Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антигенные и иммуногенные свойства штаммов вируса болезни Марека при создании эффективных экспериментальных и производственных вакцин
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Антигенные и иммуногенные свойства штаммов вируса болезни Марека при создании эффективных экспериментальных и производственных вакцин"
На правах рукописи
ЯРЫГИНА Елена Игоревна
АНТИГЕННЫЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА ПРИ СОЗДАНИИ ЭФФЕКТИВНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ
ВАКЦИН
03.00.23- биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
го ое-А
На правах рукописи ЯРЫГИНА Елена Игоревна
АНТИГЕННЫЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА ПРИ СОЗДАНИИ ЭФФЕКТИВНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ
ВАКЦИН
03.00.23- биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Щелково - 2005
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Лукина Виктория Алексеевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Скичко Николай Данилович
доктор ветеринарных наук, профессор Придыбайло Николай Дмитриевич
доктор биологических наук, профессор Фомина Наталья Васильевна
Ведущая организация:
ГНУ «Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» Россельхозакадемии
Защита состоится 23 декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01. во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (141142, Московская область, г. Щелково, п/о Кашинцево, ВНИТИБП).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан 22 ноября 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
Ю.Д. Фролов
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность темы. Болезнь Марека (БМ) - лимфопролиферативное заболевание кур, является серьезной проблемой для птицеводства. Возбудитель -онкогенный ДНК-содержащий альфагерпесвирус - обладает способностью сохраняться и в хозяине, и в экосистеме, при этом эволюционирует, что приводит к появлению более вирулентных популяций патотипов вируса болезни Марека (ВБМ) первого серотипа. Это, в свою очередь, порождает новые научные и хозяйственные проблемы. Кроме вирулентных штаммов ВБМ 1 серотипа, в природе существуют два неонкогенных: 2 серотип - вирус герпеса кур (ВГК) и 3 серо-тип - вирус герпеса индеек (ВГИ).
Болезнь Марека регистрируется практически во всех странах мира с развитым промышленным птицеводством, наносит огромный экономический ущерб. Ведущим звеном в системе организации профилактических мероприятий при БМ является эпизоотическая характеристика птицехозяйств (Коровин Р.Н., 1989, Карпуть И.М., Бабина М. П., 1996), основанная на точной и своевременной диагностике заболевания. А правильный выбор подходящей по своим иммунизирующим свойствам вакцины для конкретного птицехозяйства способен полностью исключить вспышки БМ.
Многие годы превалирующее значение имели вакцинные препараты на основе штамма FC-126 ВГИ. Первая отечественная вакцина против БМ также создавалась из штамма FC-126 ВГИ. Существенный вклад в разработку нативной и сухой вирусвакцины внесли ученые ВНИТИБП (Никитин Е.Е., Лукина В.А., То-карик Э.Ф., Слепенко Т.Б., Блехерман Б.Е., Перельштейн Л.Г.), ВНИВИП (Коровин Р.Н., Придыбайло Н.Д.), ВГНКИ (Зубцова Р.В., Деревлева Т.А., Баррос Па-лома Е.В.) и др.
Однако в последнее время, в связи с селекцией полевых штаммов и появлением особо вирулентных ВБМ (ОВВБМ) данный тип вакцин значительно снизил эффективность, а порой и полностью утратил способность защищать птицу от БМ, так как высоко вирулентные изоляты содержат антигены-мишени, несоответствующие таковым на вакцинном вирусе (Prajapat K.S., Joshi В.Р. et al., 1990, Witter R.L., 1992). В исследованиях американских ученых, особенно в рабо-
тах Witter (1988, 1995) показано, что эффективность ВГИ значительно усиливается даже против ОВВБМ, если применять его в комбинации с вирусами второго серотипа.
Возможность прогнозирования поствакцинального гуморального иммунитета у привитой птицы, а также создание и применение поливалентных вакцин, в составе которых имеются актуальные штаммы ВГК, позволяют надежно профи-лактировать БМ за счет вытеснения из птицехозяйств патогенных штаммов ВБМ.
Динамика накопления и уровень специфических антител зависят от генетической и возрастной резистентности птицы, но в большей степени - от самого вируса (Payne L.N., 1992, Cho К.-О., Endoh D., Qian D„ 1998). Существование шгаммо-, серотипо- и видоспецифических вирусных антигенных детерминант позволяет дифференцировать антитела к вакцинным и полевым вирусам БМ, а также выделять и исследовать отдельные вирусные антигены, ответственные за выработку антител, нейтрализующих цельные вирионы. Подобные работы уже привели к созданию экспериментальных вакцин без инфекционного вируса (Calnek B.W., 1992, Zelnik V., Ross L.J.N., Smith G.D. et al., 1992).
Всестороннее углубленное изучение антигенных особенностей ВБМ и его взаимосвязей с другими представителями Herpesviridae будут способствовать в дальнейшем изготовлению новых поколений вакцинных препаратов, возможно препятствующих селекции ВБМ в природных условиях и появлению высоковирулентных патотипов вируса.
Таким образом, изучение антигенных и иммуногенных свойств штаммов ВБМ, входящих в коммерческие и экспериментальные вакцины, напрямую влияющих на эпизоотическую обстановку в птицехозяйствах, зависящую не только от типа применяемого препарата, но и от циркуляции патогенных штаммов, представляется своевременным и обоснованным.
1.2. Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным была поставлена цель настоящей работы: основываясь на результатах изучения антигенных и иммуногенных свойств инфекционных и инактивированных препаратов вакцинных штаммов вирусов болезни Марека с использованием поли- и моно-
клональных антител, дать теоретическое и экспериментальное обоснование разработке новых эффективных вакцинных препаратов против болезни Марека,. В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:
- Создать тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА) для детекции антигенных детерминант штаммов ВБМ, а также количественного учета полноценных вирионов и иммуноактивных клеток в составе вакцинных препаратов против БМ.
- Изучить зависимость протективных свойств производственных серий вакцины против БМ на основе ВГИ от морфологического состава вирусной популяции.
- Разработать способы получения антигенов ВБМ, различающихся по перекрестной серотипической активности, и изучить их антигенные и иммуногенные свойства.
- Разработать способы получения поликлональных антиидиотипических антител (АИД АТ), содержащих «внутренний образ» антигенов ВГИ, и изучить их иммунобиологические свойства.
- Разработать варианты ИФА с применением поли- и моноклональных антител, направленных к белкам вируса простого герпеса (ВПГ) человека, для детекции gB и gD ВГИ и ВГК.
- Подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК вируса болезни Марека.
- Разработать модификации ИФА для изучения динамики антител к антигенным комплексам ВБМ в условиях птицехозяйств с различной эпизоотической ситуацией по БМ, применяющих moho-, би - или поливалентные вакцины на основе второго и третьего серотипов ВБМ, и оценить качество вакцинных препаратов по серологическому статусу привитой птицы.
1.3. Научная новизна - Впервые в России разработана тест-система ИФА для оценки биологической активности вакцин против БМ.
-Разработан способ выделения иммунохимически чистого препарата IgG желтка яиц кур (а.с. № 1497811).
- Синтезирован иммунопероксидазный антивидовой конъюгат (анти-ТдО кур) (патент за № 2202369 от 20.04.2003).
- Разработан способ стабилизации вируса герпеса индеек, на который получено положительное решение (приоритетная справка № 5015791).
- Разработаны методы выделения ВГК от невакцинированных птиц благополучного по БМ хозяйства, идентификации и поддержания вируса в культуре клеток эмбрионов БРР-кур.
-Впервые в России выделены и идентифицированы штаммы ВГК. Два из них, под номерами «42» и «50», депонированы в ВГНКИ как производственные вакцинные штаммы и используются для изготовления первой в России жидкой поливалентной вакцины против БМ (патенты № 2085582 и № 2085583).
- Впервые в мире разработана сухая поливалентная вакцина на основе отечественных штаммов ВГК «42» и «50» и штамма РС-126М ВГИ.
- Впервые получены и исследованы в ИФА специфичные и стабильные антигенные комплексы в непрогретых и прогретых ультразвуковых лизатах клеток, инфицированных тремя серотипами ВБМ. Показана возможность применения полученных неинфекционных антигенных комплексов для изучения динамики антител в сыворотке крови кур в условиях птицехозяйства.
- Впервые проведено фракционирование термоденатурированных антигенов ВГИ, получены различающиеся по иммунобиологическим свойствам неинфекционные препараты ВГИ (белки В и С).
- Впервые получены и изучены в серологических реакциях идиотипические антитела (ИД АТ) к отдельным фракциям термоденатурированного ВГИ, способные нейтрализовать инфекционную активность вируса, и АИД АТ, которые содержат «внутренний образ» ВГИ, способные заменить антиген в индукции иммунного ответа.
- Подобраны специфичные праймеры, комплиментарные гену глико-протеина А и последовательностям внутренних инвертированных повторов, позволяющие выявлять ДНК вирулентных, онкогенных штаммов 1 серотипа и вакцинных штаммов вируса 3 серотипа, определены оптимальные параметры постановки ПЦР для обнаружения вирусной ДНК.
- Впервые в России для анализа антигенного сходства поверхностных белков gB и gD разных серотипов ВБМ и ВПГ человека в ИФА были применены моноклональные антитела (МАТ), направленные к белкам ВПГ. Установлено, что для детекции в ИФА гликопротеинов D ВГИ и ВГК пригодны МАТ 4f6, направленные к gD ВПГ человека.
- Впервые в России разработана тест-система ИФА для индикации и количественного определения антител к серотипам ВБМ.
- Впервые в России разработана методика оценки эффективности вакцинации по определению серологического статуса птицы, привитой против БМ.
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке иммуноферментных наборов для изучения поствакцинального иммунитета у кур, привитых моно, би- и поливалентными вакцинами против БМ, для выделения и идентификации ВГК (штаммы № «42» и «50») от непривитых птиц, для оценки биологической активности сухой и кле-точно-ассоциированной вакцин против БМ и легли в основу Временной инструкции по изготовлению и контролю набора для оценки биологической активности вакцин против БМ иммуноферментным методом, Технических условий (ТУ 9383-038-00008064-97) на набор, Временного наставления по применению набора. НТД на набор согласована директорами ВНИТИБП и ВГНКИ и утверждена в департаменте Ветеринарии РФ в 1997 г. Разработанные наборы с положительным результатом испытаны на ГЩБК, Курской биофабрике, во ВГНКИ и применяются в птицехозяйствах РФ.
1.8. Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту:
- тест-система ИФА для детекции антигенных детерминант штаммов ВБМ, а
также количественного учета полноценных вирионов и иммуноактивных клеток в составе вакцин против БМ;
- результаты разработки метода стабилизации ВГИ в вакцине;
- результаты детекции и идентификации антигенных детерминант различных серотипов ВБМ и антител к ним методом блокирования ИФА;
результаты выделения и идентификации ВГК от невакцинированных птиц благополучного по БМ хозяйства, поддержания вируса в культуре клеток эмбрионов SPF-кур;
результаты по разработке поливалентных вакцин против БМ; результаты разработки способов получения и исследования в ИФА антигенов ВБМ, различающихся по перекрестной серотипической активности;
результаты разработки способов получения поликлональных антиидиоти-пических антител, имитирующих «внутренний образ» антигенов ВГИ, и изучения их иммунобиологических свойств;
метод применения МАТ, направленных к белкам ВПГ для детекции в ИФА gB и gD ВГИ и ВГК;
результаты разработки условий постановки ПЦР для обнаружения ДНК ВБМ и ВГИ;
модификация ИФА для изучения динамики антител к антигенным комплексам ВБМ у птиц в птицехозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по БМ, применяющих moho-, би- или поливалентные вакцины из штаммов второго и третьего серотипов ВБМ.
1.6. Апробация. Основные материалы лиссертации доложены и обсуждены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2000; Щелково, 2005), на научной сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России» (Москва, 1998), на Межрегиональном Координационном совещании по итогам НИР за 1996-2000 гг и задачам на 2001-2005 гг (г. Ломоносов Ленинградской обл., 2001), на научно-практических конференциях-семинарах «Научные достижения и стратегия борьбы с наиболее опасными болезнями птиц в промышленном птицеводстве» ВНИВИП (г. Ломоносов Ленинградской обл., 2001, 2003, 2004), на Всероссийских и международных научных конференциях (Москва, 1986, 1988, 1996, 1997, 1999, Владимир, 1990, 1995, Покров, 1999, 2000, Пущино, 2000, Щелково, 1996, 2000, 2002, 2003, 2005), а также на заседаниях методического и ученого советов ВНИТИБП (1986-2005 гг.)
1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 научных работ, в том числе 3 патента, 1 положительное решение по приоритетной справке, утверждено в установленном порядке 3 нормативных документа (технические условия, наставление по применению, инструкция).
1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 331 странице и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 65 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает 462 наименования, из которых 120 отечественных и 348 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь А .Я. Самуйленко, В.А. Лукина, A.A. Бойко, H.H. Быкова, С.Г. Панова, Скороходова, И.В. Румянцева, И.В. Бобровская, С.М. Панферова,Е.В. Баррос Палома, Б.Е. Блехерман, Л.А. A.A. Не-жута, Е. С. Сербис, Б.В. Соловьев, Т.Б. Слепенко, A.A. Маслак, В.В. Крюкова, за что приносим им сердечную признательность. Выражаем искреннюю признательность за помощь и сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа выполнена в 1986-2005 гг в лаборатории иммунологии, лаборатории по разработке и производству противоопухолевых биопрепаратов и отделе молекулярной биологии ВНИТИБП в соответствии с планом НИР и ОКР ВНИТИБП отраслевых научных программ и Федеральной целевой научно-технической программы «Ветеринарное благополучие» (1996-2000гг и 2001-2005 гг).
2.1.1. Вирус. В работе использовали промышленные серии нативной и сухой вакцины против БМ на основе штаммов ВГИ FC-126 и FC-126M. Штамм Jm ВБМ серсггипа 1 в виде инактивированного формалином и лиофилизированного ультразвукового (УЗ) лизата эпителия перьевых фолликулов, а также наивную вируссодержащую кровь инфицированных SPF-цыплят получали из ВГНКИ.
Изоляты ВГК (ВБМ серотипа 2), условно обозначенные как "шт. 42" и "шт.50", выделены нами от кур-несушек.
В качестве контрольных препаратов использовали: кулътуральную жидкость с неинфицированных клеток; УЗ-лизаты неинфицированных культур клеток куриных и перепелиных эмбрионов (КККЭ и ККПЭ); живые неинфициро-ванные клетки.
2.1.2. Антигены. В работе использовали УЗ-лизаты инфицированных КККЭ в виде препаратов на основе ВГИ, ВГК с высокой цитопатической активностью (ЦПД): исходные сухие; сухие термоденатурированные при 100°С в течение 30 минут; восстановленные физраствором до исходного объема (нативные) и термоденатурированные при 100°С в течение 15 минут.
УЗ-лизаты неинфицированных КККЭ: сухие термоденатурированные при 100°С 30 минут; нативные термоденатурированные при 100°С 15 минут. УЗ-лизаты неинфицированных клеток эпителия перьевых фолликулов цыплят.
2.1.3. Культуры клеток и среды. Для размножения и титрования вируса использовали первичные культуры клеток 10-12-дневных куриных 8РР -эмбрионов.
В качестве ростовой и поддерживающей среды применяли среды Игла, ГЛАЭ, 199 производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва, или их смеси.
2.1.4. Размножение и пассирование ВГК в культуре клеток. Инокуляцию исследуемого материала производили непосредственно в суспензию клеток или на монослой. Съем инфицированных клеток осуществляли через 4-7 суток культивирования. Собранные клетки частично использовали для изучения в ИФА, частично для заражения свежеприготовленных культур, оставшиеся клетки консервировали замораживанием в криозащитной среде.
2.1.5. Определение инфекционной активности проводили по методике (Слепенко Т.Б., 1987).
2.1.6. Концентрирование и фракционирование внеклеточного ВГИ проводили методом межфазного распределения вирусных частиц в водных растворах полимеров, предложенным Альбертсоном (1974).Построение фазовых диаграмм
и выбор точки концентрирования для каждой серии проводили по методике, разработанной во ВНИТИБП (Писеева Г.П., Лукина В.А., Дьяконов Л.П., 1981).
2.1.7. Инфекционный и термоденатурированный ВГИ фракционировали на колонке К 29/100, заполненной Сефадексом G-200. Профиль элюирования белков вычерчивали по значениям оптической плотности (ОП) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм. Активность и специфичность фракций вируса определяли по инфекционной активности (количество фокусообразующих единиц в мл - ФОЕ) на культуре клеток и в ИФА.
2.1.8. Антигенную активность, специфичность и инфекционность УЗ-лизатов устанавливали в реакции диффузионной преципитации (РДП), ИФА и по ФОЕ на культуре клеток.
2.1.9. Электронно-микроскопические исследования выполняли в секторе электронной микроскопии ВНИТИБП (зав. сектором канд. вет. наук Блехерман Б.Е.) и в лаб. ультраструктуры нейрона института теоретической и экспериментальной биофизики (г. Пущино) (лаб. проф. Д.А. Мошковым).
2.1.10. Иммуногенность образцов ВГИ и ВГК определяли на цыплятах методом контрольного заражения по относительной разнице в поражености птицы БМ в опытных и контрольной группах.
Эффективность вакцинации рассчитывали по формуле:
Е = (А-В)/А х 100 % (или Е = 100 - (Вх100/А), где Е - эффективность вакцинации, %; А - число случаев БМ в контрольной группе, %; В - число случаев БМ в опытной группе, %.
2.1.11. Моноклональные антитела. МАТ, направленные к белкам gD и gB ВПГ и реагирующие с белками ВГИ и ВГК, любезно предоставлены зав. лабораторией Института вирусологии им. Д.И. Ивановского профессором Аллой Александровной Кущ: MAT 4А5, реагируют с гликопротеином D (gD); MAT 2С, реагируют с гликопротеином В (gB). МАТ, направленные на серотипспецифиче-скую антигенную детерминанту ВГК штамм SB-1 (фирма "Select", США).
2.1.12. Выделение лейкоцитов из крови кур проводили по методу А. Boyum (1968).
2.1.13. Концентрирование и очистку антигена А (gA) из культуральной жидкости проводили методами ультрафильтрации совместно с научным сотрудником ВНИТИБП С.М. Панферовой. Активность очищенного gA определяли в ИФА и РДП.
2.1.14. Экспериментальные животные. В опытах по получению анти-IgG желтка яиц кур использовали кроликов и баранов. В опытах по выделению изо-лятов ВГК использовали здоровых кур 150-180-тидневного возраста из благополучного по БМ птицехозяйства, а также суточных SPF-цыплят. При получении ИД AT к неинфекционным термоденатурированным образцам ВГИ (белки В и С) - морских свинок 2-х месячного возраста, массой 350-400 г. При получении АИД AT - суточных SPF-цыплят.
2.1.15. Выделение и очистка иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур. За основу выделения иммуноглобулинов класса 6 желтка яиц кур был взят метод двукратного переосаждения ПЭГ-6000 (Poison, 1980). Иммунохимически чистый IgG желтка яиц кур получали из глобулиновой фракции гель-хроматографией на сефадексе G-200 ("Pharmacia" Швеция) или ультрагеле А-4 ("Reactifs IBF", Франция) на колонках К 26/100 ("Pharmacia", Швеция).
Чистоту и специфичность выделенных препаратов IgG проверяли методом электрофореза в ПААГ и иммуноэлектрофореза с полиспецифической сывороткой, полученной на протеины желтка яиц кур.
2.1.16. Получение иммунных сывороток. Специфические к ВГИ сыворотки получали от иммунизированных в суточном возрасте 48-70-дневных SPF-цыплят во ВГНКИ и на Курской биофабрики. Специфические к штамму Jm ВБМ (США) и штамму CVI 988 сыворотки от SPF-птицы получали из ВГНКИ. Специфические к ВГК сыворотки получали от 180-200-дневных SPF-кур. Специфические к gA сыворотки получали гипериммунизацией кроликов.
2.1.17. Выделение специфических антител из сывороток крови проводили методом аффинной хроматографии на колонках. 26x40.
2.1.18. Для получения ИД AT (ATI) морских свинок иммунизировали по следующей схеме: фракционированные термоинактивированные вирусные (ВГИ) и контрольные (КК) антигены смешали с полным адъювантом Фрейнда в
соотношении 1:1 и вводили внутримышечно по 0,5 см3 в область бедра трехкратно через недельный интервал. Через 7 дней после последнего введения брали сыворотки крови и выделяли из них антитела.
2.1.19. Для получения АИД AT (АТ2) антителами (IgG) морских свинок, смешанными с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, иммунизировали SPF-цыплят по 0,2 см3 внутрибрюшинно в суточном, 7-дневном и 14-дневном возрасте. Через 7 дней после последнего введения брали сыворотки крови и выделяли из них антитела.
2.1.20. Конъюгацию антител с пероксидазой осуществляли перйодатным методом (Nakane Р. и Kawaoi А., 1974; Wilson М. и Nakane Р., 1978).
2.1.21. При разработке тест-системы ИФА для определения антигенов се-ротипов ВБМ и антител к ним применяли неконкурентные методы с использованием антивидовых конъюгатов, специфических антител и иммобилизованного антигена; модифицированный "сэндвич"-метод с иммобилизованными антителами и метод блокирования иммуноферментного анализа.
2.1.22. Производственные опыты по определению эффективности вакцинации и оценки серологического статуса вакцинированной птицы методами ИФА проводили на базе ПЦБК, на базе АО ПАФ "КУРС" г. Лакинск Владимирской обл. Клинические наблюдения, вскрытие, учет павшей и выбракованной гггицы, отбор крови у разновозрастной птицы осуществлялись при непосредственном участии вет. врача В. В. Крюковой.
2.1.23. Достоверность результатов опытов оценивали по критерию Стью-дента. При статистической обработке экспериментальных результатов использовали формулы регрессивного анализа (Лакин Г.Ф., 1980).
2.1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ
2.1.1. ТЕСТ-СИСТЕМА ИФА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА
Разработка способов выделения антител из желтков яиц кур для получения антивидовых иммунофермеитных конъюгатов
К исследованию возможности применения методов ИФА для определения качества вакцинных препаратов против БМ мы приступили в начале 80-х годов,
кем да еще пе было коммерческих тест-систем ИФА и, соответственно, компонентов для их комплек совании. Поэтому одной из первых задач, которую мы успешно разрешили, было разработать способы выделения IgG кур, пригодного для синтеза ашивидовых иммуноферменгных коньюгатов. В результат сочетания методой препаративной биохимии был разработан способ получения иммунохи-мически чистого препарата IgG желтка яиц кур (рис.1), на который получено (в соавторстве) авторское свидетельство N 1497811.
Рис. 1. Результаты электрофореза в полиакри-ламидном геле:
1 - цельного желтка яиц кур;
2 - IgG, полученного по способу-нрототипу (Poison А., 1980);
3 - IgG, полученный по разработанному способу.
Синтез иммунопероксидазного конъюгата
Очищенные иммуноглобулины С использовали для гипериммунизации баранов и кроликов с целыо получения антивидовой сыворотки, содержащей антитела к кур.
Специфичность и активность гипериммунных антисывороток к кур проверяли и IV (И и ИФА. Активность антисывороток барана в РДП была 1:64 -1:128, активность кроличьих - 1:8 - 1:64. В ИФА сыворотка барана реагировала с
из желтков яиц кур до разведений 1:128000 - 1:256000, сыворотка кроликов до 1:32000 1:64000.
Следовательно, при отборе сывороток для конъюгации с пероксидазой следует учитывать не только активность сывороток в серологических реакциях, но также и уровни значений показателей оптических плотностей в ИФА. Мы пришли к выводу, что в нашем случае для получения коньюгатов лучше использовать гинериммунные сыворотки, полученные на баранах.
Иммунизация животных иммунохимически чистым препаратом IgG желтка яиц кур позволила получить активные и специфические аигисыворотки, из кого рых методом аффинной хроматографии были выделены антивидовые антитела и сконъюгированы с ферментом пероксидазой.
Данная разработка защищена патентом за № 2202369 от 20.04.2003 года «Способ изготовления иммунопероксидазных конъюгатов».
Конъгогаты использовали для отработки методов ИФА применительно к нашим условиям, для оценки биологической активности вакцин против )>М, а также для индикации и идентификации в ИФА антигенов ВБМ, ВГИ и BIX и антител к ним в сыворотках крови кур, инфицированных различными серотипами ВБМ.
Оптимизация условий постановки ИФА для оценки биологической активности вакцин на основе ВГИ против болсши Марека
Учитывая зависимость уровня хромофорной реакции в ИФА от количества ВГИ в препаратах, естественно было бы предположите, что чем больше ФОН/см3, тем выше должна быть активность вируса в ИФА. Наличие такой зависимость установлена нами для ВГИ в вакцине фирмы "Нобилис". Однако взаимосвязь между величинами оптической плотности (ОП) в ИФА и количеством ФОК/см3 для ВГИ в отечественных препаратах отсутствовала. Это объясняется струтурпым полиморфизмом ВГИ, репродуцированных в культуре клеток, в не оптимизированных условиях.
Поэтому в ряде экспериментов определяли корреляцию между иммунохи-мической активностью В1 И в ИФА, инфекционностью вируса в культуре клеток и морфологией вирусных частиц (наличие полноценных вирионов IIB) в промышленных сериях сухой вакцины. Из результатов проведенных исследований следует, что показатель Г1В/см3 не коррелирует с исходным количеством ФОЕ/см3 вакцины (г=0,211). Высокоактивные в ИФА серии характеризовались высоким содержанием морфологически зрелых вирионов и полноценных нуклеокапсидов и являлись лучшими образцами по данным показателям. Серии, высокоактивные в культуре клеток и малоактивные в ИФА, характеризовались
большим содержанием незрелого вируса (в основном нуклеокапсиды на ранней стадии морфогенеза). Худшие из всех проб по данным электронно-микроскопического исследования оказались не активными в ИФА. Представленные данные позволяют сделать вывод о том, что в ИФА принимают участие не все вирионы, образующие фокусы в культуре клеток, а только морфологически полноценные формы, в том числе, возможно, и сформированные нуклеокапсиды. Такими образом, ИФА позволяет проводить количественный учет ПВ в каждой серии сухой вакцины против БМ.
Для изучения состава бесклеточных препаратов ВГИ и получения гомогенной вирусной популяции с преобладанием полноценных вирионов провели фракционирование вирусных частиц в двухфазной системе водорастворимых полимеров декстран-полиэтиленгликоль.
Нашими опытами установлено, что в процессе межфазного разделения в промежуточной фазе концентрируются морфологически зрелые вирионы и полноценные нуклеокапсиды с максимально плотной упаковкой нуклеоида, которые активно вступают в иммунохимическую реакцию «антиген-антитело». Оказалось, что в ИФА принимают участие не все вирусные частицы, входящие в вакцину, а только те, которые, попав в организм животного, вызовут полноценный поствакцинальный иммунитет.
1 2 Рис. 2. Электронно-микроскопический снимок содержимого интерфазы (1) (х 210000) и нижней фазы (2) (х 90000).
Электронное микроскопирование ВГИ, находящегося в интерфазе (рис. 2-1) и в нижней фазе (рис. 2-2), показало, что полноценные вирионы (электронно-плотные, покрытые оболочкой), ответственные за иммуногенность вакцинных препаратов, сконцентрированы в интерфазе, тогда как в нижней фазе преобладают «пустые» капсиды, отдельные электронно-прозрачные крестообразные капси-ды и клеточные обломки. По результатам проделанной работы, можно сделать вывод, что производственные серии сухих препаратов ВГИ на основе штамма РС-126 гетерогенны по своему составу и содержат кроме полноценных вирионов смесь различных клеточных и вирусных белков.
2.1.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА СТАБИЛИЗАЦИИ ВГИ В ВАКЦИНЕ
Влияние метода стабилизации на сохранность активности ВГИ в сухой вакцине
При производстве сухой вакцины из ВГИ традиционно используют стабилизаторы, в состав которых входят белки (например, сахарозо-фосфат-глютамат-альбуминовая среда - СФГА). Такие вакцины сохраняют исходную активность в условиях бытового холодильника не более месяца. Предложенный нами метод стабилизации ВГИ в безбелковой среде позволяет получать сухой препарат длительного хранения, который используется в ИФА без фоновых реакций, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к биологическим компонентам набора для ИФА. На данный безбелковый углеводный стабилизатор получено (в соавторстве) положительное решение по приоритетной справке N 5015791/13. С 1992 г. на ГЩБК вакцина на основе ВГИ производится на безбелковом стабилизаторе.
Изучая зависимость степени инфекционности вируса в вакцине от сроков ее хранения, отметили низкий процент корреляции показателей биологической активности по инфекционности и в ИФА для свежеприготовленных препаратов (в среднем, 40-60 % в зависимости от способа стабилизации вакцины). Однако, в процессе хранения (3-10 лет) наблюдали появление значительной положительной связи между показателями инфекционной и иммунохимической активности как для вакцины
на основе СФГА, так и для вакцины на основе безбелкового стабилизатора (74,7+7,2 % и 90,0+2,2 %, соответственно).
Увеличение степени корреляции показателей биологической активности, определенных по цитопатическому действию (ЦПД) и в ИФА после длительного хранения препаратов, свидетельствует о гетерогенности популяции ВГИ, ответственного за инфекционную активность, и об участии в ИФА только стабильных полноценных форм вирусных частиц. Эти данные говорят и о том, что при вакцинации предпочтительнее использовать вакцину, активность которой определена в ИФА.
Таким образом, использование безбелковой стабилизирующей среды позволило изготавливать в производственных условиях вакцины с большим, в сравнении с вакцинами на основе СФГА, содержанием полноценных вирионов.
Оценка качества нативной вакцины против БМ методом ИФА
Учитывая иммунохимическую активность в ИФА инфицированных клеток и сравнивая полученные результаты с инфекционной активностью вируса в нативной вакцине, определенной по ФОЕ, обнаружили, что корреляция между этими показателями оказалась выше, чем для сухой вакцины (г=0,658, р < 0,05).
Инфекционной единицей в нативной вакцине является клетка, содержащая вирионы на разной стадии созревания, включая полностью сформированные нук-леокапсиды, морфологически зрелые ядерные и цитоплазматические формы. Отражением репродукции ВГИ в клетке является появление на клеточной мембране антигенов, идентичных вирусным (Calnek, B.W., Witter R. L., 1991; Jeggo M.H., 1986). По-видимому, именно этот феномен уравнивает методы оценки нативной вакцины по иммунохимической и инфекционной активности.
Разрушенные клетки утрачивают биологическую активность. Поэтому ИФА может быть использован для анализа только неповрежденных, жизнеспособных клеток, что увеличивает его ценность.
Таким образом, коэффициент корреляции оптической плотности в ИФА и титра по ФОЕ нативной вакцины является показателем качества репродукции вируса в культуре клеток.
Проведенные исследования завершились созданием наборов ИФА для оценки биологической активности вакцин против болезни Марека иммунофер-ментным методом. Документация на наборы утверждена Департаментом Ветеринарии РФ 23 июня 1997 года.
2.1.3. ДЕТЕКЦИЯ АНТИГЕНЫХ ДЕТЕРМИНАНТ РАЗЛИЧНЫХ СЕРОТИПОВ ВБМ И АНТИТЕЛ К НИМ МЕТОДОМ БЛОКИРОВАНИЯ ИФА
Применив классический метод блокирования ИФА, определили общие и специфические для ВБМ, ВГИ и ВГК антигенные детерминанты.
Установлено следующее: 1) вакцинный ВГИ и инактивированный ВБМ штамм М не имеют общих антигенных детерминант; 2) индуцированный ВГИ gA содержит перекрестно реагирующие с ВГИ и ВБМ антигенные детерминанты, условно обозначенные Л и В. Детерминанта А не выявлена у вирионов иммуно-генного вакцинного ВГИ (штамм РС-126), атгенуированного ВБМ (штамм Кека-ва), но обнаруживается у вирулентных штаммов ВБМ (штаммы и Конкур) и неиммуногенного варианта ВГИ; 3) на поверхности клеток, инфицированных ВГИ, и морфологически зрелых вирионов имеются идентичные антигенные детерминанты; 4) установлена детерминанта, определяющая специфичность исследованных штаммов ВБМ (антигенная детерминанта Д); 5) обнаружена общая антигенная детерминанта на ВГК (штамм БВ-1) и клетках животного происхождения.
Следовательно, мы определили в ИФА общие и специфические антигенные детерминанты для ВГИ, ВГК, ВБМ и
2.1.4. ВЫДЕЛЕНИЕ АПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ ВГК И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ
Используя результаты исследований, касающиеся разнообразия антигенных детерминант различных серотипов вирусов БМ и особенностей антительного ответа у птиц, вакцинированных препаратами из штаммов ВГИ и ВГК, а также опираясь на литературные данные, мы пришли к выводу о возможности изучения циркуляции ВГК в конкретных регионах (птицехозяйствах) и его изолирования.
Применив общепринятые методики, мы выделили от птиц из благополучного по БМ птицехозяйства 5 изолятов ВГК. По результатам фокусообразования и серотипирования с помощью моноклональных антител на специфическую антигенную детерминанту классического ВГК штамм SB-1 (антитела получены на фирме "Select", США), мы определили, что выделенные штаммы принадлежат ко второму серотипу ВБМ.
Два из них, обозначенные нами как штаммы ВГК "42" и "50", были комиссионно изучены и задепонированы во ВГНКИ, а на способ их выделения получены Патенты № 2085582 и № 2085583. С 1993 г. штаммы используются как вакцинные в составе поливалентной вакцины против БМ.
В соответствии с разрешением Департамента ветеринарии МСХ РФ от 29.11.1993 г. № 19-4/721 проведен Комиссионный опыт по испытанию иммуно-генных свойств новой жидкой поливалентной вакцины против БМ.
Таблица 1
Зависимость эффективности вакцинации от состава вакцины
Труп Состав вакцины % БМ к пав- % БМ к общему Эффективность
па (ИАК*/доза) шим и вы- поголовью вакцинации, %
ВГИ изолят изолят нужденно
"42" "50" убитым
1 2000 300 300 0 0 100
2 2000 300 - 0,11 0,0077 99,8
3 2000 - 300 0,33 0,012 99,7
4 - 300 - 30, 86 2,0 50,98
5 - - 300 47,66 4,08 контроль***
6** 2000 - - 10,15 0,697 83,57
Примечание- * - иммунеактивные клетки; ** - коммерческие серии сухой моновалентной вакцины из штамма РС-126 ВГИ, изготовленные ГЩБК; *** - процент защиты птицы от БМ высчитывали по отношению к числу птиц с признаками БМ в группе 5.
Установлено (см. табл. 1)), что в группах 4 и 5 (птица привита штаммами «42» и «50», соответственно) заболеваемость птиц БМ составила по отношению к павшим и вынужденно убитым (санбрак) 30,86-47,66 %, а к общему поголовью -2,0-4,08 %. Высокий уровень заболеваемости птиц в данных группах свидетельствует о том, что ВГК не эффективен в монопрепарате. В то время как при
сочетанном применении с ВГИ (штамм FC-126) процент заболевания колеблется в пределах 0-0,33 % в группах I, 2 и 3 по отношению к павшей и вынужденно убитой птице и 0-0,012 % к общему поголовью. Это подтвердило явление протек-тивного синергизма ВГК в сочетании с ВГИ.
Таким образом, прогноз инфицированности птицы полевым штаммом ВБМ по наличию специфических антител в сыворотках крови цыплят на 90 день после вакцинации соответствует данным, полученным при патологоанатомическом учете больной птицы, и позволяет объективно оценивать и контролировать развитие эпизоотической ситуации в птицехозяйстве.
Зависимость иммуногенных свойств штаммов "42" и "50" ВГК от репродуктивной активности вируса в культуре клеток (Производственный опыт)
Особенностью ВГК низкого пассажа является слабое проявление цитопати-ческого действия на культуре клеток, что затрудняет учет инфекционной активности вируса по количеству ФОЕ. Из литературных источников известно, что ВГК в процессе репродукции приобретают гораздо большую склонность к мутациям, чем вирусы серотипов 1 или 3 (Calnek, B.W., Witter R. L., 1991). Учитывая эти обстоятельства, мы поставили перед собой задачу: определить зависимость иммуногенных свойств ВГК от его репродуктивной активности (или от соотношения показателей инфекционной активности, учтенной по ФОЕ, и иммунохи-мической активности, учтенной в ИФА по ИАК).
В работе была использована поливалентная вакцина (ВГИ + ВГК штамм № «42» + ВГК штамм № «50») (условное обозначение - вакцина "С"). ВГК в составе данной вакцины обладал низкой репродуктивной активностью, но принимал активное участие в ИФА. Для сравнения мы применили поливалентную вакцину, условно обозначенную "Д", в состав которой тоже входили ВГИ и ВГК (но с высокой репродуктивной активностью), при этом показатели инфекционности, учтенные по фокусообразованию, коррелировали с показателями, учтенными в ИФА.
Исследовали иммуногенную активность вакцин С и Д в птицехозяйстве, благополучном по БМ. В данном птицехозяйстве поливалентную вакцину приме-
няли с 1993 года и к моменту проведения опыта отмечали лишь единичные случаи БМ. Продолжительность опыта составила 300 дней.
Сохранность птицы в первой группе (где применена вакцина С) оказалась несколько выше, чем во второй (93,74 % и 92,60 %, соответственно).
В результате проведенных исследований сывороток крови в ИФА установлено, что на 55-65 сутки у всех цыплят обоих групп формировались антитела, реагирующие только с ВГИ. К 120 дню после вакцинации отмечали появление в крови антител, перекрестно реагирующих с ВБМ. Но, начиная со 120 дня после вакцинации, установлено достоверное снижение уровней антител к патогенным штаммам ВБМ, особенно в первой группе. К окончанию исследований у цыплят, привитых вакциной С, антитела к полевому ВБМ выявлялись лишь в 10 % исследованных проб, а у цыплят, привитых вакциной Д, подобные антитела выявлялись в 40-60 % исследованных проб.
Полученные данные свидетельствуют о том, что вакцина С на основе ВГИ и ВГК (штаммы "42" и "50" с низкой репродуктивной активностью), является более эффективной по сравнению с вакциной Д.
Таким образом, показано, что в данном случае лучшими протективными свойствами обладали вирусы герпеса индеек, объединенные для вакцинации цыплят с вирусами герпеса кур, которые проявляли низкую репродуктивную активность в культуре клеток.
Сравнительное изучение эффективности вакцин и вакцинных штаммов на вРР-цыплятах (Комиссионный опыт)
Для избежания негативного влияния трансовариальных антител при изучении поствакциналъного иммунитета у цыплят, привитых поливалентной вакциной, в состав которой входит ВГК с низкой или высокой репродуктивной активностью в культуре клеток, был поставлен Комиссионной опыт (Акт от 04 ноября 1996 г.). Было сформировано 7 групп БРР-цыплят, привитых в суточном возрасте препаратами на основе штаммов: 1 - "СУ1-988" (ВГНКИ); 2 - "Ь8-2" (модифицированный вариант штамма "РС-126"); 3 - "АО" (штамм 'ТС-126", изготовлен на фирме "Селект", США); 4 - поливалентная вакцина Д (изготовлена на Курской
биофабрике); 5 - поливалентная вакцина С (изготовлена на Курской биофабрике); б - матриксная расплодка штамма "РС-126М" (изготовлена на Щелковском биокомбинате); 7 - сухая вакцина на основе штамма "РС-126М" и безбелкового стабилизатора (изготовлена на Щелковском биокомбинате); в 8-ю группу вошли невакцинированные цыплята (контроль вирулентного вируса).
Цыплят на 7-е сутки после вакцинации заражали вирулентным ВБМ штамм который поддерживается во ВГНКИ. Продолжительность опыта составила * 78 дней после заражения. Через 51 день после заражения и по окончании опыта взяты пробы крови для определения в ИФА уровней антител к вакцинному и вирулентному ВБМ, а затем проведен убой и патологоанатомическое вскрытие всей птицы.
Установлено, что наиболее эффективной в условиях данного опыта оказалась поливалентная вакцина С, в состав которой входят штаммы "42" и "50" ВГК с низкой репродуктивной активностью в КККЭ (эффективность 100 %). Модифицированный штамм "Ь8-2", штамм "АО", матровая расплодка ВГИ штамм 'ТС-126М" и сухая вакцина из штамма "РС-126М" ВГИ создавали высокий уровень защиты против БМ (эффективность вакцинации составила 97,2 %, 89,3 %, 94,2 % и 89,8 %, соответственно). Вакцина Д, в состав которой входил ВГК с высокой репродуктивной активностью в КККЭ, оказалась менее эффективной (79,4 %).
Полученные данные свидетельствуют о том, что применение поливалентной вакцины, одним из компонентов которой является ВГК с низкой репродуктивной активностью, индуцирует стойкие иммунные реакции, ингиби-рующие репликацию ВБМ в организме цыплят. Напротив, использование в качестве компонента вакцины ВГК с высокой репродуктивной активностью в ККЭ » БРР-кур приводит к снижению эффективности вакцинации.
За период наблюдения в контрольной группе при патологоанатомическом исследовании 82,6 % птиц оказались с признаками БМ. При исследовании сывороток в ИФА в 75,8 % случаев обнаружены антитела к вирулентному ВБМ (разница статистически не достоверна, р > 0,1).
Итоги Комиссионного опыта указывают на возможность оценивать в ИФА эффективность конкретного штамма ВБМ по поствакциналъным реакциям в организме кур без контрольного заражения вирулентным вирусом.
В следующей серии опытов, дня отработки технологических процессов культивирования, выделенные нами штаммы № «42» и № «50» ВГК сравнивали по некоторым биологическим характеристикам с классическим штаммом SB-1 ВГК, полученным из ВГНКИ. Нами было определено:
1) Пассирование вируса в культуре клеток приводит к усилению репликатив-ной активности и изменению морфологии фокусов цитопатического действия (S-признак);
2) С повышением репликативной активности in vitro, уменьшается таковая in vivo, вплоть до полного прекращения горизонтальной передачи вируса у цыплят;
3) Степень репродуктивной активности, S-признак и урожайность бесклеточного вируса коррелируют между собой и, исходя из литературных данных, и с иммуногенностью;
4) Только низкопассажные вирусы усиливают эффективность ВГИ (протек-тивный синергизм).
Экспериментальные серии сухой бивалентной вакцины
Доказано, что сухие моновалентные вакцины из ВГИ не всегда обладают нужной степенью защиты птицы против вирулентных и особо вирулентных штаммов вируса болезни Марека, а жидкие моно- и поливалентные препараты не удобны при хранении и транспортировке, так как требуют наличия жидкого азота (температура - минус 196 °С).
ВГК, репродуцированный в КККЭ, прочно ассоциирован с клеткой. Поэтому получение клеточно-свободного ВГК ограничено количеством вируса, находящегося в культуральной жидкости (не более 1-3 %). Учитывая выше изложенное, нами была поставлена задача получить свободный от клеток вирус герпеса кур, пригодный для лиофилизации и способный увеличить иммуногенную активность штамма FC-126 ВГИ при использовании его в качестве второго (усиливающего) компонента при изготовлении сухой поливалентной вакцины против БМ.
С учетом культуральных и биологических особенностей ВГК были изготовлены экспериментальные серии сухой моновалентной и бивалентной вакцины (ВГИ + ВГК) и испытаны на безвредность, контаминацию чужеродными вирусами. а также иммуногенность в остром лабораторном опыте на базе Люберецкой производственно-диагностической лаборатории с разрешения ВГНКИ.
Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Сравнительная эффективность вакцинации сухими препаратами на основе живых вирусов в остром лабораторном опыте
№ Вид вакцины БМ, Эффективность
группы % вакцинации, %
1 ВГИ + ВГК нет 100
2 ВГИ (серия промышленная) 6,9 88,6
3 ВГИ (серия ВНИТИБП) 3,2 94,7
4 Контрольные не вакцинированные цыплята 60,4 0
Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о перспективности сухого препарата на основе ВГИ + ВГК для профилактики БМ и о возможности использования разнообразия свойств ВГК и их сильную изменчивость в пользу получения высокоэффективных препаратов.
Разработанный нами сухой препарат из штаммов РС-126 ВГИ и «42» и «50» ВГК в данный момент патентуется.
2.1.5. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВБМ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПЕРЕКРЕСТНОЙ СЕРОТИПИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ТЕРМОДЕНАТУРАЦИЯ АНТИГЕНОВ)
Фундаментальный интерес к механизму формирбвания иммунитета к БМ неразрывно связан с выявлением и изучением общих для всех трех серотипов ВБМ антигенов и антигенных детерминант. Поэтому целью данного этапа работы было получить и исследовать в ИФА специфичные и стабильные антигенные комплексы в непрогретых и прогретых УЗ-лизатах клеток, инфицированных различными серотипами ВБМ.
Штамм М ВБМ любезно предоставила Е.В. Баррос Палома (ВГНКИ) в инактивированном (формалином) и лиофилизированном виде. Сухие и восстановленные физиологическим раствором УЗ-лизаты клеток, инфицированные ВГК и ВГИ, подвергали термоденатурированию в водяной бане при 100°С в течение 515, 30, 45 и 60 мин. Специфичность, антигенную и инфекционную активность термообработанных и необработанных УЗ-лизатов, устанавливали в ИФА и титрованием на ККЭ БРР-кур.
В препаратах ВГИ, термообработанных в сухом виде при 100° С, инфекци-онность вируса, учтенная по ФОЕ, через 15 мин резко снижалась (на 98%) и полностью исчезала через 30 мин. Структурные компоненты антигена, перекрестно реагирующего в ИФА с АТ к ВБМ и с АТ к ВГИ, полностью сохранялись в течение всего периода термообработки. То есть, при таком способе воздействия на сухие препараты вирусные антигены, реагирующие с АТ к ВБМ и с АТ к ВГИ, оказались термостабильными.
Продемонстрировано, что антигены, реагирующие с сывороткой «1т» (получена на штамм «М»), оказались более чувствительными к нагреванию в натив-ном виде, по сравнению с антигенами, реагирующими с сывороткой «Курская» (получена на штамм РС-126 ВГИ). При взаимодействии антигенов с сывороткой Лпъ уже через 15 мин прогревания при 100°С исчезают сигналы, регистрируемые в ИФА.
Другие результаты получены для восстановленных физиологическим раствором антигенов, реагирующих с АТ к ВГИ. Сохранность их антигенной активности не зависела от времени термообработки и составила в среднем 44% по сравнению с исходным материалом. Инфекционность полностью утрачивалась через 15 мин.
В представленной работе удалось создать условия для выявления групп термолабильных и термостабильных структурных компонентов ВБМ 3 (ВГИ), схематически представленных на рисунках 3,4, 5.
Таким образом, использование метода термообработки препарата ВГИ в восстановленном виде позволяет получить антиген, реагирующий в ИФА только с сывороткой «Курская». Данный антиген применен при постановке ИФА в каче-
стве антигена ВГИ, при изучении гуморального иммунитета у кур, привитых moho-, би- и поливалентными вакцинами против БМ.
При изучении инфекционной и антигенной активности УЗ-лизатов клеток, инфицированных ВГК с высокой степенью ЦПД, получены результаты, указывающие на снижение инфекционности препарата уже через 15 мин термообработки в сухом виде (на 98,7%). Но, в отличие от сухого препарата ВГИ, для препарата ВГК в ИФА снижаются также и показатели оптической плотности, характеризующие сохранность антигенной активности (до 32,2% для антигенов, реагирующих с АТ к ВБМ и до 35,8% для антигенов, реагирующих с АТ к ВГИ).
АТкВБМ
АТкВГИ
АТкВБМ
АТкВГИ
Рис. 3. Инфекционный препарат Рис. 4. Препарат на основе ВБМ 3,
на основе ВБМЗ
АТкВБМ
инактивированный прогреванием в сухом ввде (100°С - 45 мин) АТкВГИ
Рис. 5. Препарат на основе ВБМ 3, инактивированный прогреванием в нативном виде (100°С - 45 мин)
Следовательно, в процессе термообработки динамика сохранности антигенной активности в сухих препаратах резко различается: перекрестно реаги-
руюшие антигены ВГИ полностью сохраняются (100%), перекрестно реагирующие антигены ВГК сохраняются частично (32,2 - 35,8%).
Инфекционность и антигенная активность восстановленных физиологическим раствором и подвергнутых термообработке препаратов ВГК, определяемых с АТ к ВБМ, уже через 5 мин не выявлялась. При этом антигенная активность, определяемая с АТ к ВГИ, утрачивалась лишь на 63,2 %. Эти данные свидетельствуют о большей устойчивости к экстремальным температурным воздействиям антигенов, реагирующих в ИФА с АТ к ВГИ. Очевидно, что антигены ВГК, определяющие перекрестную реакцию с АТ к ВБМ, находятся в термолабильных формах общего антигенного комплекса ВБМ.
Итак, в данной работе показано, что у ВГК с усиленным ЦПД начинают проявляться некоторые характеристики ВГИ. Так, у термоденатурированного в жидком виде ВГК стабилизируются антигены, реагирующие только с АТ к ВГИ.
В результате проведенных исследований, применив приемы термоденатурирования (в сухом или нативном виде) УЗ-лизатов клеток, инфицированных разными серотипами ВБМ, нами было подтверждено наличие индивидуальных отличительных признаков. Были получены следующие антигенные комплексы: а) перекрестно реагирующие с АТ к ВБМ и с АТ к ВГИ; б) реагирующие только с АТ к ВГИ; в) реагирующие только с АТ к ВБМ.
Изучение фракций, полученных при прохождении через колонку восстановленного физиологическим раствором и термоденатурированного прогреванием на водяной бане при 100° С в течение 10 мин бесклеточного ВГИ, показало, что данный режим термоденатурации позволяет получить монопрепарат, реагирующий только с антителами к ВГИ. Это дало возможность исключить стадию гель-хроматографии при изготовлении такого антигена.
При фракционировании инфекционного и термоинактивированного в сухом виде бесклеточного ВГИ, удалось получить2 пика: пик, содержащий антигены, перекрестно реагирующие с сыворотками «Конкур» и «Курская», и пик, содержащий антигены, реагирующие только с сывороткой «Курская».
Результаты электрофореза в полиакриаамидном геле (ПААГ) фракций тер-моииактивироваиных препаратов ВГИ позволяют сделать заключение, что за перекрестную реакцию с АТ ВБМ и АТ ВГИ ответственны белки с мол.м. 65,4 кД. Белки с мол.м. 83 кД отвечают за реакцию с АТ ВГИ.
Реагирующую только с сывороткой «Курская» фракцию обозначили как «белок В», а фракцию, перекрестно реагирующую с сыворотками «Курская» и «Конкур» - «белок С». Таким образом, сочетая приемы термоденатурации и фракционирования на колонке с сефадексом 6-200, получены белки В и С с различной антигенной активностью в серологических реакциях.
Белки В и С использованы в дальнейшем для получения идиотипических антител к неинфекционным антигенам ВГИ.
2.1.6. ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, ИМИТИРУЮЩИХ «ВНУТРЕННИЙ ОБРАЗ» АНТИГЕНОВ ВГИ
Принимая во внимание тот факт, что срок жизни бройлера 40-60 суток, и то обстоятельство, что весь мир приходит к необходимости вакцинации бройлеров против БМ, становится очевидным, что в данном случае выгоднее использовать для вакцинации неинфекционный препарат. Это может быть как термоинактиви-рованный ВГИ, так и АИД АТ, иммитирующие «внутренний образ» АГ ВГИ.
Поэтому мы приступили к изучению свойств идиотипических антител к инфекционным и неинфекционным препаратам ВГИ.
В ответ на введение неинфекционных антигенов В и С получали на морских свинках антитела первого (обозначили как ИД АТ-В и ИД АТ-С), а на цыплятах - второго порядка (обозначили как АИД АТ-В и АИД АТ-С).
Из результатов реакции блокировании нейтрализации (РБН) следует, что АИД АТ способны конкурировать с цельновирионным инфекционным ВГИ за связывание с нейтрализующими антителами, содержащимися в сыворотках «Курская» и «Конкур» (получена на штамм «Конкур» ВБМ). Максимальной блокирующей активностью обладали АИД АТ-В - инфекционная активность конкурирующего ВГИ составила 91,0±3,7 % от исходного числа ФОЕ.
В реакции блокирования ИФА получены следующие результаты: при смешивании моноспецифических к ВБМ или ВГИ сывороток и АИД АТ происходит снижение титров АТ 1 в сыворотках «Курская» и «Конкур» с 1:6400 и 1:3200 до 1:800. Таким образом, АИД АТ-В и АИД АТ-С конкурируют с исходным инфекционным антигеном ВГИ за связывание с антителами первого порядка, тем самым имитируя «образ» этого антигена.
Существенные различия между АИД АТ обнаружены в РДП. Установлено, что «внутренний образ» преципитирующего антигена имитируют только АИД
АТ-В.
Рис. 6. Лабораторная технологическая схема получения АИД АТ-В.
В результате проделанной работы получены АИД AT (антитела второго порядка), имитирующие «внутренний образ» инфекционного антигена ВГИ, обладающего высокой нейтрализующей и преципитирующей активностью. Итоговая лабораторная технологическая схема получения АИД AT представлена на рис. 6.
Таким образом, термоинактивированный антиген ВГИ обладает иммуно-генностью, а свойства индуцированного им каскада антител указывают на возможность использования в качестве неинфекционной вакцины не только термо-инактивированного ВГИ, но и АИД АТ-В, имитирующих «внутренний образ» инфекционного ВГИ. Разработанную технологическую схему получения АИД АТ-В мы рекомендуем использовать для получения неинфекционного вакцинного препарата против БМ.
2.1.7. ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВБМ
В последние годы авторы многочисленных исследований по структуре генома ВБМ и перекрестным реакциям с ВПГ человека предлагают отнести ВБМ к подсемейству Alphaherpesvirinae ( Becker Y., 1992; Izumega Y., 1998; et al.). Так Davidson I. (1995) показал, что чувствительные к нагреванию олигомеры структурного антигена В ВБМ содержат корформационные эпитопы, родственные оли-гомерам гликопротеина В (gB) ВПГ-1 и ВПГ-2. Из трех наиболее изученных антигенов (А, В, D) только gB индуцирует антитела, степень иммунологической защиты которых можно выразить количественно (Nazerian К., 1992; Jang Н.К., 1996). gA выделяется in vitro и in vivo и не имеет отношения к онкогенности (Liu X., 1992), тогда как gD появляется в чистом виде только in vitro и участвует в проникновении вируса в клетку (Anderson A.S., 1998).
Целью настоящего этапа работы явилось исследование клеточно-свободных термоденатурированных лизатов, исходных сухих и клеточно-ассоциированных препаратов ВБМ в ИФА, в РДП и в РН с применением монотипичных (поликлональных) сывороток, а также анализ антигенного сходства поверхностных белков gB и gD разных серотипов ВБМ и ВПГ человека с помощью
МАТ, направленных к белкам ВПГ, с использованием двух модификаций ИФА и реакции непрямой иммунофлуоресценции.
В ИФА, РДП и РН показано, что полученные на неинфекционный антиген антитела сывороток морских свинок способны нейтрализовать инфекционный ВГИ. Эти данные свидетельствуют о наличии в термоденатурированном неинфекционном сухом препарате лизата клеток, зараженных ВГИ, антигена В, индуцирующего синтез вируснейтрализующих антител.
Для детекции белка ^ в препаратах ВБМ трех серотипов в ИФА использовали МАТ 4{6 по схеме двойного антительного «сэндвича».
Установлено, что ВБМ и ВПГ содержат общую антигенную детерминанту в белке ¿О. Исследование белка дО позволяет четко идентифицировать ВГК и ВГИ, когда они фиксировались в термоденатурированной форме в сухом виде. Так, §0 выявляется как в исходном сухом препарате ВГИ, так и в термоденату-рировнной форме, а в препарате ВГК только в исходном виде. То есть, для ВГИ является термоустойчивым белком, а для ВГК - термолабильным. На поверхности клеток, инфицированных ВГИ, §0 выявляется только методом двойного "сэндвич" в ИФА. Нами было показано, что ВБМ не содержит антигенной детерминанты, опознаваемой МАТ 2С к белку ВПГ человека.
2.1.8. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВБМ С ПОМОЩЬЮ НЦР
Основной целью данного этапа работы являлась отработка постановки ПЦР для выявления ДНК вирусов болезни Марека 1 и 3 серотипов.
В результате подбора праймеров, оптимизации режима проведения реакции (буферная система, концентрация ионов магния, оптимальная температура отжига праймеров) были отработаны условия постановки ПЦР для выявления ДНК ВБМ 1 и 3 серотипов. Электрофоретический анализ ПЦР продуктов различных штаммов ВБМ показал, что полученные фрагменты имели размеры, соответствующие расчетному значению 200 п.н. (ВБМ, штамм НР118-16) и 388 п.п. (ВГИ, штамм РС-126).
Получены также данные, свидетельствующие о том, что электрофоретический анализ продуктов амплификации последовательностей генома с праймера-
ми, фланкирующими инвертированные повторы длиной 132 п.н., позволяет дифференцировать исследуемый вирулентный (онкогенный) штамм HPRS-16 от вакцинных штаммов 2 и 3 серотипов.
2.1.9. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ АНТИТЕЛ КЛАССА IgG В КОЛЛЕКЦИОННЫХ СЫВОРОТКАХ, РЕАГИРУЮЩИХ С РАЗНЫМИ
СЕРОТИПАМИ ВБМ
Разработанная в лаборатории методика ИФА используется для выявления антител класса IgG у цыплят, невакцинированных и вакцинированных различными вакцинными препаратами против БМ. Мы применили эту методику для изучения коллекционных анти-ВБМ сывороток, собираемых в лаборатории с 1986 года.
Наличие антител в сыворотке крови кур определяли к двум серовариантам ВБМ, не несущим общих антигенных детерминант: к первому - инактивирован-ному штамму Jm ВБМ и третьему - термоинактивированному ВГИ шт. FC-126. Применение в качестве антигена для ИФА термоинактивированного ВГИ позволило стандартизировать реакцию ИФА, т.к. использовали препарат, приготовленный в одинаковых условиях и длительно хранящийся в условиях бытового холодильника без изменения сорбционных и антигенных свойств.
Кроме того, определяли уровни антител к контрольному отрицательному антигену неинфицированной культуры клеток куриного или перепелиного эмбрионов (КК). Если величина ОП сыворотки с КК достигала 0,30 o.e. и менее, результат считали отрицательным, а специфичность сыворотки к антигенам ВГИ и ВБМ определяли по разнице значений положительных и отрицательных антигенов (ДОП). Если величина ОП сыворотки с КК достигала более 0,40 o.e., то учитывали числовые значения для всех трех антигенов без вычитания.
В 1986 г. во ВНИТИБП была основана постоянно пополняемая лабораторная коллекция поликлональных сывороток кур, в которую вошли 6 контрольных сывороток, полученных в лабораторных условиях, и более 500 образцов полевых сывороток из птицехозяйств.
РОС. НАЦИОНАЛ- «■ БИБЛИОТЕКА i ClfeMtfVpr
Начало коллекции сывороток было положено образцами, полученными из ВГНКИ на штамм «Конкур» ВБМ (19.06.1986). Штамм «Конкур» - это ВБМ средней вирулентности, вызывающий в острых лабораторных опытах до 40 % случаев БМ среди невакцинированной птицы. Этот штамм индуцирует специфические антитела, перекрестно реагирующие с антигенами ВГИ и ВБМ с примерно равными высокими показателями значений оптической плотности в ИФА. Сыворотка, полученная на штамм, условно обозначена нами как сыворотка «Конкур» (см. рис.7). С антигеном КК данная сыворотка не реагирует. В ИФА зафиксирована только фоновая реакция (низкие значения ОП).
1,8 п 1,6 1,4 -1,2 1
0,8 0,6 н
0,4 -0,2 0
га
|
йн
Сы воротки
[{¡значение оп для анти-вги антител. Означение оп для анти-вбм антител, БЗзначение оп для анти-КК антител
Рис. 7. Гистограммы распределения антител в коллекционных контрольных сыворотках к антигенам ВГИ, ВБМ и КК.
20.10.1986 г. коллекцию пополнили полученными на штамм РС-126 ВГИ сыворотками 8РР-цыплят в условиях вивария Курской биофабрики. В те годы данный штамм в острых комиссионных опытах вызывал 88-92 % защиту цыплят от БМ. Штамм РС-126 ВГИ индицирует специфические антитела, реагирующие только с ВГИ. Эта сыворотка получила условное обозначение «Курская» (см. рис.7).
Следующими образцами стали сыворотки, обозначенные как «.1т», полученные в условиях вивария ВГНКИ на штамм 1ш ВБМ. Штамм является высоковирулентным, вызывает 80-90 % случаев БМ у зараженных и не вакцинирован-
ных цыплят и индуцирует специфические антитела, реагирующие только с первым серотипом ВБМ (см. рис.7).
Затем (27.01.1992 г.) на фирме «Селект» (США) доктором биологических наук Лукиной В.А. было получено два образца сывороток: 1) в штате Алабама -на бивалентный препарат FC-126 + SB-1 (3 и 2 серотипы ВБМ) и 2) в условиях вивария фирмы - на вакцинный моновалентный препарат CVI-988 (1 серотип ВБМ). Бивалентный препарат в острых лабораторных опытах вызывал 90-95 % защиту цыплят от БМ, а препарат на основе CVI-988 - 95-100 % защиту. Гистограммы экспериментального исследования сывороток, индуцированных этими штаммами и реагирующих с антигенами ВГИ, ВБМ и КК, резко отличаются друг от друга и от предыдущих гистограмм для сывороток «Конкур» и «Курская». Сыворотка «Алабама», полученная на бивалентный препарат (см. рис.7), активно реагирует с антигенами ВГИ и КК и не взаимодействует с антигеном ВБМ, а сыворотка «Селект», полученная на препарат CVI-988, активно взаимодействует с одинаково высокими показателями оптической плотности со всеми антигенами.
Известно, что при активации Т-лимфоцитов цыплят на этих клетках образуется MATSA (опухоле-ассоциированный поверхностный антиген), который при определенных условиях индуцирует выработку антител к данному антигену (Dandapat S., Pradhan Н. К., Mohanty G.C., 1994, Ross N.J., 1999). Эти антитела, так как MATSA является антигеном хозяина (Calnek, B.W., Witter R. L., 1991), очевидно должны реагировать с культурой клеток эмбрионов кур. Кроме того, моноклональные антитела, полученные на MATSA, реагируют с нормальными клетками цыплят, подтверждая мысль о том, что MATSA может иметь общий эпитоп с опухолевыми и нормальными клетками цыплят.
Однако, высоковирулентные штаммы (например, шт. «Jm» ВБМ) также трансформируют Т-лимфоциты. Но антитела к данному антигену у таких цыплят не выявляются (см. рис. 7) видимо из-за сильного депрессивного воздействия на иммунную систему. Поэтому обнаруженные нами в сыворотках «Алабама» и «Селект» перекрестно реагирующие с КК, ВГИ и ВБМ антитела могут свидетельствовать о наличии антигена MATSA в сыворотке крови цыплят, вакцинированных бивалентными препаратами или аттенуированными штаммами первого серо-
типа ВБМ, что, в свою очередь, указывает на отсутствие иммунодепрессивного действия названных вакцинных препаратов (SchatK.A., 1992).
Таким образом, впервые показано, что контрольный отрицательный антиген КК в совокупности с антигенами ВГИ и ВБМ может быть использован для выявления и дифференциации антител, индуцированных бивалентной вакциной на основе ВГИ + ВГК, моновалентной вакциной на основе атгенуированного штамма ВБМ 1-го серотипа и патогенными штаммами.
На протяжении почти 20 лет мы пополняли коллекцию сыворотками, полученными из птицехозяйств с различной эпизоотологической обстановкой по БМ. Установили, что все полевые образцы также подразделялись на 6 групп, аналогичных группам коллекционных лабораторных сывороток. Наличие большого процента сывороток типа «Конкур» и «Jm» (в сумме 38,5%) и 14 % отрицательных сывороток свидетельствует об ак1ивной циркуляции вирулентных полевых штаммов в исследованных хозяйствах, а также о проблемах, связанных с неэффективной вакцинацией против БМ.
Следовательно, по значениям ОП в ИФА при использовании антигенов ВГИ, ВБМ и КК можно дифференцировать сыворотки, полученные при вакцинации и/или заражении цыплят разными серотипами ВБМ, что в свою очередь позволяет делать выводы об успешно прошедшей вакцинации и о полевых штаммах ВБМ, циркулирующих в птицехозяйстве. А применение широкого набора антигенов и антител при постановке ИФА предоставляет возможность в каждом конкретном случае подбирать вакцинный препарат с оптимальным сочетанием антигенов для получения полноценного антительного ответа против вирулентных и очень вирулентных штаммов ВБМ.
Таким образом, нами предложен метод оценки поствакцинального и/или инфекционного процесса при БМ по уровню и качественному составу гуморальных антител, вырабатываемых иммунной системой птиц на внедрение в организм ВБМ.
2.1.10. ДИНАМИКА РАЗВИТИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У КУР, ПРИВИТЫХ MOHO-, БИ- И ПОЛИВАЛЕНТНЫМИ ВАКЦИНАМИ ПРОТИВ БМ
Для логического завершения работы по изучению активности и специфичности коллекционных сывороток возникла необходимость исследования динамики и структуры распределения антител в сыворотках, полученных от вакцинированной птицы из птицехозяйств с различной степенью благополучия по БМ.
Первая стадия поствакцинального иммунитета при БМ характеризуется продукцией вируснейтрализующих антител и подавлением размножения патогенного вируса. Однако определенное влияние на развитие гуморальных реакций в организме цыпленка оказывают материнские антитела к вакцинным и патогенным ВБМ, а также качество применяемых для профилактики БМ препаратов. Необходимо учитывать и реакцию организма цыпленка на введение вакцинного препарата.
Сравнительное изучение динамики гуморальных антител против ВГИ и ВБМ в птицехозяйстве позволило сделать следующее заключение. В сыворотках суточных цыплят в 100 % исследованных проб выявлялись высокие уровни материнских антител, плавное или резкое снижение которых коррелировало с качественным и количественным составом вакцины. В разных опытах в группах цыплят с высоким отходом от БМ первый подъем уровня антител, реагирующих с ВБМ, происходил в разные сроки и зависел от многих причин, в том числе от вирулентности полевого штамма ВБМ, от промежутка времени между вакцинацией и инфицированностью цыплят полевым ВБМ, от содержания иммунохимически активных вирионов ВГИ и концентрации gA в вакцине. Так, отличительной особенностью сывороток, полученных от цыплят одной из групп, где вакцинация проводилась препаратом с избыточным содержанием gA, является отсутствие материнских антител, реагирующих с ВБМ уже на 10 день после вакцинации. У цыплят, вакцинированным препаратом с нормальным количеством gA, содержание материнских антител против ВГИ и ВБМ плавно снижалось к 30 дню после вакцинации.
Высота уровня специфических антител, выявляемых на 40, 50 и 60 день в ответ на вакцинацию препаратом на основе ВГИ коррелировала со степенью специфической защиты. Следует заострить внимание на том, что указанные сроки появления специфических антител были характерны для того периода, когда в превалирующем большинстве птицехозяйств применялась моновакцина на основе ВГИ отечественного производства. В последующие голы появились разнообразные профилактические препараты на основе различных штаммов ВБМ, что определенным образом отразилось на качестве вакцинального процесса. Учитывая эти обстоятельства, мы продолжили работу по изучению влияния состава вакцинных препаратов на качество вакцинального процесса.
Определение серологического статуса вакцинированной против БМ птицы с целью оценки качества применяемых препаратов (Комиссионный опыт 1)
Учитывая положительные результаты использования ИФА при определении качества вакцины на основе ВГИ и желая проверить возможности этого метода на практике, мы, по просьбе ВГНКИ (письмо N 708/3 от 8.10.93.), приняли участие в Комиссионном опыте, в котором были применены пять заранее зашифрованных вакцин против БМ. Этими препаратами прививали цыплят в суточном возрасте, в 7-дневном возрасте их заражали патогенным штаммом ВБМ. Опыт проводили в птицехозяйстве 3 на базе ВГНКИ.
Перед нами были поставлены задачи: а) идентифицировать примененные препараты по индуцированным антителам, б) определить эффективность вакцинации с помощью ИФА.
Поэтому при исследовании сывороток от цыплят 45-дневного возраста, привитых зашифрованными препаратами, полученные показатели сравнивали с показателями для контрольных сывороток.
Анализ результатов свидетельствует, что сыворотки групп 1 и 2 имели аналогичные с контрольной сывороткой на ВГИ показатели. Следовательно, препараты, используемые для вакцинации птиц в этих группах, были изготовлены на основе серотипа 3 ВБМ. Сыворотки групп 3 и 5 имели идентичные показатели в сравнении с контрольной сывороткой на штамм "Конкур" ВБМ, так как реагиро-
вали в ИФА как с ВГИ, так и с Можно предположить, что эти цыплята привиты вакцинными вирусами, имеющими антигенный состав, приближенный к апа-тогенным вариантам серотипа 1 ВБМ. Сыворотки группы 4, которые реагировали только со штаммом ВБМ, взяты от контрольных невакцинированных цыплят, зараженных в семидневном возрасте патогенным вирусом.
Выявленное по группам соотношение антител, реагирующих с ВГИ и с Лгп, указывает на то, что лучшими (р<0,01) в Комиссионном опыте оказались препараты, зашифрованные под номерами 3 и 5 (эффективность вакцинации 81,0 % и 93,6 %). Следующим по качеству был препарат под номером 2 (эффективность вакцинации всего 76,0 %) и худшим препарат под номером 1 (эффективность вакцинации составила лишь 57,6 %).
Используемые в Комиссионном опыте препараты по тождественности взаимодействия сывороточных антител с антигенами отнесены: в группах 1 и 2 к серотипу 3 ВБМ; в группах 3 и 5 к апатогенным вариантам серотипа 1 ВБМ. При составлении Акта и дешифровке опыта наши предположения подтвердились.
Таким образом, представленные данные Комиссионного опыта 1 свидетельствуют об эффективности ИФА для идентификации примененных препаратов и оценки эффективности вакцинации по количеству положительно прореагировавших цыплят.
Изучение эффективности вакцинации различными серотипами ВБМ и их сочетаниями (Комиссионный опыт 2)
Одновременно с Комиссионным опытом 1 на базе неблагополучного по БМ птицехозяйства (письмо N 709/3 от 8.10.93. из ВГНКИ) был проведен Комиссионный опыт 2 по изучению эффективности вакцинации препаратами на основе различных серотипов ВБМ и их сочетаний. Параллельно с исследованием в ИФА вакцин из разных штаммов и сывороток крови оценивали эпизоотологическую ситуацию по БМ в птицехозяйстве по результатам патологоанатомических изменений у птиц.
Исследование проб сывороток крови кур 120-дневного возраста, вакцинированных опытными образцами вакцин из ВГИ, ВГК и ВБМ в различных сочета-
ниях свидетельствовало о том, что вакцины в разной степени предотвращали ин-фицированность птицы полевым вирусом. Более эффективным оказался бивалентный препарат, состоящий из штаммов TJI (ВГИ) + SB-1 (ВГК), который предотвратил проявление заболевания у большего числа цыплят. Иммуногенность -72,1 %. Худшей оказалась моновалентная вакцина на основе штамма TJT ВГИ -эффективность вакцинации 59,1 %. Учитывая тот факт, что применение препарата считается обоснованным при величине эффективности вакцинации не менее 80 %, было сделано заключение о том, что ни один из предложенных вариантов вакцин не обладал способностью эффективно защитить птицу от БМ.
ИФА был использован и для характеристики вакцинных штаммов ВБМ. Это показано на примере штамма "CVI-988" ВБМ (ВГНКИ). Для этого исследовали сыворотки крови 60-дневных цыплят, вакцинированных этим штаммом, но не зараженных вирулентным ВБМ. В 76,6 % проб сывороток выявили антитела к штамму "CVI-988", в 23,4 % случаев антитела отсутствовали. Был сделан прогноз, что данный препарат способен предотвращать заболеваемость у 70-80 % вакцинированных цыплят. Часть вакцинированных в суточном возрасте цыплят этой же группы были заражены в 7-дневном возрасте штаммом Jm ВБМ. Эффективность вакцинации по результатам патологоанатомического вскрытия составила 72,7 %, полностью подтвердив предварительный прогноз.
Проведенные исследования легли в основу методики определения серологического статуса вакцинированной против БМ птицы и характеристики качества вакцины иммуноферментным методом.
Динамика антител в сыворотках цыплят из птицехозяйств с различной степенью благополучия по БМ
Исследования проводили в трех птицехозяйствах, применяющих разные вакцины и имеющих разные уровни носительства ВБМ у привитой птицы. Степень благополучия по БМ устанавливали до исследования сывороток в ИФА на основании патологоанатомических и клинических признаков у привитой птицы.
Наиболее информативным и важным для определения напряженности иммунитета в ИФА считаем возраст 50-65 дней, т.к. составленный именно в этом
возрасте прогноз вакцинации полностью подтверждается для птиц старшего возраста.
Птицу считали с хорошим иммунным фоном к ВГИ при напряженности иммунитета в возрасте 5о-65 день 80 % и более (т.е. если в 80 % и более проб сывороток крови титр антител к ВГИ достигал значений 1:200 и выше). При этом у цыплят данного возраста должны полностью отсутствовать антитела к ВБМ.
Если в 90-дневном возрасте по хорошему иммунному фону к ВГИ определялись антитела к ВБМ у менее чем 50 % цыплят, такое птицехозяйство считали благополучным по БМ. Увеличение до 80 % количества птиц-носителей ВБМ при наличии клинических и патологоанатомических признаков БМ является веским основанием для объявления хозяйства неблагополучным по БМ.
Известно, что моновалентная вакцина на основе ВГИ предотвращает заболевание и развитие лимфом, но не препятствует инфицированию полевым вирусом БМ, персистированию вирулентного вируса и выделению его в окружающую среду. В подтверждение сказанному в птицехозяйстве 1, длительное время применяющем моновакцину из ВГИ, в 90-дневном возрасте, у 30 % птиц, в сыворотках обнаружены перекрестно-реагирующие антитела.
По результатам исследования в ИФА сывороток крови кур из птицехозяй-ства 1 и по эпизоотологическим данным сделано заключение, что, несмотря на единичные случаи клинического проявления БМ, это птицехозяйство - благополучное по БМ, с хорошим иммунным статусом к ВГИ, благодаря вакцинации.
В отличие от первого птицехозяйство 2, также применяющее моновалентную вакцину на основе ВГИ, нельзя назвать благополучным по БМ. Полученные результаты (напряженность иммунитета в 60 дней 40 %, при наличии 20 % сывороток, содержащих антитела к ВБМ) свидетельствуют о том, что в этом птицехозяйстве либо плохо была проведена вакцинация, либо применена не качественная вакцина, либо активная циркуляция полевого ВБМ повлияла на приживление вакцинного вируса.
В птицехозяйстве 3 применяли поливалентную вакцину (ВГИ + ВГК) производства Курской биофабрики. Там тоже имели место единичные случаи заболевания, подтвержденные клинически. Результаты, полученные в ИФА, свиде-
тельствуют о том, что в 55-65 дневном возрасте 100 % птиц имеют антитела к ВГИ и 10 % - к ВБМ. Следовательно, птица имеет хороший иммунный фон. К 90-днсвному возрасту в этом птицехозяйстве по высокому иммунному фону нарастает количество цыплят, в крови которых обнаружены перекрестно-реагирующие с ВГИ и ВБМ антитела. К 128-дневному возрасту количество таких птиц стабилизируется (20 %), а, начиная с 200-дневного возраста, уменьшается до 10 %. Таким образом, в птицехозяйстве 3 вакцинацию можно признать эффективной, поскольку у подавляющего числа птиц по всем возрастам выявлены антитела к ВГИ в высоких титрах.
Таким образом, ira в одном из птицехозяйств вакцинация не препятствовала инфицированию цыплят полевым ВБМ. Отмечен высокий процент выбраковки и падежа от БМ в неблагополучном по ЬМ птицехозяйстве 1 (18 %); в благополучных по БМ птицехозяйствах 2 и 3 - лишь 0,64 % и 0,20 %, соответственно.
Полученные сведения полностью подтвердили данные о том, что применение поливалентной вакцины в птицехозяйствах дает стойкие и продолжительные иммунные реакции, ингибирукнцис репликацию ВБМ в организме птиц, начиная со 120-дневного возраста.
На основании представленных данных разработан метод оценки серологического статуса и напряженности иммунного ответа у вакцинированной против БМ птицы по выявлению антител к разным серотипам ВБМ в сыворотке крови кур с помощью ИФА.
Итак, в диссертационной работе показано, что невозможно полностью «освободить» птицехозяйство от циркуляции полевых штаммов ВБМ. Поэтому необходима перманентная корректировка стратегии вакцинопрофилактики. Доказано, что гуморальный поствакцинальный иммунитет у кур к БМ зависит от эпизоотической ситуации в хозяйстве (циркуляция патогенных вариантов ВБМ), от валентности вакцинного препарата (moho-, би- и поливалентные вакцины), от качества вакцинных препаратов (наличие зрелых форм вирионов и нуклеокапси-дов), чередования применяемых вакцин (альтернативная вакцинация), а также от
уровня и качественного состава трансовариальных антител. При выборе вакцинного препарата появилась возможность учитывать с помощью ИФА перечисленные факторы, влияющие на развитие поствакцинального иммунитета к БМ. Показано, что грамотно примененный препарат, соответствующий эпизоотической обстановке в конкретном птицехозяйстве, приводит к снижению циркуляции патогенных штаммов, что, в свою очередь, способствует общему оздоровлению пти-цепоголовья.
3. ВЫВОДЫ
3.1. Разработана тест-система ИФА для детекции антигенных детерминант штаммов ВБМ, позволившая создать наборы ИФА (ТУ 9383-038-00008064-97) для количественного учета полноценных вирионов и иммуноактивных клеток в составе вакцинных препаратов против БМ.
3.2. Научно обоснован способ получения иммунохимически чистого препарата IgG желтка яиц кур сочетанием методов препаративной биохимии: ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, осаждения неионными полимерами, центрифугирования (A.c. N 1497811), пригодного для создания компонентов тест-систем ИФА (получение антисыворотк и синтез конъюгата).
3.3. Синтезирован иммунопсроксидазный антивидовой конъюгат (анти-IgG кур) (патент за № 2202369 от 20.04.2003), который использован для идентификации антигенных детерминант и серовариантов ВБМ, дифференциации антител к ним, индикации гликопротеинного низкомолекулярного gA и антител к нему, оценки биологической активности вакцин против БМ в различных модификациях имму-ноферментного анализа.
3.4. Изучен морфологический состав вирусной популяции в производственных сериях вакцины против БМ на основе ВГИ, что позволило определить прямую зависимость между количеством полноценных вирионов в вакцине и качеством вакцинных препаратов.
3.5. Разработан и внедрен в производство способ стабилизации ВГИ в безбелковой среде, позволяющий готовить сухую моновалентную вирусвакцину с длительным сроком хранения при +4° - +8° С (приоритетная справка N 5015791/13).
3.6. Разработаны методы выделения от невакцинированной птицы из благополучных по БМ птицехозяйств апатогенных штаммов вируса герпеса кур и их идентификации в ИФА. Выделено пять изолятов, два из которых, под номерами "42" и "50", депонированы во ВГНКИ в качестве производственных вакцинных штаммов. Эти штаммы в совокупности с ВГИ используются для изготовления би- и поливалентной вакцины против БМ (патенты N 2085582 и N 2085583).
3.7. Впервые разработан способ получения бесклеточного ВГК, на основе которого создана сухая поливалентная вакцина против БМ.
3.8. Показано, что у клеточно-свободного препарата ВГК с сильным ЦПД преобладают некоторые характеристики ВГИ.
3.9. На основе термоденатурации (в сухом и нативном виде) препаратов ВБМ разных серотипов, получены следующие антигенные комплексы:
- перекрестно реагирующие с АТ к ВБМ и с АТ к ВГИ;
- реагирующие только с АТ к ВГИ;
- реагирующие только с АТ к ВБМ.
ЗЛО. Получены перекрестно реагирующие неинфекционные антигены, стимулирующие выработку антител, обладающих преципитирующей и вируснейтрали-зующей активностью.
3.11. Выделены неинфекционные специфические антигены с различной имму-нохимической активностью в серологических реакциях из термоинактивирован-ных препаратов ВГИ, пригодные для получения высокоактивных идиотипиче-ских антител. Установлено, что иммунизация цыплят ИД АТ вызывает образование антиидиотипических антител, имитирующих «внутренний образ» антигена ВГИ, отличающихся по способности конкурировать с цельновирионным вирусом за связывание с вируснейтрализующими антителами (индекс блокирования нейтрализации 91% и 62%, соответственно). Установлено, что в РДП со специфическими сыворотками вступают только АИД АТ (1:64—1:128), в основе получения которых использован белок, реагирующий в ИФА только с анти-ВГИ сывороткой.
3.12. Отработаны условия «сэндвич» и непрямого варианта ИФА для выявления белка в вируссодержащих препаратах с использованием моноклональных
(4f6) и поликлональных антител. Установлено, что ВБМ и ВПГ содержат общую антигенную детерминанту в белке gD, позволяющую идентифицировать ВГК и ВГИ.
3.13. Отработаны условия постановки ПЦР с использованием праймеров, комплементарных вариабельным участкам последовательности гена гликопротеина А ВБМ 1 и 3 серотипов, что позволило выявлять ДНК вакцинных и вирулентных штаммов в пробах патматериала и зараженных культур клеток, содержащих 100 ФОЕ/см3 вируса.
3.14. Систематизирована и исследована в ИФА лабораторная коллекция поликлональных сывороток, полученных в лабораторных опытах, а также из птицехо-зяйств. Впервые показано, что контрольный отрицательный антиген КК в совокупности с антигенами ВГИ и ВБМ может бьггь использован для выявления и дифференциации антител, индуцированных бивалентной вакциной на основе ВГИ + ВГК, моновалентной вакциной на основе аттенуированного штамма ВБМ 1-го серотипа и патогенными штаммами.
3.15. Изучена динамика антител к антигенным комплексам ВБМ в условиях птицехозяйств с использованием модифицированного варианта ИФА. Показано, что количество суточных цыплят с перекрестно реагирующими антителами позволяет судить о степени инфицированное™ кур-несушек полевым вирусом. Уровень антител к вакцинному и полевому вирусу на 55-65 дни позволяет оценить профилактическую эффективность применяемой moho-, би- или поливалентной вакцины против БМ, а их динамика на 90-й, 120-й и 240-й дни подтверждает прогноз по БМ. Результаты мониторинга антител свидетельствуют о том, что ВГК с низкой репродуктивной активностью в культуре клеток в совокупности с ВГИ ингибирует репликацию вирулентного ВБМ, начиная со 120-дневного возраста.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
4.1. Результаты проведенных исследований отражены в «Методических рекомендациях по оценке биологической активности вакцин против болезни Марека
иммуноферментным методом» (рассмотрены и одобрены на секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины РАСХН) и использованы при разработке нормативно-технической документации по изготовлению, контролю и применению набора для оценки биологической активности вакцин против БМ в ИФА (утверждена в департаменте Ветеринарии РФ 26 июня 1997 г.). Разработанный набор прошел апробацию на ГЩБК с положительным результатом. Опытная партия наборов изготовлена в лаборатории по разработке и производству противовирусных биопрепаратов ВНИТИБП.
Наставления по применению набора включены в «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом», допущенные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий (1998 г, стр. 136-145).
4.2. Предложенный способ стабилизации ВГИ в безбелковой среде применяется на ГЩБК с 1992 при производстве сухой вирусвакцины против БМ на основе штамма РС-126М ВГИ.
4.3. Выделенные из благополучного по БМ птицехозяйства штаммы "42" и "50" ВГК применены в качестве компонентов поливалентной вакцины против БМ.
4.4. Разработанный способ определения иммуноглобулинов класса в в сыворотках крови невакцинированной и вакцинированной против БМ птицы позволил прогнозировать гуморальный поствакцинальный иммунитет у кур к вакцинным и полевым вирусам БМ.
4.5. Разработанные «Методические рекомендации по выявлению антител к вакцинному вирусу герпеса индеек и вирусу болезни Марека в сыворотке крови кур иммуноферментным анализом» (рассмотрены и одобрены на секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины РАСХН), основанные на данных изучения закономерностей гуморального поствакцинального иммунитета у кур, привитых моно-, би- и поливалентными вакцинами против БМ, позволяют прогнозировать эффективность вакцинации без контрольного заражения цыплят вирулентным вирусом БМ, могут быть применены для оценки серо-
логического статуса вакцинированной птицы и напряженности иммунитета у привитых против БМ цыплят в птицехозяйствах.
4.6 Разработанные «Методические указания по выявлению ДНК вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции», могут быть использованы для выявления вирусной ДНК и идентификации возбудителя в патологическом материале и вируссодержащей культуральной жидкости.
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я., Бобровская И.В., Румянцева И.В., Скороходова Л.А. К проблеме вируса болезни Марека. Получение антигенов вируса болезни Марека, различающихся по перекрестной се-ротипической активности // Вестник РАСХН, 2001, № 5, с. 67-70.
2. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я., Бобровская И.В., Румянцева И.В., Скороходова Л.А., Климова P.P., Масалова О.В., Кущ А.А, К проблеме вируса болезни Марека. Применение поли- и моноклональных антител для выявления структурных белков вируса болезни Марека // Вестник РАСХН, 2001, № 5, с. 67-70.
3. Ярыгина Е.И., Хашин О.В., Кузнецов Д.П. Репродукция вируса гриппа А птицы в аллантоисной полости и первично-трипсинизированной культуре клеток куриных SPF-эмбрионов // Доклады РАСХН, Москва, 2004, № 6, с. 48-50
4. Ярыгина Е.И. Разнообразие поликлональных антител к серотипам вируса болезни Марека как один из критериев поствакцинального ответа // Доклады РАСХН, Москва, 2005, №5.
5. Ярыгина Е.И. Поствакцинальные антитела как критерий благополучия пти-цехозяйства по болезни Марека // Вестник РАСХН, Москва, 2005, № 3, с. 77-79.
6. Ярыгина Е.И. Неинфекционные препараты вируса герпеса индейки: получение и антигенные свойства // Достижения науки и техники АПК, Москва, 2005, № 3, с. 35-36.
7. Ярыгина Е.И., Бойко A.A., Шкварук Т.Я., Клюкина В.И., Панферова С.М. Способ получения иммунохимически чистого препарата IgG желтка яиц кур // Авторское свидетельство № 1497811 от 01.04.1989 г.
8. Бобровская И.В., Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Румянцева И.В., Еремец В.И., Самуйленко А.Я. Способ изготовления иммунопероксидазных конъюгатов // Патент 2202369,20 апреля 2003.
9. Лукина В.А., Панова С.Г., Пухова Н.М., Ярыгина Е.И. Способ получения антигена вируса герпеса индеек // Положительное решение по приоритетной справке №5015791 от 06.12.1991,1994.
10. Лукина В.А., Баррос Палома Е.В., Быкова H.H., Ярыгина Е.И., Шевырев Н.С., Безгин В.М., Серебрякова В.Н. Штамм вируса герпеса кур как компонент для изготовления бивалентной вакцины против болезни Марека Патент № 2085582 от 27.07.1997.
11. Лукина В. А., Баррос Палома Е.В., Быкова H.H., Ярыгина Е.И., Шевырев Н.С., Безгин В.М., Серебрякова В.Н. Штамм вируса герпеса кур как компонент для изготовления бивалентной вакцины против болезни Марека Патент № 2085583 от 27.07.1997.
12. Баррос Палома Е.В., Смоленский В.И., Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Куляшбе-кова Ш.К. Специфическая профилактика болезни Марека в птицехозяйствах Российской Федерации // Сборник материалов науч. сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России» г. Москва, 16-17 июня 1998 г., Ч. И. М„ 1999, с. 253
13. Лукина В.А., Соловьев Б.В., Быкова H.H., Ярыгина Е.И., Бобровская И.В., Румянцева И.В. Современное состояние и перспективы вакцинопрофилактики болезни Марека // Сборник статей «Агропромышленный комплекс России в XXI веке: стратегия развития», М., 1999, 318-320.
14. Lukina V.A., Yarigina E.I., Bikova N.N., Samuilenko A.Y., Praksin F.G. Antigenic variability of marek's disease vaccine viruses // 26-th World Veterinary Congress WSA, France, Lyon; http: www.Mondialvet99.com France, Lyon, 1999.
15. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Скороходова Л.А., Бобровская И.В., Румянцева И.В. Динамика трансовариальных антител у цыплят, полученных от кур-несушек из птицехозяйств с разлиной эпизоотической обстановкой по болезни Марека // Материалы междунар. науч.-практич. конф. «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» 15-16 августа 2000 г. Покров, 2000, с. 119-121
16. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Румянцева И.В., Бобровская И.В., Скороходова Л.А. Идиотипические антитела к термоденатурированному антигену вируса гер-
песа индеек (ВГИ), вызывающие у цыплят специфические иммунные реакции // Материалы науч.-практич. конф. «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы», 22-23 мая 2001 г., Киров, 2000, с. 83-85.
17. Бобровская И.В., Румянцева И.В., Ярыгина Е.И. Фракционный состав инфекционного и термоденатурированного вируса герпеса индейки // Материалы науч.-практич. конф. «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы», 22-23 мая 2001 г., Киров, 2000, с. 85-86.
18. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Пшиоков В.В., Румянцева И.В., Скороходова Л.А. Идиотипические антитела к антигенам вируса герпеса индейки, используемого в качестве вакцины против болезни Марека // Материалы междунар. науч.-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов», 24-25 апреля 2003 г., Щелково, 2003, с. 39-43.
19. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Пилюков В.В., Скороходова Л.А., Румянцева И.В. Куриные моноспецифические поликлональные антиидиотипические антитела, имитирующие «внутренний образ» антигена вируса герпеса индейки // Материалы междунар. науч.-практич. конф. «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов», 24-25 апреля 2003 г., Щелково, 2003, с. 44-51.
20. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Пилюков В.В., Румянцева И.В., Скороходова Л.А. Версии иммуноответа при болезни Марека // Материалы Одиннадцатого Московского международного ветеринарного конгресса. 17-19 апреля 2003, Москва, Россия. Материалы. Москва, 2003, с. 218-219.
21. Ярыгина Е.И. Болезнь Марека: вакцины и иммунный ответ //Материалы Международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве». Посвящается 40-летию ВНИВИП. 14-16 сентября 2004 г., Ломоносов, 2004, с. 49-54.
22. Ярыгина Е.И. Использование полимеразной цепной реакции для типирования вируса болезни Марека // Материалы Международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве». Посвящается 40-летию ВНИВИП. 14-16 сентября 2004 г., Ломоносов, 2004, с. 55-56.
23. Самуйленко А.Я., Лукина В.А., Ярыгина Е.И. Болезнь Марека: проблемы вакцинации и иммунитета // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию института (ВНИТИБП) «Научные основы
производства ветеринарных биологических препаратов». 26-27 мая 2005 г., Щелково, 2005, с. 75-80.
24. Ярыгина Е.И.,. И.В. Румянцева, JI.A. Скороходова Способы выделения иммуноглобулинов класса G из желтков яиц кур - преимущества и недостатки // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию института (ВНИТИБП) «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». 26-27 мая 2005 г., Щелково, 2005, с. 81-82.
25. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Румянцева И.В., Скороходова Л.А. Критерии оценки качества антисыворотки, полученной к IgG желтка яиц кур // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию института (ВНИТИБП) «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». 26-27 мая 2005 г., Щелково, 2005, с. 83-87.
26. Румянцева И.В., Скороходова Л.А. Ярыгина Е.И. Выделение из гипериммунной сыворотки животных специфических антивидовых антител к IgG желтка яиц кур методом аффинной хроматографии // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию института (ВНИТИБП) «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». 26-27 мая 2005 г., Щелково, 2005, с. 87-89.
27. Румянцева И.В., Ярыгина Е.И. Конъюгация антивидовых антител (анти- IgG кур) с пероксидазой // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию института (ВНИТИБП) «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». 26-27 мая 2005 г., Щелково, 2005, с. 89-91.
Список тезисов докладов по теме диссертации
1. Ярыгина Е.И. Выделение иммуноглобулина класса G из желтка куриных яиц // Тез. докл. респ. науч.-практич. конф. мол. ученых и специалистов в г. Чимкенте «Проблемы интенсификации животноводства в Казахской ССР» Алма-Ата, 1986, с. 117-118.
2. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Быкова H.H., Самуйленко А.Я. Получение имму-нопероксидазного конъюгата анти-IgG желтка яиц кур и использование его для выявления вируса герпеса индеек и антител к нему // Тез. докл. Всес. науч.-теор. конф. молодых ученых «Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии» Владимир, 1990, с. 38-39
3. Ярыгина Е.И., Лукина В.А. Идентификация антигенов вируса болезни Марека блокированием иммуноферментного анализа // Тез. докл. Всес. конф. «Методы получения, анализа и применения ферментов», Рига, 1990, с. 188.
4. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Авдосьева И.К. Взаимосвязь между уровнем антител, выявляемых у вакцинированных цыплят в ИФА, и устойчивостью их к болезни Марека // Сб. науч. трудов «Разработка технологических процессов изготовления биопрепаратов для профилактики и диагностики болезней с/х животных», М., 1991, с. 32-42.
5. Лукина В.А., Быкова H.H., Ярыгина Е.И., Скороходова Л.А., Баррос Палома Е.В., Праксин Ф.Г., Крюкова В.В. Выделение и испытание апатогенных изолятов вируса герпеса кур с целью создания би- и поливалентных вакцин против болезни Марека // Тез. докл. Всерос. науч. конф. "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных", Владимир, 1995, с. 255.
6. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Писеева Г.П., Блехерман Б.Е. Оценка активности в иммуноферментном анализе вакцины против болезни Марека на основе вируса герпеса индеек // Тез. докл. Всерос. науч. конф. "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных", Владимир, 1995, с. 256.
7. Лукина В.А., Быкова H.H., Ярыгина Е.И., Праксин Ф.Г., Крюкова В.В., Бар-рос Палома Е.В., Шевырев Н.С. Новая поливалентная вакцина против болезни Марека // Тез. докл. 5-ой Всерос. конф. "Науч. основы технологии промышл. производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково, 1996, с. 7.
8. Ярыгина Е.И., Лукина В.А. Стабильность производственных серий сухой вакцины, определяемая в иммуноферментном анализе // Тез. докл. 5-ой Всерос. конф. "Науч. основы технологии промышл. производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково, 1996, с. 8-9.
9. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H. Возможность прогнозирования заболевания болезнью Марека цыплят, привитых вакциной на основе вируса герпеса индеек // Тез. докл. 5-ой Всерос. конф. "Науч. основы технологии промышл. производства ветеринарных биологических препаратов", Щелково, 1996, с. 10-11.
10. Лукина В.А., Быкова H.H., Ярыгина Е.И., Панферова С.М., Козлов В.Е., Гле-бова Е.И. Индикация индуцированного вирусом герпеса индейки антигена А и антител к нему иммуноферментным анализом // Тез. докл. науч.-произв. конф., по-свящ, 100-летию со дня основания Курской биофабрики, положившей начало раз-
витию агробиологической промышленности в России (1896-1996) Курск, 1996, с. 190-191.
11. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Тимофеева Е.Л., Серебрякова В.Н., Су понева В.И. Критерий качества питательных сред для культивирования вакцинного вируса герпеса индеек // Тез. докл. науч.-произв. конф., посвяш, 100-летию со дня основания Курской биофабрики, положившей начало развитию агробиологической промышленности в России (1896-1996) Курск, 1996, с. 191-192.
12. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H. Особенности конструирования би- и поливалентной вакцины против болезни Марека и оценка ее активности в имму-ноферментном анализе // Тез. докл. Всерос. науч. конф. «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных», М., 1996, с. 30-32.
13. Лукина В.А., Быкова H.H., Ярыгина Е.И. Гуморальные поствакцинальные реакции организма кур на введение моно- и бивалентной вакцины против болезни Марека // Тез. докл. Всерос. науч. конф. «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных», М., 1996, с. 32-34.
14. Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Лукина В.А. Стандартизация вирусных антигенов набора для оценки биологической активности вакцин против болезни Марека // Тез. докл. 2-ой Междунар. науч.-практич. конф. «Актуальные проблемы ветери-нарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции», ч. 2. «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», М., 1997, с. 112.
15. Лукина В.А., Быкова H.H., Ярыгина Е.И. Экспресс-метод оценки биологической активности вирусвакцины против болезни Марека (БМ) // Тез. докл. 2-ой Междунар. науч.-практич. конф. «Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции», ч. 2. «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», М., 1997, с. 113.
16. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Скороходова Л.А. Поствакцинальный иммунитет к болезни Марека и влияющие на него факторы // Тез. докл. Всерос. науч.-практич. конф., посвящ. 70-летию со дня рождения профессора В.А. Першина, 14 июля 1997 г. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково, 1998, с. 16-17.
17. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Скороходова Л.А., Бобровская КВ. Мониторинг материнских антител у цыплят, полученных от кур-несушек из пти-цехозяйств с различной эпизоотической обстановкой по болезни Марека // Тез. докл. Всерос. науч.-практич. конф.. посвящ. 70-летию со дня рождения профессо-
pa В.А. Першина, 14 июля 1997 г. «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково, 1998, с. 18-19.
18. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Скороходова Л.А., Баррос Палома Е.В., Праксин Ф.Г., Крюкова В.В. Выделение и использование апатогенных штаммов вируса болезни Марека второго серотипа // Tel докл. конф., посвящ. 30-летию со дня основания завода «Покровский з-д биопрепаратов» «Производство и контроль медицинских, ветеринарных препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ» 27-28 мая 1999 г., п. Вольгинский Владимирской обл., Россия Покров, 1999, с. 48-49.
19. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Самуйленко А.Я., Бобровская И.В., Праксин Ф.Г., Крюкова В.В. Особенности вакцинных вирусов болезни Марека в процессе их репродукции in vitro и in vivo // Тез. докл. конф. «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе», М., 1999, с. 24-25
20. Ярыгина Е.И., Лукина В.А., Быкова H.H., Скороходова Л.А., Бобровская И.В., Тетеричев В.И. Экспресс-метод определения специфических антител и прогнозирования эффективности вакцины против БМ // Тез. докл. конф. "Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе". М., 1999, с. 33-34.
21. Е.И. Ярыгина, В.А. Лукина, Б.В. Соловьев, Л.А. Скороходова, И.В. Бобровская, И.В. Румянцева Антигенная активность термоденатурированных препаратов вируса болезни Марека // Тез. докл. на Международной конф. «Биотехнология-2000», Пущино 2000, с. 70-71.
22. Лукина В.А., Соловьев Б.В., Быкова H.H., Ярыгина Е.И., Бобровская И.В., Румянцева И.В. Современное состояние и перспективы вакцинопрофилактики болезни Марека // Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИ-ТИБП, 8-9 июня 2000 г., Щелково, 2000, с. 6-8.
23. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Соловьев Б.В., Бобровская И.В., Румянцева И.В., Скороходова Л.А. Выявление различными биохимическими методами структурных белков вируса болезни Марека // Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП, 8-9 июня 2000 г., Щелково, 2000, с. 8-10.
24. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Соловьев Б.В., Бобровская И.В., Румянцева И.В., Скороходова Л.А. Антигенные свойства термоденатурированных вариантов вируса болезни Марека - влияние термоденатурации на антигенную активность пре-
паратов на основе вируса герпеса индеек (сообщение первое) // Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП, 8-9 июня 2000 г., Щелково, 2000, с. 10-12.
25. Лукина В.А., Ярыгина Е.И., Соловьев Б.В., Бобровская И.В., Румянцева И.В., Скороходова Л.А. Антигенные свойства термоденатурированных вариантов вируса болезни Марека - изучение антигенных свойств препаратов на основе вируса герпеса кур (сообщение второе) // Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП, 8-9 июня 2000 г., Щелково, 2000, с. 12-14.
26. В.А. Лукина, Е.И. Ярыгина, Е.А. Рубан, Л.А. Скороходова, В.В. Пилюков Профилактика болезни Марека: перспективы получения сухой бивалентной вакцины // Международная научно-практическая конференция «Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных» 23-24 окт. 2003 г., Беларусь, Минск, с. 203-204.
Другие публикации
1. Ярыгина Е.И., Шкварук Т.Я., Бойко A.A. Получение антисыворотки к IgG желтка яиц кур // Бюлл. ВИЭВ, М., 1988, Выпуск 68, с. 58-59.
2. Лукина В.А., Бойко A.A., Ярыгина Е.И., Быкова H.H., Козлов В.Е. Выявление А-антигена вируса герпеса индеек и антител к нему иммуноферментным анализом // Передовой научно-произв. опыт в биол. промышленности, М., 1987, № 8, с. 1-4.
3. Лукина В.А., Быкова H.H., Ярыгина Е.И. Временное наставление по применению набора по оценке биологической активности вакцин против болезни Марека иммуноферментным методом // «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом», допущенные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий, 1998 г, с. 136-145.
-J
Отпечатано в ООО "Мешера" Московская область, г Щелково, Свирская д 8а, тир 100 экз, зак Хе551
-I
I
I
»23740
РНБ Русский фонд
2006-4 24963
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ярыгина, Елена Игоревна
1. Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 21 2.1 БОЛЕЗНЬ МАРЕКА 21 2.1.2. Классификация ВБМ
2.1.2.1. Вирусы 1 серотипа
2.1.2.2. Вирусы 2 серотипа
2.1.2.3. Вирусы 3 серотипа
2.2. МОРФОЛОГИЯ И МОРФОГЕНЕЗ
2.3. БИОЛОГИЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВБМ, ВГК И ВГИ
2.3.1. Патогенез и типы взаимодействия вируса с клеткой
2.3.2. Культивирование
2.3.3. Вирусные ДНК
2.3.4. Локализация генов
2.3.5. Различия и сходства между серотипами
2.4. СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА БОЛЕЗНИ МА- 42 РЕКА РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ВАКЦИН
2.4.1. Вакцины на основе штаммов ВБМ серотипа
2.4.1.1. Вакцины на основе аттенуированных вирулентных штам- 46 мов ВБМ
2.4.1.2. Вакцины на основе аттенуированных умеренно ви- 47 рулентных штаммов ВБМ
2.4.1.3. Вакцины на основе особо вирулентных штаммов ВБМ.
2.4.2. Вакцины на основе штаммов ВБМ серотипа
2.4.3. Вакцины на основе штаммов ВБМ серотипа
2.4.4. Поливалентные вакцины
2.4.5. Рекомбинантные вакцины
2.4.6. Инактивированные вакцины
2.4.7. Сравнительная эффективность применяемых вакцин
2.4.8. Причины неэффективности вакцинации и способы их уст- 58 ранения
2.5. АНТИГЕНЫ ВБМ
2.5.1. Антиген А
2.5.2. Антиген В
2.5.3. Антиген С
2.5.4. Антиген D
2.5.5. Другие антигены и белковые комплексы, обнаруженные 68 в составе ВБМ, ВГК и ВГИ
2.6. МЕХАНИЗМ ИММУНИТЕТА И ИММУННЫЕ PEAK- 72 ЦИИ В ОРГАНИЗМЕ ЦЫПЛЯТ, ИНФИЦИРОВАННЫХ
РАЗЛИЧНЫМИ СЕРОТИПАМИ ВБМ
2.6.1. Персистенция вируса болезни Марека
2.6.2. Патогенез
2.6.3. Генетическая резистентность
2.6.3.1. Пассивно приобретенная резистентность к БМ
2.6.3.2. Активно приобретенная резистентность к БМ
2.6.4. Поликлональные антитела, обеспечивающие резистент- 80 ность к болезни Марека
2.6.5. Моноклональные антитела к антигенам ВБМ, обладающие 81 высокой специфичностью
2.6.5.1. Получение гибридом, синтезирующих МАТ
2.6.5.2. Применение МАТ для изучения структуры и функций ан- ' 82 тигенов ВБМ 1, 2 и 3 серотипов
2.6.6. Антиидиотипические антитела, участвующие в иммунных 85 реакциях организма
2.6.6.1. Идиотипический каскад и внутренний образ антигена
2.6.6.2. Антиидиотипические антитела — вакцинные препараты но- 87 вого поколения
2.7. СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУ- 89 НОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВБМ, ВГК и ВГИ
2.7.1. Серологические методы, широко применяемые для инди- 89 кации антигенов ВБМ и антител к ним
2.7.2. Особенности получения компонентов ИФА для индикации 92 антигенов ВБМ и антител к нему
2.7.3. Применение ИФА для индикации антигенов ВБМ, ВГК и 99 ВГИ и антител к ним
2.8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ PEAK- 101 ЦИИ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА БОЛЕЗНИ МАРЕКА
Введение Диссертация по биологии, на тему "Антигенные и иммуногенные свойства штаммов вируса болезни Марека при создании эффективных экспериментальных и производственных вакцин"
Болезнь Марека (БМ) - лимфопролиферативное заболевание кур, является серьезной проблемой для птицеводства. Возбудитель - онкогенный ДНК-содержащий альфагерпесвирус [153, 159, 160, 161, 205, 256] - обладает способностью сохраняться и в хозяине, и в экосистеме, при этом эволюционирует, что приводит к появлению более вирулентных популяций патотипов вируса болезни Марека (ВБМ) первого серотипа. Это, в свою очередь, порождает новые научные и хозяйственные проблемы [168, 189, 303, 326]. Кроме вирулентных штаммов ВБМ 1 серотипа, в природе существуют два неонкогенных: 2 се-ротип - вирус герпеса кур (ВГК) и 3 серотип - вирус герпеса индеек (ВГИ).
ВБМ - патогенный герпесвирус, который может вызывать: 1) Т-клеточные лимфомы; 2) изменения периферических нервов, характеризующиеся лимфопролиферативной инфильтрацией и демиелинизацией, как правило, приводящие к параличу или слепоте; 3) различные проявления иммунодефицита и 4) атеросклероз у цыплят с нормальной холестеринемией, необыкновенно схожие с болезнями человека [44, 105].
Болезнь Марека регистрируется практически во всех странах мира с развитым промышленным птицеводством, наносит огромный экономический ущерб [352]. Ведущим звеном в системе организации профилактических мероприятий при БМ является эпизоотическая характеристика птицехозяйств [4, 15, 23, 37], основанная на точной и своевременной диагностике заболевания. А правильный выбор подходящей по своим иммунизирующим свойствам вакцины для конкретного птицехозяйства способен полностью исключить вспышки БМ.
Многие годы превалирующее значение имели вакцинные препараты на основе штамма FC-126 ВГИ, выделенного от индеек Kawamura и Witter (независимо друг от друга) [266, 279]. Первая отечественная вакцина против БМ также создавалась из штамма FC-126 ВГИ. Существенный вклад в разработку нативной и сухой вирусвакцины внесли ученые ВНИТИБП (Никитин Е.Е., Лукина В.А. [56], Токарик Э.Ф., Слепенко Т.Б. [92], Блехерман Б.Е., Перель-штейн Л.Г.), ВНИВИП (Коровин Р.Н. [46], Придыбайло Н.Д. [82]), ВГНКИ (Зубцова Р.В., Деревлева Т.А., Баррос Палома Е.В.) и др.
Однако в последнее время, в связи с селекцией полевых штаммов и появлением ОВВБМ данный тип вакцин значительно снизил эффективность, а порой и полностью утратил способность защищать птицу от БМ, так как высоко вирулентные мутанты содержат антигены-мишени, несоответствующие таковым на вакцинном вирусе [44, 239, 302, 451]. В исследованиях американских ученых, особенно в работах Witter [436, 445, 450, 454] показано, что эффективность ВГИ значительно усиливается даже против ОВВБМ, если применять его в комбинации с вирусами второго серотипа.
Эффективным инструментом для идентификации вирусных антигенов являются моноклональные антитела (МАТ), которые позволяют изучать структуру и функции вирусных белков [302, 325, 395, 436]. Bullow и Biggs подтвердили, что антиген A (gA) является группоспецифическим, но тем не менее имеет и типоспецифические детерминанты [177, 398].
В последнее время для идентификации патогенных и непатогенных штаммов и изолятов ВБМ широко применяют такие высокочувствительные методы исследования генома, как рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция, молекулярная гибридизация и секвенирование [166, 199, 401, 402, 467].
Применение рестрикционного эндонуклеазного анализа показало существенное различие между образцами ДНК 1, 2 и 3 серотипов, а также между ДНК вирусов низкого и высокого пассажа в культуре клеток [256, 299, 379].
Результаты проведения ДНК-ДНК гибридизации между геномами ВБМ и ВГИ указывают на то, что уровень гомологии нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих gA, составляет 73%, а сравнение генов, кодирующих gB трех серотипов ВБМ выявило наличие в них существенных различий [34].
Хотя серотипы ВБМ различимы в серологических реакциях, они имеют много общих антигенов. Сыворотка против одного серотипа обычно перекрестно реагирует с антигенами других серотипов, но гораздо слабее, чем с гомологичными [219, 222].
Возможность прогнозирования поствакцинального гуморального иммунитета у привитой птицы, а также создание и применение поливалентных вакцин, в составе которых имеются актуальные штаммы ВГК, позволяет надежно профилактировать БМ за счет вытеснения из птицехозяйств патогенных штаммов ВБМ.
Динамика накопления и уровень специфических антител зависит от генетической и возрастной резистентности птицы, но в большей степени — от самого вируса [181, 342]. Существование штаммо-, серотипо- и видоспецифи-ческих вирусных антигенных детерминант позволяет дифференцировать антитела к вакцинным и полевым вирусам БМ, а также выделять и исследовать отдельные вирусные антигены, ответственные за выработку антител, нейтрализующих цельные вирионы. Подобные работы уже привели к созданию экспериментальных вакцин без инфекционного вируса [176, 189].
Всестороннее углубленное изучение антигенных особенностей ВБМ и его взаимосвязей с другими представителями Herpesviridae будут способствовать в дальнейшем изготовлению новых поколений вакцинных препаратов, возможно препятствующих селекции ВБМ в природных условиях и появлению высоковирулентных патотипов вируса.
Изучение антиген-антительного взаимодействия в организме животных привело ученого N. Jerne (1974) [272] к заключению о существовании сетевой регуляции иммунной системы, элементами которой являются антитела 1, 2 и т.д. порядка. Предпринятые в последствии попытки экспериментально индуцировать образование антиидиотипических антител, несущих «внутренний образ» антигенов и использовать эти антитела в качестве вакцинных препаратов, оказались удачными. Что касается ВБМ, то исследования в этом направлении проводили в основном с антигеном MATS А [197] и опухоле-ассоциированными антигенами [309].
Таким образом, изучение антигенных и иммуногенных свойств штаммов ВБМ, входящих в коммерческие и экспериментальные вакцины, напрямую влияющих на эпизоотическую обстановку в птицехозяйствах, зависящую не только от типа применяемого препарата, но также и от циркуляции патогенных штаммов, представляется своевременным и обоснованным.
Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.
1.2. Цель и задачи исследования
В связи с вышеизложенным, была поставлена цель настоящей работы: основываясь на результатах изучения антигенных и иммуногенных свойств инфекционных и инактивированных препаратов вакцинных штаммов вирусов болезни Марека с использованием поли- и моноклональных антител, дать теоретическое и экспериментальное обоснование разработке новых эффективных вакцинных препаратов против болезни Марека,.
В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:
1.2.1. Создать тест-системы ИФА для детекции антигенных детерминант штаммов ВБМ, а также количественного учета полноценных вирио-нов и иммуноактивных клеток в составе вакцинных препаратов против БМ.
1.2.2. Изучить зависимость протективных свойств производственных серий вакцины против БМ на основе ВГИ от морфологического состава вирусной популяции.
1.2.3. Разработать способы получения антигенов ВБМ, различающихся по перекрестной серотипической активности, и изучить их антигенные и иммуногенные свойства.
1.2.4. Разработать способы получения поликлональных антиидиотипи-ческих антител, содержащих «внутренний образ» антигенов ВГИ, и изучить их иммунобиологические свойства.
1.2.5. Разработать варианты ИФА с применением поли- и моноклональ-ных антител, направленных к белкам ВПГ человека, для детекции gB и gD ВГИ и ВГК.
1.2.6. Подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки полимеразной цепной реакции для выявления ДНК вируса болезни Марека.
1.2.7. Разработать модификации ИФА для изучения динамики антител к антигенным комплексам ВБМ в условиях птицехозяйств с различной эпизоотической ситуацией по БМ, применяющих моно-, би -или поливалентные вакцины на основе второго и третьего серотипов ВБМ, и оценить качество вакцинных препаратов по серологическому статусу привитой птицы.
1.3. Научная новизна
Впервые в России разработана тест-система ИФА для оценки биологиче ской активности вакцин против БМ.
Разработан способ выделения иммунохимически чистого препарата IgG желтка яиц кур (а.с. № 1497811).
Синтезирован иммунопероксидазный антивидовой конъюгат (анти-IgG кур) (патент за № 2202369 от 20.04.2003).
Разработан способ стабилизации вируса герпеса индеек, на который получено положительное решение (приоритетная справка № 5015791).
Разработаны методы выделения ВГК от невакцинированных птиц благополучного по БМ хозяйства, идентификации и поддержания вируса в культуре клеток эмбрионов SPF-кур.
Впервые в России выделены и идентифицированы штаммы вируса герпеса кур. Два из них, под номерами «42» и «50», депонированы в ВГНКИ как производственные вакцинные штаммы и используются для изготовления первой в России жидкой поливалентной вакцины против БМ (патенты № 2085582 и № 2085583).
Впервые в мире разработана сухая поливалентная вакцина на основе отечественных штаммов ВГК «42» и «50» и штамма FC-126M ВГИ.
Впервые получены и исследованы в ИФА специфичные и стабильные антигенные комплексы в непрогретых и прогретых ультразвуковых лизатах клеток, инфицированных тремя серотипами ВБМ. Показана возможность применения полученных неинфекционных антигенных комплексов для изучения динамики AT в сыворотке крови кур в условиях птицехозяйства.
Впервые проведено фракционирование термоденатурированных антигенов ВГИ, получены различающиеся по иммунобиологическим свойствам неинфекционные препараты ВГИ (белки В и С).
Впервые получены идиотипические антитела (антитела первого порядка) к отдельным фракциям термоденатурированного ВГИ, способные нейтрализовать инфекционную активность вируса.
Впервые в России получены и изучены в серологических реакциях АИД AT, которые содержат «внутренний образ» ВГИ, способный заменить антиген в индукции иммунного ответа.
Подобраны специфичные праймеры, комплиментарные гену глико-протеина А и последовательностям внутренних инвертированных повторов, позволяющие выявлять ДНК вирулентных, онкогенных штаммов 1 серотипа и вакцинных штаммов вируса 3 серотипа, определены оптимальные параметры постановки ПЦР для обнаружения вирусной ДНК.
Впервые в России для анализа антигенного сходства поверхностных белков gB и gD разных серотипов ВБМ и ВПГ человека в ИФА были применены МАТ, направленные к белкам ВПГ. Установлено, что для детекции в ИФА гликопротеинов D ВГИ и ВГК пригодны MAT 4f6, направленные к gD ВПГ человека.
Впервые в России разработана тест-система ИФА для индикации и количественного определения антител к серотипам ВБМ.
Впервые в России разработана методика оценки эффективности вакцинации по определению серологического статуса птицы, привитой против БМ.
1.4. Практическая значимость работы
Результаты проведенных исследований использованы при разработке иммуноферментных наборов для изучения поствакцинального иммунитета у кур, привитых моно, би- и поливалентными вакцинами против БМ, для выделения и идентификации ВГК (штаммы № «42» и «50») от непривитых птиц и для оценки биологической активности сухой и клеточно-ассоциированной вакцин против БМ, что отражено в соответствующей нормативно-технической документации: методических рекомендациях для количественного определения морфологически зрелых иммунохимически активных вирионов методом твердофазного ИФА (утверждены директором ВНИТИБП в 1991 г.); методике количественного определения антип-енно-активных клеток в жидкой вакцине против БМ на основе шт. FC-126 ВГИ методом ИФА (утверждена директором ВНИТИБП в 1992 г.); методике определения серологического статуса вакцинированной против БМ птицы с целью оценки качества сухой вакцины методом ИФА (утверждена директором ВНИТИБП в 1992 г.); методических рекомендациях по оценке эффективности сухой и жидкой вирусвакцины против БМ и определению серологического статуса вакцинированной птицы (утверждены директором ВНИТИБП в 1993 г.);
Временном наставлении по применению набора по оценке биологической активности вакцин против БМ иммуноферментным методом; (утверждено в департаменте ветеринарии в 1997 г.); методических рекомендациях по выделению и поддержанию апатоген-ных вариантов вируса герпеса кур (утверждены директором ВНИТИБП в 1997 г.); методических указаниях по выявлению ДНК вируса болезни Марека с помощью ПЦР (утверждены директором ВНИТИБП в 2000 г.); методике по выявлению антител к вакцинному вирусу герпеса индеек и вирусу болезни Марека в сыворотках крови кур иммуноферментным анализом (утверждена директором ВНИТИБП в 2000 г); методике изготовления неинфекционных антигенов ВГИ, пригодных для получения специфических идиотипических антител (утверждена директором ВНИТИБП в 2002 г); методике получения антиидиотипических антител, имитирующих «внутренний образ» антигенов цельновирионного вируса герпеса индеек (утверждена директором ВНИТИБП в 2002 г); методических рекомендациях по оценке биологической активности вакцин против болезни Марека иммуноферментным методом (рассмотрены и одобрены на секции «Биотехнология» отделения ветеринарной медицины Рос-сельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН в 2005 г.); методических рекомендациях по выявлению антител к вакцинному вирусу герпеса индеек и вирусу болезни Марека в сыворотке крови кур иммуноферментным анализом (рассмотрены и одобрены на секции «Биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН в 2005 г.).
Разработанные Методические рекомендации легли в основу Временной инструкции по изготовлению и контролю набора для оценки биологической активности вакцин против БМ иммуноферментным методом, Технических условий (ТУ 9383-038-00008064-97) на набор, Временного наставления по применению набора. НТД на набор согласована директорами ВНИТИБП и ВГНКИ и утверждена в департаменте Ветеринарии РФ в 1997 г.
Разработанные наборы с положительным результатом испытаны на
ГЩБК, Курской биофабрике, во ВГНКИ и применяются в птицехозяйствах РФ.
1.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту тест-система ИФА для детекции антигенных детерминант штаммов ВБМ, а также количественного учета полноценных вирионов и иммуноактив-ных клеток в составе вакцин против БМ; результаты разработки метода стабилизации ВГИ в вакцине; результаты детекции и идентификации антигенных детерминант различных серотипов ВБМ и антител к ним методом блокирования ИФА; результаты выделения и идентификации ВГК от невакцинированных птиц благополучного по БМ хозяйства, поддержания вируса в культуре клеток эмбрионов SPF-кур; результаты по разработке поливалентных вакцин против БМ; результаты разработки способов получения и исследования в ИФА антигенов ВБМ, различающихся по перекрестной серотипической активности; результаты разработки способов получения поликлональных антиидио-типических антител, имитирующих «внутренний образ» антигенов ВГИ, и изучения их иммунобиологических свойств; метод применения МАТ, направленных к белкам ВПГ для детекции в ИФА gB и gD ВГИ и ВГК; результаты разработки условий постановки ПНР для обнаружения ДНК ВБМ и ВГИ; модификация ИФА для изучения динамики антител к антигенным комплексам ВБМ у птиц в птицехозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по БМ, применяющих моно-, би- или поливалентные вакцины из штаммов второго и третьего серотипов ВБМ.
1.6. Апробация
Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2000), секции «Биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково, 2005), на научной сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России» (Москва, 1998), на Межрегиональном Координационном совещании по итогам НИР за 1996-2000 гг и задачам на 2001-2005 гг (г. Ломоносов Ленинградской обл., 2001), на научно-практических конференциях-семинарах «Научные достижения и стратегия борьбы с наиболее опасными болезнями птиц в промышленном птицеводстве» ВНИВИП (г. Ломоносов Ленинградской обл., 2001, 2003, 2004), на Всероссийских и международных научных конференциях (Москва, 1986, 1988, 1996, 1997, 1999, Владимир, 1990, 1995, Покров, 1999, 2000, Пущино, 2000, Щелково, 1996, 2000, 2002, 2003, 2005), а также на заседаниях методического и ученого советов ВНИТИБП (1986-2005 гг.)
1.7. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 56 научных работ, в том числе 3 патента, 1 положительное решение по приоритетной справке, утверждено в установленном порядке 3 нормативных документа (технические условия, наставление по применению, инструкция).
1.8. объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 331 странице и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 65 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает 463 наименования, из которых 120 отечественных и 348 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ярыгина, Елена Игоревна
6. ВЫВОДЫ
6.1. Разработана тест-система ИФА для детекции антигенных детерминант штаммов ВБМ, позволившая создать наборы ИФА (ТУ 9383-03800008064-97) для количественного учета полноценных вирионов и иммуноактивных клеток в составе вакцинных препаратов против БМ.
6.2. Научно обоснован способ получения иммунохимически чистого препарата IgG желтка яиц кур сочетанием методов препаративной биохимии: ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, осаждения неионными полимерами, центрифугирования (А.с. N 1497811), пригодного для создания компонентов тест-систем ИФА (получение антисыворотвк и синтез конъюгата).
6.3. Синтезирован иммунопероксидазный антивидовой конъюгат (анти-IgG кур) (патент за № 2202369 от 20.04.2003), который . использован для идентификации антигенных детерминант и серовариантов ВБМ, дифференциации антител к ним, индикации гликопротеинного низкомолекулярного gA и антител к нему, оценки биологической активности вакцин против БМ в различных модификациях иммуноферментного анализа.
6.4. Изучен морфологический состав вирусной популяции в производственных сериях вакцины против БМ на основе ВГИ, что позволило определить прямую зависимость между количеством полноценных вирионов в вакцине и качеством вакцинных препаратов.
6.5. Разработан и внедрен в производство способ стабилизации ВГИ в безбелковой среде, позволяющий готовить сухую моновалентную вирусвакцину с длительным сроком хранения при +4° - +8° С (приоритетная справка N 5015791/13).
6.6. Разработаны методы выделения от невакцинированной птицы из благополучных по БМ птицехозяйств апатогенных штаммов вируса герпеса кур и их идентификации в ИФА. Выделено пять изолятов, два из которых, под номерами "42" и "50", депонированы во ВГНКИ в качестве производственных вакцинных штаммов. Эти штаммы в совокупности с ВГИ используются для изготовления би- и поливалентной вакцины против БМ (патенты N 2085582 и N 2085583).
6.7. Впервые разработан способ получения бесклеточного ВГК, на основе которого создана сухая поливалентная вакцина против БМ.
6.8. Показано, что у клеточно-свободного препарата ВГК с сильным ЦПД преобладают некоторые характеристики ВГИ.
6.9. На основе термоденатурации (в сухом и нативном виде) препаратов ВБМ разных серотипов, получены следующие антигенные комплексы: перекрестно реагирующие с AT к ВБМ и с AT к ВГИ; реагирующие только с AT к ВГИ; реагирующие только с AT к ВБМ.
6.10. Получены перекрестно реагирующие неинфекционные антигены, стимулирующие выработку антител, обладающих преципитирующей и вируснейтрализующей активностью.
6.11. Выделены неинфекционные специфические антигены с различной иммунохимической активностью в серологических реакциях из термоинактивированных препаратов ВГИ, пригодные для получения высокоактивных идиотипических антител. Установлено, что иммунизация цыплят ИД AT вызывает образование антиидиотипических антител, имитирующих «внутренний образ» антигена ВГИ, отличающихся по способности конкурировать с целыювирионным вирусом за связывание с вируснейтрализующими антителами (индекс блокирования нейтрализации 91% и 62%, соответственно). Установлено, что в РДП со специфическими сыворотками вступают только АИД AT (1:64-1:128), в основе получения которых использован белок, реагирующий в ИФА только с анти-ВГИ сывороткой.
6.12. Отработаны условия «сэндвич» и непрямого варианта ИФА для выявления белка gD в вируссодержащих препаратах с использованием моноклональных (4f6) и поликлональных антител. Установлено, что ВБМ и ВПГ содержат общую антигенную детерминанту в белке gD, позволяющую идентифицировать ВГК и ВГИ.
6.13. Отработаны условия постановки ПЦР с использованием праймеров, комплиментарных вариабельным участкам последовательности гена гликопротеина А ВБМ 1 и 3 серотипов, что позволило выявлять ДНК вакцинных и вирулентных штаммов в пробах патматериала и л зараженных культур клеток, содержащих 100 ФОЕ/см вируса.
6.14. Систематизирована и исследована в ИФА лабораторная коллекция поликлональных сывороток, полученных в лабораторных опытах, а также из птицехозяйств. Впервые показано, что контрольный отрицательный антиген КК в совокупности с антигенами ВГИ и ВБМ может быть использован для выявления и дифференциации антител, индуцированных бивалентной вакциной на основе ВГИ + ВГК, моновалентной вакциной на основе аттенуированного штамма ВБМ 1-го серотипа и патогенными штаммами.
6.15. Изучена динамика антител к антигенным комплексам ВБМ в условиях птицехозяйств с использованием модифицированного варианта ИФА. Показано, что количество суточных цыплят с перекрестно реагирующими антителами позволяет судить о степени инфицированности кур-несушек полевым вирусом. Уровень антител к вакцинному и полевому вирусу на 55-65 дни позволяет оценить профилактическую эффективность применяемой моно-, би- или поливалентной вакцины против БМ, а их динамика на 90-й, 120-й и 240-й дни подтверждает прогноз по БМ. Результаты мониторинга антител свидетельствуют о том, что ВГК с низкой репродуктивной активностью в культуре клеток в совокупности с ВГИ ингибирует репликацию вирулентного ВБМ, начиная со 120-дневного возраста.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7.1. Результаты проведенных исследований отражены в «Методических рекомендациях по оценке биологической активности вакцин против болезни Марека иммуноферментным методом» (рассмотрены и одобрены на секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины РАСХН) и использованы при разработке нормативно-технической документации по изготовлению, контролю и применению набора для оценки биологической активности вакцин против БМ в ИФА (утверждена в Департаменте ветеринарии РФ 26 июня 1997 г.). Разработанный набор прошел апробацию на ГЩБК с положительным результатом. Опытная партия наборов изготовлена в лаборатории по разработке и производству противовирусных биопрепаратов ВНИТИБП.
Наставления по применению набора включены в «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом», допущенные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий (1998 г, стр. 136-145).
7.2. Предложенный способ стабилизации ВГИ в безбелковой среде применяется на ГЩБК с 1992 при производстве сухой вирусвакцины против БМ на основе штамма FC-126M ВГИ.
7.3. Выделенные из благополучного по БМ птицехозяйства штаммы "42" и "50" ВГК применены в качестве компонентов поливалентной вакцины против БМ.
7.4. Разработанный способ определения иммуноглобулинов класса G в сыворотках крови невакцинированной и вакцинированной против БМ птицы позволил прогнозировать гуморальный поствакцинальный иммунитет у кур к вакцинным и полевым вирусам БМ.
7.5. Разработанные «Методические рекомендации по выявлению антител к вакцинному вирусу герпеса индеек и вирусу болезни Марека в сыворотке крови кур иммуноферментным анализом» (рассмотрены и одобрены на секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины РАСХН), основанные на данных^ изучения закономерностей гуморального поствакцинального иммунитета у кур, привитых моно-, би- и поливалентными вакцинами против БМ, позволяют прогнозировать эффективность вакцинации без контрольного заражения цыплят вирулентным вирусом БМ, могут быть применены для оценки серологического статуса вакцинированной птицы и напряженности иммунитета у привитых против БМ цыплят в птицехозяйствах.
7.6. Разработанные «Методические указания по выявлению ДНК вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции», могут быть использованы для выявления вирусной ДНК и идентификации возбудителя в патологическом материале и вируссодержащей культуральной жидкости.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ярыгина, Елена Игоревна, Щёлково
1. Антиидиотипические антитела к вирусу простого герпеса типа 1 нейтрализуют инфекционную активность вируса. / Кущ А.А., Посевая Т.А. и др. // Вопросы вирусологии. 1991. - С. 312-314.
2. Аффинная хроматография. Методы. /Пол ред. П. Дина, У. Джонсона, Ф. Мидла. М.: Мир, 1988. 278 с.
3. Белкина И.В., Хлопина А.Ф., Придыбайло Н.Д. Определение клеточного иммунного ответа при болезни Марека. // Тез. докл. конф. по птицеводству. -Сергиев Посад, 1995. С. 101-102.
4. Бойко А.А., Хорьков И.А. Перспективы использования антивидовых иммуноглобулинов, меченных пероксидазой, в ветеринарии и животноводстве. //Вест. с.-х. науки. 1987. - № 9. - С. 96-100.
5. Болотников И.А. Словарь иммунологических терминов, 2-е издание переработанное и дополненное. М.: Росагропромиздат, 1991. — 129 с.
6. Борсук Э. А., Воробьева М. С., Эбралидзе Л. К. Оценка коммерческой тест-системы ИФА для определения специфической активности противогерпетиче-ских препаратов. //Вопр. вирусологии. 1991. № 2. - С. 137-139.
7. Бурдыгина И. Ф., Венгерова И. А., ЭльцеФон Б. С. Изучение возможности модификации функциональных свойств отечественных планшетов. //Биотехнология. 1994. - № 11-12. - С. 35-37.
8. Быкова Н.Н. Разработка иммуноферментного анализа для индикации антигенов вируса парагриппа-3 КРС и антител к нему. / Автореф. диссертации канд. биол. наук. Щелково, 1989. - 24 с.
9. Вирусология. Методы. / Под редакцией Мейхи Б. М.: Мир, 1988. - 344 с.
10. Выделение и идентификация вируса болезни Марека / Петянина А.П., Рязанов И.А., Баррос Е.В., Дудников JI.A. // Материалы Международной научной конференции молодых ученых, 24-26 марта 2004 года. Владимир, 2004. - С. 139-143.
11. Выявление А-антигена вируса герпеса индеек и антител к нему иммуно-ферментным анализом. /В. А. Лукина, А. А. Бойко, Е. И. Ярыгина и др. //Передовой научно-произв. опыт в биол. промышленности. М., 1987. - № 8. -С. 1-4.
12. Гааль Э., Медьеши Г., Верцкеи Л. Электрофорез в разделении биологических молекул. // М.: Мир, 1982. - С. 214-224.
13. Горбовицкая М. Диагностика болезни Марека с использованием ДНК-зондов. // Птицеводство. 1996. - №2. - С. 27-28.
14. Гринин А.С., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. -М., 1971.-.С. 136-141.
15. Гусева Е.В., Сатина Т.А. Вирусные болезни кур. // В кн.: Ветеринарные аспекты вет. патологии животных. — Владимир,: 1998. С. 128-146.
16. Джавадов Э.Д., Кудрявцев Ф.С., Кожемяка Н.В. Эффективность вакцинации против болезни Марека. // Ветеринария. 1999. № 9. - С. 28-30.
17. Диагностическая ценность ускоренного имму но ферментного метода. / В.А. Мищенко, М.Г. Костюченко, А.Б. Смирнов и др. // Сб. Вирусные и микробные бол. жив-х. — Владимир, 1995. С. 143-146.
18. Дудников JI.А. Онковирусные инфекции птиц. // БИО «Январь», 2002. С. 13-16.
19. Жаков М.С., Прибытько С.П. Иммуноморфологические реакции в крови и органах цыплят, вакцинированных против БМ совместно с иммуностимулятором натрия тиосульфатом. // Ученые записки Витебской гос. акад. вет. мед. — Витебск, 1994. -Т.31. С. 93-96.
20. Жибинов В. И. Вопросы патогенеза и диагностики острого течения болезни Марека: Автореф. дис. канд. ветер, наук. Л., 1986.
21. Жибинов В. И. Особенности лейкоцитарного профиля крови при остром течении болезни Марека //Сборник научных трудов "Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями сельскохозяйственных птиц". Л., 1987. С. 23-26.
22. Иммунологические методы. /Под ред. Г.Фриммеля. М.: Медицина, 1987. -518с.
23. Иммунологические методы исследований. / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1988. - 528 с.
24. Иммунология. /Под ред. У- Пола. М.: Мир. - 1987. - Т. 1. - 476 с.
25. Иммунология. /Под ред. У. Пола. М.: Мир. - 1987. - Т. 3. - 360 с.
26. Иммуноферментная тест-система на основе (РаЬ)2-фрагментов антител для индикации гемагглютинина вируса гриппа. / С.В.Леонов, Ю. Л. Закомырдин. Г. И. Эггерт и др. // Вопр. вирусол. 1987. - N 4. - С. 498-502.
27. Иммуноферментный анализ. / Под ред. Т. Т. Иго, Г.Ленхоффа. М.,: Мир. 1988.-446 с.
28. Иммуноферментный анализ моноклональных антител на твердой фазе инфицированных клеток. /А. С. Новохатский, Л. Н. Носик, Н. Е. Литвинович, И.
29. B. Малахова // Вопр. вирусол. 1986. - N 4. - С. 440-445.
30. Итоги науки и техники. Серия «Вирусология». Культура клеток в вирусологии // Москва, ВИНИТИ. 1990. - 254 с.
31. Иотова И. Еритроцитни антигенни летермитнанти в зависимост от устой-чивостта на птипите от яйценосното направление към вируса на болестта на Марек. //Животновъдни науки. София, 1988. - XXV. - № 3. - С. 66-70.
32. Карпуть И.М., Бабина М. П. Формирование иммунного статуса цыплят-бройлеров. //Ветеринария. 1996. - N 6.- С. 28-30.
33. Климова P.P. Получение моноклональных антител к вирусу простого герпеса и применение их для диагностики герпесвирусных инфекций. // Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 2000.
34. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих гликопротеины А- и В-антигенов онкогенного штамма Jm вируса болезни Марека. / Бедристов А.И., Бахтина М.М. и др. // Молек. генет., микробиол. и вирус. 1996. - № 3.1. C. 6-11.
35. Клюкина В. И. Классы иммуноглобулинов сыворотки крови и молозива свиней и их применение в иммунохимических исследованиях. //Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1986. 18 с.
36. Количественная оценка морфологического состава популяции герпесвиру-са в сухой вакцине против болезни Марека. / Могильный Ю.И., Смоленский
37. B.И. и др. // Тез. докл. 2-й междунар., научно-практ. конф. «Актуальные пробл. вет.-сан. контроля с.-х. Продукции». М., 1997. - Ч. 2. - С. 103.
38. Коляков Я.Е. Ветеринарная иммунология. М.: Агропромиздат, 1986. 272 с.
39. Коровин Р.Н., Зеленский В.П. Болезнь Марека, лейкоз и саркома птиц. // Метод, рекомендации. JL: 1989. - С. 5-32.
40. Коровин Р.Н., Зеленский В.П., Трошева Г.А. Справочник «Лабораторная диагностика болезней птиц» -М.: Агропромиздат, 1989,- С. 92-94.
41. Коровин Р.Н. Особенности эпизоотологии болезни Марека и организация мер борьбы с ней в птицеводческих хозяйствах промышленного типа: Авто-реф. дис. докт. ветер, наук. Л., 1989. 34 с.
42. Коровин Р. Н., Придыбайло Н. Д. Основы профилактики болезни Марека. // Тез. докл. конф. по птицеводству. Сергиев Посад, 1995. - С. 99-100.
43. Кузнецова С. В. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов. //Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1991. 46 с.
44. Кузнецова С. В., Филиппова Г. И., Бойко А.А. Получение моноспецифической антисыворотки к иммуноглобулину G лошади. //Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. 1984. - Вып. 8.1. C. 1-3.
45. Курненкова Е.В. Разработка технологии изготовления и контроля вирус-вакцины против болезни Марека из штамма «3004». //Автореф. диссертации канд. вет. наук. Владимир, 2004. - 25 с.
46. Куцак Р.С. Сравнительная оценка эффективности вакцинации против болезни Марека кур на стадии эмбриогенеза и в поснатальный период. // Международный тематический научный сборник «Ветеринарная медицина». — Украина, Харьков, 1997. Вып. 73. - С. 45 - 47.
47. Лабораторное руководство по хроматографическому и смежным методам. / Под ред. Микеш О. М.: Мир, 1982.
48. Лавров С.В., Мазуренко Н.П., Черняховская ИЛО. и др. Выделение от индеек вируса герпеса, антигенно родственного вирусу болезни Марека. // «Физ.-хим. и биол. свойства некоторых онкогенных вирусов». Рига, «Зинатне», 1975.-С. 186.
49. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. 294 с.
50. Лукина В.А., Бойко Л.Л., Авдосьева И.К. Использование ИФА для определения серологического статуса вакцинированных против болезни Марека птиц. //Ветеринария. 1989. - N 4. - С. 32-35.
51. Лукина В.А. Вакцина против болезни Марека и оценка активности имму-ноферментным анализом. // Автореф. дисс. докт. биол. наук. -М., ВИЭВ, 1992. 46 с.
52. Лукина В.А., Бойко А.А., Перелынтейн Л.Г. Определение активности ВГИ в вакцине против болезни Марека. // Ветеринария. 1989. - № 4. - С. 32-35.
53. Лукина В. А. Разработка иммуноферментного анализа для изучения свойств вируса герпеса индеек. //Тез. докл. 4-й Всес. конф. "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. М., 1991. С. 107-108.
54. Лукина В.А., Бойко А.А. Сравнительное изучение иммунохимической активности инфекционного вируса герпеса индеек и виру-синдуцированного антигена в ИФА. //Доклады ВАСХНИЛ. 1990. - N 4. - С. 55-60.
55. Лукина В.А. Теоретические и экспериментальные предпосылки изготовления моно-, би- и поливалентной вакцины против болезни Марека. // Тез. докладов научно-произв. конф. «100 лет Курской биофабрике и агропромышленное™ России».-Курск, 1996.- С. 184-189.
56. Лукина В.А. Разработка иммуноферментного анализа для изучения свойств вируса герпеса индеек. // Тез. докл. 4-й Всесоюзной конф. «Научн. основы технологии пром. произв. вет. биол. препаратов». М., 1991. - С. 107- 108.
57. Марыгина А.Ф. Морфология и морфогенез вируса герпеса индеек. // Авто-реф. дисс. канд. биол. наук М.: 1987. - 24 с.
58. Маслов Е. В., Панферова С. М., Бойко А. А. Сравнительная характеристика препаративных методов очистки антивидовых иммуноглобулинов. // Передовой научно-произв. опыт в биологической промышленности. М., 1985. - N 8. -С. 4-6.
59. Некоторые особенности приготовления иммуноферментных конъюгатов на основе моноклональных антител. / Н.Е. Вихрев, А. А. Жвирблене, Е.С. Северин и др. // Вопр. вирусол. 1986. - N 4. - С. 507-509.
60. Новых А.А. Клеточные механизмы реализации ответа на внедрение гер-песвируса. // Сборник научных трудов «Диагностика, лечение и профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных». Ставрополь, 1997. - С. 52-57.
61. Нявера Ч.З. Изучение особенностей эпизоотологии и усовершенствование специфической профилактики болезни Марека в промышленных птицехозяйствах. //Автореф. диссертации канд. вет. наук. С-Пб., 1993. - 15 с.
62. Оптимизация иммуноферментной тест-системы для определения антител к ДНК. / Л. И. Саттарова, Л. А. Гафиятуллина, Д.Г.Аглиуллина, В. Г. Винтер // Биотехнология. 1994. - № 11-112. - С. 38-41.
63. Оценка активности в иммуноферментном анализе вакцины против болезни Марека на основе вируса герпеса индеек / В.А. Лукина, Е.И. Ярыгина, Г.П.
64. Писеева, Н.Н. Быкова, Б.Е. Блехерман // Тез. докл. всерос. науч. конф. "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" Владимир, 1995. - С. 256.
65. Оценка результатов прямого твердофазного иммуноферментного метода для определения антигенов. / Г. В. Резанкин, А.П.Иванов, Е.А. Ткаченко, Г. Ван дер Грун. // Вопросы вирусологии. 1986. - № 5. - С. 573-577.
66. Пантелеев о.А., Ванеева л. И. Непрямой твердофазный метод иммуноферментного анализа, его точность и источники погрешностей. // ЖМЭИ. 1986. -№ 3. - С. 95-99.
67. Пинчук JI.M. Неспецифические эффекты в твердофазных имму-носорбентных методах. // ЖМЭИ. 1987. - N 5. - С. 110-117.
68. Писеева Г. П. Гетерогенность, инфекционные и антигенные свойства производственного штамма вируса герпеса индеек, выращенного в культуре клеток: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1986. - 24 с.
69. Писеева Г.П., Лукина В.А., Дьяконов Л.П. Методические указания по концентрированию вируса герпеса индеек из бесклеточных препаратов вакцины против болезни Марека. М., 1981 - 8 с.
70. Плейфер Дж. Наглядная иммунология. М.: ГЕОТАР Медицина, 1998.
71. Покровский В.И., Шебалина С.В. Иммунобиотехнология и проблемы современной эпидемиологии. // ЖВХО. 1989. - Т. XXXIV, N 1. - С. 3-11.
72. Полехин С.В. Идентификация вируса болезни Марека методом полимераз-ной цепной реакции. // Автореф. дис. канд. биол. наук. Владимир, 2002. - 26 с.
73. Пономарев Б.П. Болезнь Марека у цыплят первых дней жизни. / Доклады ВАСХНИЛ, 1991. № 10. - С. 53-54.
74. Придыбайло Н. Д., Коровин Р. Н., Афанасьева Г. Е. Эффективность соче-танного применения вакцины против болезни Марека и им-муномодулятора тималина. //Вестн. с.-х. науки. 1991. - N 7. - С. 136-138.
75. Придыбайло Н. Д. Средства и методы повышения эффективности специфической профилактики болезни Марека. //Автореф. дис. докт. ветер, наук. Ленинград, 1991. 33 с.
76. Применение иммуноферментных и некоторых других иммунологичес-ких методов в диагностике вирусный инфекций. / Э. Курстак, П. Тийссен, К. Кур-стак, Р. Морриисет //Бюл. ВОЗ. 1986. - № 2. - С. 110-124.
77. Производственные испытания экспериментальных серий бивалентной вакцины из шт. FC-126 и SB-1. / Ш.К. Куляшбекова, А.А. Гусев, В.И Родичкин. // Тез. докл. конф. «Проблемы инфекционной патологии с/х животных». Владимир, 1997.-С. 154-155.
78. Разработка статистической процедуры определения титра противопараг-риппозных сывороток животных в иммуноферментном анализе. / А.А. Маслак, В.А. Лукина, Н.Н. Быкова, А.А. Бойко // Биотехнология. 1988. - Т. 4, N3. - С. 390-393.
79. Ройт А. Основы иммунологии. -М.: мир, 1991, с. 327.
80. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика Минск: Вышэйшая школа, 1967. - 328 с.
81. Ропонич В. Г. Способы определения напряженности иммунитета при болезни Марека. Автореф. дис. канд. вет. наук. С-Пб., 1993. 17 с.
82. Рубцов И.В., Пименова Г.Н., Кулаков В.Н. Метод статистической обработки результатов иммуноферментного анализа. // ЖМЭИ. 1985. - N 6. - С. 4448.
83. Слепенко Т.Б. Выделение из клеток и изучение свойств вируса герпеса индеек. // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М.: 1987. - 24 с.
84. Соловьев Б.В. Технологии промышленного производства культуральных вакцин против болезни Марека и инфекционной бурсальной болезни. // Автореф. дисс. докт. биол. наук. — М., 2001. 52 с.
85. Соловьев Ю. В., Королев А. М., Белов Ю. И. Протективные свойства вакцины БЦЖ при болезни Марека. // Сб. науч. тр. "Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями сельскохозяйственных птиц", ч. 1. Д., 1987.-С. 19-23.
86. Соловьев Ю. В., Королев Л. М. Влияние тилорона на ассоциированное течение болезни Марека и лейкоза птиц. // Сб. науч. тр. "Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями сельскохозяйственных птиц", ч. 1. Л., 1988. С. 18-21.
87. Сорокина Г. В. Эпизоотология болезни Марека и инфекционного ларин-готрахеита на крупной птицефабрике яичного направления (эпизоотический процесс и система профилактических мероприятий). // Автореф. дис. канд. вет. наук. С-Пб., 1996. - 20 с.
88. Специфическая профилактика и механизм иммунитета при болезни Марека. / В. А. Лукина, Л. Н. Демидов, В. Н. Серебрякова, В. В. Салажова. // Курская биофабрика, к 100-летию биологической промышленности. Курск, 1996. -С. 422-451.
89. Способ выделения иммуноглобулина G из сыворотки крови кур / Э.Д. Джавадов, Е.Н. Горбачева, И.М. Джавадова // Авторское свидетельство № 1695931 от 07. 12. 1991.
90. Способ получения вакцины против болезни Марека. / В.А. Лукина, Е.Е. Никитин, А.Д. Перемитина, Е.Ф. Сенько // Авторское свидетельство № 467621 от 19. 12. 1974.
91. Способ повышения биологической активности и иммуногенных свойств производственного штамма FS-126 вируса герпеса индеек. / Куляшбекова Ш.К., Гусев А.А. и др. // Кн.: Современные аспекты вет. патологии животных. -Владимир: 1998.-С. 146-151.
92. Способ получения антигена вируса болезни Марека / Писеева Г.П., Лукина, В.А., Кузнецов П.П., Дьяконов Л.П. // Авторское свидетельство №1034232 от 08.04.1983.
93. Справочник ветеринарного врача. / Составитель Кунакова А.А. — М.: Колос, 1996.-С. 127-129.
94. Сюрин В. Н., Белоусова Р. В., Фомина Н. В. Болезнь Марека. // В кн.: Диагностика вирусных болезней животных. Справочник. М., Агропромиздат., 1991.-С. 101-116.
95. Сюрин В.Н., Белоусова Р.Н., Фомина Н.В. Семейство герпесвирусов. // В кн.: Ветеринарная вирусология. М., 1991, с. 362-365.
96. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Болезнь Марека. // Кн. Вирусные болезни животных. -М.: ВНИТИБП, 1998. С. 689-720.
97. Тарасишин Л. А. Иммуноферментный анализ и его модифика/ции в исследовании вирусных антигенов. //Микробиол. журнал. 1986. - Т. 48, № 4. -С. 99-104.
98. Трофимов А. А. Получение пероксидазного конъюгата против гаммаг лобулинов кур. // Сб. науч. трудов " Современные средства и методы борьбы < заразными болезнями сельскохозяйственных птиц", ч. 1. 1988. - С. 3-7.
99. Тыщенко И.П., Джавадов Э.Д. Тонкослойный иммунный анализ для вы явления миелинспецифических антител в сыворотке крови кур при болезш Марека. // Ветеринария. 1992. № 4. - С. 29-31.
100. Тыщенко И.П. Модель фенотипической классификации герпесвирусны? частиц. // Ветеринария. 1993. - № 7. - С. 24-27.
101. Ультразвуковой фонофорез. / Акопян В.Б., Рыхлецкая О.С. и др. // Пти цеводство, № 7. М.: 1991 -N 7. - С. 35.
102. Фарис Балча Башю. Патоморфология лимфоидных и эндокринных орга нов цыплят и некоторые вопросы патогенеза при острой болезни Марека //Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 1994. 16 с.
103. Фримелъ X., Брок Й. Основы иммунологии. // М.: Мир, 1986. 254 с.
104. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. // М., Медицина. 2000. - 430 с.
105. Хант С. Выделение лимфоцитов и вспомогательных клеток. // В кн. Лимфоциты. Методы. Под ред. Дж. Клауса. М., Мир. - 1990. - 400 с.
106. Шалкова М.В. Биологические особенности и хозяйственно полезные качества кур, отселекционированных на устойчивость к неоплазмам //Автореф дис. канд. с.-х. наук. С.-Пб., 2000. - 17 с.
107. Шевырев Н.С. Введение в ветеринарную иммунологию. Курск: Издательство Курской с/х. Академии, 1999.
108. Эффективность вакцинации бройлеров против болезни Марека. / Макеег А., Гусев А.; Куляшбекова Ш.; Ирза В. // Птицеводство. 2000. - № 6 - С. 38.
109. Эффективность различных адъювантов при получении диагностических сывороток. / В.А.Мищенко. А.И.Дудников, М.А.Базаров и др. // Сб. науч. трудов "Вирусные и микробные бол. животных". Владимир, 1995. - С - 149-152.
110. Яковлева Л.Д., Мазуренко Н.И., Виноградов В.И. Изучение свойств штамма Кекава вируса болезни Марека в опытах на цыплятах. // Вопросы вирусологии. 1973. - № 5. - С. 588.
111. A bivalent vaccine consisting of Chinese strain of serotype 2 virus Z4 and FC-126 against Marek's disease: experimental studies and field trials. // X. Liu, R. Zhang et al. // In: 19-th World's Poultry Congress, V.l. Amsterdam. 1992. - P. 305-309.
112. Abujoub Amin A., Coussens Paul M. Evidence that Marek's disease virus in a latent state in a sustainable fibroblast cell lines. // J. Virology. - 1997. - N 229. - P.309.311.
113. A comparison of the biological properties of type 2. Plaque-producing agent derived from the Cal-1 strain of Marek's disease virus with other related viruses. / R. Ririsava, K. Hirai, S. Yachida et al. // Arch. Virol. 1986. - V. 89. - P. 29-43.
114. Adenlran G.A., Dyejide A. Monitoring of response to Marek's disease vaccination in chickens by ELISA. // J. Ahhlied Animal Res. 1995. - V. 8, N 1. - P. 5562.
115. Afraz F., Yamamoto Y., Okada I. Divergent selection for delayed-type wattle reaction of domestic fowls to BCG antigen. // British Poultry Sci. 1994. V. 36, № 1. - P. 47-58.
116. A genetically engineered cell line resistant to subgroup J avian leukosis in chickens following vaccination with herpesvirus of turkeys. / Hunt H.D., Lee L.F., Foster D, Silva R.F. // Aust vet. J. 1999. - 53 (9). - P. 457-459.
117. Ahrestani S. R., Mulbagar P.M., Paranjape V. L. Studies on serum immunoglobulins of fowl (Gallus Domesticus): characterization and quantisation of IgG. // Indian vet. J. -1987. V.64. - P. 98-103.
118. Aly M.M., Fadly A.M., Witter R.L. Effects of serotype 2 Marek's disease virus on development of viremia, antibody and lymphoma induced by reticuloendo-theliosis virus. // In: 19-th World's Poultry Congress. V.l. Amsterdam. 1992. - P. 272-276.
119. Amin A. Abujoub and Paul M. Coussens. Evidence that Marek's Disease Virus Exists in a Latent State in a Sustainable Fibroblast Cell Line. // J. Virology.1997.-№ 229.-P. 309-321.
120. Analysis of Marek's disease virus serotype 1-phosphorylated polypeptides in virus-specific cells and disease lymphoblastoid cells. / K. Nakajima, K. Ikuta, M. Naito et al. // J. Gen. Virol. 1987. - V. 68. - P. 1379-1390.
121. Analysis of transcriptional and translational activities of Marek's disease (MD) virus genes in MD central nervous system lesions in chickens. / K.-O. Cho; D. Endoh; M. Onuma; C. Itakura. // Avian Pathology. 1999. - V.28. - N. 1. - P. 4753.
122. An L.L., Mudson A.P., Prendergrast R.A. et al. Biochemical and functional antigenic mimicry by a polyclonal antiidiotypic antibody for chlamydial exoglycol-ipid antigen. // Pathobiolodgy. 1997. - V. 65 - P. 229-240.
123. An outbreak of lymphomas in commercial broiler breeder chickens vaccinated with a fowlpox vaccine contaminated with reticuloendotheliosis virus / A.M. Fadly, R.L. Witter, E.J. Smith et al. // Avian Pathol. -1996. V. 25, N 1. - P. 35-47.
124. Antibodies to rotaviruses in chicken eggs: a potential source of antiviral immunoglobulins suitable for human consumption. / R. H. Yolken. F. Leister. S.-B Wee et al. //Pediatrias. 1988.-V. 81,N2. -P. 291-295.
125. A practical insight into vaccination. // Int. Poultry Prod. 1995. - V. 3, N 3. -P. 25-29.
126. Arteriosclerosis associated with a natural Marek's disease infection in Japanese a bantam (Gallus gallus). / Kawada M., Tokuma Yanai, Hiroki Sakai, Kazunori Yoshida // Avian Pathol. 1995. - № 24. - P. 565-571.
127. Association Marek's disease with Ea-B and immune response genes in subline and F2 populations of the Iowa State SI leghorn line. / E.M. Steadham S., J. Lament. I. Kujdvch, A. W. Nordskog // Poult. Sci. 1987. - V. 66. - P. 571-575.
128. Aufschub der fruhinfektion als Mittel zur Erhohung des vakzinationseffektes bei der Merekscheu Krankheit. / Z. Pospisill, D. Zendulkowva, E. Jurak, V. Juraida //Monatsh. Veterinarmed. 1987. - B. 42, N 18. - S. 668-672.
129. Avian encephalomyelitis following oral vaccination. / J.A. Smyth, F. McNeilly, G.A.C. Reillv et al. // Avian Pathol. 1994. - V. 23, N 3. - P. 435-445.
130. Bacon L.D., Witter R.L. B-haplotype influence on the relative efficacy of Marek's disease vaccines in commercial chickens. // Poultry Sci. 1994. - V.73. - N 4.-P. 481-487.
131. Bacon L. p., Witter R. L. Efficacy of Marek's disease vaccine in Mhc heterozygous chickens: Mhc congenic X inbred line Fi matings. // J. Heredity. -1995. -V. 86, N4.-P. 269-273.
132. Bacon L. D., Witter R. L., Faldy A.M. Augmentation of retrovirus-induced lymphoid leukosis by Marek's disease herpesvirus in White Leghorn chickens. // J. Virol. 1989. - V. 63, N 2. - P. 504-512.
133. Bacon L.D., Witter R.L. Influence of B-haplotype on the relative efficacy of Marek's disease vaccines of different serotypes. // Avian Disease. 1993. - V.37. -P. 53-59.
134. Bacon L. D., Witter R. L. Serotype specificity of В haplotype on the relative efficaci of Marek's disease vaccines. // Avian Dis. 1994. - V. 38, N 1. - P. 65-71.
135. Baigent S.M., Davison T.F. Development and composition of, lymphoid lesions in the spleens of Marek's disease virus infected chickens: association with spead and the pathogenesis of Marek's disease. // Avian Path. 1999. - V.28. - P. 287.
136. Baigent S.M. The immunological basis of genetic resistance to Marek's disease. // Ph. D thesis, University of Bristol. 1995.
137. Baigent S. J., Ross L.J.N., Davison Т.Е. A flow cytometric method for identifying Marek's disease virus pp38 expression in lymphocyte subpopulations. // Avian Pathol. 1996. - V. 25, N 2. - P. 255-267.
138. Bartolazzi A., Cerboni C., Nicotra M.R. et al. // Int. J. Cancer. 1994. - V. 58.-P. 488-491.
139. Becker Y. Comparative molecular biology of alphaherpesviruses: genes involved in virus pathogenecity. // In: 19th World's Poultry Congress. V. 1. World's Poultiy Science Association, Amsterdam. 1992. - P. 105-108.
140. Biggs P.M. Lymphoproliferative disease of turkeys. // In Disease of Poultry, 10-th Ed. (Calnek B.M. with Barned H.J.) Iowa State University Press, Amess. -1997.-485 p.
141. Bona C., Kang C.Y. Epibody the image of the network created by a single antibody.//Immunol. Rev. 1986. - V.90.-P. 115-125.
142. Bradley G., Hayashi M. Structure of the MDV BAM HI-H gene family: A gene potentially important for tumor induction. // In В.: Advances in Marek's Disease Research. 1989. - P. 69-75.
143. Brunovskis P., Chen X. and Velicer L.F. Analysis of Marek's Disease virus glycoprotein D, I and E. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam. — 1992.-P. 118-121.
144. Brunovskis P., Velicer L.F. Genetic organization of the Marek's Disease virus unique short region and identification of Us-encoded polypeptides. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992. - P. 74-79.
145. Brunovskis P., Velicer L.F. The Marek's disease virus (MDV) unique short region: Alphaherpesvirus-homologous, fowlpox virus-homologous, and MDV- specific genes. // Virology. 1995. - V. 206, N. 1. - P. 324-338.
146. Buchholz U. Examination of chicken anemia virus by using monoclonal antibodies. //Berlin. 1994. - 101 pp.
147. Bulow V.Von, Biggs P.M. Differentiation between strain of Marek's disease virus and turkey herpesvirus by immunofluorescence assays. // Avian Pathol. — 1975.-N.4.-P. 133-162.
148. Bumstead N. Genomic mapping of resistance to Marek's Disease. // Avian Pathol. -1998. N 27. - P. 78-82.
149. Bumstead N. Genetic resistance to avian viruses. / In: Genetic resistance to animal diseases.//Rew. Sci.tech. Off. Int. Epiz. 1998.-N 17 (1).-P. 249-265.
150. Bumstead N., Silibourne J., Rennie M., Ross N., Davison F. Quantification of Marek's Disease Virus in Chicken Lymphocytes Using the Polymerase Chain Reaction with Fluorescence Detection. //J. Virol. Methods. 1997. - № 65. - P. 75-81.
151. Bumstead N., Silibourne J., Rennie M. et al. Quantification of Marek's disease virus in chicken lymphocytes using the polymerase chain reaction with fluorescent detection. // J. Virol. Methods. 1997. - № 65. - P. 75-81.
152. Burmester B.R. Future research on the control of MD. // Avian Pathol. -1997.-P. 187-191.
153. Buscaglia C., Calnek B. W., Schat K.A. Effect of immunocompetence on the establishment and maintenance of latency with Marek's disease herpesvirus. // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 1067-1077.
154. Calnek B. W., Adene D. F. Schat K.A. Immune response versus susceptibility to Marek's disease. // Poultry Sci. 1989. - V. 68. - P. 17-26.
155. Calnek B.W., Adldinger N.K. and Kahn D.E. Feather follicle epithelium: A source of enveloped and infections cell-free herpesvirus from Marek's disease. // Avian Dis. 1970.-N 14. - P. 219-233.
156. Calnek B.W. Established cells lines of avian limphocvtes and their use. // In: Toivanen A., Toivanen P. Avian Immunology: Basis and Practice. CRC Press, Boca Raton, EL. 1987.-V. 2.-P. 57-70.
157. Calnek B.M., Harris R.W. Relationship between the immunosuppressive potential and the pathotype of Marek's disease virus isolates. // Avian Disease. V. 42. - 1998. - P.124-132.
158. Calnek B.W. Lymphomogenesis in Marek's disease. // Avian Pathol. Oxfordshire: Carfax Publishing Company. V.27. - 1998. - P. 54-64.
159. Calnek B.W. Marek's disease contributions to comparative herpes virology and oncology. // In: 19th World's Poultry Congress, V. 1. World Poultry Science Association, Amsterdam, 1992. P. 220-232.
160. Calnek, B.W., Witter R. L. Marek's disease // In.: "Disease of poultry" 9-th. 1991.-P. 342-385.
161. Central nervous system lesion induced experimentally by a very virulent strain of Marek's disease virus in Marek's disease resistant chickens. / Cho. — K.O., Endoh. D., Qian. - J.F. et al. // Avian Pathol. - 1998. - V. 27 (5). - Oct. - P. 512517.
162. Cheng Y.Q., Lee L. F. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to Marek's disease virus. // Avian Dis. 1985. - V. 28, N 4. - P. 900-911.
163. Cho K.-O., Ohashi K., Onuma M. Electron Microscopic and Immunohisto-chimical localization of Marek's disease (MD) herpesvirus Particles in MD skinfc lymphomas. // Vet. Pathol. 1999. = V.36. - P. 314-320.
164. Churchill A.E., Biggs P.M. Agent of Marek's disease in tissue culture. // Nature. N. 215. - 1967. - P. 528-530.
165. Churchill A. E., Chubb R.C., Baxendale C. W. |The attenuation with loss of oncogenecity of the herpes-type virus of Marek's disease (strain HPRS-16) on passage in cell culture. // J. Gen. Virol.'- 1969. N 4. - P 557-564.
166. Coman Т., Coman S. Determination of the apathogenecity of Marek's disease herpesvirus SB-1 strain after successive passages in chicken embryofibroblasts. //Arch. Vet. 1990. - N. 19. - P. 93-102.
167. Coman Т., Coman S. Study on the morphological modification induced by the apathogenic Marek's disease herpesvirus SB1 strain in cell cultures. // Arch. Vet. -1990.- 19 (II).-P. 103-111.
168. Co M., Gaultion G.N. et al. // Proc. Natl. Asad. Sci. USA. 1985. - V. 82. -P. 1494-1498.
169. Comparison of glycoprotein D (gD) genes of Marek's Disease virus and Herpesvirus of turkeys. / Zelnik V., Ross L.J.N., Smith G.D. et al. // In: 19-th World's Poultry Congress, V.l. Amsterdam 1992. - P. 114-117.
170. Control of Marek's disease in the Netherlands. II. Field trials of vaccination with an avirulent strain CCVI 988) of Marek's disease virus. / В. H. Rispens, H. Van Vloten, N. Mastenbroek et al. // Avian Dis. 1972. V. 16. - P. 126-138.
171. Corak R. Determination of the prevalence of Marek's disease in the Adana area by using histopathological techniques. // Havvan Asilardurlugu Derglsi. 1994. - V. 18,N32.-P. 47-59.
172. Cui Z., Qin A., Lee L.F. Expression and processing of Marek's disease virus pp 38 gene in insect cells and immunological characterization of the gene product. // In: 19-th World's Poultry Congress, V. 1. Amsterdam. 1992. - P. 123-125.
173. Cui Z., You Y. and Lee L.F. Identification and localization of the Marek's disease virus group-common antigen p79 gene. // In: 19-th World's Poultry Congress. V. 1. Amsterdam. - 1992. - P. 89-92.
174. Cui Z., Yan D., Lee L. F. Marek's disease virus gene clones encoding virus-specific phosphorylated polypeptides and serological characterization of fusion proteins. // Virus Genes. 1990. - V. 3, N. 4 - P. 309-322.
175. Dandapat 5., Pradhan H. K., MohantyG.C. Anti-idiotype antibodies to Marek's disease associated tumour surface antigen in protection against Marek's disease. // Vet. Immunol. Immunopath. 1994. - V. 40, N 4. - P. 353-366.
176. Davidson I., Becker Y., Malkinson M. Virus neutralization domains on the oligomeric (230 kDa) forms of antigen В herpesvirus turkeys and Marek's disease virus in cross-serotypic activity. // J. Vet. Med. B. - 1995. - V.42. - P. 100 - 109.
177. Davidson I., Borovskaya A. and Malkinson M. Use of the polymerase chain reaction for the diagnosis of natural infection of chickens and turkeys with Marek's disease virus and reticuloendotheliosis virus. // Avian Pathol. 1995. - № 24. - P. 69-94.
178. Davidson I., Tanaka A., Nonovama M. Common antigenic epitopes are present on heat-labile oligomers of MDV glycoprotein В and HSV glycoprotein R. // Virus Res. 1995. - V. 35, N 3. - P. 233-245.
179. De Boer G.F., Groenendal J.E. Protective efficacy of Marek's disease (MDV) CVI-988 CEF65 clone С against challenge infection with three very virulent MDV strain. // Av.dis. 1986. - № 30. - P. 276-283.
180. Delecluse H.-J., Hammershmidt W. Status of Marek's disease virus in established Lymphoma cell lines: Herpesvirus integration is common. // J. Virolog. Jan. -1993.-P. 82-92.
181. Detection of poultry infection with the virus of Marek's disease using different laboratory methods. / M. Gagic. S. Durisic, R. Asanin. T. Palic. // Acta Vet. 1995. -V. 45, N2-3.-P. 127-135.
182. De Y., Daoruo W. //J. West China Univ. Med. Sci. 1990. - V. 21, N 3. - P. 263-266.
183. Dohms J.E., Saif I.M. Criteria for evaluating immunosuppression. // Avian Disease. 1984. - N 28 (2). - P. 305-309.
184. Differential diagnosis of two paralytic conditions affecting young chicken with emphasis on PCR findings. / Davidson I., Weisman Y., Perl S., Malkinson M //Avian Pathol. 1998. - V. -27. - P. 417-419.
185. Dudnikov Z.A., Witter R.Z. A comparison of autologous and heterologous vaccination against Marek's disease. // The 6-th International Symposium on Marek's disease, Monreal, Canada. 2000. - August 20-23, p.37.
186. Dulow V. Von, Lesjak M. Modifizierter ELISA zur Lachweis antiviraler Antikorper in Huhnerseren unter Einbezichund von Virus-freien Zellantigenen zur Spezifitats Kontrolle. // J. Vet. Med. 1987. - V. 34, N 9. - P. 655-669.
187. Efficacy and safety of recombinant fowl pox Marek's disease vaccine. / Kinney N., Page D., Taylor J. et al. // Zootecnica - International. - 1995. - V. 18. -N9.-P. 32-33.
188. Efficacy of a bivalent vaccine against Marek's disease. / A.K.Pruthi, R.K.P. Gurta, J.R.Sadana et al. // Res. in Veter. 1987. - V. 42, N 2. - P. 145-149.
189. Efficient production of chicken egg yolk antibodies against a conserved mammalian protein. / M.Gassmann, P.Thommes, T. Weiser et al. // FASEB J. -1990.-V. 4, N8.-P. 2528-2532.
190. Expression and purification of recombinant Marek's disease virus serotype 1 specific phosphorylated protein pp 38 in E. Coli. / Endoh D., Niikura M. et al. // J. Vet. Med. Sci. 1994. - V. 56, N 5. - P. 823-826.
191. Expression Marek's disease virus (MDV) serotype 2 gene with has partial homology with MDV serotype 1 pp 38 gene. / Ono M., Maeda M.K., Kawaguchi Y. et al. // Virus. Res. 1995. - V.35, N 2. - P. - 223-229.
192. Expression of a putative tumor-associated antigen on normal versus Marek's disease virus-transformed lymphocytes. / K. McColl, B.W. Calnek, W.V. Harris et al. // J. Nat. Cancer Inst. 1987. - V. 79. - P. 991-1000.
193. Expression of Marek's disease virus genes in recombinant fowlpox virus and protection of chickens against MD. / Nazerian K., Yanagida N., Lee L.F. et all. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992. - P. 136-139.
194. Expression of the A antigen Cgp57-65) of Marek's disease virus by recombinant baculovirus. / M. Niikura, Y.Matsuura, M.Hattori et al. // J. gen. Virol. 1991. -V. 72.-P. 1099-1104.
195. Fadly A.M., Witter R.L. Effect of age at infected with serotype 2 Marek's disease virus on enhancement of avian leukosis virus-induced lymphoma. // Av. Path. -1993.-№22.-P. 565-576.
196. Fadly A.M., and Ewert D.L. Enhancement of avian retrovirus-induced B-Cell lymphoma by Marek's disease herpes virus. In: Kung H.J. and Wood C. (Eds) Interactions between Retroviruses and Herpesviruses. (Ne>v Jersey, World Sci., Publ. Co.).-1994-P. 1-9.
197. Field Safety and Efficacy of In Ovo Administration of HVT+SB-1 Bivalent Marek's Disease Vaccine in Commercial Broilers. / G. Sarma, W. Greer, R.P. Gild-esleeve, D.L. Murray, and A.M. Miles. // Avian Disease. 1995. - N 39. - P. 211217.
198. Francoise C., Ahluwalia R. Antigen requirements and specifity of a mi-croplate enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Marek's disease viral antibodies in chicken, mause and rabbit sera. // Ann. rech. vet. 1984. - V. 15, N 4. - P. 529-534.
199. Gagic M., Carherine A. St. Hill, Sharma J.M. In Ovo vaccination of specific-pathogen-free chickens with vaccines containing multiple agents. // Avian Dis. — 1999. № 43. - P. 293-301.
200. Gagic M., Durisic S. Extraction of antigen "A" from the skin of chickens infected with the pathogenic virus of Marek's disease. // Acta Veter. Beograd. 1995. -V. 45, N 1. - P. 25-30.
201. Gavora J.S. Genetics aspects of interactions between Marek's disease virus and their hosts. // Proc. XIX World's poultry congress, Amsterdam, the Motherland.- 1992.-P. 175-180.
202. Gene identification and effective expression of Marek's disease virus В antigen (gp 100, gp 60, gp 49). / Niikura M., Matsuura Y., Endoh D., Okuma M. and Mikami T. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992. - P. 100-102.
203. Genetic effects of Marek's disease mutual thymus transplantation between lines on and immunocompetences in chickens. / F. Afraz, Y. Yamamoto, M. Nishi-bori, I. Okada// Anim. Scl. Technol. 1992. - V. 63, N 7. - P. 675-681.
204. Genetics and vaccines for the future control of Marek's disease. / Witter R.L., Bacon L.D., Hunt H.D. and Cheng H.H. // Proc. 43 Annual nat. beepers round table.- 1994. S.l. - P. 90-96.
205. Genome Analysis of Marek's Disease Virus Strain CVI-988: Effect of Cell Culture Passage on the Inverted Repeat Regions. / Hoofi van Iddekinge B.J.L., L. Stenzler, K.A. Shat, H. Boerrigter, and G. Koch. // Avian Disease. 1999. - N 44. -P. 182-188.
206. Gilka E., Spenser J.L. Extravascular hemolytic anemia in chickens infected with highly pathogenic Marek's disease viruses. // Avian Pathol. 1995. - V. 24, № 3.-P. 393-410.
207. Gingerich E. Tools for controlling Marek's disease. // Egg. Ind. 1989. - V. 95, N.3. - P. 29.
208. Grandies P. Monoclonal antibody purification guide: Part 1. // Amer. Bio-technol. Lab. 1994. - V. 12, N 6. - P. 58-60.
209. Hafez H.N. Field investigations on Marek's disease in commercial pullet and layer flocks //Arch. Geflugelk. 1997. - V 61 (5). - P. 215-217.
210. Harasawa R. The new classification of animal viruses. // J. Vet. Med. 1995. -V.48.-P. 911-917.
211. Hartmann W. Evaluation of major genes affecting resistance to disease in poultry. / World's Poultry Science Journal. 1997. - V. 53, September - P. 231-252.
212. Hase Т., Summers P.L., Eskelesk H. // Virally Infected Cell. New York. -1989.-P. 275-308.
213. Hassl A., Horst A. Purification of egg yolk immunoglobulins. A two-step procedure using hydrophobic interaction chromatography and gel filtration. // J. Im-munnol. Meth. 1988. - V. 110, N 2. - P. 225-228.
214. Heryn D., Ross A.H., Koprowski H. Anti-idiotipic antibodies bear the internal image of human tumor antigen. // Science. 1986. - V. 232. - P. 100-102.
215. Hillerman M.R. Marek's disease vaccine: it's implications in biology and medicine. // Avian Pathol. 1997. - P. 191-199.
216. Hillerman M.R. Marek's disease vaccine. Immunising effect of purified turkey herpes virus and cellular membrane from infected cells. // Avian Pathol. 1997. -P. 261-269.
217. Hommel U., Behn I., Weichert H. Hen egg yolk as an alternative source oi secondary antibodies. / Abstr. 2-nh World Congr. Altemal. and Anim. Use Life Sci., Utrecht, 20-24 Oct. 1996. //ATLA 1996. - 24. Spec. Issue. - P. 317.
218. Hong Y., Frame M., Coussens P.M. A 14 kDa immediate-early phosphopro-tein in specifically expressed in cells infected with oncogenic Marek's disease virus strains and their attenuated derivatives. // Virology. 1995. - V. 206, №1. - P. 695700.
219. Hoofi Van Idderinge B.SJ. Genome analysis of Marek's disease virus strain CVI-988. Effect of cell culture passage on the inverted Repeat Region. // Avian Dis. -1999.-№44.-P. 182.
220. Humoral and cellular response of the resistant and sensitive chickens against Marek's disease. / Matta M.F. de R., Coudert F., Cauchy L., Bernard S. // Vet. E Zoot., Sao Paulo. 1995. - V. 7. - P. 63-74.
221. Identification and localization of glycoprotein В expression in lymphoid tissues of chickens infected with turkey herpesvirus. /M.S. Holland, R. Silva, C.D. Mackenzie et al. //Avian Dis. 1994. - V. 38, N 3. - P. 446-453.
222. Identification of Marek's disease herpesvirus В antigen's precursor polypeptide and encoding it. /I.Sithole, P.M.Coussens, L. F.Lee et al. // In: Advances in Marek's Disease Research. Japanese Association on Marek's disease, Osaka. -1989.-P. 148-154.
223. Immunomodulation of peripheral T cells in chickens infected with Marek's disease virus: Involvement in immunosuppression. /М. Toshifiimi, M. Hattori. K. Ohashi et al. //J. Gen. Virol. 1995. - V. 76, N 12. - P. 2979-2985.
224. Immunoprecipitation of Marek's disease virus-specific polypeptides with chicken antibodies purified by affinity chromatography. / Ikuta K., Nishi Y., Kato S., Hirai K. // Virology. 1981. - V. 114. - P. 227-281.
225. Influence of Marek's disease virus strain AC-1 on cellular immunity in birds carrying endogenous viral genes / Lessard M., Hutchings D.L., Spencer J.L. at al. // Avian Dis. 1996. - V. 40. - P. 645-653.
226. Interazione tra i virus dell malattia di Marek e dell'anemia infettiva aviare / Zanella A., Coaro R., Dall'ara P. et al. // La Selezione Veterinaria. 1999. - V. 10. -P. 727-742.
227. Interferon Modulation of Marek's Disease Virus Genome Expression in Chicken Cell Lines. / Volpini L. M., B. W. Calnek, B.Sheath, M.J. Sekellick, and P.I. Marcus. // Avian Disease. 1996. - N. 40. - P. 78-87.
228. Iritani Y., Savvaguchi K. Measurement of antibody titer to pox fowl virus by enzyme-linked immunosorbent assay. //J. Vet. Med. Sci. 1994. - V. 56, N 6. - P. 1191-1193.
229. Isolation and characterization of Marek's disease virus (MDV) cDNAs mapping to the BamHI-12, BamHI-02, and BamHI-L fragments of the MDV genome from lymphoblastoid cells transformed and persistently infected with MDV / Peng
230. Qinghai, Zeng-Ming, Z.A.Bhuivan et al. // Labor. Tumor Virol. 1995. - V. 213, N 2.-P. 590-599.
231. Isolation from turkeys of a cell-associated herpesvirus antigenically related to Marek's disease virus. / Witter R.L., Nazerian K. et al. // Am. J. Vet. Res. 1970. -V.31.-P. 525-538.
232. Isolation of serotype 1 Marek's disease viruses from vaccinated Australian flocks. /D. B. De Lanev, A.E. Jones, M. Zerbes et al. // Veter. Microbiology. 1995. - V. 46, N 1-3.-P. 213-219.
233. Isolation of serotype 1 Marek's disease viruses from vaccinated Australian flocks. / De Laney D.B., Iones A.E., Zerbes et al. // Veter. Microbiol. 1995. - V. 46.-№ 1-3.-P. 213-219.
234. Istort J.R., Kung H., Velicer L.F. Identification of the gene encoding Marek's disease herpesvirus A antigen. // J. Virol. V. 61. - N 8. - 1987. - P. 2614-2620.
235. Jeggo M.H. Diagnosis of viral diseases using ELISA techniques. //Nucl. and Related Tech. Anim. Prod, and Health Proc. Int. Symp., Vienna, 17-21 March. -1986.-P. 289-301.
236. Jerne N.K. Toward a network theory of the immune system. // Ann. Immunol. (Paris). 1974. - V. 125 - P. 373-389.
237. Johnson E.S. Poultry oncogenic retroviruses and humans. // Cancer Detect. Prev. 1994.-N 18.-P. 9-30.
238. Johnson E.S, Griswold C.M. Oncogenic retroviruses of cattle, chickens and turkeys: potential infectivity and oncogenecity for humans. Med. Hypoth. - 1996. -V. 46. - P. 354-356.
239. Jurajda V., Halouzka R. Icolace a studium biologickych vlastnosti neonkogennich nukecich herpesviru markovy nemoci. 2. Charakterizatce in vivo. // Veter. Med., Praha. 1992. - N 9-10. - P. 535-542.
240. Kaaden O.K., Dietrchold B. and Ubrschar S. Vaccination against Marek's disease: Immunising effect of purified turkey herpes virus and cellular membrane from infected cells. // Med. Microbiol. Immunol. 1974. - № 159. - P. 261-269.
241. Kaleta E. F. Herpesviruses of birds a review. //Avian Path. - 1990. - V. 19. -P. 193-211.
242. Kato S., Hirai K. Marek's disease. Advances in virus research. / Ed Maram-orsch K., Murphy F.A., Shatkin A.J. // New York: Academic Press. 1985. - V. 30. -P.-225-227.
243. Kawamura H., King D.J., Anderson D.P. A herpesvirus isolated from kidney cell culture of normal turkeys. // Avian Dis. V. 13. - 1969. - P. 853-863.
244. Kazuhiro Nakajima. Synthesis and processing of a gp 28/32 membrane glycoprotein induced by Marek's disease virus serotype 2. // J. of General Virology. -1990.-V.71.-P. 1807-1810.
245. Keay S., Merigan T.C., Rasmussen L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. -V. 86.-P. 10100-10103.
246. Kennedy R.C., Melnich J.Z. and Dreesma G.R. Anti-idiotypes and immunity. // Sci. Am. 1986. -V. 255 (1). - P. 40-48.
247. Kobler G., Milstein C. Dervation of specific antibody producing tissue culture and tune or lines by cell Lucian. // Eur. J. Immunol. 1976. - № 6. - P. 611-621.
248. Krah D.L., Choppin P.W. // J. Virol. 1988. - V. 62. - P. 1565-1572.
249. Kreager K.S. Chicken industry strategies for control of tumor virus infections. // Poultry- sci. Savoy, IL. 1998. - V. 77(8). - Aug. - P. 1213-1216.
250. Kross I., Davis P.J., Shilleto R.W. Isolation of highly cytolytic MDV strains from Germany and Spain. // Avian Pathol. 1998. - V.27 (3). - June. - P. 313-315.
251. Lack of evidence for Marek's disease virus genomic seguences in leucocyte DNA from multiple sclerosis patients in Germany. / Hennig H., Wessel K., Sonder-meijer P., Kirchner H., Wandinger K.P. // Neurosci Lett. 1998. - V. 250 (2). - P. 138-140.
252. Larson A., Sjoquist J. Chicken's antibodies: a tool avoid false positive results by rheumatoid factor in latex fixation tests. // J. Immunol. Meth. 1988. -V. 108. - P. 205-208.
253. Latent Turkey Herpesvirus Infection in Lymphoid, Nervous, and Feather Tissues of Chickens. / Holland M.S., Mackenzie C.D., Bull R.W., Silva R.F. // Av. Disease. 1998. - V. 42. - P. 292-299.
254. Lee F.L, Cui Z. Identification of Marek's disease virus genes in bacteriophage lambda gtll with monoclonal antibodies. //In: Advances in Marek's Disease Research. Japanese Association on Marek's disease, Osaka. - 1989. - P. 56-61.
255. Lee L.F., Witter R.L. Humoral immune responses to inactivated oil emul-sitied Marek's disease vaccine. // Avian Disease. - 1991. - V. 35. - P. 452-459.
256. Lee L.F., Witter R.L. Monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of Marek's disease viruses in chickens. // J. Immunol. 1983. — V. 130.-P. 1003-1006.
257. Lesnik F., Ross I.J. Immunization against Marek's disease using Marek's disease virus-specific antigenes from infectious virus. // Int. J. Cancer. 1975. - V. 16. -P. 153-163.
258. Lessard M., Hutchings D.L., Spenser J.L. et al. Influence of Marek's disease virus strain AC-1 on celluar Immunity in birds carrying endogenous viral genes. // Avian Dis. 1996. - V. 40. - P. 645-653.
259. Liberona P. Marek's disease vaccine still a treat! // Poultry adv. 1990. - V. XXIII, N 1.-P. 65-69.
260. Lin J.A., Tsong-Shymen Lee. Genetic susceptibility to Marek's disease virus of local chickens in Taiwan. // Avian Disease. 1996. - V.40. - P. 576-581.
261. Lindenmaier W., Bauer H.J. Cosmid Cloning and Restriction-Endonuclease Mapping of the Herpesvirus of Turkeys (Hvt) Genome. // Arch. Virology. 1994. -N 135.-P. 171-177.
262. Malkinson M., Davidson I. and Becker Y. A novel immunological approach to the structure and function of antigen B. // In: 19-th World's Poultry Congress, V.l. Amsterdam. 1992. - P. 239-241.
263. Marek J. Multiple Nervenentzuendung (Polyneuritis) bei Huehnern / Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1907. - N 15. - P. 417-421.
264. Marek's disease: a comprehensive view. / Prajapat K.S., Joshi B.P. et al. // Poultry Guide. 1990. - V. 27. - N 12. - P. 67-72.
265. Marek's disease field experience and vaccination strategies. // Poultry International.1993.-N 11.-P. 33-36.
266. Marek's disease virus: Comparative efficacy. / R.W. Morgan, J.A.J. Classens, M.J. Willemse et al. // Avian Dis. 1987. - V. 31. - P. 752-765.
267. Marek's disease virus isolated with unisuai iredism and virulence for ocular tissues: Clinical findings, challenge studies and pathological features. / M. D. Ficken, M. P. Nasisse, G.D. Boggan et al. // Avian Pathol. 1991. - V. 20, N 3. - P. 461-474.
268. Marek's disease virus vaccine. / R.W.Morgan, J.A.J. Classens, M.J.Willemse et al. //Пат. 5283191 США, МКИ6, C12P 21/02, C12P 19/34. N 912015. 01.02.94.
269. Marsh J.D., L.D.Bacon, and A.M.Fadly. Effect of serotype 2 and 3 Marek's disease vaccines on the development of avian Leukosis virus-induced Pre-neoplastic Bursal Follicles. // Avian Disease. 1995. - N 39. - P. 743-751.
270. Marx S.L. Malking antibodies without the antigens. // Science. 1984. - V. 228.-P. 162-165.
271. McGeoch D.J., Cook S. Molecular phylogeny of the Alphaherpesvirinae subfamily and proposed evolutionary timescale. // J. Molecular Biol. 1994. - V. 238, N 1.-P. 9-22.
272. Mischak M., Neubauer C. et al. // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 26532656.
273. Mitochondrial PEPCK: a highly polymorphic gene with alleles co-selected with Marek's disease resistance in chickens / Li S., Zadworny, Aggrey S.E., Kuhnlein U. // Animal Genetics. 1998. - V. 29. - P. 395-397.
274. Molecular analysis of the glycoprotein С negative phenotype of attenuated Marek's disease virus. / Wilson M.R., Southwick R.A. et al. // Virology. - 1994. - V. 199.-N2.-P. 393-402.
275. Molecular characterization of the Marek's disease herpesvirus В antigen. /R. J. Istort, I. Sithole, H.-J. Kung et al. // J. Virol. 1986. - V. 59. - P. 411-419.
276. Castell J.V. Long-term storage of peroxidase-labelled immunoglobulins for use in enzyme immunoassay. // J. Immunol. Meth. 1988. - V. 110. - P. 13-20.
277. Motto H., Coleman M.A. Quality control methods to preventing vaccine breaks. // Poultry Adviser. 1995. - V. 28, N 8. - P. 77-80.
278. Murthy K.K., Calnec B.M. Pathogenesis of Marek's disease: effect of immunization with inactivated viral and tumor-associated antigenes. // Infect. Immun. -1979.-V. 26.-P. 547-553.
279. Mutational analysis of the proteolytic cleavage site of glycoprotein В (gB) of Marek's disease virus. /S.Yoshida, L.F. Lee, N. Yanagina, K. Nazerian //Gene. -1994. -V. 150,N2.-P. 303-306.
280. Nagang G., Kharole M. U. Effects of levamisole on the efficacy of turkey herpesvirus vaccine against Marek's disease. //Indian J. Virol. 1995. - V. 11, N 1. -P. 13-22.
281. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody: a new methods of conjugation //J. Histochem. Cytochem. 1974. - V. 22, N 12. - P. 1084-1091.
282. Nazerian K., Burmester B.R. Electron microscopy of a herpesvirus associated with the agent of Marek's disease in cell culture. // Cancer Res. 1968/ - V.28. - P. 2454-2464.
283. Nazerian K., Burmester B.R. Isolation of serotype 1 Marek's disease viruses. // Cancer Res. 1968. - V. 28. - P. 2465-2474.
284. Nazerian K., Chen J.H. Immunoferritin studies of Marek's disease virus directed intracellular and membrane antigenes. // Arch. Ges. Virusforsch. 1973. - V. 431.-P. 59-65.
285. Nazerian K., Witter R.L., Lee L.F. Protection and synergism by recombinant fowl pox vaccines expressing genes from Marek's disease virus. // Avian Dis. -1996.-V. 40.-P. 368-376.
286. New vaccines for old problems. //International Poultry Production. 1995. -V.3.-N6.-P. 17-19.
287. Njenga M.K., Dangler C.A. Endothelial MHC Class II antigen expression and ^.endarteritis associated with Marek's disease virus infection in chickens. //Veter.
288. Pathol. 1995. - V. 32, N 4. - P. 403-411.
289. Nucleotide sequence analysis of Marek's disease virus CMDV) serotype 2 homology of MDB serotype 1 pp38, an antigen associated with transformed cells.
290. Office International des Epizooties (OIE), (1999). Manual of standards for diagnostic tests and vaccines, 3rd Ed. OIE, Paris. - 723 p.
291. Omar A.R., Schat. K.A., Lee L.F., Hunt M.D. Cytotoxic T Lymphocyte response in chickens immunized with a recombinant fowlpox virus expressing Marek's disease herpesvirus glycoprotein B. // Vet. Immunol. And Immunopath. — 1998.-V. 62.-P. 73-82.
292. Ono M. Preparation of monoclonal antibodies against Marek's disease virus serotype 1 glycoprotein D expressed by a recombinant baculovirus. // Virus Res. -1995. V.38. -N.2-3. - P. 219.
293. Palya V. Manual for the production of Marek's disease, Gumboro disease and Newcastle disease vaccines. 1989. - P. 3-54.
294. Parcells M.S., Anderson A.S., Morgan R.W. Retention of oncogenecity by Marek's disease virus mutant lacking six unique short region genes. // J. Virology. -V.69. N.12. - 1995. - P. 888-898.
295. Patrascu I.-V., Calnek B.W., Smith M. Vaccination with lyophilized turkey herpesvirus (HVT): minimum infective and protective doses. // Avian Pathol. -1997.-P. 86-93.
296. Patrascu J.-V. Zpusov pripravy vakciny proti Markove chorobe. // Pat. N 244931.-A 61 К 39/255. 15.07. 1988.-6 p.
297. Payne L.N. Gillespie A.M. & Howes K. (1993). Recovery of acutely transforming viruses from myeloid leukosis induced by the HPRS-103 strain of avian leukosis virus. //Avian Dis. - V. 37(2). - P. 438-450.
298. Payne L.N. (1992). HPRS-103: a retroviruses strikes back. The emergence of subgroup J. avian leukosis virus. Avian Pathol. V. 27 (Suppl. 1). - P. 36-45.
299. Payne L. N. (ed.). Marek's disease. // Martinus Nijhoff, Boston. 1985. - P. 17-24, 77-112, 177-201, 267-291, 293-340.
300. Payne L. N., Frazier J.A., Powell P.C. Pathogenesis of Marek's disease. //Int. Rev. Exp. Pathol. 1976. - V. 16. - P. 59-153.
301. Payne L.N. Pathogenesis of Marek's disease: recent development. // In: 19-th World's Poultry Congress. V. 1. World Poultry Science Association, Amsterdam. -1992.-P. 189-194.
302. Payne L.N., Venugopal K. Neoplastic disease: Marek's disease, avian leukosis and reticuloendotheliosis / Revue scientifique technique Off. int. Epiz. // Disease of poultry. 2000. - V. 19(2). - P. 544-564.
303. Petrone Garcia V.M. Xochill herrades velasco gullermo teller isaias. // Veterinaria Mexico. 2000. - V. 31. - № 4. - P. 355-369.
304. Phenotype analysis of lymphoid cells in Marek's disease of CD4+ or CD8+ T-cell-deficient chickens: occurrence of double negative T-cell tumour. // Okada K., Talaka Y. et al. // Avian Pathol. 1997. - V. 26. - P. 525-534.
305. Poison A., Barbara M. von Wechmar, Fazakerley G. Antibodies to proteins from yolk of immunizet Hens, //immunological Communications. 1980. - V. 9. -N5.-P. 495-514.
306. Polymerase chain reaction analysis of MDV-1 DNA. / Becker Y., Asher Y. et al. // In: 19-th World's Poultry Congress, V.I.Amsterdam 1992. -P. 216-219.
307. Polymerase chain reaction for differentiation between pathogenic and nonpathogenic serotype 1 Marek's disease virus (MDV) and vaccine viruses of MDV-serotypes 2 and 3. / Becker Y., Asher Y. et al. // J. Virol. Meth. 1992. - V. 40 (3). -P. 307-314.
308. Powell P. C. Host resistance Factors: Immune responses a review. //In: Calnek B. W. and Spencer J.L. (eds.), Proc Int Symp MD. 1985. - P. 238-261.
309. Powell P.C., Lombardini F. Progress in vaccination against Marek's disease. // Clin. Vet. 1987. - V. 42. - P. 36-41.
310. Powell, P. C. Marek's disease a world poultry problem. //World's poultry Science Journal. V. 42. - N 3. - 1986. - P. 205-218.
311. Pradhan H.K., Mohanty G.C., Lee W.Y. Antibody directed against Marek's disease associated tumour surface antigen can be eluted from against Marek's disease tumour cells. // Vet. Immunol. And Immunopath. - 1991. - V. 29. - P. 229238.
312. Preparation of monoclonal antibodies against Marek's disease virus and herpesvirus of turkeys. /Н. Hirose, M. Matsuda, M. Murata et al. //Jpn. J. Vet. Sci. -1986.- V. 48.-P. 1263-1266.
313. Preparation of monoclonal antibodies against Marek's disease virus serotype 1 glycoprotein D expressed by a recombinant baculovirus. / Mitsuru O., Hyung-Kwan, Ken M. et al. // Virus Res. 1995. - V. 38, N 2-3. - P. 219-230.
314. Production, purification and characterization of antibodies to 1,25-dihydroxyvitamin D raised in chicken egg yolk /R.M. Bauwens, J.A. Kint, M. P. Devos et al //Clin. Chlm. Acta. 1987. - V. 170, N 1. - P. 37-44.
315. Protection against Marek's disease by fowlpox virus recombinant expressing the glycoprotein В of Marek's disease virus. / Nazerian K., Lee L.F. et al. // J. Virol. 1992.-V. 66.-P. 1409-1413.
316. Protection and synergism by recombinant fowl pox vaccine expressing genes from Marek's disease virus. /К. Nazerian, R.L. Witter, L.F. Lee, N. Yanagida //Avian Dis. 1996. - V. 40. - P. 368-376.
317. Protection studies against Marek's disease using baculovirus-expressed glycoproteins В and С of Marek's disease virus type 1, / Jang H.-K., Kitazawa Т., Ono M. et al. // Avian Pathology. 1996. - V. 25, N 1. - P. 5-24.
318. Protective efficacy of Marek's disease viruses CMDV) CVI-988 CEF65 clone С against challenge infection with three very virulent MDV strain. /G. F. de Boer, J.F. Groenendal. H.M. Boerrigter et al. //Avian Dis. 1986. -V. 30. - P. 276-283.
319. Protein measurement with the Folin phenol reagent. / 0. H. Loury, N. J. Rose-hrough, A. L. Farr, R. I. Randall //Rlol. Chem. 1951. - V. 193. - P. 265-275.
320. Pulaski J.T.,. Tieber V.L., and Coussens P.M. Marek's virus-mediated enhancement of avian leukosis virus gene expression and virus production. // Virology. 1992. -V. 186.-P. 113-121.
321. Quantification of Marek's Disease Virus in Chicken Lymphocytes Using the Polymerase Chain Reaction with Fluorescent detection. / Bumstead N., Silibourne J., Rennie M., Ross N., Davison F. // J.Virol. Methods. 1997. - № 65. - P. 75-81.
322. Range chickens prefer inside. //Poultry Digest. 1988. - N 6. - P. 286.
323. Rapid detection and titration of Marek's disease virus vaccine on CER-cell line. / Wassel M.S., Suzan E.-M. et al. // Assiut Vet. Med. J. 1996. - V. 35, N 70. -P. 148-154.
324. Recombinant fowl pox vaccine for protection against Marek's disease. /К. Nazerian, L. F. Lee, N. Yanagida et al. //USA Secretary of Agriculture. N 803633. Pat. 5369025 QUA, MKI/P C12N 7/00: C12N 15/00. 29.11.95: HKM 435/235.1.
325. Relationship between the immunosuppressive potential and the pathotype of Marek's disease virus isolates. / Calnek B.W., Harris R.W., Buscaglia C. et al. // Avian Dis. Kennett Sguare, Pa. 1998 - V. 42 (1). - Jan./Mar. - P. 124-132.
326. Rispens B.H., Van Vloten H., Mastenbroek N. Control of Marek's disease inthe Netherlands. 1. Isolation of an avirulent Marek's disease virus (strain CVI 988) and its use in laboratory vaccination trails. //Avian Dis. 1972. - № 16. - P. 108125.
327. Rispens B.H., Van Vloten H., Mastenbroek N. Control of Marek's disease in the Netherlands 2. Field trials of vaccination with an avirulent strain (CVI-988) oft|
328. Marek's disease virus.//Avian Dis. 1972. - V .16. - P. 126-129.
329. Rock D.L. The molecular basis of latent infections by alphaherpesviruses. //Virology.- 1993.-N4.-P. 157-165.
330. Rodriguez J.M. Detection of animal pathogens by using the Polymerase Chain Reaction.//Vet. J. 1997. - V. 153. - P. 287-305.
331. Roizman В., Furlong D. The replication of herpesviruses. // J. Virol. 1980. -V. 37.-P. 334-342.
332. Ross I. J.N., Miln В., Biggs P. Restriction endonuclease analysis of Marek's disease virus DNA and homology between strains. // J. Gen. Virol. 1983. - 64. - P. 2785-2790.
333. Ross L.J.N. Molecular biology of the virus. //Marek's disease, /ed. L.N. Payne. Boston: Martinus Nijhoff Publishing. 1985. - P. 113-150.
334. Ross L.J.N. Recombinant vaccines against Marek's disease. // Avian Pathol. Oxfordshire: Carfax Publishing Company. Apr. 1998. - V.27. (Suppl 1). - P. 865873.
335. Ross N.J. T-cell transformation by Marek's disease virus. // Trends Microbiol. -1999.-V. 7.-№ 1.-P.22-28.
336. Rusov C., Gancic M. Vaccination strategies against Marek's disease. //Zhivinarstvo. 1994. - V. 29. - N 4-6. - P. 31-36.
337. Sachs D.Z., Esser K., Sher A. Immunization of mice against African trypanosomiasis using anti-idiotypic antibodies. // J. Ezp. Med. 1982. - V. 155. - P. 11081119.
338. Sharma J.M. Delayed replication of Marek's disease virus following in ovo inoculation during late stages of embryonal development. //Avian Dls. 1987. - V. 31.-P. 570-576.
339. Sarma G. Field trial and immunogenesity studies on the polyvalent Marek's disease vaccines in chickens. // In: 19-th World's Poultry Congress, V.l. World Poultry Science Association. Amsterdam. 1992. - P. 310-314.
340. Shat K.A., Calnek B.W. Characterization of an apparently nononcogenic Marek's disease virus. // J. Natl. Cancer Inst. 1978. - V. 60. - P. 1075-1082.
341. Schat К.A., Calnek B.W., Fabricant I. Characterization of two highly oncogenic strains of Marek's disease virus. // Avian Pathol. 1982. - V. 11. - P. 593606.
342. Schat K.A., Calnek B.W. Protection against Marek's disease derived tumor transplants by the nononcogenic SB-1 strain of Marek's disease virus. // Infect. Immunol. - 1978. - V. 22. - P. 225-232.
343. Schat K.A. Immune responses against Marek's disease virus. // In: 19-th World's Poultry Congress. V.l. - Amsterdam. - 1992. - P. 233-238.
344. Schat K.A. Immunity in Marek's disease and other tumors. //Avian Immunology: Basis and Practice. 1988. - V. 11. - P. 102-110.
345. Schat K.A. Marek's disease: A model for protection against herpesvirus-induced tumors. //Cancer Surveys. 1987. - V. 6. - P. 1-37.
346. Schat K.A., Taylor R.L., Jr., Briles W.E. Resistance to Marek's disease in chickens with recombinant haplotypes of the major histocompatibility (B) complex. //Poultry Sci. 1994. - V. 73. - P. 502-508.
347. Scholten R., Hilgert L.A.T. Detection of Marek's disease virus antigen in chickens by a novel immunoassay. // J. Virol. Meth. 1990. - V.27, №2. - P. 220226.
348. Shapiro D. Practical advice on Marek's vaccination. // Egg. Ind. — 1990. V. 96. - N.2. - P. 28-29.
349. Shierman W.L. Transplantable Marek's disease lymphomas. II. Variable tumor immunity induced by different lymphoblastoid cell. // J. Natl. Cancer Inst. -1984.-V. 73.-P. 423-428.
350. Shunsuke Yachida. Comparative studies on Aptigens induced by Turkey Herpesvirus and Marek's disease virus. 1. Agar gel precipitation and neutralization studies. //Zbl. Vet. Med. B. 30 1983. - P. 609-618.
351. Significance of Marek's disease virus serotype 1-specific phosphorylated proteins in Marek's disease skin lesions. / Cho K.-O., Endon D., Kimura T. et al. // Avian Pathology. 1997- V.26. - P. 707-720.
352. Silva R.F., Barnett J.C. Restriction endonuclease analysis of Marek's disease virus DNA: differentiation of viral strains and determination of passage history. //Avian Dis. 1991. - V. 35. - P. 487- 495.
353. Silva R.F. Differentiation of Pathogenic and Nonpathogenic Serotype-Marek's Disease Viruses (Mdvs) by the Polymerase Chain-Reaction Amplification of the Tandem Direct Repeats within the MDV Genome. // Avian Diseases. 1992. -V. 36.-P. 521-528.
354. Silva R.F. and Barnett J.C. Restriction endonuclease analysis of Marek's disease virus DNA differentiation of viral strains and determination of passage history. //Avian Disease. 1991.-P. 487-495.
355. Silva R.F., Gal vert I.G., Lee L.F. A simple immunoperoxidase plague assay to detect quantitate Marek's disease virus plagues. // Avian Disease. 1997. - V.41. -P. 528-534.
356. Sithole I., Coussens P.M., Lee L.F. Identification of Marek's disease herpesvirus В antigen's precursor polypeptide and the gene encoding it. // In В.: Advances in Marek's disease research. 1989. - P. 148-154.
357. Sithole L, Lee L. F., Vellcer L. F. Synthesis and processing of the Marek's disease herpesvirus В antigen glycoprotein complex. //J. Viral. 1986. - V. 57. - P. 4270-4279.
358. Some characteristics of a recent virulent isolate of Marek's disease virus. / M. Zerbes, G. A. Tannock, R.J. Jenner, P.L. Young // Australian Veter. J. 1994. - V. 71,N 1.-P. 21-22.
359. Standard I.M., Fuller A.O., Spear P.G. Herpes simplex virus glycoproteins associated with different morphological enities // J. Virol. 1986. - V. 57. - P. 4754479.
360. Stein K., Soderstrom T. Neonatal administration of idiotype or anti-idiotype primes for protection against Escherichia coli К 13 infection in mice. // J. Exp. Med.- 1984.-V. 160.-P. 1001-1011.
361. Strivastava R.N., Raushik A.K., Prasad S. Исследование методом фермент-связанных иммуносорбентов сывороточных антител к ВБМ у вакцинированных цыплят. // Acta Virol. V.26. - 1982. - P. 302.
362. Synthesis, processing and secretion of the Marek's disease herpesvirus A antigen glycoprotein. /R.J.Istort, R. A. Stringer, H.-J. Kung et al. // J. Virol. 1986. - V. 57. - P. 464-474.
363. Tablante N., Vaillancourt J.P., Julian R.J. Mortality in a flock of layer hens during the first half of the production period. //Med. Vet. du Quebec. 1994. - V. 24, N2.-P. 82-85.
364. Taylor R.D., Jones G.P.D., Murison R.D. Influence of the method of calcium provision on Marek's disease losses in compound and choice fed layers // British Poultry Science. 2000. - V. 41. - P. 219-223.
365. Tests of association of immunoglobulin allotype genes and viral oncogenesis in chickens. / L. D. Bacon L.K. Chang, J. Spencer et al. // Immunogenet. 1986. - V. 23.-P. 213-220.
366. The development and evolution of two tissue culture-grown Marek's disease challenge viruses. / D.B. Laney, C.J. Morrow, K.M. Read, G.A. Tannock // Avian Pathology. 1998. - V.27. -N.3. - P. 472-477.
367. The early pathogenesis in chickens inoculated with nonpathogenes serotype 2 Marek's disease virus. / Lin J.A., Kodoma H. et al. // J. Vet. Med. Sci. 1991. - V. 53.-N2.-P. 269273.
368. The glycoprotein В genes of Marek's disease virus serotypes 2 and 3: identification and expression by recombinant fowlpox virus. /S. Yoshida, F.L. Lee. N. Ya-nagida, K. Nazerian //Virology. 1994. - V. 200, N 2. - P. 484-493.
369. The use of blood from selected chickens as an immunizing agent for Marek's disease. / Zander D.V., Hill R.W. Raymond R.G., Balch R.K // Avian Dis. 1972. -V. 16.-P. 163-178.
370. Transformation of T-lymphocyte subsets by Marek's disease herpesvirus. / K.A. Schat, C.-L. H. Chen, B, W. Calnek. D. Char //J. Virol. 1991. - V. 65. - P. 1408-1413.
371. Two distinct antigens on chickens thymocytes defined by monoclonal antibodies. /Т. Hondo, T. Mikaml, H. Kodama, H. Izawa // Avian Pathol. 1988. - V. 17.-P. 589-600.
372. Use of recombinant pp 38 antigen Marek's disease virus to identify serotype 1-specific antibodies in chicken's sera by Western blotting. / Li D.S., Green P.F., Skinner M.A. et al. // J. Virol. Meth. 1994. - V. 50, N 1-3. - P. 185-196.
373. Uspjesnost uzg oja tovnin pilica vakciniranin protiv Marekove bolestiuz visestruku upotrebu stelje. / Nemarnik D., Mazija H. et al. // Praxis Veter. 1992. -V. 40. - N 2. - P. 159-173.
374. Venugopal К., Payne L.N. Molecular pathogenesis of Marek's disease — recent development. // Avian Pathol. 1995. - V.24. - N 4. - P. 597-609.
375. Vielitz E., Landgraf. Protection against Marek's disease with different vaccines, determination of PD50 and duration of vaccinal immunity. //Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1986. - V. 93. - P. 53-55.
376. Vielitz E. Resent problems and advances in the control of Marek's disease. //Proc 10th Lat Am Poult. Congr. Buenos Aires, Argentina. 1987. - P. 155-184.
377. Von Bulow V., Biggs P.M. Differentiation between strain of MDV and turkey herpesvirus by immunofluorescence assays. // Avian Pathol. 1975. - V. 4. -P. 133139.
378. Wang В., Pan Y. H., Liu X.F. Study on the characteristics and immunogenic lty of different, passages of strain Z-4 of Marek's disease virus in culture. //J. Jiangsu Agricultural College. 1994. - V. 15, N 3. - P. 47-51.
379. Wiestler 0. D., Gemot W. Sensitive two-site sandwich enzyme immunoassay with antipeptide antibodies for detection of viral antigens. //J. Immunol. Meth. -1988.-V. 110.-P. 153-159.
380. Wilcox C.L., Johnson E.M. Nerve growth factor deprivation results in the reactivation of latent herpes simplex virus in vitro. // J. Virol. 1987. - V. 61. - P. 2311-2315.
381. Wilson M.R., Tieber V.L. Molecular basis for reduced expression of glycoprotein С (gp 57-65) in attenuated Marek's disease virus. // In: 19-th World's Poultry Congress, v. 1 Amsterdam. 1992. - P. 108-111.
382. Witter R. L. Association in broiler chickens between natural serotype 2 Marek's disease virus infection and leukosis condemnations. //In: Calnek B. W., Spencer J.L. Proc Int Symp Marek's Dis. 1985. - P. 545-554.
383. Witter R.L. Attenuated revenant serotype Г Marek's disease virus: safety and protective efficacy. // Avian Dis. 1991. V. 3. P. 877-891.
384. Witter R.L. Attenuation of lymphoid leukosis enhancement by serotype 2 Marek's disease virus. // Avian Pathology. V. 24. - 1995. - P. 665-678.
385. Witter P.L., Bacon L.D., Calvert J.G. Partial inhibition by turkey herpesvirus of serotype 2 Marek's disease virus plaque formation and in Vivo infectivity. //Avian Dis. 1994. - V. 38, N 4. - P. 800-809.
386. Witter R.L. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates. // Avian Dis. -V.41.-N.L- 1997.-P. 149-163.
387. Witter R.L., Lee L.F., Faly A.M. Characteristics of CVI-988/Rispens and R2/23, new prototype vaccine strains of serotype 1 Marek's disease virus. // Avian Dis. 1995. - № 39. - P. 269-284.
388. Witter R. I., Lee L. F. Polyvalent Marek's disease vaccines. Safety, efficacy and protective synergism in chickens with maternal antibodies. //Avian Path. 1984. -V. 13.-P. 75-92.
389. Witter R.L., Lee L.F., Sharma J.M. Biological diversity among serotype 2 Marek's disease viruses. // Avian Disease. 1990. - V. 34. - P. 944-957.
390. Witter R.L. Principis of vaccination //In. L.N. Paune. Marek's disease. -1985.-P. 203-209.
391. Witter R.L. Low enhancement serotype 2 vaccine for Marek's disease. // United States Departament of Agriculture patents. Washington. - Oct. 15. - 1996. -P. 1-12.
392. Witter R.L. Marek's disease: prevention and control. // In: Advances in Marek's disease Research. — Japanese Association on Marek's disease, Osaka. -1989.-P. 389-397.
393. Witter R. L. Marek's disease: some new vaccine development. //Poultry Digest. 1988. - V. 17, N 556. - P. 286-288.
394. Witter R.L., Nazerian К. et al. Isolation from turkeys of a cell-associated herpesvirus antigenically related to Marek's disease virus. //Am. J. Vet. Res. 1970. -V. 31.-P. 525-538.
395. Witter R. L. New serotype 2 and attenuated serotype 1 Marek's disease vaccine: comparative efficacy. //Avian Dis. 1987. - V. 31. - P. 752-765.
396. Witter R.L. New virulent Marek's disease virus: Comparative efficacy. //Avian Dis. 1987. - V. 31. - P. 752-765.
397. Witter R. L. Principles of vaccination. //In: L. N. Paune. Marek's disease. -1985.-P. 203-250.
398. Witter R.L. Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strain of Marek's disease virus. // Avian Pathol. 1982. - V. 11. - P. 49-62.
399. Witter R.L. Recent development in the prevention and control of Marek's disease. // In: 19-th World's Poultry Congress, V. 1. World Poultry Science Association. Amsterdam. 1992. - P. 298-304.
400. Witter R.L., Silva R., Lee F.L. New serotype 2 and attenuated serotype 1 Marek's disease vaccine viruses: selected biological and molecular characteristics. // Avian Dis. V. 31. - 1987. - V. 31. - P. 829-840.
401. Witter R.L. The changing landscape of Marek's disease. Avian Pathol. — 1998.-V.-27.-P. 46-63.
402. Witter R.L. Very virulent Marek's disease viruses: importance and control. // World's Poultry. 1989. - V.45. - N.lP. 60-65.
403. Wu C.F., Liu X.F. Механизм протективного синергизма между серотипами 2 и 3 болезни Марека. // Zhong guo Shoyi Xiebao Chin. J. Vet. Sci. - 1999. - V. 5. - № 19. - P. 425-428.
404. Wu C.X., Zhang R.K., Liu X.F. Comparative efficacy trials of different dose proportions of the component viruses in the Marek's disease bivalent vaccine Z4+FC-126. // Acta Vet. Zootechsin. Sin. 1994. - V. 25, N 3. - P. 279-283.
405. Wu P., Lee L.F., Reed W.M. Serological characteristics of membrane glycoprotein gp 82 of Marek's disease virus. // Avian Dis., Kennett Sguare, Pa: American Association of Avian Pathologists Inc. -V. 41(4). Oct./Dec. - 1997. - P. 824-831.
406. Yonash N., Bacon L.D., Witter R.L., Cheng H.H. High resolution mapping and identification of new quantitative trait loci (QTL) affecting susceptibility to Marek's disease. //Animal Genetics. 1999. -V. 30. - P. 126-135.
407. Zanella A., Dall'Ara P., Marchi M. Malattia di Marek: valore diognostico e prognostico dee test di agar-gel diffusione con le piume. //La Selezione Veterinaria. Supplemento - 2000. - S. 217 - 224.
408. Zelnik V. Marek's disease and new approaches to its control. // Acta Virol. — 1995. V.39.-N.1.-P. 53-63.
409. Zhang L., Zxang S., Xue W. et al. Expression of a 50kDa putative receptor for bovine viral diarrhea virus in bovine fetal tissues. // Can. J. Vet. Res. 1998. - V.62. -№ 2.-P. 156-159. .
410. Zhang S., Chen W., Song D. Действие смеси эпимедиум-прополис на устойчивость цыплят к болезни Марека и обмен RBC-CR1 // Xiumu Shouyi Xue-bao = Acta Vet. Zootech. Sin. 1996. - V. 27, N 3. - P. 254-259.
411. Zhang X. Replication of HVT in chicken feather tips containing MDV and effect of its vaccination on MDV antigens detection. // Acta Veter. Zootechb. Sinica. -1998. V. 29 (3). - P. 274 - 279.
412. Zhizhohg C. Marek's disease virus gene clones encoding virus-specific phosphorylated polypeptides and serological characterization of fusion proteins. // Virus genes. 1990. - V.3. - P. 309-322.
413. Zhizhong С., Lee L.F. A lymphocyte surface ^ntigen complex related of Marek's disease tumor cells and recognized by a monoclonal antibody. // Acta Vet-erinaria at Zootecnica. 1995. - V. 26 (2). - P. 139-146.
414. Zhu G.S., Ojima Т., Hironaka Т., Ihara Т., Mizukoshi N., Kato A., Ueda S., Hirai-K. Differentiation of Oncogenic and Nononcogenic Strains of Marek's Disease Virus Type-1 by Using PCR DNA Amplification. // Avian Diseases 1992. -№36. -P. 637-645.
415. Zygraich N. and Huygelen C. Inoculation of one-day-old chicks with different strains of turkey herpesvirus. II. Virus replication in tissues of inoculated animals. // Avian Dis.- 1972.- V. 16. -P. 793-798.
-
Ярыгина, Елена Игоревна
-
доктора биологических наук
-
Щёлково, 2005
-
ВАК 03.00.23
- Бивалентная вакцина против болезни Марека из вируса 1 и 3 серотипов
- Уровень цитокинов у цыплят при воздействии патогенного и вакцинного вируса болезни Марека в сочетании с иммуномодулятором беталейкином
- Безопасность, иммуногенность и профилактическая эффективность вакцинных штаммов вируса гриппа А/Н5N1 с удаленными факторами патогенности: белками NS1 и PB1-F2
- Разработка технологии изготовления и контроля вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни кур из штамма "БГ"
- Вакцины против клещевого энцефалита, бешенства и гепатита В
