Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анатомия микобактерий туберкулеза в норме и в условиях применения новых методов патогенетической терапии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анатомия микобактерий туберкулеза в норме и в условиях применения новых методов патогенетической терапии"

Г8/-0 г 8'1 '

I

Госкомитет РСФСР санэпиднадзора МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМ.Г.Н.ГАБРИЧЕВСКОГО

На прао&х рукописи

ЛЕВЧЕНКО Татьяна Николаевна

АНАТОМИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА В НОРМЕ И В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ МЕТОДОВ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москпа - 1992.

Работа оылолмена п Московском научно-исследовотв! Ском институте туберкулеза МЗ РСФСР и Научно-исследовательском институте эпидемиологии микробиологии им. Н.Ф.Гамплеи.

Научные руководители:

доктор медицинских наук В.М.Должанский доктор биологических наук В.J1.Попоо

Офици«зльные оппоненты:

доктор медицинских наук Ссмеиооа Л.П. доктор медицинских наук, профессор Ерохин В

Ведущая организация: Научно-исслсдопательск! институт вакцин и сызороток им.И »И. .Мечников,

Защита диссертации состоится "¿.3" /У 1992г. о ^ на заседании специализирооанного сооето К 084 • 10 Московского научно-исследооатсльского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричеоск< Госкомитета РСФСР санэпиднадзора по адресу: 1252! Москоа, ул.Адмирала Макарооа, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

7/ Г

Автореферат разослан "<d'" >f/_ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

кандидат медицинских наук о.Н. Ермрлен!

гащ-З

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время туберкулез сохраняет значительный удельный в группе инфекционных заболеваний. Это подтверждают неблаго-учныс цифры эпидемиологического и эпизоотологического плана, для ряда регионов нашей страна, так и для развивающихся стран, этом свидетельствуют и терапевтические неудачи во вполне квали-ироаанных клиниках (А.Г.Хоменко, 1975, 1981; В.Я.Сагалович, . Должанский, 1984, М.С.Беленький, Л.А.Лукьянов, 1980).

Однако, вышесказанное не значит, что ресурсы терапии туберкуло-полностью исчерпаны и всякая исследовательская работа в данном екте бесперспективна. Работами школи А.Г.Хоменко и его сотрудии-доказана высокая пластичность микобактерий туберкулеза, их ве-ационнан способность, что убеждает в целесообразности поиска но-путей лечения, с обязательным изучением морфофункционгльнкх, энений микробных клеток после воздействия лечебных факторов . Хоменко, 1981).

Проблему эффективного лечения туберкулезных процессов, преду-кдения осложнений,' Изменений возбудителя заболевания туберкуле-невозможно решить без комплексного исследования морфофункцио-ьной организации микобактерий туберкулеза.

Особое внимание привлекает изучение механизма воздействия на )бактерии туберкулеза всех используемых медикаментозных средств ¡тодов, то есть повреждающих факторов физической, биологической шической природы, применяемых в клинической практике.

К ним, в частности, относятся биологические антиоксид^нты и :оэнергетичеекое лазерное излучение, используемое н клиникз ¡Т. В клинической практике применяются преимущественно Л- токо-

форол и его синтетический аналог дибунол с хорощими.результатами. (В.Д.Пушкарева, 1Э68). Помимо предупреждения формирования избыточной соединительной ткани, .содействия более полноценному заживлению воспалительного очага, а - токоферол обладает и бактериостатической активностью (Е.В.Старостенко, Н.А.Смирнова, А.М.Салпагаров, 1989, Г.М.Сардалы, Л.И.Калинина, У.К.Лликперов, 1983). Однако, механизм его действия а, гласное, структурные изменения самого возбудителя, происходящие при этом, но изучены.

За последнее десятилетие заметно активизировалось использование света низкоэнергетических лазеров в лечебных целях. Экспериментальными и клиническими исследованиями установлено, что низкоинтексивное излучение гелий-неонового лазера (ИГНЛ)оказывает противовоспалительное действие, нормализует трофику, стимулирует регенерацию тканей и местный иммунитет (Н.в.Гамглей, 1972, С.Н.Садовый, Л.В. Казаков, Г.К. Бадалов, 1986, Н.И.Штельмах, 1983). .

Во фтизиатрии ИГКЛ не нашло еще достаточно широкого применения, что можно объяснить отсутствием' единого мнения у• немногочисленных исследователей, занимавшихся изучением влияния красного лазерного, света на возбудитель туберкулезного заболевания, полностью не изученной является проблема механизма влияния лазерного красного света на анатомию микобактерий.

Цель настояаего исследования.

Комплексное изучение ультраструктурной организации МБТ с применением современных методов ка новом методическом уровне электронной микроскопии как в норме, так и под действием некоторых терапевтических физических и химико-биологических факторов.

Задачи исследования.

С помощью совремегМ&лх методов электронной микроскопии: высоковольтной. просвечивающей, раптровей, метода криоультратомии изучить

анатомию МВТ в норме и в условиях воздействия биологических Фантороз зиворотки больних, получавших токоферол или дибунол.

Изучить действие сыворотки крови больных, получавших биологические антноксздэнты, на жизнеспособность МВТ.

Изучить анатомию МБТ в условиях воздействия излучения гелий-кео-ювого лазера (ИГНЛ).

Оценить эффективность влияния ИГНЛ на жизнеспособность МБТ штам-дов HJ7RV и чувствительного к лекарственным препаратам штамма 8926, зыделенного от больного и провести изучение вирулентности МБТ, облу-<енных ИГНЛ, для лабораторных животных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уточнены морфометрические параметры ультраструктурных элементов МБТ при использовании криоультратомической методики подготовки 1репаратов.

2. Установлено повреждающее действие сыворотки крови больных пос-1в введения им ОС- токоферола и дибунола на анатомию и биологические :войства возбудителя туберкулеза.

3. Доказано, что низкоэнергетическое излучение гелий-неонового тэера в изученных тёрапезтических режимах- нарушает ультраструктур-tyw организации возбудителя туберкулеза, снижает интенсивность его >оста на искусственных питательных средах и степень вирулентности У1Я чувствительных лабораторных животных.

Научная новизна.

Принципиально новым является то, что впервые при использовании ютода криоультратошш при изучении улътрастручтурной организации !БТ выявлены ранее не описанные структуры конусообразной и глсбуло-)бразной формы, го есть различные по своей конфигурации у вирулент-1ых и авирулентных штаммов, Возможна связь указанных структур с сэ-1ержаниек антигенов и корд-фактора в бактериальных клетках.

Доказано повреждающее действие сыворотки крови больных,получавип биоактиоксиданты, на ультраструктуру МБТ.Бактериостатическая активно' сыворотки крови больных, получавших к - токоферол, достигала максим; ыа к 40 минутам инкубации.

По способу лечения инфильтративного .туберкулеза легких получено авторское свидетельство 1577795 от 1990 р. на изобретение.

Установлена биологическая активность ИГНЛ в отноизнии ИБТ о раз ми биологическими свойствами. Степень анатомических изменевий ультра структур МБТ коррелировала с нарушением других биологических свойств интенсивностью роста на питательных средах, и вирулентностью.

Установлена прямая зависимость степени анатомических нарушений времени воздействия квантового излучения гелий-неонового л

зера.

Практическая значимость.

Полученные данные существенным образом дополняют и по-новому об ясчяют действие биологических антиоксидантов в качестве противотубер кулезных препаратов при лечении этого заболевания.- Получены новые да ные, касающиеся интерпретации действия антиоксидантов в качестве ком нентов терапии, используемой при лечении инфильтративного туберкулез

Установлено бактерирстатическое действие ИГНЛ (ЛГ-75) на ЫБТ tip изученных режимах воздействия, что подтверждает необходимость примен ния квантового излучения при клинических показаниях.

Выполненная работа решила актуальную научную проблему по исслея ванию ульграструхтурной организации микобактерий с разными биилогиче кими свойствами з норме и при воздействии на них сыворотки крови бол Нмх.получаьших биологические актионсиданты - К - токоферол или диб> нол, а такяэ при воздействии излучения низкоэнергетического гелий-нс нового лазера - ЛГ-75 в разных диапазонах непосредственно на культуру КВТ.

Полученные в процессе выполнения исследования данные по ультра-зтруктурным изменениям микобайТерий верифицировали стандартными микро-5иологическиии методами: определением бактериостатическпй активности фови больных,характеристикой макроростр микобактериальных колоний на потных питательных сродах и изучением Ечрулентности интачтных и под-¡ергшихся воздействию низкоэнергетического кван-гопого излучения культур возбудителя туберкулеза.

Данные исследования используются б учс-бних педагогических процес-:ах при обучении студенчов, ординаторов, аспирантов и практикующих вра-1ей в Московском НИИ туберкулеза !,'3 РСФСР, Центральной НИИ туберкулеза ,МН, на кафедре патологической анатомии Московского стоматологического шетитута им. Н.А.Семашко, на кафедре дртиьиспульмэчологии Московской :едицинской Академик, о чем имеется соответствующая документация.

