Антилактоферриновая активность микроорганизмов

Валышева, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антилактоферриновая активность микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антилактоферриновая активность микроорганизмов"

На правах рукописи

Валышева Ирина Викторовна

Антилактоферриновая активность микроорганизмов

03.00.07 - «Микробиология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оренбург-2005

Диссертация выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук,

профессор Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Габидуллин Зайнулла Гайнулинович

доктор медицинских наук,

профессор Усвяцов Борис Яковлевич

Ведущая организация -

Челябинская государственная медицинская академия

Защита состоится «¿£у> ¡/УУО'лЯ' 2005 г. в ^^часов на заседании диссертационного совета Д.208.066.03 в Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Н. В. Немцева

:<££» Рш-Аеи^ 2005 Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Лактоферрин - железосвязывающий гликопротеин из семейства трансферринов, участвующий в ряде гомеостатических функций организма человека. С начальных этапов изучения лактоферрина было известно, что он играет роль в неспецифической защите организма, оказывая как бактериостатическое, так и бактерицидное действие на микроорганизмы (грамположительные и грамотрица-тельные бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, вирусы). Описаны механизмы антимикробного действия лактоферрина: способность конкурировать с микроорганизмами за ионы железа в среде (Masson P. L., Heremans J. F., 1966); взаимодействие с клеточной стенкой микроорганизмов, которое приводит к нарушению транспортной функции мембраны (Visca P. et al., 1990; Elass-Rochard E. et al., 1995); протеолитическое расщепление факторов вирулентности микроорганизмов (Qiu J. et al., 1998; Plaut A. G. et al., 2000; Hendrixson D. R. et al., 2003); образование активных производных -лактоферрицинов и лактоферрампина (Bellamy W. et al., 1992; van der Kraan M. I. et al., 2004); стимуляция фагоцитоза (Broxmeyer H. E. et al., 1990).

В настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, такие как лизоцим, комплемент, гистоноподобные белки, катионный белок тромбоцитов (Бухарин О. В., 1999). Наличие факторов персистенции обеспечивает бактериям длительное нахождение в макроорганизме. Разработка методических приемов микробиологического тестирования персистентного потенциала бактерий позволяет повысить качество диагностики и терапии инфекционных заболеваний.

В то же время, вопрос об адаптации микроорганизмов к антимикробному действию лактоферрина остается в значительной степени не изученным.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилось определение способности микроорганизмов к инактивации лактоферрина и оценка биологической роли этого признака. Для реализации этой

цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработать метод определения антилактоферриновой активности (АЛ фА) микроорганизмов.

2. Определить распространенность и выраженность антилактоферриновой активности у микроорганизмов различных групп.

3. Оценить биологическую роль антилактоферриновой активности микроорганизмов.

Научная новизна

Разработан метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов, основанный на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси с помощью имму-ноферментного анализа (патент РФ на изобретение № 2245923). Данный метод позволяет количественно определять АЛфА у широкого круга микроорганизмов, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, сокращает время исследования.

С помощью разработанного метода определена антилактофер-риновая активность у стафилококков, стрептококков, энтеробакте-рий, франциселл, дрожжеподобных грибов, выделенных из различных биотопов организма человека в норме и при инфекционных заболеваниях. Более половины (60-80%) исследуемых культур микроорганизмов обладали способностью инактивировать лакто-феррин. Установлено, что выраженность и распространенность АЛфА зависят от источника выделения микроорганизмов и формы инфекционного процесса. Высокие значения АЛфА бактерий были выявлены у культур, изолированных из биотопа с высоким содержанием лактоферрина (репродуктивный тракт женщин), а также при хронических воспалительных заболеваниях и от бактерионосителей.

мышей. Определены особенности взаимодействия клонов кишечной палочки, обладающих разным уровнем АЛфА, с клетками организма хозяина. Показано, что микроорганизмы с антилактофер-риновой активностью подавляют регенераторные потенции тканей макроорганизма, вызывают деструктивные изменения, что характеризует антилактоферриновый признак как «малый» фактор пато-генности.

Выявлено, что система «лактоферрин хозяина - антилактофер-риновая активность микроорганизмов» имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования бактерионосительства. Высокий уровень АЛфА сальмонелл и сниженная концентрация лактоферрина в кишечнике в разгар заболевания обуславливают развитие реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства (патент РФ на изобретение № 2242756).

Научно-практическая ценность

Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, способствуют расшифровке патогенеза инфекционных заболеваний, что используется в процессе преподавания раздела «Инфекция и иммунитет» курса медицинской микробиологии в Оренбургской государственной медицинской академии.

Практическое значение исследований определяется разработкой метода изучения одного из факторов персистенции микроорганизмов - антилактоферриновой активности. Исследование у культур микроорганизмов персистентного потенциала позволяет прогнозировать переход болезни в хроническую форму, а также возникновение бактерионосительства.

Разработанный метод также может быть использован для прогнозирования течения инфекционного процесса (в частности, прогнозирования реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства), оценки эффективности терапии гнойно-воспалительных заболеваний.

Полученные материалы использованы в методических рекомендациях МЗ РФ «Прогнозирование тяжести течения и местное лечение острых ограниченных гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры» (Оренбург, 2004).

Положения, выносимые на защиту

1. Антилактоферриновая активность микроорганизмов широко распространена среди бактерий и грибов различных групп, определяя их адаптацию к многофакторному антимикробному действию лактоферрина.

2. Антилактоферриновая активность микроорганизмов является фактором персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на: региональной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2001; 2003; 2005); I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003); IV Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2003); Всероссийской конференции «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004); научно-практической конференции по медицинской микологии (VII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2004); VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005).

Диссертационное исследование является фрагментом научно-исследовательской работы, проводимой в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект «Разработка новых подходов к диагностике и терапии дисбиозов и ассоциированной с ними инфекцион-но-воспалительной патологии»), проекта «Антилактоферриновая активность микроорганизмов» (грант РФФИ № 04-04-96162) и темы «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека» (№ гос. регистрации 01.2.00 104756).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 публикации в рецензируемых научных журналах, 2 патента РФ на изобретение, пособие для врачей МЗ РФ.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения. Указатель литературы содержит 219 источников литературы, из которых 60 отечественных и 159 зарубежных. Текст иллюстрирован 14 таблицами и 24 рисунками. Диссертация содержит 6 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовано 368 штаммов микроорганизмов, из них 105 штаммов Staphylococcus spp., 8 штаммов Streptococcus spp., 157 штаммов энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella spp., Salmonella spp., Enterobacter aerogenes, Morganella morganii, Providencia rettgeri, Shigella flexneri), 38 штаммов F. tularensis, 60 штаммов дрожжеподобных грибов (Candida albicans, Rhodotorula mucilagi-nosa). Выделение и идентификацию штаммов проводили общепринятыми методами по морфологическим, тинкториальным, культу-ральным свойствам (Биргер М. О. и др., 1982). Биохимические свойства микроорганизмов выявляли с использованием тест-систем «ЭНТЕРОтест 24», «СТАФИтест 16», «СТРЕПТОтест 16» («La-chema», Чехия). Способность к ассимиляции углеводов дрожжепо-добными грибами рода Candida и Rhodotorula исследовали с использованием системы «API 20C AUX» («bioMerieux», Франция).

У выделенных штаммов микроорганизмов изучали биологические свойства: протеолитическую активность (Никитин Н. В., 1986), антилизоцимную и антикомплементарную активности (Бухарин О. В., 1999).

Для определения биологической роли АЛфА микроорганизмов использовали интраорбитальное заражение мышей линии СВА отобранной парой изогенных клонов штамма Staphylococcus aureus. Один клон имел высокую антилактоферриновую активность (клон «АЛ ф А +»), значение АЛ ф А второго клона было низким (клон «АЛфА -»). Анализу подвергались: длительность бактериовыделе-ния, массивность обсеменения почечной ткани животных, доля инфицированных стафилококком животных в различные сроки на-

блюдения, распространенность и средние значения АЛфА стафилококков в высеваемых из почечной ткани популяциях; распределение клонов по изучаемому признаку в субпопуляциях. Параллельно с бактериологическим исследованием проведено гистологическое изучение почечной ткани инфицированных животных. Для поиска общих закономерностей участия АЛфА микроорганизмов в формировании инфекционного процесса была воспроизведена экспериментальная инфекция с интратрахеальным заражением крыс изогенными клонами кишечной палочки (Е. coli A37), отличающимися уровнем экспрессии антилактоферринового признака. Для гистологического исследования брали кусочки трахеи, бронхов, легкого. Материал фиксировали в 12% нейтральном формалине, после стандартной проводки готовили гистопрепараты, окрашивали гематоксилином Майера и эозином, исследовали методами световой и электронной микроскопии, морфометрии.

Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми методиками с использованием критерия Стьюдента, корреляционного анализа (Лакин Г. Ф., 1990).

Разработка метода определения антилактоферриновой активности микроорганизмов

Для определения антилактоферриновой активности микроорганизмов был разработан метод с применением иммуноферментно-го анализа (рис. 1). При определении АЛфА исследуемые культуры микроорганизмов выращивали на плотной питательной среде при 37°С в течение 18-24 ч. Из выросшей агаровой культуры готовили взвесь микроорганизмов (10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича) в жидкой питательной среде. Готовили раствор лактоферрина (200 нг/мл) на забуференном физиологическом растворе.

Взвесь исследуемых культур микроорганизмов объемом 150 мкл вносили в лунки стерильного полистиролового планшета (Labsystems, Финляндия) и смешивали с 150 мкл приготовленного раствора лактоферрина (конечная концентрация лактоферрина 100 нг/мл). Параллельно с опытной готовили контрольную пробу: в лунки планшета вносили 150 мкл раствора лактоферрина и 150 мкл жидкой питательной среды. Пробы инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После инкубации содержимое лунок переносили в пла-

стиковые пробирки, центрифугировали при 3000-8000 об/мин в течение 20 мин на холоде, отбирали 50 мкл супернатанта в опытной и контрольной пробах.

Пробы разводили в 5 раз (до объема 250 мкл) рабочим раствором фосфатно-солевого буфера с твином. Для достоверности получаемых результатов опыт и контроль проводился в трех дубликатах.

Концентрацию лактоферрина в пробах проводили с использованием реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия). В лунки первого ряда планшета с иммобилизованными антителами к лактоферрину вносили по 100 мкл растворов калибровочных образцов. В остальные лунки планшета вносили по 100 мкл анализируемых образцов. Планшет выдерживали в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего содержимое лунок удаляли энергичным вытряхиванием в кювету с дезинфицирующим раствором. Лунки планшета промывали 3 раза рабочим буферным раствором и дважды - дистиллированной водой.

Далее, во все лунки добавляли по 100 мкл раствора конъюгата антител с пероксидазой хрена и выдерживали в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего содержимое лунок удаляли вытряхиванием, лунки промывали 3 раза рабочим буферным раствором и дважды - дистиллированной водой. Затем во все лунки добавляли по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. Стрипы выдерживали в течение 10-20 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. По истечении указанного времени во все стрипы добавляли 100 мкл стоп-реагента (2 н. серная кислота). Регистрацию результатов в лунках с опытной и контрольной пробами проводили на фотометре ИФА-ОЭП (Россия) при длине волны 450 нм. По результатам измерения строили график в координатах: ось абсцисс -концентрация лактоферрина в калибровочных образцах (нг/мл), ось ординат - соответствующее значение оптической плотности. Концентрацию лактоферрина в опытных и контрольных пробах определяли по калибровочному графику.

Найденные по графику значения концентрации лактоферрина умножали на коэффициент разведения проб, т.е. на 5 и выражали результат в нг/мл.

Рисунок 1.

Способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов ОПЫТ КОНТРОЛЬ

Рассчитывали антилактоферриновую активность по формуле:

С = Ск - Со, где

С - антилактоферриновая активность микроорганизмов,

нг инактивированного лактоферрина/мл супернатанта;

Ск - концентрация лактоферрина в контроле, нг/мл;

Со - концентрация лактоферрина в опыте, нг/мл.

В отличие от ранее разработанного способа определения АЛ-фА (патент РФ на изобретение № 2156807), новый метод позволяет не только качественно выявлять данный признак, но и количественно выражать уровень антилактоферриновой активности микроорганизмов. Кроме того, инкубация живых культур микроорганизмов, а не их супернатантов, с лактоферрином значительно повышает частоту выявления АЛфА бактерий, поскольку в первом случае могут быть обнаружены как конститутивные, так и индуцибельные ингибиторы лактоферрина. Отказ от использования живой тест-культуры Micrococcus luteus позволяет определять АЛфА у штаммов микроорганизмов, продуцирующих лизоцим, гистоноподобные белки, перекись водорода и другие антагонистически активные вещества многих микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл, стрептококков, синегнойной палочки и др.). Применение иммуно-ферментного анализа приводит к повышению чувствительности и специфичности метода (Егоров А. М., 1991).

Таким образом, разработанный метод позволяет в короткие сроки, с высокой точностью, количественно определять АЛфА у широкого круга микроорганизмов.

Характеристика антилактоферриновой активности микроорганизмов

Распространенность и выраженность АЛфА микроорганизмов определяли у 368 штаммов бактерий и грибов. Установлено, что 60-80% штаммов микроорганизмов различных видов способны инактивировать лактоферрин. Выраженность АЛфА микроорганизмов составила от 4 до 13 нг/мл в зависимости от видовой принадлежности.

При изучении особенностей распространенности и выражен-

ности АЛфА у бактерий, выделенных из различных биотопов организма человека и при разных формах инфекционного процесса было отмечено, что распространенность АЛ фА у штаммов Е. coli, К. pneumoniae и S. aureus, выделенных из влагалища, составила 90,0±9,5, 100 и 85,7±13,2% соответственно. Частота встречаемости признака у фекальных штаммов Е. coli и К. pneumoniae была ниже по сравнению с вагинальными штаммами - 43,5±10,3 и 60,0±12,6% соответственно (р<0,01). Штаммы S. aureus, выделенные со слизистой оболочки носовой полости, инактивировали лактоферрин в 65,2±9,9% случаев.

Уровень АЛфА энтеробактерий, выделенных из влагалища, был в 3-4 раза выше, чем у тех же видов микроорганизмов, выделенных из кишечника (р<0,01), составив у Е. coli соответственно 17,0±3,8 и 4,5±1,7 нг/мл; у К. pneumoniae соответственно 15,7±1,2 и 5,9±1,3 нг/мл (рис. 2). Дрожжеподобные грибы, выделенные из кишечника, инактивировали 7,1+1,1 нг/мл лактоферрина, в то время как выделенные из влагалища - 11,3±2,8 нг/мл. Штаммы золотистого стафилококка, выделенные со слизистой носовой полости, обладали АЛфА 8,4±1,0 нг/мл, что было ниже, чем АЛфА влагалищных штаммов (10,0 ±1,0 нг/мл).

Таким образом, исследование АЛфА микроорганизмов, выделенных из кишечника, влагалища и со слизистой оболочки носовой полости, показало, что данный признак широко распространен, зависит от видовой принадлежности, биотопа. В нижних отделах репродуктивного тракта женщин значения АЛфА достигают более высоких значений по сравнению с кишечником и носовой полостью. Не исключено, что выявленная закономерность объясняется тем, что во влагалище концентрация лактоферрина примерно в 10 раз выше, чем в носовой полости и в несколько раз выше, чем в кишечнике.

Распространенность изучаемого признака у штаммов микроорганизмов - возбудителей острых гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ) - находилась на низком уровне (16-25%), составив 33,3±19,2% у Е. coli, 31,3±11,6% у S. aureus, 33,3±19,2% у S. epi-dermidis. При хронических ГВЗ 66,7± 19,2% штаммов кишечной палочки, 66,7±15,7% штаммов золотистого и 75,0±15,3% штаммов эпидермального стафилококков инактивировали лактоферрин.

Штаммы S. aureus, выделенные от бактерионосителей, обладали АЛ фА в 65,2±9,9% случаев.

Рисунок 2.

Выраженность АЛфА микроорганизмов, выделенных из различных источников

Примечание: * - р<0,01 для сравниваемых групп Уровень антилактоферриновой активности всех исследуемых микроорганизмов, выделенных при острой форме гнойно-воспалительных заболеваний, был низким (рис. 3). АЛфА штаммов кишечной палочки составила 2,8±2,2 нг/мл, золотистого стафилококка - 3,9±1,0 нг/мл, эпидермального стафилококка - 1,3±0,8 нг/мл. При хронической форме инфекционного процесса выраженность АЛфА у всех трех видов исследуемых микроорганизмов была выше (р<0,05): 9,6±0,5; 9,1±1,5 и 7,9±1,4 нг/мл соответственно у Е. coli, S. aureus и S. epidermidis. Штаммы золотистого стафилококка, выделенные от бактерионосителей, обладали АЛфА 8,4±1,0 нг/мл, что также превышало уровень АлфА штаммов, выделенных при острой форме заболеваний (р<0,05).

Рисунок 3.

Выраженность АЛфА микроорганизмов, выделенных при различных формах инфекционного процесса

S. aureus S. epidermidis Е. coli

□ Острые ГВЗ ИХронические ГВЗ О Бактерионосительство

Примечание: * - р<0,05 для сравниваемых групп

Таким образом, при хроническом течении гнойно-воспалительных заболеваний и бактерионосительстве антилакто-ферриновая активность микроорганизмов достигает наиболее высоких значений, по сравнению с острым течением. Данный факт свидетельствует, что АЛфА микроорганизмов способствует длительному нахождению возбудителя в организме хозяина.

Изучена связь антилактоферринового признака микроорганизмов с некоторыми их биологическими характеристиками. Обнаружена корреляционная связь между продукцией бактериями протеаз и АЛфА. В эксперименте на штаммах S. aureus и S. enteritidis показано, что добавление к взвеси исследуемой культуры бактерий ингибиторов сериновых протеаз (EDTA, PMSF) снижало АЛфА микроорганизмов в несколько раз.

Ингибиторы протеаз оказывали влияние на АЛфА и сальмонелл, и стафилококков. В опыте среднее значение антилактоферри-новой активности сальмонелл составило 5,0±1,3 нг/мл, АЛфА ста-

филококков - 5,8±1,3 нг/мл. При добавлении в опытную пробу ЭД-ТА антилактоферриновая активность сальмонелл снизилась до 1,3±0,5 нг/мл (р<0,05), у стафилококков - до 1,8±О,7 нг/мл. Добавление PMSF также снижало АЛфА сальмонелл и золотистого стафилококка. Эти данные могут объяснить один из вероятных механизмов инактивации бактериями лактоферрина - протеолиз. Связь между антилактоферриновой активностью и такими факторами персистенции, как антилизоцимная и антикомплементарная активность, не установлена.

Биологическая роль антилактоферриновой активности микроорганизмов

Для определения биологической роли антилактоферриновой активности микроорганизмов использовали модели экспериментальной инфекции и клинико-бактериологическое исследование.

При проведении стафилококковой инфекции установлено, что течение экспериментального инфекционного процесса зависит от начального уровня АЛ ф А клона S. aureus. Была изучена длительность бактериовыделения S. aureus из почечной ткани мышей. От животных, инфицированных клоном «АЛфА -», бактерии высевались до 35 дня, в среднем 16,5±2,0 дней; тогда как при заражении клоном «АЛфА +», микроорганизмы высевались до 49 дня, а средний срок бактериовыделения составил 25,1±2,7 дней (р<0,05). Таким образом, длительность выделения микроорганизмов из почечной ткани животных зависела от начального уровня антилактофер-риновой активности клонов золотистого стафилококка.

При изучении динамики массивности обсеменения почечной ткани животных, инфицированных клонами S. aureus, отличающимися по антилактоферриновому признаку, была обнаружена зависимость между массивностью обсеменения почек и сроками бакте-риовыделения (рис. 4). Массивность обсеменения почечной ткани мышей, зараженных клоном «АЛфА -», снижалась: если на 7 день она составляла 7,7±1,5 lg КОЕ/г, перед прекращением бактериовыделения, на 35 день, данный показатель снизился до 4,7 lg КОЕ/г. Анализ полученных данных выявил статистически значимую обратную корреляцию между сроками исследования и массивностью обсеменения почек лабораторных животных (r= -0,92).

При инфицировании мышей клоном «АЛфА +» исходная мас-

сивность обсеменения почек (на 7 сутки) составила 7,7±1,5 lg КОЕ/г. В течение инфекционного процесса происходили колебания массивности обсеменения. К 49 суткам массивность обсеменения почечной ткани мышей составила 6,1±0,6 Ig КОЕ/г.

Рисунок 4.

Динамика микробной обсемененности почек в зависимости от исходного уровня АЛфА S. aureus

7 14 21 28 35 42 49 дни

■ Клон "АЛфА -" Клон "АЛфА +"

При инфицировании клоном «АЛфА -» с течением времени снижалась массивность обсеменения стафилококками почек животных, что приводило к полному освобождению организма от возбудителей к 42 суткам. Распространенность и выраженность ан-тилактоферриновой активности клона «АЛфА -» характеризовалась низкими значениями; в период, предшествующий окончанию бак-териовыделения, признак не регистрировался. Данное течение инфекционного процесса подобно краткосрочному бактерионосительству и заканчивается элиминацией возбудителя из макроорганизма (Бондаренко В. М. и др., 1991).

Экспериментальный инфекционный процесс, вызванный клоном S. aureus с антилактоферриновой активностью («АЛ ф А +»), носил затяжной характер. Клон длительно высевался из почечной ткани мышей, микробная обсемененность почек мышей постоянно находилась на высоком уровне. Распространенность АЛфА в популяциях данного клона в течение экспериментальной инфекции составляла 90 - 100%. Клон изначально характеризовался гетерогенностью популяций по антилактоферриновому признаку. Гетерогенность популяций возрастала в ходе инфекционного процесса, в субпопуляциях преобладали клоны с уровнем признака более 20 нг/мл. Неоднородность популяционного состава клона золотистого стафилококка по АЛфА, вероятно, представляет своеобразный резерв для изменчивости под влиянием факторов естественной резистентности организма, что согласуется с данными по антилизоцим-ной активности шигелл (Герасимов В. Е., 1987), стафилококков (Шеенков Н. В., 1993). Наличие высокого уровня антилактоферри-новой активности у возбудителя позволяет ему длительно находиться в макроорганизме. Таким образом, вероятно, АЛфА микроорганизмов вносит свой вклад в персистентный потенциал бактерий.

Поскольку при интраорбитальном заражении животных S. aureus наблюдается преимущественное поражение почечной ткани (Анатолий С. А. и др., 1971; Аникина Т. А. и др., 1975), на 7 сутки после инфицирования было проведено гистологическое исследование паренхиматозных и стромальных элементов почек экспериментальных животных двух сравниваемых групп (инфицированных клоном S. aureus «АЛфА -» и клоном «АЛфА +»). Оказалось, что введение в организм экспериментальных животных клона S. aureus, обладающего антилактоферриновой активностью, приводило к формированию множественных очагов деструктивных изменений паренхиматозных и стромальных элементов почки на фоне выраженного геморрагического отека, определяя течение воспалительного процесса.

На базе лаборатории функциональной морфологии клетки ИКиВС УрО РАН была поставлена экспериментальная инфекция с интратрахеальным заражением крыс изогенными клонами кишечной палочки, отличающимися по уровню антилактоферриновой активности. Морфо-функциональные изменения тканевых элементов

слизистой оболочки трахеи экспериментальных животных в основном носили сходные черты: обнаружены альтеративно-экссудативные процессы в бронхо-сосудистом и альвеоло-сосудистом барьерах. Однако, введение микроорганизмов «АЛфА +» приводило к более выраженным ультраструктурным изменениям во всех сериях опытов и стадиях наблюдений, что проявлялось в существенном нарушении межклеточных контактов эпителиоци-тов, в более значительной вазодилятации сосудов микроциркуля-торного русла, экстравазации форменных элементов крови, включая эритроциты. При введении клона «АЛфА +» отмечали изменения ультраструктуры реснитчатого аппарата эпителия: деструкция цитолеммы, микротрубочек, дискомплексация динеиновых и не-ксиновых нитей. Усиление секреции бокаловидных клеток приводило к усугублению нарушений мукоцилиарного барьера. Это, в свою очередь, усиливало десквамацию эпителия, что способствовало глубокому проникновению возбудителей в стенку трахеи. В собственной пластинке слизистой оболочки, просвете микрососудов, макрофагах были обнаружены жизнеспособные реактивно измененные бактерии.

При введении бактерий без АЛфА отмечались процессы усиления внутриклеточной регенерации эпителиальных и соединительнотканных клеток, что проявлялось в увеличении численности свободных рибосом (полисом) в условной единице площади цитоплазмы, в том числе в участках ее секвестрации.

При введении клона «АЛфА +» деструкция не сопровождалась адекватными репаративными процессами, что свидетельствует об угнетении адаптивных и компенсаторных свойств тканей в этих условиях.

Из данных литературы известно, что наличие факторов перси-стенции у возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний обуславливает утяжеление течения заболевания (Первушина Л. А., 1990; Швецов С. А., 1994). Не исключено, что тяжесть течения заболевания обусловлена деструктивными изменениями клеток макроорганизма под воздействием возбудителя, обладающего перси-стентным потенциалом, что, по-видимому, позволяет оценивать АЛфА микроорганизмов в качестве «малого» фактора патогенно-сти.

Учитывая, что антилактоферриновый признак микроорганиз-

мов может быть отнесен к факторам персистенции, данные знания представляется возможным использовать в клинико-лабораторной практике.

В условиях клиники обнаружение у исследуемых культур микроорганизмов факторов персистенции (в том числе АЛфА) позволяет прогнозировать возникновение бактерионосительства.

Система «лактоферрин хозяина - антилактоферриновая активность микроорганизмов» имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования сальмонеллезного рекон-валесцентного бактерионосительства. Известно, что в разгар заболевания (сальмонеллез) концентрация лактоферрина в копрофильт-ратах увеличивается по сравнению со здоровыми людьми в 12 раз, постепенно снижаясь к периоду реконвалесценции. При нарушениях в системе неспецифической защиты организма от инфекции концентрация лактоферрина в кишечнике снижается.

Анализ данных показал, что при значениях антилактоферрино-вой активности возбудителя 7,8-13,0 нг/мл и содержании лакто-феррина в копрофильтрате больного сальмонеллезом в количестве 460-1400 нг/мл развивается сальмонеллезное бактерионосительство.

Оценивая материал в целом, следует выделить основные моменты: во-первых, антилактоферриновая активность микроорганизмов широко распространена среди бактерий и грибов, определяя их адаптацию к многофакторному антимикробному действию лактоферрина. Во-вторых, антилактоферриновая активность микроорганизмов является одним из факторов персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина. Изучение механизмов инактивации бактериями лактоферрина перспективно как с теоретической, так и с практической точек зрения.

ВЫВОДЫ

1. Разработан иммуноферментный метод определения антилак-тоферриновой активности микроорганизмов, основанный на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси, который позволяет в короткие сроки, с высокой точностью, количественно определять АЛфА у микроорганизмов различных групп.

2. Установлена высокая частота встречаемости антилактоферри-нового признака у бактерий, выделенных из биотопов организма человека в норме и при инфекционных процессах. Высокие значения АЛфА характерны для культур, выделенных из биотопа с высокой концентрацией лактоферрина (репродуктивный тракт женщин), по сравнению со штаммами, выделенными из кишечника и со слизистой носовой полости.

3. Обнаружена антилактоферриновая активность грибов видов Candida albicans и Rhodotorula mucilaginosa. Представители обоих таксонов характеризовались высокими показателями пе-нетрантности и экспрессии АЛфА.

4. Распространенность и выраженность АЛфА у микроорганизмов, выделенных при хронической форме инфекционного процесса и от бактерионосителей, характеризуются более высокими значениями признака по сравнению с культурами, изолированными при острых формах заболевания.

5. На модели экспериментальной инфекции установлено, что клон золотистого стафилококка, обладающий высоким уровнем АЛфА, более длительно выделяется из организма мышей, по сравнению с клоном с низкой АЛфА.

6. Обнаружена корреляционная связь между продукцией протеаз и АЛфА S. aureus. Установлено, что ингибиторы протеаз подавляют АЛфА бактерий.

7. Бактерии с антилактоферриновой активностью снижают адаптивные и репаративные потенции клеток хозяина, приводя к деструктивным изменениям тканей и определяя течение воспалительного процесса.

8. Выявлено, что система «лактоферрин хозяина - антилактофер-риновая активность микроорганизмов» имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования бактерионосительства. Высокий уровень АЛфА сальмонелл и сниженная концентрация лактоферрина в кишечнике в разгар заболевания обуславливают развитие реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сычева И. В. Способность микроорганизмов к инактивации лактоферрина / И. В. Сычева, А. В. Валышев // Региональная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов (сборник материалов). - Ч. 3. - Оренбург: ИПК ОГУ, 2001.-С. 162-163.

2. Валышев А. В. Инактивация факторов естественной резистентности грибами Rhodotorula mucilaginosa / А. В. Валышев, Н. Б. Перунова, И. В. Валышева // Успехи медицинской микологии: материалы Первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003 г.). - Т. 1. -М: Национальная академия микологии, 2003. С. 54-55.

3. Валышева И. В. Антилактоферриновая активность микроорганизмов из различных биотопов тела человека / И. В. Валышева // Региональная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Оренбургской области (сборник материалов). - Ч. I. - Оренбург: РИК ГОУ ОГУ, 2003. - С. 177-178.

4. Острый пиоторакс, вызванный Providencia rettgeri / О. М. Аб-рамзон, А. В. Валышев, О. Л. Карташова и др. // Грудная и серд.-сосуд. хир. - 2003. - № 3. - С. 80.

5. Новый метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов / И. В. Валышева, А. В. Валышев, О. Л. Карташова и др.// Журн. микробиол. - 2003. - № 4. - С. 64-67.

6. Антилактоферриновая активность Candida species / И. В. Ва-лышева, А. В. Валышев, О. Л. Карташова, О. В. Бухарин // Проблемы медицинской микологии. - 2004. - Т. 6, № 2. - С. 65.

7. Способ прогнозирования реконвалесцентного сальмонеллезно-го бактерионосительства / О. В. Бухарин, И. Н. Чайникова, А. В. Валышев и др. // Патент РФ на изобретение № 2242756, Бюл. № 35, 2004 г.

8. Способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов / О. В. Бухарин, А. В. Валышев, И. Н. Чайникова и др. // Патент РФ на изобретение № 2245923, Бюл. № 4,2005 г.

9. Прогнозирование тяжести течения и местное лечение острых ограниченных гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры / О. М. Абрамзон, О. В. Бухарин, П. П. Курлаев и др. // Пособие для врачей МЗ РФ.- Оренбург. - 2003.- 24 с.

Для заметок

Валышева Ирина Викторовна Антилактоферриновая активность микроорганизмов

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал - макет изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Word 2000 for Windows. Подписано в печать 15.03.2005. Гарнитура Таймс. Печать оперативная. Усл. печ. л. - 1,0. Тираж 100 экз.

1 9 МАЙ 20D5

( 37 2 4 í 9

\ « ' у

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Валышева, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.:.

ГЛАВА 1. ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ «МИКРООРГАНИЗМЫ - ЛАКТОФЕРРИН ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА» обзор литературы)

1.1. Роль лактоферрина в гомеостазе организма человека.

1.2. Антимикробное действие лактоферрина.

1.3. Адаптация микроорганизмов к действию лактоферрина.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Характеристика культур микроорганизмов.

2.2. Выделение и идентификация микроорганизмов.

2.3. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов

2.3.1. Определение протеолитической активности 40 микроорганизмов.

2.3.2. Определение факторов персистенции микроорганизмов

2.4. Методы воспроизведения экспериментальной инфекции.

2.4.1. Метод воспроизведения стафилококковой экспериментальной инфекции.

2.4.2. Метод воспроизведения интратрахеального заражения крыс.

2.5. Методы гистологической обработки материала.

2.6. Приготовление копрофильтратов и определение в них 46 концентрации лактоферрина.

2.7. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ-ЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ.

4.1. Распространенность и выраженность антилактоферриновой активности микроорганизмов.

4.2. Связь антилактоферриновой активности микроорганизмов с другими биологическими характеристиками.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ АНТИЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИМОВ.

5.1. Роль антилактоферриновой активности микроорганизмов в развитии экспериментального инфекционного процесса

5.2. Морфо-функциональная характеристика тканей макроорганизма при экспериментальной инфекции.

5.3. Использование показателя антилактоферриновой активности микроорганизмов в клинико-лабораторной практике.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антилактоферриновая активность микроорганизмов"

Актуальность проблемы

Лактоферрин - железосвязывающий гликопротеин из семейства транс-ферринов, участвующий в ряде гомеостатических функций организма человека. С начальных этапов изучения лактоферрина не было сомнений в том, что он играет определенную роль в неспецифической защите организма, оказывая как бактериостатическое, так и бактерицидное действие на микроорганизмы. Антимикробное действие лактоферрин оказывает на грамположительные и гра-мотрицательные бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, вирусы. Подробно описаны механизмы антимикробного действия лактоферрина: способность конкурировать с микроорганизмами за ионы железа в среде [182], взаимодействие с клеточной стенкой микроорганизмов, которое приводит к нарушению транспортной функции мембраны [147, 175], протеолитическое расщепление некоторых факторов вирулентности микроорганизмов [132, 203, 133], образование активных производных - лактоферрицинов и лактоферрампина [74, 157]; стимуляция фагоцитоза [181].

В настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, такие как ли-зоцим, комплемент, гистоноподобные белки, катионный белок тромбоцитов [10]. Наличие факторов персистенции обеспечивает бактериям длительное нахождение в макроорганизме. Разработка методических приемов микробиологического тестирования персистентного потенциала бактерий позволяет повысить качество диагностики и терапии инфекционных заболеваний.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось определение способности микроорганизмов к инактивации лактоферрина и оценка биологической роли этого признака.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработать метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов.

3. Оценить биологическую роль антилактоферриновой активности микроорганизмов.

Научная новизна

Разработан метод определения антилактоферриновой активности (АЛфА) микроорганизмов, основанный на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси с помощью иммуноферментного анализа (патент РФ на изобретение № 2245923). Данный метод позволяет количественно определять АЛфА у широкого круга микроорганизмов, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, сокращает время исследования.

С помощью разработанного метода определена антилактоферриновая активность у стафилококков, стрептококков, энтеробактерий, франциселл, дрож-жеподобных грибов, выделенных из различных биотопов организма человека в норме и при инфекционных заболеваниях. Более половины (60-80%) исследуемых культур микроорганизмов обладали способностью инактивировать лакто-феррин. Установлено, что выраженность и распространенность АЛфА зависит от источника выделения микроорганизмов и формы инфекционного процесса. Высокие значения АЛфА бактерий были выявлены у культур, изолированных из биотопов с высоким содержанием лактоферрина (репродуктивный тракт), а также при хронических воспалительных заболеваниях и от бактерионосителей.

На модели экспериментальной стафилококковой инфекции определена роль антилактоферринового признака бактерий в феномене их персистенции - длительного переживания возбудителя в организме хозяина. При инфицировании лабораторных животных изогенными клонами Staphylococcus aureus, отличающимися по АЛфА, отмечены более длительные сроки бактериовыделения стафилококков, обладающих данной активностью. Отмечено, что клон с АЛфА вызывает деструктивные изменения в почечной ткани мышей. Определены особенности взаимодействия клонов кишечной палочки, обладающих разным уровнем АЛфА, с клетками организма хозяина. Показано, что микроорганизмы с антилактоферриновой активностью подавляют регенераторные потенции тканей макроорганизма, вызывают деструктивные изменения, что характеризует антилактоферриновый признак как «малый» фактор патогенности.

Выявлено, что система «лактоферрин хозяина - антилактоферриновая активность микроорганизмов» имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования бактерионосительства. Высокий уровень АЛфА сальмонелл и сниженная концентрация лактоферрина в кишечнике в разгар заболевания обуславливают развитие реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства (патент РФ № 2242756).

Научно-практическая ценность

Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах патогенных и условно-патогенных бактерий, способствуют расшифровке патогенеза инфекционных заболеваний, что используется в процессе преподавания раздела «Инфекция и иммунитет» курса медицинской микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии.

Разработанный метод также может быть использован для прогнозирования течения инфекционного процесса (в частности, прогнозирования реконва-лесцентного сальмонеллезного бактерионосительства), оценки эффективности терапии гнойно-воспалительных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

2. Антилактоферриновая активность микроорганизмов является одним из факторов персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

- региональной конференции молодых ученых и специалистов (Оренбург, 2001; 2003; 2005);

- I Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003);

IV Всероссийской конференции по персистенции микроорганизмов (Оренбург, 2003);

- Всероссийской конференции «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003);

- научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (Санкт-Петербург, 2004);

- научно-практической конференции по медицинской микологии (VII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2004);

- VII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2005).

Диссертационное исследование является фрагментом научноисследовательской работы, проводимой в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект «Разработка новых подходов к диагностике и терапии дисбиозов и ассоциированной с ними инфекционно-воспалительной патологии»), проекта «Антилактоферриновая активность микроорганизмов» (грант РФФИ № 04-04-96162) и темы «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека» (№ гос. регистрации 01.2.00 104756).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе: 3 публикации в рецензируемых научных журналах, 2 патента РФ на изобретение, пособие для врачей МЗ РФ.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, приложения. Указатель литературы содержит 262 источника литературы, из которых 62 отечественных и 200 зарубежных. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 24 рисунками. Диссертация содержит 6 приложений.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Валышева, Ирина Викторовна

104 ВЫВОДЫ

1. Разработан иммуноферментный метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов, основанный на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси, который позволяет в короткие сроки, с высокой точностью, количественно определять АЛфА у микроорганизмов различных групп.

2. Установлена высокая частота встречаемости антилактоферринового признака у бактерий, выделенных из биотопов организма человека в норме и при инфекционных процессах. Высокие значения АЛфА характерны для культур, выделенных из биотопа с высокой концентрацией лактоферрина (репродуктивный тракт женщин), по сравнению со штаммами, выделенными из кишечника и со слизистой носовой полости.

3. Обнаружена антилактоферриновая активность грибов видов Candida albicans и Rhodotorula mucilaginosa. Представители обоих таксонов характеризовались высокими показателями пенетрантности и экспрессии АЛфА.

8. Выявлено, что система «лактоферрин хозяина - антилактоферриновая активность микроорганизмов» имеет диагностическое значение и может быть использована для прогнозирования бактерионосительства. Высокий уровень АЛфА сальмонелл и сниженная концентрация лактоферрина в кишечнике в разгар заболевания обуславливают развитие реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства.

106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лактоферрин - железосвязывающий гликопротеин, участвующий в поддержании гомеостаза макроорганизма. ЛФ содержится в большинстве экзок-ринных секретов, а также во вторичных гранулах зрелых нейтрофилов. Данный гликопротеин играет роль в регуляции системы иммунитета, участвует в регуляции гемопоэза, обладает противовоспалительной активностью [98]. Одной из важнейших функций лактоферрина является антимикробный эффект. Известно о бактерицидном действии гликопротеина в отношении многих грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий, грибов, простейших, вирусов. В процессе адаптации к условиям макроорганизма бактерии приобрели способность инактивировать лактоферрин, то есть проявлять антилактоферриновую активность (АЛфА).

Целью настоящего исследования являлось определение способности микроорганизмов к инактивации лактоферрина и оценка биологической роли этого признака. Для решения этой цели был разработан метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов, основанный на определении остаточного количества лактоферрина в инкубационной смеси с помощью иммуно-ферментного анализа; определена распространенность и выраженность АЛфА у различных групп микроорганизмов; на модели экспериментальной инфекции определена биологическая роль антилактоферриновой активности; установлено значение АЛфА в клинико-бактериологической практике.

Работа выполнена на 368 штаммах микроорганизмов различных групп (стафилококки, стрептококки, энтеробактерии, франциселлы, грибы). Использовались общепринятые методы выделения и идентификации бактерий (Биргер, 1982). Факторы персистенции микроорганизмов выявляли по методикам О. В. Бухарина с соавт. (1999). Материалы, полученные в результате экспериментальных исследований, были статистически обработаны (Г. Ф. Лакин, 1990).

Для определения антилактоферриновой активности микроорганизмов разработан метод с применением иммуноферментного анализа (патент РФ на изобретение № 2245923). Исследуемые культуры микроорганизмов выращивали на плотной питательной среде. Из выросшей культуры готовили микробную взвесь, смешивали ее с раствором лактоферрина. Параллельно готовили контроль, при этом в контроль вместо микробной взвеси добавляли жидкую питательную среду. После инкубации опытной и контрольной проб при 37°С в течение 18-24 ч отделяли центрифугированием супернатант. Концентрацию лактоферрина в супернатанте опытной и контрольной проб определяли иммуно-ферментным анализом. Антилактоферриновую активность рассчитывали по разнице концентраций остаточного количества лактоферрина в контроле и опыте.

В отличие от ранее разработанного способа определения АЛфА (патент РФ на изобретение № 2156807), новый метод позволяет не только качественно выявлять данный признак, но и количественно выражать уровень антилактоферриновой активности микроорганизмов. Кроме того, инкубация живых культур микроорганизмов, а не их супернатантов, с лактоферрином значительно повышает частоту выявления АЛфА бактерий, поскольку в первом случае могут быть обнаружены как конститутивные, так и индуцибельные ингибиторы лактоферрина. Отказ от использования живой тест-культуры Micrococcus luteus позволяет определять АЛфА у штаммов микроорганизмов, продуцирующих лизо-цим, [11], гистоноподобные белки, перекись водорода и другие антагонистически активные вещества многих микроорганизмов (бифидобактерий, лактобацилл, стрептококков, синегнойной палочки [2] и др.). Применение иммунофер-ментного анализа приводит к повышению чувствительности и специфичности метода [53].

Используя разработанный метод, была определена антилактоферриновая активность микроорганизмов различных групп. Исследование распространенности и выраженности изучаемого признака показало, что оба параметра определяются источником выделения микроорганизма и формой течения инфекционного процесса.

Зависимость пенетрантности и экспрессии АЛфА от источника выделения микроорганизмов обусловлена, по-видимому, содержанием лактоферрина в биотопе. Известно, что концентрация лактоферрина во влагалище здоровых женщин составляет до 106 нг/мл, в носовом секрете - до 105 нг/мл [15], а в ко-профильтратах, полученных от здоровых людей, - 2x10 нг/мл (патент РФ № 2242756). Сравнение уровня экспрессии антилактоферринового признака показало, что у микроорганизмов, выделенных из нижних отделов репродуктивного тракта женщин, АЛфА достигает более высоких значений по сравнению с кишечником и слизистой оболочкой носовой полости. Вероятно, высокий уровень персистентных характеристик микроорганизмов, в частности антилактоферриновая активность, позволяет бактериям адаптироваться, длительно находиться в биотопе с высоким уровнем лактоферрина.

По данным проведенных исследований, при хроническом течении гнойно-воспалительных заболеваний АЛфА микроорганизмов достигает наиболее высоких значений, по сравнению с острым течением. Данный факт свидетельствует, что АЛфА микроорганизмов способствует длительному нахождению бактерий в организме хозяина. Полученные результаты согласуются с опубликованными ранее данными в отношении факторов персистенции - антилизоцимной активности [55, 36, 13], «антиинтерфероновой» активности [10].

На следующем этапе была рассмотрена связь изучаемого признака с некоторыми биологическими свойствами микроорганизмов. В ходе исследований не выявлено связи между АЛфА микроорганизмов и факторами персистенции, такими как антилизоцимная и антикомплементарная активность, что согласуется с литературными данными (ранее было показано отсутствие связи между антилизоцимной и антикомплементарной активностями [7]). Учитывая, что инактивация факторов естественной резистентности хозяина может быть обусловлена продукцией микроорганизмами протеаз [90], была предпринята попытка расшифровать механизм инактивации бактериями лактоферрина. Выявлена зависимость между наличием у стафилококков казеинолитической активности и АЛфА. Помимо штаммов S. aureus, продуцирующих казеинолитические ферменты, в опыт взяли штаммы S. enteritidis, так как микроорганизмы продуцируют многие другие протеазы. В эксперименте на 10 штаммах S. aureus и 20 штаммах S. enteritidis показано, что добавление к взвеси исследуемой культуры бактерий ингибиторов сериновых протеаз (EDTA, PMSF) снижает АЛфА микроорганизмов в несколько раз. Эти данные могут объяснить один из вероятных механизмов инактивации бактериями лактоферрина - протеолиз. Из данных литературы известно, что с экспрессией сериновых протеаз связана патогенность, проявление вирулентности грамотрицательных микроорганизмов [6]. Поскольку факторы персистенции являются «малыми» факторами патогенности [38], подтверждается возможность участия сериновых протеаз микроорганизмов в инактивации лактоферрина. Полученные факты согласуются с данными De Lillo A. et al. (1999), которые указывают на наличие у некоторых анаэробных бактерий (P. gingivalis, P. intermedia, P. nigrescens) способности связывать и разрушать лактоферрин. При этом, добавление в смесь «бактерия-лактоферрин» ингибиторов протеаз (EDTA, PMSF) останавливает разрушение гликопротеина, что говорит о протеолитической природе деградации лактоферрина. Подобные исследования проведены Alugupalli и Kalfas (1996), которые показали, что Porphyromonas gingivalis и Capnocytophaga sputigena интенсивно деградируют ЛФ, более слабо - Capnocytophaga ochracea, Actinobacillus actinomycetemcomitans и Prevotella intermedia.

Для определения биологической роли антилактоферриновой активности микроорганизмов использовали модели экспериментальной инфекции и клини-ко-бактериологическое исследование.

При проведении стафилококковой инфекции установлено, что течение экспериментального инфекционного процесса зависит от начального уровня АЛфА клона S. aureus. Показано, что при инфицировании клоном «АЛфА -» с течением времени снижается массивность обсеменения стафилококками почек животных, что приводит к полному освобождению организма от возбудителей к 42 суткам. Распространенность и выраженность антилактоферриновой активности клона «АЛфА -» характеризуются низкими значениями; в период, предшествующий окончанию бактериовыделения, признак не регистрируется. Данное течение инфекционного процесса подобно краткосрочному бактерионосительству и заканчивается элиминацией возбудителя из макроорганизма (Бонда-ренко и др., 1991).

Экспериментальный инфекционный процесс, вызванный клоном S. aureus с антилактоферриновой активностью («АЛфА +»), носит затяжной характер. Клон длительно высевается из почечной ткани мышей, микробная обсеменен-ность почек мышей постоянно находится на высоком уровне. Распространенность АЛфА в популяциях данного клона в течение экспериментальной инфекции составляет 90 - 100%. Клон изначально характеризуется гетерогенностью популяций по антилактоферриновому признаку. Гетерогенность популяций возрастает в ходе инфекционного процесса, в субпопуляциях преобладают клоны с уровнем признака более 20 нг/мл. Неоднородность популяционного состава клона золотистого стафилококка по АЛфА, вероятно, представляет своеобразный резерв для изменчивости под влиянием факторов естественной резистентности организма, что согласуется с данными по антилизоцимной активности шигелл [14], стафилококков [60]. Наличие высокого уровня антилактоферриновой активности у возбудителя позволяет ему длительно находиться в макроорганизме. Таким образом, АЛфА микроорганизмов вносит свой вклад в пер-систентный потенциал бактерий. Полученные в ходе экспериментального инфекционного процесса результаты согласуются с данными, опубликованными ранее в отношении АЛА [60], АКА [7].

На 7 сутки после инфицирования проведено гистологическое исследование паренхиматозных и стромальных элементов почек экспериментальных животных двух сравниваемых групп (инфицированных клоном S. aureus «АЛфА -» и клоном «АЛфА +»). Показано, что при инфицировании клонами S. aureus (независимо от уровня АЛфА клона) формировались множественные очаги деструктивных изменений паренхиматозных и стромальных элементов почки на фоне выраженного геморрагического отека. Полученные данные согласуются с работами ряда авторов при исследовании структурных изменений в почечной ткани при экспериментальной стафилококковой инфекции (Танцюра Е.М., 1973; Боткина Е. М., 1975; Тепляков В.Г., 1987). Показано, что введение в организм экспериментальных животных клона S. aureus, обладающего антилактоферриновой активностью, приводит к более выраженным деструктивным изменениям, определяя течение воспалительного процесса. Из данных литературы известно, что наличие факторов персистенции у возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний обуславливает утяжеление течения заболевания [4, 36, 61]. Не исключено, что тяжесть течения заболевания обусловлена деструктивными изменениями клеток макроорганизма под воздействием возбудителя, обладающего персистентным потенциалом, что, по-видимому, позволяет оценивать АЛфА микроорганизмов в качестве «малого» фактора патогенности.

На модели экспериментальной инфекции при интратрахеальном заражении крыс изогенными клонами штамма Е. coli показаны различия в действии бактерий, отличающихся по уровню антилактоферринового признака, на клетки макроорганизма. Было показано, что клоны энтеробактерий, обладающие высокими значениями признака, длительное время находятся в респираторном тракте, вызывают деструктивные изменения структурных элементов дыхательной системы, подавляют регенерацию тканей макроорганизма.

Известно, что активация репаративных гистогенезов проходит при участии нейрогормонов задней доли гипофиза (окситоцин и вазопрессин) [48]. Помимо этого, нейрогормоны оказывают антимикробный эффект в отношении ряда микроорганизмов (S. aureus, S. epidermidis, Е. coli, P. aeruginosa, В. subtilis) [9], способны стимулировать фагоцитоз. Вероятно, наблюдаемое при введении клона «АЛфА +» подавление регенераторных потенций тканей макроорганизма может быть связано с ингибированием высвобождения нейрогормонов из ней-росектреторных клеток.

Поскольку установлено, что антилактоферриновый признак микроорганизмов является одним из факторов персистенции, данные знания представляется возможным использовать клинико-лабораторной практике.

Известно, что определение факторов персистенции микроорганизмов можно использовать для прогнозирования исхода инфекционного процесса [40]. Анализ взаимодействий в системе «лактоферрин хозяина - антилактоферриновая активность микроорганизмов» показал, что содержание гликопротеина в биотопе и уровень факторов персистенции (АЛфА) бактерий имеют диагностическое значение и могут быть использованы для прогнозирования бактерионосительства.

Целесообразность использования антилактоферриновой активности микроорганизмов для прогнозирования реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства обусловлена несколькими причинами. Во-первых, во многих предложенных ранее способах не учитываются биологические свойства сальмонелл, от которых во многом зависит характер течения и исход инфекционного процесса [41]. Во-вторых, способы прогнозирования сальмонеллезного бактерионосительства, учитывающие динамику нарастания антител [52], снижение индекса литической активности сыворотки [34] и мононуклеарного индекса [37] становятся информативными только с 3-4 недели заболевания. Несомненно, при прогнозировании бактерионосительства важным является учет персистентных характеристик микроорганизмов.

В антимикробной защите слизистой оболочки кишечника, препятствующей развитию реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства, участвует, наряду с другими бактерицидными белками, лактоферрин [24]. При нарушениях в системе неспецифической защиты организма от инфекции концентрация лактоферрина в кишечнике может снижаться.

Анализ данных показал, что при значениях антилактоферриновой активности возбудителя 7,8-13,0 нг/мл и содержании лактоферрина в копрофильтра-те больного сальмонеллезом в количестве 460-1400 нг/мл развивается сальмо-неллезное бактерионосительство. Полученные данные легли в основу разработанного «Способа прогнозирования реконвалесцентного сальмонеллезного бактерионосительства» (патент РФ № 2242756).

Роль АЛфА, как фактора персистенции, позволяет оценить и эффективность терапии инфекционных заболеваний, поскольку снижение персистентно-го потенциала бактерий способствует их скорейшей элиминации из макроорганизма [10]. Полученные материалы использованы в пособии для врачей МЗ РФ «Прогнозирование тяжести течения и местное лечение острых ограниченных гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры» (Оренбург, 2003).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Валышева, Ирина Викторовна, Оренбург

1. Аникина Т. А. Методика воспроизведения у мышей хронического осум-кованного стафилококкоза глубоколежащих тканей / Т. А. Аникина // Журн. Микробиол. 1975. - № 5. - С. 119-123.

2. Беляков В. Д. Псевдомонады и псевдомонозы / В. Д. Беляков, Л. А. Ря-пис, В. И. Илюхин // М.: Медицина. 1990. - 224с.

3. Бигон М. Экология. Особи, популяции и сообщества / М. Бигон, Дж. Харпер, К. Таусенд // М.: Мир. 1989. - Т. 2. - С. 118-121.

4. Биологические свойства микроорганизмов как основа прогнозирования тяжести гнойно-воспалительных заболеваний легких и плевры / О. М. Абрамзон, О. Л. Карташова, А. В. Валышев и др. // Журн. Микробиол. -2004. №3. - С. 7-10. ISSN 0372-9311.

5. Бондаренко В. М. Динамика формирования инфекционного очага в кишечнике / В. М. Бондаренко, В. П. Жалко-Титаренко // Журн. Микробиол. 1991.-№ 8. - С. 23-27.

6. Бондаренко В. М. Сериновые протеазы грамотрицательных бактерий: структура, механизмы секреции, биологическая активность / В. М. Бондаренко, А. Р. Мавзютов, О. В. Агапова // Журн. Микробиол. 2002. -№6.-С. 80-85. ISSN0372-9311.

7. Брудастов Ю. А. Антикомплементарная активность микроорганизмов. / Ю. А. Брудастов // Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск. - 1992.

8. Бугланов А. А. Метаболизм железа и металлопротеиды (обзор) / А. А. Бугланов // Вопросы медицинской химии. 1988. - № 3. - С. 2-7.

9. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий / О. В. Бухарин // М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН. 1999. - 370 с.

10. Бухарин О.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине / О. В. Бухарин,

11. H. В. Васильев // Томск. 1974. - С. 44-50.

12. Вельтищев Ю. Е. Биологически активные факторы грудного молока / Ю. Е. Вельтищев, Р. М. Харькова // Вопр. Охраны материнства и детства. — 1991. Т. 36, № 6. - С. 48-53. - ISSN 0042-8825.

13. Воронина Л. Г. Совершенствование диагностики, прогнозирования и лечения гонореи под контролем антилизоцимного признака гонококков / Л. Г. Воронина// Автореф. дис. . докт. мед. наук. М. - 1998.

14. Герасимов В. Е. Биологическое значение антилизоцимной активности шигелл / В. Е. Герасимов // В сб. Персистенция микроорганизмов. Куйбышев: КМИ. - 1987. - С. 60-68.

15. Герман Г. П. Иммунохимическое определение лактоферрина человека / Г. П. Герман, Н. В. Лаврова, Л. А. Шерер // Журн. микробиол. 1983. - № 9. -С. 17-20.

16. Дворецкий Л. И. Изучение содержания лактоферрина в бронхиальном содержимом у больных хроническим бронхитом / Л. И. Дворецкий, Н. А. Дидковский, Г. Чарлыев // Здравоохранение Туркменистана. 1985. - № 10.-С. 15-18.

17. Действие лактопероксидазы, лактоферрина и лактоглобулина на Shigella sonnei в эксперименте in vivo / И. И. Денисова, Т. Я. Геннадьева, Т. В. Жданова и др. // Журн. Микробиол. 1996. - №1. - С. 66-69. - ISSN 03729311.

18. Дюгеев А. Н. Структура и функции человеческого лактоферрина; перспективы изучения в акушерстве / А. Н. Дюгеев, А. Н. Шипулин // Акушерство и гинекология. -1991. № 1. - С. 6-8.

19. Железозависимые микобактерии / А. Л. Лазовская, 3. Г. Воробьева, Л. В. Смирнова, Т. В. Гончарова // Успехи соврем, биологии. 1991. - Т. III, №1.-С. 101-107.- ISSN 0042-1324.

20. Ивановская Т. Е. Патологическая анатомия болезней плода и ребенка / Т. Е. Ивановская, Л. В. Леонова // М.: Медицина. 1989. - С. 3-45.

21. Иммуноферментный метод определения лактоферрина / Т. В. Конышева, О. Ф. Лыкова, С. В. Архипова и др. // Клиническая и лабораторная диагностика. 1998. - № 4. - С. 33-34.

22. Иммуноферментный метод определения лактоферрина человека и его использование для диагностики гнойно-септических осложнений / Е. Р. Немцова, Л. М. Иванова, Р. И. Якубовская и др. // Вопросы медицинской химии. 1995. - Т. 41, № 3. - С. 58-61.

23. Иммунногистохимическое выявление лактоферрина женского молока в тканях взростлого человека и плода / Н. И. Казачкина, И. Д. Коханова, С. Е. Егорова и др. // Архив анат. 1988. - № 5. - С. 19-23. ISSN 0004-1947.

24. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения / В. Н. Кокряков // Санкт-Петербург. 1999. - С. 65-66.

25. Конь И. Я. Биологическая роль лактоферрина и его значение в питании детей раннего возраста / И. Я. Конь, К. С. Ладодо // Педиатрия. 1992. -№2.-С. 91-93.

26. Кэбот Е. Экспериментальная иммунохимия / Е. Кэбот, М. Мейер // М.: Мир.- 1968.-С. 140-246.

27. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин // М.: Высшая школа, 1990. 288 с.

28. Меркулов А. Г. Количественное иммуноферментное определение лактоферрина в сыворотке и плазме крови / А. Г. Меркулов, О. П. Шевченко // Вопросы медицинской химии. 1989. - № 6. - С. 125-128.

29. Мирисмаилов М. М. Клиническое течение и способы лечения сальмонел-лезной инфекции у детей / М. М. Мирисмаилов, Р. А. Рашидова, А. Г. Ва-лиев // Журн. Микробиол. 2002. - №6. - С. 69-72. ISSN 0372-9311.

30. Немцова Е. Р. Иммунохимическое сравнение лактоферрина женского молока и лактоферрина нейтрофилов / Е. Р. Немцова, М. М. Уткин, Р. И. Якубовская//Вопросы медицинской химии. 1988. - № 3. - С. 127-131.

31. Никитин В. М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов / В. М. Никитин // Кишинев: Картя молдовеняскэ. 1986. - 235 с.

32. Николаева Н.Г. Показатели литической активности сыворотки крови больных брюшным тифом, хронических бактерионосителей и больных сальмонеллезом / Н.Г. Николаева // Второй Всесоюзный съезд инфекционистов. Ташкент. - 1985. - С.23-24.

33. Патологоморфологические изменения в печени и почках при экспериментальной стафилококковой инфекции / Е. М. Танцюра, П. Н. Гудзенко, Л. М. Синчук, Н. И. Мринская // Врач. Дело. 1973. - № 11. - С. 80-84.

34. Первушина Л.А. Антилизоцимный признак микроорганизмов в бактериологической диагностике и лечении воспалительных заболеваний внутренних женских половых органов / Л. А. Первушина // Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск. - 1990.

35. Перекопская Т.Н. Определение мононуклеарного индекса у больных ОКИЗ с целью прогнозирования продолжающегося бактериовыделения / Т. И. Перекопская, В. В. Колмогорцева //Второй Всесоюзный съезд инфекционистов. Ташкент. - 1985. - С. 375-376.

36. Петровская В. Г. Общие закономерности взаимодействия систем паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций / В. Г. Петровская // Журн. Микробиол. 1982. - №8. - С. 24-31.

37. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериозакишечника / Н. М. Грачева, Г.И. Гончарова, А.А. Аваков и др. // Методические рекомендации. М. - 1986. - 23 с.

38. Прусс В.Ф. Антилизоцимная активность шигелл и ее значение в формировании реконвалесцентного бактерионосительства при дизентерии / В.Ф. Прусс // Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск.

39. Ш©$фсая Е.С. Свободные и связанные в иммунном комплексе копроан-титела при сальмонеллезе и их диагностическое и прогностическое значение / Е. С. Пясецкая // Дис. . канд. мед. наук. Ленинград. - 1986. -156 с.

40. Семенов Д. В. Взаимодействие лактоферрина молока человека с АТР / Д. В. Семенов, Т. Г. Канышкова, А. М. Акимжанов // Биохимия. 1998. - Т. 63, № 8. - С. 1107-1115. - ISSN 0320-9725.

41. Система автоматизированного хемотаксономического обнаружения сальмонелл и других патогенных бактерий / В. М. Бонаренко, А. Т. Лат-кин, Г. Д. Комаров и др. // Журн. Микробиол. 1999. - №6. - С. 8-13. ISSN 0372-9311.

42. Способ определения антилактоферриновой активности микроорганизмов / О. В. Бухарин, А. В. Валышев, Т. В. Харитонова и др. // Патент РФ на изобретение № 2156807, Бюл. № ., 2000 г.

43. Способ определения колонизационной резистентности экологической ниши тела человека / О. В. Бухарин, Т. М. Забирова, К. Л. Чертков и др. // Патент РФ на изобретение № 2175673, Бюл. № 31, 2001 г.

44. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М. О. Биргера // М.: Медицина. 1982. - 464 с.

45. Сравнительная характеристика некоторых экспериментальных моделей стафилококковой инфекции / С. А. Анатолий, И. И. Антоновская, С. Я. Таек, Е.М. Падерина // Журн. Микробиол. 1971. - № 9. - С. 60-63.

46. Стадников А. А. Роль гипоталамических нейропептидов во взаимодействиях про- и эукариот: структурно-функциональные аспекты / А. А. Стадников // Екатеринбург: УрО РАН. 2001. - 244 с. ISBN5-7691-1195-Х.

47. Структурные изменения в почечной ткани при экспериментальной стафилококковой септикопиемии / У. М. Боткина, С. Н. Кутчак, JL Ф. Сте-баева, J1. Д. Шипилова // Антибиотики. 1981. - № 8. - С. 623-628. ISSN 0003-5637.

48. Сухарев А.Е. Уровень сывороточного лактоферрина в норме и при патологии / А. Е. Сухарев, А. А. Николаев, М. Ю. Васильев // Вопросы медицинской химии. 1990. - т. 36, №3. - С. 81-83.

49. Сухарев А. Е. Лактоферрин и лейкоциты крови у онкологических больных / А. Е. Сухарев, А. А. Николаев, М. Ю. Васильев // Лабораторное дело. 1990. - № 8. - С. 33-35.

50. Тендетник Ю.Я. Серологический метод диагностики различных форм сальмонеллезного бактерионосительства / Ю. Я. Тендетник, Н. Д. Ющук, В. В. Трушина // Акт. вопр. эпидемиологии и инфек. болезней. Вып.5, Ч.1.-М. - 1975.-С.74-77.

51. Теория и практика иммуноферментного анализа / А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, Е. М. Гаврилова // М.: Высш. Шк. 1991. - 288 с.

52. Тепляков В. Г. Морфологические изменения внутренних органов при экспериментальном стафилококковом сепсисе / В. Г. Тепляков, М. Л. Шимкевич // Архив Патол. 1987. - № 2. - С. 32-37. ISSN 0004-1955.

53. Фадеев С.Б. Видовой состав и персистентные характеристики возбудителей хирургической инфекции мягких тканей / С.Б. Фадеев // Автореф. дис. . канд. мед. наук. Оренбург. - 1998.

54. Фельдман Ю. М. Количественное определение бактерий в клинических материалах / Ю. М. Фельдман, // Лаб. дело. 1984. - № 10. - С. 616-619.

55. Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов / О. В. Бухарин, А. В. Валышев, Н. Н. Елагина и др. // Журн. Микробиол. 1997. - № 4. - С. 117-120. ISSN 0372-9311.

56. Халяпин Б.Д. Кинетический метод количественного определения комплемента / Б.Д. Халяпин, А.А. Прокопьев // Иммунология. 1986. - № 3. -С. 60-66.

57. Чайникова И. Н. Иммунологические показатели при сальмонеллезной инфекции в эксперименте и клинике / И. Н. Чайникова // В кн.: Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии. Оренбург. - 2000. - С. 8894.

58. Шеенков Н. В. Роль антилизоцимной активности бактерий в развитии инфекционного процесса / Н.В. Шеенков // Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Челябинск. - 1993.

59. Швецов С. А. Клиническое значение персистентных характеристик аэробной условно-патогенной микрофлоры у больных холециститом / С. А. Швецов //Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Пермью - 1994.

60. Яковлев А. М. Роль железо- и медьсвязывающих белков в резистентности к инфекции / А. М. Яковлев, В. В. Туркин, Т. В. Толмазова // Журн. Микробиол. 1988. - № 10. - С. 75-78.

61. A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development / P. K. Singh, M. R. Parsek, E. P. Greenberg, M. J. Welsh // Nature. 2002. - Vol. 417, No 6888.-P. 552-555.

62. A helical region on human lactoferrin. Its role in antibacterial pathogenesis / D. S. Chappie, C. L. Joannou, D. J. Mason et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. -V. 443. - P. 215-220.

63. A review: the active peptide of lactoferrin / M. Tomita, M. Takase, W. Bellamy, S. Shimamura // Acta. Paediatr. Jpn. 1994. - Vol. 36, No 5. - P. 585-591.

64. Abe S. Host defense mechanisms against fungal infections / S. Abe, H. Yamaguchi // Nippon. Ishinkin. Gakkai. Zasshi. 2000. - V. 41, No 2. - P. 7767. gdugupalli K. R. Degradation of lactoferrin by periodontitis-associated bacteria

65. K. R. Alugupalli, S. Kalfas // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol. 145, No 2.-P. 209-214.

66. Andersen J.H. Lactoferrin and lactoferricin inhibit Herpes simplex 1 and 2 infection and exhibit synergy when combined with acyclovir / J. H. Andersen, H. Jenssen, T. J. Gutteberg // Antiviral. Res. 2003. - V. 58, No 3. - P. 209-215.

67. Antibacterial activity of bovine lactoferrin and its peptides against entero-haemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 / K. Shin, K. Yamauchi, S. Teraguchi et al. // Lett. Appl. Microbiol. 1998. - V. 26, No 6. - P. 407-411.

68. Antibacterial activity of multiple antigen peptides homologous to a loop region in human lactoferrin / M. Azuma, T. Kojima, I. Yokoyama // J. Pept. Res. -1999. V. 54, No 3. - P. 237-241.

69. Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment / K. Yamauchi, M. Tomita, T. J. Giehl, R. T. 3rd Ellison // Infect. Immun. 1993. - V. 61, No 2. - P. 719-728.

70. Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human lactoferrin / E. W. Odell, R. Sarra, M. Foxworthy et al. // FEBS Lett. 1996. -V. 382, No 1-2.-P. 175-178.

71. Antibacterial effects of lactoferricin В / L. H. Vorland, H. Ulvatne, J. Andersen et al. // Scand. J. Infect. Dis. 1999. - V. 31, No 2. - P. 179-184.

72. Antibacterial spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin / W. Bellamy, M. Takase, H. Wakabayashi et al. // J. Appl. Bacterid. 1992. - V. 73, No 6. - P. 472-479.

73. Anti-Candida activity of calprotectin in combination with neutrophils or lactoferrin / T. Okutomi, T. Tanaka, S. Yui et al. // Microbiol. Immunol. 1998. -Vol. 42, No 11.-P. 789-793.

74. Anti-HSV activity of lactoferrin and lactoferricin is dependent on the presence of heparan sulphate at the cell surface / J.H. Andersen, H. Jenssen, K. Sandvik, T.J. Gutteberg // J. Med. Virol. 2004. - V. 74, No 2. - P. 262-271.

75. Antirotaviral activity of milk proteins: lactoferrin prevents rotavirus infection in the enterocyte-like cell line HT-29 / F. Superti, M. G. Ammendolia, P. Valenti et al. // Med. Microbiol. Immunol. (Berl). 1997. - V. 186, No 2-3. - P. 83-91.

76. Antiviral effect of bovine lactoferrin saturated with metal ions on early steps of human immunodeficiency virus type 1 infection / P. Puddu, P. Borghi, S. Ges-sani // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1998. - V. 30, No 9. - P. 1055-1062.

77. Arnold R.R. A bactericidal effect for human lactoferrin / R. R. Arnold, M. F. Cole, J. R. McGhee // Science. 1977. - V. 197, No 4300. - P. 263-265. -ISSN 0036-8075.

78. Arnold R. R. Bactericidal activity of human lactoferrin: sensitivity of a variety of microorganisms / R. R. Arnold, M. Brewer, J. J. Gauthier // Infect. Immun. -1980. Vol. 28, No 3. - P. 893-898.

79. Augmented inhibition of growth of Candida albicans by neutrophils in the presence of lactoferrin / T. Okutomi, S. Abe, S. Tansho et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997. - V. 18, No 2. - P. 105-112.

80. Bacteriostatic effect of orally administered bovine lactoferrin on proliferation of Clostridium species in the gut of mice fed bovine milk / S. Teraguchi, K. Shin, K. Ozawa et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61, No 2.-P. 501-506.

81. Bagby G. C. Feed-back regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production / G. C. Bagby, R. M. Bennet // Blood. 1982. - Vol. 60. - P. 108-112.

82. Bezkorovainy A. The effect of metal chelators and other metabolic inhibitors on the growth of Bifidobacterium bifidus var. Pennsylvanicus / A.

83. Bezkorovainy, N. Topouzian // Clin. Biochem. 1981. - V. 14, No 3. - P. 135141.

84. Bhimani R.S. Influence of lactoferrin feeding and injection against systemic staphylococcal infections in mice / R. S. Bhimani, Y. Vendrov, P. Furmanski //J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 86, No 1. - P. 135-144.

85. Biserte J. et al. // Expos, ann. Biochem. med. 1963. - Vol. 24. - P. 85.

86. Binding and degradation of lactoferrin by Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens / A. de Lillo, R. Teanpaisan, J. F. Fierro, C. W. Douglas // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 14, No 2-3.-P. 135-143.

87. Booth B. A. Vibrio cholerae soluble hemagglutinin/protease is a metalloenzyme / B. A. Booth, M. Boesman-Finkelstein, R. A. Finkelstein // Infect. Immun. 1983. - Vol. 42, No 2. - P. 639-644.

88. Bortner C.A. Bactericidal effect of lactoferrin on Legionella pneumophila / C. A. Bortner, R. D. Miller, R. R. Arnold // Infect. Immun. 1986. - V. 51, No 2. -P. 373-377.

89. Both lactoferrin and iron influence aggregation and biofilm formation in Streptococcus mutans / B. Francesca, M. Ajello, P. Bosso et al. // Biometals. -2004. Vol. 17, No 3. - P. 271-278.

90. Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications / M. Tomita, H. Wakabayashi, K. Yamauchi et al. // Biochem. Cell. Biol.-2002.-Vol. 80, No l.-P. 109-112.

91. Bovine lactoferrin and Lactoferricin inhibit tumor metastasis in mice / Y. C. Yoo, S. Watanabe, R. Watanabe et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. - V. 443. -P. 285-291.

92. Bovine lactoferrin peptidic fragments involved in inhibition of herpes simplex virus type 1 infection / R. Siciliano, B. Rega, M. Marchetti et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 264, No 1. - P. 19-23.

93. Broc J. Н. Lactoferrin in human milk; its role in iron absorbtion and protection against enteric infection in the newborn infant / J. H. Broc // Arch. Dis. Childh. 1980. - No 12. - P. 353-359.

94. Brock J. Lactoferrin: a multifunctional immunoregulatory protein? / J. Brock // Immunology Today. 1995. - Vol.16, No 9. - P. 417-419.

95. Bullen J. J., Armstrong J. A. // Immunology. 1979. - Vol. 36. - P. 781-791.

96. Butrus S. I. The adherence of Pseudomonas aeruginosa to soft contact lenses / S. I. Butrus, S. A. Klotz, R. P. Misra // Ophthalmology. 1987. - V. 94, No 10.-P. 1310-1314.

97. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus / A. Lupetti, A. Paulusma-Annema, M. M. Welling et al. // Antimicrob. Agents. Chemother. 2000. - Vol. 44, No 12. - P. 3257-3263.

98. Cationic amphipathic peptides, derived from bovine and human lactoferrins, with antimicrobial activity against oral pathogens / J. Groenink, E. Walgreen-Weterings, W. van 4 Hof et al. // Microbiol. Lett. 1999. - V. 179, No 2. - P. 217-222.

99. Characterization of antiviral activity of lactoferrin against hepatitis С virus infection in human cultured cells / M. Ikeda, A. Nozaki, K. Sugiyama et al. // Virus. Res. 2000. - V. 66, No 1. - P. 51-63.

100. Characterization of lactoferrin interaction with Streptococcus mutans / M. O. Lassiter, A. L. Newsome, L. D. Sams, R. R. Arnold // J. Dent. Res. 1987. -V. 66, No 2.-P. 480-485.

101. Clarke N. M. Effect of antimicrobial factors in human milk on rhinoviruses and milk-borne cytomegalovirus in vitro / N. M. Clarke, J. T. May // J. Med. Microbiol. 2000. - V. 49, No 8. - P. 719-723.

102. Сох Т., Mazurier J., Spic С. et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - Vol. 588.-P. 120-128.

103. Custer M. C. Lactoferrin and transferrin fragments react with nitrite to form an inhibitor of Bacillus cereus spore outgrowth / M. C. Custer, J. N. Hansen // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 45, No 3. P. 942-949. - ISSN 00992240.

104. Direct detection and quantitative determination of bovine lactoferricin and lactoferrin fragments in human gastric contents by affinity mass spectrometry /

105. H. Kuwata, Т. T. Yip, C. L. Yip et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. - V. 443. - P. 23-32.

106. Dionysius D. A. Forms of lactoferrin: their antibacterial effect on enterotoxigenic Escherichia coli / D. A. Dionysius, P. A. Grieve, J. M. Milne // J. Dairy Sci. 1993. - Vol. 76, No 9. - P. 2597-2600.

107. Effect of bovine lactoferricin on enteropathogenic Yersinia adhesion and invasion in HEp-2 cells / A. M. Di Biase, A. Tinari, A. Pietrantoni et al. // J. Med. Microbiol. 2004. - V. 53(Pt 5). - P. 407-412.

108. Evaluation of the antimicrobial effect of lactoferrin on Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia and Prevotella nigrescens / O. Aguilera, M. T. Andres, J. Heath et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. - V. 21, No1.-P. 29-36.

109. Fowler С. E. MICs of rifampicin and chloramphenicol for mucoid Pseudomonas aeruginosa strains are lower when human lactoferrin is present / С. E. Fowler, J. S. Soothill, L. Oakes // J. Antimicrob. Chemother. 1997. - Vol. 40, No 6.-P. 877-879.

110. Free secretory component and lactoferrin of human milk inhibit the adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli / L. G. Giugliano, S. T. Ribeiro, M. H. Vainstein, C. J. Ulhoa // J. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 42, No 1. - P. 3-9.

111. Fujihara T. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type-1 (HSV-1) infection to mouse cornea / T. Fujihara, K. Hayashi // Arch. Virol. 1995. - V. 140, No 8. - P. 1469-1472.

112. Functional fragments of ingested lactoferrin are resistant to proteolytic degradation in the gastrointestinal tract of adult rats / H. Kuwata, K. Yamauchi, S. Teraguchi et al. // J. Nutr. 2001. - Vol. 131, No 8. - P. 2121-2127.

113. Fungicidal effect of three new synthetic cationic peptides against Candida albicans / H. Nikawa, H. Fukushima, S. Makihira et al. // Oral. Dis. 2004. - V. 10, No 4.-P. 221-228.

114. Gastric juice levels of lactoferrin and Helicobacter pylori infection / K. Nakao, I. Imoto, E. C. Gabazza et al. // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - V. 32, No 6. -P. 530-534.

115. Gauthier J.D. Inhibition of in vitro replication of the oyster parasite Perkinsus marinus by the natural iron chelators transferrin, lactoferrin, and desferoxamine / J. D. Gauthier, G. R. Vasta // Dev. Сотр. Immunol. 1994. - V. 18, No 4.-P. 277-286.

116. Giles S. Transferrin independent serum inhibition of Blastomyces dermatitidis / S. Giles, C. Czuprynski // Microb. Pathog. 2002. - Vol. 32, No 2. - P. 8797.

117. Growth and adsorption of Streptococcus mutans 6715-13 to hydroxy apatite in the presence of lactoferrin / P. Visca, F. Berlutti, P. Vittorioso // Med. Microbiol. Immunol. (Berl). 1989. - Vol. 178, No 2. - P. 69-79.

118. Growth inhibitory effects of bovine lactoferrin to Toxoplasma gondii parasites in murine somatic cells / T. Tanaka, Y. Omata, A. Saito et al. // J. Vet. Med. Sci. 1996. - Vol. 58, No 1. - P. 61-65.

119. Growth-promoting effects of lactoferrin on L. acidophilus and Bifidobacterium spp / W. S. Kim, M. Ohashi, T. Tanaka et al. // Biometals. 2004. - Vol. 17, No 3. - P. 279-283.

120. Hansen N. E. Plasma mieloperoxidase and lactoferrin measured by radioimmunoassay: relations to neutrophil kinetics / N. E. Hansen, J. Malmquist, J. Thorell // Acta. Med. Scand. 1975. - No 12. - P. 437-443.

121. Hase С. C. Comparison of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease and the Pseudomonas aeruginosa elastase / С. C. Hase, R. A. Finkelstein // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58, No 12. - P. 4011-4015.

122. Haug В. E. The role of tryptophan in the antibacterial activity of a 15-residue bovine lactoferricin peptide / В. E. Haug, J. S. Svendsen // J. Pept. Sci. 2001. - V. 7, No 4.-P. 190-196.

123. Henric S. The biological significance of lactoferrin in haematology / S. Henric, M. D. Birgens // Scand. J. haematol. 1984/ - V. 33. - P. 225-230.

124. Human lactoferrin and peptides derived from its N terminus are highly effective against infections with antibiotic-resistant bacteria / P. H. Nibbering, E. Ravensbergen, M. M. Welling et al. // Infect. Immun. 2001. - V. 69, No 3. -P. 1469-1476.

125. Human lactoferrin inhibits growth of solid tumors and development of experimental metastases in mice / J. Bezault, R. Bhimani, J. Wiprovnick // Cancer. Res. 1994. - V. 54, No 9. - P. 2310-2312.

126. Human milk lactoferrin inactivates two putative colonization factors expressed by Haemophilus influenzae / J. Qiu, D. R. Hendrixson, E. N. Baker et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. Vol. 95, No 21. - P. 12641-12646.

127. Human milk lactoferrin is a serine protease that cleaves Haemophilus surface proteins at arginine-rich sites / D. R. Hendrixson, J. Qiu, S. C. Shewry et al. // Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 47, No 3. - P. 607-617.

128. Identification of lactoferrin as the granulocyte-derived inhibitor of colony-stimulating activity production / H. E. Broxmeyer, A. Smithyman, R. R. Eger et al. // J. Exp. Med. 1978. - Vol. 148. - P. 1052-1067.

129. Impact of proteases on iron uptake of Pseudomonas aeruginosa pyoverdin from transferrin and lactoferrin / G. Doring, M. Pfestorf, K. Botzenhart, M. A. Ab-dallah // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, No 1. - P. 291-293.

130. Increased antibacterial activity of 15-residue murine lactoferricin derivatives / M. B. Strom, O. Rekdal, W. Stensen et al. // J. Pept. Res. 2001. - V. 57, No 2. -P. 127-139.

131. Increased levels of lactoferrin in synovial fluid but not in serum from patients with rheumatoid arthritis / D. Caccavo, G. D. Sebastiani, C. Di Monaco et al. // Int. J. Clin. Lab. Res. 1999. - V. 29, No 1. - P. 30-35.

132. Influence of infant diets on the ecology of the intestinal tract of human flora-associated mice / D. J. Hentges, W. W. Marsh, B. W. Petschow et al. // J. Pedi-atr. Gastroenterol. Nutr. 1992. - Vol. 14, No 2. - P. 146-152.

133. Inhibition with lactoferrin of in vitro infection with human herpes virus / K. Hasegawa, W. Motsuchi, S. Tanaka et al. // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1994. - V. 47, No 2. - P. 73-85.

134. Inhibition of Helicobacter pylori infection by bovine milk glycoconjugates in a BAlb/cA mouse model / X. Wang, S. Hirmo, R. Willen, T. Wadstrom // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50, No 5. - P. 430-435.

135. Inhibition of poliovirus type 1 infection by iron-, manganese- and zinc-saturated lactoferrin / M. Marchetti, F. Superti, M. G. Ammendolia // Med. Microbiol. Immunol. (Berl). 1999. - V. 187, No 4. - P. 199-204.

136. Initial binding sites of antimicrobial peptides in Staphylococcus aureus and Escherichia coli / L. H. Vorland, H. Ulvatne, O. Rekdal et al. // Scand. J. Infect. Dis. 1999. - V 31, No 5. - P. 467-473.

137. Innate immune responses in children and adults with Shigellosis / R. Raqib, S. M. Mia, F. Qadri et al. // Infect. Immun. 2000. V. 68, No 6. - P. 3620-3629.

138. Interaction of lactoferrin with Escherichia coli cells and correlation with antibacterial activity / P. Visca, C. Dalmastri, D. Verzili et al. // Med. Microbiol. Immunol. Berl. 1990. Vol. 179, No 6. - P. 323-333. - ISSN: 0300-8584.

139. Interference of the antimicrobial peptide lactoferricin В with the action of various antibiotics against Escherichia coli and Staphylococcus aureus / L. H. Vorland, S. A. Osbakk, T. Perstolen // Scand. J. Infect. Dis. 1999. - V. 31, No 2.-P. 173-177.

140. In vitro antiviral activity of lactoferrin and ribavirin upon hantavirus / M. E. Murphy, H. Kariwa, T. Mizutani et al. // Arch. Virol. 2000. - V. 145, No 8. -P. 1571-1582.

141. In vitro susceptibility of Candida species to lactoferrin / Y. Y. Xu, Y. H. Samaranayake, L. P. Samaranayake, H. Nikawa // Med. Mycol. 1999. - V. 37, No l.-P. 35-41.

142. Kalmar J. R. Killing of Actinobacillus actinomycetemcomitans by human lactoferrin / J. R. Kalmar, R. R. Arnold // Infect. Immun. 1988. - V. 56, No 10. - P. 2552-2557.

143. Kawase К. Physiological functions of lactoferrin. / K. Kawase, S. Teraguchi // Rakunoukagaku Shokuhin no Kenkyu. 1996. Vol. 45. - A75-81.

144. Killing of Candida albicans by lactoferricin B, a potent antimicrobial peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin / W. Bellamy, H. Wakabayashi, M. Takase et al. // Med. Microbiol. Immunol. 1993. - V. 182, No 2.-P. 97-105.

145. KRDS, a new peptide derived from human lactotransferrin, inhibits platelet aggregation and release reaction / E. Mazoyer, S. Levy-Toledano, F. Rendu et al. // Eur. J. Biochem. 1990. - V. 194, No 1. - P. 43-49.

146. Kulics J., Kijstra A. // Immunol. Lett. 1986/1987. - Vol. 14. - P. 349-353.

147. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the Nl-domain of bovine lactoferrin / M. I. van der Kraan, J. Groenink, K. Nazmi et al. // Peptides. -2004. V. 25, No 2. - P. 177-183.

148. Lactoferricin, a new antimicrobial peptide / E. M. Jones, A. Smart, G. J. Bloomberg et al. // Appl. Bacteriol. 1994. - V. 77, No 2. - P. 208-214.

149. Lactoferricin influences early events of Listeria monocytogenes infection in THP-1 human macrophages / C. Longhi, M. P. Conte, M. Penta et al. // J. Med. Microbiol. 2004. - V. 53, Pt. 2. - P. 87-91.

150. Lactoferrin. Antiviral activity of lactoferrin / P. J. Swart, E. M. Kuipers, C. Smit et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. - V. 443. - P. 205-213.

151. Lactoferrin and cyclic lactoferricin inhibit the entry of human cytomegalovirus into human fibroblasts / J. H. Andersen, S. A. Osbakk, L. H. Vorland et al. // Antiviral. Res.-2001. V. 51, No 2.-P. 141-149.

152. Lactoferrin can protect mice against a lethal dose of Escherichia coli in experimental infection in vivo / T. Zagulski, P. Lipinski, A. Zagulska et al. // Br. J. Exp. Pathol. 1989. V. 70, No 6. - P. 697-704. - ISSN 0007-1021.

153. Lactoferrin can supply iron for the growth of Bifidobacterium breve / R. Miller-Catchpole, E. Kot, G. Haloftis et al. // Natr. Res. 1997. - Vol. 17. - P. 205-213.

154. Lactoferrin concentration in milk of bovine clinical mastitis / K, Kawai, S.

155. Lactoferrin is responsible for the fungistatic effect of human milk / Y. Anders-son, S. Lindquist, C. Lagerqvist et al. // Early. Hum. Dev. 2000. - V. 59, No 2.-P. 95-105.

156. Lactoferrin markedly inhibits hepatitis С virus infection in cultured human hepatocytes / M. Ikeda, K. Sugiyama, T. Tanaka et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - V. 245, No 2. - P. 549-553.

157. Lactoferricin of bovine origin is more active than lactoferricins of human, murine and caprine origin / L. H. Vorland, H. Ulvatne, J. Andersen // Scand. J. Infect. Dis. 1998. - V. 30, No 5. - P. 513-517.

158. Lactoferrin / R. Iuliano, P. Piantino, G. F. Tapperoet al. // Minerva-Med. -1991. V. 82, No 12. - P. 799-805.

159. Lactoferrin given in food facilitates dermatophytosis cure in guinea pig models / H. Wakabayashi, K. Uchida, K. Yamauchi et al. // J. Antimicrob. Chemother. 2000. - Vol. 46, No 4. - P. 595-602.

160. Lactoferrin inhibits hepatitis С virus viremia in patients with chronic hepatitis C: a pilot study / K. Tanaka, M. Ikeda, A. Nozaki // Jpn. J. Cancer. Res. -1999. V. 90, No 4. - P. 367-371.

161. Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type 1 adsorption to Vero cells / M. Marchetti, C. Longhi, M. P. Conte // Antiviral. Res. 1996. - V. 29, No 2-3. - P. 221-231.

162. Lactoferrin in infant formulas: effect on oxidation / M. T. Satue-Gracia, E. N. Frankel, N. Rangavajhyala et al. // J. Agric. Food. Chem. 2000. - V. 48, No 10. - P. 4984-4990.

163. Lactoferrin-binding proteins in Bifidobacterium bifidum / W. S. Kim, T. Tanaka, H. Kumura, K. Shimazaki // Biochem. Cell Biol. 2002. - Vol. 80, No 1.-P. 91-94.

164. Leitch E. C. Lactoferrin increases the susceptibility of S. epidermidis biofilms to lysozyme and vancomycin / E. C. Leitch, M. D. Willcox // Curr. Eye. Res.1999.-V. 19, No l.-P. 12-19.

165. Leitch E. C. Lactoferrin-induced reduction of vanB vancomycin resistance in enterococci / E. C. Leitch, M. D. Willcox // Int. J. Antimicrob. Agents. -2001. V. 18, No 4. - P. 399-402.

166. Leukocyte activation in sepsis; correlations with disease state and mortality / A. C. Muller Kobold, J. E. Tulleken, J. G. Zijlstra et al. // Intensive. Care. Med.2000. V. 26, No 7. - P. 883-892.

167. Levay P. F. Lactoferrin: a general review / P. F. Levay, M. Viljoen // Haema-tologica. 1995. - V. 80, No 3. - P. 252-267.

168. Li S. H. Various forms of mouse lactoferrins: purification and characterization / S. H. Li, Y. H. Chen // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1999. - V. 726, No 1-2.-P.45-52.

169. Lima M., Kierszenbaum F. //J. Immunol. 1987. - Vol. 139. - P. 1647-1651.

170. Masson P. L„ heremans J. F. // Prot. Biol. Fluids. 1966. - Vol. 14. - P. 115124.

171. Measurement of fecal lactoferrin for diagnosis on pediatric gastrointestinal disease / K. Tabata, R. Matsuse, K. Uchida et al. // Rinsho. Byori. 1997. - V. 45, No 12. - P. 1201-1203.

172. Membrane-bound lactoferrin alters the surface properties of polymorfo-nuclear leykocytes / L. A. Boxer, R. A. Haak, H. Yang, J. B. Wolach // J. Clin. Invest. 1982. - Vol. 70. - P. 1049-1057.

173. Metal complexes of bovine lactoferrin inhibit in vitro replication of herpes simplex virus type 1 and 2 / M. Marchetti, S. Pisani, G. Antonini // Biometals.- 1998.-V. 11, No2.-P. 89-94.

174. Miller M. B. Bacterial antigens and neutrophil granule proteins in middle ear effusions / M. B. Miller, P. J. Koltai, S. V. Hetherington // Arch. Otolaryngol. Head. Neck. Surg. 1990. - V. 116, No 3. - P. 335-337.

175. Montreul J. Transferrin superfamily / J. Montreul, G. Spik, J. Mazurier //

176. Muller F. M. Antimicrobial peptides as potential new antifungals / F. M. Mul-ler, C. A. Lyman, T. J. Walsh // Mycoses. 1999. - V.42, Suppl 2. - P. 77-82.

177. Murray M. J. The salutary effect of milk on amoebiasis and its reversal by iron / M. J. Murray, A. Murray, C. J. Murray // Br. Med. J. 1980. - V. 280, No 6228.-P. 1351-1352.

178. Myron S. C., Bradley E. В., French M., Bean K. // Amer. J. Obstet. Gynec. -1987. Vol. 19. - P. 679-689.

179. Naidu A. S. Lactoferrin interaction with salmonellae potentiates antibiotic susceptibility in vitro / A. S. Naidu, R. R. Arnold // Diagn. Microbiol. Infect. Dis.- 1994. Vol. 20, No 2. - P. 69-75.

180. Neutrophil phagocytosis of treponema denticola as indicated by extracellular release of lactoferrin / B. Hurlen, I. Olsen, E. Lingaas, T. Midtvedt // Acta. Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. B. 1984. - V. 92, No 3. - P. 171-173. -ISSN 0108-0180.

181. Nikawa H. Modulation of the anti-Candida activity of apo-lactoferrin by dietary sucrose and tunicamycin in vitro / H. Nikawa, L. P. Samaranayake, T. Hamada // Arch. Oral. Biol. 1995. - Vol. 40, No 6. - P. 581-584.

182. Ochoa T. J. Lactoferrin disruption of bacterial type III secretion systems / T. J. Ochoa, T. G. Clearly // Biometals. 2004. - Vol. 17, No 3. - P. 257-260.

183. Oral administration of bovine lactoferrin for treatment of tinea pedis. A placebo-controlled, double-blind study / K. Yamauchi, M. Hiruma, N. Yamazaki et al. // Mycoses. 2000. - V. 43, No 5. - P. 197-202.

184. Orsi N. The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives / N. Orsi // Biometals. 2004. - V. 17, No 3. - P. 189-196.

185. Otto B. R. Transferrins and heme-compounds as iron sources for pathogenicbacteria / B. R. Otto, A. M. J. J. Verweij-van Vught, D. M. MacLaren // Critical Reviews in Microbiol. 1992. - V. 18, No 3. - P. 21

186. Permeabilizing action of an antimicrobial lactoferricin-derived peptide on bacterial and artificial membranes / O. Aguilera, H. Ostolaza, L. M. Quiros et al. // FEBS Lett. 1999. - V. 462, No 3. - P. 273-277.

187. Perraudin J. P. Agglutinability of Micrococcus luteus by human lactoferrin upon lysozyme action proceedings. / J. P. Perraudin, J. P. Prieels // Arch. Int. Physiol-Biochim. 1980. - V. 88, No 1. - P. 43-44. - ISSN 0003-9799.

188. Plasmodium falciparum: inhibition in vitro with lactoferrin, desferri-ferrithiocin, and desferricrocin / G. Fritsch, G. Sawatzki, J. Treumer et al. // Exp. Parasitol. 1987. - Vol. 63, No 1. - P. 1-9.

189. Plaut A. G. Human lactoferrin proteolytic activity: analysis of the cleaved region in the IgA protease of Haemophilus influenzae / A. G. Plaut, J. Qiu, J. W. St Geme // Vaccine 2000. V. 8;19 Suppl 1. - P. 148-152.

190. Portelli J. Effect of compounds with antibacterial activities in human milk on respiratory syncytial virus and cytomegalovirus in vitro / J. Portelli, A. Gordon, J. T. May // J. Med. Microbiol. 1998. - V. 47, No 11. - P. 1015-1018.

191. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin / M. Tomita, W. Bellamy, M. Takase et al. // J. Dairy. Sci. 1991. - V. 74, No 12. - P. 4137-4142.

192. Potent bactericidal activity of bovine lactoferrin hydrolysate produced by heat treatment at acidic pH / H. Saito, H. Miyakawa, Y. Tamura et al. // J. Dairy. Sci. -1991. V. 74, No 11. - P. 3724-3730.

193. Proteases in Escherichia coli and Staphylococcus aureus confer reduced susceptibility to lactoferricin В / H. Ulvatne, H. H. Haukland, O. Samuelsen et al. // J. Antimicrob. Chemother. 2002. - V. 50, No 4. - P. 461-467.

194. Protective effect of lactoferricin against Toxoplasma gondii infection in mice / T. Isamida, T. Tanaka, Y. Omata et al. // J. Vet. Med. Sci. 1998. - V. 60, No 2. - P. 241-244.

195. Proteolytic activity of bovine lactoferrin / M. T. Massucci, F. Giansanti, G. Di Nino // Biometals. 2004. - Vol. 17, No 3. - P. 249-255.

196. Recombinant human lactoferrin is effective in the treatment of Helicobacter fe-lis-infected mice / E. J. Dial, J. J. Romero, D. R. Headon, L.M. Lichtenberger // Pharm. Pharmacol. 2000. - V. 52, No 12. - P. 1541-1546.

197. Reduction of the infectivity of Toxoplasma gondii and Eimeria stiedai sporo-zoites by treatment with bovine lactoferricin // Y. Omata, M. Satake, R. Maeda et al. // J. Vet. Med. Sci. 2001. - V. 63, No 2. - P. 187-190.

198. Relationship between antibacterial activity and porin binding of lactoferrin inч

199. Escherichia coli and Salmonella typhimurium / S. S. Naidu, U. Svensson, A. R.

200. Kishore, A.S. Naidu // Antimicrob. Agents. Chemother. 1993. - V. 37, No 2. -P. 240-245/ - ISSN 0066-4804.

201. Rishore R. Inhibitory effect of lactoferrin on adhesion of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Prevotella intermedia to fibroblasts and epithelial cells / R. Rishore, Alugupalli, Sotirios Kalfas // APIMS. 1995. - V. 103. - P. 154-160.

202. Rosa G. Iron uptake from lactoferrin by intestinal brush-border membrane vesicles of human neonates / G. Rosa, N. M. Trugo // Braz. J. Med. Biol. Res.1994. V. 27, No 7. - P. 1527-1531.

203. Sakamoto N. Antitumor effect of human lactoferrin against newly established human pancreatic cancer cell line SPA / N. Sakamoto // Gan. To. Kagaku. Ryoho. 1998. - V. 25, No 10. - P. 1557-1563.

204. Salamah A. A. In vivo and in vitro effects of lactoferrin on Yersinia pseudotuberculosis / A. A. Salamah, A. S. al-Obaidi // New. Microbiol.1995. V. 18, No 3. - P. 267-274.

205. Schibli D. J. The structure of the antimicrobial active center of lactoferricin В bound to sodium dodecyl sulfate micelles / D. J. Schibli, P. M. Hwang, H. J. Vogel // FEBS Lett. 1999. - V. 446, No 2-3. - P. 213-217.

206. Separation of lactoferrin-a and -b from bovine colostrum / S. Yoshida, Z. Wei, Y. Shinmura et al. // J. Dairy. Sci. 2000. - V. 83, No 10. - P. 2211-2215.

207. Sharma A. K. Structure of oxalate-substituted diferric mare lactoferrin at 2.7 A resolution / A. K. Sharma, T. P. Singh // Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystal-logr. 1999. - V. 55, No 11. - P. 1792-1798.

208. Shi Y. Human lactoferrin binds and removes the hemoglobin receptor protein of the periodontopathogen Porphyromonas gingivalis / Y. Shi, W. Kong, K. Nakayama // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, No 39. - P. 30002-30008.

209. Silva M. Т. Neutrophil-macrophage cooperation in the host defence against mycobacterial infections / M. T. Silva, M. N. Silva, R. Appelberg // Microb. Pathog. 1989. - V. 6, No 5. - P. 369-380.

210. Singh P. K. Iron sequestration by human lactoferrin stimulates P. aeruginosa surface motility and blocks biofilm formation / P. K. Singh // Biometals. -2004. Vol. 17, No 3. - P. 267-270.

211. Sorensen M. The proteins in whey / M. Sorensen, S. P. L. Sorensen // CR Trav. Lab., Carlsberg, 1939. Vol. 23. - P. 55-99.

212. Soukka T. Combined inhibitory effect of lactoferrin and lactoperoxidase system on the viability of Streptococcus mutans, serotype с / T. Soukka, M. Lumikari, J. Tenovuo // Scand. J. Dent. Res. 1991. - Vol. 99, No 5. - P. 390396.

213. Soukka T. Fungicidal effect of human lactoferrin against Candida albicans / T. Soukka, J. Tenovuo, M. Lenander-Lumikari // FEMS Microbiol. Lett. 1992.- Vol. 69, No 3. P. 223-228.

214. Stimulation of superoxide and lactoferrin release from polymorphonuclear leukocytes by the type 2 fimbrial lectin of Actinomyces viscosus T14V / A.L. Sandberg, L.L. Mudrick, J.O. Cisar // Infect. Immun. 1988. - V. 56, No 1. -P. 267-269.

215. Stuart J. Kinetic effect of human lactoferrin on the growth of Escherichia coliOll 1 / J. Stuart, S. Norrell, J. P. Harrington // Int. J. Biochem. 1984. -Vol. 16, No 10. - P. 1043-1047.

216. Supplementation of an adapted formula with bovine lactoferrin: 1. Effect on the infant faecal flora / A. K. Roberts, R. Chierici, G. Sawatzki et al. // Acta Paediatr. 1992. - Vol. 81, No 2. - P. 119-124.

217. Synergistic and additive killing by antimicrobial factors found in human airway surface liquid / P. K. Singh, B. F. Tack, P. B. McCray et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2000. - V. 279, No 5. - P. 799-805.

218. Synergistic fungistatic effects of lactoferrin in combination with antifungal drugs against clinical Candida isolates / M. E. Kuipers, H. G. de Vries, M. C. Eikelboom et al. // Antimicrob. Agents. Chemother. 1999. - Vol. 43, No 11. -P. 2635-2641.

219. Talbot J. A. Cleavage of proteins of reproductive secretions by extracellular proteinases of Tritrichomonas foetus / J. A. Talbot, K. Nielsen, L. B. Corbeil // Can. J. Microbiol. 1991. - Vol. 37, No 5. - P. 384-390.

220. The antifungal effect of lactoferrin and lysozyme on Candida krusei and Candida albicans / Y. H. Samaranayake, L. P. Samaranayake, P. C. Wu, M. So // APMIS. 1997. - V. 105, No 11.-P. 875-883.

221. The effect of antifungal agents on the in vitro susceptibility of Candida albicans to apo-lactoferrin / H. Nikawa, L. P. Samaranayake, J. Tenovuo, T. Hamada // Arch. Oral. Biol. 1994. - Vol. 39, No 10. - P. 921-923.

222. The fungicidal effect of human lactoferrin on Candida albicans and Candida krusei / H. Nikawa, L. P. Samaranayake, J. Tenovuo et al. // Arch. Oral. Biol. -1993. Vol. 38, No 12. - P. 1057-1063.

223. The survival of ingested lactoferrin in the gastrointestinal tract of adult mice / H. Kuwata, Т. T. Yip, K. Yamauchi et al. // Biochem. J. 1998. - Vol. 334, Pt 2. - P. 321-323.

224. The therapeutic effect of bovine lactoferrin in the host infected with Helicobacter pylori / T. Wada, Y. Aiba, K. Shimizu et al. // Scand. J. Gastroenterol. 1999. - V. 34, No 3. - P. 238-243.

225. Theobald K. // Agents and Actions. 1987. - Vol. 20. - P. 10-16.

226. Three-dimensional solution structure of lactoferricin B, an antimicrobial peptide derived from bovine lactoferrin / P. M. Hwang, N. Zhou, X. Shan et al. // Biochemistry. 1998. - V. 37, No 12. - P. 4288-4298.

227. Three-dimensional structure of mare diferric lactoferrin at 2.6 A resolution / A. K. Sharma, M. Paramasivam, A. Srinivasan et al. // J. Mol. Biol. 1999. - V. 289, No 2.-P. 303-317.

228. To culture or not to culture: fecal lactoferrin screening for inflammatory bacterial diarrhea / S. W. Choi, С. H. Park, Т. M. Silva et al. // J. Clin. Microbiol. -1996. V. 34, No 4. - P. 928-932.

229. Toma C. Effect of Vibrio cholerae non-Ol protease on lysozyme, lactoferrin and secretory immunoglobulin A / C. Toma, Y. Honma, M. Iwanaga // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol. 135, No 1. - P. 143-147.

230. Towards a structure-function analysis of bovine lactoferricin and related tryptophan- and arginine-containing peptides / H. J. Vogel, D. J. Schibli, W. Jing et al. // Biochem. Cell. Biol. 2002. - V. 80, No 1. - P. 49-63.

231. Toxoplasma gondii: parasiticidal effects of bovine lactoferricin against parasites / T. Tanaka, Y. Omata, A. Saito et al. // Exp. Parasitol. 1995. - V. 81, No 4.-P. 614-617.

232. Transferrin and lactoferrin undergo proteolytic cleavage in the Pseudomonas aeruginosa-infected lungs of patients with cystic fibrosis / В. E. Britigan, M. B. Hayek, B. N. Doebbeling, R. B. Fick // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61, No 12.-P. 5049-5055.

233. Traub W. H., Bauer D. Interactions of purified Serratia marcescens metallo-proteases with fresh human serum and with purified human serum proteins / W. H. Traub, D. Bauer // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. A. 1987. -Vol. 263, No4.-P. 561-571.

234. Turchany J. M. Giardicidal activity of lactoferrin and N-terminal peptides / J. M. Turchany, S. B. Aley, F. D. Gillin // Infect. Immun. 1995. - V. 63, No 11. -P. 4550-4552.

235. Ueta E. A novel bovine lactoferrin peptide, FKCRRWQWRM, suppresses Candida cell growth and activates neutrophils / E. Ueta, T. Tanida, T. Osaki // Pept. Res. 2001. - V. 57, No 3. - P. 240-249.

236. Ultrastructural effects of lactoferrin binding on Giardia lamblia trophozoites / J. M. Turchany, J. M. McCaffery, S. B. Aley et al. // J. Eukaryot. Microbiol. -1997.-V. 44, No l.-P. 68-72.

237. Venkitanarayanan K. S. Antibacterial effect of lactoferricin В on Escherichia coli 0157:H7 in ground beef / K. S. Venkitanarayanan, T. Zhao, M. P. Doyle // J. Food. Prot. 1999. - V. 62, No 7. - P. 747-750.

238. Wakabayashi H. Lactoferricin derived from milk protein lactoferrin / H. Wa-kabayashi, M. Takase, M. Tomita // Curr. Pharm. Des. 2003. - V. 9, No 16. -P. 1277-1287.

239. Wharton B. A. Faecal flora in the newborn. Effect of lactoferrin and related nutrients / B. A. Wharton, S. E. Balmer, P. H. Scott // Adv. Exp. Med. Biol. -1994.-V. 357.-P. 91-98.

240. Wharton B. A. Sorrento studies of diet and fecal flora in the newborn / B. A. Wharton, S. E. Balmer, P. H. Scott // Acta. Paediatr. Jpn. 1994. - V. 36, No 5. -P. 579-584.

241. Yamauchi K. Potential for usefulness of bovine lactoferrin in human beings. / K. Yamauchi, S. Teraguchi, H. Hayasawa // Milk Sci. 1999. - Vol. 48. - P. 227-232.

242. Ye X. Y. Characterization of the protein and glycan moieties in different forms of bovine lactoferrin / X. Y. Ye, T. Nishimura, S. Yoshida // Biosci. Biotech-nol. Biochem. 1997. - V. 61, No 5. - P. 782-786.

243. Zhang G. H. Neutralization of endotoxin in vitro and in vivo by a human lac-toferrin-derived peptide / G. H. Zhang, D. M. Mann, С. M. Tsai // Infect. Immun. 1999. - V. 67, No 3. - P. 1353-1358.

Информация о работе

Валышева, Ирина Викторовна
кандидата биологических наук
Оренбург, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Антилактоферриновая активность микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно