Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антимикробные и иммуномодулирующие свойства комплексных экстрактов из трепанга японского - Stichopus japonicus Selenka

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антимикробные и иммуномодулирующие свойства комплексных экстрактов из трепанга японского - Stichopus japonicus Selenka"

На правах рукописи

> Е =Д!"1 Г: 7

Любавская Татьяна Яковлевна

АНТИМИКРОБНЫЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСНЫХ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ТРЕПАНГА ЯПОНСКОГО -Б^сЖорш]аротсиз 8е1епка.

03.00.07 — микробиология

14.00.36 — аллергология, иммунология.

Авторефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток — 1996 год

Диссертация выполнена во Владивостокском Государственном медицинском Университете РФ на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии.

Научный руководитель: Мотавкина Н.С. - член-корр. РАЕН и МСА, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор.

Научный консультант: Каленик Т.К. - кандидат биологических наук.

Официальные оппоненты:

Тимченко Н.Ф. - доктор медицинских наук, профессор;

Потапов В.Н. - кандидат медицинских наук.

Ведущее учреждение:

Московская медицинская Академия им. И.М. Сеченова.

Защита состоится 1997 года, на заседании Диссертаци-

онного Совета К.084.24.01 во Владивостокском Государственном медицинском Университете (адрес: 690600, Владивосток, пр. Острякова, 2, главный корпус).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского Университета (адрес тот же, корпус 3).

Автореферат разослан ¿¿¿eyisnQ года

Ученый секретарь Диссертационного Совета -

кандидат медицинских наук, доцент: /Диго Р.Н./

Общая характеристика работы.

Актуальность темы: Экономические трудности в период кризисов в стране значительно влияют на лекарственное обеспечение населения. Дефицит лекарственных препаратов и их высокая стоимость настоятельно требуют, с одной стороны, поиска новых доступных источников лечебно-профилактических средств, с другой, - совмещения их терапевтической активности с пищевыми свойствами в качестве добавок.

Среди потенциальных источников таких препаратов наше внимание привлек трепанг японский - Stichopus japonicus Selenka, широко распространенный в Дальневосточном регионе, являющийся весьма прибыльным объектом морского промысла и издавна пользующийся огромной популярностью у населения Азиатско-Тихоокеанского региона, особенно в Японии. Он используется не только как деликатесный продукт в гастрономических целях, но и как стимулятор жизненных сил организма человека. Поэтому неслучайно трепанг был образно назван "морским женьшенем".

Однако, будучи довольно хорошо изученным по содержанию химически дифференцированных, как правило, очищенных веществ и их биологическому действию, например, в отношении содержащихся в нем (Еляков Г.В. с соавт., 1968; Еляков Г.В., Стоник В.А., 1986 и др.) и его микрофлоре (Шульгина Л.В., Мотавкина Н.С., Сыч Г.С., 1984) гликозидов, трепанг японский оказался неоправданно обойденным в нативном и полунативном состоянии. Неисследованными оказались простейшие комплексные экстракты из этого морского животного. Это и определило цель и задачи наших научных поисков.

Цель настоящей работы заключалась в получении комплексных экстрактов из трепанга японского и оценке механизмов их действия на микробы, инфекционный процесс и защитные силы макроорганизма.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие конкретные задачи:

1. Приготовление комплексных экстрактов из трепанга японского - химического (водно-этанольная вытяжка) и термического (выварочные воды), проверка их токсичности.

2. Изучение антимикробного действия комплексных экстрактов из трепанга японского на микроорганизмы разных таксономических групп - бактерии, гри-

бы, вирусы.

3. Проверка биостимулирукяцего влияния комплексных термических и химических экстрактов из трепанга японского на факторы общей неспецифй-ческой реактивности в эксперименте при естественном вскармливании ими животных в виде пищевых добавок и введении парентеральным путем:

• на клеточно-фагоцитарную защиту организма мышей от инфекции и ее качественно-количественную характеристику;

• на гуморальные неспецифические факторы резистентности организма подопытных животных к инфекции (лизоцим, бета-лизины, комплемент).

4. Исследование особенностей действия комплексных экстрактов из трепанга японского на факторы специфического прививочного иммунитета у мышей (клеточность, число антитело- и розеткообразующих клеток селезенки, уровень специфических антител - гемагглютининов).

5. Выяснение влияния комплексных экстрактов из трепанга японского на развитие аллергии - гиперчувствительность немедленного типа у морских свинок и гиперчувствительность замедленного типа у мышей.

6. Проследить влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на процесс элиминации патогенных микроорганизмов и выживаемости животных при экспериментальной сальмонеллезной инфекции у мышей.

Научная новизна и теоретическая ценность работы заключалась в сути комплексно проведенных экспериментов.

Впервые выявлены и оценены механизмы исцеляющего действия комплексных экстрактов из трепанга как биостимулятора жизнестойкости макроорганизма при инфекционном процессе.

Впервые установлена возможность энтеральной стимуляции разнообразных защитных сил организма - клеточных и гуморальных, естественных неспецифических и искусственных специфических в ходе иммунизации.

Впервые экспериментально доказаны перспективы использования трепанга японского как пищевых добавок биостимулирующего назначения при инфекционном процессе.

Впервые дана комплексная характеристика антимикробного действия термических и химических экстрактов из трепанга японского по отношению к разным группам микроорганизмов и показана их эффективность в условиях пря-

мого контакта возбудителей сальмонеллеза с макроорганизмом за счет его очищения от инфекции.

Впервые установлено тормозящее действие комплексных экстрактов из трепанга японского на гиперчувствительность немедленного типа и стимулирующее - на гиперчувствительность замедленного типа в процессе развития аллергии.

Практическая значимость настоящей работы определяется научной новизной полученных результатов и решением ряда задач прикладного значения:

• доказательством всестороннего влияния комплексных экстрактов из трепанга японского на разные механизмы защитной реактивности макроорганизма, что определяет разнообразие показаний для их практического применения;

• установлением простоты биостимуляции защитных сил организма через энтеральные пути введения комплексных экстрактов из трепанга японского и перспективы их использования как пищевых добавок;

• доказательством избирательности антимикробного эффекта экстрактов и преимущественного действия в отношении определенных видов кишечной группы, что определяет возможность и целесообразность их применения в лечебно-профилактических целях без нарушения гомеостатического равновесия между- нормальными обитателями кишечника и без формирования дисбакгери-оза;

• обнаружением широкого диапазона антимикробного действия комплексных экстрактов из трепанга японского в отношении разных таксономических групп, что определяет целесообразность их употребления в качестве лечебно-профилактических добавок при диетическом питании инфекционных больных;

• немаловажное значение имеет и возможность организации безотходного производства переработки трепанга. Совокупность элементов научной новизны полученных наблюдений и их практической ценности может обеспечить в этом направлении ощутимый медико-социальный и экономический эффект.

Апробация материалов диссертации проведена в ряде докладов и опубликованных сообщений на региональных конференциях молодых ученых (Владивосток, 1995, 1996, 1997), ХП1 республиканской конференции с международным участием по проблеме "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 199 ).

Они отражены в пяти публикациях и двух работах, отосланных на депонирование в ВИНИТИ. Кроме того, полученные достижения защищены тремя авторскими удостоверениями на рационализаторские предложения (Удостов. БРИЗ ВГМУ № 2279, № 2280 от 09.01.97 г., № 2285 от 13 .01.97 г.) и 1 заявкой на изобретение. Обзорные материалы по литературе внедрены в учебный процесс кафедр микробиологии, вирусологии, иммунологии Владивостокского и Дальневосточного (г. Хабаровск) Государственных медицинских Университетов, Благовещенской и Читинской медицинских Академий Российской Федерации.

Структура диссертации традиционна. Она состоит из введения, 1 главы обзора литературы с привлечением 297 источников (220-отечественных, 77-иностранных), 7 глав собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций для внедрения результатов работы в науку и практику, указателя литературы.

Текст диссертационной работы изложен на 234 страницах машинописи, проиллюстрирован 35 таблицами, 9 рисунками, 4 рабочими схемами, 2 приложениями.

Положения, выносимые на защиту

1. Комплексные экстракты (водно-этанольный и термический - выварочные воды) из трепанга японского обладают широким диапазоном антимикробной активности, лишая жизнеспособности различные виды грибов, вирусов и некоторые виды бактерий, принадлежащие к разным таксономическим группам. Избирательность антимикробного эффекта исключает их использование для создания питательных сред узкого целевого назначения, но определяет возможность их широкого применения.

2. Комплексные экстракты из трепанга японского при энтеральном и парентеральном использовании на мышах вызывают антимикробный эффект, стимуляцию неспецифических клеточных (фагоцитоз) и гуморальных (лизоцим, комплемент, бета-лизины) факторов резистентности к инфекции, специфические иммунологические сдвиги, обеспечивая на модели экспериментального сальмонеллеза Salm, typhimurium у мышей их выживаемость и элиминацию возбудителей из организма.

3. Комплексные химические и термические экстракты ю трепанга япон-

ского в условиях иммунного ответа у мышей усиливают накопление и дифференциацию иммунокомпетентных клеток в селезенке, стимулируют созревание антитело- и розеткообразующих клеток, ускоряют синтез специфических антител. Они обладают ингибирующим действием по отношению к развитию аллергии немедленного типа и умеренно стимулируют замедленный гиперергический эффект, что особенно важно при инфекционном процессе.

4. Совокупность антимикробных функций комплексных экстрактов из трепанга японского с их биостимулирующим действием и иммунокоррегирующим эффектом может быть применена для обогащения диетического питания и лечебно-профилактических целей по отношению к больным с инфекционной патологией, не вызывая угнетения нормальной кишечной микрофлоры.

Содержание диссертации, результаты и их обсуждение.

1. Направления, материал и методы исследования.

Направления проведенных исследований были определены поставленными задачами. Они включали получение комплексных химических и термических экстрактов из трепанга японского и их биотестирование по разным параметрам: контроль антимикробного эффекта в отношении разных таксономических групп микроорганизмов, изучение влияния на клеточно-гуморальные факторы неспецифической резистентности подопытных животных к инфекции, исследование воздействия на клеточно-гуморальные механизмы специфического прививочного иммунитета, на развитие аллергии немедленного и замедленного типов, проверку интеграции всех названных параметров на модели экспериментального сальмонеллеза у мышей с проведением визуального наблюдения за животными, микроскопического и бактериологического контроля за скоростью и динамикой освобождения организма от возбудителя - Salm, typhimurium. Все направления научного поиска проведены как в условиях, приближенных к естественному употреблению'трепанга японского, так и при введении комплексных экстрактов из этого вида морского гидробионта парентеральным способом.

В тестировании биологического эффекта при применении комплексных экстрактов из изучаемого вида голотурий участвовали млекопитающие разных видов (346 мышей, 15 морских свинок), 11 видов бактерий, 7 видов грибов, 8 вариантов вирусов (4 вида вирусных вакцин, 2 вида вирусных диагностикумов,

2 вида бактериофагов). При этом было использовано 8 микробиологических методов, 3 варианта вирусологических способов (титрование бактериофага и ! РГА), 8 способов оценки показателей естественной защиты макроорганизма от инфекции (биологический эксперимент, фагоцитоз - по 5 параметрам; титры лизоцима, комплемента, бета-лизинов - по 2 способам), 4 иммунологических (клеточность, АОК, И - РОК селезенки, титр гемагглютининов) и 2 аллерголо-гических метода. Направления, материал, методы исследования и объем выполненной работы'суммированы в табл. 1 (приложение).

Выход биологического субстрата при получении комплексных экстрактов из трепанга японского и их химический состав был неодинаков.

Выварочные воды, содержащие значительное количество балластных примесей, на каждые 100 мл дали выход 2,275 г%. Водно-этанольный очищенный экстракт обнаружил выход биологически активных веществ вдвое меньше - всего 1,124 г%. В этой связи удельный вес различных основных компонентов оказался в обратной пропорции с явным превосходством показателей в водно-этанольном экстракте. В нем было в 3,1 раза больше белка, в 13,6 раза - нуклеиновых кислот, в 22,3 раза - моносахаров, в 2,0 раза - липидов.

Выявленные различия в концентрации компонентов между химическим и термическим экстрактами нашли отражение и в разных аспектах их биологической активности.

2. Антимикробное (иротивобактериальное, антимикотическое) действие комплексных экстрактов из трепанга японского.

2.1 Противобактериальная активность экстрактов.

Противобактериальные свойства водно-этанольного и термического (выварочные воды) экстрактов исследованы нами на 11 видах бактерий, в том числе грамположительных кокках (Staph, aureus 209 Р, Str. pyogenes; Str. faecalis; Str. lysodeikticus) и на серии грамотрицательных энтеробактерий кишечной группы (Е. coli КК-12, Sh. flexneri, Sh. sonnei, Pr. vulgaris, Salm, typhimurium, Ps. aeruginosa), бациллах - Вас. subtilis. Однако, результаты полученных наблюдений оказались неоднозначными.

Шигеллы, эшерихии, протей, стафилококки, стрептококки, бациллы не обнаружили чувствительности ни к одному из испытанных экстрактов. В то же время весьма распространенные в окружающей среде и часто являющиеся воз-

будителями госпитальных инфекций Salm, typhimuríum и Ps. aeruginosa погибали или приостанавливались в своем развитии в присутствии экстрактов из трепанга японского, особенно - водно-этанольной вытяжки. Последняя оказывала бактериостатический и бактерицидный эффект уже в дозе 5,0 мг/мл, но более существенно - в дозах 7,5 и 10,0 мг/мл. Значительно ниже оказалось действие выварочных вод.

2.2. Антимикотическое действие комплексных экстрактов из трепанга японского было испытано на 7 видах грибов: Aspergillus oryzae, Pinicillium chrysogenum, Conichaeta pulveracea, Dendryphiella salina, Candida albicans, Alternaría radicina, Sclerotinia sclerotiorum.

Исследования показали практически универсальное антимикотическое действие комплексных экстрактов из трепанга японского. Так, при изучении водно-этанольной вытяжки в дозах от 0,05 мг/мл до 10,0 мг/мл (6 вариантов) не обнаружено ни одного отрицательного результата в отношении большинства вышеперечисленных штаммов грибов, кроме устойчивых к ним фитопатоген-ных видов - Alternaría radicina, Sclerotinia sclerotiorum.

Довольно высокая антимикотическая активность отмечена и у термического экстракта (выварочные воды), хотя она была и несколько ниже показателей в чдно-этанольного экстракта в отношении кандид и более эффективна - против дендрифиелл.

В целом антимикробная (антибактериальная, фунгицидная) активность экстрактов обнаружила зависимость от свежести, сроков и условий хранения сырья. Дефростированое сырье, использованное для приготовления экстрактов, было менее результативным.

3. Противовирусная активность комплексных экстрактов из трепанга японского.

3.1. Противовирусная активность комплексных экстрактов в отношении патогенных видов вирусов была исследована на аттенуированных штаммах вируса гриппа А и В, полиомиелита I, II, III серотипов, инактивированных штаммах вируса гриппа А и В, вакцинном штамме вируса клещевого энцефалита, двух диагностикумах гриппозных вирусов А и В.

Испытание противовирусной активности комплексных экстрактов из трепанга японского проводилось на модели реакции гемагглютинации (РГА) на

основе взаимодействия с эритроцитами гемагглютинирующих рецепторов вирусов и исчезновения этой способности под влиянием биологически активных веществ экстрактов из трепанга.

Результаты проведенных исследований показали, что использованные нами дозы водно-этанольного экстракта, взятые в диапазоне от 10,0 мг/мл до 0,05 мг/мл, обнаружили неодинаковое действие. Большие дозы в 10,0 и 5,0 мг/мл оказались неприемлемыми для оценки противовирусного эффекта, так как ге-молизировали эритроциты. Поэтому все основные испытания были проведены с дозами 1,0 мг/мл; 0,5 мг/мл; 0,1 мг/мл и 0,05 мг/мл. При этом доза в 1,0 мг/мл обнаружила стойкий инактивирующий эффект, полностью исключив РГА. Остальные дозы экстракта лишь уменьшали титр и интенсивность реакции.

При этом более чувствительными к гемагглютининам после обработки их водно-этанольным экстрактом оказались отмытые от фиксатора эритроциты барана.

Противовирусный эффект при обработке вирусных препаратов водно-этанольным экстрактом практически не зависел от вида вируса и хорошо проявлялся в потере их гемагглютинирующих свойств. Выварочные воды обладали подобной, но меньшей активностью.

3.2. Противовирусное действие комплексных экстрактов на вирусы бактерий - бактериофаги.

Если в первой части исследований противовирусный эффект при использовании экстрактов основывался на потере гемагглютинирующей активности вирусов в результате их воздействия на рецепторый аппарат, то во второй части предполагалось подавление экстрактами не только рецепторов, но и репродуктивной способности вирусов. С этой целью в качестве модели были использованы моноваленгаый стафилококковый бактериофаг и 2 компонента (стафилококковый и протейный) поливалентного пиофага, а также соответствующие им индикаторные культуры - Staph, aureus 209 Р и Pr. vulgaris. Оба вида тест-бактерий, как уже говорилось, не чувствительны к прямому действию экстрактов.

Обработка бактериофагов экстрактами из трепанга японского вне зависимости от способа их приготовления и состава обнаружила хороший противовирусный эффект, значительно снижая лизирующее действие бактериофагов на

тест-культуры, их титр. При этом водно-этанольный экстракт из трепанга японского оказался более активным по сравнению с выварочными водами из тех же морских гидробионтов.

4. Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на клеточ-но-гуморальные факторы неспецифической резистентности организма к инфекции.

Исследования проведены на 70 белых мышах, которые внутрибрюшинно получали различные дозы водно-этанольного экстракта - 25,0 мг/мышь, 2,5 мг/мышь и 0,25 мг/мышь в объеме 0,2 мл.

Контрольной группе вводили в том же объеме физиологический раствор. Выварочные воды животные получали энтеральным путем без дозировки с учетом примерно равной потребности в них мышей близкого веса и возраста.

В качестве показателей неспецифической резистентности к инфекции исследованы фагоцитоз и гуморальные факторы - лизоцим, комплемент, бета - ли-зины.

При изучении влияния экстрактов на обеспеченность организма мышей ли-зоцимом установлено, что максимальный стимулирующий эффект водно-этанольного экстракта в отношении тест - культуры М. ^БоёегкйсиБ был обнаружен в дозе 25,0 мг/мышь (зона лизиса 21,25+0,21 мм), самый низкий - при дозе 0,25 мг/мышь (зона лизиса 16,75+2,0 мм). Аналогичные результаты получены при использовании выварочных вод. В контроле размер зоны лизиса составил всего 14,25±0,75 мм. Однако, статистическая значимость различий в эффекте имела место лишь при применении максимальной и средней доз водно-этанольного экстракта. В переводе на количественное содержание лизоцима, рассчитанное по количественной кривой О.В. Бухарина с соавт. (1972), оно повышается с 54,8 мкг/мл до 81,7 мкг/мл при дозе экстракта в 25,0 мг/мл (р<0,01) и до 69,2 мкг/мл - при дозе 2,5 мг/мл (р<0,01).

Изучение стимулирующего влияния водно-этанольного экстракта и выварочных вод на титр комплемента в сыворотках крови подопытных животных показало также существенный прирост его величины у получавших экстракт в большой и средней дозах - 25,0 и 5,0 мг/мышь соответственно. При этом титр комплемента увеличивался с 33,5% в контроле до 53,1% и 50,6% соответственно в опытных группах (р<0,01). Зона гемолиза в индикаторной гемо-системе

возрастала с 8,0+0,75 мм до 12,7±1,25 мм и 12,1±1,25 мм соответственно.

Выварочные воды по своему эффекту в отношении стимуляции уровня комплемента явно отставали, обеспечив его титр лишь в 44,5% (зона лизиса 10,6+2,0 мм), но это было несколько больше полученного при применении минимальной дозы (0,25 мг/мышь) водно-этанольного экстракта (титр 41,8%).

Иные результаты были отмечены в уровне бета-лизинов. Как оказалось, ни водно-этанольный, ни термический (выварочные воды) экстракты из трепанга японского не обнаружили выраженного влияния на уровень этого важного фактора защиты. Только максимальная доза (25,0 мг/мышь) водно-этанольного экстракта дала незначительные сдвиги в уровне бета-лизинов (всего на 4,04% против контроля).

При рассмотрении и оценке этого показателя необходимо учесть не только противоинфекционное назначение бета-лизинов в организме, но и то, что этот фактор относится к числу гормоноподобных веществ, и ему приписываются функции гормона стресса. В этом качестве в условиях эксперимента, когда возникает стрессовая ситуация для животных, следовало ожидать усиленного выброса бета-лизинов в кровоток. Однако, этого не случилось, и уровень их остался близким к норме. Это позволяет высказать предположение о возможном антистрессовом влиянии экстрактов из трепанга японского. При исследовании влияния экстрактов на состояние клеточно-фагоцитарной защиты организма мышей удалось установить четкие биостимулирующие свойства у водно-этанольной вытяжки и незначительные - у выварочных вод (табл. 2).

Водно-этанольный экстракт во всех испытанных дозах статистически значимо стимулировал фагоцитарный показатель Гамбургера, в большой и средней дозах - спонтанный и активированный НСТ-тест, фагоцитарный резерв, но недостоверно в связи с большим разбросом показателей - фагоцитарное число Райта.

Выварочные воды обнаружили эффект, подобный малым дозам водно-этанольного экстракта.

Таблица 2.

Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на фагоцитарную реакцию нейтрофилов.

Статистические показатели Показатели фагоцитоза

Контроль (0,85% физ р-р) Дозы БАВ водно-этанольного экстракта в мг/мышь Выварочные воды рег ов

25,0 2,5 0,25

Индекс Гамбургера (ФП)

М 51,6+0,95 83,2+1,58 80,8±3,48 64,8+0,35 56,4+5,3

Р <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01

Коэффициент стимуляции >1,6 >1,5 >1,2 >1,08

Индекс Райта (ФЧ)

М 4,8+0,32 8,2±3,16 8,2±2,45 6,0±1,26 5,2±0,32

Р <0,01 <0,05 <0,05 <0,01 <0,01

Коэффициент стимуляции >1,5 >1,5 >1,2 >1,08

Спонтанный НСТ - тест

М 5,8+0,32 6,4±0,32 6,2±0,35 6,2±1,2 6 4,8+0,63

Р <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01

Стимулированный НСТ - тест

М 25,2±6,01 40,4±8,36 39,0+6,01 28,8±0,95 25,2+1,58

Р <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01

Фагоцитарный резерв 4,3 6,3 6,2 4,6 5,25

Коэффициент стимуляции > в 1,6 > в 1,5 > в 1,06 > в 1,2

5. Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на формирование специфического прививочного иммунитета.

С целью получения возможности для суждения не только о количественных, но и качественных (функциональных) сдвигах в иммунокомпетентной системе организма, мы сочли необходимым воспользоваться традиционной моделью специфического прививочного иммунитета с применением в качестве антигена эритроцитов барана.

Подопытные нелинейные мыши в количестве 64 штук были подразделены на 8 подгрупп: 7 опытных и 1 контрольная. 6 подгрупп мышей по 8 в каждой получали водно-этанольный экстракт в объеме 0,2 мл в дозах 25,0 мг/мышь, 2,5 мг/мышь, 0,25 мг/мышь, но в разное время - одна группа за 1 сутки до начала иммунизации (индуктивная фаза), другая - на 3-й сутки после ее начала (продуктивная фаза). 7—группа получала 1 месяц рег оз выварочные воды, 8— - контрольная, физиологический раствор. Иммунизацию проводили внутри-брюшинным введением взвеси эритроцитов барана в концентрации 4х108 кл/мл в объеме 0,5 мл (2х108 кл).

Главным объектом для изучения иммунологических сдвигов служила селезенка, которую извлекали у мышей, забиваемых дислокацией позвонков в шейном отделе позвоночника. В ней определяли вес, обеспеченность спленоцитами, число антителообразующих клеток (АОК), количество клеток, образующих иммунные розетки (И-РОК) с учетом экспрессии гемагглютинирующих рецепторов, и в сыворотке крови - титр гемагглютининов. Результаты исследований суммированы по основным параметрам в табл. 3, 4. Изучение влияния комплексных экстрактов из трепанга японского на эффективность иммунного огве-та показало статистически достоверный рост общей клеточности селезенки, числа антителообразующих клеток и количества клеток, образующих иммунные розетки (табл. 3), титра антител-гемагглютининов (табл. 4). На 7 сутки от начала иммунизации у мышей, получивших водно-этанольный экстракт в дозе 2,5 мг/мышь, уровень гемагглютининов вырос с 1о§2 (4,5 ± 0,58) - вконтроле до 1°ё2 (7,1 ± 0,53) - в опыте, а на 14 день - до \о%г (7,8 ± 0,80). При этом коэффициент стимуляции антителогенеза стал равным 1,6 и 1,7 соответственно. Выварочные воды также обеспечили нарастание гемагглютининов, но достоверно незначимое. Коэффициент стимуляции составил всего 1,1 и 1,2 соответственно.

Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на количество иммунных аитигенсвязывающих клеток селезенки

белых мышей

Доза БАВ мг/мышь Общее число И-РОК в% В том числе по типам

И-РОК I типа И-РОК II типа И-РОК Ш типа И-РОК IV типа

м m Р м ±ш P М ±ш P М ±ш P м ±ш Р

Контроль 51,7 0,85 <0,01 83,4 2,83 <0,01 12,0 3,08 <0,01 6,5 1,54 <0,01 2Л 0,57 <0,05

25 81,05 0,42 <0,01 613 7,8 <0,01 24,58 2,19 <0,01 439 1,17 <0,05 6,95 134 <0,01

2,5 74,03 1,98 <0,01 72,9 0,21 <0,01 20,01 1,94 <0,01 4,9 03 <0,05 3,4 03 <0,05

0,25 65Д) 1,45 <0,01 72,7 3,54 <0,01 21,53 3,18 <0,01 2,5 138 <0,05 3,4 0,3 <0,05

Выпароч-ные воды 59,58 12,27 <0,01 73,7 2,12 <0,01 1338 0,14 <0,01 6,25 2,86 <0,05 3,1 139 <0,05

Примечание: И-РОК I типа - с 3 эритроцитами барана; И-РОК И типа- с 4 - 6 эритроцитами в "розетке"; И-РОК III типа - спленоциты с 7 - 10 эритроцитами в розетке; IV - тип клеток с 11 и более эритроцитами барана.

Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на синтез и секрецию антител - гемагглютининов против

эритроцитов барана.

Доза БАВ мг/мышь Титр гемагглютининов (ГА) через 7 и 14 суток после иммунизации

Индуктивная фаза (7 суток) Продуктивная фаза (14 суток)

М ±ш PI Р2 к М ±ш PI PZ к

Контроль 4,5 ±0,58 <0,01 - 5,0 ±0,53 <0,05 -

25,0 7,1 ±0,53 <0,01 <0,01 1,6 7,8 ±0,80 <0,05 <0,02 1,7

2,5 6,1 ±0,53 <0,01 <0,05 1,4 6,6 ±0,75 <0,05 <0,05 1,5

0,25 5,0 ±0,63 <0,01 >0,05 1,1 5,8 ±0,53 <0,05 >0,05 1,16

Выварочные воды per os 4,8 ±0,29 <0,01 >0,05 1,06 5,4 ±0,32 <0,05 >0,05 1,08

Примечание: К - коэффициент стимуляции ГА; р! - достоверность показателей в подгруппе; р2 - достоверность различий с контролем.

7. Влияние комплексных экстрактов га трепанга японского на процессы аллергии.

Одним из важных вопросов, исследованных нами, была проверка влияния комплексных экстрактов на развитие аллергии - гиперчувствительности немедленного и замедленного типов (ГЧНТ и ГЧЗТ). Исследования проводили на разных видах животных.

ГЧНТ изучена на 15 морских свинках в ходе сенсибилизации их 0,1 мл нормальной лошадиной сыворотки с применением ее же как аллергена в качестве разрешающей дозы. Одновременно с инъекцией сенсибилизирующей дозы животные получали в объеме 0,2 мл разные дозы водно-этанольного экстракта (25,0 мг/особь; 2,5 мг/особь; 0,25 мг/особь), 3 морские свинки получали выварочные воды per os в течение 1 месяца до сенсибилизации, 3 животных -инъекции физиологического раствора в том же объеме (контроль).

Все животные на 14 день получали инъекции 0,1 мл нормальной лошадиной сыворотки (разрешающая доза).

Наблюдение за ними начинали сразу, отмечая особенности поведения, состояние здоровья, жизнеспособность, смерть. Интенсивность различных проявлений, согласно методике, оценивали по 4-плюсовой системе, а их совокупность - в баллах.

Исследованиями установлено, что в контрольной группе морских свинок имело место развитие яркой клиники анафилаксии или гиперчувствительности немедленного типа (ГЧНТ) с последующей гибелью животных. В опытных группах, получавших экстракты из трепанга, отмечено четкое, но неодинаковое снижение проявлений анафилактической реакции. Причем, ближе всего к контрольной группе оказались животные, которым были даны выварочные воды. У двух из них отмечена выраженная картина анафилактического шока (4 +), у одного - реакция на 3 + со спастическим кашлем, прострацией животных, непроизвольными актами мочеиспускания и дефекации. Однако, все 3 особи данной подопытной группы выжили. Их состояние оценено в 3,6 балла при 4,0 в контроле. Эти наблюдения свидетельствуют о некотором защитном значении выварочных вод в отношении развития ГЧНТ в виде анафилактического шока.

В группах животных, получавших одномоментно с сенсибилизирующей позой аллергена БАБ водно-этанольного экстракта в различных дозах, проявле-

ния анафилактической реакции были единичны, слабо выражены и гибели морских свинок не наступало. Их состояние при дозе 25,0 мг/особь оценено в 1,5 балла, при дозе 2,5 мг/особь - 2,3 балла, при дозе 0,25 мг/особь - в 3,3 балла.

7.2. Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на гиперчувствительность замедленного типа (ТЧЗТ).

При изучении ГЧЗТ использовали 2 0 беспородных белых мышей, которые были разделены на 5 групп по 4 особи в каждой. Мышей опытных групп иммунизировали 0,5 мл взвеси эритроцитов барана в дозе 2 х 108, контрольные -получали тот же объем физиологического раствора.

За 1 сутки до введения разрешающей дозы всем подопытным животным внутрибрюшинно вводили комплексные водно-этанольные экстракты в объеме 0,25 мл в дозах 25,0 мг/мышь, 2,5 мг/мышь, 0,25 мг/мышь. Контрольной группе инъецировали в том же объеме, тем же способом физиологический раствор. Одна подопытная группа получала в течение 1 месяца выварочные воды per os.

На 5 сутки после инъекции эритроцитов всем животным в подушечку задней лапки вводили разрешающую дозу аллергена - эритроциты барана 1х108 в объеме 0,025 мл физиологического раствора.

Через 24 часа всех животных умерщвляли эфиром, обе задние лапки ниже сочленения стопы и большеберцовой кости отрезали, осторожно обсушивали фильтровальной бумагой, взвешивали, после чего определяли индекс реакции (ИР) по формуле:

ИР = Р о-Рк

Рк , где Ро и Рк - вес опытной и контлатеральной лапок.

Проведенные исследования показали, что инъекция экстрактов через 4 суток после введения сенсибилизирующей дозы антигена (за 1 сутки до разрешающей дозы) не только не тормозит, а, напротив, увеличивает реакции ГЧЗТ во всех опытных группах, но их интенсивность зависела от дозы испытуемых БАВ экстрактов. При введении животным максимальной дозы (25,0 мг/мышь) водно-этанольного экстракта ИР составил 16,5±1,2%, а его увеличение по сравнению с контрольной группой было выше на 6,57%.

В группе животных, получавших дозы БАВ в 2,5 и 0,25 мг/мышь, показатели ИР составили соответственно 15,35±1,73% и 11,0±1,03%, а разница с контро-

лем - 5,42 и 1,10%. В группе животных, получавших выварочные воды из трепанга per os, ИР оказался выше контроля на 2,15%, то есть по эффекту он приближался к группе с минимальной дозой водно-этанольного экстракта, но оказался все же вдвое больше.

Полученные наблюдения, очевидно, связаны со стимулирующим действием экстрактов из трепанга японского на зрелые Т-эффекторы, усиленным синтезом и выбросом так называемых "медиаторов воспаления".

Усиление ГЧЗТ, отмеченное нами под влиянием экстрактов, по мнению Н.В. Медуницына (1983), имеет важное значение в противоинфекционном, трансплантационном и противоопухолевом иммунитете. У больных с онкопато-логией, в частности, введение различных медиаторов, высвобождаемых при ГЧЗТ, предотвращает появление метастазов. К сожалению, арсенал таких веществ крайне мал. В этой связи, полученные нами наблюдения имеют важное научно-практическое значение.

Таким образом, экстракты из трепанга японского обнаружили весьма полезные качества: они, в зависимости от доз, смягчают или исключают развитие ГЧНТ и, напротив, - умеренно стимулируют ГЧЗТ.

8. Проверка токсичности как предпосылка к лечебно-профилактическому применению экстрактов.

Одним из обязательных качеств различных препаратов, рекомендуемых для лечебно-профилактических целей, является их полезность для организма. Об этих свойствах экстрактов говорилось выше.

Другим непременным требованием к таким препаратам служит отсутствие вредного влияния на организм, в частности, токсичности.

И, наконец, окончательная оценка экстрактов может быть проведена при определении ХТИ или химиотерапического индекса, рассчитываемого по соотношению минимальной полезной дозы (Dosis minima curativa) и максимальной переносим ой, не. дающей никаких неблагоприятных воздействий (Dosis maxima tolerata). Последняя должна быть выше первой не менее как вдвое.

Для оценки токсичности экстрактов из трепанга японского нами был разработан комплексный способ, сочетающий в себе определение токсичности на разных уровнях: in vivo на животных с учетом рекомендаций Б.Н. Орлова с со-авт. (1985), расчетом LD50 - по Керберу и определение гематоксичности на эри-

троцитах in vitro no Bernliemer A.W. с соавт. (1984) с расчетом LD50 в НЕ/мл.

Токсичность экстрактов in vivo проверена на 85 мышах в остром (20 - минутном) и отстроченном суточном эксперименте с внутрибрюшинным применением водно-этанольного экстракта в объеме 0,2 мл и дозах 0,1; 0,5; 1,0; 10,0; 25,0; 50,0; 75,0 и 100 мг/мышь. Выварочные воды были использованы в том же объеме, но только в больших дозах, начиная с 10,0 мг/мышь. Контрольная группа получала физиологический раствор. В каждой группе было по 5 животных.

Гибель мышей от токсического влияния экстрактов регистрировалась редко и только при применении больших доз. У получавших водно-этанольный экстракт это отмечено в 11 случаях (24,4%), при использовании выварочных вод - в 9 (22,5%). LDso у испытуемых экстрактов была неодинаковой - соответственно 57,5 мг/мышь и 142,5 мг/мышь, то есть очень высокой. Токсичность, следовательно, оказалась крайне низкой.

В острых опытах гибели животных совсем не отмечено.

Проверка гемотоксичности проведена нами на эритроцитах барана и рекомендуемых Т. Yamanouchi (1955) в качестве наиболее чувствительных эритроцитах кролика. Однако, особых преимуществ последних перед бараньими мы не только не отметили, но и по отношению к испытуемым экстрактам они оказались в 3 раза более устойчивыми.

Результаты гемотоксичности оценивали по ОД - показателю преломления лучей на Specol в сравнении с двумя конролями - 100% гемолизом эритроцитов, достигнутым под действием дистиллированной воды (I контроль) и цитолизина ТХ-20 из актинии Radianthus Macrodactilus к.х.н. М.М. Монастырной (II контроль).

Результаты исследования гемотоксичности показали, что водно-этанольный экстракт как и в опыте in vivo оказался хотя и слабо, но более токсичным. Его LD50 составила 1,0 мг, содержащий 1 НЕ. Выварочные воды из трепанга обеспечивали такой же гемолиз эритроцитов лишь в дозе 3,0 мг. Титр 50% гемотоксичности, таким образом, во втором случае был в 3 раза ниже и составлял всего 0,3 НЕ.

Расчеты химиотерапевтического индекса (ХТИ) экстрактов, проведенные по соотношению с антимикробной, обшей биостимулирующей, иммуномодули-

рукнцей активностью и токсическими эффектами, показали перспективу применения водно-этанольной вытяжки и выварочных вод из трепанга японского для лечебно-профилактических целей. Это было проверено в опыте in vivo на животных.

9. Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на течение экспериментального сальмонеллеза у мышей

Воспроизведению экспериментального сальмонеллеза у мышей предшествовал отбор штамма, чувствительного к антимикробному действию комплексных водно-этанольного и термического экстрактов из трепанга японского и орпеделение его вирулентности (LD50) для мышей. Им оказался штамм Salm, typhimurium №1044. Его LD50 равнялась 500 млн. микробных тел. Далее была проведена подготовка 96 мышей, разделенных на 8 подгрупп по 12 особей в каждой. 6 подгрупп получали внутрибрюшинно по 0,2 мл водно-этанольного экстракта в дозах 25,0 мг/мышь (2 подгруппы), 2,5 мг/мышь (2 подгруппы) и 0,25 мг/мышь (2 подгруппы). Одной из перечисленных групп экстракт вводили за 1 сутки до заражения сальмонеллами, другой - за 5 суток.

Отдельную группу составили мыши, получавшие per os выварочные воды, и контрольная группа - получавшая вместо экстрактов физиологический раствор. После подготовки животных их заражали внутрибрюшинно LD50 Salm, typhimurium в объеме 0,5 мл и вели наблюдение, микробиологическое исследование в течение 3 недель.

На 1, 3, 7, 14, 21 сутки животных забивали по 1 в группе и помимо визуального контроля за развитием клиники болезни, учета выживаемости, патоло-гоанатомической картины проводили микробиологический (микроскопический, бактериологический) анализ их крови и органов: сердца, легких, печени, селезенки, лимфоузлов.

Результаты исследования показали, что комплексные экстракты из трепанга японского повышают устойчивость организма высокочувствительных к возбудителю Salm, typhimurium и экспериментальному сальмонеллезу мышей. Это выражалось в удлинении инкубационного периода, снижении остроты и тяжести клинического течения болезни, увеличении частоты и сроков выживаемости животных, а также в более быстрой элиминации возбудителя из инфици-

рованного организма.

При этом водно-этанольный экстракт обнаружил самую высокую эффективность. Он обеспечивал выживаемость животных в 47,6±0,5% (р<0,01) случаев, выварочные же воды - только в 14,3±3,7% (р<0,01) при почти 100% летальности в контроле.

Нормализация в состоянии здоровья у подопытных мышей, получивших экстракты, наступала на 10 -14 сутки.

При микробиологическом анализе органов мышей обращает на себя внимание максимальная насыщенность сальмонеллами иммунокомпетентных органов - селезенки и лимфоузлов, меньшая - в других тканях. Именно первые из них обеспечивают иммунный гомеостаз в организме за счет раннего распознавания, фагоцитирования и ответной иммунной реакции (Кузник Б.И. с соавт., 1989). Эти механизмы оказались наиболее выраженными у животных, получавших экстракты из трепанга японского.

Именно совокупность их влияния на разные объекты и механизмы обеспечила многоплановый эффект. При этом лучшие результаты обнаружил водно-этанольный экстракт, введенный за 1 сутки до заражения.

Таким образом, полученные нами материалы свидетельствуют о высоких лечебно-профилактических свойствах комплексных экстрактов из трепанга японского. Это открывает перспективы для их широкого использования в медицине и ветеринарной практике. Низкая токсичность и только в больших дозах исключает возможность возникновения каких бы то ни было осложнений.

Общие выводы:

1. Приготовлены комплексные химический (водно - этанольная вытяжка) и термический (выварочные воды) экстракты из свежего и дефростированного трепанга японского - БйсЬориэ ¡арогисиБ Бе1епка. Выход из них лиофилизирван-ных препаратов с биологически активными веществами составил соответственно 2,275 мг% и 1,120 мг%, содержание белка -соответственно 0,11% и 0,35%, нуклеиновых кислот - 7,6% и 0,56%, моносахаров - 0,92% и 20,48%, липидов -0,32% и 0,15%.

2. Комплексные водно-эганольная вытяжка и термический (выварочные воды) экстракт из трепанга японского обладают широким диапазоном антимик-

робной активности - фунгицидной, противовирусной, мешьше - антибактериальной. Выраженность ее зависит от способа их получения (выше при водно-этанольном извлечении), концентрации различных химических веществ (больше у водно-этанольного экстракта), родо-видовой принадлежности тест-культур.

3. Фунгицидная активность комплексных экстрактов из трепанга японского носит универсальный характер, обнаруживая антимикотический эффект в отношении разных штаммов грибов, поражая почти в равной степени нитчатые грибы и дрожжеподобные формы. Наибольшую антимикотическую активность проявляет водно-этанольный экстракт, меньшую - выварочные воды.

4. Противобактериальная активность комплексных экстрактов из трепанга японского обнаружила избирательный характер. К ним не чувствительны грам-положительные кокки (стафилококки, стрептококки), многие грамнегативные бактерии (эшерихии, шигеллы Флекснера и Зонне, протей), но в их присутствии погибают Salm, typhimurium и Ps. aeruginosa.

5. Комплексные экстракты из трепанга японского обладают противовирусной активностью в отношении патогенных видов вирусов (гриппа А и В, полиомиелита I, П, Ш типов, энцефалита) и вирусов бактерий - бактериофагов (стафилококкового моновалентного, стафилококкового и протейного компонентов поливалентного пиофага). Она выше у водно-этанольного экстракта и ниже - у выварочных вод.

6. Комплексные экстракты из трепанга японского обладают биостимули-рующими свойствами в отношении различных факторов неспецифической резистентности организма к инфекции, повышая его обеспеченность лизоцимом, увеличивают титр комплемента, активизируют фагоцитарую защиту (фагоцитарный показатель, фагоцитарное число, НСТ-тест, фагоцитарный резерв), но лишь стабилизируя при этом уровень бета-лизинов. Наибольшую эффективность обнаружил водно-этанольный экстракт, меньшую - выварочные воды.

7. Комплексные экстракты (особенно водно-этанольная вытяжка) из трепанга японского в ходе формирования специфического прививочного иммунитета в эксперименте обнаружили четкий иммуномодулирующий эффект. Они стимулировали нарастание клеточности селезенки, число антителообразующих

клеток, титр гемагоготининов, увеличивали число иммунных розеткообразую-щих клеток, их созревание и дифференцировку.

8. Комплексные экстракты из трепанга японского влияют на аллергические процессы. Они сдерживают развитие и проявление гиперчувствительности немедленного типа и умеренно усиливают гиперчувствительносгь замедленного типа, что свидетельствует о готовности организма под их воздействием к мобилизации его защитных сил. Большей активностью обладает водно-этанольный экстракт, меньшей - выварочные воды.

9. На модели экспериментального сальмонеллеза у мышей, вызванного Salm. typhimurium, под влиянием комплексных экстрактов установлено интегральное взаимодействие антимикробного, биостимулирующего и иммуномо-дулирующего эффектов комплексных экстрактов из трепанга японского. Это проявилось в ускорении элиминации возбудителя из различных органов и крови инфицированных животных, удлинении инкубационного периода и смягчении клинического течения болезни, более высокой выживаемости мышей по сравнению с контрольной группой. Лучшие результаты обеспечил водно-этанольный экстракт при профилактическом его использовании.

Рекомендации для внедрения результатов диссертации в науку и

практику.

На основании совокупности материалов, полученных в ходе выполнения диссертации, можно дать следующие рекомендации для внедрения в науку и практику: 1. На основе изучения антимикробных, в частности, противобактери-альных и антимикотических свойств комплексных экстрактов из трепанга японского и доказательства высокой чувствительности к ним грибов, некоторых видов бактерий - Salm. typhimurium, Ps. aeruginosa, а также устойчивости многих других видов грамположительных и грамотрицательных бактерий целесообразно:

- использовать комплексные экстракты, особенно выварочные воды, не утилизируемые в производстве, при конструировании простых и дифференциально-диагностических питательных сред разного назначения;

- применять комплексные экстракты в качестве пищевой добавки при диетическом питании больных токсикоинфекцией, вызванной Salm. typhimurium и с иной патологией, обусловленной Ps. aeruginosa, а также кандидозом с возбуди-

телем Candida albicans, не боясь развития дисбакгериоза.

2. В связи с установлением противовирусной активности комплексных экстрактов из трепанга японского рекомендуется:

- применение их для прямого и опосредованного воздействия на вирусы гриппа, полиомиелита в виде полосканий и пищевой добавки. Последнее весьма важно и для биостимуляции защитных сил организма, и для получения имму-номодулирующего эффекта.

3. Высокий антимикробный, биостимулирующий и иммуномодулирующий эффект комплексных экстрактов из трепанга японского, установленные нами, а также данные литературы о целебных свойствах самого морского гидробионта этого вида определяют возможность использования отходов промысла и обработки трепанга японского в животноводстве и для ветеринарии, а в самом промысле - организацию комплексного безотходного производства.

4. При определении токсичности тех или иных препаратов и пищевых добавок рекомендуется:

- сочетанное использование ее контроля на разных уровнях - in vivo на животных с одновременным контролем in vitro гемотоксичности на эритроцитах разных видов животных (кролика, барана) и (или) человека, как наиболее чувствительных объектах.

- более широкое применение для оценки полезности и опасности БАВ хи-миотерапевтического индекса, свидетельствующего о возможности и перспективах дальнейшего их использования в практике.

5. Обзор литературы "Особенности химического состава и БАВ голотурий" о биологических свойствах трепанга японского, его субпродуктах и продуктах жизнедеятельности, максимально охвативший известные данные об этом морском гидробионте, может быть полезным в учебном процессе на ряде кафедр Владивостокского и Хабаровского Государственных медицинских Университетов, Благовещенской и Читинской медицинских Академий. Его целесообразно сделать достоянием библиотек.

Список публикаций по теме диссертации:

1. "Гемолитическая активность экстрактов из дальневосточного трепанга" (соавт.: Каленик Т.К.) // Тез. докл. XXXVI науч.-практич. конф. СНО и молодых

ученых, г. Владивосток, 1995 г., с. 15.

2."Антимикробная активность экстрактов из трепанга японского" (соавт.: Каленик Т.К.) // Тез. докл. XXXVII науч.-практич. конф. СНО и молодых ученых, г. Владивосток, 1996, с. 11.

3."Интегральный элиминирующий эффект комплексных экстрактов из трепанга японского при экспериментальном сальмонеллезе у мышей". // Тез. докл. XXXVIII науч.-практич. конф. СНО и молодых ученых, г. Владивосток, 1997, с. 27.

4."Оценка показателей неспецифической резистентности к инфекции у животных при воздействии комплексных экстрактов из трепанга японского".// Тез. докл. XXXVIII науч.-практич. конф. СНО и молодых ученых, г. Владивосток, 1997, с. 34.

5."Иммуномодулирующий эффект комплексных экстрактов из трепанга японского" (соавт.: Мотавкина Н.С.) // Материалы Всесоюзной науч. конф. с международн. участием по проблеме "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при физиологических и патологических состояниях", г. Челябинск, 1997, с. 48.

6."Биостимулирующее влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на формирование специфического иммунитета." (соавт.: Мотавкина Н.С., Каленик Т.К.) // Отослано на депонирование в ВИНИТИ, 1996, 15 с.

7."Влияние комплексных экстрактов из трепанга японского на течение экспериментального сальмонеллеза у белых мышей." (соавт. Мотавкина Н.С.) // Отослано на депонирование в ВИНИТИ, 1996, 16 с.

Список рационализаторских предложений и изобретений:

1."Усовершенствованный комплексный способ оценки токсичности различных веществ". // Удостов. БРИЗ ВГМУ № 2279 от 09.01.97, (соавт. Мотавкина Н.С.).

2." Усовершенствованный способ определения гемотоксичности экстрактов из морских гидробионтов". // Удостов. БРИЗ ВГМУ № 2280 от 09.01.97.

3."Способ приготовления элективных и дифференциально-диагностических сред на основе комплексных экстрактов из трепанга японского".// Удостов. БРИЗ ВГМУ № 2281 от 09.01.97, (соавт. Потапов В.А. и др.).

4. "Способ эффективного извлечения комплекса БАВ из трепанга япон-

ского" (соавт. Каленик Т.К., Мотавкина Н.С.) // Заявка на изобретение. Отослана в ВНИИГПЭ, 1997г.

Приложение таблица 1. Направления, методы, объем исследований.

№ п/п Направления исследования Методы исследования Объем работы

1 2 3 4

I Приготовление комплексных экстрактов из трепанга японского и изучение их химического состава. 1. Водно-этанольная экстракция. 2. Получение выварочных вод. 3. Изучение химического состава: а) белки - по Lowry O.N. с соавт. (1951); б) нуклеиновые кислоты - по Спирину A.C. (1958); в) моносахара - по Dubois М. с соавт. (1956); г) липиды - по Кейтс М. (1975). 4 серии 15 серий 6 проб 6 проб 6 проб 6 проб

II Изучение противо-бактериальной, ан-тифунгальной активности экстрактов из трепанга японского. 4. Метод дисков с комплексными БАВ на плотных питательных средах с 11 разными тест-культурами бактерий. 5. Метод лунок с 7 тест-культурами грибов. 100 проб 70 проб

III Определение противовирусной активности комплексных экстрактов из трепанга японского. 6. На модели бактериофагов: а) титрование стафилококкового бактериофага на плотной среде (до и после обработки БАВ) с тест - культурой; б) титрование стафилококкового и протейного компонентов поливалентного пиофага в жидкой среде по 118 проб 195 проб

Аппельману с тест-культурами. 7. РГА в описании Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я. (1954) с тест-вирусными препаратами: а) живыми вакцинами гриппа А, полиомиелита, клещевого энцефалита; 48 проб

1 2 3 4

б) инактивированными штаммами вируса гриппа А и В; в) вирусными диагностикумами гриппа А и В. • 34 пробы 48 проб

IV Изучение влияния комплексных экстрактов из трепанга японского на гуморальные факторы неспецифической резистентности организма к инфекции. 8. Определение титра комплемента по методу Бухарина О.В., Луды А.П. (1972). 9. Определение титра комплемента в геле микрометодом Мотавкиной Н.С., Ковалева Б.М., Шаронова А.С (1980). 10. Определение титра лизоцима в геле микрометодом Мотавкиной Н.С., Ковалева Б.М., Шаронова A.C. (1979) с тест-культурой М. lisodeiKticus. 11. Определение титра бета-лизинов в геле микрометодом Мотавкиной Н.С., Ковалева Б.М., Шаронова A.C. (1987) с тест-культурой Вас. subtilis. 5 проб 40 проб 40 проб 40 проб

V Изучение влияния комплексных экстрактов из трепанга японского на фагоцитарную активность нейтро-филов. 12. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов с тест-культурой Staph, aureus: а) ИФ, ФЧ - по методу Бухарина О.В., Луды А.П. (1972); б)определение НСТ-теста (спонтанного, стимулированного) по методу Park В.Н. (1968). 25 проб 25 проб

VI Изучение влияния комплексных экстрактов из трепанга японского на процессы аллергии. 13. Определение интенсивности ГЗТ- согласно "Методическим материалам по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодули-рующего действия фармакологических средств "Фарм. Комитета МЗ СССР (1984). 14. Определение интенсивности ГНТ по тем же "Методическим материалам" Фарм. Комитета МЗ СССР (] 984). 20 проб .15 проб

1 2 3 4

VII Исследование влияния коплек-сных экстрактов на клеточное и гуморальное звено специфического иммунитета 15. Подсчет спленоцитов в камере Горяева. 16. Определение общего количества И-РОК в селезенке мышей по методу Haskill J.S. с соавт. (1972). 17. Определение общего количества АОК в селезенке мышей по методу Jeme N.K., Nordin A.A. (1963). 18. Определение общего количества гемагглютининов в сыворотке крови мышей по методу Cunningham А. (1965). 40 проб 40 проб 64 пробы 80 проб

vm Изучение токсичности комплексных экстрактов из трепанга японского in vitro и in vivo. 19. Определение гемотоксичности in vitro по методу Bernhemer A.W. с соавт. (1984). 20. Определение токсичности по методу Кербера in vivo. 22 пробы 85 проб

IX Исследование влияния комплексных экстрактов из трепанга японского на течение экспериментального сальмонеллеза у мышей. 21. Определение LD50 Salm, typhimurium на мышах. 22. Воспроизведение экспериментального сальмонеллеза у мышей после введения экстрактов из трепанга японского. 23. Визуальный контроль: а) клиническое наблюдение; б) патологоанатомический анализ; в) оценка выживаемости. 24.Микробиологический контроль элиминации: а) микроскопический анализ; б) бактериологический контроль элиминации Salm, typhimurium из организма белых мышей. 25 проб 96 проб 96 проб 40 проб 96 проб 40 проб 175 проб 40 проб

X Статистический анализ цифровых данных. 25. Методы статистической обработки материалов по Каминскому Л.К. (1964), Ашмарину И.П., Воробьеву A.A. (1962). Кумулятивный метод Reed L.J., Mench Н. (1938). Все цифровые данные.