Результаты работы кавди отражения е следующих документах: Методи-сские рекомендации № ЙТ-Ов/П-^бб."Способ лечения ипфильтративного ту-еркулеза легких", ИЗ. РСФСР, 1990.

вторское свидетельство на изобретение I? 1577795 "Способ лечения ин-ильтративного туберкулеза легких".

Апробация работы.'

Основные положения диссертации доложены .на: научных конференциях 1990, 1991 в Московском НИИ туберкулеза, на межлабораторней конферен-ии НИИЭМ им. К.Ф.Гамалеи 1990 , на X Всесоюзном съезде Фтизиатров & . Киеве 1980 ,' на У1 Всероссийском съездо фтизиатров в г.Кемерово [987 , на Международном симпозиуме по лазерной хирургии к медицине £ .Самарканде 1988 , на ХШ Всесоюзной конференции по электронной микро-{опии в г.Звенигороде 1986 , на обществе микробиологов-фтизиатров в .Москве 1989 . По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания иатч-1ала и методов исследования, собственных данных, изложенных в 3' ГА&-

•ос, заключения, выводов и библиографии, содержащей 101 наименование ..:ечествекных и 126 - иностранных авторов. Объец диссертации составля-162 страницы машинописи, -диссертация иллюстрирована таблицами ,гр&-. :икеыи, электроннограммами. .

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Для выполнения поставленных задач з работе были использованы комплексные методы исследования.

В работе использовали двухнедельные штаммы ЫБТ: вирулентный^?^ вакцинный штамм BCG, чувствительный штамм 8926, полученный от больного. Микобактерии культивировали на плотной питательной среде Левенштейна-Кенсека или жидкой питательной среде Сотона, изготовленных по классическим прописки.

Препарирование осуществлялось различными способами в зависимости от использования того или иного метода электронной микроскопии.

В основном, препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе jlm - 100 В (Япония). Длк описания структур микроколоний применялся сканирующий электронный микроскоп Hitochi - s 405 А Япония . В отдельных опытах использовался высоковольтный электронный микроскоп JEM - 1000 В (Японии). • ;

Основная масса информации была получена-на трансмиссионном микроскопе, что позволяло сопоставлять результаты с данными, приводимыми другими исследователями.

Для исследования в трансмиссионном электронном микроскопе осадок г.икобактерий префиксировали 2,5% раствором глутарозого альдегида :'пгс1- на 0,2 М какодилатном буфере рн 7,2 - 7,3. Далее материал пролили по иетодике A.Ryter, E.Kellenberqer (195В).заЛИВПЛИ В ЭПОКСИД-

':молу Араядит М.. Ультратонкие срезы получали на ультратоме^кн-овоо

¡Швеиия). Срезы контрастировали по методу цв1поЫв (1963). Для съем-'.и объектов использовали фотопластины типа МР для ядерных исследова-мй производства Московского завода фотопластин.

Кроме описанного выше рутинного метода препарирования, нами опер-)ые в практике изучения МБТ использовался метод криоультрамикротомии, соторый позволяет исключить процессы двойной фиксации, обезвоживания 1 заключения в эпоксидные смслы, в ряде случаев приводящие к появлз-1ию артефактов. В качестве криопротекторов были использованы 10% раст-юр этиленгликоля с последующим -замещением 3% поливиниловым алкоголем 30-88/02 КЕВО,'Швеция).

После криопротекции осадок МБТ погружали в предварительно пере-1хлажденный азот (- 203° С). Ультракриосрезы получали на ультратоме кв - 4802 А с криоприставкой Сгуоки - 14800 (Швеция). Срезы чон-растировали 2% водным раствором фосфорноЕольфрамовой кислоты или I-% раствором уранилацетата.

Для просмотра на. сканирующем электронном микроскопе после проводи МБТ по методу д.ЯуЬвг, Е.квПепЬегдсг (1958), осадок подвергали ёгидратации в растворах ацетона возрастающей концентрации, затем ма-ериал высуживали методом обхода критической точки в жидкой С02 . Пре-араты напыляли в ионном напылитаче Е^ко-З (Япония) коллоидным золо-ом или палладием.

Для высоковольтной электронной микроскопии микобактериальную звесь с помощью микропипетки наносили на поверхность сеточки, покры-эй формваровой пленкой. После высыхания сеточек проводилось контрас-ирование по методу 11е1по1<18 (1963).

Для эксперимента с воздействием на МБТ излучения гелчй.-кеоковогэ азера применялся лазер ЛГ-75 с длиной волны 0,63 мкм и мощностью изучения 29 мВТ. Микобактериальные взгеси подвергали облучения гелий-зоновым лазером в стерильных чашках Петри.

С целью изучения вирулентности МВТ, подвергшихся воздействию ИГНЛ, исследовали вихиваеность морских свинок после заражения .их МВТ,облученными гелий-неоновым лазером.' Заражение животных осуществляли подкожным введением в область бедра задней лапы 0,1 мг культуры М5Т в 0,5 мл физиологического раствора.

Учет результатов проводился еженедельно в течение трех месяцев, оценивали величину и консистенцию паховых лимфатических узлов,туберкулиновые пробы, прибавку животных ь весе, выживаемость, распространенность поражения внутренних органов по данным аутопсии.

При изучении воздействия сыворотки крови лиц, получавших к -токоферол или дибунол, на МВТ обследовали больных стационара, не получавши» антибактериальных препаратов, до и после введения антиоксидантов (23 человека). Отделяли сыворотку от сгуста форменных элементов, сыворотку омешизали с культурой МВТ до получения нужной концентрации. После задан ной экспозиции, образцы центрифугировали, отмывали осадок и производили дозированные посевы на плотные питательные среди Левенштейна-Иенсена и Финн - 2. ,

Все результаты и морфометрические данные были обработаны статистически с применением критерия Стыодента и величины Р. Для определения ультраструктурных параметров клеток использовали теетсистем'ы, изготовленные на прозрачной пленке (Г.Г.Автандилов-, 1973).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Электронная микроскопия оказала существенную помощь в расшифровке зи:ологии и патогенеза многих патологических процессов, нозологических единиц, раскрыла перед исследователями возможности проведения дифференциальной диагностики заболеваний, выявила тесные связи иезду биохимичес

лик процессами и состоянием ультраструктур клетки, дала начало иово-направлении в микробиологии-анатомии микроорганизмов.

В наших исследованиях чикобактериаяьнче колонии как вирулентного гамма Н37яу , так И вакцинного РСС несли на своей поверхности лиг.ид-ый капсульный покров, но у вирулентного штамма он был более мощным.

Этот покров может бить удзлзн с повеохнэсти микобактериальной элонки детергентами, и тогда при исследовании з сканирующем электрон-эм микроскопе становятся видны отдельные клетки. У вирулентного ятам-а они обычно упакованы более тесно, в то вр^дя как у вакцинного шам-а наблюдается более ры\лое расположение клеток в Колонии.

На поверхности одиночных «теток обычно располагается тонкий фиб-ялляркый слой, умеренно плотный для электронен, который обычно спиеы-злея как микрокапсула. Поэтому подлежащий слой, прозрачный для элек-ронов, трактовался как наружный слой клегсчноП стенки.

Однако, если клетки МБТ расположены группой, то возникает совсем Лая картина. В этих случаях ясно видно, что фибриллярный слой, плотей для электронов, ясляется только внутренней частью обскрчого яокро-1, "одевающего" всю группу клеток. Подобная структура четко и хоропо росматривается и после лазерного облучения микобактериальнах колоний, эгда происходит разрушение покрова, но тем не менее ясно ввдне, "то я является обща одновременно для нескольких клеток.

Если принять такую трактовку капсульного покрова,то слой.прозрач->1Й для электронов, располагавшийся под ним (между ним и клеточной генкоП), должен содержать материал микрокапсулы. И в этой капа точза рения совпадает с интерпретацией А.А.Ецянко, 1972.

Результаты исследований ультратоккчх срезов совпадают с данными, мученными при исследовании целых клеток в высоковольтном алехтрон-эм микроскопе. - ,

В одной из наиболее поздних, рабст по анатоиии микобакгериЯ

ко1ь«1 и.к.,1982, пишет об этом слое как о липидном-капсульном покрове. На разделяем точку зрения последнего автора й в дальнейшей определяем данную структуру как липидный. капсульный покров. ' •

4

При изучении ультраструктуры МБТ методой криоультрамикратомив. в котором не используются процедуры обезвоживания и .заключения в эпоксидные смолы, то есть клетки исследуются в состоянии, наиболее приближенном к прижизненному, было обнаружено, что микобактерий снаружи покрыты толстым прозрачным для электронов слоем.

Сравнительный анализ электроннограмм, полученных отим методом, а также методом зысоковольтной электронной микроскопии и сопоставление этих данных с результатами исследования в сканирующем электронном микроскопе привел нас к выводу о том, что этот слой является липидным капсульный покровом. В связи с этим мы должны несколько изменить интерпретацию данных, опубликованных в навей ранней работе(Н.А.Переверзев, Т.Н.Левченко, 1985). Описанные нами глобулярные образования у клеток штамма всс и конусообразное структуры у клеток итаммаю7ну располагаются в капсульнсм покров-з, но образуются, вероятно,' клеточной стенкой и затем от нее отделяются.

Снаружи клетки МБТ ограничены клеточной стенкой, которая устроена по типу клеточной стенки грамположительных бактерий (фирмйкутов). При исследовании в просвечиванием электронном микроскопе она имеет, гомогенное строение, однако иногда в ней можно различить несколько слоев.

Вопрос о количество слоев клеточкой стенки микобактерий является предметом дискуссии в литературе.

При исследовании МБТ методом криоультрамикротомии клеточная стенка определялась нами как гомогенная однослойная структура. Л.Н.Кац, 1971, Л.Н.Кац, Н.Д.Константинова, 1985, отмечают, "то молодые особи микобактерий имеют внутренний слой клеточной стенки, который, тесно прилегая к цитоплаэматической мембрана, образует с ней единую линию. При исследовании в просвечиванием электронном микроскопе в местах отделения клеточ

ной стенки от цитоплазматической мембраны или в местах плазмолиза у лиэи-рованных клеток отмечается трехслойная клеточная стенка. Фактически аналогичную наблюдавпейся нами структуру клеточной стенки вирулентного штампа микобактерий туберкулеза югяи описали ранее (В.В.Брохин, 1973,1985).

Эти авторы говорят о многослойной клеточной стенке, но собственно клеточной стенке, очевидно, соответствует то, что сни описывают как ее внутренний ссмиофильный слой, состояний из двух тонких плотных листков, тесно прилежащих друг к другу. У большинства (в основном, молодых) мико-бактериальных клетск, этот слой имел вид сплошной осмиофильной линии тол-виной около 100 Я. Располагающийся под ним электроннопрозрачный слой, выявлявшийся ливь при наличии на его поверхности аморфного оемкофильного материала, соответствует аналогичному слою, обнаруженному нами и отделяющему покров от собственно клеточной стенки. В этом случае "аморфный

осмиофильный материал" является остатками липидного капсульного покрова, . «

а не "адсорбированными элементами питательной среди или разрувенных микобактерий". Видимо, однослойная клеточнал стенка у клеток при криоультра-' «

микротомии более соответствует анатомически нативному се состоянию, так как в данном случае клетка'пччтй не подвергается обработке.

В процессах дегидратации, заключения в смолы могут нарушаться связи> растворяться компоненты, клеточная стенка мояет расслаиваться.

Таким образом можно сделать заключение, что подобно другим фирмику-там МВТ имеют гомогенную клеточную стенку, однако в ультратонких конвенциональных срезах она часто выглядит как трехслойное образование, обычно с неравномерной толщиной слоев и некоторой их волнистостью.

Отличающуюся структуру клеточной стенки мы наблюдали после воздействия ИГНЛ на МВТ. В этом случае происходило ее отчетливое расслоение, однако, слои обычно имели более или менее равномерную толщину.

При исследовании методом криоультратомии нами обнаружены мезосомо-подобные структуры. Структуры, аналогичные мезосомам, описывались в цитоплазме микобактерий и ранее, они определялись как плотно упакованные

концентрические мембраны с периодом чередования 0,6 нм. Такие же структуры мы обнаружили в микобактериях после действия лазерного излучения.

Природа, функции и даже само существование мезосьм в МЕТ до сих пор является спорным. Считается, обычно, что мезосомы невидны в нефиксированных, замороженных бактериях. При использовании метода криоультрато-иии в нааей модификации были обнаружены структуры, аналогичные по анатомии и своему расположению мезосомам. Мезосомы обнаруживались в ультратонких срезах МБТ вташа нзтии (В.В.Ерохкн, 1973, 1985).

Доеольно убедительные доказательства представлены В.И.Бирюзовой о четкой и узкой функциональной дкффеоенциации бактериальных мембран и, в частности, мезосомоподобных образований. Она пишет, что это очень легко сделать, представив пространственное расположение анатомических органо-идоподсбных структур в клетке, и'их изменении в процессе онтогенеза.' ке указывает б своей работе на наличие в.бактериальной клетке внутриклеточных мсыбран - аналогов митохондрий, эндоплаэыатического ретикулюма, как гладкого, так и шероховатого (В.И.Бирюзова, 1981, В.И.Бирюзова, По-глазоза Ц.М., 1-976, А.А.Сценко, 1966, Н.К.кыье1 , 1982>; > ■

По нааим данным, в иикобактериальных клетках чаще всего обнаруживаются так называемые истинные.мезосомы, он» обычно располагаются в "районе закладки поперечных перегородок при делении клеток.

Делать категоричные выводы о мезосомах МБТ на имеющемся у' нас экспериментальном материале, тем не менее представляется преждевременным. Работая с вирулентными штаммами (из7яу и К- 8926), в которых были обнаружены мезосоиоподобныо структуры, иы были вынуждены проводить фиксацию препаратов тетраоксидом осмия, что могло привести к появлению ме-зосомоподобных структур. В то же время нужно учитывать, что аналогичные структуры регистрировались нами и в вакцинном штаммевсс , не подвсргав-иемся обработке тетраоксидом осмия.

Цитоплазма представляет основную массу клеточного содержимого. В

1J -

цитоплазме содержатся рибосомы; а также включения вакуоли, фосфатные гранулы, жировые гранулы, играющие лажную роль в процессах метаболизма клетки. Цитоплазма при криоультратомии мало отличалась от цитоплазмы микобактериальных клеток, исследуемых классическим методом, но при препарировании бактерий методом криоультратомии нами были найдены ранее не описанные органеллы, в которых проявляется, возможно, штаммовое различие бактерий туберкулеза. В цитоплазме четко выявлялись фибриллярные структуры, длина которых составляла 7,0 нм, у штамманз7яу обнаружены многослойные внутриклеточные мембраны с периодичностью 10 нм, морфологически сходные с внутриклеточными мембранами Bordetcllf pertussis , которые относятся к внутриклеточным мембранам I типа.

Нуклеоид микобактерий туберкулеза был представлен тонкими нитями

ДНК.

Наряду с этиотропными (противотуберкулезными) препаратами в современной терапии туберкулеза часто-»(¡пользуются препараты патогенетические': сииптоматичейкйе, нейтрализующие органотропное действие туберкуло-етатиков, способствующие восстановлению гомеостаза макроорганизиа. В качестве таких препаратов в клинической практике используются биологические антиоксиданты и, в частности, и - токоферол (витамин Е) и дибунол.

В микробиологических экспериментах доказано, что а - токоферол подавляет культуру МВТ только р Концентрациях, превынаюцих IC00 мкг/мл (Н.В.Пушкарева, 1972). Учитывая, что подобные концентрации в организме больного недостижимы, логичным казался вывод об индифферентности ос -токоферола в отношении возбудителя туберкулеза при использовании в специфической терапии. Клинический эффёкт этого препарг л. связывался только с действием на органы и ткани макроорганизма, изменением химизма и так далее.

Тем не менее мы решили вернуться к изучению данного вопроса,постаравшись в максимальной степени смоделировать in vitro условия, возникающие в организме больного. Для этого в микробиологических экспериментах

кы использовали сыворотку крови больных, получавших внутривенно а- токоферол или дибунол. Эффективность действия антиоксидантов на анатомии UCT изучали у 23 больных, получавших V- токоферол. Сыворотка крови, взятая через 3 часа после введения этого препарата, вызывала ультраструктурные изменения ИБТ, проявляющиеся в разрывах клеточной стенки, коагуляции нухлеоида, расщеплении цитоплазмы на фрагменты,не окаймленные мембранными структурами. У 40% клеток отмечался разрыв клеточных оболочек и выход содержимого во внеклеточное пространство.Аналогичные изменения наблюдались и при терапии дибунолои.

Выявленные с использованием метода криоультратомии структуры покрова после воздействия ОС- токоферола и дибунола отсутствовали.

Такиу образом, нам удалось доказать in vitro , что сочетанное действие(V- токоферола и сыворотки крови больных оказывает вак*^- -риостэтический эффект на микобактерии, возможно, связанный с изменениями перекисного окисления липйдов. ;

Подобные эксперимента убеждают в йеобходимости проведения исследования . как in vivo , так .и in-vitroТолько трудоемкость алек-■ • - . '

тронномйкроскопических исследований не позволяет нам рекомендовать, проведений их во всех случаях испытания препаратов или 'медикамен--. тов. Использование се - токоферола как препарата, обладающего бакте-риостатическим действием, было . оформлено в. виде заявки на • изобретение. . ' • .

Не меньший интерес представляют электронномикроскопические исследования МВТ при действии на них физических факторов, в частности,квантовой энергии гелий-неонового лазера.

Исходя из общих принципов лечения туберкулеза, У.Я. Богданович, А.И.Гордеева, К.Е.Красноаекова, 1985, считают, что применение излучения гелий-неонового лазера для лечения больных с активной формой туберкулеза противопоказано.Более осторожны И.В.Казаков.И.П.Красильников, Í986.HO их данным,в зависимости от режима и величины проводимой энергии,

рост МВТ может быть стимулирован или," наобЪрот, ингибиоован лазером. В последнем случае его выводы совпадают с результатами исследования А.А-.Гуляева, В.П.Бахарова, 1977.

В предварительном исследовании М.В.ШестериноЯ, А.Н.Калюк.Б.Ы.Налие-ва, 1987, удалось установить, что прерывистое действие излучения гелий-неонового лазера в дозах от 2,7 до 9,0 Дж, во всяком случае, не окаэыэа-эг стимулирующего действия на рост МБТ.

При постановке комплексного эксперимента нам удалось установить шрушения ультраструктуры облученных клеток. Анатомические нарушения в ликобактериальных клетках носили различный характер: от повреждения поверхностных структур до полного лизиса клеток.

Видимо, степень разрушения клетки МБТ зависела не только от време-ш ее облучения и режима подаваемой энергии, но и от глубины залегания слеток в облучаемых колониях микобактерий.

Результаты элёктронномикроскопического исследования были подтвер-щепы ыорфологиейполоний, выросших после облучения, снижением зирулент-юсти МБТ в опытах на животных (морение свинки). Признаки эти дсстаточ-ю наглядны, но должны быть отнесены к факультативным. В этом аспекте юлученные нами данные лучше документируют альтерацию микробных клеток, ! их следует, признать более фундаментально характеризующими процесс заимодействия возбудителя с повреждающим фактором. Обнаружена керреля-,ия степени анатомических изменений МБТ с-нарушениями других биологи-еских свойств: ростом на питательных средах, вирулентностью, способ-остью Быэивать генерализованные формы туберкулеза у экспериментальных иэотных.

Наша работа послужила одним из оснований для применения излучения елий-неонового лазера в комплексном лечении больных туберкулезом, сложненного эндобронхитами.

Одновременно няйденныч нами анатомические изменения в клетках воз-

будителя туберкулеза раскрыли новые аспекты действия биологических антиоксидантов.

ВЫВОДЫ:

1. Методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии (криоультромикрэтомии, высоковольтной микроскопии, ультратонких срезов) проведено комплексное и сравнительное изучение строения колоний и отдельных клеток вирулентного и вакцинного штаммов микобактерий туберкулеза. Показано наличие капсульного покрова, окружающего как отдельные клетки, так и группы клеток микобактерий.

Клетки вирулентного штамманз7м имели более тесную упаковку в колониях, более развитый липидиый, капсульный покров и более плотную иита-плазму, чем клетки вакцинного штамма. Клеточная стенка микобактерий определена как однослойная структура неравномерной толщины.

2. Методом криоультрамикротоуяи выявлено различий в ультраструктурной организации вирулентного и вакцинного штаммов. ■•

Клетки вирулентного ттамманз7т/ на внешней стороне'клеточной стенки в толщине капсульного покрова и на'е'го поверхности' имели, структуры конусообразной формы,- не' имеющие перетяжки у своего основания. У клеток вакцинного шташавсс на внешней стороне клеточной стенки в капсульном покрове определялись глобулярные структуры, которые, образуя узкие перетяжки, отпочковывались'от клеточной стенки.'

Данные различия, по-видимому, явились проявлением штамыовых особенностей микобактерий.

3. Доказано опосредованное действие биологических антиоксидантов на возбудитель туберкулеза: при действии сывороток крови больных людей, получавших (У гтокоферсл или дибунол в терапевтических дозах, происходило Достоверное снижение непродуктивной способности микобактерий на 48,8Х, достигавшее максимальных значений через 40 мин. инкубации.

4. Установлено, что снижение жизнеспособности микобактерий туберкулеза после инкубации с сывороткаци крови больных, получавших а -токоферол или дйбунол, обусловлено повреждениями ультраструктурной организации большинства бактериальных клеток, имеющими необратимый характер, а приводит к лизису клеток.

5. Выявленные изменения ультраструктурной организации микобактерий туберкулеза под влиянием сыворотки крови больных, получавших только ан-тиоксиданты (0<-токоферол или дйбунол) позволило обосновать их антитуберкулезный эффект.

6. Показано, что действие излучения гелий-неонового лазера приводит к изменению биологических свойств микобактерий туберкулеза - уменьшает способность роста на элективных питательных средах, количество и величину бактериальных колоний,а также вирулентность для морских свинок.

Установлена.прямая зависимость снижения ростовых свойств и яиру-лзнтности микобактерий от дозы и.времени облучения.

' 7. Чувствительность к воздействию излучения гелий-кеонового лазера относительно более выражен^ у штамма, выделенного от больного, по сравнению с лабораторным'вирулентным'и вакцинным штаммами.

8. Действие излучения гелий-неонового лазера приводит к прогрессирующему разрушению и последующему-'исчезновению капсульного покрова и к потере взаимосвязи клеток,-что нарушает структуру и форму колонии. Клетки микобактерий становятся округлыми или угловатыми, в них развиваются необратимые изменения: разрушение клеточной стенки, образование и расширение периплазматического пространства, образование пучков параллельных мембран в цитоплазме, дезорганизация рибосом, коагуляция нуклеоида.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Левченко Т.Н. Ультраструктура трех референтных штаммов микобактерий туберкулеза // Сб.трудов Московского НИИ туберкулеза. - М., 1979. - Т. 84. - С. 71 - 73.

2. Перезерзев H.A., Левченко Т.Н. Ультраструктурная организация микобактерий туберкулеза при криоультратомии // Журн.микробиол.эпидеми-ол. и иммунобиол.. - 1985. - К? 8. - С. 18-21.

3. Левченко Т.Н., Переверзев H.A., Должанский В.М. Криоультратомии микобактерий туберкулеза// Тезисы докл. Ш Всесоюзн.симпозиума по криогенным методой в электронной микроскопии. - Пущино-на-Оке, 1985. -•С. 34 - 36.

4. Попов С.А., Линберг Л.Ф.., Левченко Т.Н. Исследование иикооолта-рий туберкулеза методом капиллярной, газожидкостной хроматографии с электронным детектором // Современные проблемы фтизиатрии: Сб. тр. ННИИТ

113 РСФСР, Депонир. в ВИНИТИ.IR 3375-:l86-iI.5.86.- .'•".."

5. Левченко Т.Н..Должанский В Л. Исследование структуры микобакте-

• « ■ ' . * • ' >* рий туберкулеза с использованием метода криоультратомии // Тезисы^ доил.

X Всесоюзн. съезд фтизиатров: -'КиевЛ 1986. - С. Ю6тЮ7. . . ..

6. Девятова А.И.', Попов С.А., Левчекко_Т.Н. Современные методы исследования микобактерий туберкулеза // Тезисы докл. У1 Всеросс.фезд

• '■ * .

фтизиатров. - Кемерове, 1987. - С.218-219. •"..'■

7. Попов С.А..Линберг Л.Ф..Девятова А.И. и др. Использование методов газожидкостной хроматографии для исследования резистентных штаммов микобактерий туберкулеза // Тезисы докл. Современные проблемы биохимии и биофизики. - Горький, 1987. - С. 75-78.

8. Малиев Б.М.,Калюк А.Н.,Попов В.Л. и др.. Анатомия микобактерий туберкулеза в норме и под воздействием гелий-неонового лазера// Сб.трудов Московского НИИ туберкулеза. - М., 1988. - Т.112, - С.75-78.

* 9. ТОшнико-экспериментальнре обоснование лазерной фототерапии во Ьтизиопулъмонологии/ М.В.Шестерина.А.А.Хайтук.А.Н.Калюк и др. // Тезисы хокд. Международн. симпозиум по лазерной хирургии и медицине. - 14., 1988. - С. 337 - 339.

10. Ультраструктурная характеристика микобактерий туберкулеза после зоздействия излучения гелий-неонового лазера/ Т.Н.Левченко,Б.М.Малиев, 1.А.Переверзев и др.. //Тезисы докл. ХП Всесоюзн.конф. по электронной <икроскопии. - М., 1988. - С. 86-87.

11. Влияние низкоэнергетического гелий-неонового лазера на биологи-4еские свойства микобактерий туберкулеза/ В.М.Должанский.А.Н.Калюк, Г.Н.Левченко и др.. // Пробл.туберкулеза. - 1990. - №4. - С. П-14.

12. Способ лечения инфильтративного туберкулеза легких /Е.В.Старо-стенко, В.М.Должанский.А.М.Салпагаров и др.. //Метод.рекомендации.

- М., 1990-. • _ , ' . -

13. Применение антиоксидантоз в комплексном лечении больных инфиль-тративным туберкулезом легких / Б.В.Старостенко.А.М.Салпагаров.В.М.Дол-*анский и др..// Пробл.туберкулеза. - 1991. - Р I. - С.9 - II.

14. Использование анти|жсидантов в комплексном лечении больных инфильтративным-туберкулезом легких с целью уменьшения медикаментозной нагрузки антибактериальными препаратами / Е.В.Старостенко.В.М.Должан-ский, Т.Н.Левченко и.др..//"Тезисы докл. Ш Всесоюзн.конф. по биоантиэк-сйдантам. - М., 1989. - С. 42 - 44.