Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антифунгальные целлобиозолипиды дрожжевых грибов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антифунгальные целлобиозолипиды дрожжевых грибов"

на правах рукописи

Кулаковская Екатерина Владимировна

Антифунгальные целлобиозолнпиды дрожжевых грибов (специальность - 03.00.04 «биохимия»)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

Пущино-2006 г.

Работа выполнена в Лаборатории регуляции биохимических процессов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. ПК. Скрябина РАН

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор И.С, Кулаев доктор биологических наук В.И. Голубев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Я. И. Бурьянов доктор биологических наук Е.О. Пучков

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «30» ноября 2006 г. в 15 час 30 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте Биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН

Автореферат разослан октября 2006г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.038.01

кандидат биологических наук / Смолихина Т.И.

/

Актуальность проблемы. Поиск и характеристика новых соединений, за счет которых обеспечиваются антагонистические взаимоотношения микроорганизмов, необходимы как для понимания механизмов, обеспечивающих это широко распространенное явление, так и для разработки новых средств борьбы с патогенными микроорганизмами. У дрожжевых грибов такие взаимоотношения обеспечиваются в первую очередь белками (или гликопротеинами), называемыми микоцинами и отличающимися таксономически специфичным спектром действия (Golubev, 1998, 2005).

Однако антибиотическая активность, проявляемая дрожжевыми грибами, обеспечивается не только за счет микоцинов. Сравнительно недавно обнаружены штаммы дрожжей, продуцирующие аптифунгальные соединения с широким спектром действия, включающим дрожжи далеких друг от друга филогенетических групп, относящихся как к аскомицетам, так и к базидиомицетам (Golubev and Schabalin, 1994). Данные соединения имеют низкую молекулярную массу (около 1000 Да), термостабильны и устойчивы к действию протеиназ. К началу настоящей работы природа и структура такого антифунгального соединения, оказавшегося целлобиозолипидом, была установлена только для штамма 9-6 дрожжей Cryptococcus humicola (Puclikov et al., 2002).

В литературе широко распространено мнение о том, что внеклеточные гликолипиды в первую очередь выполняют роль биосурфакгантов, т.е. соединений, облегчающих растворение и поглощение клетками органических гидрофобных соединений, присутствующих в среде и используемых микроорганизмами в качестве субстратов для своего роста (Cameotra and Makkar, 2004). Антибиотические свойства гликолипидов начали изучаться сравнительно недавно. На сегодняшний день в литературе имеется лишь небольшое число работ, посвященных исследованию внеклеточных целлобиозолипидов дрожжевых грибов, их структуре и биологической активности (Haskins and Thorn, 1951; Spocckner et al., 1999), причем только в некоторых из них приводятся данные об их фунгицидных свойствах (Puchkov et al., 2002; Mimee et al., 2005). Исследование этих соединений позволяет

1

расширить наши представления о способах антагонистического взаимодействия между дрожжеподобными грибами в сообществах, а также вести разработку новых фунгицидов.

В связи с этим представляется актуальным определить природу антифунгальных соединений ряда видов и штаммов дрожжевых грибов, характеризующихся секрецией таких соединений, которые в соответствии со своими свойствами (низкая молекулярная масса, термостабильность, широкий спектр действия), по-видимому, не относятся к микоцинам.

Цели и задачи работы. Целью данной работы была очистка и установление структуры соединений, обуславливающих антифунгальную активность дрожжевых грибов, относящихся к родам РаеисЬжута^ ЭутросИотусорзгз и Сгур(ососсш, а также изучение механизма действия этих соединений на клетки дрожжевых грибов. Были поставлены следующие задачи:

1. Очистить низкомолекулярные антифунгальныс соединения, продуцируемые тремя видами головневых дрожжей родов Ряеш/огута и Зутро&отусорзЬ и тремелловыми дрожжами Сгур1ососси$ Иит(со1а.

2. Изучить физико-химические свойства и определить структуру антифунгальных соединений, продуцируемые 16-ю штаммами указанных дрожжевых грибов.

3. Исследовать механизм действия данных соединений на клетки дрожжей.

Научная новизна работы. В данной работе у двух видов дрожжевых

грибов рода Рзеийогута н 5утр<кИотусор$1з рарМорес1Ш впервые обнаружены

внеклеточные целлобиоюлипиды, обладающие фунгицидным действием.

Разработан эффективный способ очистки целлобиозолипндов из

культу рал ьной жидкости штаммов-продуцентов.

Установлено, что ЗутросИотусорзг.$ рарЫорес1Ш секретирует

целлобиозолипид А, представляющий собой р-1>-глюкопиранозил-(1—»4)-р-1>-

глюкогтиранозил-( 1 —»■ 16)-2,15,1 б-тригидроксигексадекановую кислоту.

2

Представители рода РзеисЬгута секретируют целобиозолипид В» представляющий собой (2-0-3-п1Дрокснгексаноил-р-0-глюкопиранозил-( 1 —>4)-(6-О-ацетил-р-0-глгокопиранозил-( 1—>16)- 2,15,16-тригидроксигексадекановую кислоту. Эти целлобиозолипиды отличаются от известных ранее антифунгальных целлобиозолипидов Сгур1ососсш Ьитгсо1а наличием дополнительной гндроксильной группы в остатке пальмитиновой кислоты, отсутствием или уменьшенным количеством ацетатных групп и наличием остатка 3-гидроксикапроновой кислоты в качестве О-заместнтеля (для рода РзеиЛогута) в остатке целлобиозы.

Показано, что исследованные целлобиозолипиды обладают фунгицидным действием при кислых значениях рН среды и активны против широкого спектра дрожжевых и мицелиальных грибов, включая виды, патогенные для растений, животных и человека,

С помощью нескольких методов, таких как измерение выхода АТФ, фосфата и а-глюкозндазы из клеток и сферопластов, окрашивание клеток бромкрезоловым пурпурным, показано, что основой механизма фунгицидного действия этих соединений являются их мембраноповреждающие свойства.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные изменяют представление о функциях внеклеточных гликолипидов и открывают возможности их нового практического применения. Сведения о действии изученных гликолипидов на дрожжи, вызывающие кандидозы и криптококкозы человека и животных, а также на мицелиальные грибы, вызывающие белую гниль плодов и корнеплодов н серую пятнистость подсолнечника, представляет интерес для разработки на их основе фунгицидов нового поколения. Изучаемые соединения могут быть использованы в качестве специфических мембраноповреждающих агентов в исследовательских целях.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на

105 страницах, содержит 13 таблиц и 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 150 источников литературы.

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на 8ой и 9°" Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука 21°™ века» (Пущино, 2004,2005).

Благодарности. Автор приносит искреннюю благодарность и признательность научным руководителям члену-корреспонденту РАН Игорю Степановичу Кулаеву и доктору биологических наук Владиславу Ивановичу Голубеву за постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение результатов. Автор благодарит доктора химических наук A.C. Шашкова (ИОХ им. Зелинского РАН) за проведение ЯМР-спектроскопического и масс-спектрометрического анализов, и В. Я. Лысанскую (ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) за проведение углеводного анализа, а также сотрудников лаборатории регуляции биохимических процессов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН за содействие при выполнении работы и активное обсуждение результатов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для получения антифунгальных соединений использовали дрожжевые грибы Sympodiomycopsis paphiopedili В KM Y-2817, Cryptococcus humicola В KM Y-2238, Y-1613, 9-6, X-397 и X-297, а также Pseudozyma fusiformata BKM Y-2821, Y-2898, Y-2909, Ll-16, LÎ-41, LI-71, ПТЭ-351 и ПТЗ-356 и Pseudozyma sp. BKM Y-2938 и Ll-46,

В качестве тестовых культур для определения антифунгальной активности использовали дрожжи Cryptococcus terreus BKM Y-2253, Saccharomyces cerevisiae BKM Y-1173, Candida albicans JCM 1542 (Японская коллекция микроорганизмов), Filobasidiella neoformans IGC 3957, Clavîspora Insitaniae IGC 2705 (Коллекция института Гульбекяна, Португалия), Candida gîabrata CBS 138 и Candida viswanathii CBS 4024 (Центральная коллекция чистых культур грибов, Нидерланды), мицелиальные грибы Phomopsis helianthi, Sclerotinia sclerotiorum, Mortierélla isabeîlina BKM F-526 и Mucor mucedo BKM F-l 3550.

4

Продуценты антифунгальных соединений культивировали в состоянии покоя при температуре 20-24'С в течение 2-4 недель в жидкой среде, содержащую (г/л): глюкозу — 10, (NH^SOi - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, MgS04 х 7 Н20 - 0,05, Na2HP04 * 12 Н20 - 10,9, рН доводили до 4,0 добавлением лимонной кислоты. Выращивание тест-культур проводили на качалке при температуре 24°С в течение 2 суток в среде, содержащей (г/л): глюкозу — 10, пептон — 5, дрожжевой экстракт — 4, S. cerevisiae выращивали о среде Рядер (Reader, 1927), содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт и минеральные соли в течение 1 суток на качалке при температуре 29°С.

Для получения антифунгальных соединений культуральную жидкость отделяли от биомассы центрифугированием и фильтрованием через стеклобумагу GF/A (Whatman, Великобритания), лиофильно высушивали, затем экстрагировали метанолом и фильтровали. Полученные препараты упаривали на роторном испарителе при ~50°С и суспендировали в холодной деионизованноб воде, после чего выдерживали при 5°С для образования осадка. Выпавший осадок отделяли фильтрованием на стеклянном фильтре, дважды промывали деионизованной водой при 5°С и растворяли в метаноле. Для дополнительной очистки препараты подвергали хроматографии на колонке с LH-сефадексом (Pharmacia, Швеция) и тонкослойной хроматографии на стеклянных пластинках Kieselgel 60 (Merck, Германия) в системе хлороформ : метанол: вода (4:4:0.2).

Масс-спектрометр пческий анализ (ESI-MS) проведен в Институте органической химии им. Зелинского РАН и Институте белка РАН на масс-спектрометре LCO DECAXP (Thermo Finnigan, США).

ЯМР-спектроскопический анализ с использованием одномерных (1Н ЯМР, 13С ЯМР) и двумерных ('н'Ы COSY, TOCSY, ROESY, lH13C HSQC и 'Н,3С НМВС) экспериментов проведен д.х.н. А. С. Шашковым в Институте органической химии им. Зелинского РАН на приборе Bruker DRX-500 (Германия).

Для определения антифунгальной активности пробы получаемых препаратов наносили на стерильные диски GF/A диаметром 5 мм, помещали

5

их на поверхность агаризованной глюкозо-пептонной среды (pH 4,0), инокулированной тест-культурами и инкубировали в течение 2-3 суток при 20-24°С. Активность оценивали до диаметру зон подавления роста.

Для определения выживаемости клеток их обрабатывали различными концентрациями гликолипидов в 0,04 М цитрат-фосфатном буфере, pH 4,0 при комнатной температуре в течение 30 минут. В качестве контроля (100% выживаемость) использовали суспензию клеток, обработанную в тех же условиях соответствующим количеством метанола. Суспензии обработанных клеток высевали на агаркзованную глюкозо-пептонную среду, культивировали при 24-30°С и подсчитывали количество колоний.

Выход АТФ определяли лциферин-люцнферазным методом (Wulff and Doppen, 1985) на люминометре 1250 (LKB, Швеция).

Окрашивание клеток Cr. terreus бромкрезоловым пурпурным (5' 5 дибромо-о-крезолсульфонафталин, Sigma, США) проводили в соответствии с методом, описанным в (ICurzweilova and Sigler 1993).

Зачисление инкубационной среды клетками S. cerevisiae определяли с помошью pH-метра в дистиллированной воде при 30°С после добавления 100 мМ глюкозы. Содержание ортофосфата и полифосфатов в сферопластах S. cerevisiae определяли, как описано в (Вагабов и др., 2000). Активность а-глюкозидазы определяли с использованием в качестве субстрата а-нитрофенилглюкозида.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение гликолипидов из культуральной жидкости дрожжевых

грибов

Получение и очистка антифунгальных соединений была проведена из

культуральной жидкости дрожжевых грибов Cr. humicola (5 штаммов), Symp.

paphiopedili (1 штамм), Ps. fusiformata (8 штаммов) и Pseudazyma sp. (2

штамма). В предварительных опытах было показано, что для использованных

6

штаммов и условий культивирования в экстрактах из биомассы содержится не более 5% антифунгальных компонентов по сравнению с культуральной жидкостью (при оценке по суммарной активности).

С использованием указанной выше методики были получены хроматографически чистые препараты антифунгальных соединений для всех исследованных продуцентов. В системе хлороформ: метанол: вода (4:4:0,2) очищенные антифугальные соединения представителей рода Р$еш1о2ута имели 0,75, а вещество, полученное из культуральной жидкости Эутр. рарШореЫШ, - IV 0,78. Препараты О. Ьит1со1а штаммов 9-6, ВКМ У-1613 и У-2238 содержали соединение с Кг 0,82, штамма Х-397 - два соединения с 0,82 и 0,50, а штамма Х-297 - соединение с Кг 0,50.

2. Физико-химические свойства и структура антифунгальных соединений.

Полученные препараты хорошо растворялись в 0,04 М цитрат-фосфатном буфере, но не растворялись в дистилированной воде при 0-20° С. Это свойство использовали в процессе очистки для отделения осадка антифунгальных веществ от растворимых в метаноле солей, Сахаров и других компонентов, присутствующих в культуральной жидкости. Эти соединения не растворялись в хлороформе, но растворялись в пиридине и метаноле до концентрации 20-50 мг/мл.

Антифуигальные соединения Сг. Ьит1со1а и Ря. /их[рэппа(а сохраняли активность при хранении в метаноле при 0-4° по крайней мере в течение 1,5 лет, тогда как препарат из культуральной жидкости Зутр. рарЫорейШ утрачивал эту активность через два месяца после хранения в таких же условиях.

При углеводном анализе всех полученных препаратов без гидролиза сахара не были обнаружены, после кислотного гидролиза в течение 30 мин обнаруживали глюкозу и целлобиозу, а после гидролиза в течение б ч - только глюкозу. По совокупности физико-химических свойств, в том числе и по поведению в ходе очистки все изучаемые соединения оказались похожи на целлобиозолипнд Сгур(ососсш Иит1Со1а 9-6 (РисЬкоу ег а1., 2002).

7

Таблица 1. Молекулярные массы антнфувгальиых глнколнпндов по данным масс-спектрометрин очищенных препаратов

Исследуемые штаммы

Молекулярная масса, Да

СгурШоссиБ кштсо1а 9-6, В КМ У-1613, У-2238 СгурПкоссш Иипйсо1а X - 397 Сгур(ососси5 Ъит1со1а X - 297

РзеиЛотута^¡/огта(а ВКМ У-2821, У-2898, Ы-41» ГГТЗ-356 Р$еш1о:ута£т/огта(а ВКМ У-2909, 1Л-16, Ы-71, ПТЗ-351 РхеиЛогута эр. ВКМ У-2938,1Л-46 ЯутрЫготусорз^з рарЫорейШ ВКМ У-2817

781 781 и 739

739 784 н 671

784 784 628

Молекулярные массы очищенных антифунгальных соединений, определенные с помощью масс-спектрометрии, представлены в таблице I. Четыре штамма Сг. кит1со1а продуцировали антифунгальное соединение с молекулярной массой 781 Да, два штамма этого же вида продуцировали кроме него еще одно соединение, с молекулярной массой на 42 Да меньше, либо только последнее. Гликолипиды с такими молекулярными массами были обнаружены в комплексе гликолипидов, секретируемых штаммом 9-6, и их структура установлена (РисЬкоу ^ а!., 2002). Целлобиозиолипид, содержащий 4 ацетатные группы в остатке целлобиозы представляет собой (2,3,4-0-триацетил-Р-1>глюкопиранозил-(1—>4)-(6-0-ацетил-р-В-глюкопиранозил-(1 —> 16)-2,1 б-дигидроксигексадекановую кислоту (рис. 1 а). Гликолипид, имеющий молекулярную массу на 42 Да меньше, лишен одной из ацетатных групп.

Все штаммы рода РзеЫогута синтезировали соединение с молекулярной массой 784 Да. Хотя на масс-спектрах некоторых препаратов присутствовало соединение с молекулярной массой 671 Да, оно может быть продуктом деградации основного соединения в процессе масс-спектрометр им еского анализа. Соединение, полученное из культуральной жидкости Эутр, рарЫоресИИ имело молекулярную массу 628 Да.

Данные ЯМР-спектроскопии с учетом данных масс-спектрометрии и углеводного анализа позволили установить структуру гликолипидов, продуцируемых дрожжевыми грибами рода Pseudozyma и Symp. paphiopedüi. Представители рода Pseudozyma секретируют (2-0-3-гадроксигексаноил-|3-1>-глюкопиранозил-( 1 —+4)-{6-0-ацетил-р-0-глюкопира1юзил-( 1—>16)-2,15,16-тригидроксигексадекановую кислоту (рис. 16). Symp. paphiopedüi секретирует р-1>глюкопиранозил-( I —*4)-р-1>глюкопиранозил-( 1 —► 16)-2,15,16-тригидроксигексадекановую кислоту (рис. 1в). Эти целлобиозолипиды ранее были известны под названием устилаговых кислот, которые продуцируются фмлогенетически близкими к Pseudozyma грибами Ustilago mayáis (Tíaskins and Thorn, 1951), однако об их антифунгальной активности не сообщалось. Далее будут использованы принятые в литературе (Kitamoto et al., 2002) названия этих соединений: целлобиозолипид А (рис. 1 в) и целлобиозолипид В (рис 1 б).

Рис. 1. Структура внеклеточных целлобнозолнпндов Cryptococcus humicola

(Puchkov et al., 2002) (a), Pseudozyma spp. (целлобиозолипид В) (б) и Sympodiomycopsis paphiopedili (целлобиозолипид А) (в). R - H или ацетатные

группы

R

*СООН а

Н

2соон 6

н

* соон в

Все исследованные в данной работе гликолипиды содержат остаток целлобиозы, к которому в качестве агликона присоединена гидроксилированная пальмитиновая кислоту с различным количеством гидроксильных групп. Они различаются по наличию и структуре О-заместителей. Целлобиозолипиды оказались сходны по структуре не только для различных штаммов, но и для продуцентов, имеющих тремелловый (Cryptococcus humicolä) и головневый (остальные использованные в работе продуценты) аффинитет.

3. Антифунгальная активность целлобиозолипидов.

Было изучено влияние различных концентраций очищенных гликолипидов на выживаемость аскомицентых дрожжей S. cerevisiae, CI lusitaniae, С albicans, С glabrata, и С. viswanathi и базидиомицентых дрожжей F. neoformans и Cr. ter reus. После 30 мин инкубации с 0,04 и 0,12-0,16 мг/мл целлобиозолипидГ А, соответственно, рост клеток Cr. terreus и С. albicans при высеве на агаризованную среду не наблюдали. Результаты таких же опытов для целлобиозолипнда В и целлобиозолипида Cr. humicola представлены в таблицах 2 и 3. Среди медицински важных видов к исследуемым целлобиозолиггидам наиболее чувствительным оказался возбудитель криптококкоза F. neoformans, относящийся к базидиомицетам, клетки которого погибали после 30 мин инкубации с 0,02 мг/мл гликолипидов. Для аскомицетных дрожжей, в том числе возбудителей кандидозов С/, lusitaniae; С. albicans, С. glabrata, и С. viswanathi, такой же эффект достигался при концентрации гликолипидов в 5-8 раз выше. Таким образом, в настоящей работе обнаружено новое свойство целлобиозолипидов * их фунгицидная активность.

Способность изучаемых целлобиозолипидов подавлять рост дрожжей оценивали также по диаметру зон подавления роста на твердой среде (рис. 2, 3, табл. 4).

Таблица 2. Влияние различных концентраций целлобнозолипнда Сг.ИитмсЫа 9-6 на выживаемость клеток дрожжей

Концентрация, мг/мл

Количество выживших клеток, %

Виды

О 0,02 0,04 0,16 0,30

I 5

I I & *

о

100

2 0

§ I

-О

I

-я &

100 5 1

3 1 1 I

5 1 >

100 71 16 1

3 1

I л

<0 ьо

100 100

25 2

3

а I

•о

и ^

100 100

I л

I Л

100 100

10

I

г

I

■I £

8

100 100

- не определяли

Таблица 3. Влияние различных концентраций целлобнозолипнда В на выживаемость клеток дрожжей

Концен-

трация, мг/мл

Количество выживших клеток, %

Виды

а

о

а, с?

С

5 ё

I

"5»

л о

о1 ё

I 1

1 I 31

Л Й

3 2 5

.д

О оо

•8

1

/з

о ^

I I •I 1

О

I 1

1

8

1 Й

8

0 100 100 100 100 100 100 100

0,01 4 27 46 100 100 100 100

0,02 2 16 40 - - - -

0,05 0 4 29 - - - -

0,10 - 0 3 23 21 4 14

0,30 - - - 2 1 1 3

- не определяли

Рис.2. Диаметр зон подавления роста СгурЮсоссия ¿еггею ВКМ У-2253 на чашках с глюкозо-пептонным агаром, рН 4,0 под действием

целлобиозолипида А

30 п

х о

т &

ш s

(О

а

20 -

10

0 0,05 0,1 0,15 0,2 Количество препарата, мг

На рис. 2 показана зависимость диаметра зон подавления роста О. геггеиз от количества целлобиозолипида А, нанесенного на газон, а на рис. 3 -подавление роста трех видов дрожжей на агаризованной среде под действием целлобиозолипида В.

Рис.3. Подавление роста Cryptococcus terreus ВКМ Y-2253 (a), Candida albicans JCM 1542 (б) и Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-l 173 (в) различным количеством (мг) целлобиозолипида В при рН 4,0

Таблица 4. Количество целлобнозолнпнда Сг. кштсоЫ 9-6 и целлобнозолнпнда В, дающее зоны подавления роста тест-культур

диаметром 15-20 мм при рН 4,0

Виды Количество препарата (мг),

Целлобиозолипид Целлобиозолипид В

Cr. humicola 9-6

Cryptococcus terreus 0,05 0,02

Filobasidieila neoformans 0,05 0,02

Clavispora lusitamae 0,3 0,2

Saccharomyces cerevisiae 0,3 ОД

Candida albicans 0,3 0,2

Candida glabrata 0,3 0,2

Candida viswanathii 0,2 0,12

Sclerotinia sclerotiorum 0,5 0,12

Phomopsis helianthi 0,5 0,12

Mucor mucedo 0,5 0,12

Из таблиц 2-4 видно, что в отношении исследованных дрожжей существенной разницы по степени фунгицидной активности между целлобиозолипидом В и целлобиозолипидом Cr. humicola 9-6 по отношению к использованным тест-культурам не наблюдалось.

В отношении фитопатогенных грибов Phomopsis helianthi, вызывающего серую пятнистость листьев подсолнечника и Sclerotinia sclerotiorum, вызывающего белую гниль плодов и корнеплодов, а также плесневых грибов Mortierella isabellina и Mucor mucedo целлобиозолипид В оказался более эффективным по сравнению с гликолипндом Cr. humicola 9-6 (табл. 4). Рост гриба М. isabellina на агаризованной среде не подавлялся целлобиозолипидом Cr. humicola 9-6 даже при нанесении на диск 1 мг этого соединения. Выяснение того, с какими особенностями структуры связано различие в эффективности изучаемых целлобиоюлинидов против грибов, требует дальнейших исследований.

Для определения способности целлобиозолипидов повреждать цитоплазматическую мембрану клеток дрожжей изучили выход из них АТФ при обработке данными соединениями. На рис. 4 показана зависимость выхода АТФ из клеток О. геггеш от времени инкубации под действием целлобиозолипида А. Для целлобиозолипида В и целлобиозолипида О. кит\со1а 9-6 получены похожие данные.

Рис. 4. Зависимость выхода АТФ из клеток Сгур/ососсш /еггеш В КМ У-2253 от времени при воздействии целлобиозолипида А (рН 4,0, 20°С). Концентрации целлобиозолипида А, мг/мл:

По выходу АТФ наблюдается такая же тенденция, как и при подавлении роста на агаризованной и снижении выживаемости: базидиомицетные дрожжи более чувствительны ко всем трем целлобиозолипидам, чем аскомицетные. Наименьшие эффективные концентрации, вызывающие максимальный выход АТФ, схожи с теми, которые приводят к почти полной табели клеток исследованных тест-культур (табл. 5).

• - 0,0X5, ■ - 0,03, ▲ - 0,05, о - 0,06

0 10 20 30 40 50 60.

Время (мин.)

Таблица 5. Наименьшие эффективные концентрации целлобнозолнпндов, вызывающие выход АТФ и гибель клеток дрожжей

Соединение Концентрация, мг/мл

Выживаемость не более 1% Выход АТФ из клеток 100% от

максимального

Cryptococcus Candida Cryptococcus Candida

terreas albtcans terreus albtcans

Целлобиозолипид А 0,04 0,16 0,05 0,12

Целлобиозолипид В 0,05 0,20 0,06 0,10

Целлобиозолипид 0,04 0,16 0,05 0,12

Cr. humicola 9-6

Используя в качестве тест-культуры Cr. terreas, определили зависимость выхода АТФ при воздействии целлобиозолипидов от рН (рис. 5). Оптимальный рН действия этих соединений находится в кислой области, однако для целлобиозолипнда В профиль зависимости от рН более широкий, чем для целлобиозолипида Cr. humicola 9-6 и целлобиозолипнда А Возможно, эта разница объясняется наличием остатка 3-гидроксикапроновой кислоты.

Рис. 5. Зависимость выхода АТФ

из клеток Cryptococcus terreas от

рН при 20° под действием 0,06

мг/мл целлобиозолипида А (а),

целлобиозолипида В (о) и

целлобиозолипида Cryptococcus

1 humicola 9-6 (•). 7

4 5 6

рН ин^^сцюниой CMSCK

Скорость выхода АТФ под воздействием целлобиозолипидов увеличивалась при повышении температуры (рис. 6), что согласуется с представлением о том, что при увеличении жидкостности липидного бислоя он становится более чувствительным к воздействию детергентов.

Рис. 6. Зависимость выхода АТФ из клеток СгурШсосст /еггею ВКМ У-225Э под действием целлобиозолипида В (0,13 мг/мл) от температуры (рН 4,0). А- 0°С, Д - 10°С,» - 20°С,о - 30°С

В о 100 —

3

§ 75 -

1

г

Ё 50 -

е"

25 -

§

3

ш

Опыты по выходу АТФ из клеток дрожжей под воздействием целлобиозолипидов свидетельствуют в пользу того, что фунгицидное действие этих соединений обусловлено способностью вызывать повреждение клеточной мембраны. Для подтверждения этого клетки Сг. Iеггеш окрашивали бромкрезоловым пурпурным, красителем, который не проникает в клетки с неповрежденной мембраной. После обработки различными концентрациями целлобиозолипида В наблюдали увеличение флоресценцни клеток, которое зависело от концентрации целлобиозолипида, так же как уменьшение выживаемости и выход АТФ. Для 5". сеге\ч51ае одним из критериев целостности плазматической мембраны является способность к закислепню среды в присутствии глюкозы. Обработка клеток £ сегеукше целлобиозолнпидом В привела к утрате этой способности. Таким образом, способность целлобиозолипидов к повреждению мембраны клеток дрожжей подтверждена тремя независимыми методами.

Так как изучаемые целлобиозолипиды увеличивают проницаемость цитоплазматической мембраны, были проведены опыты, направленные на

выяснение возможности использования их в качестве специфических агентов, повреждающих мембраны, в частности, для оценки того, в какой степени биосинтез полифосфатов у дрожжей <£ сег^зше зависит от целостности плазматической мембраны. На рис. 7 показано, что при обработке сфсропластов £ сегеуЫае целлобиозолипидом В в условиях синтеза полифосфатов происходил выход АТФ, а-глкжозидазы, фермента, локализованного в цитоплазме, падение уровня ортофосфага и подавление накопления полифосфатов.

Рис. 7. Влияние целлобнозолипида В на сферопласты Засскаготусез сегсхтае В КМ У-1173, находящиеся в условиях синтеза полифосфатов. 1 - содержание ортофосфата в сферопластах; 2 — содержание полифосфатов в сферопластах; 3 — содержание АТФ в сферопластах; 4 — выход АТФ из сферопластов; 5 — выход а-глюкозндазы из сферопластов.

100

3

Г

о

0 0,05 0,1 0,15

Концентрация гликолипида мг/мл

-1

-2 •3

Для клеток наблюдали такие же эффекты, за исключением выхода а-глюкозндазы, видимо, потому, что выходу фермента препятствовала клеточная стенка. Удалось подобрать такую концентрацию целлобнозолипида В, при которой выход а-глюкозндазы из сферопластов не наблюдали, в сферопластах сохранялся существенный уровень ортофосфата, а накопление полифосфатов,

несмотря на полную потерю АТФ, составляло 50% от контрольного. При этой концентрации цсллобиозолшшда целостность цнтоплазматической мембраны нарушена, о чем свидетельствует выход АТФ. Из этого следует, что сохранившийся синтез полифосфатов не зависел от градиентов на цито плаз м атичес кой мембране, а также от содержания АТФ. Можно предположить, что эти полифосфаты образуются непосредственно в процессе гликолиза за счет работы 1,3-дифосфоглицератполифосфаткиназы. Таким образом, целлобиозолипиды могут быть использованы для изучения влияния нарушения проницаемости плазматической мембраны на биологические процессы.

Проведенная работа показала, что дрожжевые грибы, характеризующиеся антифунгальной активностью по отношению к грибам различной филогенетической принадлежности, секретируют целлобиозолипиды. Sympodiomycopsis paphipediliпредставители рода Pseudozyma (настоящая работа), а также Ustílago mayáis (Haskins and Thorn, 1951) и Pseudozyma Jlocculosa (Mimee et al., 2005), относящиеся к головневым грибам, секретировали целлобиозолипиды, отличающиеся от целлобиозолипвдов Сг. humicola (Puchkov et al., 2002) отсутствием или уменьшенным количеством ацетатных групп в остатке целлобиозы, наличием остатка 3-гидроксикапроновой кислоты в качестве О-заместителя (для рода Pseudozyma) и дополнительной гидроксильной группы в положении 15 остатка пальмитиновой кислоты. Вопрос о влиянии этих различий на фунгицидную активность по отношению к различным тест-культурам требует дальнейших исследований.

выводы

1. Из кулътуральной жидкости базидиомицетных дрожжей родов Р&еис1огутау ЗутросНотуеорзк и Сгур1ососсш получены хроматографически чистые низкомолекулярные антифунгальные соединения.

2. Установлено, что эти соединения представляют собой целлобиозолипиды, различающиеся по количеству гндроксильных групп в остатке гидроксилиро ванной пальмитиновой кислоты, присоединенной к аномерному атому кислорода в остатке целлобиозы, а также наличию и структуре О - заместителей.

3. Показано, что целлобиозолипиды обладают фунгицидным действием при кислых значениях рН среды н активны против широкого спектра дрожжевых и мицелиальных грибов, включая виды, патогенные для растений, животных н человека.

4. Получены доказательства в пользу того, что фунгицидная активность целлобиозолипндов обусловлена их способностью увеличивать неспецифическую проницаемость цитоплазматической мембраны, следствием чего является выход из клеток дрожжей АТФ и фосфата, окрашивание клеток непроникающим красителем бромкрезоловым пурпурным, снижение их способности к закислению среды и накоплению полифосфатов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Kulakovskaya T.V., Kulakovskaya E.V. and Golubev W.I. ATP leakage from yeast cells treated by extracellular glycolipids of Pseudozyma fiisiformata. FEMS Yeast Res. 2003, v. 3, p. 401-404.

2. Kulakovskaya T.V., Shashkov A.S., Kulakovskaya E.V., Golubev W.I. Characterization of antifungal glycolipid secreted by the yeast Sympodiomycopsispaphiopedilu FEMS Yeast Research, 2004, v. 5, p. 247252.

3. В.И. Голубев, T.B. Кулаковская, E.B. Кулаковская, H.B. Голубев. Фунгицидная активность внеклеточного гликолилида Sympodiomycopsis paphiopedili Sugtama et al. Микробиология, 2004, т.75, № 6, с. 841-845.

4. Kulakovskaya T.V., Shashkov A.S., Kulakovskaya E,V., and Golubev W.I. Ustilagig acid sccretion by Pseudozyma fiisiformata strains FEMS Yeast Res., 2005, v. 5, p. 919-923,

5. E.B. Кулаковская, В.И. Голубев, И.С. Кулаев. Внеклеточные антифунгальные гликолипиды дрожжей Cryptococcus humicola. Доклады Академии Наук, 2006, т. 410, № 3, с. 422-424.

6. Е.В. Кулаковская Очистка и характеристика антифунгальных гликолипидов, секретируемых головневыми дрожжами. Биология-наука XXI века. 8-я Международная Пущинская конференция молодых ученых Сборник тезисов, Пущино, 2004 г., с. 153.

7. Е.В. Кулаковская Действие целлобиозолипидов, секретируемых Pseudozyma fiisiformata на накопление полифосфатов у Saccharomyces cerevisiae. Биология- наука XXI века. 9-я Международная Пущинская конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 2005 г., с. 198.

Принято к исполнению 26/10/2006 Исполнено 26/10/2006

Заказ Ks 811 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва. Варшавское ш„ 36 (495) 975-78-56 www. au toreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулаковская, Екатерина Владимировна

Введение

Глава 1. Обзор литературы. Внеклеточные гликолипиды дрожжевых грибов

1.1. Распространение и структура внеклеточных гликолипидов

1.2.Условия образования внеклеточных гликолипидов, пути биосинтеза и их 16 генетическая детерминация

1.3. Методы очистки внеклеточных гликолипидов

1.4. Биологическая активность и перспективы практического использования 22 внеклеточных гликолипидов дрожжевых грибов

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2.Состав среды и условия культивирования

2.3. Очистка гликолипидов

2.4.Тонкослойная хроматография

2.5.Метанолиз гликолипидов

2.6.Углеводный анализ

2.7.Масс-спектрометрический анализ

2.8.ЯМР-спектроскопия 35 2.9.Определение антифунгальной активности по подавлению роста тест-культур 35 на агаризрованной среде

2.10. Определение выживаемости клеток дрожжей после обработки 3 6 гликолипидами

2.11 .Определение выхода АТФ из клеток дрожжей

2.12. Окрашивание бромкрезоловым пурпурным

2.13 .Измерение закисления среды клетками Saccharomyces cerevisiae

2.14.Получение сферопластов из клеток Saccharomyces cerevisiae

2.15.Определение влияния целлобиозолипида В на накопление ортофосфата и 39 полифосфатов у Sctccharomyces cerevisiae.

2.16.Определение ортофосфата

2.17. Определение содержания полифосфатов

2.18.Определение активности а-глюкозидазы

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 .Получение антифунгальных гликолипидов из культуральной жидкости 42 дрожжевых грибов

3.2.Физико-химические свойства и структура целлобиозолипидов 46 3.2.1 .Растворимость в воде и органических растворителях

3.2.2.Стабильность при хранении

3.2.3.Структура целлобиозолипидов

3.3. Антифунгальная активность целлобиозолипидов. 5 9 З.ЗЛ.Влияние целлобиозолипидов на рост и выживаемость дрожжей и грибов 59 3.3.2.Мембраноповреждающее действие целлобиозолипидов 69 3.3.2.1 .Выход АТФ из клеток дрожжей при обработке целлобиозолипидами

3.3.2.2.Дополнительные методы оценки мембраноповреждающего действия 75 целлобиозолипидов

3.3.2.3.Действие целлобиозолипида В на сферопласты и синтез полифосфатов у 77 Saccharomyces cerevisiae

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антифунгальные целлобиозолипиды дрожжевых грибов"

Актуальность проблемы. Поиск и характеристика новых антибиотических соединений, актуальны для понимания механизмов антагонистических взаимоотношений между микроорганизмами и борьбы с возбудителями различных заболеваний. У дрожжей антагонистические взаимоотношения преимущественно обеспечиваются секрецией в окружающую среду так называемых киллер-токсинов (микоцинов), специфических белков (или гликопротеинов), обладающих активностью против определенных таксонов (Makover and Bevan, 1963; Thornton, 1986; Heard and Fleet, 1987; Sawant et al., 1989; Stark et al., 1990; Голубев, 1991; McCracken et al., 1994, Wickner, 1996; Klassen and Meinhardt, 2003; Golubev, 1998, 2006). Однако, далеко не всегда антибиотическая активность, проявляемая грибами, включая дрожжевые грибы, обеспечивается синтезом микоцинов. Грибы, также как и бактерии, способны изменять окружающую среду продуктами своего метаболизма, сохраняющими их доминирующую позицию за счет создания условий неблагоприятных для выживания других микроорганизмов. Например, антибактериальная активность дрожжей обычно вызывается изменениями рН в результате образования органических кислот (Лозинов и др., 1974) или этанола. Примером неспецифической антифунгальной активности также является секреция пульхерриминовой кислоты дрожжами Metschnikowia piilcherrima (Nguyen and Panon, 1998). Это соединение подавляет рост дрожжей благодаря тому, что связывает в комплекс необходимые для них ионы железа. Многие грибы продуцируют низкомолекулярные антифунгальные соединения, относящиеся к алкалоидам и поликетидам, например патулин, фумагиллин и цитринин (Cole and Сох, 1981).

Сравнительно недавно обнаружены штаммы дрожжей, продуцирующие антифунгальные соединения с широким спектром действия, включающим дрожжи далеких друг от друга филогенетических групп, относящихся как к аскомицетам, так и к базидиомицетам (Golubev and Schabalin, 1994; Голубев и др., 2003). Данные соединения имеют низкую молекулярную массу (не свыше 1000 Да), термостабильны и устойчивы к действию протеиназ. К началу настоящей работы природа и структура таких антифунгальных соединений, оказавшихся целлобиозолипидами, была установлена только для штамма 9-6 дрожжей Cryptococcus humicola (Puchkov et al., 2002). Антифунгальная активность обнаружена и у другого целлобиозолипида, секретируемого Pseadozyma flocculosa (Mimee et al., 2005).

На сегодняшний день в литературе имеется лишь небольшое число работ, посвященных исследованию внеклеточных целлобиозолиподов дрожжевых грибов, их структуре и биологической активности (Haskins and Thorn 1951; Lemieux 1951, Lemieux et al. 1951; Bhattacharjee et al. 1970; Spoeckner et al. 1999; Puchkov et al., 2002; Голубев и др., 2003; Mimee et al., 2005), причем только в последних из них приводятся данные об антифунгальной активности этих соединений. В то же время, исследование этих соединений позволяет расширить наши представления о механизмах антагонистического взаимодействия дрожжеподобных грибов в сообществах, а с другой стороны, широкий спектр антифунгальной активности указанных гликолипидов, их стабильность, в том числе термостабильность, позволяют рассматривать данные соединения в качестве перспективных антифунгальных агентов. В связи с этим представляется актуальным определить природу антифунгальных соединений у неизученных в этом отношении видов и штаммов дрожжевых грибов, поддерживаемых в ВКМ и характеризующихся секрецией антифунгальных соединений, которые по своим свойствам (низкая молекулярная масса, термостабильность, широкий спектр действия) по всей видимости не относятся к микоцинам.

Цели и задачи работы. Целью данной работы была очистка и установление структуры соединений, обуславливающих антифунгальную активность дрожжевых грибов, относящихся к родам Pseadozyma, Sympodiomycopsis, и Cryptococcus, а также изучение механизма действия этих соединений на клетки дрожжевых грибов.

Были поставлены следующие задачи:

1. Очистить низкомолекулярные антифунгальные соединения, продуцируемые тремя видами головневых дрожжей родов Pseiidozymci и Sympodiomycopsis и тремелловыми дрожжами Ciyptococcus humicola.

2. Изучить физико-химические свойства и определить структуру антифунгальных соединений, продуцируемые 16-ю штаммами указанных дрожжевых грибов.

3. Исследовать механизм действия данных соединений на клетки дрожжей.

Научная новизна работы. В данной работе у двух видов дрожжевых грибов рода Pseudozyma и Sympodiomycopsis paphiopedili впервые обнаружены внеклеточные целлобиозолипиды, обладающие фунгицидным действием. Разработан эффективный способ очистки целлобиозолипидов из культуральной жидкости штаммов-продуцентов. Установлено, что Sympodiomycopsis paphiopedili секретирует целлобиозолипид А, представляющий собой Р-0-глюкопиранозил-( 1 —>4)-Р-0-глюкопиранозил-( 1 —> 16)-2,15,16-тригидроксигексадекановую кислоту. Представители рода Pseudozyma секретируют целобиозолипид В, представляющий собой (2-0-3-гидроксигексаноил-P-D-глюкопиранозил-(1^4)-(6-0-ацетил-Р-В-глюкопиранознл-(1—>16)- 2,15,16-тригидроксигексадекановую кислоту. Эти целлобиозолипиды отличаются от известных ранее антифунгальных целлобиозолипидов Ciyptococcus humicola отсутствием или уменьшенным количеством ацетатных групп в остатке целлобиозы, наличием остатка 3-гидроксикапроновой кислоты в качестве О-заместителя (для рода Pseudozyma) и дополнительной гидроксильной группы в остатке пальмитиновой кислоты.

Показано исследованные целлобиозолипиды обладают фунгицидным действием при кислых значениях рН среды и активны против широкого спектра дрожжевых и мицелиальных грибов, включая виды, патогенные для растений, животных и человека.

С помощью нескольких методов, таких как измерение выхода АТФ, фосфата и а-глюкозидазы из клеток и сферопластов, окрашивание клеток бромкрезоловым пурпурным, показано, что основой механизма фунгицидного действия этих соединений являются их мембраноповреждающие свойства.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные изменяют представления о функциях внеклеточных гликолипидов дрожжевых грибов и открывают возможности их нового практического применения. Сведения о действии изученных гликолипидов на дрожжевые и мицелиальные грибы, вызывающих заболевания человека, животных и растений, представляет интерес для разработки на их основе фунгицидов нового поколения. Изучаемые соединения могут быть использованы в качестве мембраноповреждающих агентов в исследовательских целях.

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на 8ой и 9ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21ого века» (Пущино, 2004, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

Благодарности. Автор приносит искреннюю благодарность и признательность научным руководителям члену-корреспонденту РАН Игорю Степановичу Кулаеву и доктору биологических наук Владиславу Ивановичу Голубеву за постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение результатов. Автор благодарит доктора химических наук А.С. Шашкова (ИОХ им. Зелинского РАН) за проведение ЯМР-спектроскопического и масс-спектрометрического анализов, В. Я. Лысанскую (ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН) за проведение углеводного анализа, а также сотрудников лаборатории регуляции биохимических процессов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН за содействие при выполнении работы и активное обсуждение результатов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kulakovskaya, T.V., Kulakovskaya, E.V. and Golubev, W.I. ATP leakage from yeast cells treated by extracellular glycolipids of Pseiidozymci fusiformata. FEMS Yeast Res. 2003, v. 3, p. 401-404.

2. Kulakovskaya T.V., Shashkov A.S., Kulakovskaya E.V., Golubev W.I. Characterization of antifungal glycolipid secreted by the yeast Sympodiomycopsis paphiopedili. FEMS Yeast Research, 2004, v. 5, p. 247-252.

3. В.И. Голубев, Т.В.Кулаковская, Е.В.Кулаковская, Н.В.Голубев. Фунгицидная активность внеклеточного гликолипида Sympodiomycopsis paphiopedili Sugiama et al. Микробиология, 2004, т.75, № 6, с. 841-845.

4. Kulakovskaya T.V., Shashkov A.S., KulakovskayaE.V., and GolubevW-I. Ustilagig acid secretion by Pseadozymafusiformata strains FEMS Yeast Res., 2005, v. 5, p. 919-923.

5. E. В. Кулаковская, В. И. Голубев, И. С. Кулаев. Внеклеточные антифунгальные гликолипиды дрожжей Cryptococcus humicola. Доклады Академии Наук, 2006, т. 410, №3, с. 422-424.

6. Е.В. Кулаковская Очистка и характеристика антифунгальных гликолипидов, секретируемых головневыми дрожжами. Биология-наука XXI века. 8-я Международная Пущинская конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 2004 г, с. 153.

7. Е.В.Кулаковская Действие целлобиозолипидов, секретируемых Psendozyma fusiformata на накопление полифосфатов у Saccharomyces cerevisiae. Биология-наука XXI века. 9-я Международная Пущинская конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 2005 г., с. 198.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кулаковская, Екатерина Владимировна

выводы

1. Из культуральной жидкости базидиомицетных дрожжей родов Pseudozyma, Sympodiomycopsis и Ciyptococcus получены хроматографически чистые низкомолекулярные антифунгальные соединения.

2. Установлено, что эти соединения представляют собой целлобиозолипиды, различающиеся по количеству гидроксильных групп в остатке гидроксилированной пальмитиновой кислоты, присоединенной к аномерному атому кислорода в остатке целлобиозы, а также наличию и структуре О - заместителей.

3. Показано, что целлобиозолипиды обладают фунгицидным действием при кислых значениях рН среды и активны против широкого спектра дрожжевых и мицелиальных грибов, включая виды, патогенные для растений, животных и человека.

4. Получены доказательства в пользу того, что фунгицидная активность целлобиозолипидов обусловлена их способностью увеличивать неспецифическую проницаемость цитоплазматической мембраны, следствием чего является выход из клеток дрожжей АТФ и фосфата, окрашивание клеток непроникающим красителем бромкрезоловым пурпурным, снижение их способности к закислению среды и накоплению полифосфатов.

Заключение

Разработанная в работе методика очистки антифунгальных гликолипидов из культуральной жидкости дрожжей является простой и позволяет оценить, обусловлена ли антифунгальная активность тех или иных штаммов секрецией этих соединений. Она не требует применения сложных и дорогостоящих хроматографических методов, дает возможность получить препараты гликолипидов с приемлемой для дальнейших исследований степенью очистки.

Проведенная работа показала, что все имеющиеся в ВКМ представители дрожжевых грибов, характеризующиеся антифунгальной активностью с широким спектром действия, секретируют сходные по структуре целлобиозолипиды. При этом относящиеся к головневым грибам Sympodiomycopsis paphipedili и различные виды и штаммы рода Pseudozyma (настоящая работа), а также известные из литературны продуценты Ustilago maydis (Haskins and Thorn, 1951) и Pseudozyma flocculosa (Mimee et al., 2005) секретировали целлобиозолипиды А и Б, а штаммы Cr. humicola, относящиеся к тремелловым грибам, секретировали целлобиозолипид, отличающийся от вышеуказанных по отсутствию ОН-группы в положении 15 жирной кислоты и имеющий в качестве 0-заместителей только ацетатные группы (Puchkov et al., 2002; настоящая работа). Вопрос о влиянии этих различий на фунгицидную активность по отношению к различным грибам требует дальнейших исследований.

По эффективным концентрациям в отношении одних и тех же видов дрожжей антифунгальные гликолипиды, продуцируемые всеми исследованными штаммами, были весьма близкими. В то же время по отношению к исследованным мицелиальньш грибам целлобиозолипид В был более эффективным, чем целлобиозолипид О. humicola.

Что касается MEL и софоролипидов, то имеются указания на достаточно низкую по сравнению с целлобиозолипидами антифунгальную активность, однако эти данные получены при нейтральном рН (Kitamoto et al., 2002), поэтому вопрос об антифунгальном действии этих соединений остается нерешенным. Следует учесть, что у MEL жирные кислоты имеют короткие цепи, что может сказываться на взаимодействии с мембраной, а софоролипиды в кислой среде подвергаются лактонизации (см. обзор литературы), что делает менее возможным их эффективное встраивание в липидный бислой (Nunez et al., 2004).

Сравнение эффективных концентраций для целлобиозолипидов по отношению к дрожжевым и грибным культурам, приводимых различными авторами (Puchkov et al., 2001; Kitamoto et al., 2002; Cheng et al., 2003, Mimee et al., 2005), представляет собой сложную задачу, так как применяются различные методы их определения, а тест-культуры относятся к разным видам и штаммам.

Интересно отметить, что при использовании одного и того же метода (нанесение аликвот целлобиозолипида на агаризованную среду, инокулированную тест-культурой), наблюдается совпадение по чувствительности Candida albicans к целлобиозолипиду В по данным настоящей работы и работы (Cheng et al., 2003): для появления зоны подавления роста достаточно около ~0,1 мг этого соединения.

Следует учитывать, что по отношению к таким хорошо изученным фунгицидам, как нистатин и флуконазолы различные штаммы патогенных видов, в том числе Candida albicans и Filobasidiella neoformans, отличаются по чувствительности в десятки раз (от 0,019 до 10 мг/л) (Carrillo-Monoz et al., 1999). Учитывая, что при широком применении данных препаратов возрастает количество устойчивых штаммов, целлобиозолипиды в силу их небольшой токсичности и возможностью сочетания с амфотерицином В (что позволяет снизить действующую концентрацию обоих соединений) могут представлять интерес для разработки новых фунгицидов (Mimee et al., 2005).

Рассматривая механизм фунгицидного действия целлобиозолипидов, следует учесть, что жирные кислоты, остатки которых являются основным гидрофобным компонентом этих соединений, хорошо известны как разобщители, разрушающие ионные градиенты на биологических мембранах Разобщающий эффект свободных жирных кислот на мембранные градиенты известен давно (Скулачев, 1985), однако в этом отношении появляются и новые данные. Так, недавно была продемонстрирована способность пальмитиновой кислоты индуцировать открытие митохондриальной поры и набухание митохондрий в присутствии свободного Са2+ (Белослудцев и др., 2005).

В литературе имеются данные о фунгицидном действии жирных кислот. Так, показано, что цис-9-гептаноевая кислота подавляет рост различных фитопатогенных грибов (Avis and Belanger, 2001, 2002). Авторы объясняют ее мембраноповреждающий эффект способностью встраиваться в бислой и нарушением его структуры благодаря изогнутой форме углеводородной цепи (Avis and Belanger, 2001, 2002). б-нондеканойевая кислота подавляла рост Filobasidiella neoformans при концентрации около 0,004 мМ, но была неэффективна против Candida albicans (Carballeira et al., 2005). Но антифунгальной активностью обладают не только ненасыщенные, но и некоторые насыщенные жирные кислоты. В частности, Сю и Схг насыщенные жирные кислоты подавляли рост Candida albicans на агаре Сабуро в концентрации 2,5-5 мМ (Bergsson et al., 2001). Для сравнения целлобиозолипиды в данной работе подавляли рост Candida albicans в концентрации 0,2 мМ.

Гидроперокси - и гидрокси - производные линолевой и линоленовой кислот, продуцируемые растениями, являются одним из компонентов защитной системы растений от фитопатогенных грибов (Hou and Forman, 2000; Тарчевский, 2002; Graner et al., 2003). В то же время, эти соединения достаточно быстро метаболизируются грибами и их фунгицидный эффект непродолжителен.

По всей видимости для фунгицидного действия углеводный остаток имеет важное значение, как для стабильности самой структуры, так и для взаимодействия с гидрофильной поверхностью мембраны и/или компонентами клеточной оболочки. Возможность взаимодействия с компонентами клеточной оболочки и влияния этого взаимодействия на чувствительность к гликолипидам можно предположить, в связи с тем, что сферопласты S. cerevisiae были более чувствительны к устилаговой кислоте, чем клетки. Вопрос о том, почему базидиомицеты более чувствительны к целлобиозолипидам, чем аскомицеты, остается открытым. Вероятно, это связано как с особенностями липидного состава их мембран, так и с особенностями строения клеточных стенок. Дальнейшие исследования, в том числе и с использованием мутантов с определенным образом нарушенной структурой клеточной стенки, должны дать ответ на этот вопрос.

На рис. 4.1 показана гипотетическая схема действия гликолипидов на мембраны, в соответствии с которой жирнокислотный остаток проникает в мембранный бислой и вызывает нарушение его структуры и выход метаболитов. Углеводный остаток может быть важным для того, чтобы молекула не проходила через бислой полностью, а могла бы закрепиться в нем, кроме того, не исключено, что углеводный остаток важен для стабильности антифунгального компонента. За счет того, что в состав молекулы гликолипида входит остаток жирной кислоты, она встраивается в бислой. Гидрофильный углеводный остаток удерживает молекулы на поверхности бислоя. При увеличении концентрации гликолипида нарушается структура бислоя и через образовавшиеся участки повышенной проницаемости из клеток выходят низкомолекулярные соединения.

АТФ, К*, фосфат и т.

САОЮ/О 0000

Гликолипид иш

Липидный бислой

0000

АТР, К+, фосфат и т. д

00000000

Рис.4.1. Гипотетическая схема действия антифунгальных гликолипидов на клетки дрожжей.

В определенной степени результат действия целлобиозолипидов на клетки оказался близким к таковому, характерному для антифунгальных природных компонентов совершенно другой, белковой природы - микоцинов.

Хотя известны микоцины, действующие по самым разнообразным механизмам, например, вызывающие задержку фазы G1 клеточного цикла (Butler et al., 1991), ингибирующие синтез ДНК (Schmitt et al., 1989), вызывающие апоптотическую гибель клеток (Klassen and Meinhardt, 2005; Reiter et al., 2005), ингибирующие синтез (3-1,3-глюкана (Yamamoto et al., 1986) или обладающие глюканазной активностью (Comitini et al., 2004; Izgu and Altinbay, 2004), многие из этих белков после связывания со специфическими рецепторами, которыми являются компоненты клеточной стенки (Schmitt and Radler, 1988; Zhu and Bussey, 1989; Nakajima et al., 1989; Golubev and Boekhout, 1992; Golubev, 2006) затем взаимодействуют с цитоплазматической мембраной. Механизм действия таких микоцинов связан с их способностью к нарушению трансмембранных градиентов, в первую очередь протонов и ионов калия (Skipper and Bussey, 1977; Middelbeek et al., 1980a-c; de la Pena et al., 1981; Ashida et al., 1983), а также кальция (Gage et al., 2002). Следствием такого мембраноповреждающего действия является снижение внутриклеточного рН, выход из клеток-мишеней ионов калия, АТФ, других низкомолекулярных соединений и подавление транспорта аминокислот в клетку. Считается, что микоцины встраиваются в цитоплазматическую мембрану и создают каналы ионной проницаемости, что в конечном итоге приводит к гибели клетки (Kagan, 1983; Martinac et al., 1990; Gage et al., 2002; Santos and Marquina, 2004). Хотя гликолипиды, по-видимому, не связываются со специальными рецепторами, а взаимодействуют с мембраной непосредственно, результатом их действия также является повреждение мембраны.

Биологическая роль внеклеточных гликолипидов в природе в первую очередь связывается с их сурфактантными свойствами (Spencer et al., 1979; Lang and Wagner, 1987; Rosenberg and Ron, 1999; Cameotra and Makkar, 2004). Однако обнаружение антифунгальной активности у этих соединений по отношению к широкому спектру дрожжеподобных грибов (Golubev and Shabalin, 1994; Голубев и др., 2001, Mimee et al.,

2005) позволяет предполагать, что подобно микоциногении, секреция гликолипидов может играть важную роль в приспособлении видов-продуцентов к конкурентным взаимоотношениям в сообществах.

Стабильность и отсутствие токсичности, по крайней мере, для культивируемых линий клеток человека (Mimee et al., 2005) делает внеклеточные гликолипиды перспективными антифунгальными агентами для практического применения в медицине в качестве наружного антигрибкового средства или в сельском хозяйстве для защиты растений. Одной из проблем такого применения является кислый оптимум рН, необходимый для проявления активности, однако получение химических производных этих соединений может быть использовано для решения этой проблемы. В связи с детергентными свойствами эти гликолипиды могут представлять интерес в качестве агентов, улучшающих проникновение в клетки различных соединений, в том числе лекарственных средств, чужеродной ДНК или красителей. Это свойство может быть использовано как в лабораторной практике, так и при разработке новых комплексных фунгицидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулаковская, Екатерина Владимировна, Пущино

1. Георгиевская Е.Б., Захарченко Н.С., Бурьянов И.Я., Голубев В.И. (2006) Влияниедрожжей Pseudozyma fusiformata на устойчивость растений к возбудителю белойгнили Sclerolinia sclerotiorum. Микология и фитопатология, 40, 53-58.

2. Голубев В.И. (1991) Таксономическое значение микоцинов, продуцируемыхбазидиомицетными дрожжами Cryptococcus podzolicus. Микробиология, 60, 115-121.

3. Голубев В.И. (1992) Дрожжи филлосферы в дальневосточном заповеднике

4. Кедровая падь». Сибирский биологический журнал, №2, с 37-42.

5. Голубев В. И., Голубева Е.В. (2004) Дрожжевые грибы степного и лесныхфитоценозов Приокско-террасного биосферного заповедника. Микология ифитопатология. 38, 20-27.

6. Голубев В.И., Кулаковская Т.В., Голубева Е.В. (2001) Pseudozyma fusiformata -продуцент антифунгального гликолипида. Микробиология 70, 642-646. Кейтс М. (1975) Техника липидологии. Москва, Мир.

7. Кулаев И.С. (1975) Биохимия высокомолекулярных полифосфатов. Изд. МГУ. Кулаев И.С., Вагабов В.М., Кулаковская Т.В. (2005) Высокомолекулярные неорганические полифосфаты: биохимия, клеточная биология, биотехнология. Москва, Научный мир.

8. Кулаковская Т.В., Андреева НА., Трилисенко Л.В., Суетин С.В., Вагабов В.М., Кулаев И.С. (2005) Накопление полифосфатов и экспрессия высокомолекулярной экзополифосфатазы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Биохимия, 70, 1186-1192.

9. Лозинов А.Б., Финогенова Т.В., Глазунова Л.Р., Илларионова В.И. (1974) Лимитирование роста и сверхпродукция некоторых метаболитов дрожками Candida lipolytica. Микробиология. 43, 786-790.

10. Скулачев В.П. (1989) Энергетика биологических мембран. Москва, Наука.

11. Тарчевский И.А. (2002) Сигнальные системы клеток растений. Москва, Наука.

12. Трилисенко Л.В., Андреева Н. А., Кулаковская Т. В,.Вагабов В.М, Кулаев И. С. (2003) Ингибиторный анализ обмена полифосфатов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперкомпенсации. Биохимия, 68, 706-711.

13. Altona, С., and Haasnoot, C.A.G. (1980) Prediction of anti and gauche vicinal proton-proton coupling constants in carbohydrates: a simple additivity rule for pyranose rings. Organ. Magn. Reson. 13, 417-433.

14. Ashby R.D., Solaiman D.K., Foglia T.A. (2006) The use of fatty acid esters to enhance free Acid sophorolipid synthesis. Biotechnol. Lett., 28, 253-260.

15. Ashida S., Shimazaki Т., Kitano К., Hara S. (1983) New killer toxin of Hansemda mrakii. Agric. Biol. Chem., 47, 2953-2955.

16. Avis, T.J. and Belanger, R.R. (2001) Specificity and mode of action of the antifungal fatty acid ш-9-heptadecanoic acid produced by Pseudozyma flocculosa. Appl. Environm. Microbiol., 67, 956-960.

17. Avis T.J., Belanger, R.R. (2002) Mechanisms and means of detection of biocontrol activity of Pseudozyma yeasts against plant-pathogenic fungi. FEMS Yeast Research 2, 5-8.

18. Bednarski W, Adamczak M, Tomasik J, Plaszczyk M. (2004) Application of oil refinery waste in the biosynthesis of glycolipids by yeast. Bioresour. Technol., 95,15-18.

19. Belanger R., Labbe C., Cheng Y., McNally D. (2004) Flocculosin-CA, antimicrobial molecule. Canada Patent CA2492666.

20. Bergsson G, Arnfinnsson J, Steingrimsson 0, Thormar H.(2001) In vitro killing of Candida albicans by fatty acids and monoglycerides. Antimicrob Agents Chemother., 45, 3209-3212.

21. Bhattacharjee S.S., Haskins R.H., Gorin P.A.J. (1970) Location of acyl groups on two partly acylated glycolipids from strains of Ustilago (smut fungi) Carbohydr. Res., 13, 235246.

22. Borzeix F. (2000) Sophorolipids as stimulating agent of dermal fibroblast metabolism. United States Patent, US6057302.

23. Butler A.R., White J.H., Stark M.J.R. (1991) Analysis of the response of Saccharomyces cervisiae cells to Kluyveromyces lactis toxin. J. Gen. Microbiol., 137, 1749-1757.

24. Carballeira N.M., Sanabria D., Parang K. (2005) Total synthesis and further scrutiny of the in vitro antifungal activity of 6-nonadecynoic acid. Arch. Pharm. (Weinheim), 338, 441443.

25. Cameotra S.S., Makkar R.S. (2004) Recent applications of biosurfactants as biological and immunological molecules. Cur. Opin. Microbiol., 7, 262-266.

26. Casas J. A., Garcia-Ochoa F. (1999) Sophorolipid production by Candida bombicola: medium composition and culture methods. J. Biosci. Bioeng., 88, 488-494.

27. Cheng Y., McNally D.J., Labbe C., Voyer N., Belzyle F., Belanger R.R. (2003) Insertional mutagenesis of a fungal biocontrol agent led to a discovery of a rare cellobiose lipid with antifungal activity, Appl. Environ. Microbiol., 69, 2595-2602.

28. Chen J., Song X., Zhang H„ Qu Y.B., Miao J.Y. (2006) Sophorolipid produced from the new yeast strain Wickerhamiella domercqiae induces apoptosis in H7402 human liver cancer cells. Appl. Microbiol. Biotechnol., 72, 52-59.

29. Chu M., Mierzwa R., Xu L., He L., Langsdorf E., Beyazova M., Terracciano J., Patel M., Chan T-M., Gullo V. (2003) Isolation and characterization of two new antifungal antibiotics from a Basidiomycete. J. Antibiotics. 56, 9-15.

30. Cole R.D., Cox R.H. (1981) Handbook of toxic fungal metabolites. Acad. Press, pp.937

31. Comitini F., Di Pietro N., Zacchi L., Mannazzu I., Ciani M. (2004) Kluy\>eromycesphaffii killer toxin active against wine spoilage yeasts: purification and characterization. Microbiology, 150, 2535-2541.

32. Cooper D.G., Paddock D.A. (1983) Torulopsis petrophilum and surface activity. Appl. Environm. Microbiol., 46, 1426-1429.

33. Cooper D.G., Zajic J.E. (1980) Surface active compounds from microorganisms. Adv. Appl. Microbiol., 26, 229-253.

34. Cutler A.J., Light R.J. (1979) Regulation of hydroxydocosanoic acid sophoroside production in Candida bogoriensis by the levels of glucose and yeast extract in the growth medium. J. Biol. Chem. 254, 1944-1950.

35. Davila A.M., Marchel R, Vandecasteele J.P. (1997) Sophorose lipid fermentation with differentiated substrate supply for growth and production phases. Appl. Microbiol. Biootechnol., 47,496-501.

36. Fluharty A.L., O'Brien J.S. (1969) A mannose- and erythritol-containing glycolipid from Ustilago mciydis. Biochemistry, 8, 2627-2632.

37. Frautz, В., Lang, S., and Wagner, F. (1986) Formation of cellobiose lipids by growing and resting cells of Ustilago maydis. Biotechnol. Lett., 8, 757-762.

38. Gage MJ, Rane SG, Hockerman GH, Smith TJ. (2002) The virally encoded fungal toxin KP4 specifically blocks L-type voltage-gated calcium channels. Mol. Pharmacol. 61, 936944.

39. Golubev W., Shabalin Y. (1994) Microcin production in Cryptococcus humicola. FEMS Microbiol. Lett., 119, 105-110.

40. Golubev W.I., Boekhout T. (1992) Dimorphism in Itersonilia perplexans: Differences between yeast and hyphal forms in sensitivity to mycocins produced by tremellaceous yeasts. FEMS Microbiol. Lett. 98, 187-190.

41. Golubev, W.I. (1998) Mycocins (Killer toxins). In: The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th edn. (Kurtzman, C.P. and Fell, J.W., Eds.), pp. 55-62. Elsevier Science В. V., Amsterdam.

42. Golubev, W.I. (2006) Antagonistic interactions among yeast. In: Biodiversity and Ecophysiology of The Yeasts, pp. 197-219. Berlin Verlag

43. Golyshin, P.M., Fredrickson, H.L., Giuliano, L., Rothmel, R., Timmis, K.N., and Yakimov, M.M. (1999) Effect of novel biosurfactants on biodegradation ofpolychlorinated biphenyls by pure and mixed bacterial cultures. Microbiologica, 22, 257267.

44. Graner G., Hamberg M., Meijer J. (2003) Screening of oxylipins for controlof oilseed rape (Brassica napus) fungal pathogens. Phytochemistry, 63, 89-95.

45. Haskins R.H., Thorn J.A. (19 51) Biochemistry of the Ustilaginales. VII. Antibiotic activity of ustilagic acid, Can. J. Botany 29, 585-592

46. Heard G.M. and Fleet G.H. (1987) Occurrence and growth of killer yeast during wine fermentation. Appl. Envinronm. Microbiol. 53, 2171-2174.

47. Hewald S., Josephs K, Bolker M. (2005) Genetic analysis of biosurfactant prduction in Ustilago maydis. Appl. Environm. Microbiol. 71, 3033-3040.

48. Hewald S, Linne U., Scherer M., Marahiel M.A., Kamper J., and Bolker M. (2006) Identification of a gene cluster for biosynthesis of mannosylerythritol lipids in the basidiomycetous fungus Ustilago maydis. Appl Environm Microbiol. 72, 5469-5477.

49. Hillion G., Marchal R., Stoltz C., Borzeix F. (1998) Use of a sophorolipid to provide free radical formation inhibiting activity or elastase inhibiting activity. United States Patent US-5756471.

50. Hinton A Jr. and Ingram K.D. (2005) Microbicidal activity of tripotassium phosphate and fatty acids toward spoilage and pathogenic bacteria associated with poultry. J Food Prot. 68, 1462-1466.

51. Hommel, R. K., Weber, L., Weiss, A., Himmelreich, U., Rilke, O., and Kleber, H.-P. (1994) Production of sophorose lipid by Candida (Torulopisis) apicola grown on glucose. J. Biotechnol., 33, 147-155.

52. Hou С. Т., Forman R. J. (2000) Growth inhibition of plant pathogenic fungi by hydroxy fatty acids. J. Industr. Microbiol. Biotechnol. 24, 275-276.

53. Hua Z, Chen J, Lun S, Wang X. (2003) Influence of biosurfactants produced by Candida antarctica on surface properties of microorganism and biodegradation of n-alkanes. Water Res. 37, 4143-4150.

54. Im J.H., Nakane Т., Yanagishita H., Ikegami Т., Kitamoto D. (2001) Mannosylerythritol lipid, a yeast extracellular glycolipid, shows high binding affinity towards human immunoglobulin G. BMC Biotechnol.,1, 11-15,

55. Imura Т., Ohta N. Inoue K., Yagi N., Negishi H., Yanagishita H., Kitamoto D. (2006) Naturally engineered glycolipid biosurfactants leading to distinctive self-assembled structures. Chemistry, 12, 2434-2440.

56. Inoh Y., Kitamoto D., Hirashima N., Nakanishi M. (2001) Biosurfactants of MEL-A increase gene transfection mediated by cationic liposomes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 289, 57-61.

57. Inoh Y., Kitamoto D., Hirashima N., Nakanishi M. (2004) Biosurfactant MEL-A dramatically increases gene transfection via membrane fusion. J. Control. Release, 94, 423431.

58. Isoda H., Shinmoto H., Matsumura M., Nakahara Т. (1999) The neurite initiating effect of microbal extracellular glycolipids inPC12 cells. Cytotechnology, 31, 163-170.

59. Itoh S., Inoue S. (1082) Sophorolipids from Torulopsis bombicola aqs microbial surfactants in aikane fermentations. Appl. Environm. Microbiol., 43, 1278-1283.

60. Itoh S., Suzuki T. (1982) Sophorolipids from Torulopsis bombicola as microbial surfactants in aikane fermentation. Appl. Envinron. Microbiol., 43, 1278-1283.

61. Izgu F. and Altinbay D. (2004) Isolation and characterization of the K5-type yeast killer protein and its homology with an exo-beta-l,3-glucanase. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68, 685-693.

62. Kabara J.J., Vrable R. (1977) Antimicrobial lipids: natural and synthetic fatty acids and monoglycerides. Lipids, 12, 753-759.

63. Kagan B.L. (1983) Mode action of yeast killer toxin: channel formation in lipid bilayer membranes. Nature, 302, 709-711.

64. Kakugawa K., Tamai M., Imamura K., Miyamoto K, Miyoshi S., Morinaga Y., Suzuki O., Miyakawa T. (2002) Isolation of yeast Kurtzmanomyces sp. I-11, novel producer of mannosylerythritol lipid. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 188-191.

65. Kim H.S., Yoon B.D., Choung D.H., Oh H.M., Katsuragi Т., Tani Y. (1999) Characterization of a biosurfactant, mannosylerythritol lipid produced from Candida sp. SY16. Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 713-721.

66. Kitamoto D., Akiba S., Hioki C, and Tabuchi T. (1990) Extracellular accumulation of mannosylerythritol lipids by a strain of Candida antarctica. Agric. Biol. Chem., 54, 31-36.

67. Kitamoto D., Fujishiro K., Yanagishita H, Nakane T. and Nakahara T. (1992) Production of mannosylerythritol lipids as biosurfactants by resting cells of Candida antarctica. Biotechnol. Lett., 14, 305-310.

68. Kitamoto D„ Haneishi K„ Nakahara T, and Tabuchi T. (1990) Production of mannosylerythritol lipids by Candida antarctica from vegetable oils. Agric. Biol. Chem., 54, 37-40.

69. Kitamoto D., Isoda H. and Nakahara T. (2002) Functions and potential applications of glycolipid biosurfactants from energy-saving materials to gene delivery carriers. J. Biosci. Bioeng., 94, 187-201.

70. Kitamoto D., Nakane Т., Nakao N., Nakahara Т., and Tabuchi T. (1992) Intracellular accumulation of mannosylerythritol lipids as storage materials by Candida antarctica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 768-772.

71. Kitamoto D., Nemoto Т., Yanagishita H., Nakane Т., Kitamoto H. K. and Nakahara T. (1993) Fatty acid metabolism of mannosylerythritol lipids as biosurfactants produced by Candida antarctica. J. Jpn. Oil Chem. Soc., 42, 346-358.

72. Kitamoto D., Sangita G., Ourisson G., and Nakatani Y. (2000) Formation of giant vesicles from diacylmannosylerythritols, and their binding to concanavalin A. Chem. Commun., 861-862.

73. Kitamoto D., Yanagishita H., Endo A., Nakaiwa M., Nakane T. and Akiya T. (2001) Remarkable antiagglomeration effect of a yeast biosurfactant, diacylmannosylerythritol, on ice-water slurry for cold thermal storage. Biotechnol. Prog., 17, 362-365.

74. Kitamoto D., Yanagishita H., Hayara K., and Kitamoto H. K. (1995) Effect of cerulenin on the production of mannosylerythritol lipids as biosurfactants by Candida antarctica. Biotechnol. Lett., 17, 25-30.

75. Klassen R., Meinhardt F. (2005) Induction of DNA damage and apoptosis in Saccharomyces cerevisiae by a yeast killer toxin. Cell. Microbiol., 7, 393-401.

76. Klassen R., Meinhardt F. (2003) Structural and functional analysisof the killer element pPinl-3 from Pichia inositovora. Mol. Gen. Genomics, 290, 190-199.

77. Kurz M., Eder C., Isert D., Li Z., Paulus E.F., Schiell M., Toti L., Vertesy L., Wink J., Seibert G. J. (2003) Ustilipids, acylated beta-D-mannopyranosyl D-erythritols from Ustilago mciydis and Geotrichum candidum. Antibiot (Tokyo), 56, 91-101.

78. Kulaev I. S. and Vagabov V. M. (1983) Polyphosphate metabolism in microorganisms. Adv. Microbiol. Physiol., 24, 83-171.

79. Kurzweilova H. and Sigler, K. (1993) Fluorescent staining with bromocresol purple: a rapid method for determining yeast cell dead count developed as an assay of killer toxin activity. Yeast, 9, 1207-1213.

80. Lang S. and Wagner F. (1987) Structure and properties of biosurfactants, in: N. Kosari, W. Cairns, Eds. p.36

81. Lemieux R.U. (1951) Biochemistry of the ustilaginales. III. The degradation products and proof of the chemical heterogeneity of ustilagic acid. Can. J. Chem., 29, 415-425.

82. Lemieux R.U., Thorn J.A., Brice C., Haskins R.H. (1951) Biochemistry of the ustilaginales. II. Isolation and partial characterization of ustilagic acid. Can. J. Chem., 29, 409-414.

83. Makover M. and Bevan E.A. (1963) The inheritance of a killer character in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Proc. Int. Congr. Genet. XI., 1, 202.

84. Martinac В., Zhu H., Kubalski A., Zhou X., Culberston M., Bussey H., Kung C. (1990) Yeast K1 toxin forms ion channels in sensitive yeast spheroplasts and artificial liposomes. Proc. Natl. Acad. USA, 87, 6228-6232.

85. McCracken D.A., Martin V.J., Stark M.J.R, Bolen P.L. (1994) The linear-plasmid-encoded toxin produced by the yeast Pichia acaciae: characterization and comparisonwith the toxin of Kluyveromyces lactis. Microbiology, 140, 425-431.

86. Middelbeek E.J., Peters J.G.W.H., Stumm C., Vogel G.D. (1980a) Properties of Cryptococcus laurentii killer toxin and conditional killing effect of the toxin on Cryptococcus albidus, FEMS Microbiol. Lett., 9, 81-84.

87. Middelbeek E.J, Stumm C„ Vogel G.D. (1980b) Effects of a Pichia khiyven killer toxin on sensitive cells/ Ant van Leeuwenh., 46, 205-220.

88. Mimee В., Labbe C., Pelletier R., Belanger R.R. (2005) Antifungal activity of flocculosin, a novel glycolipid isolated from Pseudozyma flocculosa. Antimicrob. Agents Chemother., 49, 1597-1599.

89. Mulligan C. N. (2005) Environmental applications of biosurfactants. Environ. Pollut, 133, 183-198.

90. Mulligan, С. N., Raymond, N. Y., and Gibbs, B. F. (2001) Heavy metal removal from sediments by biosurfactants. J. Hazard. Mater., 85, 112-125.

91. Nakajima Т., Aoyama K., Ichishima E., Matsuda K. (1989) Structural analysis of .3-glucans from a killer toxin sensitive yeast, Saccharomyces cerevisiae, and a killer-resistant mutant. Agric. Biol. Chem., 53, 1983-1985.

92. Nguyen, H.-V. and Panon, G. (1998) The yeast Metschnikowia pulcherrima has an inhibitory effect against various yeast species. Sci. Aliments, 18, 515-526.

93. Niwano M., Mirumachi E., Uramoto M., Isono K. (1984) fatty acid as inhibitors of microbial cell wall synthesis. Agric. Biol. Chem., 48, 1359-1360.

94. Noordman, W.H, Bruining, J.-P., Wietzes, P., and Janssen, D. K. (2000) Facilitated transport of a PAH mixture by a rhamnolipid biosurfactant in porous silica matrices. J. Contarn. Hydrol., 44, 119-140.

95. Nunez A, Ashby R., Foglia T.A, Solaiman D.K. (2004) LC/MS analysis and lipase modification of the sophorolipids produced by Rhodoiorula bogoriensis. Biotechnol. Lett., 26, 1087-1093.

96. Nunez A., Foglia T.A., Ashby R. (2003) Enzymatic synthesis of a galactopyranose sophorolipid fatty acid-ester. Biotechnol. Lett., 25,1291-1297.

97. Patt, S.L. and Shoolery, J.N. (1982) Attached proton test for carbon-13 NMR, J. Magn.1. Reson. 46, 535-539.

98. Pena P., de la, Barros F., Gascon S., Lazo P.S, Ramos S. (1981) The effect of yeast killer toxin on sensitive cells of Sacchromyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 256, 10420-10425.

99. Pestov, N. A., Kulakovskaya, T.V., Kulaev I.S. (2004) Inorganic polyphosphate in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae at phosphate limitation and phosphate excess. FEMS Yeast Research, 4, 643-648.

100. Petrov , V.V., Smirnova, V.V., Okorokov, L.A. (1992) Mercaptoethanol and dithiotreitol decrease the difference of electrochemical proton potential across the yeast plasma and vacuolar membrane and activate their H+- ATPases. Yeast, 8, 589-599.

101. Puchkov, E.O., Wiese, A., Seydel, U. and Kulakovskaya, T.V. (2001) Cytoplasmic membrane of a sensitive yeast is a primary target for Cryptococcus humicola mycocidal compound (microcin). Biochim. Biophys. Acta (Biomembranes), 1512, 239-250.

102. Ratledge C., Wilkinson S.G. (1988) Fatty acids, related and derived lipids. In: Microbial lipids. Ratledge C., Wilkinson S.G., Eds. Academic Press.

103. Rau U„ Nguyen L.A., Schulz S„ Wray V., Nimtz M., RoeperH., Koch H„ Lang S. (2005) Formation and analysis of mannosylerythritol lipids secreted by Pseudozyma aphidis. Appl. Microbiol Biotechnol., 66, 551-559.

104. Rau U., Manzke C., Wagner F. (1996) Influence of substrate supply on the production of sophorose lipids by Candida bombicola. ATTC 22214. Biotechnol. Lett., 18, 149-154.

105. Reader, V. (1927) The relation of the growth of certain microorganisms to the composition of the medium:! The synthetic culture. Biochem. J., 21, 901-907.

106. Reiter J., Herker E., Madeo F., Schmitt M.J. (2005) Viral killer toxins induce caspase-mediated apoptosis in yeast. J. Cell. Biol., 168,353-358.

107. Rosenberg E. and Ron E.Z. (1999) High- and Low-molecular-mass microbial surfactants. Appl. Microbiol. Biootechnol., 52, 154-162.

108. Sandrin, T. R., Chech, A. M., and Maier, R. M. (2000) A rhamnolipid biosurfactatnt reduces cadmium toxicity during naphthalene biodegradation. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4585-4588.

109. Santos A., Marquina D. (2004) Ion channel activity by Pichia membranifaciens killer toxin. Yeast, 21, 151-162.

110. Sawant A.D., Abdelal A.T., Ahearn D.G. (1989) Purification and characterization of anti-Candida toxin of Pichia anomala WC 65. Antimicrob. Agents Chemother., 33, 48 52.

111. Schippers C., Gessner K„ Muller Т., Scheper T. (2000) Microbial degradation of phenanthrene by addition of a sophorolipid mixture. J. Biotechnol., 83, 189-198.

112. Schmitt M., Brendel M., Schwarz R., Radler F. (1989) Inhibition of DNA synthesis in Sasccharomyces cerevisiae by yeast killer toxin KT28. J. Gen. Microbiol., 135, 1529-1535.

113. Schmitt M., Radler F. (1988) Molecular structure of the cell wall receptor for killer toxin KT28 in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacterid .,170, 2192-2196.

114. Skipper N. and Bussey H. (1977) Mode action of yeast toxin: energy requirement for Saccharomyces cerevisiae killer toxin. J. Bacteriol., 129, 668-677.

115. Spencer J.F.T., Spencer D.M, Tulloch A.P.(1979) Extracellular glycolipids of yeasts, in: A. H. Rose (Ed.), Economic Microbiology, vol. 3, Secondary Products of Metabolism, Acad. Press, London, pp. 523-540.

116. Spoeckner S., Wray V., Nimtz nx, Lang S. (1999) Glycolipids of the smut fungus Ustilago maydeis from cultivation on renewable resources. Appl. Microbiol. Boitechnol., 51, 33-39.

117. Stark M.J.R., Boyd A., Mileham A.J., Romanos M.A. (1990) The plasmid-encoded killer system of Kluyveromyces lactis: a review. Yeast, 6, 1-29.

118. Sun X.X, Lee Y.J, Choi J.K, Kim E.K. (2004) Synergistic effect of sophorolipid and loess combination in harmful algal blooms mitigation. Mar. Pollut. Bull., 48, 863-872.

119. Thornton R.J. (1986) Genetic characterization of New Zeland and Australian wine yeast. Ant. vanLeewenh., 52, 97-103.

120. Tulloch A.P., Spencer J.F. (1966) Fermentation of long chain compounds by Torulopsis magiwliae. 3. Preparation of dicarboxylic acids from hydroxy fatty acid sophorosides. J. Am. Oil. Chem. Soc., 43, 153-156.

121. Tulloch A.P., Spencer J.F.T., Deinema M.H. (1968) A new hydroxy fatty acid sophoroside from Candida bogoriensis. Can. J. Chem. 46., 345-348.

122. Wickner R.B. (1996) Double-stranded RNA viruses of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Rev., 10, 250-265.

123. Wulff K., Doppen W. (1985) Luminometric method, in: H. U. Bergmayer, J. Bergmayer, M. Grasl (Eds.), Bergmayer Methods of Enzymatic Analysis, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, pp. 357-364.

124. Yamamoto Т., Hiratani Т., Hirata H., Imai M., Yamaguchi H. (1986) Killer toxin from Hansenula mrakii selectively inhibits cell wall synthesis in a sensitive yeast. FEBS Lett., 197, 50-54.

125. Zhao X., Murata Т., Ohno S., Day N., Song J., Nomura N., Nakahara Т., Yokoyama K.K. (2001) Protein kinase С alpha plays a critical role in mannosylerythritol lipid-induced differentiation of melanoma BI6 cells. J. Biol. Chem., 276, 39903-39910.

126. Zhao X., Wakamatsu Y., Shibahara M., Nomura N., Geltinger C., Nakahara Т., Murata Т., Yokoyama K.K. (1999) Mannosylerythritol lipid is a potent inducer of apoptosis and differentiation of mouse melanoma cells in culture. Cancer. Res., 59,482-486.

127. Zhou Q.H., Kosaric N. (1995) Utilization of canola oil and lactose to produce biosurfactant with Candida bombicola. J. Am. Oil Chem. Soc., 72, 67-71.

128. Zhou S., Xu C., Wang J., Gao W., Akhverdiyeva R., Shah V., Gross R. (2004) Supramolecular assemblies of a naturally derived sophorolipid. Langmuir., 20, 7926-7932.

129. Zhu H., Bussey H. (1989) The Ю toxin of Saccharomyces cerevisiae kills spheroplasts of many yeast species. Appl. Environm. Microbiol., 55, 807-811.