Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АНТГЕЛЬМИНТИК ТЕНАЛ И ЕГО ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "АНТГЕЛЬМИНТИК ТЕНАЛ И ЕГО ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА"



На правах рукописи

КОВЕШНИКОВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

АНТГЕЛЬМИНТИК ТЕНАЛ И ЕГО ФАРМАКОТОКСИКОЛОГИМЕСКНЕ СВОЙСТВА

Специальность: 03.00.19 ~ парачктстоги*

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

Работа выполнена в ПНУ Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И.Скрябина Россельхозакадемии (ГНУ ВИГИС Россельхозакадемии)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Новик Тамара Самуиловна

Официальны* оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Малахова Екатерина Ивановна; доктор биологических наук, Бондареико Владимир Олегович

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябииа (МГАВМиБ)

Защита диссертации состоится «30» мая 2007 г. в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 006.011.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии им. К.И.Скрябина Россельхозакадемии (ГНУ ВИГИС Россельхозакадемии). Адрес: 117218, г. Москва, Б. Черемушкинская ул., д. 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС Автореферат разослан «¿X апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Бережко В.К.

Общая характеристики работы

Актуальность проблемы. Рынок противопаразнтарных средств с выраженным цестодоцидным и нематодоцидным действием на первый взгляд поражает довольно большим изобилием и широтой. Казалось бы, можно найти препараты с любой лечебной и профилактической н аправлен ностью, которые в полной мере отвечали конкретным поставленным целям, задачам и ситуациям для обработки животных. Однако при более близком и детальном рассмотрении ассортимента современных антгельминтиков можно придти к ряду довольно неутешительных выводов. Во-первых, среди данных препаратов довольно мало качественных средств отечественного производства, которые были бы доступ* ны, отличались высокой эффективностью, безопасностью и приемлемой ценой. Во-вторых, многие антгельминтики являются морально устаревшими и уже не отвечают жестким современным требованиям в отношении сочетания полезной терапевтической эффективности и безопасности в самом широком понимании.

Исходя из вышесказанного, создание и разработка новых противопаразнтарных средств всегда является востребованной и весьма актуальной исследовательской задачей.

В наше распоряжение был представлен целый ряд новых, синтезированных в ВИГИСе и МГУ соединений из различных химических классов, которые в силу ряда причин представляли собой вполне реальный и возможный источник получения нового перспективного отечественного препарата. В случае обнаружения при этом эффективного соединения весьма логичной нам представлялась следующая схема дальнейших исследований: оценка его переносимости, детальная токсикологическая характеристика препарата и испытание эффективности.

Все вышеуказанное определяет актуальность темы работы и обосновывает целесообразность проведения наших исследований.

Цель к задачи исследований. Отправной целью настоящих исследований было проведение скрининга ряда соединений на цестодоцидную и немато-доцидную активность соответственно на лабораторных моделях на мышах, зараженных гименолепнсами и трихинеллами. Поскольку в результате проведенного скрининга было выявлено новое химическое соединение (впоследствии названное теналом), показавшее высокую эффективность против цестод н имеющее явную перспективу для применения в качестве субстанции антгельминтиков, необходимо было решить целый ряд следующих задач:

• определение параметров острой токсичности тенала при введении в

желудок и нанесении на кожу;

• оценка кумулятивных свойств тенала;

■ исследование подострой токсичности препарата;

• оценка тенала на некоторые специфические эффекты (эмбриотоксиче-

ское, тератогенное и мутагенное действие);

• создание лекарственных композиций на основе тенала с целью «снятия» эмбриотоксических свойствгае»ара1а, ргдУ-МСХА ^

, имени К.А. Тимирязева \щб имени Н И. Железное» Фонд научный литературы

• оценка острой токсичности двух композиций тенала с глицином и сернокислое меда при введении в желудок;

• исследование эффективности композиций тенала при гимеиолепидозе мышей;

• первичное испытание эффективности тенала (субстанции) и лекарственных композиций на его основе при мониезиозе овец.

Научная новизна.

• В результате скрининга на мышах, зараженных гименолеписами, найдено новое соединение, в химическом отношении представляющее собой 3,5-дибромсалициловую кислоту, обладающее 100% эффективностью на данной модели, и названное теналом.

• Проведена детальная токсикологическая оценка тенала с исследованием параметров острой токсичности, кумулятивных свойств, подострой токсичности и некоторых специфических эффектов.

• Изысканы средства (глицин и сернокислая медь) для полного предупреждения эмбриотоксического эффекта тенала.

• Созданы и получили первичную оценку лекарственные композиции на основе тенала, глицина или сернокислой меди.

• Оценена эффективность тенала и его композиций при мониезиозе овец, которая во всех случаях составила 100%.

Практическая значимость* Результаты исследований являются основой для внедрения в широкую ветеринарную практику новой субстанции тенала и его лекарственных композиций для лечения и профилактики цестодозов сельскохозяйственных животных.

Данные, полученные в ходе исследований, представляют собой основу материалов, предназначенных для регистрации препаратов.

«Методические указания по применению композиций тенала с глицином н сернокислой медью при мониезиозе овец» утверждены на секции «Инвазионные болезни животных» РАСХН 1.03.2007 г.

По материалам диссертации получен патент «Антгельминтное средство» № 2242976 от 27 декабря 2004 г.

Апробация работы. Результаты исследований были неоднократно пред* ставлены на отчетных научных конференциях ВИГИС и научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями животных». (2003, 2006 гг.).

Основные положения, выносимые на защиту;

• Результаты скрининга ряда соединений из различных химических классов на нематодоццдную и цестодоцидную активность.

• Особенности токсических свойств тенала.

• Лекарственные композиции на основе тенала и их характеристика.

• Эффективность тенала (субстанции) и композиций на его основе при мониезиозе овец.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных статей.

Объем И структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 158 источников, в том числе 85 отечественных и 73 иностранных. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 14 рисунками.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

D обзоре литературы представлен анализ данных отечественных и зарубежных авторов по эффективности, фармакологии и токсикологии препаратов из группы салицилаиилидов, наиболее близких к салициловым кислотам.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной терапии и виварии ГНУ ВИПИС Россельхозахадемии в 2003-2006 гг.

2.1.1. Схемы проведения опытов по скринингу рядя соединений нз различных химических групп на иестодоцндную и нематодоцндную активность

Для проведения исследований нам был предоставлен ряд соединений, из группы замещенных салициловых кислот, производных салицилаиилидов, бен-зодиоксанов, бензтиазола, бензоксазола и N.S-гетерюциклических соединений (Михайлицин Ф.С., ВИГИС; Гаджиева П.И., МГУ).

2.1.1.1. Опыты на модели Hymenolepis tuma. Испытание замещенных салициловых кислот, производных салншшаннлнзов, бензодноксаиов, N,S-гетероциклических соединений на цестодоцидное действие проводили на белых мышах, экспериментально иибазированных Н. папа. Мышей заражали перорально с помощью шприца, снабженного специальной канюлей, из расчета 100-400 инвазионных яиц на животное. Для этого собранных от предшествующего заражения цестод Н. пала растирали пестиком в ступке или разрушали в небольшом объеме водопроводной воды посредством неоднократного насасывайия в шприц с насаженной на него игяой-канюлей для перорального заражения. На 13-й день после заражения в желудок мышей разных групп вводили различные тестируемые препараты однократно в дозе 100 мг/кг в виде водкой суспензии с добавлением 1-2 капель ПЭГа. Животным контрольной труппы вводили дистиллированную воду с ПЭГом в соответствующих объемах. На 4 сутки после введения препаратов животных убивали. Активность соединений учитывали по результатам гельминтологического вскрытия кишечника. Извлеченных при вскрытии цестод подсчитывали. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных цестод и икгенсэффективности.

2.1.1.2. Опыты на модели Trichinella spiralis. Изучение нематодоцидной активности новых соединений проводили на лабораторной модели трихинеллеза на белых мышах, экспериментально инвазированных Т. spiralis, в возрасте 1,5-2 месяцев в дозе 100 личинок на животное. Животных заражали через рот введением суспензии с личинками с помощью шприца с канюлей. На 6-й день после заражения мышам подопытных групп вводили перорально однократно 6 препаратов из класса N.S-гетеро циклических соединений, 9 препаратов из класса бензодиок-санов, 1 соединение производное бензоксазола н 1 соединение из группы бензтиа-золавдозе 100 мг/кг, Животные контрольных групп получали дистиллированную воду в соответствующих объемах.

Животных убивали на 3 сутки. Нематодоцидную активность испытуемых препаратов учитывали по результатам гельминтологического вскрытия кишечника и исследования компрессорным методом изолированных отрезков кишечника. Учитывали обнаруженное при этом количество трихинелл. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных нематод и интенсэффеюивности.

2.1 Л. Схемы опытов по оценке токсических свойств те нал а

2.1.2.1. Изучение острой токсичности тенала проводили с учетом «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).

Опыты по изучению острой токсичности тенала проводили на 30 белых крысах-самцах с массой тела 180-220 г и 36 белых мышах с массой тела 18-20 г.

Препарат вводили крысам в виде суспензии на ПЭГе однократно, перорально с помощью желудочного зонда в дозах 300; 500; 800; 1000 и 1500 мг/кг; мышам - в дозах 300; 350; 400; 450 и 800 мг/кг.

На каждую дозу было использовано по б животных. Наблюдение за животными проводили в течение 1 месяца, при этом учитывали общее состояние, прием корма и воды, состояние шерстного покрова, поведение и активность животных.

Для расчета средней смертельной дозы использовали метод пробит-анализа по Литчфицду и Уилкоксону (Беленький М.Л., 1963).

2.1.2.2. Опыты по изучению острой накожной токсичности тенала проводили на белых крысах-самцах с массой тела 180-220 г.

За 1-2 дня до эксперимента кожу животных освобождали от шерстного покрова. Площадь поверхности участка кожи составляла 5x5 см.

Препарат наносили в виде водной суспензии на ПЭГе однократно в дозах 2500 и 5000 мг/кг.

В течение 14 суток вели наблюдение за состоянием и поведением животных в отношении проявления симптомов интоксикации; оценивали физиологические функции, реакцию на раздражители и т.п.

2.1.2.3. Раздражающее дейстеие тенала на кожу оценивали при нанесении препарата в дозах 2500 и 5000 мг/кг при оценке острого токсического действия.

Исследовали состояние кожи, обращая особое внимание на возможность покраснения, наличия трещин, изъязвлений, кровоизлияний, появления сухой корки и т.д.

Состояние кожи оценивали с учетом развития возможной эритемы и интенсивности отека кожи (по измерению изменения толщины кожной складки в мм) («Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны», 1980).

Исследование действия тенала на слизистую глаза проводили на 3 взрослых здоровых кроликах, которым в левый глаз вносили 1%-ую суспензию тенала, а правый служил контролем. Тенал вносили в конъюнктивальный мешок с помощью пипетки однократно в количестве 1-2 капель.

Состояние глаз контролировали через 15 мин; 1; 24; 48 и 72 часа после внесения 1%-го раствора тенала. Обследование проводили визуально.

Реакцию оценивали в баллах по шкале:

0 ~ видимой реакции нет

1 — легкое покраснение коньюктивы

2 — покраснение коньюктивы и частично склеры (в направлении к роговице)

3 — резкое покраснение коньюктивы и всей склеры, гнойный офтальмит («Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны», 1980).

2.}.2.4.Изучение кумулятивных свойств тенала проводили по методу Ю.С.Кагана и В.В.Станкевича (1964). Было сформировано две группы животных по 20 крыс-самцов в каждой с исходной массой тела 140-160 г. Тенал вводили в виде водной суспензии на ПЭГе через рот ежедневно в течение 2-х месяцев в дозах 110 и 55 мг/кг, что соответствует 1/10 и 1/20 от 1Л5зо (1100 мг/кг).

В течение всего опыта вели наблюдение за внешним видом, общим состоянием и поведением животных; учитывали падеж крыс и проявление признаков токсикоза.

2.1.2.5. Исследование подострой токсичности тенала проводили на крысах-самцах с исходной массой 100-150 г. Тенал вводили в течение 2-х месяцев ежедневно перорально в дозах 1/100 и 1/1000 от ЬОзд (от установленной ранее — 1100 мг/кг) соответственно 11 и 1,1 мг/кг массы тела. Контрольная группа получала дистиллированную воду с ПЭГом в соответствующих объемах.

В течение всего опытного периода проводили наблюдение за общим состоянием животных, приростом массы тела, видимыми физиологическими функциями.

В конце опыта животных всех групп подвергали эвтаназии; отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей; взвешивали основные органы для определения массовых коэффициентов; проводили макроскопическое исследование печени, почек, селезенки, легких и других органов.

Определение гематологических показателей проводили на анализаторе «Гематоскрин» (Италия); в целом было определено 13 наиболее информативных показателей; 10 биохимических показателей сыворотки крови определяли на анализаторе «Clima MC 15» (Испания).

2.1.2.6. Опыты по выявлению возможного хчбриотропного действия тенала проводили на 48 беременных крысах-самках (42 подопытных и 6 контрольных) и 10 крысах-самцах, которых содержали отдельно. К самкам, находящимся в стадии эструса и проэструса, подсаживали самцов нз расчета один самец на четыре самки. Обнаружение сперматозоидов во влагалищном мазке на следующее утро считали первым днем беременности.

Беременным крысам тенал вводили в виде водной суспензии на ПЭГе в терапевтической дозе. Препарат вводили с использованием различных схем 7 группам беременных крыс в дозе 100 мг/кг перорально с помощью желудочного зоцда в периоды с 1 по б; с 7 по 14 и с 15 по 19 дни эмбриогенеза. Также препарат вводили однократно на 3; б; 9 и 11 дни беременности. Контрольная группа крыс самок получала воду в объемах, соответствующих таковым при введении препарата. В течение всей беременности вели наблюдение за общим клиническим состоянием самок.

На 20-й день беременности крыс убивали декапитацией. По соотношению числа желтых тел беременности, мест имплантации, живых и резорбированных эмбрионов, определяли пред- и постам плантационную гибель, общую эмбриональную смертность (%). Плоды извлекали из матки, тщательно осматривали, взвешивали, определяли краниокаудальные размеры. Измеряли массу и размер плаценты (Дыбам А.П., Баранов B.C., Акимова И.М.,1970).

Кроме того, плоды исследовали на наличие внешних и внутренних аномалий развития. В последнем случае состояние внутренних органов оценивали с использованием метода Вильсона (J.G.Wilson, 1965) в модификации отдела эмбриолога и ИЭМ АМН СССР (Дыбан А.П., Баранов B.C., Акимова И.М., 1970).

2.1.2.7. Оценку антимшпотического действия тенала проводили на 15 белых крысах-самцах. Препарат вводили перорально однократно в дозе от LDjo (550 мг/кг). Выделение костного мозга и обработку материала проводили по методике C.E.Ford, J.L.Hamerton, 1956.

Костный мозг фиксировали через 3; б и 24 часа после введения тенала.

Определяли митотический индекс, который выражали в процентах <%). Регистрировали все стадии митоза и также выражали в процентах (%),

Изучение мутагенного действия тенала проводили на белых крысах-самцах. Препарат вводили перорально однократно в дозе Vi от LDjo (550 мг/кг). За 2-2,5 часа до убоя вводили 0,04% раствор колхицина из расчета 0,01 мл на I г массы тела животного. Опытных и контрольных животных убивали через 24; 48 и 72 часа после введения препарата. Далее готовили препараты клеток (фасного костного мозга крыс по вышеописанной методике.

При метафазном анализе в препаратах костного мозга учитывали следующие типы нарушений хромосом: одиночные и парные фрагменты, хрома-

тндные и хромосомные обмены в соответствии с принятыми рекомендациями (Бочков Н.П. и др., 1972; Бочков Н.П., 1975). Определяли процентное содержание метафаз с абберациямн.

2.13. Проведение опытов по снятию эмбриотокснческого действия тенала при многократном введении

Опыты по снятию эмбриотропного действия тенала проводили на 78 беременных самках (72 подопытных и 6 контрольных) и 18 самцах, которых содержали отдельно.

Беременным хрысам тенал вводили в виде водной суспензии на ПЭГе в терапевтической (100 мг/кг) и в три раза повышенной (300 мг/кг) дозах. Препарат вводили в комбинации с глицином и медным купоросом с использованием различных схем 12 группам беременных крыс в периоды с ! по б; с 7 по 14 и с 15 по 19 дни эмбриогенеза. Сразу же после введения тенала в дозе 100 и 300 мг/кг перорально 6 группам беременных крыс вводили медный купорос соответственно в дозах 100 и 300 мг/кг, б группам беременных крыс вводили глицин соответственно в дозах 100 и 300 мг/кг, т.е. во всех случаях соотношение соединений по массе составляло 1:1. Контрольная группа крыс самок получала дистиллированную воду с ПЭГом в объемах, соответствующих таковым при введении препарата. В течение всей беременности вели наблюдение за общим клиническим состоянием самок.

Исследование эмбрионального материала проводили аналогично тому, как подробно описано в разделе 2.1.2.6.

2.1.4. Опыты по определению острой токсичности комбинаций тенала с глицниом и сернокислой медью

Изучение острой токсичности смесей тенала проводили с учетом «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005),

Опыты по изучению острой токсичности композиций тенала проводили на 48 белых крысах-самцах с массой тела 180-220 г и 48 белых мышах с массой тела 18-20 г.

Препараты вводили крысам в виде водной суспензии на ПЭГе однократно, перорально с помощью желудочного зонда в дозах 600; 800; 1100 и 1200 мг/кг — для смеси тенала с медным купоросом; в дозах — 600; 800; 1100 н 1300 мг/кг для смесей тенала с глицином. Сразу же после введения тенала в аналогичных дозах вводили медный купорос и глицин. Острую токсичность на мышах оценивали в дозах 300; 350; 400; 450 для смесей тенала с глицином и в дозах 200; 250; 300 и 350 мг/кг для смесей тенала с медным купоросом.

На каждую дозу бьто использовано по 6 животных. Наблюдение за животными проводили в течение 1 месяца, при этом учитывали общее состояние, прием корма и воды, состояние шерстного покрова, поведение и активность животных.

Для расчета средней смертельной дозы использовали метод пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький МЛ., 1963).

2.1.5. Определение терапевтической эффективности смесей тенала

проводили на белых мышах, экспериментально инвазированных Н. папа. Мышей заражали перорально с помощью шприца, снабженного специальной канюлей, из расчета 100-400 инвазионных яиц на животное. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных цестод и интенсэффективности.

2.1.6. Ограниченный опыт по оценке эффективности тенала (субстанции) и его комбинаций с глнцнном н сернокислой медью прн монне-энозе овец провели в Калмыкии совместно с д.в.н. И.А.Архмповым.

По результатам копроовоскопических исследований флотационным методом отобрали 20 ягнят, спонтанно инвазироваииых Moniezia expansa и М. benedeni. Животных разделили на 4 равноценные группы. Обработку зараженных животных проводили следующим образом:

I группа — тенал + глицин (100*100 мг/кг) перорально однократно.

II группа — тенал -I- сернокислая медь (100+100 мг/кг) перорально однократно.

III группа - тенал в дозе 100 мг/кг перорально однократно.

IV группа - контроль (без обработки).

Эффективность препаратов учитывали по результатам количественных исследований проб фекалий ягнят всех групп до и через 10 суток после введения препаратов.

Расчет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» согласно «Руководству по оценке эффективности антгельминтиков у жвачных (крупного рогатого скота, овец, коз)» (1995). В период испытаний учитывали клиническое состояние животных.

2.1.7. Данные по всем видам исследований обрабатывали статистически по методу Фншера-Стьюдента с использованием t-критерия (Плохинский Н.А., 1969).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Цестодоиндная н нематодоцндная активность ряда соединений из различных химических групп. В целях отбора наиболее эффективных соединений в отношении активности против цестод и нематод провели скрининг 13 замешенных салициловых кислот и производных салнцнланнлндов, 10 бензоднокса-нов, 9 НЗ-гетероциклических производных, 1 соединения из труппы бензтиазола и 1 соединения, производного бензоксазола, предоставленных кафедрой органической химии МГУ и синтезированных в лаборатории экспериментальной терапии ВИГИС (Гаджиева ПИ., МГУ; Мнхайлицин Ф.С., ВИГИС).

Полученные образцы под соответствующими шифрами были испытаны на лабораторных моделях: мышах, зараженных Н. папа и T.spiralis.

2,2.1.1. Оценка цестодоцидиой активности на мышах, зараженных Н. папа. На рисунке 2.2.1.1 представлены результаты испытаний в двух опытах 13 замешенных салициловых кислот и производных салициланилидов на активность против цестод. В качестве препарата сравнения взяли широко известный препарат из данной группы соединений — фенасал.

При гельминтологическом вскрытии кишечника у животных контрольной группы обнаружили взрослых Н. папа, в среднем, в первом опыте 24,7±4,3 экз./мышь и во втором опыте по Зб,8±4>1 экзУмышь.

Наиболее эффективными оказались соединения под шифрами СА-2; СА-3 и СА-4, проявившие 100% активность. Несколько уступали им по эффективности образцы СА-1 и СА-11 (ИЭ соответственно 95,0 и 97,3%); в данном случае интересно отметить, что их активность находилась на уровне препарата сравнения, т.е. фенасала (973%) (рис. 2.2.1.1).

Таким образом, с учетом данных по цестодоцидной эффективности замещенных салициловых кислот и производных салициланилидов и переносимости для дальнейших исследований отобрали соединение под шифром СА-2, получившее впоследствии название тенал.

В таблице 2.2.1.1 приведены результаты испытаний других химических соединений, а именно N,¿-гетероциклических производных и бензодноксанов, на цестодоцидную активность, на той же лабораторной модели, т.е. мышах, зараженных Н. папа.

Из первого ряда соединений можно выделить препараты под кодами МФ-OS/2 (86,03%) н МФ-04/2 (76,8%), проявившие адекватную активность при скрининге против цестод. Эффективность других производных была низкой и колебалась в пределах от 20,94 до 56,9%.

Из класса бензодноксанов 95,4% эффективность против Н. папа в опытах на лабораторной модели проявил препарат МГЗ-1 в дозе 100 мг/кг. Активность других соединений из этого класса не превышала 57%.

Таким образом, из 13 испытанных замешенных салициловых кислот и производных салициланилидов, 3 препарата в дозе 100 мг/кг проявили 100% эффективность против цестод на белых мышах, экспериментально инвазированных Н. папа. Активность против цестод проявил также препарат МФ-05/2 из N,S-гетероциклических производных и препарат МГЗ-1 из класса бензодноксанов.

РИ.Ш1

Таблица 2,2.1,1

Цсстодоцндн»я эффсктимшъ новых М^-гегеропнклнческш производных

Мк/а Препарат Кол-во жи- Дом, Обнаружено 11Э,

вотнш мг/кг нестод, эю. У.

Гетероциклические производные

1 МФ-07/3 6 100 47,2*4,0 0

2 МФ-01/2 6 100 19,1А 1,8 57.3

Контроль 6 - 45,4±3,7 -

3 МФ-02/02 6 100 4б,3±3,7 37,2

4 МФ-03/2 6 100 31,8*3,2 56,9

5 МФ-04/2 6 100 17,1±1,9 76,8

6 МФ-05/2 6 100 10,3±1Д 86,0

Контроль 6 - 73,7±6,8 -

7 МФ-Об/3 6 100 25,3±2,4 20,94

Контроль 6 - 32,0±2,8 -

Бетодноксаны

] МГЗ-1 6 100 2,3*0,3 95,4

2 МГЗ-2 6 100 51,4±3,7 0

3 МГЗ-З б 100 21,2±1,8 57,6

4 МГЗ-4 6 100 32,4±3,5 35,2

5 МГЗ-5 6 100 40,8±3,7 18,4

6 МГЗ-6 6 100 35,2±3,2 29,6

7 МГЗ-7 6 100 27,4*2,7 45,2

8 МГЗ-8 6 100 31,4*2,9 38,0

9 МГЗ-9 6 100 3б,8±3,4 26,7

10 МГЗ-10 6 100 44,3±4,0 11,4

Контроль 6 - 50,0±4,0

2.2.1.2. Оценка нематодоцидпой активности на мышах, зараженных Г. spiralis. При поиске новых препаратов мы также использовали другую лабораторную модель, позволившую провести скрининг соединений на нематодо-цидную активность.

Для данного вида скрининга использовали N.S-гетероциклические производные, бензодноксаны, одно соединение из группы бензтиазола н одно соединение из труппы бензоксазола.

В таблице 2.2.1.2 приведены результаты испытаний указанных соединений на мышах, зараженных Т. spiralis.

Как свидетельствуют представленные данные, ни одно из соединений в дозе 100 мг/кг не проявило 100% нематодоцидной активности.

Из гетероциклических производных наибольшую эффективность против трихинелл проявило соединение под шифром МФ-01/2, показавшее 76,9% активность, и из класса бензодноксанов МГЗ-9, проявившее 78,1%-ный эффект. Эффективность других соединений была низкой (в пределах 49,6-72,0 для гетероциклических соединений и 24,6-75,ЗУ« для бензодноксанов).

Таблица 2.2,1.2

Неметодоцидиаи активность новы» соединений при тршиншез« мышей

Jttn/n Препараты Кол-во ЖМ ПОТНЫ! Дом, мг/кг Обнаружено нематод, иэ, %

NtS-гетероцнкляческяе соединен ня

1 МФ-05/2 6 100 17,0±2,4 72,0

2 МФ-01/2 б 100 14,0±2,1 76,9

3 4 МФ-04/2 МФ-06/3 б б 100 100 19,0±2,5 30,б±4,1 68,7 49,6

5 6 МФ-09/3 МФ-10/3 Контроль б б б 100 100 24,6±2,3 24,0±2,5 60,б±4,7 59,4 60,4

Бешолноксаиы, производные бензтнжмла и беюоксмола

1 2 МГЗ-1 МГЗ-2 б 6 100 100 26,0*4,2 15,0±2,4 57,1 75,3

3 4 МГЗ-9 МГЗ-10 б 6 100 100 13,3*2,2 20,0±2,5 78,1 67,0

5 ВИГ-02 б too 52,8

б ВИГ-01 б 100 76,9

Коктроль 6 - 60,6*4,4 -

5 МГЗ-4 6 100 33,3±4,0 36,3

б МГЗ-5 б 100 39,3±3,6 24,6

7 МГЗ-6 6 too 28,6*3,8 45,4

8 МГЗ-7 6 100 29,0±4,2 44,6

9 МГЭ-8 б 100 36,0±4,0 31,2

Контроль 6 100 S2,3±4,2 -

Таким образом, испытанные препараты из класса бензодноксанов, бензтиазола, бензоксазола и гетероциклических соединений проявили недостаточную эффективность против нематод на лабораторной модели Т. spiralis.

2.2.2. Токсикологическая характеристика тенала. В результате проведенного скрининга в целом 34 соединений нз различных химических классов на цестодоцндную и нематодоцидную активность наиболее подходящей для дальнейших исследований и имеющей вполне реальную основу для практического применения была замещенная салициловая кислота — 3,5-дибромсалициловая кислота. При первичном отборе она проявила 100% эффективность против Н. папа и хорошо переносилась животными. Это соединение и стало основным предметом наших исследований. Оно получило название тенал.

Основным и наиболее значительным фрагментом нашей работы были исследования, посвященные токсикологической характеристике тенала.

2.2.2.1. Острая токсичность тенала при введении в желудок. По результатам опытов, согласно классификации опасности веществ по степени воздействия на организм (ГОСТ 12.1.007-76) тенал относится к 3 классу опасности: LDjo для белых крыс и мышей соответственно 1100 (843+1357) мг/кг и 425 (399+451) мг/кп

Обращает на себя внимание более низкое значение среянесмертельной дозы препарата для мышей по сравнению с крысами: 425 против 1100 мг/кг. На основании этого можно сделать однозначный вывод о наличии видовой чувствительности у мышей к теналу.

2.2.2.2. Острое токсическое действие тенала при нанесении на кожу. LDjo тенала при нанесении на кожу составляет более 5000 мг/кг, и согласно общепринятой классификации (ГОСТ 12.1.007-76) препарат относится к 4 классу опасности.

2.2.2.3. Раздражающее действие на кожу и слизистые. При постановке опытов по определению параметров острой накожной токсичности тенала одновременно оценивали его воздействие на кожу. Как было установлено, обе дозы, 2500 и 5000 мг/кг, были субтоксичесхими.

Препарат не оказывал отрицательного воздействия на неповрежденную кожу ссрыс. Примерно через 10 суток после нанесения препарата кожа покрылась ровным шерстным покровом.

Кроме того, оценили влияние препарата на конъюнктиву глаза при внесении 1% суспензии препарата кроликам. Тенал не проявил раздражающего действия на слизистые глаза кроликов.

2.2.2.4. Кумулятивные свойства тенала. При введении препарата в большей дозе, т.е. 1/10 от LDje (суммарная доза составила 4840 мг/кг) из 20 крыс, находившихся в опыте, через 1 неделю после начала введения пала 1 крыса.

В тоже время при введении дозы 1/20 от LDjo (суммарная доза 2420 мг/кг) падежа крыс не наблюдали.

Поскольку отсутствовала гибель животных, то нам не удалось определить коэффициент кумуляции.

На основании вышеизложенного, тенал можно классифицировать как препарат со слабо выраженной кумуляцией.

2.2,2.5. Подострая токсичность тенала.

Общее состояние н поведение крыс, динамика прироста массы тела, значения массовых коэффициентов

При ежедневном введении тенала в двух тестированных дозах (11 и 1,1 мг/кг массы тела) внешних признаков токсикоза и гибели крыс не наблюдали в течение всего опытного периода.

Еженедельные привесы и конечное значение массы тела, а также процент к исходной массе тела у крыс, которым вводили тенал, в количественном отношении не отличались отданных показателей у контрольных животных.

Массовые коэффициенты органов у животных двух опытных групп колебались в пределах контрольных значений н физиологической нормы для данного вида животных. В частности, значение относительной массы печени у крыс, получавших тенал в дозах 1/100 и 1/1000 от ЬО;о, составило 30,48±3,31 и 32,9810,21 против контрольного значения 33,95±2,93; почек - 6,б7±0,24 и 7,21 ±0,11 против 7,86±0,45 в контроле и сердца - 3,69±0,25 и 3,56±0,12 против 3,74±0,17 в контроле.

Гематологические показатели

В таблице 2.2.2.5.1 представлены результаты определения наиболее информативных гематологических показателей у крыс, получавших тенал в двух дозах, и у контрольных животных.

Таблица 2.2.2.5.1

Влияние тенал« при введении * Л01ЯХ 1! мг/кт/суткн Н 1,1 мг/кг/сутки

в течение 2 месяцев на гематологические показатели крыс (п - 6, р > 0,05)

Показателя П мг/кг/еугка 1,1 мг/кг/сутки Контроль

ГемоглоФая, г/% 9,62+1,74 11,7010,97 10,7711,92

Эритроциты, 10*/им^ 4,39±0,9б 5,8310,52 5,63Ю.88

Тромбоциты, 10^/мм' 152,25124,21 179,25120.19 177,55127,41

Лсйкопнты, К^/им' 5,9011,82 6,7512,00 8,9012,46

Средний объем эритроцитов, мкм* 52,0011,08 51,5010,64 50.5010,50

Гсматокрит, % 22.614,95 30,1712,55 28,4514,46

Среднее содержа* м« гемоглобина в одной эрвтро-цвте, лк 23,2212.07 19,72мл 8 19,2011,38

Средней объем тромбоин-ТОа,мкм* 7.60Ю.47 7,3210,16 7,2010,23

Тромбовдмт, % 0.ШЮ.018 0,13010,012 0,12910,023

Мо/нЬолыия щмни:

Лпмфоакты, % 69.23+0,'»4 69,0013,11 71,0012,86

Эоэякофалы, % 3,25 ±0,47 3.2510,85 2,7510,47

Мопоцнты, % 2^5 ±0,47 4,0010,7 3,00*0,91

Сегмептмиерпые, % 25,2510,47 23.75£М2 23,2513.09

Как следует из данных таблицы, тенал не оказал достоверного влияния ни на один тестируемый показатель.

Биохимические показатели

В таблице 22.2.52 приведены биохимические показатели сыворотки крови крыс, которым вводили тенал в дозах 11 и 1,1 мг/кг, и у контрольных животных.

Таблица 2.2.2.5.2

Влияние тенала в дозах 11 и 1,1 мг/кг/сутки прн введении в течение 2 месяцев на биохимические показатели крыс (о ~ 6, р >

Показателя Имг/гг/сутки 1,1 м(Ук(У«утки Коятром

Обшнй бедок, г/л 45,515,0 S7.7Si3.96 54,513,3

Альбумин, г/л 42,013,19* 30,2514,28 30.015,91

Креатяпим, мкмлль/л 81,2517,58 75.7513,06 68,014,8

Мочевина, ммоль/л 13,2*1,68 12,2711,17 10,5211,08

Глюкоза, ммоль/л 8,1511,23* 5,12±0,92 5,4510,46

Балнрубия, ммоль/л 4,6210,21' 6,6210,45 6,410.61

АЛТ, Е/.1 40,75±2,921 695513.59 64,25*9,87

ЛСТ, ил 132,7512,68* 278.514958 390,5146,65

Щелочимы фосфатам, Е/л 60,2511,93 69,2519.8 52,7511,65

А н алия, Е/л 466,5± 17,40 514,5±Я,55 483,0129,08

* ряшичие между опытной и контрольной группами статистически достоверно (р < 0,05)

При рассмотрении данных таблицы, можно придти к выводу, что введение тенала в дозе 11 мг/кг привело к достоверному снижению активности алании- и аспартатаминотрансфераз н уровня билирубина. Установленное свидетельствует о нарушении функционального состояния печени.

Введение препарата в дозе 1,1 мг/кг не изменило ни один из тестируемых биохимических показателей у животных по сравнению с контролем.

Функциональное состояние почек не претерпело отрицательных изменений при обеих дозах тенала, поскольку уровень креатинина и мочевины был сравним с контрольными значениями.

На основании вышеизложенного, доза 1/100 от 1Л>я> является пороговой; доза 1/1000 от ЦЭзо- недействующей.

2.2.2.6. Оценка тенала на эмбриотоксинеског и тератогенное действие. Поскольку при исследовании эмбриотропного действия тестируемый препарат вводят в дозах, кратных терапевтической, то ввиду отсутствия на момент проведения этих опытов сведений об эффективности тенала на овцах, мы принимали за терапевтическую дозу 100 мг/кг, в которой тенал проявил 100% эффект прн гименолепидозе мышей.

Первоначально тенал тестировали при многократном введении в повышенной терапевтической дозе, а именно превышающей таковую в три раза (300 мг/кг).

Результаты тестирования оказались весьма неутешительными. При введении препарата на 1-6; 7-14 и 15-19 дни беременности гибель плодов соответственно равнялась 31,91±6,87; 62,50±12,5 и 34,37±8,53 против 8,16±3,90% в контроле (р £ 0,05). Эмбрионы погибали на стадии после имплаитапии. Имели место случаи полной внутриутробной гибели плодов.

При дальнейшем тестировании препарата на эмбриотоксическое действие его доза была снижена до терапевтической, т.е. 100 мг/кг, но схема введения оставалась многократной.

Результаты оценки тенала на эмбриотоксическое и тератогенное действие при многократном введении беременным крысам в различные периоды эмбриогенеза в дозе 100 мг/кг представлены в таблице 2.2.2.6.1.

Кратко суммируя приведенные данные, можно заключить, что при введении тенала в период с I по 6 и с 15 по 19 дни эмбриогенеза гибель плодов находилась в пределах контрольных значений; однако масса эмбрионов в эти периоды тестирования была достоверно ниже по сравнению с контролем. При введении препарата с 7 по 14 сутки помимо более низкой массы эмбрионов наблюдалась достоверно более высокая гибель плодов. В целом, можно отметить, что при многократном введении тенала беременным самкам характерно проявление эмбриотоксического эффекта.

Продолжением наших исследований было изменение схемы тестирования препарата, иными словами, многократную схему введения препарата сменили на однократную, выбрав при этом сроки, когда эмбрионы наиболее чувствительны к воздействию чужеродных веществ.

Таблица 2.2.2.6,1

Влияние многократного введения тенала в различные периоды эмбриогенеза в терапевтической дозе (100 мг/кг) на препатальное развитие крыс (п-(;р> 0,05)

Показатели М±в Стадия эмбриогенеза, на которую вводили препарат (сутки)

1-6 7-14 15-19 Контроль

Иредкмпла нгаштопная гибель, % 6,66 ±4,62 8,33 ±5,76 4,76 ± 3,32 4,08±2,88

Постнмплантааиопная гибель, % 3,57 ±3,44 22,72±8,73* 7,50 ±4,06 4Д5±3,0

Общ*» эмбрмояяльняя смертность, % 10,0 ±5,37 29.16i9.47* 11,90±5,05 8,16±3,90

Число случаев колкой внутриутробной гибели 0 0 0 0

Масса плода, г 2,16 ±0,03* 2,03±0,03* 1.95±0,03* 2,47±0,02

Размер плода, см 3,02 ±0,02 2,87±0,03 2,82±0,05 3,00±0,02

Масса плаценты, г 0,55 ±0,02 0,50±0,02 0,54±0,01 0,5 2 ±0,01

Размер плаценты, см 1,55±0.01 1,45±0.02 1,50±0,01 1,46±0,02

Число плодов с внешними и внутренними аномалиями развития - - - -

* различие между опытной и контрольной группами статистически достоверно (р £ 0.05)

Результаты оценки тенала на эмбриотоксическое и тератогенное действие при однократном введении в дозе 100 мг/кг в различные выборочные периоды эмбриогенеза представлены в таблице 2.2.2.6.2.

В данном случае можно с уверенностью констатировать, что гибель, масса и размеры плодов достоверно не отличались от соответствующих контрольных значений.

Таблица 2.2.2.6.2

Влияние однократного введение тенала в различные периоды эмбриогенеза в терапевтической дозе (100 мг/кг)

на пренатальиое развитие крыс (о е 6; р > 0,05)

Показатели М±ш Стадия эмбриогенеза, па которую вводили л репяраг (сутки)

3 « 9 11 Контроль

Предямплаитациокная гибель, % б,98±3,93 б,87±4,64 7,91 ±5,58 7,55±3,66 4,08±2,88

Постнмодантацмояная гибель, % 5,(№3,36 9,7б±4,69 5,41 ±3,45 2,04±!,96 4Д5±3,0

Общая >чбрно1г*льн»я смертность, У* ll.63i4.95 13,57±5,91 12,45 ±6,15 9,43±4.05 8,1б±3,90

Число случаев полной внутриутробной гибели 0 0 0 0 0

Масса плода, г 231 ±0.01 2,41 ±0,064 2,67±0,04 2,35*0,04 2,47±0,02

Размер плодя7 см 2,97±0,01 3^5±0,035 3,39+0,04 2,86*0,02 3.0+0.02

Масса плаценты, г 0,49±0,01 0,51 ±0,92 0,55±0,016 0,5110,01 0,52±0,01

Размер плаценты, см 1,47±0,007 1,51 ±0,02 1,55±0,02 1.4б±0,01 1,46±0,02

Чясло плодов с внешними я внутренними аномалиями раюнтвя - - - - -

Основной вывод, который вытекает из двух видов исследований, представленных в данном разделе, заключается в том, что при многократном введении тенала в отличие от однократного в терапевтической дозе (100 мг/кг) проявляется эмбриотоксическое действие. Во всех случаях препарат не индуцирует развития внешних и внутренних аномалий, т.е. не оказывает тератогенного действия.

2,12.7, Цитогенетическое действие тенала, Еще одной необходимой характеристикой тенала является его оценка на цитогенетическое действие.

Значения основного показателя митотической активности клеток, т.е. митотнческого индекса, при различных периодах экспозиции после введения препарата в дозе, составляющей Уз от ранее установленной LD*» (т.е. 550 мг/кг), колебались от 0,32±0,2б+0,51±0,33% до 0,34±0Д9-И),37±0Д8% в контроле. Иными словами, митотнческая активность в популяции клеток костного мозга крыс не подвергалась изменениям после введения препарата.

Кроме того, тенал не оказывал статистически значимого влияния на процентное число делящихся клеток. Относительное количество клеток на всех стадиях митоза, т.е. в профазе, метафазе, анафазе и телофазе, было сопоставимым с таковыми показателями в контроле. На основании этих данных можно с очевидностью заключить, что тенал не индуцировал патологических изменений митоза и для него не характерно антимитотическое действие.

Приводим результаты оценки тенала на мутагенную активность. Через 24 часа после введения тенала относительное количество аберрантных метафаз составило 0,32±0,17% против 0,37±0,10 % в контроле. Проведение анализа метафаз через 4S и 72 часа не выявило повышения метафаз с аномалиями, и количество аберрантных клеток через вышеуказанные периоды времени составило соответственно 0,41±0,15% и 0,37±0,10% против контрольных значений 0,33±0,12+0,35±0,12%(р>0,05).

В то же время введение цнклофосфамида в качестве положительного контроля привело к резкому увеличению количества аберрантных метафаз до 23,86±3,15% против контрольных значений в пределах от 0,33*0,12% до 0,37±0,10%.

Таким образом, с учетом результатов постановки анафазного теста и определения количества аберрантных метафаз можно придти к заключению, что тенал не обладает антимитотической и мутагенной активностью.

2.2.2.8. Снятие эмбриотоксического действия тенала при комбиниро-ваннам введении с глицином и сернокислой медью, В качестве веществ, снимающих эмбриотоксическое действие тенала, мы апробировали глицин и сернокислую медь.

В первом варианте испытаний комбинацию тенала с глицином и сернокислой медью (1:1) вводили однократно, в выборочные критические сроки эмбриогенеза, но в максимальной дозе, т.е. превышающей терапевтическую в три раза (соответственно таблицы 2,2.2.8.1 и 2.2.2.8.2).

Таблица 2.2.2.8.1

Влияние однократного введения емесн тенала с глицином (1:1) в различные периоды эмбриогенеза в трехкратной терапевтической дозе _(300 мг/кг но теналу) на пренатальное развитие крыс_

Показатели Стадия эмбриогенеза, на которую вводили препарат (сутки)

3 « 9 Контроль

Преднмплантацнонная гнбель, % 7,50*4,20 6,15*3,19 5,00*2,81 6,12*3,45

Постнмпламтаиион ная гибель, % 5,40±3,61 7,31*3,61 8,14*4.05 6,52*3,56

Обшая эмбриональная смертность, % 13,17*5,14 11,62*4,45 14,38*4,51 1224*4,73

Число случаев полной внутриутробной г и беля 0 0 0 0

Масса плода, г 2,62*0,04 2,70*0.05 2,67*0,03 2,80*0,05

Размер плода, см 3,21*0,05 3,00*0,08 2,89*0.06 3,10*0,03

Масса плаценты, г 0,58*0,02 062±0,02 0,66*0,03 0,57*0,02

Размер плаценты, см 1,52*0,03 1,62*0,02 1,67*0,04 1,65*0,02

Число плодов с внешен мн и внутренними аномалиями развития - - - -

Таблица 2.2.2А2

Влияние однократного введения смеси тенала с сернокислой медью (1;1) в ршнчные периоды эмбриогенеза в трехкратной терапевтической лозе _(300 мг/кг по теналу) на преяатальное развитие крыс_

Показатели Стадия эмбриогенеза, на которую вводили препарат (сутки)

3 « 9 Контроль

П реднмп лантаонопная гибель, % 8,36*4,17 6,49*3,22 7,17*4,06 6,12*3,45

Постн м плантационная гибель, % 6,38*3,36 8,16*4,33 10,40*5,12 6,52*3,56

Обшая эмбриональная смертность, *А 12,50*4,45 14,22*3,60 16.52*4,92 12,24*4,73

Число случаев полной внутриутробной гибели 0 0 0 0

Масса плода, г 2,70*0,02 2,68*0,02 2,76*0,04 2,80*0,05

Размер плоя», см 3,12*0,04 ЗД 1*0,03 3,0+0,06 3,10*0,03

Масса плаценты, г 0,60*0,02 0,58*0,02 0,64*0,03 0.57*0,02

Размер плаценты, см 1,67*0,04 1,56*0,02 1,60*0,04 1,65*0,02

Число плодов с внешними н внутренними аномалиями развилин - - - -

Следующей схемой тестирования комбинаций тенала с глицином и сернокислой медью (1:1) было многократное введение в различные периоды эмбриогенеза, но уже в терапевтической дозе, т.е. 100 мг/кг. Результаты приведены в таблицах 2.2.2.8.3 и 2.2.2.8.4.

Таблица 1.2.2.8.3

Влияние многократного введения смеси теиала с глвцвном (1:1) в различные периоды эмбриогенеза в терапевтической до» (100 мг/кг по теналу) на пренатальное развитие крыс

Показатели Стадия эмбриогенеза, на которую вводили препарат (сутки)

1-6 7-14 15-19 Контроль

Лреянмплантацнон> ная гибель, % 4,34 ± 3,03 4,25 ±2.97 4,36 ± 3,32 6,12±3,45

Постимплантацион-иая гибель, % 4,54 ±3,14 б,66±3,67 4.65 ±3,11 6,52±3.56

Обшав эмбриональная смертность, *А 8,69 ±4,19 10,63±4,54 9,12±4.37 12Д4±4,73

Число случает полной внутриутробной гибели 0 0 0 0

Масса плода, г 3,04 ±0,06 2,81 ±0,11 2,93±0,03 2,80±0,05

Размер плода, см 3,23 ±0,06 3,13*0,10 3,Э7±0,03 3,1040,03

Масса плаценты, г 0,73 ±0,03 0,5310,02 0,67±0,02 0,57±0,02

Размер плаценты, см 1,5б±0,02 1,52±0,05 1,55±0,02 1,65 ±0.02

Число плодов с внешними н внутренними аномалиями развитая - - - -

Таблица 2.2.2.8.4

Влияние многократного введения смеси теиала с сернокислой медью (1:1) в различные периоды эмбриогенеза в терапевтической дозе (100 мг/кг по теналу) _ на пренатальное развитие крыс_

Показатели Стадия эмбриогенеза, па которую вводили препарат {сутки)

1-6 7-14 15-19 Контроль

Препнмллантациониая гибель, % 3,27 ± 2,29 4,00 ±2,79 3,92 ±2.12 б,12±3,45

Постнмплантацнонная гибель, */* 3,38 ±2,33 4,16±2,85 3,56 ± 2,23 6,52±3,56

Общая эмбриональная смертность, % 6,55 ±3,19 8,00±3,87 7,00±3,22 12,24±4.73

Число случаев полной внутриутробной гибели 0 0 0 0

Масса плода, г 2,71 ±0,07 2.70±0,13 2.82±0,03 2.80±0,05

Размер плода, «м 3,22 ±0,05 3,16±0,10 3,25±0,05 3,10±0.03

Масса ллаиенты, г 0,59 ±0,02 0^5±0,03 0,57±0,02 0,57±0,02

Размер плаценты, см иб±о,оз М5±0,04 1,65±0.02 1,65 ±0,02

Число плодов с внешними н внутренними аномалиями развития - - - -

В таблицах 222.8.5 и 2.2.2.8.6 представлены результаты еще более жесткого тестирования комбинаций теиала с глицином и сернокислой медью (1:1) при их многократном введении в трехкратной терапевтической дозе, т.е. 300 мг/кг.

Таблица 2.2.2.8.5

Влияние многократного введения смеси тенала с глицином (1:1) в различные периоды эмбриогенеза в трехкратной терапевтической дозе (300 мг/кг по теналу) _ на пренатальиое развитие крыс_

Показателя Стадия эмбриогенеза, на (с которую вводили препарат тки)

1-6 7-14 15-19 Контроль

Предн мплантационная гибель, % 6,72*3,45 6,89*3,32 5,87*3,45 6,12*3,45

Постнмплантационная гнбель, % 5,55*3,03 8,77*3,71 6,73*3,21 6,52*3,56

Общая эмбриональная смертность, % 12,06*4^1 15,51*4,75 12,21*4,77 12^4*4,73

Число случаев полной внутриутробной гибели 0 0 0 0

Масса плода, г 2,72*0,05 2,68±0,03 2.76*0,05 2.80*0,05

Размер плода, см 3,36*0,05 3,15*0,05 3,40*0.05 3,10*0,03

Масса плаценты, г 0,55±0,02 0,59*0,02 0,56*0t02 0,57*0,02

Размер планенты, см 1,65*0,03 1,56*0,02 1.62*0,03 1,65±0,02

Число плодов с внешними и внутренними аномалиями развития - - - -

Таблица 2.2.2.8.6

Влияние многократного введения смссн теняля с сернокислой медью (1:1) в различные периоды эмбриогенеза в трехкратной терапевтической дозе _(300 мг/кг по теналу) на пренатальное развитие крыс_

Показатели Стадия эмбриогенеза, яа (С! которую вводили препарат >>ткн)

1-6 7-14 15-19 Контроль

Преднмплантаинонная гибель, V* 7,14*3,47 7.55*3,19 6,75*3,56 6,12*3,45

Постнмплантационная гнбель, % 5,76*3,14 12,52*3,96 6,88*3,12 6,52*3,56

Общая эмбриональная смертность, % 12,50*4,45 18,39*4,77 13,12*4,3! 12,24*4,73

Число случаев полной внутриутробной гибели 0 1 0 0

Масса плода, г 2,74*0,02 2,62*0,03 2,70*0.05 2,80*0,05

Размер плода, см 3,04*0,08 3,10*0,09 3,30*0,05 3,10*0,03

Масса плаценты, г 0,55*0,02 0,62*0,03 0,54*0,02 0,57*0,02

Размер плаценты, си 1,56*0,04 1,68*0,02 1,65*0,03 1,65*0,02

Число плодов с внешними н внутренними аномалиями развития - - -

Интересно отметить еще один момент. Как уже указывалось выше, эм-бриотоксическое действие тенала проявлялось за счет повышенной смертности эмбрионов на стации после имплантации. Во всех случаях применения препарата в комбинации с глицином и сернокислой медью (однократное или многократное введение) показатели гибели эмбрионов на данной стадии развития эмбрионов не превышали контрольных значений. Иными словами, в данном случае была устранена причина проявления данного побочного эффекта.

Как и при введении одного тенала, отсутствовали внешние и внутренние аномалии развития.

Таким образом, при однократной и многократной схеме тестирования глицин и сернокислая медь «снимают» эмбриогокснческое действие тенала при применении последнего в терапевтической н трехкратной терапевтической дозах.

2.2.2.9. Краткая токсикологическая и терапевтическая характеристика композиций тенала с глицинам и сернокислой медью.

2.2.2.9.1. Изучение параметров острой токсичности композиций тенала с глицином и сернокислой медью проводили, как и с самим теналам, на крысах и мышах. При очень краткой интерпретации полученных данных можно отметить, что совместное введение тенала с глицином и сернокислой медью крысам практически не привело к усилению токсических свойств по сравнению с одним препаратом: соответственно 925 (782+1068) и 860 (717+] 003) прошв 1100 (843+1357) мг/кг для одного тенала.

Однако при оценке острой токсичности на мышах комбинации «повели» себя по-разному. Токсичность смеси тенала с глицином практически не изменилась по сравнению с самим теналом, так, ЬО» смеси составила 391 (345+437) против 425 (399+451) мг/кг для одного тенала.

В то же время среднесмертельная доза композиции тенала с сернокислой медью равнялась 275 (237*313) против 425 (399+451) мг/кг; иными словами токсичность препарата в смеси с сернокислой медью явно усилилась, о чем свидетельствуют не только значения но и доверительных интервалов.

2.2.2.9.2. Определение цестодоцидной активности композиций тенала с глицином и сернокислой медью. При вскрытии у животных контрольной группы обнаружили в среднем 42,7±4,8 экзУмышь взрослых Н. папа. Введение обеих комбинаций, т.е. тенала с глицином и сернокислой медью, привело к полной элиминации паразитов из кишечника. Иными словами, эффективность испытанных комбинаций составила 100%.

2.2.2.10. Первичное испытание тенала и его композиций с глицином и сернокислой медью при мониезиозе овец. В программу наших исследований входило испытание тенала (который мы рассматриваем в качестве субстанции) и его смесей на цестодоцидную активность, а именно при мониезиозе овец; исследования проводили в сравнении с известным цестодоцидным средством и аналогом — фенасалом.

Несмотря на довольно ограниченный характер данных исследований, особенно в отношении тестируемых доз, их целью была апробация антгель-минтной эффективности самого тенала и сравнительная оценка его комбинаций с глииином и сернокислой медью.

Сам тенал в дозе 100 мг/кг проявил 100% эффективность против моние-зий у ягнят.

При испытании комбинаций тенала с глицином и сернокислой медью также было получено высокое цестодоцкдное действие на уровне 100%.

Таким образом, установлено, что композиции тенала являются высокоэффективными при одном из наиболее распространенных цестодозов овец -мониезиозе и в этом отношении не уступают самому теналу.

С учетом результатов оценки токсических свойств и цестодоцидной эффективности считаем вполне реальной перспективу применения указанных композиций в качестве лекарственных средств для ветеринарии, а сам тенал — субстанции для их производства.

Выводы

1. На мышах, зараженных Hymenolepis папа, из 13 замешенных салициловых кислот и производных салициланнлндов три (СА-2; СА-3 и СА-4) проявили 100% эффективность; из 7 N.S-гетероци клическ их производных наиболее активными были два соединения на уровне 76,8-86,0% (МФ-04/2 и МФ-05/2) и из 10 бензодиоксанов только одно соединение (МГЗ-1) было активно на 95,7%,

2. На мышах, зараженных Trichinella spiralis, из 6 НЗ-гетероциклическнх производных наилучшую эффективность на уровне 72,0 и 76,9% проявили два соединения (МФ-05/2 и МФ-0,1/2); из 9 тестированных бензодиоксанов только два соединения (МГЗ-9 и МГЗ-2) были активны соответственно на 78,1 и 75,3%.

3. LD» тенала при введении крысам и мышам в желудок составляет соответственно 1100 (843+1357) и 425 (399-^-451) мг/кг. Для мышей характерна видовая чувствительность: тенал для них более токсичен. Согласно установленным параметрам на двух видах животных тенал относится к 3 классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76).

LDjo тенала при нанесении на кожу крысам превышает 5000 мг/кг (4 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76)

4. Тенал не оказывает раздражающего действия на неповрежденную кожу крыс и слизистые глаза кроликов.

5. Препарат обладает слабо выраженной кумуляцией. При введении тенала в дозах 11 и 1,1 мг/кг/сутки в течение двух месяцев первая доза является пороговой; доза 1,1 мг/кг/сутки — недействующей.

6. При многократном введении тенала крысам-самкам в дозах 100 и 300 мг/кг (терапевтической и в три раза повышенной дозах) в период 1-6; 7-14 и 1519 сутки беременности препарат оказывает эмбриотоксическое действие. При однократном введении препарата крысам-самкам в критические сроки эмбриогенеза (3; б; 9 и 11 сутки) в дозе 100 и 300 мг/кг (терапевтической и в три раза повышенной дозах) эмбриотоксическое н тератогенное действие не проявлялось.

7. При однократном и многократном введении тенала крысам-самкам в комбинации с глицином и сернокислой медью (1:1) в дозах 100 и 300 мг/кг на 1-6; 7-14 и 15-19 дни беременности эмбрнотоксическое действие не проявлялось.

8. В анафазном тесте при введении в дозе 550 мг/кг( 1/2 от LD») препарат не оказал отрицательного влияния на митоз клеток костного мозга крыс.

В метафазном тесте при введении в дозе 550 мг/кг (1/2 от LDjo) тенал не проявил мутагенной активности в популяции клеток костного мозга крыс.

9. LDjo комбинации тенала и глицина для крыс и мышей при введении в желудок равняется соответственно 925 (782-И 068) и 391 (345+437) мг/кг (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76).

LD50 комбинации тенала и сернокислой меди при пероральном введении крысам и мышам составляет соответственно 860 (717-Н003) и 275 (237+313) мг/кг (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76).

10. Комбинации тенала с глицином и сернокислой медью проявили 100% эффективность против Н. папа на мышах в дозе 100 мг/кг.

11. Композиции тенала с глицином и сернокислой медью (100 + 100 мг/кг) обеспечили 100% эффективность при введении овцам, зараженным мо-ннезиями, и не уступали самому теналу (100 мг/кг).

Практические предложения

1. На основе результатов скрининга на лабораторной модели 3,5-дибромсалициловая кислота предлагается для применения в качестве субстанции цестодоцидных препаратов.

2. Предлагаются добавки для усовершенствования тенала с целью снятия его побочного эмбриотоксического действия.

3. Рекомендуется применять комбинации тенала с глицином и сернокислой медью в качестве лекарственных средств при мониезиозе овец.

4. Разработаны «Методические указания по применению композиций тенала с глицином и сернокислой медью при мониезиозе овец».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ковешннкова Е.И., Архипов ИЛ., Гаджиева П.И., Мочалов С.С., Зефиров Н.С. Цестодоцидная активность новых соединений из класса салнцнлани-лидов//Материалы докладов науч. конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М., 2003, вып. 4, с. 189-190.

2. Архипов И.А., Ковешникова Е.И., Гаджиева П.И. Мочалов С.С., Зефиров Н.С. Антгельминтная эффективность тенала при мониезиозе овец в опыте «Контрольный тесг»//Материалы научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПБГВМ, 2004, с. 8-9.

3. Ковешникова Е.И., Архипов И.А., Трусов С.Н., Севбо Д.П., Мнхайли-цын Ф.С, Изучение трихинеллоцидной активности препаратов ряда беизтиазола и бензоксазола//Мед. паразитол. и паразитарн. болезни, 2004, № 3, с. 38-39.

4. Ковешникова Е.И. Кумулятивное действие тенала//Материалы докладов науч. конференции «Теория н практика борьбы с паразитарными болезнями», М., 2006, выл. 7, с. 175-176.

5. Ковешникова Е.И. Изучение острой токсичности тенапа//Материалы докладов науч. конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М., 2006, вып. 7,с. 176-178.

6. Ковешникова Е.И. Подострая токсичность тенала//Материалы докладов науч. конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М., 2006, вып. 7, с. 178-180.

7. Ковешникова Е.И. Цитогенетическая активность тенапа//Материалы докладов науч. конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», М., 2006, вып. 7, с. 180-182.

8. Ковешникова Е.И. Токсикологическая характеристика тенала//Труды ВИГИС, М., 2006, т. 43, с, 132-137.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД№ 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 24.04.07. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,63 Печать авторефератов (095) 730-47-74,778-45-60