Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антибактериальная активность нового нитрофуранового соединения N - (5 - нитрофурфурилиден)-5 -нитрофуран -2- (N'-ацетил) карбоксамидразона (ПАП-49) в отнош. сапротрофных усл. патоген. микроорг. ж.-к. тракта молод. с.-х. жив.

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антибактериальная активность нового нитрофуранового соединения N - (5 - нитрофурфурилиден)-5 -нитрофуран -2- (N'-ацетил) карбоксамидразона (ПАП-49) в отнош. сапротрофных усл. патоген. микроорг. ж.-к. тракта молод. с.-х. жив."

ШСКОВСКАЯ ОРЛЕ НА ЛЕНИНА И ОРЛЕНА ТРУДОВОГО КРАСЮГО ЗНШНИ СЕЛЬСМШЗЯЙСТШННАЯ АЮЦ*£ЫИЯ имени К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

УДК б1б.33/.34-022.7-092.9:579.8--085.28.012:547.722.5

ТЕРЕЯЗВ Владимир Иванович

АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЮЮГО НИТРОШАГОВОГО ОВДНЗНИЯ Н- (5-НИТГО1УРИРИЛВДЕН)-5-НИТ-ГО1УРАН-2-(Н-АЦЗШ)КАРВ0КСАШДРАЭ0НА (ПАП-49) В ОТЮШЕНИИ САПР0ТР01НЫХ И УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ Ш1КРООРГАНИЗШВ ШУД)ЧЮ-ШЕЧЮП> ТРАКТА МОЛОДНЯКА СЕЛЬШ/ЗЗЯЙСТванных ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.07- микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степепз кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в отделе болезней молодняка Краснодарской научно-исследовательской ветеринарной станции и на кафедре неорганической химии Кубанского Государственного университета.

Научные руководители - профессор, доктор биологических наук В.К.Шильникова, старший нзучный сотрудник, кандидат химических наук П.А.Павлов

Официальные оппоненты - профессор, доктор биологических наук Г.И.Ежов, старший научный сотрудник, доктор ветеринарных наук Н.Т.Татаринцев

Ведущая организация - Кубанский ордена Трудового Красной Знамени Государственный аграрный университет

Загата состоится " & 1992 г.

в " ^^2?часов на заседании специализированного совета К. 20.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии имени К.А.Тимирязева по адресу:127550, Москва, ул.Тимирязевская, 49 Ученый совет ТС.ХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБТСХА.

Автореферат разослан " "... г"/.'.*: г.у^?.-.^.. 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук /

Л. В.¡¿осина

ОЕЯДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность гзботь;. Нз современном уровне развития животноводства, когда на относительно небольших плошадях концентрируется значительное поголовье тавотных, создаются предпосылки еоз-яикновенил различных заболеваний, в том тесле бактериальных. 1ри этом е|£ектквность лечения во многих случаях достигается с 70М0аь:с звтибзктериальнвх препаратов, в частности, антибиотиков ;Чергягое Д.К. с еоавт., i977; Мозгов И.Е., i985; Ковалев В.Ф. ; созет., i9B9). Однако частое, порой бессистемное применение »нтиФятяго? приводит ь- рзэвитии нежелательных экологических юследотЕИ/, среди которых возникновение и распространение ан-•ибксг/кзрегкстенгккх микрооргзнизиов и нарушение эволкщиокно :ло~нвенхзя :.::'!'робоценозов ззякызэт ведущее место (Навешан С.М., .939).

Препараты нй7ро|уравового ряда могут служить альтернативой кткбистикэв при некоторых формах заболеваний (Маркова И.В., алиничгЕЗ Е.Й., 19s7; /оиекко B.C., i99l; Hofкап W., 1984; Vas-L к.,1587). По химкотерапевтическим свойствам они конкурируют о кнсгиаи антибиотиками, обладая иироким спектром действия антибактериальным, антимикотическим, противопротозойнкы), э$-гктавнв в отношении энтибиотикоустойчиЕЫХ |орм возбудителей н4екдий (Блюгер A.I., 1958; Алексеева Л.Н., 1963; Платова Н.Г., 373; Тоннинов a.c. с созет., i988) и в отличие от антибиотиков эеышэют обшую иммунорезистентность иакроорганизма (Топоринз А.Н., 370, 1935; Ароне P.M., 1975; Адакян $.Б. с соавт., 1983). В то ; время некоторье из них высокотоксичны (фурацилин, фурадонин) ; эмулируются в организме (Зуразолидон); вызывают отравления мо-(дняка сельскохозяйственных животных (Хоменко B.C., 1970; Ли-

ыитров С. с соавт., 1986; Моргунов В.И., 1989). В связи с этим необходим скрининг новых нитрофурановых соединений со сниженной токсичностью, повышенными биодоступностью и антимикробными свойствами (Сухова Н.М. с соавт., 1984; Томников A.C. с соавт., 1988; Tanalca A., Usui Г., 1980; El-Obeid Н. et al., 1985; Scher-гег R., 1985 ), которые могли бы благодаря этим качествам обеспечить •получение экологически чистой продукции животноводства.

Цель и задачи работы. Основная цель - поиск нового, малотоксичного, обладающего значительными антибактериальными свойствами 5-нитрофуранового препарата для использования в животноводстве.

Задачи исследования:

- определить антибактериальную активность новых, синтезированных в Кубанском Государственном университете на кафедре неорганической химии производных фурана и изучить физико-химические свойства наиболее активного из них соединения;

- определить спектр и степень антибактериального действия препарата на различные виды бактерий в условиях in vitro и in vivo;

- определить степень адаптации бактерий желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных к новому нит-рофурану и возможность его совместного использования с другими препаратами;

- установить параметры острой токсичности и фармакокинети-ческого поведения в организме лабораторных животных (на примере белых мышей и кроликов).

Научная новизна. Впервые получен ряд новых нитрофурановых соединений (A.C. I* 1487411, 1492697, 1499394, 1529685, 1589641, 1640971) и определена их антимикробная активность. Методом скри-

нинга выявлено соединение Г1-(5-нитрофурфурилиден)-5-нитрофу--ацетил)карбоксамидразон (ПАП-49), обладающее наивысшими бактериостатическими свойствами в отношении граыположи-тельных и грамотрицательных бактерий. Впервые установлена структурная формула, физико-химические свойства ПАП-49, изучено его влияние на условно патогенные и сапротрофные микроорганизмы желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных. Показана степень взаимодействия с другими антибактериальными препаратами и на лабораторных животных (белые мыши, кролики), определены параметры острой токсичности, кумуляции, фармакокинетики препарата.

Теоретическое и прикладное значение. Из новых синтезированных нитрофураноЕЫх соединений значительные антибактериальные свойства и низкая токсичность установлены у м-( 5-нитрофурфурн-лиден) -5-нитрофуран-2-( N'-ацетил) карбоксамидразона (ПАП-49). Вследствие высокой терапевтической эффективности при »ксперимен-тальных стафилококковой и эшерихиозной септицемиях, спонтанном колибактериозе у телят новое нитрофурановое соединение рекомендовано в качестве лекарственного средства для сельского хозяйства.

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на Всесоюзном совещании по кислородсодержащим гетероциклам (Краснодар, i990 r.).

Публикации. По материалам диссертации получено б авторских свидетельств, одно положительное решение, опубликованы тезисы доклада.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20

таблицами и 8 рисунками. Список литературы рключзет 250 источников, из них 101 - иностранные.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследований. Работа выполнена в отделе болезней молодняка сельскохозяйственных животных Краснодарской научно-исследовательской ветеринарной станции и на кафедре неорганической химии Кубанского госуниЕерситета.

Первичному скринингу подвергнуто 24 новых соединения. Изучены антибактериальные и противогрибковые свойства продуктов . взаимодействия фурановых нитрилов с гидразином, а также конденсатов 5-нитрофурогидразидиыида с различными альдегидами. Биоактивность 5-нитро$урановьх соединений сопоставлена с аналогичными соединениями, содержащими вместо нитрогруппы другие заместители.

Биологическую активность ПАП-4Э и фуразолидона (втзлон сравнения, широко применяемый в медицине и ветеринарии) е условиях in vitro и in vivo оценивали по ингибирующему действию на различные бактерии. Поскольку особенно нас интересовали бактерии желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, как представителей "нормальной" биоты, так и возбудителей кишечных болезней, основной акцент делзлся именно в отношении «тих родов и видов. Однако в ряде случаев использовали и "случайные" роды.

Для опытов использовали 560 белых мышей и 32 кролика. Клиническое испытание проведено на 15 новорожденных телятах больных колибактериозои, которым новый нитрофурэн задавался иа расчета 5 иг/кг массы 3 раза в день в течение 5-7 дней подряд.

Антибактериальные сеойстеэ новых соединений изучены на 114 штаммах 22 видов бактерий клинического и музейного происхождения. Фунгистатическую активность оценивали по действии на дрож-жеподобный гриб Candida albicans.

Растворимость нового соединения изучали по методике регламентированной Государственной Фармакопеей СССР (изд. 11). Антимикробную активность in vitro определяли методом серийных разведений в бульоне лоттингера, in vivo - на моделях стафилококковой и эшерихиозной септицемиях белых мышей. Препарат вводили лерорально одновременно с внутрибрюшинным заражением животных. Терапевтическую эффективность оценивали по результатам выживания мышей. ЕJI^q вычисляли по методу Г.Н.Першина.

Способность бактерий адаптироваться к новому нитрофурану проверяли методом 30-кратного пассирования в питательной среде с суббактериостатическими концентрациями ПАП-49. Через каждые 5 пассажей проводили определение чувствительности тест-бактерий к препарату. О возможности совместного применения нового нитрофурана с другими антибактериальными препаратами судили по наличию синергидного действия.

Влияние нитрофураноЕЬ'х препаратов на килечные микроорганизмы в условиях in vivo изучали на кроликах с жиеой массой 2,53 кг, которым нитрофурэны задавали 5 дней подряд в терапевтических. дозах рекомендованных для этого класса лекарственных веществ - 5 и 10 ыг/кг массы, iо и после эксперимента отбирали пробы кала и"схеме А.З.Смолянской ( 1986) про водили качественное и количественное определение выделенных бактерий.

Острую токсичность ПАП-49 (ДД1б. ЛД50' -"-W изУчали по методу пробит-анализа и Г.Н.Перашну на беспородных белых мышах (18-20 г) обоего пола при двух методах введения - перораль-ном и внутрибрюшинном; степень кумуляции и обратимости токси-

б

ческого действия изучали на белых мышах по Л.Е.Гольдберг, В.Е.Баумштейн (1969); кинетику - на кроликах породы советская шиншила массой 2-2,5 кг. Препарат яиеотнкм вводили однократно перорзльно в дозе 100 мг/кг. Через 1, 3, 6Д12, 24 ч в крови и моче методом ВЭЖХ определяли количество всосавшегося и выводимого венества.

Математическую и биометрическую обработку полученных данных проводили, используя статистические методы, предложенные И.П.Ашмариным, А.А.Воробьевым (1962), И.А.Ойвиным (i960), а также программу "Statgraf" для персональных компьютеров ("Искра 1033.11").

Антибактериальная активность новых производных фуранз. При изучении продуктов взаимодействия фурзноЕКх нитрилов и конденсатов 5-нитрофурогидразидимидэ с различными альдегидами установлено, что величина антибактериальной и противогрибковой активности ноеых синтезированных соединений зависит, в первую очередь, от природы заместителя фурэнового кольца е положении "5", "2" и типа химических связей между заместителями и 5-нитрофура-новым циклом. Показано, что конденсация 5-нитро-2-фурогидрззид-

и формальдегидом ведет к образование соединений Ц-( 2,3-диокси-пропилиден)-5-нитрофуран-2-карбоксамидразон и ( М-шетилиден)-5-нитрофуран-2-карбоксамидразон, проявляющих выраженные антибактериальные (МПК от 2,5 до 62,5 мкг/мл) и фунгистатические (МПК от 2,5 до 25 мкг/мл) свойства. Конденсация с ароматическими альдегидами (езлициловым и нитросэлициловым) ожидаемого результата не дает, замена же китрогруппы в 5-м положении фурэнового цикла

Результаты исследований и их обсуждение

имидэ (

) с ( d,i )-глицериновым альдегидом

на бро м и трихлор|енольньй фрагмент значительно сниззет и даке исключает антибактериальную активность полученного соединения.

Усиление антибактериальных сеойств происходит после введения в молекулу 5-нитрофурогидрззидиыида 2-го фуранового цикла, при этом МПК нового соединения (1М-(5-нитро|ур}урилиден)-5-нит-рофуран-2-карбоксамидрззонэ) в отношении стафилококков достигла 0,75 мкг/мл. Удлинение боковой цепи на один винильный фрагмент (СВ=СН) за счет конденсации нитрофурогидразидимида с нитрофу-риларолеином повышает ингибирующие свойства и значительно расширяет спектр антибактериального действия (1.ШК для стафилококка 0,3, кишечной палочки - 7.,8, протея и кэндида - 500 мкг/мл). Ацилкровзние аминогруппы в соединении Я-(5-нитрофурфурилиден)-5-нитрофуран-2-карбоксамидразон с использованием уксусного, монохлоруксусного и дихлоруксусного ангидридов дало возможность получить три новые соединения с различной степенью бактериостз-тического действия. Наибольшей антибактериальной активностью характеризовалось соединение Ы-(5-нитрофурфурилиден)-5-нитро-фуран-2-( Н-ацетил)карбоксзмидразон (зарегистрированного под шифром ПАП-49), КПК которого в отношении Staph.aureus было 0,3, E.coli - 3,13, Fr.mirabilis - 12,5 мкг/ь:л. В дальнейшем данный нитро'}уран изучен нами более обстоятельно.

Дизико-химические сеойстез ПАП-49. ПАП-49 - новое нитрофу-рзнорое соединение Н-(5-нитрофурфурилиден)-5-нитро4уран-2-( М-ацетил)карбоксзмидразон - получено путем взаимодействия 11—(5— нитро'}урфурилиден)-5-нитрофуран-2-карбоксзмидразона с уксусным ангидридом, имеет следующую структурную и брутто формулу:

В соединении найдено (в %): С - 42,53 Н - 2,7i И - 20,78; вычислено (в I): С - 43,43 Н - 2,68 N - 20,88. Препарат представляет собой порошок желтого цвета, без вкуса и запаха, Тпл - 174-176°С. ПАП-49 растворим при 20+2°С в ацетоне (1:30), ДИОО (1:20), малорастворим в хлороформе (1:220), плохо растворим в »таноле (1:1300) и практически не растворим в воде (1: 23000). Растворимость при 50-7СРС увеличивается в этаноле почти в 7, е остальных растворителях в 2 раза.

Антибактериальные свойства ПАП-49 в условиях in vitro ПАП-49 обладает широким спектром действия, ингибируя как грам-положительные, так и гракотрицательные бактерии (табл.1). Наиболее чувствительны к препарату кокки и Pasteurelia nultocida. Так, АПК ПАП-49 для 20 шташс стафилококков находилась в пределах 0,03-0,78, 9 штаммов стрептококков - 0,35-6,25 мкг/мл. Бее испытанные штаммы Pasteureiia multocida ингибироЕались при концентрации препарата в питательной среде 0,78 мкг/мл. Бакте-риостатическая активность фуразолидона (аталона сравнения) для кокков и пастерелл проявлялась при больших в 2-8 раз концентрациях (от 0,2 до 12,5 мкг/мл). Энтеробактерии по-разному реагировали на действие ПАП-49, наиболее чувствительны зшерихии, наименее - бактерии родов ProteuB, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter . Установлено, что 45,5? штаммов E. coli

чувствительны к концентрациям препарата на уровне 1,56-10,0, 27,ЗС - до 20, 18,21 - до 30 и 9,1? - до 50 мкг/мл. Для остальных »нтеробактерий ШК нового нитрофурана составляет 12,5-50,0 мкг/мл. Исключение -S.pullorma , рост которой препарат подавлял при концентрациях 4,0-12,5 мкг/мл.

Pseudomonas aeruginosa наименее чувствительна к нигрофура-

Таблица 1

Антибактериальная активность ПАП-49 и фуразолидона

Виды микроорганизмов (число ! ЫПК, MKT/ил

штаммов) ! ! ПАП-49 ! фураsoлидон

Staphylococcus aureus (8) 0,04-0,78 0,2-6,25

S.epidermidis (12) 0,03-0,78 0,2-1,56

Streptococcus faecium (2) 0,36-0,78 1,56

S.pneumoniae (5) 0,24-3,13 1,56-12,5

S.uteris (2) 3,13-6,25 12,5

Pasteurella multocida (3) - 0,78 3,13

Pseudomonas aeruginosa (8) ' 125 500

Escherichia coli (22) 1,56-50,0 6,25-62,5

Eroteus vulgaris (8) 12,5-50,0 31,2-125

P.mirabilis (13) 12,5-50,0 31,2-125

Salmonella dublin (3) 25,0-50,0 12,5-62,5

S.enteritidis (3) 12,5-50,0 12,5-62,5

S.pullorun (6) 4,0-12,5 12,5-62,5

Klebsiella pneumoniae (2) 15,6-31,2 7,8-15,6

Enterobacter cloaceae (2) 25,0-50,0 31,2-62,5

Citrobacter freundii (2) 12,5 31,2

нам, тем не менее новый нитрофуран подавляет ее рост и развитие в концентрации 125 ыкг/мл (эталон сравнения - 500 мкг/мл).

Действие ПАП-49 при экспериментальных стафилококковой и эшерихиозной септицемиях. Дзннные антибактериального действия ПАП-49 в отношении стафилококков и кишечной палочки в условиях* in vitro позволили предположить о его эффективности в условия* in vivo. При определении хиыиотерапеЕТкческой эффективности

ПАП-49 и фуразолидона показало, что минимальными дозами, способствующими выживанию мышей при стафилококковом сепсисе, являются у нового препарата - 10, у эталона - 30 мг/кг; при эшерихиозном сепсисе 30 и 50 ыг/кг соответственно. ЕД^ препаратов соответственно равны: при стафилококковом сепсисе - 44,75+8,37 и 56,0+ 8,48 ыг/кг; при эшерихиозном сепсисе - 60,0+5,6 и 80,0+5,6 мг/кг.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ПАП-45 превосходит по терапевтической эффективности эталон сравнения - фура-золидон в 1,3 раза; по результатам селезеночного индекса способствует на 1-2 дня более быстрому, чем фуразолидон освобождению организма животных от патогенных бактерий.

Определение возможности и степени привыкания бзктерий к ПАП-49. Методом 30-кратного пассирования в суббактериостатичес-ких концентрациях изучена еозмо/Кность и определен уровень привы-кзния стафилококков, стрептококков и кишечных палочек к ПАП-49. Установлено, что приЕЫкание бзктерий к новому нитрофурану в условиях in vitro незначительно. Динамика развития резистентности исследуемых культур к ПАП-49 такова, что наиболее интенсивно процесс адаптации идет е течение первых 10 пзссзжей, затем в течение последующих 10-15 пассажей уровень чувствительности остается без изменений ( E.coli ), или даже несколько повышается ( Staphylococcus, Streptococcus, в дзльнейшем вновь отмечается Еозрзстзние резистентности. Уровень приЕЫкзния у различных бактерий неодинаков, Наибольшими адаптационными способностями отличаются стрептококки, наименьшими - стафилококки и кишечная палочка. Пассирование стрептококков е средах с суббактерностэти-ческики концентрациями нового нитрофурзнз позволило получить мутанты в 20,2 раза менее чувствительные, чем те же бактерии до пассирования. При пассировании кишечных палочек и£ПК снизилась

для них. в 2,9 раза по сравнению с первоначальным значением, при пассировании стафилококков - е 3,7 раза.

В процессе адаптации к новому нитрофурану кокковых бактерий (Staphylococcus, Streptococcus ) отмечены незначительные морфо-культурэльные и физиолого-биохимические изменения, выражающиеся в том, что у них увеличивались размера клетки и характер роста (стрептококки), менялось отношение к различным углеводам. Нз грамотрицэтельные бактерии (е.coli ) препарат практически не влиял.

Действие ПАП-49 и его сочетаний с антибактериальными препаратами нз .условно, пзтогенные бактерии. Установлено, что новое нитрофурэноЕое соединение по бзктериостатическим свойствам не уступает, а в ряде случаев даже превышает антимикробную активность бензилпении^ллина, стрептомицина, неогетинз, канамицина, гента-мицина, окситетрациклина, левомицетина, эритромицина, этазола, нитроксолинз, фуразолидона в отношении условно патогенных бактерий. Так, 1ШК ПАП-49 для штаммовStaph.epidermidis и St.pneumoniae составляет 0,19-0,39 мкг/мл. Аналогичная активность в отношении этих же видов бактерий обнаруяена только у бензилпени-циллина и гентамицинз, другие антибиотики и химиопрепараты были -е 2-40 рзз менее активны: их МПК находится в пределах от 0,78 до 1000 мкг/мл. Нз энтеробактерии ПАП-49 действует слабее. Его МПК дЛЯ Е.coli составляет 12,5, для Pr.mirabilis _ 25,0 мкг/мл. По противоэжерихиозной активности новый нитрофуран сильнее бензил-пенициллина, левомицетина, эритромицина, этазола и фуразолидонз, а по действии на мирабильный протей - неоветина, канамицина, стрептомицина и нитроксолинз.

Для предотвращения возникновения множественной лекарственной устойчивости у патогенных и условно патогенных бактерий были

Таблица 2

Изменение активности препаратов пш сочетании их. с ПАП-49 в суббактериостатических*концентрациях

Препараты -!—!- МПК, мкг/мл__

. iStapb.epifSt.pneu- ! £. со!1 . Рг.т1гаЫ'-1 ¿«паШв I шогйае ! } 11в

Б е нзилпенициллин 0,19 0,39 25,0 3,12

- " - + ПАП-49 0,09 0,19 -12,5 -

Стрептомицин - 12,5 12,5 3,13 100

- " - + ПАП-49 3,13 3,13 0,78 25,0

Неоветин 1,56 0,78 3,13 100

- " - + ПАП-49 0,19 0,39 0,78 50,0

Канашцин 12,5 12,5 1,56 . 200

- " - -г ПАП-49 6,25 6,25 0,78 -

Окситетрациклин 3,13 3,13 1,56 25,0

- " - -г ПАП-49 - - 0,39 - •

Левошцетин- 50,0 50,0 100 200

- " - -г ПАШ-49 25,0 . 12,5 50,0 -

Эритромицин 200 100 50,0 200

- " - + ПАП-49 - 25,0 100

Бтазол 1000 1000 >1000 >.1000 '

- " - + ПАП-49 ' - ■ 500

Нитроксолин 3,13 6,25 12,5 50,0

- " - -Г ПАП-49 3,13 12,5

Примечение: * - " -усиление эффекта не наблюдалось

испытаны сочетания ( в суббактериостатическил концентрациях) ПАП-49 с перечисленными выше препаратами (табл.2). Установлено, что между испытуемыми веществами ни в одном случае антагонизма не было. В то же время разные сочетания проявляли неодинаковую активность. Взаимодействие ПАП-49 с пенициллином, эыиногликози-цаыи (стрептомицином, неоветином, канамицином) и леЕОмицетином

усиливало противоыикробную активность препаратов в 2-8 раз в отношении как кокков, так и энтеробактерий. Значительное усиление (в 4-9 раз) ингибирующих свойств в отношении кишечной палочки и протея отмечалось при сочетании ноеого нитрофурана с тетрациклином и нитроксолином, а при сочетаниях с эритромицином и этазолом проявлялось только аддивное действие в отношении этих же бактерий.

Влияние ПАП-49 на сапротрофшэ и нормальные микроорганизма в условиях in vitro и in vivo . П&П-49 в услоЕИЯх1п vitro как и фуразолидон в значительной степени действует на сапротроф-ные и нормальные виды килечной микрофлоры. При атом наибольшему ингибированию подвержены бактерии рода Bacillus , на которые оба нитрофурана действуют примерно в равной степени: ШК нового ни?-рофурашвого соединения для них колеблется в пределах 0,01-0,73 мкг/мл, эталона - 0,01-0,71 мкг./мл (табл.3).

Таблица 3

Чувствительность бацилл и молочнокислых бактерий к ПАГТ-49 и фуразолидону

Видь бактерий

МПК, мкг/цд

ПАП-49 ! Фурз80лид0н

Bacillus raycoidea (3) B.cereus (2) B.subtiliB (3) B.brevis (I)

Lactobacillus acidophilua (I) Streptococcus lactis (2)

0,15-0,35 0,15-0,35

0,01 0,78 0,71 1,40

0,03-0,17 0,31-0,71

0,01 0,40 0,35 0,71

На молочнокислые бактерия (L.acidopiiilum.s.lactis ) тггрэ-фурзны влияли в кеньгой степени, чзы га саорообрззуслге Савтзркл.

Ингибирующая активность фуразолидона была при этом в 2 раза более сильной (МПК 0,25-0,71 мкг/мл), чем ПАД-49 (МПК 0,71-1,40 мкг/мл).

Несмотря на сильное ингибирующее действие нитрофуранов in vitro на молочнокислые бактерии и Bacillus , при их введении кроликам в дозе 5 мг/кг в течение 5 суток ежедневно, значительных сдвигов в видовом составе микроорганизмов толстого кишечника не обнаружено. Вместе с тем количество некоторых из них снизилась. Так, численность кишечных палочек уменьшилась на lO^-lü2 клеток в 1 г кала, бацилл на lOd, энтерококков и молочнокислых бактерий на Ю*.

Увеличение дозы препаратов до Ю ыг/кг вызывало более существенные изменения микробного пейзажа у тех животных, которые получали фуразолидон. У них не только значительно снижалась численность кишечных палочек (на 10^), бацилл (на 103), энтерококков (на 10^) и молочнокислых'бактерий (на 10^), но появлялись в больших количествах (ic£) бактерии родов Proteus и Clostridium.

У киеотных, получавших ПАП-49 в дозе 10 мг/кг развития дис-бактериозного состояния не обнаружено: уменьшение количества кишечных микроорганизмов было в тех ке пределах, как и е случае дозы 5 мг/кг, однако численность молочнокислых бактерий снижалась. Так, до обработки кроликов препаратом их численность в кале достигала 1(Р, после обработки - колебалась в пределах 107.

Токсикологическая оценка ПАП-49. На основании данных по острой токсичности ПАП-49 (его JIJ^q для белых мышей при пероральном введении составила 4631,9+251,1 мг/кг, при внутрибрюшинноы -1216,2+64,1 мг/кг),-соединение Ы-(5-нитрофур|урилиден)-5-нитро-4уран-2-( н-ацетил)карбоксашдрэзон согласно ГОСТ 12.1.007-76 отнесено нами к разряд ыалотоксичных соединений.

При сравнительной оценке величин JI^q других нитро$уранов

Таблица 4

Показатели острой токсичности ПАП-49 и широкоизвестных нитрофурановьх препаратов для белых мышей

Препараты |__

Л%0. мг/кг

!при пероральном вЕе-! дении ! при внутрибрштнном ! введении

ПАП-49 4631,9 1216,2

1уразолидон 1807,0 1057,0

Фурацилин 166,7 82,5

Фурадонин 166,7 43,3

Фурагин ' 2813,0 284,3

Фуразолин 720,0 270,0

Фуразонал 250,0 75,0

Еурзкрилин 1922,0 757,8

(табл.4) выявлено, что новое нитрофурзноЕое соединение менее токсично, чем Зурззолидон, ,|урэцилин, фурадонин, Зурагин, фуразонал, фуразолин, |уракрилин.

При введевви белым кьтам максимально переносимых доз ПАП-49 установлено, что препарат практически не кумулируется в организме. Через 24 ч после Еведения он выводится в объеме 54,2?, через 43 ч - в объеме 80,91, по истечении 72 ч индекс кумуляции препарата равен только 4,1%, индекс обратимости - 95,9?.

Оценка Дар:-;зкокинетических свойств ПАП-49. Данные хро:,;атог-рз|ического поведения и УЗ-спентроскопии показали, что ПАП-49 довольно мобильное ге^естЕО, в условиях кислой среды (рН 3)- ге-лудка и переднего отдела кизечника в течение 30 кин оно распадается на два метаболита, которые составляют основную долг. веа.естЕЗ, зарегистрированного е организме. Тем неменее, в незначительных

С, икг/мл 15 •

12 ■

9 .

6 .

3 ■ 1 ■

1 3 б 9 12 24 I ' 4

Рис. 1 Кинетика ПАП-49 в моче и крови кроликов (при однократном пероральном введении в дозе 100 иг/кг)

количествах (2-20 нг/мл) соединение Ы-(5-нитрофурфурилиден)-5-нитрофуран-2-( к'-эцетил) карбоксамидрэзон в течение первых 9 ч фиксируется в крови и моче в неизменном виде.

Кинетика ПАП-49 в крови и моче кроликов представлена на рис.1, из которого видно, что в течение первых 60 мин препарат в максимальной концентрации (7,11+0,27 мкг/мл) всасывается в кровь, затем уровень препарата в крови снижается и через 24 ч обнаруживается в концентрации 0,71*0,17 мкг/ыл. Интенсивность выведения ПАП-49 из организма прямо пропорциональна интенсивности Есасывзния. Со снижением количества нитрофурана в кроЕИ возрастает его концентрация в моче. Максимальная его концентрация в моче регистрируется через 6 ч (14,96*0,52 мкг/мл), после чего уровень препарата также снижается и через 24 ч становится в пределах 3,62+0,42 мкг/мл.

моча

КрОЕЬ

17

Выводы

1. Впервые синтезирован и изучен ряд новых фурансодержаи?« соединений. Показано, что некоторые из них обладают выраженными антимикробными свойствами (A.C. #1487411, #1492697, #1499894, Ж1529685, *l58964i, #i64097l) и могут успешно использоваться ■ в животноводстве и ветеринарии. Соединение М.-(5-нитрофурфу-рилиден) -5-нитрофуран-2-( Н-ацетил) карбоксамидразон, зарегистрированное под игифром ПАП-49 обладает наибольшей противобЬк-териальной активностью.

2. В условиях in vitro установлена высокая активность ПАП-49 в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий -представителей нормальной кишечной микрофлоры и возбудителей кишечных инфекций (патогенных и условно патогенных) у молодняка сельскохозяйственных жиеотных. ¿¡ПК для большинства штаммов стафилококков, стрептококков, бацилл, пастерелл, энтеро-бактерий находится в пределах 0,03-50 мкг/мл. В зависимости

от штаммовых особенностей по данным показателям ПАП-49 превосходит фуразолидон (эталон) в 2-10 раз.

3. Устойчивость бактерий к ПАП-49 в условиях in vitro развивается медленно и не достигает высоких значений. Чувствительность у стафилококков после 30-кратного пассирования на средах с суббактериостатическими концентрациями нового нитрофурана снизилась в 3,7, стрептококков - 20,2, кишечной палочки - 2,9 раза. В процессе адаптации к ПАП-49 кокковидных бактерий (Staphylococcus, streptococcus ) отвлечены незначительные морфо-куль-туральные и физиолого-биохимические изменения, на грамотрица-тельные бактерии (в.coli ) препарат практически не влиял.

4. ПАП-49 в сочетании с пенициллином, левомицетиком и ааяногогао-

зидными антибиотиками (стрептомицином, неоветином, кэнаыици-ном) проявляет выраженное синергидное действие в отношении бактерий родов Staphylococcus, Streptococcus в сочетании с тетрациклином и нитроксолином + в отношении E.coli, Pr.mira-bilis . Рекомендуется использовать эти комбинации для предотвращения возникновения множественной лекарственной устойчивости у патогенных и условно патогенных бактерий. Сочетание ПАП-49 с эритромицином и атазолом дают суммирующий эффект только в отношении энтеробактерий.

5. Проявление в отношении сапротрофных бактерий и нормальной кишечной микрофлоры животных антибактериального эффекта препарата ПАП-49 в условиях in vitro отличается от такового в условиях in vivo . ШК ПАП-49 в отношении В.mycoides, B.öereus, B.subtilie , B.brevis , L.acidophilum , S.lactis (представителей "нормальной" кишечной биоты) варьирует в диапазоне 0,01-1,4 мкг/мл. Применение препарата животным (на примере кроликов) в регламентируемых для нитрофуранов дозах (5-Ю кг/кг) в отличие от фуразолидона (эталон сравнения) не вызыяяет заметных качественных и количественных изменений в составе кишечных микроорганизмов.

6. Новое нитрофурановое соединение ПАП-49 отнесено к малотоксичным веществам (JI%0 4631,9+231,1 ыг/кг), при пероральном введении его токсичность в 2,6 раза меньше, чем фуразолидона, и

в отличие от последнего он практически не кумулируется в организме животных (белые мыши).

7. Установлено, что ПАП-49 из желудочно-кишечного тракта животных быстро всасывается в кровь, создавая там максимальные концентрации (7,11+0,27 мкг/мл) уже через 1 ч после введения. Элиминация препарата происходит наиболее интенсивно в течение

первых 6 ч, максимальная концентрация его в моче через б ч составляет 14,95тС,52 мкг/мл, через 24 ч ПАП-49 почти полностью шеодится из организма. 8. На моделях экспериментальных стафилококковой и эшерихиозной септицемиях белых мышей определено, что по терапевтической эффективности (Щ0 44,75+6,37 - 60,0+5,6 мг/кг) ПАП-49 в 1,3 раза превосходит фуразолидон, и на 1-2 дня быстрее последнего освобождает организм животных от патогенных бактерий. Отмечена высокая терапевтическая эффективность (100-С-ное выздоровление) ПАП-49 при спонтанном колибактериозе телят.

Список работ, опубликованных по теио диссертации

1. Павлов O.A., Бибиков S.A., Буланкин А.Л., Терехов В.К. iu-( 5-нитрос[ур$урилидэн) -5-нитро$уран-2-карбоксададразон, прояЕ-msocfiü антимикробную активность // Авт.сеидот. СССР ДХ492657, кл. с 07 Д S07/74, 1989.

2. Павлов П.А., Буланкин А.Л., Терехов Е.И, 1-ацотил-З-ыетил-5-(5-нитро£урил-2)-1,2,4-триазал, проявляющий антимикробную активность // Авт.свидет. ССОР £1499834, кл.С 07 Д405/04, 1989.

3. Павлов П.А., Буланкин А.Л., Терехов В.И., здоров H.H. И-(2,3-д;:01гс;!проппл1!дзн)-5-нитро^уран-2-1:арбокса1:идразэь', про-евлиз^й противоыикробную активность // Авт.свидог. СССР .'Л487411, кл. С07 Д S07/70, 1539.

4. Пакозкин В.Т., Павлов П.А., Буланкин А.Л., Терехов В.И. П-ызтилидэн-5-нитро4уран-2-1:£рбОЕсамидразон, проявляющий антимикробную и ||унгицидкуа активность // Ает.сеидзт. СССР £1529585, кл.С 07 Д 307/73, х989.

5. Павлов П.А., Терехов Б.И. Реакция производных 5-нитро-2-] у ро г и дра з и ди 1;и да с галогенаыи. // Тезисы Есессаз.совещания кислородсод. гетероциклов. Краснодар. 1990. -С.85.

6. Павлов П.А., Буланкин А.Л., Терехов Е.И., Федоров H.H.

5-нитро$ур$урилиден)-5-нитро$уран-2-(ri'-ацетил)карбоксамид-

рааон // Авт.свидет. СССР £1589541, кл. С 07 Д 307/73, i590.

7. Павлов П.А., Терехов В.И., Федоров H.H. М-(5-ннтрофу-рилаллилндав)-5-нитрофуран-2-карбоксаиидразон, проявляэщий антиинкробнув активность // Авт.свидет. СССР,В1640971, кл. С 07 Д 807/73, 1990.