Анализ степени структурной и функциональной однотипности поливалентного ингибитора протеаз, содержащегося в поджелудочной железе животных, и соевого ингибитора трипсина

Памирский, Игорь Эдуардович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ степени структурной и функциональной однотипности поливалентного ингибитора протеаз, содержащегося в поджелудочной железе животных, и соевого ингибитора трипсина
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ степени структурной и функциональной однотипности поливалентного ингибитора протеаз, содержащегося в поджелудочной железе животных, и соевого ингибитора трипсина"

На правах рукописи

Памирский Игорь Эдуардович

АНАЛИЗ СТЕПЕНИ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОДНОТИПНОСТИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ, И СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА

03.00.13 - физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Благовещенск - 2009

003480234

Работа выполнена на кафедре биологической химии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Бородин Евгений Александрович

доктор биологических наук, Лукьянова Ольга Николаевна

доктор биологических наук, профессор, Новгородцева Татьяна Павловна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Читинская государственная

медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита, состоится «12» ноября 2009 г. в 10-00 на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 005.008.03 при Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН по адресу: 690041, г.Владивосток, ул.Пальчевского, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН.

Автореферат разослан « 1 » октября 2009 г.

Ученый секретарь Объединенного диссертационного совета, к.м.н.

А.Ю. Горькавая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Ферментативный гидролиз белков (протеолиз) лежит в основе регуляции важных физиологических процессов (переваривание белковых компонентов пищи, образование кровеносных сосудов, иммунный ответ, секреция) на разных уровнях организации (8е1к1, Уапа, 2003; С1юпс1го|ратц, Оопоэ, 2008; Бкогко-ОЬпек, БоЫеска-БгкаЫа, 2008). Протекание протеолиза обеспечивается большим количеством протеолитических ферментов (протеаз), которые способны функционировать внутри и вне клеток. Типичными представителями ферментов класса протеаз являются трипсин, калликреин, тромбин, плазмин, урокиназа, пепсин, дуоденаза, катепсины. Протеолиз регулируется преимущественно белками-ингибиторами, составляющими мощный антипротеолитический потенциал организма. Белки-ингибиторы встречаются в организмах млекопитающих, червей, микробов и растений (2ауазшк-Ве^аггё, 2008). Предотвращая преждевременную и чрезмерную активность, либо полностью блокируя работу протеолитических ферментов, ингибиторные белки участвуют в механизмах. многих сопряженных с протеолизом процессов, таких как свертывание крови, распад фибринового сгустка, активация комплемента и других. Функциональная деятельность ингибиторов не ограничивается влиянием на протеазы, они также могут препятствовать действию цитокинов, токсинов и ряда других биологически активных веществ (Зорин и соавт.,

Особую группу белков-ингибиторов животного происхождения составляют серпины. Серпины ингибируют сериновые протеазы -ключевые ферменты, отвечающие за функционирование и взаимосвязь физиологических систем организма (пищеварение, иммунитет, гемостаз и др.). К характерным представителям данной группы белков относят гирудин, агантитрипсин, а2-макроглобулин и другие. Особый интерес представляет поливалентный ингибитор протеаз (апротинин), выделенный из органов крупного рогатого скота, который активно практикуется как регулятор протеолиза в организме человека. Аналоги белков-ингибиторов животного происхождения обнаружены у таких растений как табак, горчица, картофель, пшеница, соя и другие (Дунаевский и соавт., 2005; Мосолов, Валуева, 2005). В частности, к ним относятся ингибиторы из соевых бобов, способные препятствовать действию сериновых протеаз, подобно серпинам. К сожалению, вопрос о структурной и функциональной однотипности протеазных ингибиторов, присутствующих в организмах животных и растений, имеет существенные

1995).

пробелы. Поэтому в качестве объектов сравнения были выбраны поливалентный ингибитор протеаз поджелудочной железы животных (апротинин) и соевый ингибитор трипсина. Кроме того, актуальность данного исследования обуславливается исключительно важной ролью регуляторов протеолиза в функционировании физиологических процессов.

Цель работы: проанализировать степень структурной гомологии и функциональную однотипность апротинина животного происхождения и соевого ингибитора трипсина (СИТ). Задачи исследования:

1. Методами биоинформатики установить степень структурной гомологии, спектр биологической активности и определить потенциальные молекулы-мишени апротинина и СИТ из числа протеаз организма человека.

2. Определить трипсин-ингибиторную активность апротинина и СИТ в опытах in vitro.

3. Изучить влияние апротинина и СИТ на свертывание крови (протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время и тромбиновое время).

4. Определить влияние апротинина и СИТ на фибринолиз (время фибринолиза).

5. Сравнить влияние апротинина и СИТ на агрегацию тромбоцитов (скорость и степень агрегации).

6. Проанализировать влияние апротинина и СИТ на функциональное состояние системы комплемента (гемолитическая активность комплемента).

7. Изучить влияние приема изолята соевого белка, содержащего соевый ингибитор трипсина, на общую протеолитическую и трипсин-ингибиторную активности в сыворотке крови людей.

Научная новизна исследования. Впервые методами биоинформатики показана высокая структурная гомологичность белкового ингибитора протеаз животного происхождения апротинина и его растительного аналога - соевого ингибитора трипсина (СИТ). Сравнение электронных структурных формул позволило выявить, что оба соединения являются ингибиторами ренина, а также ангиотензин-превращающего и эндотелин-превращающего ферментов. Апротинин и СИТ не обладают токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью. Произведено построение электронных трехмерных

третичных структур изученных соединений, что необходимо для расчета молекул-мишеней.

Впервые приведены доказательства, что апротинин и СИТ имеют не только структурное, но и функциональное сходство. Они в одинаковой степени ингибируют трипсин в опытах in vitro. При исследовании влияния на гемостатические показатели в опытах in vitro апротинин и СИТ препятствуют свертыванию крови (СИТ замедляет время свертывания по внутреннему и внешнему пути, а апротинин только по внутреннему) и блокируют фибринолиз. Оба соединения оказывают антиагрегационное действие, не различаясь между собой по силе торможения обратимой, двухфазной, необратимой АДФ-инициируемой и двухфазной адреналин-инициируемой агрегации. Растворы апротинина и СИТ в концентрации 0,01-1,0% не влияют на скорость и интенсивность комплемент-зависимого гемолиза.

Впервые получены данные, свидетельствующие, что двухмесячный прием соевого белка, содержащий активный СИТ, снижает общую протеолитическую и увеличивает трипсин-ингибиторную активность сыворотки крови.

Положения, выносимые на защиту:

1. На уровне первичной структуры белки апротинин и СИТ являются низкогомологичными соединениями. Наиболее высокий уровень сходства наблюдается между С-концевым участком полипептидной цепи СИТ и молекулой апротинина.

2. Апротинин и СИТ проявляют высокую степень функциональной однотипности в отношении трипсина и физиологических показателей гемостаза.

Теоретическая значимость. Получены новые знания о структурной гомологии и функциональной однотипности апротинина и соевого ингибитора трипсина. Эти данные расширяют недостаточно разработанные представления о физиологической роли апротинина и соевого ингибитора трипсина в регуляции функциональных процессов организма (свертывание крови, фибринолиз, работа системы комплемента, агрегация тромбоцитов).

Исследование дополняет современное знание о воздействии экзогенных ингибиторов протеаз растительного и животного происхождения на плазменные белки, обеспечивающие гемостатическую и защитную функции крови человека.

Результаты данного исследования позволяют глубже понять механизмы ряда физиологических процессов (гемостаза, неспецифических

гуморальных и клеточных защитных механизмов), сопряженных с протеолизом.

Практическая значимость. В работе продемонстрирована адекватность использования ряда методов биоинформатики в исследовании гомологии белковых ингибиторов протеаз. Показана возможность перспективного использования соевого ингибитора протеаз в качестве регулятора протеолиза в организме, в частности процессов гемостаза. По результатам исследования оформлена приоритетная заявка на выдачу патента на изобретение «Способ коррекции общего уровня трипсин-ингибиторной активности сыворотки крови с помощью соевого печенья, обогащенного активным соевым ингибитором». Предложен метод исследования гемолитической активности комплемента in vitro.

Новые данные о структурно-функциональной гомологии белков-ингибиторов протеаз, содержащихся в животных и растительных объектах, представляют интерес для поиска аналогов этих соединений с заданными биологическими свойствами.

Материалы диссертации включены в курс лекций кафедры биологической химии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Практические рекомендации:

1. Используемые нами электронные базы белков содержат актуальную и достоверную информацию и могут применяться в исследовании белковых ингибиторов как средство биоинформатики.

2. Употребляя изолят соевого белка, обладающий антипротеазной активностью, можно корректировать уровень общей протеолитической активности сыворотки крови.

3. Полученные данные можно использовать при поиске и разработке новых регуляторов протеолиза в организме человека. Апробация диссертации. Результаты исследования доложены и

обсуждены на VII и VIII региональных научно-практических конференциях «Молодежь 21 века» (Благовещенск, 2006, 2007), X Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2006), IV Международном Российско-китайском фармацевтическом форуме (Благовещенск, 2007) и XV Российско-Японском медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2007).

опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», утвержденный ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах компьютерного набора. Она содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, описание собственных результатов, обсуждение и выводы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 209 первоисточников, из них 58 отечественных и 151 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объект исследования. Препараты апротинина («Контрикал», Германия) и соевого ингибитора трипсина («Reanal», Венгрия). Всего выполнено 684 пробы.

Биоинформационные методы (in silicó). Для сравнения гомологии аминокислотных последовательностей использовали интернет-сервер BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) и программу Bio Edit 5.0.9. Спектр возможных биологических активностей определяли при помощи программ ISIS Draw 2.4 и PASS Professional. Для построения и визуализации электронных пространственных структур белков использовали программы Chem Office 5.0 и Yasara 6.2.5. Для работы с программами использовали файлы формата FASTA, MOL и PDB. С программами и сервером работали согласно прилагаемым инструкциям. Также применяли базы данных белков (Protein Data Bank, Uni Prot и др.).

Определение протромбинового времени (метод Квика). Протромбиновое время определяли с помощью тест-наборов «Техпластин-тест» («Технология Стандарт», Россия) в соответствии с прилагающейся инструкцией. Опытные образцы плазмы с трипсином и ингибиторами предварительно инкубировали на водяной бане в течение 5 минут при 37°С. Всего выполнено 48 проб.

Определение тромбинового времени. Тромбиновое время определяли с помощью тест-наборов «Тромбин-тест» («Ренам», Россия). Определение проводили в соответствии с инструкцией к тест-набору. Плазму с трипсином или ингибиторами инкубировали 5 минут на водяной бане при 37°С. Всего выполнено 48 проб.

Определение активированного частичного тромбопластинового времени. Активированное частичное тромбопластиновое время свертывания крови определяли с помощью тест-наборов «Коагуло-тест» («Ренам», Россия). Образцы плазмы с трипсином и ингибиторами

инкубировали на водяной бане в течение 5 минут при 37°С. Всего выполнено 48 проб.

Определение времени фибринолиза. Время фибринолиза определяли с помощью тест-наборов «Фибринолиз-тест» («Технология Стандарт», Россия) по прилагаемым инструкциям. Образцы опытной плазмы с трипсином или ингибитором предварительно инкубировали на водяной бане в течение 5 минут при 37°С. Всего выполнено 48 проб.

Исследование агрегации тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов в плазме исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов АР 2110 («Солар», Беларусь), совмещенного с ПЭВМ, по методу указанному в инструкции к прибору. Опытную плазму с трипсином или ингибиторами предварительно инкубировали в термостате в течение 5 минут при 37°С. Всего выполнено 116 проб.

Определение трипсин-иигибиторной активности. Определение трипсин-ингибиторной активности исследуемых ингибиторов проводили по методу В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1977). Трипсин-ингибиторную активность определяли в сыворотке крови добровольцев (60 проб), солянокислых растворах исследуемых ингибиторов (80 проб) и растворах изолята соевого белка (60 проб).

Определение протеолитической активности. Определение общего уровня протеолитической активности в сыворотке крови проводили по методу В.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1977). Выполнено 60 проб.

Определение гемолитической активности комплемента. Для исследования гемолитической активности комплемента in vitro нами был разработан способ реконструкции анализатора агрегации тромбоцитов SOLAR АР 2110, а также методика проведения эксперимента. Принцип метода заключается в регистрации изменений светопропускания раствора в процессе гемолитического распада эритроцитов. Метод позволяет наблюдать и контролировать ход измерений в динамике, а также хранить данные в виде электронных файлов. Всего выполнено 116 проб.

Исследование влияния приема соевого белка на протеолитическую и трипсин-ингибиторную активность крови человека. Исследование проводилось с участием врачей М.А. Штарберга и И.Г. Белоглазовой. Легитимность испытания на людях подтверждена Этическим комитетом ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» (выписка из протокола от 23 сентября 2007 г.). В экспериментальную группу вошли 28 взрослых (средний возраст 50 лет) практически здоровых людей. Среди них было 16 женщин и 12 мужчин. Эксперимент длился 2 месяца, на протяжении которых добровольцы

употребляли изолят соевого белка (ежедневно по 30 г на человека). Кровь для исследований брали до и после 2-х месяцев приема изолята. В сыворотке крови определяли общий уровень протеолитической и трипсин-ингибиторной активности.

Статистические методы. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ «StatPlus 2007 Professional 4.3.0.0» и «StatSoft Statistica 6.0». Различия между группами устанавливались по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение Обзор электронных баз данных белков

В Интернете нами было найдено более 100 баз данных с информацией о различных веществах. Белкам посвящено около 50 баз (список приводится в диссертации), среди которых только 9 (табл. 1) содержат информацию об апротинине и СИТ, представленную в виде электронных файлов специального формата.

Таблица 1

Базы белков, содержащие информацию об апротинине и СИТ

Название и электронный адрес базы данных Идентификационный код в базе данных

Апротинин СИТ

UniProt-Swiss-Prot ВРТ1 BOVIN ITRA SOYBN

http://www.expasy.org/ (Р00974) (P01070)

Blocks http://www.ebi.ac.uk/ Р00974 IPR002160

COG Р00974;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NP 001001554;

GTOP btauO:ENSBTAGOOOO ?athaO:Atlgl78

http://spock.genes.nig.ac.ip/ 0017328 60.1

iProClass Р00974/ВРТ1 BOVI

http://pir.georgetown.edu/ N; P1RSF001621

LIGAND - LIGAND 50059016; 3809839;

http://www.pasteur.fr/ bta:616039; 100156830 -

MMDB http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Р00974 (Precursor); 1QLQ 1AVU

PDB http://www.rcsb.org/ ЮА6 1AVU; 1BA7

MEROPS 102.001 103.001

http://merops.sanger.ac.uk/

Определение степени гомологии аминокислотных последовательностей апротинина и СИТ т \Шсо В ходе исследования установлено, .что полипептидные цепи данных ингибиторов гомологичны на 10% (рис. 1).

Сравнение отдельных аминокислотных областей данных белков показало более высокий уровень гомологии (рис. 2). Наиболее гомологичными (35%) оказались С-концевая область СИТ (участок цепи 132-181) и молекула апротинина без 6 последних С-концевых аминокислот.

> Г Лссзогу АргУйЛоп ' - й'Ыо« .

VВ " " "

Ш I WW .fi JS3L i<*»» г. .

" tsss« ¡F -r IffST1

Г» KSV^A^ra i!T

W ТйкВоИ F nateiilrirfa» V питЬе...!*»'««* ГТМкМсМ rSenwiceAeW " ■■""

Г TürtOfldwiMa г 5ефай»(1йсй p мкшstwfr«' r^^mßAs-:.

Г~ id/Sm. SheÄig wlht« "

Й£Т-

^арнТпмпг Ri

PaaoWA'j

liaWe jNotfcTS^pffilBiSSTiiny!^WjieÄlboiJsfe№lopwldчкйГвю»"»raw(ijppeЙ)~

Aprotinin 1 ------*-----------------------------------------------------------------i

SBTI 1 DFVLDNEGNPLEWGGTYYIIiaDITAFGGIRAAPTGNERCPLTVVQSRNELDKGIGTIIBS 60

Apr о tinin 1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------1

SSII 61 PYRIRFIAEGHPL3bKFD3FAVim.CVGIPTEW3VVE0bPEGPAVKIGENK£>AKDGWFRI, 120

Aprotinin SBTI

121 ERVSPDEFNIi

Aprotinin 49 -fc

SBTI

178

Рис. 1. Результаты подсчета гомологии апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI) в Bio Edit 5.0.9 (черным цветом выделены идентичные аминокислоты, серым - химически подобные).

Aprotinin 1 SBTI 1

—REgpcb;

dfviHneg:

CKAR tyy l

Aprotinin 1 RPDFCbEPPYTSPCKARMIKYFY SBTI 61 PYRIRFIAEGHPLSbKFDSFAVi:

Aprotinin 1 sbti

Рис. 2. Результаты определения гомологичных областей полипептидных цепей апротинина (Aprotinin) и СИТ (SBTI).

Согласно представлениям классической протеомики, эволюционно родственные белки, независимо от количества аминокислот, входящих в их состав, и различий третичной структуры, имеют консервативные области (домены), определяющие свойства белков. Например, в родственных глутамилэндопептидазах бактерий неизменны только пять аминокислотных остатков из 215 (Степанов, 1998). Поэтому полученные нами данные указывают на гомологию полипептидных цепей апротинина и СИТ.

Определение и сопоставление спектров биологической активности апротинина и СИТ in silico Нами были построены электронные структурные формулы апротинина и СИТ формата MOL для программы PASS (рис. 3).

i шт

ü ;3t \ г- V 1-" »<? : - М^Хт- }

¡§|IÉilÉOi€>lQl¿l¿1<?i<>|giOi.a] ___

'■■я

l¿¡ р|

j/vv-i*-

G Й-

^ L Е Р Р Y Т

D Р

-С К А R

"-С

N N

К А

D S"-C М

К S

COI

А /

: А

G G

•"-с

Рис. 3. Полипептидная цепь апротинина. В окне «Residues» приведена таблица обозначений аминокислот.

Выявлено 4 вида активности для апротинина и 3 для СИТ (рис. 4). Программа показала, что данные белки являются ингибиторами ренина, ангиотензин- и эндотелин-превращающего ферментов.

Возможность проявления (drug-likeness) перечисленных эффектов практически одинакова у обоих ингибиторов. Также установлено, что исследуемые ингибиторы не обладают токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью и тератогенностью.

Ole Вз» frecfct Spited ыф"

ч?' л? íSTñ~3 i а в ы

•-"■лИф-ОЗ

0.187 0.023 RewrMAM 0.1W 0.015 Áno®tensjn corwertinc enq^ rtifcitoi ? 0.152 0.078 Endothefc-iconveibrig ers-yme rh¿jo<

СОЕВЫЙ ИНГИБИТОР

127 Subskuéture Oescrip*«», 0 г

Drug-Likeness 0.985

3o»5l Possible Activities Oo/6Po«iíePharmeco¡Oi}fC4Í£ffecí» 3of 42 Possfcie Moleoi« MechííwnB 0 of 3 Possible Side Efleeis «id Twoaty 0 oí 0 Potato MetabcSstn

[ No Selected Activity "'.СЫЙ- ^chwaai j JmMeb&óSw,

4 0» 51 Powite Aceites at Pe > Pi

0.120 0.011 Ansjcrfensh converting enzyme гЫ»»с* 0.035 0.016 Neuti'al eodopep(idete nl-ibáoí 0,127 0,063 Renin НтйЛх 0.147 0,086 EndotheSn converting епгутгв inhibit«

АПРОТИНИН

S Súbita***» Deectpíoft; 0 n

Drug-Likeness 0.967

4 о» 51 Possible Activities QoiS Postile Phvmocdagicel EHeds 4 oí 42 Possible Mofeaiaf Mechanisms 0 of 3 Possible SicJeEfteds and Тоясйу 0 Ы 0 PossWo MetaboÜsm

Рис. 4. Спектр биологической активности апротинина и СИТ «Drug-Likeness» - вероятность проявления эффекта; Ра— вероятность наличия активности; Р, - вероятность отсутствия активности.

Построение электронных трехмерных третичных структур

апротинина и СИТ in silico В исследовании механизма действия и биологических функций белковых соединений большую ценность представляет их трехмерная структура (Blundell et al., 2006; Pazos, Bang, 2006; Silveira et al., 2007). Поэтому с целью более тщательного изучения функциональности и выявления молекул-мишеней, нами были построены электронные

пространственные структуры апротинина и СИТ (рис. 5).

...... тддтаияЕР

СИТ

АПРОТИНИН

Рис. 5. Электронные трехмерные модели третичных структур апротинина и СИТ (построено в программе Chem Office 5.0).

Произвести поиск молекул-мишеней методами биоинформатики не удалось из-за отсутствия необходимых программ в свободном доступе. В целом, полученные методами биоинформатики данные показали статистически достоверную степень структурной и функциональной однотипности апротинина и СИТ, что явилось предпосылкой дальнейших исследований in vitro и in vivo.

Трипсин-ингибиторная активность апротинина и СИТ in vitro

Результаты определения активности отображены на рисунках 6 и 7. Для сравнения мы определили активность синтетических ингибиторов. Установлено, что трипсин-ингибиторная активность снижается в следующей последовательности: апротинин (141,1±13,3 ИЕ/мг), СИТ (61,4±0,9 ИЕ/мг), D-лизин (1,31 ±0,02 ИЕ/мг), е-аминокапроновая кислота (1,36±0,04 ИЕ/мг). Таким образом, активность апротинина при данном способе расчета более чем в 2 раза выше таковой СИТ (р<0,0002).

ИЕ

12 3 4

Рис. 6. Трипсин-ингибиторная активность апротинина (I), СИТ (2), е-аминокапроновой кислоты (3) и D-лизина (4) в ингибиторных единицах (ИЕ) на I мг вещества.

ИЕ

1 2

Рис. 7. Трипсин-ингибиторная активность апротинина (I) и соевого ингибитора трипсина (2) в ингибиторных единицах (ИЕ) на I нмоль

вещества.

Ингибиторная активность синтетических низкомолекулярных ингибиторов на 2 порядка ниже, чем у апротинина, и в 40 раз ниже, чем у СИТ. Учитывая, что молекулярная масса. СИТ (20 100) в 3 раза выше, чем у апротинина (6 514), при расчете на моль ингибитора активность первого будет несколько выше (см. рис. 7).

Исследование системы свертывания крови и фибринолиза in vitro

В условиях in vitro нами было проведено исследование воздействия апротинина, СИТ и трипсина на ряд показателей свертывания крови и противосвертывающей системы. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние апротинина, СИТ и трипсина на показатели свертывания крови и

фибринолиза in vitro

Показатель Время, сек

Плазма (контроль) (1) Плазма + 0,1% р-р трипсина (2) Плазма + 1,0% р-р апротинина (3) Плазма + 1,0% р-р СИТ (4)

Протромбиновое время 20±0,9 13±0.9 Р,.2<0.0001 21 ¿0,9 Р|.з>0,05 31 ±0,9 Рм<0,0001

АЧТВ 36±1,7 3±0,9 Р,.2<0,0001 113±1,8 Р,.3<0,0001 105±2,7 Р,.4<0.0001

Тромбиновое время 16±0,9 2,5±0,5 Р,.2<0,0001 24±0,9 Р,.3<0.0001 оо *

Время фибринолиза 400±34,7 182±7 Р,.2<0.0001 Лизиса сгустка не происходило Лизиса сгустка не происходило

Примечание. * - в некоторых пробах наблюдалось слабое помутнение через 300 секунд. АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время.

Установлено, что протромбиновое время уменьшается на 33-

35% при воздействии 0,1% раствора трипсина, незначительно возрастает (не более 5%) при воздействии 1,0% раствора апротинина и увеличивается практически вдвое при воздействии 1,0% раствора СИТ. АЧТВ снижается в 10-12 раз при воздействии 0,1% раствора трипсина, возрастает в 3 раза при воздействии 1,0% раствора апротинина или 1,0% раствора СИТ.

Образование сгустка под действием тромбина (тромбиновое время) усиливается на 85% в присутствие 0,1% раствора трипсина, замедляется на 50% в присутствие 1,0% раствора апротинина и не происходит в присутствие 1,0% раствора СИТ. Фактор ХП-калликреинзависимый фибринолиз ускорятся на 50-60% при воздействии 0,1% раствора трипсина и не протекает в присутствие 1% растворов апротинина или СИТ. Результаты исследования указывают на однотипность биологического воздействия апротинина и ингибитора трипсина из соевых бобов в отношении изученных физиологических процессов.

Исследование агрегации тромбоцитов in vitro Исследование проводили на АДФ- и адреналин-инициируемой типах

агрегации. Результаты представлены в таблице 3 и на рисунках 8 и 9.

Таблица 3

Влияние апротинина, СИТ и трипсина на агрегацию тромбоцитов in vitro

Тип агрегации Контроль (плазма) (1) Плазма + Апротинин (2) Плазма + СИТ (3) Плазма + Трипсин (4)

Обрат. (Адф) МА ТмА 22±1.8 55±4,7 14±0,9 Р,.2«Ш 55±4,7 Р,.2<0,3 15±0.9 Р!.;<0.01 55±4,7 Р,.,<0,3 34±0,9 Р,.4<0,01 65±15РМ<0,07

Двухфаз.(Адф) Первая фаза МА Тмд Вторая фаза МА Тм^ 48±1.8 85±4,7 70±2 350±9,2 35±0.9 Р,^<0.01 68±Ю,5 Р,.:<0,001 56±2 Р,.2<0,02 325±9,2 Р,.,<0.001 34±1 Р,.5<0.01 70±9 Р|.3<0,005 58±1 Р,.,<0.05 320±9,3 Р,.,<0.001 57±3 Pi.4<0,01 80±10РИ<0,08 99±1 Pw<0,02 310±9,2 Ры<0,005

Необрат.(Адф) МА ТмА 49±0.9 400±18 33±0.9 Р,.,<0.02 410±9.3 Р,.:<0.04 29±0.9 Р,.,<0.02 410±9,3 Р,.3<0,04 100РМ<0.001 210±26.4 Рм<0.001

Двухфаз.(адр) Первая фаза МА Тмд Вторая фаза МА ТМА 23±0,9 ПО±9,3 47±2,4 390±9.3 16±1.8 Р|.2<0,02 125±13,1 Р,.2<0,001 44±2 Р|.2>0,05 430±18 Р|.2<0.0001 16±1.8Р,.3<0.02 125± 13 Р,.3<0.001 44±1.8 Р|.)>0.05 430±18 Р].з<0.0001 32±0.9 1'|.4<0.01 130±9.3 Рм<0.0001 55±0.9 Рм<0.02 435±16Р,.4<0,0003

Примечание. МА - максимальный уровень агрегации (процент светопропускания), ТМА - время достижения максимального уровня агрегации в секундах, адр - адреналин, Обрат. - обратимая агрегация, Необрат. - необратимая агрегация, Двухфаз. - двухфазная агрегация.

св его пропускание, %

Рис. 9. Типичные агрегатограммы влияния апротинина, СИТ и трипсина на адреналин-инициируемую двухфазную агрегацию тромбоцитов in vitro (адреналина 25 мкмоль). 1 - контроль; 2-3 - СИТ 1,0% (апротинин 1,0%); 4 - трипсин 0,1 %.

трипсина на АДФ-инициируемую двухфазную агрегацию тромбоцитов in vitro (АДФ 15 мкмоль). 1 - контроль; 2 - апротинин 1,0%; 3 - СИТ 1,0%; 4 -трипсин 0,1%.

Ингибиторы факторов свертывания являются на сегодняшний день основным объектом исследования в работах, посвященных регуляции агрегации тромбоцитов (Klauss, Spannagl, 2006; Jennings, Saucedo, 2008). В литературе имеются данные об успешном применении некоторых серпинов как регуляторов агрегации (Rothman, 2005; Nutescu, Shapiro, Chevalier, 2006; Lepor, 2007; Fareed et al., 2008a, 2008b; Hoppensteadt et al., 2008). Мы поставили перед собой задачу исследовать влияние апротинина и СИТ на процесс агрегации тромбоцитов. В ходе исследования было установлено, что апротинин и СИТ тормозят процесс агрегации тромбоцитов in vitro, а трипсин оказывает обратный ингибиторам эффект. Антиагрегационные свойства исследуемых ингибиторов протеолитических ферментов практически не отличаются.

Исследование влияния апротинина, СИТ и трипсина на систему комплемента in vitro

Ингибиторы протеаз участвуют в различных протеолитических каскадах организма, в том числе в активации комплемента (Silverman et al., 2004; Richardson, Viswanathan, Lucas, 2006). Поэтому одним из объектов данного сравнительного исследования биологической активности панкреатического ингибитора протеаз и соевого ингибитора мы выбрали систему комплемента как протеолитическую систему (рис. 10, табл. 4).

—-^контроль - - • апротинин или СИТ (0,01 -1,0%) —трипсин 0,01 %

Рис. 10. Типичные кривые влияния апротинина, СИТ и трипсина на гемолитическую активность комплемента in vitro.

Таблица 4

Влияние апротинина, СИТ и трипсина на скорость гемолиза эритроцитов _в присутствии системы комплемента in vitro_

Время лагфазы, мин Общее время гемолиза включая лагфазу, мин

Контроль (1) 3,5±0,5 8,5±1,5

Апротинин (1,0%) (2) 3,2±0,15 Р[.2>0,05 7,25±0,25 PI-2>0,05

СИТ (1,0%) (3) 3,2±0,15 Р,.3>0,05 7,25±0,25 Р|_з>0,05

Трипсин (0,01%) (4) 4,25±0,25 Pw<0,02 15,5±0,5Рм<0,02

Мы предполагали, что исследуемые ингибиторы смогут препятствовать работе комплемента, тем самым увеличив время гемолиза. Однако было установлено, что скорость гемолиза не изменяется при воздействии апротинина и СИТ. Такой эффект ингибиторов можно объяснить их специфичностью к протеазам. Трипсин угнетает активность комплемента, возможно, потому что компоненты последнего гидролизируются трипсином.

Влияние приема изолята соевого белка на протеолитическую и трипсин-ингибиторную активность в сыворотке крови

В рамках исследования протеолиза, затрагивающего систему крови, мы поставили перед собой задачу выяснить, как длительное употребление в пищу продуктов, содержащих активные ингибиторы протеолитических ферментов, может влиять на протеазно-ингибиторную систему организма человека. В качестве такого продукта был выбран изолят соевого белка, обладающий антипротеолитической активностью. В процессе приготовления изолята соя подвергается термической обработке, в ходе которой биологически активные компоненты могут инактивироваться, в том числе и ингибиторы. Известно, что около 20% соевого ингибитора трипсина обладают термостабильностью (Kennedy, 1998). Поэтому для корректной оценки показателей общей активности протеолитических ферментов и их ингибиторов в сыворотке крови, было определено содержание ингибиторов в изоляте соевого белка. Определение показало, что 1 мг изолята соевого белка содержит 1,4±0,1 ингибиторных единиц (ИЕ).

Установлено, что прием изолята соевого белка на протяжении 2 месяцев сопровождался статистически достоверным снижением общей протеолитической активности сыворотки крови на 18% (р<0,05) и увеличением трипсин-ингибиторной активности на 21% (р<0,01) (табл. 5).

Таблица 5

Уровень протеолитической и трипсин-ингибиторной активности в

сыворотки крови людей, употреблявших изолят соевого белка

Время исследования сыворотки Показатели сыворотки крови

Общая протеолитическая активность (относительные единицы) Трипсин-ингибиторная активность (ИЕ/мл)

До приема 0,343±0,010 113±3,6

После приема 0,282±0,008 р<0,05 137±5,3 р<0,01

Полученные данные позволяют предполагать, что употребление активных ингибиторов в составе пищевых продуктов может оказывать влияние на физиологические процессы, сопряженные с протеолизом.

ВЫВОДЫ

1. Первичные структуры и спектры биологической активности апротинина и СИТ гомологичны in silico.

2. СИТ и апротинин обладают одинаковой трипсин-ингибиторной активностью in vitro.

3. СИТ и апротинин в равной степени препятствуют свертыванию крови, фибринолизу и агрегации тромбоцитов. СИТ замедляет время свертывания, протекающего по внешнему и внутреннему пути, а апротинин - только по внутреннему пути.

4. Оба ингибитора полностью блокируют фибринолиз.

5. Апротинин и СИТ обладают антиагрегационными свойствами. Они не отличаются по силе торможения обратимой, двухфазной, необратимой АДФ-инициируемой и двухфазной адреналин-инициируемой агрегации тромбоцитов.

6. Растворы СИТ и апротинина в концентрациях 0,01-1,0% не влияют на скорость и степень комплемент-зависимого гемолизиса in vitro.

7. Двухмесячный прием изолята соевого белка, содержащего активный СИТ, снижает общую протеолитическую активность на 18% и увеличивает трипсин-ингибиторную активность на 21% в сыворотке крови человека.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аникин C.B., Памирский И.Э., Горин A.A., Чекмарев М.В., Димова Е.А. Разработка лекарственного препарата ингибитора протеаз с использованием методов протеомики и биоинформатики // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VII региональной научно-практической конференции, посвященной 150-летию основания г.Благовещенска. 16-17 мая 2006 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2006. Книга 2. С. 10-11.

2. Памирский И.Э., Блоцкий P.A., Штарберг М.А. Отечественные и зарубежные компьютерные программы в создании и прогнозировании свойств новых лекарственных средств // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VII региональной научно-практической конференции, посвященной 150-летию основания г.Благовещенска. 1617 мая 2006 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2006. Книга 2. С. 215-216.

3. Памирский И.Э. Отечественные и зарубежные компьютерные программы в создании и прогнозировании свойств новых лекарственных средств // X Международной молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии: Тез. докл. 12-19 сентября 2006 г., Владивосток. Владивосток: Изд-во ДВО РАН, 2006. С. 34.

4. Памирский И.Э., Блоцкий P.A., Штарберг М.А. Сравнительное исследование ингибирования трипсина фармацевтическим препаратом «Гордокс» и ингибитором из бобов сои // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VIII региональной научно-практической конференции. 17-18 мая 2007 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2007. Книга 1. С. 228.

5. Памирский И.Э., Блоцкий P.A., Штарберг М.А. Проблемы моделирования первичной структуры белков // Молодежь 21 века: Шаг в будущее: Материалы VIII региональной научно-практической конференции. 17-18 мая 2007 г., Благовещенск. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2007. Книга 2. С. 110.

6. Borodin Е., Pamirski I., Shtarberg M., Gorin A., Anikin S., Beloglazova I. Proteolysis, protease inhibitors and soya. In: Studies on Drugs Used in Traditional Therapy // IV Russia and China Medical Forum: Book of Abstract. 10-12 September 2007, Blagoveshchensk. Blagoveshchensk: ASMA, 2007. P. 31-35.

7. Pamirski I.E., Shtarberg M.A., Beloglazova I.G., Borodin E.A. The influence of soy bean trypsin inhibitor on some biologically relevant proteolitic processes in vitro and in vivo // Book of- Abstract, Commemorating 15 years of Russia-Japan Medical Exchange under the guidance of Japan-Russia Medical Exchange Foundation (1992-2007): Book of Abstract. 21-22 September 2007, Blagoveshchensk. Blagoveshchensk: ASMA, 2007. P. 82.

8. Памирский И.Э., Штарберг M.A., Белоглазова И.Г., Бородин Е.А. Влияние трипсина и ингибитора трипсина соевых бобов на свертывание крови, фибринолиз, агрегацию тромбоцитов и гемолитическую активность комплемента in vitro // Дальневосточный медицинский журнал. 2008. № 1. С. 98-100.

Выражаю благодарность заведующему кафедры биохимии АГМА, д.м.н., профессору Бородину Евгению Александровичу за руководство и приобретенный опыт, заведующему кафедры физиологии, д.м.н., профессору Григорьеву Роману Николаевичу и к.м.н., доценту Матыцину Анатолию Петровичу за научные консультации, с.н.с. ЦНИЛ АГМА, к.м.н., Штарбергу Михаилу Анатольевичу, к.м.н., Тиханову Виктору Ивановичу, Белоглазовой Ирине Геннадьевне, Корпушиной Людмиле Петровне, Шильниковой Тамаре Михайловне за помощь в проведении лабораторных исследований, Памирскому Эдуарду Павловичу за предоставление необходимой литературы.

Памирский Игорь Эдуардович

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 20.09.2009. Бумага «Снежинка». Ризография. Тираж 100 экз. Зак. 732.

Отпечатано в типографии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

675000, Благовещенск, ул. Горького, 95

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Памирский, Игорь Эдуардович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Система протеолиза в организме человека.

Глава 2. Регуляция протеолиза.

Глава 3. Исследование высокомолекулярных соединений методами биоинформатики.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 4. Материалы и методы.

Глава 5. Исследование апротинина и соевого ингибитора трипсина методами биоинформатики (in silico).

5.1. Обзор компьютерных программ, баз данных и серверов.

5.2. Определение степени гомологии аминокислотных последовательностей ингибиторов.

5.3. Определение спектров биологической активности ингибиторов.

5.4. Построение электронных третичных структур ингибиторов.

Глава 6. Определение трипсин-ингибиторной активности апротинина и соевого ингибитора трипсина in vitro.

Глава 7. Исследование влияния апротинина и соевого ингибитора трипсина на протеолитические системы крови in vitro.

7.1. Исследование свертывания крови и фибринолиза.

7.2. Исследование агрегации тромбоцитов.

7.3. Исследование системы комплемента.

Глава 8. Исследование влияния приема изолята соевого белка, содержащего соевый ингибитор трипсина, на уровень общей протеолитической и трипсин-ингибиторной активности в сыворотке крови людей.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ степени структурной и функциональной однотипности поливалентного ингибитора протеаз, содержащегося в поджелудочной железе животных, и соевого ингибитора трипсина"

Актуальность темы. Ферментативный гидролиз белков (протеолиз) лежит в основе регуляции важных физиологических процессов (переваривание белковых компонентов пищи, образование кровеносных сосудов, иммунный ответ, секреция) на разных уровнях организации (Seiki, Yana, 2003; Chondrogianni, Gonos, 2008; Skorko-Glonek, Sobiecka-Szkatuia, 2008). Протекание протеолиза обеспечивается большим количеством протеолитических ферментов (протеаз), которые способны функционировать внутри и вне клеток. Типичными представителями ферментов класса протеаз являются трипсин, калликреин, тромбин, плазмин, урокиназа, пепсин, дуоденаза, катепсины. Протеолиз регулируется преимущественно белками-ингибиторами, составляющими мощный антипротеолитический потенциал организма. Белки-ингибиторы встречаются в организмах млекопитающих, червей, микробов и растений (Zavasnik-Bergant, 2008). Предотвращая преждевременную и чрезмерную активность, либо полностью блокируя работу протеолитических ферментов, ингибиторные белки участвуют в механизмах многих сопряженных с протеолизом процессов, таких как свертывание крови, распад фибринового сгустка, активация комплемента и других. Функциональная деятельность ингибиторов не ограничивается влиянием на протеазы, они также могут препятствовать действию цитокинов, токсинов и ряда других биологически активных веществ (Зорин и соавт., 1995).

Особую группу белков-ингибиторов животного происхождения составляют серпины. Серпины ингибируют сериновые протеазы — ключевые ферменты, отвечающие за функционирование и взаимосвязь физиологических систем организма (пищеварение, иммунитет, гемостаз и др.). К характерным представителям данной группы белков относят гирудин, агантитрипсин, а2-макроглобулин и другие. Особый интерес представляет поливалентный ингибитор протеаз (апротинин), выделенный из органов крупного рогатого скота, который активно практикуется как регулятор протеолиза в организме человека. Аналоги белков-ингибиторов животного происхождения обнаружены у таких растений как табак, горчица, картофель, пшеница, соя и другие (Дунаевский и соавт., 2005; Мосолов, Валуева, 2005). В частности, к ним относятся ингибиторы из соевых бобов, способные препятствовать действию сериновых протеаз подобно серпинам. К сожалению, вопрос о структурной и функциональной однотипности протеазных ингибиторов, присутствующих в организмах животных и растений, имеет существенные пробелы. Поэтому в качестве объектов сравнения были выбраны поливалентный ингибитор протеаз поджелудочной железы животных (апротинин) и соевый ингибитор трипсина. Кроме того, актуальность данного исследования обуславливается исключительно важной ролью регуляторов протеолиза в функционировании физиологических процессов.

Цель работы: проанализировать степень структурной гомологии и л функциональную однотипность апротинина животного происхождения и соевого ингибитора трипсина (СИТ).

Задачи исследования:

2. Определить трипсин-ингибиторную активность апротинина и СИТ в опытах in vitro.

4. Определить влияние апротинина и СИТ на фибринолиз (время фибринолиза).

5. Сравнить влияние апротинина и СИТ на агрегацию тромбоцитов (скорость и степень агрегации).

Положения, выносимые на защиту:

Результаты данного исследования позволяют глубже понять механизмы ряда физиологических процессов (гемостаза, неспецифических гуморальных и клеточных защитных механизмов), сопряженных с протеолизом.

Предложен метод исследования гемолитической активности системы комплемента in vitro.

Апробация диссертации. Результаты исследования доложены и обсуждены на VII и VIII региональных научно-практических конференциях «Молодежь 21 века» (Благовещенск, 2006, 2007), X Дальневосточной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2006), IV Международном Российско-Китайском фармацевтическом форуме (Благовещенск, 2007) и XV Российско-Японском медицинском симпозиуме (Благовещенск, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья в журнале, включенном в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», утвержденный ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Памирский, Игорь Эдуардович

ВЫВОДЫ

1. Первичные структуры и спектры биологической активности апротинина и СИТ гомологичны in silico.

2. СИТ и апротинин обладают одинаковой трипсин-ингибиторной активностью in vitro.

3. СИТ и апротинин в равной степени препятствуют свертыванию крови, фибринолизу и агрегации тромбоцитов. СИТ замедляет время свертывания, протекающего по внешнему и внутреннему пути, а апротинин — только по внутреннему пути.

4. Оба ингибитора полностью блокируют фибринолиз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

3. Полученные данные можно использовать при поиске и разработке новых регуляторов протеолиза в организме человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Памирский, Игорь Эдуардович, Благовещенск

1. Акбашева О.Е., Суханова Г.А., Щепеткин И.А. и др. Показатели протеолиза в оценке резобрции при опухолях кости // Клин, лабор. диагн. 2000. № 11. С. 23-33.

2. Андреенко Г.В., Кудряшов Б.А. Экспериментальный тромбоз и его профилактика ингибитором трипсина // Вопр. мед. химии. 1961а. № 1. С. 70-74.

3. Андреенко Г.В., Кудряшов Б.А. Влияние ингибитора трипсина из соевых бобов на свертывание крови // Вопр. мед. химии. 1961b. №5. С. 513-519.

4. Арчаков А.И., Иванов Д.Ю., Раченкова Н.И. и др. Исследование взаимодействия трипсина с соевым ингибитором трипсина с помощью метода оптического биосенсора // Биомед. химия. 2005. № 6. С. 617-625.

5. Басанова А.В., Баскова И.П., Завалова JI.JI. Регуляторы тромбоцитарно-сосудистош и плазменного звеньев гемостаза из кровососущих // Биохимия. 2002. Т. 67, Вып. 1. С. 167-176.

6. Белова J1.A., Оглобина О.Г., Саталкин А.А. и др. Дисбаланс протеиназно-ингибиторной системы при акушерском сепсисе и септическим шоке // Клин, лабор. диагностика. 2003. № 7. С. 13-16.

7. Бельтюков П.П., Галебская JI.B, Симкина Н.Б. и др. Состояние системы комплемента человека после протеолитической обработки in vitro II Вест. Моск. Университета. 2003. С. 2, Т. 44, № 1. С. 24-25.

8. Бородин Е.А., Аксенова Т.В., Анищенко Н.И. Пищевые продукты из сои. Новая роль // Вестник ДВО РАН. 2000. № 3. С. 72-85.

9. Бородин Е.А., Бородина Г.П., Штарберг М.А. и др. Исследование влияния питательных соевых коктейлей и витамина Е на биохимические показатели сыворотки крови у здоровых молодых людей // Дальневост. мед. журнал. 2003. № 3. С. 14-17.

10. Веремеенко К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской практике. Киев: «Здоров'я», 1971. 217 с.

11. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П. Протеолиз и злокачественный рост (Обзор) // Вопр. мед. химии. 1986. № 6. С. 17-25.

12. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. Киев: «Здоров'я», 1988. 198 с.

13. Вовчук И.Л., Бендерская Н.В., Чернадчук С.С. и др. Тканевые протеиназы опухолей яичника и матки // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. 2001. Т. 14, № 2. С. 17-20.

14. Гинодман Л.М. О механизме функционирования пептидогидролаз // Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46, № 5. С. 477.

15. Гладышева И.П., Попыкина Н.А., Замолодчикова Т.С., Ларионова Н.И. Взаимодействие дуоденазы с а 1-ингибитором протеаиназ // Биохимия. 2001. Т. 66, Вып. 6. С. 839-845.

16. Гомазков О.А. Система эндотелиновых пептидов: механизмы кардио-васкулярных патологий // Вопр. мед. химии. 1999. № 4. С. 60-81.

17. Грицюк Т.Л., Кузнецова Т.А. Компоненты комплемента и иммунные комплексы у онкологических больных // Тихоокеан. мед. журнал. 2005. № 4. С. 17-19.

18. Дементьева И.И., Чарная М.А., Дземешкевич С.Л., Зюляева Т.П. Превентивная роль больших доз апротинина в снижении степени нарушений метаболизма при операциях аортокоронарного шунтирования // Анестезиология и реаниматология. 1996. № 1. С. 55-58.

19. Доценко В.Л., Нахинян Р.И., Соловьева Н.И. и др. Протеолитические ферменты слезной жидкости как факторы патогенеза хронических язв роговой оболочки глаза // Вопр. мед. химии. 1990. № 3. С. 73-76.

20. Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Белякова Г.А., Домаш В.И., Шарпио Т.П., Забрейко С.А., Белозерский М.А. Ингибиторы протеиназ какантистрессовые белки высших растений // Прик. биох. и микробиол. 2005. Т. 41, №4. С. 392-396.

21. Дэвени Е., Гергей Я. В кн.: Аминокислоты, пептиды и белки. Под ред. НезлинаР.С. Москва: «Мир», 1976. 168 с.

22. Дюкова Е.В. Активность протеиназ и их ингибиторов при воспалительных заболеваниях кожи: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Новосибирск, 2004. 20 с.

23. Елисеева Ю.Е. Ангиотензин-превращающий фермент, его физиологическая роль // Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46, № 5. С. 53-60.

24. Ефременко Ю.Р., Конторщикова К.Н. Состояние системы протеолиза в условиях окислительных воздействий на организм // Нижегородский мед. журнал. 2003. № 1. С. 15-21.

25. Зорин Н.А., Жабин С.Г., Козлов И.Г., Горлина Н.К. и др. Изучение Реакций между ингибиторами протеиназ плазмы крови и коллагеном // Вопр. мед. химии. 1995. Т. 41, № 6. С. 53-55.

26. Иванов В.В., Пучков К.В. Система гемостаза при хирургическом стрессе: дискуссионные аспекты факторов тромбоопасности при лапароскопических вмешательствах // Тихоокеан. мед. журнал. 2007. № 1.С. 31-33.

27. Кирпиченок JI.H., Гидранович Л.Г., Шиленок В.Н. Активность протеолитических процессов при заболеваниях щитовидной железы // Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46, № 5. С. 518-519.

28. Козлов JI.B., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, СЗ, С4 и С5 // Биоорг. химия. 1982. Т. 8, № 5. С. 652-659.

29. Инструкция по определению агрегационной активности тромбоцитов на анализаторе АР 2110. Минск: Издательство «Солар», 1995. 22 с.

30. Мазо В.К., Садыкова Р.Е., Саменкова Н.Ф. Переваривание ингибиторов трипсина в ЖКТ взрослых крыс // Патол. физиол. и экспер. терапия. 1984. №5. С. 51-53.

31. Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д., Рупакова С.А. Лизосомальные ферменты фагоцитирующих клеток в патогенезе воспаления // Вопр. мед. химии. 1987. № 5. С. 48-52.

32. Мизулин Ф.Ф. «Воспаление» Электронный ресурс.: лекция, Новосибирск, 1995. Режим доступа: http://www.5ka/50/l0594/1.html (дата обращения 25.09.2006).

33. Михайлов И.Б. Клиническая фармакология. Санкт-Петербург: «Фолиант», изд. третье, 2002. 451 с.

34. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. Москва: Наука, 1971. 414 с.

35. Мосолов В.В., Васькова Л.П., Кротова Л.И. Влияние дезаминирорвания на реакцию химотрипсина с природными ингибиторами // Биохимия. 1974. Т. 39, Вып. 4. С. 725-731.

36. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений (Обзор) // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т. 41, № 3. С. 261-282.

37. Моссе Д., Пернолле Д. Химия и биохимия бобовых. Москва: Агропромиздат, 1986. 248 с.

38. Нагорная В.Ф. Роль энзимов в патогенезе опухолей гениталий // Акушерство и гинекология. 1989. № 4. С. 11-15.

39. Нартикова, В.Ф., Пасхина Т.С. Определение антитриптической активности в сыворотке крови человека // Современные методы в биохимии. Под. ред. Ореховича В.Н. Москва: Медицина, 1977. С. 188191.

40. Никулин А.А. Никулин А.А. Препараты ферментов и коферментов, активаторы и ингибиторы ферментов. Уч. пособие. Министерствоздравоохранения РСФСР, Рязанский медицинский ин-т им. акад. И.П. Павлова. Рязань, 1989. 103 с.

41. Пашин B.C., Киридон О.А., Карабаш А.П., Родькин Д.В., Бояркин С.В., Копырин А.А. Оптимизация режима антикоагулянтной терапии у больных с тромбозом глубоких вен в условиях стационара // Тихоокеан. мед. журнал. 2007. № 3. С. 43-44.

42. Подорольская JI.B., Андреенко Г.В., Полянцева JI.P. и др. Активаторы и ингибиторы фибринолиза при хроническом гломерулонефрите и амилоидозе // Вопр. мед. химии. 1996. Т. 42, № 4. С. 322-327.

43. Потетинова Ж.В., Воюшина Т.Л., Дрозд Н.Н., Макаров В.А. Пути фармакологического ингибирования активности тромбина и плазмина // Эксперим. и клин, фармакология. 2001. Т. 64, № 5. С. 72-78.

44. Пучков К.В., Иванов В.В. Эндовидеохирургия малых пространств: особенности реакции системы гемостаза // Тихоокеан. мед. журнал.2007. №4. С. 58-61.

45. Ротанова Т.В. Энергозависимый селективный внутриклеточный протеолиз. Строение, активные центры и специфичность АТР-зависимых протеиназ // Вопр. мед. химии. 2001. Т. 47, № 1. С. 3-19.

46. Соловьева Н.И., Волкова З.И. Исследование протеолитической активности клеток крови при ревматоидном артрите // Вопр. мед. химии. 1990. Т. 36, №3. С. 48-52.

47. Соловьева Н.И., Елисеева Ю.А., Локшина Л.А. Протеолитические ферменты и их биологические функции // Вестник Российск. Академии Наук. 1995. № 2. С. 3-9.

48. Сперанская А.С., Криницына А.А., Ревина Т.А., Герасимова Н.Г., Керученько Я.С., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Гетерологичная экспрессия, очистка и свойства белка-ингибитора сериновых протеиназ из картофеля//Биохимия. 2006. Т. 71, Вып. 11. С. 1451-1458.

49. Степанов В.М. Современные проблемы физиологии пищеварения // Росс, журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1998. № 1.С. 37-41.

50. Суханова Г.А., Кондратьева Е.И., Спирина JI.B. Значение калликреина, ангиотензин-превращающего фермента и ингибиторов протеолиза при сосудистых осложнениях сахарного диабета типа 1 у детей // Клин, лабор. диагностика. 2004. № 5. С. 38-40.

51. Сыновец А.С., Левицкий А.П. Ингибиторы протеолитических ферментов в медицине. Киев: «Здоров'я», 1985. 72 с.

52. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. Под ред. Курганова Б.И. Москва: «Мир», 1980. 432 с.

53. Цыбина Т.А., Попыкина Н.А., Ларионова Н.И., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Катионные ингибиторы сериновых протеиназ из семян гречихи: изучение взаимодействия с экзогенными ферментами // Биохимия. 2004. Т. 69, Вып. 4. С. 544-548.

54. Чарная М.А., Дементьева И.И., Использование апротинина при хирургических вмешательствах, сопряженных с высоким риском геморрагических осложнений // Хирургия. 2005. № 11. С. 71-76.

55. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. Под ред. Попова Е.М. Москва: «Мир», 1982. 358 с.

56. Щербак И.Г. Биологическая химия. Уч-к для мед. вузов. Ред. Габалевская Л.В. Изд-во СПбГМУ, 2005. 276 с.

57. Яровая Г.А. Калликреин-кининовая система: новые факты и концепции (Обзор) // Вопр. мед. химии. 2001. Т. 47, № 1. С. 20-42.

58. AbuMweis S.S., Jones P.J. Cholesterol-lowering effect of plant sterols // Curr. Atheroscler Rep. 2008. Vol. 10, № 6. P. 467-472.

59. Akbasheva, O.E. Parameters of plasma blood proteolysis and phenotypes of alphal-proteinase inhibitor in children with duodenal ulcer // Biomed. Khim.2007. Vol. 53, № з. p. 338-344.

60. Al-Majid S., Waters H. The biological mechanisms of cancer-related skeletal muscle wasting: the role of progressive resistance exercise // Biol. Res. Nurs.2008. Vol. 10, № l.P. 7-20.

61. Ambesi-Impiombato A., Bernardo D. Computational Biology and Drug Discovery: From Single-Target to Network Drugs // Curr. Bioinformatics. 2006. Vol. l.P. 3-13.

62. Anderson J.W. Beneficial effects of soy protein consumption for renal function // Asia Рас. J. Clin. Nutr. 2008. Vol. 17, Suppl. 1. P. 324-328.

63. Arbogast H.P. Thrombin: antithrombotic properties and pharmacological consequences // Hamostaseologie. 2004. Vol. 24, № 3. p. 179-190.

64. Bas M., Adams V., Suvorava Т., Niehues Т., Hoffmann Т.К., Kojda G. Nonallergic angioedema: role of bradykinin // Allergy. 2007. Vol. 62, № 8. P. 842-856.

65. Bashir Т., Pagano M. Aberrant ubiquitin-mediated proteolysis of cell cycle regulatory proteins and oncogenesis // Adv. Cancer. Res. 2003. Vol. 88. P. 101-144.

66. Beierlein W., Scheule A.M., Dietrich W., Ziemer G. Forty years of clinical aprotinin use: a review of 124 hypersensitivity reactions // Ann. Thorac. Surg. 2005. Vol. 79, № 2. P. 741-748.

67. Bent S. Herbal medicine in the United States: review of efficacy, safety, and regulation: grand rounds at University of California San Francisco Medical Center // J. Gen. Intern. Med. 2008. Vol. 23, № 6. P. 854-859.

68. Bernstein I.L. Hereditary angioedema: a current state-of-the-art review, II: historical perspective of non-histamine-induced angioedema // Ann. Allergy Asthma Immunol. 2008. Vol. 100, № 1, Suppl. 2. P. S2-6.

69. Bernstein J.A. Hereditary angioedema: a current state-of-the-art review, VIII: current status of emerging therapies // Ann. Allergy Asthma Immunol. 2008. Vol. 100, № 1, Suppl 2. P. S41-46.

70. Blow D., Janin J., Sweet R.M. Mode of action of soybean trypsin inhibitor (Kunitz) as a model for specific protein-protein interactions // Nature. 1974. Vol. 3, № 249. P. 52-57.

71. Blundell T.L., Bancinyane L. Sibanda K., Montalvao R.W. et al. Structural biology and bioinformatics in drug design: opportunities and challenges for target identification and lead discovery // Phil. Trans. R. Soc. B. 2006. Vol. 361. P. 413-423.

72. Bracho F.A. Hereditary angioedema // Curr Opin Hematol. 2005. Vol. 12, № 6. P. 493-508.

73. Btihling F., Groneberg D., Welte T. Proteases and their role in chronic inflammatory lung diseases // Curr. Drug Targets. 2006. Vol. 7, № 6. P. 751759.

74. Butenas S., Mann K. Blood Coagulation // Biochemistry (Moscow). 2002. Vol. 67, № i.p. 3-12.

75. Chondrogianni N., Gonos E. Proteasome activation as a novel antiaging strategy // IUBMB Life. 2008. Vol. 60, № 10. P. 651-655.

76. Cicardi M., Zingale L., Zanichelli A., Pappalardo E., Cicardi B. CI inhibitor: molecular and clinical aspects // Springer Semin Immunopathol. 2005. Vol. 27, №3. P. 286-298.

77. Cicardi M., Zingale L.C., Zanichelli A., Deliliers D.L., Caccia S. The use of plasma-derived CI inhibitor in the treatment of hereditary angioedema // Expert Opin Pharmacother. 2007. Vol. 8, № 18. P. 3173-3181.

78. Connors J.J. 3rd. Pharmacologic agents in stroke prevention, acute stroke therapy, and interventional procedures // J. Vase. Interv. Radiol. 2004. Vol. 15, № 1, Pt. 2. P. S87-101.

79. Correale M., Brunetti N.D., De Gennaro L., Di Biase M. Acute phase proteins in atherosclerosis (acute coronary syndrome) // Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 2008. Vol. 6, № 4. P. 272-277.

80. Cottrell G.S., Coelho A.M., Bunnett N.W. Protease-activated receptors: the role of cell-surface proteolysis in signaling // J. Essays Biochem. 2002. V. 38. P. 169-183.

81. Csaky I., Fekete S. Soybean: feed quality and safety. Part 1: biologically active components. A review // Acta. Vet. Hung. 2004. Vol. 52, № 3. P. 299313.

82. Davie, E.W., Fujikawa, K., Kisiel, W. The coagulation cascade: initiation, maintenance, and regulation // Biochemistry. 1991. Vol. 30. 10363—10370.

83. Davis A.E. 3rd, Cai S., Liu D. CI inhibitor: biologic activities that are independent of protease inhibition // Immunobiology. 2007. Vol. 212, № 4. P. 313-323.

84. Debigare R., Price S.R. Proteolysis, the ubiquitin-proteasome system, and renal diseases // J. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2003. Vol. 285, № 1. P. 1-8.

85. Di Masi J.A., Hansen R.W., Grabowski H.G. The price of innovation: new estimates of drug development costs // J. Health Econ. 2003. Vol. 22. P. 151185.

86. Doherty F.J., Dawson S., Mayer R.J. The ubiquitin-proteasome pathway of intracellular proteolysis // J. Essays Biochem. 2003. Vol. 38. P. 51-63.

87. Doucet A., Overall C.M. Protease proteomics: revealing protease in vivo functions using systems biology approaches // Mol. Aspects Med. 2008. Vol. 29, № 5. P. 339-358.

88. Dupont D.M., Madsen J.B., Kristensen Т., Bodker J.S., Blouse G.E., Wind Т., Andreasen P. A. Biochemical properties of plasminogen activator inhibitor-1 // Front Biosci. 2009. Vol. 1, № 14. P. 1337-1361.

89. Edwards D.R., Handsley M.M., Pennington C.J. The ADAM metalloproteinases // Mol. Aspects Med. 2008. Vol. 29, № 5. P. 258-289.

90. Ekins S., Mestres J., Testa B. In silico pharmacology for drug discovery: applications to targets and beyond // British Journal of Pharmacology. 2007. Vol. 152. P. 21-37.

91. Fareed J., Iqbal O., Cunanan J., Demir M., Wahi R., Clarke M., Adiguzel C., Bick R. Chaining trends in anti-coagulant therapies. Are heparins and oral anti-coagulants challenged // Int. Angiol. 2008a. Vol. 27, № 3. P. 176-192.

92. Fareed J., Hoppensteadt D.A., Fareed D., Demir M., Wahi R., Clarke M., Adiguzel C., Bick R. Survival of heparins, oral anticoagulants, and aspirin after the year 2010 // Semin Thromb Hemost. 2008b. Vol. 34, № 1. P. 58-73.

93. Freeman M. Rhomboid proteases and their biological functions // Annu. Rev. Genet. 2008. Vol. 42. P. 191-210.

94. Fritz H., Jochum M. Granulocyte proteinases as mediators of unspecific proteolysis in inflammation: a review // In: Goldberg D.M, Werner M. Selected Topics in Clinical Enzymology 2: Walter de Gruyter, Berlin, 1984. Vol. 2. P. 305-328.

95. Gao Z., Li H., Zhang H. et al. PDTD: a web-accessible protein database for drug target Identification // BMC Bioinformatics. 2008. Vol. 9. P. 104.

96. Geromichalos G.D. Importance of molecular computer modeling in anticancer drug development. J. Buon. 2007. Vol. 12, Suppl. 1. P. S101-118.

97. Gibbons G.H., Dzau V.J. The emerging concept of vascular remodeling // N. Engl. J. Med. 1994. Vol. 330, № 20. P. 1431-1438.

98. Glaumann H., Ahlberg J., Berkernstam A., Henell F. Rapid isolation of rat liver secondary lysosomes—autophagic vacuoles—following chloroquine administration//Exp. Cell. Res. 1986. Vol. 163. P. 151-158.

99. Hall K.D., Baracos V.E. Computational modeling of cancer cachexia // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2008. Vol. 11, № 3. P. 214-221.

100. Hanson W.M., Domek G.J., Horvath M.P., Goldenberg D.P. Rigidification of a flexible protease inhibitor variant upon binding to trypsin // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 366. P. 230-243.

101. He S.H., Chen H.Q., Zheng J. Inhibition of tryptase and chymase induced nucleated cell infiltration by proteinase inhibitor // Acta Pharmacol Sin. 2004. Vol. 25, № 12. P. 1677-1684.

102. Hiemstra P.S. Novel roles of protease inhibitors in infection and inflammation // Biochem. Soc. Trans. 2002. Vol. 30, № 2. P. 116-120.

103. Hoppensteadt D.A., Jeske W., Walenga J., Fareed J. The future of anticoagulation // Semin. Respir. Crit. Care Med. 2008. Vol. 29, № 1. P. 9099.

104. Janciauskiene S. Conformational properties of serine proteinase inhibitors (serpins) confer multiple pathophysiological roles // J. Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1535, № 3. P. 221-235.

105. Kadowaki M., Kanazawa T. Amino acids as regulators of proteolysis // J. Nutr. 2003. Vol. 133, № 6, Suppl. 1. P. 2052S-2056S.

106. Kandzari D.E. Future perspectives on antithrombin and antiplatelet therapies: novel antiplatelet and antithrombin therapies // Rev. Cardiovasc. Med. 2006. Vol. 7, Suppl. 3. P. S43-52.

107. Kennedy A.R. The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as anticarcinogenic agent // Am. J. Clin. Nutr. 1998. Vol. 68, № 6. P. 1406-1412.

108. Khan H., Salman K., Ahmed S. Alpha-1 antitrypsin deficiency in emphysema // J. Assoc. Physicians. India. 2002. Vol. 50. P. 579-582.

109. Klauss V., Spannagl M. Thrombin inhibitors and anti-factor Xa agents in the treatment of arterial occlusion // Curr. Drug Targets. 2006. Vol. 7, № 10. P. 1285-1290.

110. Kobayashi H., Yoshida R., Kanada Y. et al. Suppression of lipopolysaccharide-induced cytokine production of gingival fibroblasts by a soybean, Kunitz trypsin inhibitor // J. Periodontal Res. 2005a. Vol. 40, № 6. P. 461-468.

111. Kobayashi H., Yoshida R., Kanada Y. et al. A soybean Kunitz trypsin inhibitor reduces tumor necrosis factor-alpha production in ultraviolet-exposed primary human keratinocytes // Exp. Dermatol. 2005b. Vol. 14, № 10. P. 765-774.

112. Kobayashi H., Yoshida R., Kanada Y. et al. Dietary supplementation of soybean kunitz trypsin inhibitor reduces lipopolysaccharide-induced lethality in mouse model // Shock. 2005c. Vol. 23, № 5. P. 441-447.

113. Kockar С., Kockar O., Ozturk M., Dagli M., Bavbek N., Kosar A. Global fibrinolytic capacity increased exponentially in metastatic colorectal cancer // Clin. Appl. Thromb Hemost. 2005. Vol. 11, № 2. P. 227-230.

114. Kuchan M.J., Frangos J.A. Shear stress regulates endothelin-1 release via protein kinase С and cGMP in cultured endothelial cells // Am. J. Physiol. 1993. Vol. 264. P. 150-156.

115. Kuester D., Lippert H., Roessner A., Krueger S. The cathepsin family and their role in colorectal cancer // Pathol. Res. Pract. 2008. Vol. 204, № 7. P. 491-500.

116. Kurzer M.S. Soy consumption for reduction of menopausal symptoms // Inflammopharmacology. 2008. Vol. 16, № 5. P. 227-229.

117. Lambert L.A., Whyteside A.R., Turner A.J., Usmani B.A. Isoforms of endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1) have opposing effects on prostate cancer cell invasion // Br. J. Cancer. 2008. Vol. 99. P. 1114-1120.

118. Lancaster L.H., Christman J.W., Blackwell T.R., Koay M.A., Blackwell T.S. Suppression of lung inflammation in rats by prevention of NF-kappaB activation in the liver // Inflammation. 2001. Vol. 25, № 1. p. 25-31.

119. Law R., Zhang Q., McGowan S., Buckle A., Silverman G., Wong W., Rosado C., Langendorf C., Pike R., Bird B. and Whisstock J. An overview of the serpin superfamily // Genome Biology. 2006. Vol. 7,1. 5, A. 216. P. 1-11.

120. Lehman S.J., Chew D.P. Bivalirudin in percutaneous coronary intervention // Vase. Health Risk Manag. 2006. Vol. 2, № 4. P. 357-363.

121. Lepor N.E. Anticoagulation for acute coronary syndromes: from heparin to direct thrombin inhibitors // Rev. Cardiovasc. Med. 2007. Vol. 8, Suppl. 3. P. S9-17.

122. Levin E.R. Endothelins // N. Engl. J. Med. 1995. Vol. 333. № 6. P. 356-363.

123. Li Q., Lai L. Prediction of potential drug targets based on simple sequence Properties //BMC Bioinformatics. 2007. Vol 8. P. 353-364.

124. Li W., Ye Y. Polyubiquitin chains: functions, structures, and mechanisms // Cell Mol. Life Sci. 2008. Vol. 65, № 15. P. 2397-2406.

125. Lindstedt K.A., Leskinen M.J., Kovanen P.T. Proteolysis of the Pericellular Matrix. A Novel Element Determining Cell Survival and Death in the Pathogenesis of Plaque Erosion and Rupture // Arterioscler. Thromb Vase. Biol. 2004. Vol. 24. P. 1350-1358.

126. Lucas A., McFadden G. Secreted immunomodulatory viral proteins as novel biotherapeutics // J. Immunol. 2004. Vol. 173, № 8. P. 4765-4774.

127. Losso J.N. The biochemical and functional food properties of the bowman-birk inhibitor // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2008. Vol. 48, № 1. p. 94-118.

128. Maignan S., Mikol V. The use of 3D structural data in the design of specific factor Xa inhibitor // J. Curr. Top Med. Chem. 2001. Vol. 1, № 2. P. 161-174.

129. Marfany G., Farms R., Salido E., Xirodimas D.P., Rodriguez M.S. Much to know about proteolysis: intricate proteolytic machineries compromise essential cellular functions // Biochem. Soc. Trans. 2008. Vol. 36, Pt. 5. P. 781-785.

130. Moreau M.E., Garbacki N., Molinaro G., Brown N.J., Marceau F., Adam A. The kallikrein-kinin system: current and future pharmacological targets // J. Pharmacol. Sci. 2005. Vol. 99, № 1. P. 6-38.

131. Moser M., Bode C. Anticoagulation in acute coronary syndrome. An update // Hamostaseologie. 2008. Vol. 28, № 1. P. 62-65.

132. Mota M., Gargavu S., Popa S., Schiopu S., Panduru N.M., Mota E. Soya the medicine food product // Rom. J. Intern. Med. 2007. Vol. 45, № 1. P. 113121.

133. Muszynska A., Janocha E., Fal A.M. Hereditary angioedema -pathophysiology, genetics, symptoms // Pol. Merkur. Lekarski. 2008. Vol. 25, № 145. P. 90-93.

134. Nepomniashchikh T.S., Shchelkunov S.N. Poxviral immunomodulatory proteins as new therapeutics for immunocorrection // Mol. Biol. 2008. Vol. 42, №5. P. 904-912.

135. Nettis E., Colanardi M.C., Loria M.P., Vacca A. Acquired Cl-inhibitor deficiency in a patient with systemic lupus erythematosus: a case report and review of the literature // Eur. J. Clin. Invest. 2005. Vol. 35, № 12. P. 781784.

136. Nichols L., Lagana S., Parwani A. Coronary artery aneurysm: a review and hypothesis regarding etiology // Arch. Pathol. Lab. Med. 2008. Vol. 132, № 5. P. 823-828.

137. Nutescu E.A., Shapiro N.L., Chevalier A. New anticoagulant agents: direct thrombin inhibitors // Clin. Geriatr. Med. 2006. Vol. 22, № 1. P. 33-56, viii.

138. Nutescu E.A., Shapiro N.L., Chevalier A. New anticoagulant agents: direct thrombin inhibitors // Cardiol. Clin. 2008. Vol. 26, № 2. P. 169-187, v-vi.

139. Oliviero C. Rapid Methods for Comparing Protein Structures and Scanning Structure Databases // Current Bioinformatics. 2006. Vol. 1. P. 75-83.

140. Pazos F., Bang J.-W. Computational Prediction of Functionally Important Regions in Protein // Current Bioinformatics. 2006. Vol. 1. P. 15-23.

141. Pengo V. New trends in anticoagulant treatments // Lupus. 2005. Vol. 14, № 9. P. 789-793.

142. Perona J.J., Craik C.S. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases // Protein Science. 1999. Vol. 4, № 3. P. 337-360.

143. Peters J.M. The anaphase-promoting complex: proteolysis in mitosis and beyond // J. Mol. Cell. Molecular Cell. Vol. 9., № 5. P. 931-943.

144. Pierre-Paul P., Benoit A., Boudjeltia K.Z. et al. Anti-hemostatic Effects of a Serpin from the Saliva of the Tick Ixodes ricinus // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 36. P. 26361-26369.

145. Voet D., Voet G. Biochemistry. Solutions Manual. John Wiley & Sons, Inc. 1995.

146. Pontremoli S., Melloni E. Extralysosomal protein degradation // Ann Rev. Biochem. 1986. Vol. 55. P. 455-481.

147. Prechel M., Walenga J.M. The laboratory diagnosis and clinical management of patients with heparin-induced thrombocytopenia: an update // Semin. Thromb Hemost. 2008. Vol. 34, № 1. P. 86-96.

148. Puente X.S., Lopez-Otin C.A. Genomic Analysis of Rat Proteases and Protease Inhibitors // Genome Res. 2004. Vol. 14. P. 609-622.

149. Radovic N., Cucic S., Altarac S. Molecular aspects of apoptosis // Acta Med. Croatica. 2008. Vol. 62, № 3. P. 249-256.

150. Rashed N.A., Macdonald M.H., Matthews B.F. Protease inhibitor expression in soybean roots exhibiting susceptible and resistant interactions with soybean cyst nematode // J. Nematol. 2008. Vol. 40, № 2. P. 138-146.

151. Rawson R.B. Regulated intramembrane proteolysis: from the endoplasmic reticulum to the nucleus // J. Essays Biochem. 2002. Vol. 38, P. 155-168.

152. Redini F., Lafuma C., Horneberk W., Choay J, Robert L. Influence of heparin fragments on the biological activities of elastase(s) and alpha 1 proteinase inhibitor//Biochem. Pharmacol. 1988. Vol. 37. P. 4257-4261.

153. Rementeria A., Lopez-Molina N., Ludwig A., Vivanco A.B., Bikandi J., Ponton J., Garaizar J. Genes and molecules involved in Aspergillus fumigatus virulence // Rev. Iberoam. Micol. 2005. Vol. 22, № 1. P. 1-23.

154. Retelny V.S., Neuendorf A., Roth J.L. Nutrition protocols for the prevention of cardiovascular disease //Nutr. Clin. Pract. 2008. Vol. 23, № 5. P. 468-476.

155. Ribeiro-Oliveira A.Jr., Nogueira A.I., Pereira R.M., Boas W.W., Dos Santos R.A., Simoes e Silva A.C. The renin-angiotensin system and diabetes: an update // Vase. Health. Risk Manag. 2008. Vol. 4, № 4. P. 787-803.

156. Ricagno S., Caccia S., Sorrentino G., Antonini G., Bolognesi M. Human Neuroserpin: Structure and Time-Dependent Inhibition Электронный ресурс.: J. Mol. Biol., 2009. Режим доступа: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez (дата обращения 10.01.2009).

157. Richardson J., Viswanathan K., Lucas A. Serpins, the vasculature, and viral therapeutics // Front. Biosci. 2006. Vol. 1, № 11. P. 1042-1056.

158. Rooijakkers S.H., van Strijp J.A. Bacterial complement evasion // Mol. Immunol. 2007. Vol. 44, № 1. P. 23-32.

159. Rothman M.T. Drug insight: bleeding after percutaneous coronary intervention-risks, measures and impact of anticoagulant treatment options // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2005. Vol. 2, № 9. P. 465-474.

160. Rubin H. Serine protease inhibitors (SERPINS): where mechanism meets medicine // Nat. Med. 1996. Vol. 2. P. 632-633.

161. Rudkowska I. Functional foods for cardiovascular disease in women // Menopause Int. 2008. Vol. 14, № 2. P. 63-69.

162. Sagili R.R., Pankiw Т., Zhu-Salzman K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L.) // J. Insect. Physiol. 2005. Vol. 51. P. 953-957.

163. Sakai Т., Kogiso M. Soy isoflavones and immunity // J. Med. Invest. 2008. Vol. 55, №3. P. 167-173.

164. Salvesen G.S., Riedl S.J. Caspase mechanisms // Adv. Exp. Med. Biol. 2008. Vol. 615. P. 13-23.

165. Santos M.M., Moreira R. Michael acceptors as cysteine protease inhibitors // Mini Rev. Med. Chem. 2007. Vol. 7, № 10. P. 1040-1050.

166. Seiki M., Yana I. Roles of pericellular proteolysis by membrane type-1 matrix metalloproteinase in cancer invasion and angiogenesis // Cancer Sci. 2003. Vol. 94, № 7. P. 569-574.

167. Schulz H., Dale G.E., Karimi-Nejad Y., Oefner C. Structure of human endothelin-converting enzyme I complexed with phosphoramidon // J. Mol. Biol. 2009. Vol. 385. P. 178-187.

168. Sigma. Catalog reagents ang labware. Sigma-Aldrich, Inc. 2006. 1440 p.

169. Silveira N.J.F., Bonalumi C.E., Arcuri H.A., Azevedo Junior W.F. Molecular Modeling Databases: A New Way in the Search of Protein Targets for Drug Development // Current Bioinformatics. 2007. Vol. 2. P. 1-10.

170. Silverman G.A., Bird P.I., Robin W.C. et al. The Serpins Are an Expanding Superfamily of Structurally Similar but Functionally Diverse Proteins // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, №. 36. P. 33293-33296.

171. Sim R.B., Tsiftsoglou S.A. Proteases of the complement system // Biochem. Soc. Trans. 2004. Vol. 32, Pt. 1. P. 21-27.

172. Skorko-Glonek J., Sobiecka-Szkatula A. The extracytoplasmic protein quality control in bacterium Escherichia coli; the role of proteases and the folding factors // Postepy Biochem. 2008. Vol. 54, № 3. P. 317-326.

173. Smith M., Kocher H.M., Hunt B.J. Aprotinin in severe acute pancreatitis Электронный ресурс.: Int. J. Clin. Pract., 2009. Режим доступа: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez (дата обращения 8.01.2009).

174. S0reide, К. Proteinase-activated receptor 2 (PAR-2) in gastrointestinal and pancreatic pathophysiology, inflammation and neoplasia // Scand. J. Gastroenterol. 2008. Vol. 43, № 8. P. 902-909.

175. Steinbuch M. Regulation of proteinase activity. In: Biological Functions of Proteinases. 30 Collog. Mosback-Badenl, 1979. 270 p.

176. Steinbuch M. Regulation of protease activity // Advanc. exp. Med. Biol. 1984. Vol. 167. P. 421-440.

177. Suzuki К. The multi-functional serpin, protein С inhibitor: beyond thrombosis and hemostasis // J. Thromb Haemost. 2008. Vol. 6, № 12. P. 2017-2026.

178. Tanaka K. The protein-destroying machinery // Gan To Kagaku Ryoho. 2008. Vol. 35, № 1. P. 6-10.

179. Tanaka K. The proteasome: overview of structure and functions // Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 2009. Vol. 85, № 1. P. 12-36.

180. Takeda-Shitaka M., Takaya D., Chiba C. et al. Protein structure prediction in structure based drug design // Curr. Med. Chem. 2004. Vol. 11, № 5. P. 551558.

181. Tirado-Conde G., Lara В., Miravitlles M. Augmentation therapy for emphysema due to alpha-1-antitrypsin deficiency // Ther. Adv. Respir Dis. 2008. Vol. 2, № l.P. 13-21.

182. Urban S., Shi Y. Core principles of intramembrane proteolysis: comparison of / rhomboid and site-2 family proteases // Curr. Opin. Struct. Biol. 2008. Vol. 18, №4. P. 432-441.

183. Velasquez M.T., Bhathena S.J. Role of dietary soy protein in obesity // Int. J. Med. Sci. 2007. Vol. 26, № 4. P. 72-82.

184. Villoutreix B.O., Renault N., Lagorce D. et al. Free resources to assist structure-based virtual ligand screening experiments // Curr. Protein Pept. Sci. 2007. Vol. 8, № 4. P. 381-411.

185. Wagenaar-Bos I.G., Hack C.E. Structure and function of CI-inhibitor // Immunol. Allergy Clin. North Am. 2006. Vol. 26, № 4. P. 615-632.

186. Wang K.J., Takahata Y., Kono Y., Kaizuma N. Allelic differentiation of Kunitz trypsin inhibitor in wild soybean (Glycine soja) // Theor. Appl. Genet. 2008. Vol. 117. P. 565-573.

187. Warkentin Т.Е., Greinacher A., Koster A. Bivalirudin // Thromb Haemost. 2008. Vol. 99, № 5. P. 830-839.

188. Wiedow O., Meyer-Hoffert U. Neutrophil serine proteases: potential key regulators of cell signalling during inflammation // J. Intern. Med. 2005. Vol. 257, №4. P. 319-328.

189. Wouters D., Wagenaar-Bos I., van Ham M., Zeerleder S. CI inhibitor: just a serine protease inhibitor? New and old considerations on therapeutic applications of CI inhibitor // Expert. Opin. Biol. Ther. 2008. Vol. 8, № 8. P. 1225-1240.

190. Xiang Z. Advances in Homology Protein Structure Modeling // Curr Protein Pept. Sci. 2006. Vol. 7, № 3. P. 217-227.

191. Xiao C.W. Health effects of soy protein and isoflavones in humans // J. Nutr. 2008. Vol. 138, № 6. P. 1244S-1249S.

192. Yang L., Dong W., He J., Ren X., Yan W. Expression and purification of natural N-terminal recombinant bovine pancreatic trypsin inhibitor from Pichia pastoris // Biol. Pharm. Bull. 2008. Vol. 31. P. 1680-1685.

193. Zavasnik-Bergant T. Cystatin protease inhibitors and immune functions // Front. Biosci. 2008. Vol. 1, № 13. P. 4625-4637.

194. Zhong Q., Xu L., Zhang C., Glatz C.E. Purification of recombinant aprotinin from transgenic corn germ fraction using ion exchange and hydrophobic interaction chromatography // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. Vol. 76. P. 607-613.

195. Zorio E., Gilabert-Estelles J., Espana F., Ramon L.A., Cosin R., Estelles A. Fibrinolysis: the key to new pathogenetic mechanisms // Curr. Med. Chem. 2008. Vol. 15, № 9. P. 923-929.

196. Zuraw B.L., Christiansen S.C. New promise and hope for treating hereditary angioedema // Expert Opin. Investig Drugs. 2008. Vol. 17, № 5. P. 697-706.

Информация о работе

Памирский, Игорь Эдуардович
кандидата биологических наук
Благовещенск, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Анализ степени структурной и функциональной однотипности поливалентного ингибитора протеаз, содержащегося в поджелудочной железе животных, и соевого ингибитора трипсина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы