.

80. Kruse J.P., Gu W. Modes of p53 regulation // Cell. 2009. V. 137. № 4. P. 609-622.

81. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

82. Lain S., Midgley C., Sparks A., Lane E.B., Lane D.P. An inhibitor of nuclear export activates the p53 response and induces the localization of

83. HDM2 and p53 to UlA-positive nuclear bodies associated with the PODs // Experimental Cell Research. 1999. V. 248. P. 457-472.

84. Lane D.P., Benchimol S. P53: oncogene or anti-oncogene? // Genes and Development. 1990. V. 4. № 1. P. 1-8.

85. Lane D.P., Crawford L.V. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells //Nature. 1979. V. 278. № 570. P. 1261-1263.

86. Lavin M.F., Gueven N. The complexity of p53 stabilization and activation // Cell Death Differ. 2006. V. 13. № 6. P. 941-950.

87. Levine A.J., Momand J., Finlay C.A. The p53 tumour suppressor gene // Nature. 1991. V. 351. № 6326. P. 453-456.

88. Li M., Chen D., Shiloh A., Luo J., Nikolaev A. Y., Qin J., Gu W. Deubiquitination of p53 by HAUSP is an important pathway for p53 stabilization//Nature. 2002. V. 416. P. 648-653.

89. Linzer D.I., Levine A.J. Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells // Cell. 1979. V. 17. № 1. P. 43-52.

90. Liu L.,Scolnick D.M., Trievel R.C., Zhang H.B., Marmorstein R., Halazonetis T.D., Berger S.L. p53 sites acetylated in vitro by PCAF and p300 are acetylated in vivo in response to DNA damage 11 Molecular and Cellular Biology. 1999. V. 19. P. 1202-1209.

91. Lowe S.W., Schmitt E.M., Smith S.W., Osborne B.A., Jacks T. P53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes// Nature. 1993. Y. 362. P. 847-849.

92. Lowe S.W., Sherr C.J. Tumor suppression by Ink4a-Arf: progress and puzzles // Current Opinion In Genetics and Development. 2003. V. 13. № 1. P. 77-83.

93. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // The Journal of Biological Chemistry. 1951. P. 265-275.

94. Machado C., Sunkel C.E., Andrew D.J. Antibodies reveal titin as a chromosomal protein // Journal of Cell Biology. 1998. V.141. P. 321-333.

95. Malkin D. p53 and the Li-Fraumeni syndrome // Cancer Genetics and Cytogenetics. 1993. V. 66. № 2. P. 83-92.

96. Mancini M.G., Liu B., Sharp Z.D., Mancini M.A. Subnuclear partitioning and functional regulation of the Pit-1 transcription factor // Journal of Cell Biology. 1999. V. 72. P. 322-338. .

97. Maraldi N.M., Lattanzi G., Cenni V., Bavelloni A., Marmiroli S., Manzoli F.A. Laminopathies and A-type lamin-associated signalling „ pathways // Advances in Enzyme Regulation. 2010. V. 50. P. 248-261.

98. Matera A.G. Nuclear bodies: multifaceted subdomains of the interchromatin space // Journal of Cell Biology. 1999. V.9. P. 302-309.

99. Matijasevic Z., Krzywicka-Racka A., Sluder G., Jones S.N. MdmX regulates transformation and chromosomal stability in p53-deficient cells // Cell Cycle. 2008. V. 7. № 19. P. 2967-2973.

100. Mattout A., Dechat T., Adam S.A., Goldman R.D., Gruenbaum Y. Nuclear lamins, diseases and aging // Current Opinion In Cell Biology. 2006. V., 18. P. 335-341.

101. Melendez J.A., Davies K.J.A. Manganese Superoxide Dismutase Modulates Interleukin-la Levels in HT-1080 Fibrosarcoma Cells // The Journal of Biological Chemistry. 1996. V. 271. № 31. P. 18898-18903.

102. Michalovitz D., Halevy O., Oren M. Conditional inhibition of transformation and of cell proliferation by a temperature-sensitive mutant of p53 // Cell. 1990. V. 62. № 4. P. 671-680.

103. Mirkovitch J., Spierer P., Laemmli U.K. Genes and loops in 320,000 base-pairs of the Drosophila melanogaster chromosome // Journal of Molecular Biology. 1986. V. 90. № 22. P. 55-58.

104. Miyashita T., Reed J.C. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene // Cell. 1995. V. 80. № 2. P. 293-299.

105. Momand J., Zambetti G.P., Olson D.C., George D., Levine A.J. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation // Cell. 1992. V. 69. № 7. P. 1237-1245.

106. Monneron A., Bernhard W. Fine structural organization of the interphase nucleus in some mammalian cells // Journal of Ultrastructure Research. 1969. V. 27. P. 266-288.

107. Moran E. Interaction of adenoviral proteins with pRB and p53 // The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 1993. V. 7. P. 880-885.

108. Mounkes L., Kozlov S., Burke B., Stewart C.L. The laminopathies: Nuclear structure meets disease // Current Opinion In Genetics and Development. 2003. V. 13. P. 223-230.

109. Muchir A., Worman H.J. The nuclear envelope and human disease // Physiology. 2004. V. 19. P. 309-314.

110. Nakamura Y. Isolation of p53-target genes and their functional analysis // Cancer Sci. 2004. V. 95. № 1. P. 7-11.

111. Narang M.A., Dumas R., Ayerl L.M., Gravel R.A. Reduced histone biotinylation in multiple carboxylase deficiency patients: a nuclear role for holocarboxylase synthetase // Human Molecular Genetics. 2004. V. 13. № 1. P. 15-23. ,

112. Nizami Z., Deryusheva S., Gall J.G. The Cajal body and histone locus body // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010. V. 2. № 7. P. a000653.

113. Neilan E.G. Laminopathies, other progeroid disorders, and aging: Common pathogenic themes and possible treatments // American Journal of Medical Genetics. 2009. V. 149 A. P. 563-566.

114. Oda E., Ohki R., Murasawa H., Nemoto J., Shibue T., Yamashita T., Tokino T., Taniguchi T., Tanaka N. Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis // Science. 2000. V. 288. №5468. P. 1053-1058.

115. Okorokov A.L., Rubbi C.P., Metcalfe S., Milner J. The interaction of p53 with the nuclear matrix is mediated by F-actin and modulated by DNA damage // Oncogene. 2002. V.21. P. 356-367.

116. Oliner J.D., Kinzler K.W., Meltzer P.S., George D.L., Vogelstein B. Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas //Nature. 1992. V. 358. № 6381. P. 80-83.

117. Oren M., Levine A.J. Molecular cloning of a cDNA specific for the murine p53 cellular tumor antigen // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1983. V. 80. № 1. P. 56-59.

118. Pearson M., Pelicci P.G. PML interaction with p53 and its role in apoptosis and replicative senescence // Oncogene. 2001. V.20. P. 72507256.

119. Peters R. Translocation through the nuclear pore: Kaps pave the way // Bioessays. 2009. V. 31. P. 466-477.

120. Reddy K.L., Zullo J.M., Bertolino E., Singh H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina // Nature. 2008. V. 452. P. 243-247.

121. Rout M.P., Àitchison J.D. The nuclear pore complex as a transport machine // The Journal of Biological Chemistry. 2001. V.276. № 20. P; 16593-16596.

122. Rowland B.D., Denissov S.G., Douma S., Stunnenberg H.G., Bernards R., Peeper D.S. E2F transcriptional repressor complexes are critical downstream targets of pl9(ARF)/p53-induced proliferative arrest // Cancer Cell. 2002. V. 2. № l. P. 55-65.

123. Rynearson A.L., Sussman C.S. Nuclear structure, organization, and oncogenesis // J Gastrointest Cancer. 2011. Epub ahead of print.

124. Sakamuro D., Sabbatini P., White E., Prendergast G.C. The . polyproline region of p53 is required to activate apoptosis but not growtharrest//Oncogene. 1997. V. 15. № 8. P. 887-898.

125. Schirmer E.C., Foisner R. Proteins that associate with lamins: Many faces, many functions // Experimental Cell Research. 2007. V. 313. P. 21672179.

126. Shieh S.Y., Ikeda M., Taya Y., Prives C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2 // Cell. 1997. V. 91. № 3. P. 325-334.

127. Sherr C.J. The INK4a/ARF network in tumour suppression // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2001. V. 2. № 10. P. 731-737.

128. Starr D.A., Han M. ANChors away: an actin based mechanism of nuclear positioning // The Journal of Cell Science. 2003. V. 116. P. 211-216.

129. Staufenbiel M., Deppert W. Preparation of nuclear matrices from cultured cells: subfractionation of nuclei in situ // The Journal of Cell Biology. 1984. V.98. P. 1886-1894.

130. Stewart Z.A., Pietenpol J.A. p53 signaling and cell cycle checkpoints // Chemical Reseach in Toxicology. 2001. V.14. № 3. P. 243-263.

131. Stewart C.L., Roux K.J., Burke B. Blurring the boundary: The nuclear envelope extends its reach // Science. 2007. V. 318. P. 1408-1412.

132. Stuurman N., Meijne A.M.L., van der Pol A.J., de Jong L., van Driel R., van Renswoude J. The nuclear matrix from cells of different origin // The Journal of Biological Chemistry. 1990. V.265. № 10. P. 5460-5465.

133. Sturzbecher H.W., Donzelmann B., Henning W., Knippschild U., Buchhop S. p53 is linked directly to homologous recombination processes via RAD51/RecA protein interaction // EMBO Journal. 1996. V. 15. № 8. P. 1992-2002.

134. Sun J.M., Chen H.Y., Davie J.R. Nuclear factor 1 is a component of the nuclear matrix // Journal of Cellular Biochemistry. 1994. V. 55. P. 252263.

135. Tarunina M., Jenkins J.R. Human p53 binds DNA as a protein homodimer but monomeric variants retain full transcription transactivation activity // Oncogene. 1993. V. 8. № 11. P. 3165-3173.

136. Tishler R.B., Calderwood S.K., Coleman C.N., Price B.D. Increases in sequence specific DNA binding by p53 following treatment with chemotherapeutic and DNA damaging agents // Cancer Reseach. 1993. V. 53. № 10. P. 2212-2216.

137. Tibbets R.S., Brumbaugh K.M., Williams J.M., Sarkaria J.N., Cliby W.A., Shieh S.Y., Taya Y., Prives C., Abraham R.T. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53 // Genes and Development. 1999. V. 13. P. 152-157.

138. Tran E.J., Wente S.R. 2006. Dynamic nuclear pore complexes: Life on the edge // Cell. V. 125. P. 1041-1053.

139. Tzur Y.B., Wilson K.L., Gruenbaum Y. SUN-domain proteins: 'Velcro' that links the nucleoskeleton to the cytoskeleton // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2006. V. 7. P. 782-788.

140. Utrera R., Cillavin L., Lazarevic D., Delia D., Schneider C. A novel p53-inducible gene coding for a microtubule-localized protein with G2-phase-specific expression // EMBO Journal. 1998. V. 17. P. 5015-5025.

141. Ventura A., Kirsch D.G., McLaughlin M.E., Tuveson D.A., Grimm J., Lintault L., Newman J., Reczek E.E., Weissleder R., Jacks T. Restoration ofp53 function leads to tumour regression in vivo // Nature. 2007. V. 445. № 7128. P. 661-665.

142. Vlcek S., Dechat T., Foisner R. Nuclear envelope and nuclear matrix: interactions and dynamics // Cellular and Molecular Life Sciences. 2001. V. 58. P.1758-1765.

143. Vlcek S., Foisner R. Lamins and lamin-associated proteins in aging and disease // Current Opinion in Cell Biology. 2007. V. 19. P. 298-304.

144. Voeltz G.K., Prinz W.A. Sheets, ribbons and tubules-how organelles get their shape // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2007. V. 8. P. 258-264.

145. Vosberg H.P. DNA topoisomerases: enzymes that control DNA conformation // Current Topics in Microbiology and Immunology;. 19$5:. V. 114. P. 19-102.

146. VousdenK.H. p53: death star// Cell. 2000. V. 103. № 5. P. 691-694.

147. Vousden K.H., Lu X. Live or let die: the cell's response to p53 // Nat Rev Cancer. 2002. V. 2. P. 594-604.

148. Wan K.M., Nickerson J.A., Krockmalnic G., Penman S. The nuclear matrix prepared by amine modification // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 1999. V. 96. P. 933-938.

149. Wang Y., Prives C. Increased and altered DNA binding of human p53 by S and G2/M but not G1 cyclin-dependent kinases // Nature. 1995. V. 376. P. 88-91.

150. Wang Y., Blandino G., Oren M., Givol D. Induced p53 expression in lung cancer cell line promotes cell senescence and differentially modifies the cytotoxicity of anti-cancer drugs // Oncogene. 1998. V. 17. № 15. P. 19231930.

151. Wilhelmsen K., Ketema M., Truong H., Sonnenberg A. KASH-domain proteins in nuclearmigration, anchorage and other processes // The Journal of Cell Science. 2006. V. 119. P. 5021-5029.

152. Worman H.J., Courvalin J.C. The inner nuclear membrane // The Journal of Membrane Biology. 2000. V. 177. P. 1-11.

153. Worman H.J., Bonne G. "Laminopathies": Awide spectrum of human diseases // Experimental Cell Research. 2007. V. 313. P. 2121-2133.

154. Xue W., Zender L., Miething C., Dickins R.A., Hernando E., Krizhanovsky V., Cordon-Cardo C., Lowe S.W. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas // Nature. 2007. V. 445. № 7128. P 656-660.

155. Yeung M.C., Lau A.S. Tumor suppressor p53 as a component of the tumor necrosis factor-induced, protein kinase PKR-mediated apoptotic pathway in human promonocytic U937 cells // The Journal of Biological Chemistry. 1998. V. 273. P. 25198-25202.

156. Yonish-Rouach E., Resnitzky D., Lotem J., Sachs L., Kimchi A., Oren M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6 //Nature. 1991. V. 352. № 6333. P. 345-347.

157. Yu J., Zhang L., Hwang P.M., Kinzler K.W., Vogelstein B. PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells // Molecules and Cells. 2001. V. 7. № 3. P. 673-682.

158. Zakut-Houri R., Bienz-Tadmor B., Givol D., Oren M. Human p53 cellular tumor antigen: cDNA sequence and expression in COS cells // EMBO Journal. 1985. V. 4. № 5. P. 1251-1255.

159. Zhang Y., Xiong Y., Yarbrough W.G. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppression pathways // Cell. 1998. V. 92. № 6. P. 725734.

160. Zhu P., Ning Y., Yao L., Chen M., Xu C. The proliferation, apoptosis, invasion of endothelial-like epithelial ovarian cancer cells induced by hypoxia // Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 2010. V. 29. P. 124.

Информация о работе

Лапшина, Мария Александровна
кандидата биологических наук
Черноголовка, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лапшина, Мария Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лапшина, Мария Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лапшина, Мария Александровна, Черноголовка

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ассоциация белка p53 с ядерным матриксом в клетках разных типов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия