Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены

Шукуров, Рахим Рахманкулыевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены"

На правах рукописи

4QOO1"

Шукуров Рахим Рахманкулыевич

Антимикробные пептиды

сорного растения Stellaria media и их гены: экспрессия и устойчивость к фитопатогенным грибам

03.01.06. - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 МАЙ 2011

Москва 2011

4848134

Работа выполнена в лаборатории стрессоустойчивости растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии (г. Москва).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Бабаков Алексей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Смирнов Алексей Николаевич Джавахия Виталий Георгиевич

Ведущая организация:

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Защита состоится «Я9 » 2011 г. в /7 часов на заседании

диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42.

Тел.: (499) 976-65-44, факс: (499) 977-09-47, e-mail: iab@iab.ac.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии

Автореферат разослан «_»_2011 г.,

размещен на Интернет-сайте www.vniisb.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день грибные заболевания культурных растений являются одной из основных проблем в сельском хозяйстве, вызывая сильное падение урожайности и нанося огромный экономический ущерб (Agrios, 1988; Ali and Reddy, 2000). Помимо снижения урожая фи-топатогенные грибы, выделяя токсины, могут прямо влиять на здоровье людей и животных. Классические попытки ограничения таких потерь в сельском хозяйстве основываются на использовании разнообразных фунгицидов, которые помимо своей стоимости имеют еще один значительный недостаток, связанный с их высоким потенциалом загрязнения окружающей среды. В настоящее время благодаря развитию биотехнологии появилась возможность создания устойчивых растений сельскохозяйственных культур с помощью методов генетической инженерии, используя собственные защитные механизмы растений. К одному из таких механизмов относится синтез пептидов растениями с высокой антигрибной активностью. В связи с этим, большой интерес представляют антигрибные пептиды сорных растений, произрастающих вместе с культурными и подвергающихся действию идентичных фитопатогенов.

Ранее в лаборатории стрессоустойчивости растений ВНИИСБ совместно с ИБХ РАН было выделено два новых гевеин-подобных пептида SmAMPl.la и SmAMP2.2a (GenBank: CBJ21248.1; CBJ21249.1) из семян сорного растения мокрицы (Stellaria media L.). Интерес к этому растению был вызван двумя причинами. Во-первых, в России это растение растет повсеместно на влажных почвах, благоприятных для роста и развития грибной инфекции; во-вторых, это растение произрастает очень часто рядом с овощными культурами и, следовательно, вступает в контакт с грибами, поражающими эти растения и при этом само не проявляет признаков заболевания. Как оказалось, оба пептида длиной 35 (SmAMPl.la) и 31 (SmAMP2.2a) аминокислотных остатков с шестью остатками цистеина, формирующих три дисульфидные связи, имеют высокую гомологию с ранее охарактеризованными гевеин-подобными пептидами из

Amaranthus caudatus и Amaranthus retroflexus (Broekaert et al., 1992; Lipkin et al., 2005). Показано, что выделенные пептиды проявляют высокую и специфичную антигрибную активность по отношению к некоторым фитопатогенным грибам: Altemaria solani, A. consortiale, Botrytis cinerea, Bipolaris sorokirtiana, Rhizoctonia solani, Fusarium culmorum, F. oxysporum и Thielaviopsis basicola. Нуклеотидные последовательности кДНК этих пептидов кодируют пропептиды pro-SmAMPl и pro-SmAMP2, имеющие уникальную структуру. Уникальность заключается в том, что каждый из пропептидов содержит в своем составе вместо одного два неодинаковых по длине гевеин-подобных пептида, разделенных линкерным пептидом из 10 аминокислотных остатков. В структуру каждого пропептида входят также сигнальный пептид и С-концевой домен (68 и 66 аминокислотных остатков соответственно) с высоким содержанием отрицательно заряженных боковых групп. При таком типе биосинтеза одновременное появление в S. media нескольких пептидов с разным спектром антигрибной активности, вероятно, дает ей определенные преимущества в защите от фитопатогенных грибов. Уникальность структуры пропетидов антимикробных пептидов в S. media определила наш интерес к их использованию для повышения устойчивости культурных растений к патогенам.

Цель данной работы заключалась в выяснении особенностей экспрессии генов pro-SmAMPl-З в растениях S. media, а также в определении возможности использования этих генов для повышения устойчивости культурных растений к грибным заболеваниям.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Исследовать экспрессию генов антимикробных пептидов pro-SmAMPl-З в S. media в стерильных растениях и в растениях при их контакте с фитопато-генными грибами;

• Получить трансгенные растения Arabidopsis thaliana и Nicotiana tabacum, экспрессирующие ген pro-SmAMPl и его производные, моделирующие известные структуры предшественников антимикробных пептидов;

• Провести молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений;

• Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность промотора гена pro-SmAMP2;

• Определить эффективность различных 5'- делеционных вариантов нук-леотидной последовательности промотора pro-SmAMP2 для экспрессии генов в гетерологичных системах.

Научная новизна. В данной работе впервые обращается внимание на молекулярные механизмы устойчивости сорных растений к биотическому стрессу посредством синтеза пептидов, обладающих высокой антигрибной активностью. Показано, что экспрессия генов антимикробных пептидов в сорном растении S. media характеризуется органоспецифичностью и существенно возрастает при взаимодействии растения с патогеном. Установлено, что передача сигнала от патогена к растению происходит с участием жасмоновой кислоты. Обоснована возможность использования гена pro-SmAMPl для повышения устойчивости растений к биотическому стрессу. В растении S. media идентифицирован новый сильный конститутивный растительный промотор и показана перспективность его использования в гетерологичных системах при наработке рекомбинантных белков в больших количествах.

Апробация работы. Две векторные генетические конструкции для агро-бактериальной трансформации растений, созданные на базе pro-SmAMPl - одна с полной копией гена, вторая с участком гена pro-SmAMPl, кодирующим сигнальный пептид вместе с антимикробным пептидом SmAMPl.la, - были переданы в лабораторию генной инженерии растений ВНИИСБ для проведения работы по генетической трансформации томата (Solarium lycopersicum L.). В результате было продемонстрировано повышение устойчивости к фитофторозу трансгенных растений томата (Халилуев М.Р., 2010), несущих ген рго-SmAMPlили ген SmAMPl.la.

Содержание работы и ее результатов отражены в пяти выступлениях на международных и всероссийских конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 298 источник. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и 36 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологический материал. Семена S. media были собраны в средней полосе России. Наращивание спор фитопатогенных грибов В. sorokiniana, F. cul-тогит, В. cinerea и Т. basicola проводили в жидкой культуре на картофельно-декстрозной среде 7 суток при 25°С в темноте.

Для измерения экспрессии генов растения S.media были выращены в стерильных условиях. В сосуд со стерильным четырехнедельным растением вносили два блока агара с мицелием гриба. Через два дня после достижения мицелием гриба стебля растения надземную часть растения отбирали для выделения тотальной РНК. Для заражения растений использовали грибы В. sorokiniana, Т. basicola, F. culmorum и В. cinerea.

При изучении действия салициловой кислоты или метилжасмоната стерильные четырехнедельные растения S.media опрыскивали растворами этих соединений и через 24 часа из них выделяли тотальную РНК.

Выделение геномной ДНК из растений проводили в соответствие с методом (Kang and Yang, 2004), а тотальной РНК - с использованием реагента Trizol («Invitrogen», США) в соответствие рекомендациям фирмы-изготовителя. Все измерения проводили в трехкратной повторности.

Синтез кДНК, постановку ПЦР, клонирование генно-инженерных конструкций осуществляли согласно протоколам «Molecular cloning» (Sambrook and Russell, 2001).

Экспрессию генов pro-SmAMPl-3 в S. media измеряли ОТ-ПЦР в реальном времени, используя пару ген-специфичных праймеров, подобранных к одинаковым фрагментам участков кДНК pro-SmAMPl-З. В качестве внутреннего стандарта использовали предварительно отсеквенированный фрагмент гена актина S. media. Определение количества ПЦР-продукта в образцах в режиме реального времени осуществляли при помощи флуоресцентно меченых гибриди-зационных зондов TaqMan («Синтол», Россия) на приборе АНК-32 (ИАП РАН, Россия).

Для определения тканеспецифичности экспрессии генов pro-SmAMPl-3 тотальную РНК выделяли из листьев, корней, стеблей и цветов отдельно, получали кДНК и затем проводили ОТ-ПЦР .

Для агробактериальной трансформации в работе использовали генетические конструкции на основе вектора рВ1121, полученные ранее в нашей лаборатории и обозначенные как pBI-pro-SmAMPl, включающей в себя полную нуклеотидную последовательность кДНК генаpro-SmAMP 1,pBI-SmAMPl.la с сигнальным пептидом и антимикробным пептидом SmAMPl.la и рВ1-SmAMPl.lafCTP) с добавленной по отношению к предыдущей нуклеотидной последовательности С-концевого домена (рис.1).

Плазмидную ДНК выделяли, используя набор Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System («Promega», США). Нуклеотидную последовательность определяли на автоматическом секвенаторе AhFexpress II («Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания) в группе анализа геномов ВНИИСБ.

pBI-SmAMPl.la(CTP) | p3SS /ЩЦЩ SP

AMPl.la

Рис. 1. Схемы векторов для трансформации растений: p35S, CaMV35S промотор; 5'UTR и 3'UTR, нетранслируемые участки кДНК гена pro-SmAMPl; SP, сигнальный пептид; AMP 1.1 а и AMP 1.2а, индивидуальные пептиды, образующиеся в результате процессинга пропептидаpro-SmAMPl; LP, линкерный пептид; СТР, С-концевой домен.

Векторы для агробактериальной трансформации растений были введены в аг-робактерию штамма AGL0 путем электропорации (Wise et al., 2006).

Трансформация растений табака и арабидопсиса.

Arabidopsis thaliana экотипа Col-0 были выращены и протрансформиро-ваны методом «floral dip» в соответствии с описанием (Zhang et al., 2006). Гомозиготные растения, содержащие одну вставку целевого гена были использованы в анализе по определению устойчивости отдельных трансгенных растений к грибу В. sorokiniana. В этих растениях был определен уровень экспрессии гена pro-SmAMPl методом ОТ-ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирующего красителя SybrGreen.

Все трансгенные растения табака (Nicotiana tabacum), используемые в данной работе, были получены в лаборатории индуцированного рекомбино-генеза (ВНИИСБ).

Анализ устойчивости отдельных трансгенных растений A. thaliana к грибу В. sorokiniana. Растения A. thaliana выращивали в горшочках, заполненных почвой в климакамере (Gallenkamp Fi-totron 600Н, United Kingdom) при круглосуточном освещении и температуре 22°С в течении 4-х недель. После чего на листья розетки наносили 20 мкл суспензии конидий гриба В.

sorokiniana (106 спор/мл). Через 7 дней измеряли высоту растений и следили за поражением листьев розетки и побегообразованием.

Анализ устойчивости линий трансгенных растений N. tabacum к фи-топатогенному грибу Т. basicola проводили, используя отделенные неповрежденные листья из среднего и верхнего ярусов растений. На левую сторону листа, от центральной жилки, наносили 50 мкл стерильной воды , а на правую - суспензию конидий гриба (106 спор/мл) в том же объеме. Чашки инкубировали 5 суток в темноте при 26°С. При оценке устойчивости учитывали площадь поражения, а также визуальные признаки заболевания: усыхание, осветление, либо пожелтение листовой пластины, побурение пятна и некроз ткани.

Оценку выживаемости проростков трансгенных растений A. thaliana поколения ТЗ и N. tabacum поколения Т1 проводили на инфекционном фоне, создаваемом в почве: В. sorokiniana для арабидопсиса и Т. basicola для табака. Для этого предварительно была определена инфекционная нагрузка фитопато-генными грибами, приводившая к гибели 50% контрольных растений. Семена трансгенных и контрольных растений высевали в почву, заполненную в чашки Петри, и инкубировали 9 суток в климакамере при круглосуточном освещении. К подсчитанным всходам добавляли суспензию конидий гриба (106 спор/мл) в количестве 10 мл и инкубировали 2 суток в термостате при 24°С. Далее растения переносили в климакамеру и через 5 суток подсчитывали процент выживших проростков.

Нуклеотидная последовательность промотора pro-SmAMP2 была определена с помощью метода "прогулка по хромосоме" (Евроген, ИБХ РАН) и проанализирована с помощью программ PLACE Web Signal Scan (http://www.dna.affrc.go.ip/PLACE/signalscan.html) (Higo et al., 1999), PlantCARE (http://bioinformatics.psb.uaent.be/webtools/plantcare/htmlA (Lescot et al., 2002) и Vector NTI 8 Suite (InforMax inc.).

Амплификацию нуклеотидной последовательности промоторной области генаpro-SmAMP2 и ее 5'-делеционных вариантов (-2160 п.н., -1544 п.н.,

-1189 п.н., - 862 п.н.) проводили с использованием Р/й-полимеразы (СибЭнзим, Россия), вектора pGEM-T и праймеров, содержащих рестриктные сайты ферментов EcoRI и Ncol. Полученные ампликоны были клонированы в вектор pCAMBIA 1381Z с репортерным геном GUS и проверены секвенированием. Трансформацию A. tumefaciens штамма AGL0 полученными генетическими конструкциями проводили, используя так называемый "трехродительский" метод (Wise et al., 2006).

Получение трансгенных растений N. tabacum поколения ТО, трансформированных генетическими конструкциями с 5'- делеционными вариантами промотора pro-SmAMP2 было проведено в лаборатории индуцированного ре-комбиногенеза (ВНИИСБ) в соответствие с методом (Horsch et al., 1985).

Измерение активности GUS в трансгенных растениях табака было проведено флуорометрическим методом (Jefferson et al., 1987) с использованием флуориметра LS55 (Perkin Elmer, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия генов pro-SmAMPl-3.

Антимикробные гевеин-подобные пептиды были идентифицированы в зрелых семенах S. media. Для оценки участия этих пептидов в защите целого растения S. media от фитопатогенов на начальном этапе работы представлялось целесообразным исследовать экспрессию кодирующих их генов в других органах растения. Методом ОТ-ПЦР было установлено, что все три гена рго-SmAMPl, pro-SmAMP2 и pro-SmAMP3 экспрессируются по-разному в S. media (рис. 2 А.) Наибольший уровень экспрессии всех 3-х генов наблюдался в корнях и стебле. Pro-SmAMP2 имел практически одинаковый уровень экспрессии во всех проверенных органах растения, pro-SmAMP3 слабо экспрессировал-ся в листьях и бутонах, apro-SmAMPl показал наименьший уровень экспрессии в листьях.

После выяснения органоспецифичности экспрессии генов pro-SmAMPl-3 нами была проверена их индуцибельность при грибном заражении растения мокрицы. Благодаря высокой гомологии генов pro-SmAMPl-З нам удалось подобрать праймеры и TaqMan зонд, которые отжигаются на всех трех генах, и поэтому мы смогли получить информацию об усредненном уровне экспрессии одновременно для всех трех генов (рис. 2 Б). Оказалось, что средний уровень экспрессии pro-SmAMP 1-3 при взаимодействии S. media с грибами увеличивался, при этом различные виды грибов по-разному влияли на экспрессию генов pro-SmAMP 1-3.

Получив эти данные, мы попытались ответить на вопрос: имеется ли различие в изменении экспрессии отдельно у каждого из этих генов. Эксперименты показали (рис. 2 В), что разные грибы неодинаково влияли на экспрессию отдельных генов; так наибольшее возрастание уровня экспрессии наблюдалось у pro-SmAMPl при взаимодействии с грибом R. solarium (до 70 раз), среднее - в 2-9 раз у pro-SmAMP2 и наименьшее - у pro-SmAMP3. В ряде случаев для гена pro-SmAMP3 наблюдалось падение уровня экспрессии. Интересно отметить, что ген pro-SmAMP2 экспрессировался на очень высоком уровне и у контрольных (стерильных) растений, пороговый цикл для него в ПЦР в реальном времени был сравним с пороговым циклом для гена актина мокрицы. Следует отметить, что во всех экспериментах по измерению влияния различных грибов на экспрессию генов pro-SmAMP 1-3 не было отмечено заметных признаков грибного поражения S.media, что указывает на высокую устойчивость этого растения к фитопатогенным грибам.

Известно (Reymond and Fanner, 1998), что в активации защитных механизмов у растений принимают участие молекулы салициловой и жасмоновой кислот. Проведенные эксперименты (рис.2 Б) показали, что индукция экспрессии pro-SmAMP 1-3 наблюдается при обработке S. media метилжасмонатом, но не салициловой кислотой.

pro-SmAMP2

pro-SmAMP3

pro-SmAMPl

КС ЛБА.

Hpohrfc iMciwbHta ЯимгЬл* Bottvtfe MrtM Mk*«c kU мЫн ЬткШ юЬпотип dn*rc« ]ашммм*к

pro-SmAMPl

pro-SmAMP2

pro-SmAMP3

О,* •• им ИИ! ■ ■ -1.......1 |ИИ

Рис.2. Экспрессия генов pro-SmAMPl-З в S. media. А. Экспрессия генов pro-SmAMPl-З в разных органах растения S. media, измеренная методом ОТ-ПЦР (выровненная по отношению к экспрессии гена актина S. media) ) К - корни, JI - листья, С - стебель, Б -бутоны.Б. Изменение экспрессии суммы генов pro-SmAMPl-З (по отношению к уровню экспрессии гена актина) в стерильных растениях S. media, подвергнутых заражению грибами или действию метилжасмоната и салициловой кислоты. В. Изменение экспрессии каждого из генов pro-SmAMPl-З при грибном заражении стерильных растений S. media.

Повышение устойчивости трансгенных растений, экспрессирующих ген pro-SmAMPl.

A. thaliana. Для того чтобы выяснить приводит ли к увеличению устойчивости к грибным заболеваниям сверхэкспрессия генов антигрибных пептидов pro-SmAMPl-З в гетерологичной растительной системе, нами был выбран ген пропептида pro-SmAMPl, имеющего в своем составе пептид, показавший в ранее проведенных экспериментах наибольший уровень антигрибной активности. Трансформацию растений проводили тремя генетическим конструкциями, показанными на рис. 1, моделирующие известные структуры пропептидов антимикробных пептидов растений.

Выбранные последовательности кДНК гена pro-SmAMPl были клонированы в вектор рВ1121 под контролем конститутивного промотора вируса мозаики цветной капусты CaMV35S. В качестве объектов для трансформации были выбраны два вида растений, относящиеся к разным семействам двудольных -арабидопсис и табак, как наиболее хорошо изученные и часто применяемые в качестве модельных растений в различных исследованиях.

Молекулярно-биологический анализ был проведен на трансгенных растениях гомозиготных линий A. thaliana поколения ТЗ. Измерения экспрессии целевых генов, проведенные методом ПЦР в реальном времени, показали, что практически у всех растений, трансформированных конструкциями рВ1-SmAMPl.la и pBI-SmAMPl.la(CTP), уровень экспрессии был значительно ниже уровня экспрессии актина, в то время как у восьми из девяти растений А. thaliana, трансформированных полной копией гена pro-SmAMPl (вектор рВ1-proSmAMPl), он был сопоставим с уровнем экспрессии гена актина (рис. 3 А), а в некоторых растениях уровень мРНК pro-SmAMP превышал уровень мРНК актина в 4 раза (рис. 3 А).

Девять отобранных растений A. thaliana, трансформированных вектором pBI-pro-SmAMP, параллельно с растениями дикого типа, служившими в качестве контрольных, проверяли на устойчивость к грибу В. sorokiniana. На рисунке 3 Б. эти растения показаны через одну неделю после заражения суспен-

зией конидий гриба Л. sorokiniana. Различия между трансгенными растениями и контрольными заключались в высоте, длине цветоноса, количестве цветов и бутонов. У контрольных растений наблюдалась существенная задержка в росте и уменьшение длины цветоноса по сравнению с трансгенными растениями (рис. 3 Б). Кроме того, трансгенные растения с высоким уровнем экспрессии pro-SmAMPl мало отличались от незараженных контрольных образцов по габитусу, количеству цветов и бутонов.

Оказалось также, что имеет место корреляция между высоким уровнем экспрессии pro-SmAMPl и повышенной устойчивостью трансгенных растений к фитопатогенному грибу (табл. 1). Например, у растений № 5, 9 и 15 наблюдалось превышение экспрессии трансгена по сравнению с уровнем экспрессии актина в 3.1,4.1 и 3.7 раза соответственно. Именно эти растения проявили и наибольшую устойчивость к фитопатогенам. В то же время растения № 10 и 14, у которых относительный уровень экспрессии трансгена составлял 0.01 и 1.03 соответственно, практически ничем не отличались по устойчивости от контрольных растений, подвергнутых заражению.

Табл. 1. Устойчивость растений A. thaliana поколения ТЗ, трансформированных конструкцией pBI-pro-SmAMPl, к фитопатогенному грибу В. sorokiniana ТЗ

№ растения Степень поражения растения Относительный

уровень экспрессии*

Дикий тип +++ -

2 ++ 3,98

4 ++ 2,03

5 + 3,09

9 + 4,11

10 +++ 0,01

12 + + 2,35

13 + + 3,08

14 ++ 1,03

15 + 3,72

* уровень экспрессии гена pro-SmAMPl в растениях A. thaliana по отношению к уровню экспрессии гена бета-актина

+++ - некроз ткани, значительное осветление листа, отсутствие цветов ++ - значительное осветление листа

+ - локальное осветление листа. Растения в возрасте 4-х недель заражали грибом В. sorokiniana, нанося 20 мкл суспензии конидий гриба (106 спор/мл) на листья розетки. Через 7 дней измеряли высоту растений и следили за поражением листьев розетки и побегообразованием.

pro-SmAMPl

SmAMPl.la

SmAMPl.la(CTP)

4,00 X ада

i 2,00 Т»

о &

& & & Ф Ъ Ь ф &

g 70

g. «>

JS 50

1 Ю

s= so

Col-0 pro-SmAMPl SmAMPl.la SmAMPl.lo(CTP) JJ,

Рис. 3. Arabidopsis thaliana А. Относительный уровень экспрессии трансгена в растениях A. thaliana, (по отношению к уровню экспрессии актина) по данным ПЦР в реальном времени. По горизонтальной оси номера растений A. thaliana поколения ТЗ (qgene-96). Б. Пятинедельные растения A. thaliana, зараженные грибом B.sorokiniana. Растения в возрасте пяти недель заражали суспензией конидий грибов B.sorokiniana (106 клеток/мл) и через 7 дней анализировали распространение инфекции. Контрольные, незараженные растения опрыскивали стерильной водой. 1- дикий тип, контроль, 2- дикий тип, зараженный грибом, 3 и 4 - трансгенные растения № 9 и №15 с геном pro-SmAMP 1, подвергнутые заражению. В. Выживаемость проростков трансгенного A. thaliana, после инфицирования грибом В. sorokiniana. Col-0 - дикий тип; pro-SmAMPl, SmAMPl.la, SmAMPl.Ia(CTP) проростки ТЗ поколения трансгенного A. thaliana.

Растения, трансформированные конструкциями pBI-SmAMPl.la и рВ1-SmAMPl.la(CTP) также проверяли на устойчивость к грибу В. sorokiniana, однако значимых различий между зараженными растениями дикого типа и трансформантами не наблюдалось.

Нами была также проведена оценка выживаемости проростков трансгенных растений A. thaliana поколения ТЗ на инфекционном фоне с грибом В. sorokiniana, подобранным таким образом, чтобы выживаемость контрольных растений составляла 50%. По результатам эксперимента оказалось, что самая высокая степень выживаемости (82%) была у трансгенных растений, несущих полную копию гена pro-SmAMP. Трансгенные растения с конструкциями pBI-SmAMPl.la и pBI-SmAMPl.la(CTP) показали меньшую степень выживаемости - 72% и 66% соответственно. Тем не менее, выживаемость всех трансгенных растений была выше, чем в контрольном варианте (рис. 3 В).

N. tabacum. Полученные нами первичные трансформанты N. tabacum с генами pro-SmAMP 1 , SmAMPl.la, SmAMPl.la(CTP) были высажены в почву и выращивались в теплице при естественном освещении. В качестве контроля служили растения, трансформированные геном nptll. В предварительных экспериментах при проведении чашечных тестов по устойчивости отделенных листьев табака ТО к фитопатогену Т. basicola нами были отобраны трансгенные растения, показавшие повышенную устойчивость к патогену: два растения с геном pro-SmAMP 1 (№ 18, и 99) и одно с геном SmAMPl.la (№189). От этих линий были получены семена поколения Т1, которые высаживали в почву на искусственно созданном инфекционном фоне с грибом Т. basicola (рис. 4 А). Установлено, что наибольшая выживаемость проростков оказалась у потомства pro-SmAmpl № 99 и достигала 89% (рис. 4 Б). Надо отметить, что в этом эксперименте мы наблюдали • гораздо более низкую выживаемость растений SmAMPl. /а№ 189 (15%) по сравнению с контролем nptll (48%).

Рис. 4. А. Оценка выживаемости проростков трансгенных растений N. tabacum поколения Т1 от линий pro-SmAMPl и SmAMPl.la, выращенных на инфекционном фоне с грибом Т. basicola. 1 - SmAMPl.la №189; 2 - pro-SmAMPl №99; 3 - контроль nptUNs 9 без заражения; 4 - nptll №9. Б. Выживаемость проростков трансгенных растений N. tabacum pro-SmAMPl и SmAMPl.la, выращенных на инфекционном фоне с грибом Т. basicola.По горизонтальной оси - номера линий трансформантов N. tabacum, от которых получены семена для проведения эксперимента.

Активность GUS в растениях, экспрессирующих репортерный ген под контролем 5'- делеционных вариантов промотора гена pro-SmAMP2.

Анализ экспрессии генов антимикробных пептидов в растении S. media показал, что ген pro-SmAMP2 экспрессировался на очень высоком уровне, сопоставимым с уровнем экспрессии гена |3 - актина. Это послужило основанием начала работы по установлению нуклеотидной последовательности промотора гена pro-SmAMP2. Нуклеотидная последовательность промоторной области длиной 2160 п.н. была определена с помощью метода "прогулка по хромосоме. Для того чтобы охарактеризовать идентифицированную промоторную область нами были получены четыре 5'- делеционных варианта, показанные на рис. 5. Эти делеционные варианты были использованы в качестве промотора репортерного гена GUS в векторе pCAMBIA 1381Z. В качестве положительного контроля была использована плазмида рСАМВ1А1301, где ген GUS находится под контролем CaMV35S промотора. Полученными конструкциями при помощи агробактериального метода были протрансформированы растения N. tabacum.

pl381Z-2160 | - 2160 pro-SmAMPl

pl381Z'lS44 ! - 1W pr&SmAMPl

pl38121189 j_- J189 pro-SmAMP2

pl381Z-862 ■ 862 pros,

pCAMBIA-1301 [_

Рис. 5. Схема конструкций с промотором pro-SmAMP2 для анализа экспрессии GUS (бе-та-глюкоронидазы) в трансгенных растениях табака. Серии 5'-делеционных фрагментов нуклеотидной последовательности промотора гена pro-SmAMP2 были слиты с репортерным геном GUS в векторе pCAMBIA1381Z. В качестве конструкции, где GUS находится под контролем CaMV35S промотора, была использована плазмида pCAMBIA1301. Int - каталазный интрон в последовательности гена GUS.

Всего было получено и проанализировано 19 линий трансгенных растений

для конструкции, (-2160) 22 растения для (-1544) 17 для (-1189), 20 растений

(-862) и 10 растений CaMV35S:GUS. Измерение активности GUS в экстрактах

из трансгенных растений показало (рис.6) что, во-первых, уровень активно-

>1-1 GUS

GUS

>м GUS

S>\"»I GUS

хч 6US

сти GUS был наименьшим у наиболее длинного фрагмента промотора рго-SmAMP2 (-2160 п. н. от точки начала трансляции); во-вторых, абсолютные значения активности GUS снижались по мере укорочения фрагмента, начиная с -1544 делеционного фрагмента; в-третьих, уровень активности GUS в большинстве растений под контролем 5'- делеционных вариантов промотора рго-SmAMP2 был существенно выше активности GUS в растениях, содержащих репортерный ген под контролем CaMV35S промотора.

-I

Ё 15000 О.

! " "

! : :

$ ! I ■ 1 и Я Щ

Р..........;.....; ...... /'" ЦРРЁ

• т ::: ■К

"""" ::................. I, 1_1

! 1 . ! - _______„_________ 11 II! Л

J L

CaMV3SS

1 I I Г

-2160 -1544 -1189 -862

pro-SmAMP2 pro-SmAMP2 pro-SmAMP2 pro-SmAMP2

Рис. 6. Активность GUS отдельных трансгенных растений N. tabacum, содержащих ген GUS, под контролем 5'-делеционных фрагментов нуклеотидной последовательности промотора гена pro-SmAMP2 и промотора CaMV35S. Активность GUS измерена флуориметриче-ским способом, используя 4MUG в качестве субстрата.

ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие S. media с разными видами фитопатогенных грибов приводит к активации экспрессии всех генов pro-SmAMPl-З, однако, как видно из рис. 2 В. их экспрессия возрастает неодинаково. Наибольший эффект вызывали F. culmorum и В. cinerea, наименьший - В. sorokiniana. Одна из причин наблюдаемого различия может быть связана с самим экспериментом, а именно, с фиксированным временем измерения экспрессии генов для всех грибов. При разной скорости развития ответа растения при контакте с конкретным фитопатогеном максимальный ответ может достигаться через разное время, что должно приводить при одномоментном измерении экспрессии генов pro-SmAMPl-З к различным величинам. Другая причина может заключаться в реальных различиях амплитуд ответа S. media при контакте с разными грибами, обусловленных специфичностью взаимодействия S. media с разными видами фитопатогенных грибов.

Измерения экспрессии генов показали, что все три пропептида рго-SmAMPl-З экспрессируются в корнях и стеблях S. media, pro-SmAMP 1 экспрес-сируется также в бутонах, a pro-SmAMP2 и в бутонах и в листьях (рис. 2 А). Из этих данных следует, что корни и стебли S. media наиболее защищены от грибной инфекции, поскольку в них, видимо, синтезируются все 5 антимикробных пептидов. Такой результат выглядит вполне логичным с точки зрения защиты от грибной инфекции, поскольку она, возникая в почве, проникает через корень и распространяется по растению через стебель.

Эксперименты с обработкой стерильных растений салициловой кислотой и метилжасмонатом, показали, что экспрессия генов pro-SmAMP 1-3 не меняется под действием салициловой кислоты, но активируется жасмонатом (рис. 2 Б). Полученные нами результаты подтверждают, что гены гевеин-подобных пептидов или экспрессируются конститутивно (Коо et al., 2002) или активируются путем передачи сигнала, не зависимым от салициловой кислоты.

Анализ трансгенных растений A. thaliana и N. tabacum показал, что устойчивость к фитопатогенным грибам увеличивается только у растений, экс-прессирующих полную копию кДНК пропептида pro-SmAMPl, что дает дополнительные сведения об определенной биологической роли гевеин-подобных пептидов S. media в защите растения-хозяина.

Уровень экспрессии трансгена, измеренный с помощью ПЦР в реальном времени, показал, что у всех растений A. thaliana pBI-SmAMPl.la и pBI-SmAMPl.la(CTP) он был значительно ниже уровня экспрессии актина, в то время как у растений, трансформированных полной копией гена pro-SmAMPl, такой низкий уровень наблюдался только у одного растения (рис. 3 А). Существенное различие в экспрессии при прочих равных условиях, вероятно, связано с большей стабильностью мРНК полной копии гена pro-SmAMPl.

Повышенная устойчивость трансгенных растений A. thaliana и N. tabacum к фитопатогенным грибам, экспрессирующих именно ген pro-SmAMPl, также может быть обусловлена вероятным процессингом пропептида pro-SmAMPl, при котором происходит двукратное увеличение общей кон-центрации антимикробных пептидов и благодаря различию в специфичности антигрибной активности пептидов повышается устойчивость, по-видимому, к более широкому кругу фитопатогенных грибов. Частично это подтверждено нашими данными об устойчивости трансгенных растений A. thaliana и N. tabacum к нескольким видам фитопатогенным грибам.

Анализ идентифицированной последовательности промотора гена рго-SmAMP2 показал наличие специфических мотивов, которые обнаруживаются только у сильных растительных промоторов (Sawant et al., 1999). 5'- делецион-ные варианты -2160, 1544, 1189, 862 п. н. промотора гена pro-SmAMP2 бьши достаточны, чтобы обеспечивать высокий и конститутивный уровень экспрессии репортерного гена GUS под их контролем в трансгенных растениях N. tabacum. В полученных нами 3-х делеционных вариантах промотора гена рго-SmAMP2 (-1544,-1189,-862) активность GUS в трансгенных растениях была на порядок выше аналогичной величины в растениях с геном GUS под контро-

лем промотора CaMV35S. Активность GUS в трансгенных растениях с деле-ционном вариантом -2160 п.н. была гораздо ниже по сравнению с активностью GUS, измеренной в растениях с более короткими 5'-делеционными вариантами (-1544, -1189, -862). Этот результат, вероятно, связан с присутствием в участке -2160 -s- -1544 неизвестных супрессорных регуляторных элементов, присутствие которых значительно снижает силу промотора. Также интересно отметить, что с укорочением нуклеотидной последовательности 5'- промотор-ной области pro-SmAMP2 возрастает стабильность экспрессии GUS, что проявилось в увеличении относительного количества трансгенных растений с высоким уровнем активности GUS (Рис.6). Возможно, это связано каким-то образом с эффектом положения целевого гена при встраивании в геном N. tabacum (Finnegan and McElroy, 1994).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Уникальность структуры предшественников антимикробных пептидов в S. media вместе с их высокой антигрибной активностью определяет интерес к их использованию в биотехнологии культурных растений. Возможность применения их для таких целей показана на примере двух видов растений, относящиеся к разным семействам —A. thaliana и N. tabacum. На основании полученных данных можно сделать вывод о перспективности использования гена пропептида pro-SmAMPl из S. media для повышения устойчивости культурных растений к фитопатогенным грибам. Кроме этого оказалось, что несомненный интерес для биотехнологии представляет также идентифицированный нами сильный растительный промотор гена pro-SmAMP2, который может быть использован в генетической инженерии растений вместо широко распространенного вирусного промотора CaMV35S.

и индуцибельностью их промоторов, так и, по-видимому, высокой стабильностью кодирующей их мРНК. Полученные знания об устройстве защитной системы сорного растения указывают на разнообразие в мире растений защитных механизмов против фитопатогенов и могут оказаться чрезвычайно полезными для понимания путей улучшения устойчивости культурных растений к грибным болезням.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что сорное растение S. media обладает эффективной защитой против фитопатогенов, обусловленной как уникальной структурой белков-предшественников антимикробных гевеин-подобных пептидов, так и высоким уровнем накопления кодирующей их мРНК.

2. Показано, что гетерологичная экспрессия гена пропептида pro-SmAMPl из S. media в растениях A. thaliana и N. tabacum приводит к повышению устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным грибам, что указывает на перспективность использования гена pro-SmAMPl в биотехнологии культурных растений.

3. В нуклеотидной последовательности промоторной области гена рго-SmAMP2 идентифицированы три 5'- делеционных фрагмента, каждый из которых проявил себя в трансгенных растениях N. tabacum в качестве сильного промотора.

4. Идентифицированные фрагменты существенно превосходят по эффективности широко используемый в генетической инженерии растений вирусный промотор CaMV35S и могут найти применение в современной биотехнологии растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шукуров P.P., Вобликова В.Д., Никонорова А.К., Егоров Ц.А., Гришин Е.В., Бабаков А.В. Повышение устойчивости растений Arabidopsis thaliana к фитопатогенным грибам, экспрессирующих гевеиноподобные пептиды из сорного растения Stellaria media. Доклады РАСХН. - Москва, 2010. - С.24-26

2. Егоров Ц.А., Мусолямов А.Х., Никонорова А.К., Вобликова В.Д., Шукуров P.P., Бабаков А.В., Гришин Е.В. Антимикробные пептиды семян звездчатки (Stellaria media L.) - VI Съезд общества физиологов растений России. Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» Сыктывкар, 2007. Материалы докладов в трех частях, часть 2: 124125

3. Вобликова В.Д., Никонорова А.К., Комахин Р.А., Шукуров P.P. Создание модельных трансгенных растений, экспрессирующих гены антимикробных пептидов из Stellaria media, для изучения механизмов устойчивости к фитопатогенным грибам, с оценкой перспективы их практического использования. -«Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России» Сергиев Посад, 2009. Материалы конференции РАСХН-РФФИ, 60-63

4. Шукуров P.P., Вобликова В.Д., Никонорова А.К., Егоров Ц.А., Бабаков А.В. Молекулярные основы преимущества сорных растений в устойчивости к биотическому стрессу на примере растения Stellaria media. Всероссийский симпозиум «РАСТЕНИЕ И СТРЕСС (Plants under Environmental Stress)», Тезисы докладов. - Москва, 2010. - С.401-402

5. Shukurov R.R., Voblikova V.D., Nikonorova А.К., Komakhin H.F., Komakhina V.V., Egorov T.A., GrishinE.V., Babakov A.V. 2011. Transformation of tobacco and arabidopsis plants with Stellaria media genes encoding novel hevein - like peptides increases their resistance to fungal pathogens, Transgenic Research, in press.

Подписано в печать: 04.05.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 801 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шукуров, Рахим Рахманкулыевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Антимикробные пептиды и PR-защитные белки.

1.2. Основные группы антимикробных пептидов.

1.3. Дефензины.

1.3.1. Структура и распределение.

1.3.2. Молекулярно-биологические особенности строения дефензинов.

1.3.3. Особенности экспрессии дефензинов.

1.3.4. Индукция экспрессии дефензинов в растениях.

1.3.5. Биологическая активность дефензинов.

1.3.6. Антигрибная активность.

1.3.7. Способы действия антигрибных дефензинов.

1.4. Тионины.

1.5. Липид-переносящие белки.

1.6. Циклотиды.

1.7. Снакины.

1.8. Четырех-цистеиновые антимикробные пептиды.

1.8.1. Пептиды Impatiens balsamina.

1.9. Ноттины.

1.10. Гевеин и гевеин-подобные пептиды.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены"

Каждый год различные заболевания сельскохозяйственных культур приводят к катастрофическому падению урожая, вызывая большие социальные и экономические проблемы (Agrios, 1988; АН and Reddy, 2000). При этом необходимо отметить, что главную роль среди общих факторов развития болезней растений играет инфицирование фитопатогенными грибами и оомицетами. Возможность серьезных эпидемий среди сельскохозяйственных культур остается крайне актуальной и в настоящее время, что ясно из многочисленных сообщений о вспышках болезней, вызванных мучнистой росой, ржавчиной, видами фитофторы и т.д. Помимо снижения урожая фитопатогенные грибы могут прямо влиять на здоровье людей и животных, вызывая отравления токсинами. Классические попытки ограничения таких потерь в сельском хозяйстве в основном базируются на использовании дорогих фунгицидов, которые помимо своей стоимости имеют еще один значительный недостаток, связанный с их высоким потенциалом загрязнения окружающей среды. В настоящее время благодаря развитию современной науки появилась возможность создания устойчивых растений сельскохозяйственных культур с помощью методов генетической инженерии, используя собственные защитные механизмы растений. К одному из таких механизмов относится способность растений к синтезу пептидов, обладающих высокой антигрибной активностью. В связи с этим, большой интерес представляют собой антигрибные пептиды сорных растений, произрастающих вместе с культурными и подвергающихся действию идентичных фитопатогенов.

Антимикробные пептиды (АМП) - это гетерогенная группа высокоосновных пептидов размером от 2 до 9 кДа, содержащих остатки цистеинов, которые благодаря формированию внутримолекулярных дисульфидных мостиков придают AMP термодинамическую стабильность (Broekaert et al., 1997). На основе количества и расположения дисульфидных связей, а также других характеристик аминокислотной последовательности обычно выделяют восемь различных семейств АМП. Это растительные дефензины (Terras et al., 1992b; Thevissen et al., 2000b), тионины (Epple et al., 1997b; Fernandez de Caleya et al., 1972), липид-переносящие белки (Cammue et al., 1995; Molina et al., 1993), гевеин-подобные пептиды (Broekaert et al., 1992; Waljuno К et al., 1975), ноттин-подобные пептиды (Cammue et al., 1992; Shao et al., 1999), антимикробные пептиды Macadamia integrifolia (Marcus et al., 1997; McManus et al., 1999) и Impatiens balsamina (Patel et al., 1998; Tailor et al., 1997), а также циклотиды (Craik et al., 1999). Выделено несколько АМП, которые не относятся ни к одному из перечисленных типов, что свидетельствует о том, что поиск новых АМП еще далеко не закончен (Guo et al., 2009; Lin and Ng, 2009).

Целый ряд АМП являются амфипатическими молекулами, что является предпосылкой эффективного их взаимодействия с мембранными структурами. В большинстве случаев мишенью действия этих АМП являются, по-видимому, мембраны клеток патогенов. Предложен ряд механизмов, объясняющих нарушение функции мембран-мишеней, которые, как правило, подразумевают избирательное взаимодействие антимикробных пептидов с поверхностными структурами клеток патогена и последующее встраивание АМП в мембраны. Тем не менее, некоторые данные свидетельствуют также в пользу реализации других механизмов действия: либо конечной мишенью являются некоторые внутриклеточные структуры, либо нарушение функции мембран происходит без активного встраивания в них молекул пептидов (Aerts et al., 2008; Lay and Anderson, 2005). На настоящий момент наиболее хорошо изучены биологические свойства тионинов и растительных дефензинов. Предполагается, что они играют важную роль в защите растений вследствие их высокой антимикробной активности (Broekaert et al., 1995). В пользу этого свидетельствуют также данные о том, что трансгенные растения с увеличенной экспрессией генов этих АМП проявляют повышенную устойчивость к фитопатогенам (Gao et al., 2000; Terras et al., 1995).

Гевеин, впервые выделенный из латекса каучукового дерева {Hevea sp.), является небольшим хитин-связывающим пептидом, состоящим из 43 аминокислотных остатков, восемь из которых цистеиновые и связанны четырьмя дисульфидными мостиками. Гевеин синтезируется в виде препропептида, включающего сигнальную последовательность из 17 аминокислотных остатков, собственно гевеин и С-концевой фрагмент из 144 остатков (Broekaert et al., 1990). Несколько гевеин-подобных пептидов было выделено из семян Amaranthus caudatus (Broekaert et al., 1992) , Amaranthus retroßexus (Lipkin et al., 2005), Pharbitis nil (Koo et al., 1998), листьев Beta vulgaris (Nielsen et al., 1997) и плодов Sambucas nigra (Van Damme et al., 1999). Многие хитин-связывающие белки содержат в своей аминокислотной последовательности или домен гевеина, или гомологичную ему последовательность, имеющую способность связывать хитин и остальные родственные полисахариды, содержащие N-ацетилглюкозамин или N-ацетилнейраминовую кислоту. Хотя гевеин-подобные пептиды имеют определенную схожесть аминокислотных последовательностей, они различаются между собой в количестве дисульфидных связей. Большинство имеют восемь цистеиновых остатков, формирующих четыре дисульфидные 7 связи, что приближает их к хитин-связывающим доменам 1-4 класса хитиназ (Beintema, 1994; Коо et al., 1998; Li et al., 2003; Raikhel et al., 1993). Также существуют немногочисленные варианты гевеин-подобных пептидов с десятью цистеиновыми остатками (Huang et al., 2002; Odintsova et al., 2009; Utkina et al., 2010; Van den Bergh et al., 2002) и варианты только с шестью остатками цистеина, формирующие три дисульфидных мостика (Broekaert et al., 1992; Huang et al., 2000; Lipkin et al., 2005; Nielsen et al., 1997).

Гевеин-подобные пептиды проявляют различные уровни антимикробной активности, хогя, как известно, сам гевеин имеет относительно слабый уровень антимикробной активности. Пока остается неясным, с какими особенностями первичной структуры гевеин-подобных пептидов ассоциирована их антимикробная активность.

Ранее в нашей лаборатории совместно с ИБХ РАН из семян сорного растения Stellaria media L. были выделены и охарактеризованы два новых гевеин-подобных пептида SmAMPl.la и SmAMP2.2a. Установлено, что эти пептиды накапливаются в S. media в результате протеолиза пропептидов pro-SmAMPl и pro-SmAMP2. Первичная структура pro-SmAMPl и pro-SmAMP2 уникальна, поскольку каждый из них имеет в своем составе помимо сигнального пептида и отрицательно заряженного С-конца не один как обычно, а два разделенных линкерным пептидом разных по длине гевеин-подобных пептида. Уникальность структуры предшественников антимикробных пептидов в S. media определила наш интерес к их использованию для повышения устойчивости культурных растений к патогенам.

Таким образом, цель данной работы заключалась в выяснении особенностей экспрессии генов pro-SmAMPl-З в растениях S. media, а также в определении возможности использования этих генов в повышении устойчивости культурных растений к грибным заболеваниям.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Исследовать экспрессию генов антимикробных пептидов pro-SmAMPl-З в S. media в стерильных растениях и в растениях при их контакте с фитопатогенными грибами;

• Получить трансгенные растения Arabidopsis thaliana и Nicotiana tabacum, экспрессирующие гены, созданные на базе гена pro-SmAMPl - один с полной копией гена, другие два, моделирующие известные структуры предшественников антимикробных пептидов;

• Провести молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений;

• Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность промотора гена рго-8тАМР2\

• Определить эффективность различных 5'- делеционных вариантов нуклеотидной последовательности промотора рго-БтАМР2 для экспрессии генов в гетерологичных системах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Инфицируя растение, патогены запускают синтез веществ, облегчающих их проникновение через различные физические барьеры, что позволяет им получить питательные вещества из клетки-хозяина, и обеспечивающие нейтрализацию защитных механизмов растения. Вещества, секретируемые патогенами во время процесса инфицирования тканей растения это в основном:

1) гидролитические ферменты, которые разрушают структурные компоненты клеточной стенки растения-хозяина, позволяя патогену проникать внутрь тканей (Collmer and Keen, 1986; Walton, 1994)

2) токсины, взаимодействующие с метаболитическими процессами клетки-хозяина и изменяющие проницаемость клеточной мембраны или, инактивирующие ферменты и, таким образом, полностью нарушают метаболизм растения (Quigley and Gross, 1994; Scholz-Schroeder et al., 2001)

3) регуляторы роста (такие как ауксины, этилен, гиббереллины и др.), создающие дисбаланс в гормональной системе растения и затем вызывающие физиологические ответы, несовместимые с особенностями нормального развития растения (Chen et al., 2003; Suckstorff and Berg, 2003)

4) полисахариды, которые возможно 01вечают за блокирование механизмов проведения воды по сосудистой системе растения (de Pinto, 2003; Leigh and Coplin, 1992).

Среди вышеперечисленных классов веществ, наиболее важными для процесса инфицирования представляются гидролитические ферменты, участвующие в начальном этапе проникновения патогена и его дальнейшего распространения. Среди них можно выделить следующие группы (Collmer and Keen, 1986; Walton, 1994):

1) кутиназы, способные разрушать воскоподобное вещество кутин - один из главных компонентов кутикулы растительной клетки. Многие грибы постоянно производят некоторое количество кутиназ, которые при контакте с субстратом (кутином) разрушают его до мономерных блоков. Эти мономеры в свою очередь индуцируют высокую экспрессию кутиназ грибами, интенсифицируя процесс заражения;

2) пектиназы, способные расщеплять пектин - компонент клеточной стенки растения, среди них выделяют: полигалактуроназы, пектиновые лиазы и пектиновые метилэстеразы

3) целлюлазы, гемицеллюлазы и лигниназы, обеспечивающие конечную стадию разрушения клеточной стенки растения, что дает возможность патогену распространяться далее по тканям растения.

При этом у растений имеется, по крайней мере, два механизма устойчивости к патогенам: первый представлен структурами и компонентами, синтезируемыми во время его нормального развития и конститутивного накопления в растении преформированных эффекторных молекул (факторы базальной или постоянной устойчивости) и второй, активируемый только после контакта с патогеном (факторы индуцированной устойчивости). Краткая последовательность развития защитных реакций в ответ на появление патогена (принципиально сходная со схемой развития ответных реакций на появление насекомых-вредителей) включает: (а) распознавание источника опасности или сигнала угрозы специализированным рецепторным аппаратом растительных клеток; (б) внутриклеточная трансдукция и обработка сигнала; (в) локальный ответ, включающий продукцию эффекторных соединений, непосредственно участвующих в инактивации патогена, и массированную гибель растительных клеток локально в месте поражения (реакция гиперчувствительного ответа); (г) синтез специализированных молекул, выполняющих роль дистального сигнала; (д) рецепция этого сигнала в удаленных частях растения; (е) системный ответ, подразумевающий накопление защитных эффекторных соединений в организме растения повсеместно, не только в очаге поражения. (Ferreira et al., 2007; Lay and Anderson, 2005).

Среди различных механизмов защитной реакции растения наиболее важным представляется механизм индуцированной устойчивости, связанный с так называемым «ген на ген» взаимодействием (Flor, 1971; Keen, 1990; Parker and Coleman, 1997). Генетический механизм такой устойчивости включает в себя молекулярное распознавание между продуктами комплиментарных генов, представленных в растении (7?-гены или гены устойчивости) и в патогене (avr- гены или гены авирулентности).

При взаимодействии между продуктами этих генов происходят ряд изменений, среди которых можно выделить (Lamb, 1994):

1) быстрое производство реактивных форм кислорода (ROS), такие как: супероксидный анион (Ог), перекись водорода (Н2О2) и свободные гидроксильные группы (ОН) (Alvarez et al., 1998; Dixon et al., 1994; Lamb and Dixon, 1997). При накоплении в растении перекиси водорода и других реактивных форм кислорода проявляется прямой антимикробный эффект и также происходит окислительное сшивание структурных молекул клеточной стенки (Dixon et al., 1994; Lamb and Dixon, 1997)

2) изменение структуры клеточной стенки. Полимеры клеточной стенки с боковыми фенольными группами, такими как тирозиновые остатки экстенсинов и остатками феруловой и п-кумаровой кислот различных полисахаридов (Fry, 1982; Fry, 1983), играющими важную роль в архитектуре клеточной стенки, посредством формирования

11 сшивок среди этих полимеров. Увеличение концентрации перекиси водорода способствует формированию сшивок среди тирозинов экстенсинов, также называемые гидроксипролин-богатые гликопротеины (HRGPs), представленные в клеточной стенке (Bradley et al., 1992; Brady et al., 1996). Такие сшивки увеличивают нерастворимость HRGPs, при этом клеточная стенка становится менее чувствительной к гидролитическим ферментам, секретируемым патогеном во время его проникновения в клетку;

3) индуцированное накопление низкомолекулярных вторичных метаболитов, известных как фитоалексины, обладающие антимикробными свойствами (Dixon, 1986; Hammerschmidt, 1999)

4) активация и синтез защитных пептидов и белков (Dixon and Harrison, 1990; Lamb et al., 1989)

5) клеточная смерть как результат проявления гиперчувствительного ответа. Смерть клеток, наблюдаемая при гиперчувствительном ответе имеет множество сходств с феноменом апоптоза, известный среди животных. Множество свидетельств указывает на то, что этот механизм не менее сложен, включающий участие некоторых сигнальных молекул, таких как реактивные формы кислорода, потоки ионов, G - белки, жасмоновая и салициловая кислота, каскад фосфорилирования и рециклинг белков с помощью системы полиубиквитинирования (Alvarez, 2000; Dangl et al., 1996; Hammond-Kosack and Jones, 1996; Pennell and Lamb, 1997).

После контакта с патогеном экспрессируются ряд пептидов и белков, многие из которых непосредственно обладают антимикробными свойствами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Шукуров, Рахим Рахманкулыевич

выводы

1. Установлено, что сорное растение S. media обладает эффективной защитой против фитопатогенов, обусловленной как уникальной структурой белков-предшественников антимикробных пептидов, так и высоким уровнем накопления кодирующей их мРНК.

3. В нуклеотидной последовательности промоторной области гена рго-SmAMP2 идентифицированы три 5'- делеционных фрагмента, каждый из которых проявил себя в растениях N. tabacum в качестве сильного промотора. Эти фрагменты существенно превосходят по эффективности широко используемый в генетической инженерии растений вирусный промотор CaMV35S.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Уникальность структуры предшественников антимикробных пептидов в S. media вместе с их высокой антигрибной активностью определяет интерес к их использованию в биотехнологии культурных растений. Возможность применения их для таких целей показана на примере двух видов растений, относящиеся к разным семействам - A. thaliana и N. tabacum. На основании полученных данных можно сделать вывод о перспективности использования гена пропептида pro-SmAMP 1 из S. media для повышения устойчивости культурных растений к фитопатогенным грибам. Кроме этого оказалось, что несомненный интерес для биотехнологии представляет также идентифицированный нами сильный растительный промотор гена pro-SmAMP2, который может быть использован в генетической инженерии растений вместо широко распространенного вирусного промотора CaMV35S.

Проведенное исследование показало, что сорное растение S. media обладает эффективной защитой против фитопатогенов. Причем эффективность определяется как уникальной структурой предшественников антимикробных пептидов и индуцибельностью их промоторов, так и, по-видимому, высокой стабильностью кодирующей их мРНК. Полученные знания об устройстве защитной системы сорного растения указывают на разнообразие в мире растений защитных механизмов против фитопатогенов и могут оказаться чрезвычайно полезными для понимания путей улучшения устойчивости культурных растений к грибным болезням.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шукуров, Рахим Рахманкулыевич, Москва

1. The Electronic Plant Gene Register. Plant Physiol., 120(2): 633.

2. Aerts, A.M., Francois, I.E., Cammue, B.P. and Thevissen, K., 2008. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell Mol Life Sci, 65(13): 2069-79.

3. Agrios, 1988. Plant Pathology. Terza Edizione Academic Press, Inc. San Diego, California 9210, San Diego.

4. Akbergenov, R. et al., 2004. ARC-1, a sequence element complementary to an internal 18S rRNA segment, enhances translation efficiency in plants when present in the leader or intercistronic region of mRNAs. Nucleic Acids Res, 32(1): 239-47.

5. AI-Kaff, N.S. et al., 2000. Plants rendered herbicide-susceptible by cauliflower mosaic virus-elicited suppression of a 35S promoter-regulated transgene. Nat Biotech, 18(9): 995-999.

6. Ali, G.S. and Rcddy, A.S., 2000. Inhibition of fungal and bacterial plant pathogens by synthetic peptides: in vitro growth inhibition, interaction between peptides and inhibition of disease progression. Mol Plant Microbe Interact, 13(8): 847-59.

7. Alvarez, M.a.E. et al., 1998. Reactive Oxygen Intermediates Mediate a Systemic Signal Network in the Establishment of Plant Immunity. Cell, 92(6): 773-784.

8. Alvarez, M.E., 2000. Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease resistance. Plant Mol Biol, 44(3): 429-42.

9. Archer, B.L., 1960. The proteins of Hevea brasiliensis Latex. 4. Isolation and characterization of crystalline hevein. Biochem J, 75: 236-40.

10. Ayabe, T. et al., 2002. Activation of Paneth cell alpha-defensins in mouse small intestine. J Biol Chem, 277(7): 5219-28.

11. Bailey-Serres, J., 1999. Selective translation of cytoplasmic mRNAs in plants. Trends Plant Sci, 4(4): 142-148.

12. Balaji, V., Sessa, G. and Smart, C.D., 2011. Silencing of Host Basal Defense Response-Related Gene Expression Increases Susceptibility of Nicotiana benthamiana to Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Phytopathology, 101(3): 349-57.

13. Bals, R. et al., 1998. Human beta-defensin 2 is a salt-sensitive peptide antibiotic expressed in human lung. J Clin Invest, 102(5): 874-80.

14. Beintema, J.J., 1994. Structural features of plant chitinases and chitin-binding proteins. FEBS Lett, 350(2-3): 159-63.

15. Ben-Nissan, G. and Weiss, D., 1996. The petunia homologue of tomato gastl: transcript accumulation coincides with gibberellin-induced corolla cell elongation. Plant Mol Biol, 32(6): 1067-74.

16. Benko-Iseppon, A.M. et al., 2010. Overview on plant antimicrobial peptides. Curr Protein Pept Sci, 11(3): 181-8.

17. Berrocal-Lobo, M. et al., 2002. Snakin-2, an antimicrobial peptide from potato whose gene is locally induced by wounding and responds to pathogen infection. Plant Physiol, 128(3): 951-61.

18. Bloch, C., Jr. and Richardson, M., 1991. A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect alpha-amylases from seeds or sorghum (Sorghum bicolar (L) Moench) have sequence homologies with wheat gamma-purothionins. FEBS Lett, 279(1): 101-4.

19. Blochet, J.E. et al., 1993. Complete amino acid sequence of puroindoline, a new basic and cystine-rich protein with a unique tryptophan-rich domain, isolated from wheat endosperm by Triton X-l 14 phase partitioning. FEBS Lett, 329(3): 336-40.

20. Boehm, R., 2007. Bioproduction of Therapeutic Proteins in the 21st Century and the Role of Plants and Plant Cells as Production Platforms. Annals of the New York Academy of Sciences, 1102(1): 121-134.

21. Bohlmann, H, 1994. The role of thionins in plant protection, 13. Taylor & Francis, Philadelphia, PA, ETATS-UNIS, 1-16 pp.

22. Bradford, M.M, 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2): 248-254.

23. Bradley, D.J, Kjellbom, P. and Lamb, C.J, 1992. Elicitor- and wound-induced oxidative cross-linking of a proline-rich plant cell wall protein: a novel, rapid defense response. Cell, 70(1): 21-30.

24. Brady, J.D, Sadler, I.H. and Fry, S.C, 1996. Di-isodityrosine, a novel tetrametric derivative of tyrosine in plant cell wall proteins: a new potential cross-link. Biochem J, 315 ( Pt 1): 323-7.

25. Broekaert, I, Lee, H.I, Kush, A, Chua, N.H. and Raikhel, N„ 1990. Wound-induced accumulation of mRNA containing a hevein sequence in laticifers of rubber tree (Hevea brasiliensis). Proc Natl Acad Sci USA, 87(19): 7633-7.

26. Broekaert, W. et al, 1997. Antimicrobial peptides from plants. Critical reviews in plant sciences, 16(3): 297-323.

27. Broekaert, W.F. et al, 1992. Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins. Biochemistry, 31(17): 4308-14.

28. Broekaert, W.F, Terras, F.R, Cammue, B.P. and Osborn, R.W, 1995. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. Plant Physiol, 108(4): 1353-8.

29. Brogden, K.A, Ackermann, M, McCray, P.B. and Tack, B.F, 2003. Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences. International journal of antimicrobial agents, 22(5): 465-478.

30. Bruix, M. et al, 1995. lH-nmr studies on the structure of a new thionin from barley endosperm. Biopolymers, 36(6): 751-63.

31. Bruix, M. et al, 1993. Solution structure of gamma 1-H and gamma 1-P thionins from barley and wheat endosperm determined by 1H-NMR: a structural motif common to toxic arthropod proteins. Biochemistry, 32(2): 715-24.

32. Bustin, S, 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol, 25(2): 169-193.

33. Cammue, B.P. et al, 1992. Isolation and characterization of a novel class of plant antimicrobial peptides form Mirabilis jalapa L. seeds. J Biol Chem, 267(4): 2228-33.

34. Cammue, B.P. et al, 1995. A potent antimicrobial protein from onion seeds showing sequence homology to plant lipid transfer proteins. Plant Physiol, 109(2): 445-55.

35. Carvalho Ade, O. and Gomes, V.M, 2007. Role of plant lipid transfer proteins in plant cell physiology-a concise review. Peptides, 28(5): 1144-53.

36. Casteels-Josson, K, Capaci, T, Castcels, P. and Tempst, P, 1993. Apidaecin multipeptide precursor structure: a putative mechanism for amplification of the insect antibacterial response. EMBO J, 12(4): 1569-78.

37. Casteels, P. et al, 1994. Biodiversity of apidaecin-type peptide antibiotics. Prospects of manipulating the antibacterial spectrum and combating acquired resistance. J Biol Chem, 269(42): 26107-15.

38. Castro, M.S. and Fontes, W, 2005. Plant Defense and Antimicrobial Peptides. Protein and Peptide Letters, 12(1): 11-16.

39. Castro, M.S., Gerhardt, I.R, Orru, S, Pucci, P. and Bloch, C, Jr., 2003. Purification and characterization of a small (7.3 kDa) putative lipid transfer protein from maize seeds. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 794(1): 109-14.

40. Chen, K.C, Lin, C.Y, Kuan, C.C, Sung, FI.Y. and Chen, C.S, 2002. A novel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid. J Agric Food Chem, 50(25): 7258-63.

41. Chen, N., Goodwin, P.H. and Hsiang, T., 2003. The role of ethylene during the infection of Nicotiana tabacum by Colletotrichum destructivum. J Exp Bot, 54(392): 2449-56.

42. Chiang, C.C. and Hadwiger, L.A., 1991. The Fusarium solani-induced expression of a pea gene family encoding high cysteine content proteins. Mol Plant Microbe Interact, 4(4): 324-31.

43. Choi, Y., Choi, Y.D. and Lee, J.S., 2008. Antimicrobial activity of gamma-thionin-like soybean SE60 in E. coli and tobacco plants. Biochem Biophys Res Commun, 375(2): 230-4.

44. Clough, S.J. and Bent, A.F., 1998. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J, 16(6): 735-43.

45. Cociancich, S., Ghazi, A., Hetru, C., Hoffmann, J.A. and Letellier, L., 1993. Insect defensin, an inducible antibacterial peptide, forms voltage-dependent channels in Micrococcus luteus. Journal of Biological Chemistry, 268(26): 19239-19245.

46. Colilla, F., Rocher, A. and Mendez, E., 1990. y-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. FEBS Letters, 270(1-2): 191-194.

47. Collmer, A. and Keen, N.T., 1986. The Role of Pectic Enzymes in Plant Pathogenesis. Annual Review of Phytopathology, 24(1): 383-409.

48. Craik, D.J., 2009. Circling the enemy: cyclic proteins in plant defence. Trends Plant Sci, 14(6): 328-35.

49. Craik, D.J., Daly, N.L., Bond, T. and Waine, C., 1999. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. J Mol Biol, 294(5): 1327-36.

50. Dangl, J.L., Dietrich, R.A. and Richberg, M.I I., 1996. Death Don't Have No Mercy: Cell Death Programs in Plant-Microbe Interactions. Plant Cell, 8(10): 1793-1807.

51. Daniell, H., Streatfield, S.J. and Wycoff, K., 2001. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends Plant Sci, 6(5): 21926.

52. Daraselia, N.D., Tarchevskaya, S. and Narita, J.O., 1996. The Promoter for Tomato 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase Gene 2 Has Unusual Regulatory Elements That Direct High-Level Expression. Plant Physiology, 112(2): 727-733.

53. Davis A., K. Renner, C. Sprague, L. Dyer and Mutch, D., 2005. integrated Weed Management: "One Year's Seeding.". Michigan State University Extension bulletin, E-2931, 112 pp.

54. De Lucca, A., 1998. Fungicidal and binding properties of three plant peptides. Mycopathologia, 144(2): 87-91.

55. De Samblanx, G.W. et al., 1997. Mutational analysis of a plant defensin from radish (Raphanus sativus L.) reveals two adjacent sites important for antifungal activity. J Biol Chem, 272(2): 1171-9.

56. Diaz-De-Leon, F., Klotz, K.L. and Lagrimini, L.M., 1993. Nucleotide sequence of the tobacco (Nicotiana tabacum) anionic peroxidase gene. Plant Physiol, 101(3): 1117-8.

57. Dixon, R.A., 1986. The Phytoalexin Response: Elicitation, Signalling and Control of Host Gene Expression. Biological Reviews, 61(3): 239-291.

58. Dixon, R.A. and Harrison, M.J., 1990. Activation, structure, and organization of genes involved in microbial defense in plants. Adv Genet, 28: 165-234.

59. Dixon, R.A., Harrison, M.J. and Lamb, C.J., 1994. Early Events in the Activation of Plant Defense Responses. Annual Review of Phytopathology, 32(1): 479-501.

60. Dong, Y. and von Arnim, A., 2003. Novel plant activation-tagging vectors designed to minimize 35S enhancer-mediated gene silencing. Plant Molecular Biology Reporter, 21(4): 349358.

61. Doran, P.M., 2000. Foreign protein production in plant tissue cultures. Curr Opin Biotechnol, 11(2): 199-204.

62. Douliez, J.P., Pato, C., Rabesona, H., Molle, D. and Marion, D., 2001. Disulfide bond assignment, lipid transfer activity and secondary structure of a 7-kDa plant lipid transfer protein, LTP2. Eur J Biochem, 268(5): 1400-3.

63. Duvick, J.P., Rood, T., Rao, A.G. and Marshak, D.R., 1992. Purification and characterization of a novel antimicrobial peptide from maize (Zea mays L.) kernels. J Biol Chem, 267(26): 18814-20.

64. Elfstrand, M. et al., 2001. Identification of candidate genes for use in molecular breeding A case study with the Norway spruce defensin-like gene, spil. Silvae Genetica(50): 75-81.

65. Epple, P., Apel, K. and Bohlmann, H., 1997a. ESTs reveal a multigene family for plant defensins in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett, 400(2): 168-72.

66. Epple, P., Apel, K. and Bohlmann, H., 1997b. Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of Arabidopsis against Fusarium oxysporum. Plant Cell, 9(4): 50920.

67. Fant, F., Vranken, W., Broekaert, W. and Borremans, F., 1998. Determination of the three-dimensional solution structure of Raphanus sativus antifungal protein 1 by 1H NMR. J Mol Biol, 279(1): 257-70.

68. Farrokhi, N., Whitelegge, J.P. and Brusslan, J.A., 2008. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnol J, 6(2): 105-34.

69. Fehlbaum, P. et al., 1994. Insect immunity. Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant antifungal peptides. J Biol Chem, 269(52): 33159-63.

70. Feldbrugge, M. et al., 1994. Functional analysis of a light-responsive plant bZIP transcriptional regulator. Plant Cell, 6(11): 1607-21.

71. Feldbrugge, M., Sprenger, M., Hahlbrock, K. and Wcisshaar, B., 1997. PcMYBl, a novel plant protein containing a DNA-binding domain with one MYB repeat, interacts in vivo with a light-regulatory promoter unit. Plant J, 11(5): 1079-93.

72. Fernandez de Caleya, R., Gonzalez-Pascual, B., Garcia-Olmedo, F. and Carbonero, P., 1972. Susceptibility of phytopathogenic bacteria to wheat purothionins in vitro. Appl .Microbiol, 23(5): 998-1000.

73. Ferreira, R.B. et al., 2007. The role of plant defence proteins in fungal pathogenesis. Mol Plant Pathol, 8(5): 677-700.

74. Fido, R.J., Mills, E.N., Rigby, N.M. and Shewry, P.R., 2004. Protein extraction from plant tissues. Methods Mol Biol, 244: 21-7.

75. Finnegan, J. and McElroy, D., 1994. Transgene Inactivation: Plants Fight Back! Nat Biotech, 12(9): 883-888.

76. Flor, H.H., 1971. Current Status of the Gene-For-Gene Concept. Annual Review of Phytopathology, 9(1): 275-296.

77. Florack, D.E. and Stiekema, W.J., 1994. Thionins: properties, possible biological roles and mechanisms of action. Plant Mol Biol, 26(1): 25-37.

78. Francois, I.E.J.A. et al., 2002. Transgenic Expression in Arabidopsis of a Polyprotein Construct Leading to Production of Two Different Antimicrobial Proteins. Plant Physiology, 128(4): 1346-1358.

79. Fry, S.C., 1982. Isodityrosine, a new cross-linking amino acid from plant cell-wall glycoprotein. Biochem J, 204(2): 449-55.

80. Fry, S.C., 1983. Feruloylated pectins from the primary cell wall: their structure and possible functions. Planta, 157(2): 111-123.

81. Futterer, J. and Hohn, T,, 1996. Translation in plants—rules and exceptions. Plant Mol Biol, 32(1-2): 159-89.

82. Gallie, D.R., 1996. Translational control of cellular and viral mRNAs. Plant Mol Biol, 32(1-2): 145-58.

83. Ganz, T., 2004. Defensins: antimicrobial peptides of vertebrates. C R Biol, 327(6): 539-49.

84. Gao, A.G. et al., 2000. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. Nat Biotechnol, 18(12): 1307-10.

85. Gao, G.-H. et al., 2001. Solution Structure of PAFP-S: A New Knottin-Type Antifungal Peptide from the Seeds of Phytolacca americanat,J. Biochemistry, 40(37): 10973-10978.

86. Garcia-Olmedo, F., Molina, A., Alamillo, J.M. and Rodriguez-Palenzuela, P., 1998. Plant defense peptides. Biopolymers, 47(6): 479-91.

87. Garcia, J.R. et al., 2001a. Identification of a novel, multifunctional beta-defensin (human beta-defensin 3) with specific antimicrobial activity. Cell and Tissue Research, 306(2): 257264.

88. Garcia, J.R. et al., 2001b. Human beta-defensin 4: a novel inducible peptide with a specific saltsensitive spcctrum of antimicrobial activity. FASEB J, 15(10): 1819-21.

89. Garrill, A., Jackson, S.L., Lew, R.R. and Heath, I.B., 1993. Ion channel activity and tip growth: tip-localized stretch-activated channels generate an essential Ca2+ gradient in the oomycete Saprolegnia ferax. Eur J Cell Biol, 60(2): 358-65.

90. Gaudet, D.A., Laroche, A., Frick, M., Huel, R. and Puchalski, B., 2003. Cold induced expression of plant defensin and lipid transfer protein transcripts in winter wheat. Physiologia Plantarum, 117(2): 195-205.

91. Gautier, M.F., Aleman, M.E., Guirao, A., Marion, D. and Joudrier, P., 1994. Triticum aestivum puroindolines, two basic cystine-rich seed proteins: cDNA sequence analysis and developmental gene expression. Plant Mol Biol, 25(1): 43-57.

92. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D. and Carter, A., 2000. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nat Biotechnol, 18(11): 1151-5.

93. Giuliano, G. et al., 1988. An evolutionarily conserved protein binding sequence upstream of a plant light-regulated gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85(19): 7089-7093.

94. Gonorazky, A.G., Regente, M.C. and de la Canal, L., 2005. Stress induction and antimicrobial properties of a lipid transfer protein in germinating sunflower seeds. J Plant Physiol, 162(6): 618-24.

95. Grandbastien, M.A., Berry-Lowe, S., Shirley, B.W. and Meagher, R.B., 1986. Two soybean ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase small subunit genes share extensive homology even in distant flanking sequences. Plant Molecular Biology, 7(6): 451-465.

96. Gruber, C.W. et al., 2008. Distribution and evolution of circular miniproteins in flowering plants. Plant Cell, 20(9): 2471-83.

97. Gu, Q., Kawata, E.E., Morse, M.J., Wu, H.M. and Cheung, A.Y., 1992. A flower-specific cDNA encoding a novel thionin in tobacco. Mol Gen Genet, 234(1): 89-96.

98. Guilfoyle, T. et al., 1993. Auxin-Regulated Transcription. Functional Plant Biology, 20(5): 489502.

99. Guo, G, Wang, H.X. and Ng, T.B, 2009. Pomegranin, an antifungal peptide from pomegranate peels. Protein Pept Lett, 16(1): 82-5.

100. Hammami, R, Ben Hamida, J, Vergoten, G. and Fliss, I, 2009. PhytAMP: a database dedicated to antimicrobial plant peptides. Nucleic Acids Res, 37(Database issue): D963-8.

101. Plammerschmidt, R., 1999. PIIYTOALEXINS: What Flave We Learned After 60 Years? Annual Review of Phytopathology, 37(1): 285-306.

102. Flammond-Kosack, K.E. and Jones, J.D, 1996. Resistance gene-dependent plant defense responses. Plant Cell, 8(10): 1773-91.

103. Hancock, R.E. and Lehrer, R, 1998. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends Biotechnol, 16(2): 82-8.

104. Hancock, R.E. and Patrzykat, A, 2002. Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics. Curr Drug Targets Infect Disord, 2(1): 79-83.

105. Harrison, S.J. et al, 1997. An Antimicrobial Peptide from the Australian Native <i>Hardenbergia violacea</i> Provides the First Functionally Characterised Member of a Subfamily of Plant Defensins. Functional Plant Biology, 24(5): 571-578.

106. Hatton, D. et al, 1995. Two classes of cis sequences contribute to tissue-specific expression of a PAL2 promoter in transgenic tobacco. The Plant Journal, 7(6): 859-876.

107. Heil, M, 2002. Induced Systemic Resistance (ISR) Against Pathogens in the Context of Induced Plant Defences. Annals of Botany, 89(5): 503-512.

108. Hellwig, S, Drossard, J, Twyman, R.M. and Fischer, R, 2004. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nat Biotechnol, 22(11): 1415-22.

109. Florsch, R.B, Rogers, S.G. and Fraley, R.T, 1985. Transgenic plants. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 50: 433-7.

110. Floward, M, 1987. Traditional folk remedies: a comprehensive herbal. Century Hutchinson, London 229 pp.

111. Huang, R.H. et al, 2002. Two novel antifungal peptides distinct with a five-disulfide motif from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. FEBS Lett, 521(1-3): 87-90.

112. Fluang, R.FI, Xiang, Y, Tu, G.Z, Zhang, Y. and Wang, D.C, 2004. Solution structure of Eucommia antifungal peptide: a novel structural model distinct with a five-disulfide motif. Biochemistry, 43(20): 6005-12.

113. Jakowitsch, J. et al., 1999. Molecular and cytogenetic characterization of a transgene locus that induces silencing and methylation of homologous promoters intrans. The Plant Journal, 17(2): 131-140.

114. Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and Bevan, M.W., 1987. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J, 6(13): 3901-7.

115. Jennings, C., West, J., Waine, C., Craik, D. and Anderson, M., 2001. Biosynthesis and insecticidal properties of plant cyclotides: the cyclic knotted proteins from Oldenlandia affinis. Proc Natl Acad Sci USA, 98(19): 10614-9.

116. Jha, S. and Chattoo, B.B., 2010. Expression of a plant defensin in rice confers resistance to fungal phytopathogens. Transgenic Res, 19(3): 373-84.

117. Jha, S., Tank, H.G., Prasad, B.D. and Chattoo, B.B., 2009. Expression of Dm-AMPl in rice confers resistance to Magnaporthe oryzae and Rhizoctonia solani. Transgenic Res, 18(1): 59-69.

118. Kader, J.C., 1996. Lipid-Transfer Proteins in Plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 47: 627-654.

119. Kang, T.J. and Yang, M.S., 2004. Rapid and reliable extraction of genomic DNA from various wild-type and transgenic plants. BMC Biotechnol, 4: 20.

120. Kanzaki et al., 2002. Overexpression of the wasabi defensin gene confers enhanced resistance to blast fungus (<SMALL>Magnaporthe grisea</SMALL>) in transgenic rice. TAG Theoretical and Applied Genetics, 105(6): 809-814.

121. Karunanandaa, B., Singh, A. and Kao, T.-h., 1994. Characterization of a predominantly pistil-expressed gene encoding a ?-thionin-like protein of Petunia inflata. Plant Molecular Biology, 26(1): 459-464.

122. Keen, N.T., 1990. Gene-For-Gene Complementarity in Plant-Pathogen Interactions. Annual Review of Genetics, 24(1): 447-463.

123. Kiba, A., Saitoh, H., Nishihara, M., Omiya, K. and Yamamura, S., 2003. C-terminal domain of a hevein-like protein from Wasabia japonica has potent antimicrobial activity. Plant Cell Physiol, 44(3): 296-303.

124. Kirsch, C., Takamiya-Wik, M., Schmelzer, E., Hahlbrock, K. and Somssich, I.E., 2000. A novel regulatory element involved in rapid activation of parsley ELI7 gene family members by fungal elicitor or pathogen infection. Mol Plant Pathol, 1(4): 243-51.

125. Klotman, M.E. and Chang, T.L., 2006. Defensins in innate antiviral immunity. Nat Rev Immunol, 6(6): 447-56.

126. Kobayashi, Y. et al., 1991. A new a-helical motif in membrane active peptides. Neurochemistry International, 18(4): 525-534.

127. Koczulla, A.R. and Bals, R., 2003. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential. Drugs, 63(4): 389-406.

128. Koike, M., Okamoto, T., Tsuda, S. and Imai, R., 2002. A novel plant defensin-like gene of winter wheat is specifically induced during cold acclimation. Biochem Biophys Res Commun, 298(1): 46-53.

129. Komakhin, R. et al., 2010. Transgenic tomato plants expressing recA and NLS-recA-licBM3 genes as a model for studying meiotic recombination. Russian Journal of Genetics, 46(12): 1440-1448.

130. Koo, J.C. et al., 2002. Over-expression of a seed specific hevein-like antimicrobial peptide from Pharbitis nil enhances resistance to a fungal pathogen in transgenic tobacco plants. Plant Mol Biol, 50(3): 441-52.

131. Koo, J.C. et al., 2004. Pn-AMPl, a plant defense protein, induces actin depolarization in yeasts. Plant Cell Physiol, 45(11): 1669-80.

132. Koo, J.C. et al., 1998. Two hevein homologs isolated from the seed of Pharbitis nil L. exhibit potent antifungal activity. Biochim Biophys Acta, 1382(1): 80-90.

133. Kotilainen, M. et al., 1999. GEG participates in the regulation of cell and organ shape during corolla and carpel development in gerbera hybrida. Plant Cell, 11(6): 1093-104.

134. Kozlov, S.A. et al., 2006. Latarcins, antimicrobial and cytolytic peptides from the venom of the spider Lachesana tarabaevi (Zodariidae) that exemplify biomolecular diversity. J Biol Chem, 281(30): 20983-92.

135. Kragh, K.M., Nielsen, J.E., Nielsen, K.K., Dreboldt, S. and Mikkelsen, J.D., 1995. Characterization and localization of new antifungal cysteine-rich proteins from Beta vulgaris. Mol Plant Microbe Interact, 8(3): 424-34.

136. Ma, J.K., Drake, P.M. and Christou, P., 2003. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nat Rev Genet, 4(10): 794-805.

137. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M.L., McNeil, B. and Harvey, L.M., 2005. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast, 22(4): 249-70.

138. Maitra, N. and Cushman, J.C., 1994. Isolation and characterization of a drought-induced soybean cDNA encoding a D95 family late-embryogenesis-abundant protein. Plant Physiol, 106(2): 805-6.

139. Manners, J.M. et al., 1998. The promoter of the plant defensin gene PDF1.2 from Arabidopsis is systemically activated by fungal pathogens and responds to methyl jasmonate but not to salicylic acid. Plant Mol Biol, 38(6): 1071-80.

140. Marcus, J.P., Goulter, K.C., Green, J.L., Harrison, S.J. and Manners, J.M., 1997. Purification, characterisation and cDNA cloning of an antimicrobial peptide from Macadamia integrifolia. Eur J Biochem, 244(3): 743-9.

141. Matzke, M.A. and Matzke, A., 1995. How and Why Do Plants Inactivate Homologous (Trans)genes? Plant Physiol., 107(3): 679-685.

142. McCabe, M.S. et al., 1999. Increased stable inheritance of herbicide resistance in transgenic lettuce carrying a petE promoter-bar gene compared with a CaMV 35S-bar gene. TAG Theoretical and Applied Genetics, 99(3): 587-592.

143. McElroy, D., Zhang, W., Cao, J. and Wu, R., 1990. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell, 2(2): 163-71.

144. McManus, A.M. et al., 1999. MiAMPl, a novel protein from Macadamia integrifolia adopts a Greek key beta-barrel fold unique amongst plant antimicrobial proteins. J Mol Biol, 293(3): 629-38.

145. Medrano, G. et al., 2009. Rapid system for evaluating bioproduction capacity of complex pharmaceutical proteins in plants. Methods Mol Biol, 483: 51-67.

146. Melo, F.R. et al., 2002. Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling, and docking. Proteins, 48(2): 311-9.

147. Mendez, E. et al., 1990. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cellfree system of a novel thionin, gamma-hordothionin, from barley endosperm. Eur J Biochem, 194(2): 533-9.

148. Mendez, E. et al., 1996. Primary structure of omega-hordothionin, a member of a novel family of thionins from barley endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free systems. Eur J Biochem, 239(1): 67-73.

149. Mette, M.F., Aufsatz, W., van der Winden, J., Matzke, M.A. and Matzke, A.J.M., 2000. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J, 19(19): 5194-5201.

150. Michaelson, D., Rayner, J., Couto, M. and Ganz, T., 1992. Cationic defensins arise from charge-neutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity? J Leukoc Biol, 51(6): 634-9.

151. Milligan, S.B. and Gasser, C.S., 1995. Nature and regulation of pistil-expressed genes in tomato. Plant Mol Biol, 28(4): 691-711.

152. Mitter, N., 1998. Systemic induction of an Arabidopsis plant defensin gene promoter by tobacco mosaic virus and jasmonic acid in transgenic tobacco. Plant Science, 136(2): 169-180.

153. Molina, A., Segura, A. and Garcia-Olmedo, F., 1993. Lipid transfer proteins (nsLTPs) from barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens. FEBS Lett, 316(2): 119-22.

154. Moon, H.J., Lee, S.Y., Kurata, S., Natori, S. and Lee, B.L., 1994. Purification and molecular cloning of cDNA for an inducible antibacterial protein from larvae of the coleopteran, Tenebrio molitor. J Biochem, 116(1): 53-8.

155. Moreno, M., Segura, A. and Garcia-Olmedo, F., 1994. Pseudothionin-Stl, a potato peptide active against potato pathogens. European Journal of Biochemistry, 223(1): 135-139.

156. Muller, P.Y., Janovjak, H., Miserez, A.R. and Dobbie, Z., 2002. Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques, 32(6): 1372-4, 1376, 1378-9.

157. Murashige, T., 1973. Nutrition of plant cells and organs in vitro. In Vitro, 9(2): 81-5.

158. Nakamura, K. and Matsuoka, K., 1993. Protein targeting to the vacuole in plant cells. Plant Physiol, 101(1): 1-5.

159. Neuhaus, J.M., Sticher, L., Meins, F., Jr. and Boiler, T., 1991. A short C-terminal sequence is necessary and sufficient for the targeting of chitinases to the plant vacuole. Proc Natl Acad Sci USA, 88(22): 10362-6.

160. Nielsen, K.K., Nielsen, J.E., Madrid, S.M. and Mikkelsen, J.D., 1997. Characterization of a new antifungal chitin-binding peptide from sugar beet leaves. Plant Physiol, 113(1): 83-91.

161. Ntui, V.O. et al., 2010. Stable integration and expression of wasabi defensin gene in "Egusi" melon (Colocynthis citrullus L.) confers resistance to Fusarium wilt and Alternaria leaf spot. Plant Cell Rep, 29(9): 943-54.

162. Odintsova, T.I. et al., 2009. A novel antifungal hevein-type peptide from Triticum kiharae seeds with a unique 10-cysteine motif. FEBS J, 276(15): 4266-75.

163. Ohtani, S., Okada, T., Yoshizumi, H. and Kagamiyama, H., 1977. Complete primary structures of two subunits of purothionin A, a lethal protein for brewer's yeast from wheat flour. J Biochem, 82(3): 753-67.

164. Oren, Z. and Shai, Y., 1998. Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers, 47(6): 451-63.

165. Osborn, R.W. et al., 1995. Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae. FEBS Lett, 368(2): 257-62.

166. Padovan, L., Scocchi, M. and Tossi, A., 2010. Structural aspects of plant antimicrobial peptides. Cuit Protein Pept Sci, 11(3): 210-9.

167. Parijs, J., Broekaert, W., Goldstein, I. and Peumans, W., 1991. Hevein: an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta, 183(2).

168. Park, H.C. et al., 2002. Characterization of a stamen-specific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage. Plant Mol Biol, 50(1): 59-69.

169. Park, Y.D. et al., 1996. Gene silencing mediated by promoter homology occurs at the level of transcription and results in meiotically heritable alterations in methylation and gene activity. The Plant Journal, 9(2): 183-194.

170. Parker, J.E. and Coleman, M.J., 1997. Molecular intimacy between proteins specifying plant-pathogen recognition. Trends Biochem Sci, 22(8): 291-6.

171. Patel, S.U., Osborn, R., Rees, S. and Thornton, J.M., 1998. Structural studies of Impatiens balsamina antimicrobial protein (Ib-AMP1). Biochemistry, 37(4): 983-90.

172. Pennell, R.I. and Lamb, C., 1997. Programmed Cell Death in Plants. Plant Cell, 9(7): 1157-1168.

173. Penninckx, I.A. et al., 1996. Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway. Plant Cell, 8(12): 2309-23.

174. Penninckx, I.A., Thomma, B.P., Buchala, A., Metraux, J.P. and Broekaert, W.F., 1998. Concomitant activation of jasmonate and ethylene response pathways is required for induction of a plant defensin gene in Arabidopsis. Plant Cell, 10(12): 2103-13.

175. Pieterse, C.M. and van Loon, L.C., 1999. Salicylic acid-independent plant defence pathways. Trends Plant Sci, 4(2): 52-58.

176. Portieles, R. et al., 2010. NmDef02, a novel antimicrobial gene isolated from Nicotiana megalosiphon confers high-level pathogen resistance under greenhouse and field conditions. Plant Biotechnol J, 8(6): 678-90.

177. Pyee, J., Yu, H. and Kolattukudy, P.E., 1994. Identification of a lipid transfer protein as the major protein in the surface wax of broccoli (Brassica oleracea) leaves. Arch Biochem Biophys, 311(2): 460-8.

178. Raikhel, N.V., Lee, H.I. and Broekaert, W.F., 1993. Structure and Function of Chitin-Binding Proteins. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44(1): 591615.

179. Reymond, P. and Farmer, E.E., 1998. Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression. Curr Opin Plant Biol, 1(5): 404-11.

180. Robson, G., Wiebe, M. and Trinci, A., 1991. Involvement of Ca in the regulation of hyphal extension and branching inA 3/5. Experimental Mycology, 15(3): 263-272.

181. Romero, A., Alamillo, J.M. and Garcia-Olmedo, F., 1997. Processing of thionin precursors in barley leaves by a vacuolar proteinase. Eur J Biochem, 243(1-2): 202-8.

182. Rouster, J., Leah, R., Mundy, J. and Cameron-Mills, V., 1997. Identification of a methyl jasmonate-responsive region in the promoter of a lipoxygenase 1 gene expressed in barley grain. Plant J, 11(3): 513-23.

183. Rushton, P.J. et al., 1996. Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes. EMBO J, 15(20): 5690-700.

184. Ryals, J., Uknes, S. and Ward, E., 1994. Systemic Acquired Resistance. Plant Physiol, 104(4): 1109-1112.

185. Sambrook, J. and Russell, D., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

186. Satchell, D.P. et al., 2003. Interactions of mouse Paneth cell alpha-defensins and alpha-defensin precursors with membranes. Prosegment inhibition of peptide association with biomimetic membranes. J Biol Chem, 278(16): 13838-46.

187. Sawant, S., Singh, P., Gupta, S., Madnala, R. and Tuli, R., 1999. Conserved nucleotide sequences in highly expressed genes in plants. Journal of Genetics, 78(2): 123-131.

188. Schagger, H., 2006. Tricine-SDS-PAGE. Nat. Protocols, 1(1): 16-22.

189. Schrader-Fischer, G. and Apel, K., 1994. Organ-specific expression of highly divergent thionin variants that are distinct from the seed-specific crambin in the crucifer Crambe abyssinica. Mol Gen Genet, 245(3): 380-9.

190. Segura, A., Moreno, M. and Garciaolmedo, F., 1993. Purification and antipathogenic activity of lipid transfer proteins (LTPs) from the leaves of Arabidopsis and spinach. FEBS Letters, 332(3): 243-246.

191. Segura, A., Moreno, M., Madueno, F., Molina, A. and Garcia-Olmedo, F., 1999. Snakin-1, a peptide from potato that is active against plant pathogens. Mol Plant Microbe Interact, 12(1): 16-23.

192. Segura, A., Moreno, M., Molina, A. and Garcia-Olmedo, F., 1998. Novel defensin subfamily from spinach (Spinacia oleracea). FEBS Lett, 435(2-3): 159-62.

193. Selitrennikoff, C.P., 2001. Antifungal Proteins. Applied and Environmental Microbiology, 67(7): 2883-2894.

194. Sels, J., Mathys, J„ De Coninck, B.M., Cammue, B.P. and De Bolle, M.F., 2008. Plant pathogenesis-related (PR) proteins: a focus on PR peptides. Plant Physiol Biochem, 46(11): 941-50.

195. Shai, Y., 2002. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers, 66(4): 236-48.

196. Shao, F. et al., 1999. A new antifungal peptide from the seeds of Phytolacca americana: characterization, amino acid sequence and cDNA cloning. Biochim Biophys Acta, 1430(2): 262-8.

197. Shaw, P.E. and Stewart, A.F., 2009. Identification of protein/DNA contacts with dimethyl sulfate: methylation protection and methylation interference. Methods Mol Biol, 543: 97104.

198. Shewry, P. and Lucas, J., 1997. Plant Proteins that Confer Resistance to Pests and Pathogens. Advances in Botanical Research, 26: 135-192.

199. Shi, L., Gast, R.T., Gopalraj, M. and Olszewski, N.E., 1992. Characterization of a shoot-specific, GA3- and ABA-regulated gene from tomato. Plant J, 2(2): 153-9.

200. Simonsen, S.M. et al., 2005. A Continent of Plant Defense Peptide Diversity: Cyclotides in Australian Hybanthus (Violaceae). Plant Cell, 17(11): 3176-3189.

201. Slavokhotova, A. A. et al., 2011. Isolation, molecular cloning and antimicrobial activity of novel defensins from common chickweed (Stellaria media L.) seeds. Biochimie, 93(3): 450-6.

202. STAM, M., MOL, J.N.M. and KOOTER, J.M., 1997. Review Article: The Silence of Genes in Transgenic Plants. Annals of Botany, 79(1): 3-12.

203. Stec, B., 2006. Plant thionins-the structural perspective. Cell Mol Life Sci, 63(12): 1370-85.

204. Suckstorff, I. and Berg, G., 2003. Evidence for dose-dependent effects on plant growth by Stenotrophomonas strains from different origins. J Appl Microbiol, 95(4): 656-63.

205. Swathi Anuradha, T., Divya, K., Jami, S.K. and Kirti, P.B., 2008. Transgenic tobacco and peanut plants expressing a mustard defensin show resistance to fungal pathogens. Plant Cell Reports, 27(11): 1777-1786.

206. Tailor, R.II. et al., 1997. A novel family of small cysteine-rich antimicrobial peptides from seed of Impatiens balsamina is derived from a single precursor protein. J Biol Chem, 272(39): 24480-7.

207. Tao, Y. et al, 2003. Quantitative Nature of Arabidopsis Responses during Compatible and Incompatible Interactions with the Bacterial Pathogen Pseudomonas syringae. Plant Cell, 15(2): 317-330.

208. Terras, F.R. et al, 1995. Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role in host defense. Plant Cell, 7(5): 573-88.

209. Terras, F.R. et al, 1992a. In Vitro Antifungal Activity of a Radish (Raphanus sativus L.) Seed Protein Homologous to Nonspecific Lipid Transfer Proteins. Plant Physiol, 100(2): 10558.

210. Terras, F.R. et al, 1992b. Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds. J Biol Chem, 267(22): 15301-9.

211. Terras, F.R. et al, 1993. A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species. FEBS Lett, 316(3): 233-40.

212. Terras, F.R.G, Penninckx, I.A.M.A, Goderis, I.J. and Broekaert, W.F, 1998. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid. Planta, 206(1): 117-124.

213. Terry, A.S. et al, 1988. The cDNA sequence coding for prepro-PGS (prepro-magainins) and aspects of the processing of this prepro-polypeptide. J Biol Chem, 263(12): 5745-51.

214. Thevissen, K. et al, 2003. DmAMPl, an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii), interacts with sphingolipids fromSaccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiology Letters, 226(1): 169-173.

215. Thevissen, K. et al, 1996. Fungal Membrane Responses Induced by Plant Defensins and Thionins. Journal of Biological Chemistry, 271(25): 15018-15025.

216. Thevissen, K, Osborn, R.W, Acland, D.P. and Broekaert, W.F, 2000b. Specific binding sites for an antifungal plant defensin from Dahlia (Dahlia merckii) on fungal cells are required for antifungal activity. Mol Plant Microbe Interact, 13(1): 54-61.

217. Thevissen, K, Terras, F.R.G. and Broekaert, W.F, 1999. Permeabilization of Fungal Membranes by Plant Defensins Inhibits Fungal Growth. Appl. Environ. Microbiol, 65(12): 5451-5458.

218. Thevissen, K. et al, 2004. Defensins from insects and plants interact with fungal glucosylceramides. J Biol Chem, 279(6): 3900-5.

219. Thoma, S, Kaneko, Y. and Somerville, C, 1993. A non-specific lipid transfer protein from Arabidopsis is a cell wall protein. Plant J, 3(3): 427-36.

220. Thomma, B. and Broekaert, W, 1998. Tissue-specific expression of plant defensin genes and in. Plant Physiology and Biochemistry, 36(7): 533-537.

221. Thomma, B.P, Cammue, B.P. and Thevissen, K, 2002. Plant defensins. Planta, 216(2): 193202.

222. Thomma, B.P. et al, 1998. Separate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. ProcNatl Acad Sci USA, 95(25): 15107-11.

223. Thomma, B.P., Eggermont, K, Tierens, K.F. and Broekaert, W.F., 1999. Requirement of functional ethylene-insensitive 2 gene for efficient resistance of Arabidopsis to infection by Botrytis cinerea. Plant Physiol, 121(4): 1093-102.

224. Thomma, B.P.FI.J, Cammue, B.P.A. and Thevissen, K, 2003. Mode of Action of Plant Defensins Suggests Therapeutic Potential. Current Drug Targets Infectious Disorsers, 3(1): 1-8.

225. Tierens, K.F. et al, 2002. Esal, an Arabidopsis mutant with enhanced susceptibility to a range of necrotrophic fungal pathogens, shows a distorted induction of defense responses by reactive oxygen generating compounds. Plant J, 29(2): 131-40.

226. Tossi, A. and Sandri, L., 2002. Molecular diversity in gene-encoded, cationic antimicrobial polypeptides. Curr Pharm Des, 8(9): 743-61.

227. Tsuboi, S., Osafune, T., Tsugeki, R., Nishimura, M. and Yamada, M., 1992. Nonspecific Lipid Transfer Protein in Castor Bean Cotyledon Cells: Subcellular Localization and a Possible Role in Lipid Metabolism. Journal of Biochemistry, 111(4): 500-508.

228. Utkina, L.L. et al., 2010. Heterologous expression of a synthetic gene encoding a novel hevein-type antimicrobial peptide of Leymus arenarius in Escherichia coli cells. Russian Journal of Genetics, 46(12): 1449-1454.

229. Van Damme, E.J., Barre, A., Rouge, P. and Peumans, W.J., 2004. Potato lectin: an updated model of a unique chimeric plant protein. Plant J, 37(1): 34-45.

230. Van Damme, E.J. et al., 1999. A gene encoding a hevein-like protein from elderberry fruits is homologous to PR-4 and class V chitinase genes. Plant Physiol, 119(4): 1547-56.

231. Van den Bergh, K.P. et al., 2002. Five disulfide bridges stabilize a hevein-type antimicrobial peptide from the bark of spindle tree (Euonymus europaeus L.). FEBS Lett, 530(1-3): 181-5.

232. Waljuno K, RA, S., Beintema J, Mariono A and AM, H., 1975. Amino acid sequence of hevein, Rubber Research Institute of Malaysia, Kuala Lumpur.

233. Walton, J.D., 1994. Deconstructing the Cell Wall. Plant Physiol, 104(4): 1113-1118.

234. Walujono, K., Scholma, R., Beintema, J., Mariono, A. and Hahn., 1975. Amino acid sequence of hevein, Proceedings of the international rubber conference, Rubber research institute of Malaysia, Kuala Lumpur, Malaysia, pp. 518-531.

235. Washida, H. et al., 1999. Identification of cis-regulatory elements required for endosperm expression of the rice storage protein glutelin gene GluB-1. Plant Mol Biol, 40(1): 1-12.

236. Wijaya, R., Neumann, G.M., Condron, R., Hughes, A.B. and Polya, G.M., 2000. Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin. Plant Sci, 159(2): 243-255.

237. Wise, A.A., Liu, Z. and Binns, A.N., 2006. Three methods for the introduction of foreign DNA into Agrobacterium. Methods Mol Biol, 343: 43-53.

238. Wu, C.Y., Suzuki, A., Washida, H. and Takaiwa, F., 1998. The GCN4 motif in a rice glutelin gene is essential for endosperm-specific gene expression and is activated by Opaque-2 in transgenic rice plants. Plant J, 14(6): 673-83.

239. Xiao, K., Zhang, C., Harrison, M. and Wang, Z.-Y., 2005. Isolation and characterization of a novel plant promoter that directs strong constitutive expression of transgenes in plants. Molecular Breeding, 15(2): 221-231.

240. Xie, Y., Liu, Y., Meng, M., Chen, L. and Zhu, Z., 2003. Isolation and identification of a super strong plant promoter from cotton leaf curl Multan virus. Plant Mol Biol, 53(1-2): 1-14.

241. Yamada, S. et al., 1997. Expression of Plasma Membrane Water Channel Genes under Water Stress in Nicotiana excelsior. Plant and Cell Physiology, 38(11): 1226-1231.

242. Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K., 1993. Arabidopsis DNA encoding two desiccation-responsive rd29 genes. Plant Physiol, 101(3): 1119-20.

243. Yang, D., Biragyn, A., Hoover, D.M., Lubkowski, J. and Oppenheim, J.J., 2004. Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in host defense. Annu Rev Immunol, 22: 181-215.

244. Yang, D., Biragyn, A., Kwak, L.W. and Oppenheim, J.J., 2002. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends Immunol, 23(6): 291-6.

245. Yount, N.Y. et al., 1995. Rat neutrophil defensins. Precursor structures and expression during neutrophilic myelopoiesis. J Immunol, 155(9): 4476-84.

246. Zasloff, M., 2002. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature, 415(6870): 389

247. Zhang, Y. and Lewis, K., 1997. Fabatins: new antimicrobial plant peptides. FEMS Microbiol Lett, 149(1): 59-64.95.

Информация о работе

Шукуров, Рахим Рахманкулыевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Антимикробные пептиды сорного растения Stellaria media и их гены - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы