Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ генетического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Анализ генетического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота"

КОЗЫРЕВА НАТАЛИЯ ГЕННАДИЕВНА

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.01.06. Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 я ДПР 2013

005057420

МОСКВА-2013

005057420

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии)

Официальные оппоненты:

Верховский Олег Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, AHO «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных», президент.

Валихов Алексей Федорович, доктор биологических наук, профессор, «Российский государственный аграрный университет — Московская сельскохозяйственная академия имени К. А. Тимирязева», профессор кафедры. Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная Академия Ветеринарной Медицины».

Защита состоится ."¿tstljl&Ji^ 2013 г. _ч. на заседании

диссертационного совета Д.006.033Д)1 приГосударственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, д.24, кор.1, тел. 8(495) 970-03-67

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, академик Россельхозакадемии, Гулюкин Михаил Иванович

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ездакова

Список сокращений

ПНР - полимеразная цепная реакция

ВЖРС - вирус лейкоза крупного рогатого скота

HTLV - Т-лимфотропный вирус человека (Human T-lymphotropic virus)

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

МЭБ - международное эпизоотическое бюро

GenBank - генетический банк

NCBI - National Center for Biotechnology Information - национальный центр биотехнологической информации США

дНТФ - дезоксинуклеотид трифосфат

NAT - nucleic amplification techniques - методы амплификации нуклеиновых кислот

ПКО - положительный контрольный образец

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

нк - нуклеиновая кислота

п.о. - пара оснований

РИД - реакция иммунодиффузии

ИФА - иммуноферментный анализ

AT - антитела

AT - антиген

кБД - компьютерная база данных

FLK - культура клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированная BJIKPC, продуцирующая BJIKPC

ПААГ - полиакриламидный гель

Т Аотж - температура отжига

М.К. - молекулярная копия

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая лимфопролиферативная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного скота (ВЛКРС), входящего в семейство RETROVIRIDAE. Как типичный представитель рода Deltaretrovirus ВЛКРС широко распространен в мировом масштабе и представляет серьезную угрозу скотоводческой отрасли разных стран (N.L. Huber et al, 1981; F.L. Pollari et al, 1992; Y. Da et al, 1993; R.M. Jacobs et al, 1991; K.G. Trono et al,2001; A. Kurdi et al, 1999; D.D. Motton et al, 2003; S.M. Rodríguez et al, 2011; J. Brenner et al, 1989; К. Trono et al, 1999; M.C. Wu et al, 1989), что делает актуальным изучение молекулярно-генетических аспектов при данной инфекции.

Ретровирусы на сегодняшний день являются важными патогенами как для человека, так и для многих видов животных. Семейство данных вирусов отличается наличием уникального этапа в процессе репликативного цикла -обратной транскрипции, опосредованного ферментом обратной транскриптазой - РНК-зависимой ДНК-полимеразой, которую кодирует ген pol в составе генома ретровирусов (G. Gerald et al, 1980; R. Kettmann et al, 1981).

На основании ветеринарной отчетности Департамента ветеринарии МСХ РФ лейкоз крупного рогатого скота - одно из наиболее распространенных инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. Инфицирован-ность скота в Российской Федерации долгие годы колеблется на уровне 10%. В структуре инфекционной патологии с 1997 года лейкоз КРС занимает одно из первых мест и в настоящее время составляет более 60% (М. И. Гулюкин и др., 2011).

Изучением лейкоза крупного рогатого скота в нашей стране стали заниматься после создания в начале 1961 года лаборатории ВИЭВ по изучению лейкозов сельскохозяйственных животных и птиц. Были разработаны методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота: гематологический (модификация «лейкозного ключа»), патоморфологический. Открытие ВЛКРС (1969) как этиологического агента лейкоза положило начало разработке специфических непрямых (серологических) методов. Долгие годы основой диагностики и оздоровительных мероприятий служила реакция диффузионной преципитации. С 1980г. разработана промышленная технология изготовления наборов методом

РИД. В последние годы разработаны и внедрены в производство диагностические наборы для выявления АТ против ВЛКРС методом ИФА на основе моноклональных АТ. Основу мер борьбы с этой болезнью, таким образом, составляют методы серологической диагностики, поскольку у большинства инфицированных животных вырабатываются антитела против антигенов вируса (М. И. Гулюкин и др.,2011; В.А. Апалькин и др.,2005).

В результате проведения многолетних противолейкозных мероприятий в странах Евросоюза лейкоз КРС фактически ликвидирован (N.Gillet et al,2007). Однако, ситуация в Восточной Европе отличается от таковой в Западной Европе, так как болезнь до сих пор присутствует в Болгарии, Греции, Эстонии, Латвии, Польше, Румынии, Украине (S.M. Rodríguez et а/,2011). Более 10 и 30% молочного и мясного скота в США и Аргентине, соответственно, инфицированы ВЛКРС (S. Dube et al,2009).

Проблема лейкоза крупного рогатого скота имеет непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. Несмотря на то, что случаев естественного инфицирования человека ВЛКРС не выявлено, не исключается вероятность рекомбинации между ВЛКРС и HTLV, что может привести к появлению онкогенных свойств вируса, опасных для человека (А. Биту et al, 1987).

Совершенствование ранней диагностики лейкоза остается по-прежнему актуальным. В ветеринарную практику активно внедряются современные молекулярно-биологические методы - ПЦР как высокочувствительный, специфичный метод прямого выявления возбудителя, секвенирование ДНК, проведение филогенетического анализа. При этом унифицированные методики пробоподготовки, детекции продуктов реакций и автоматизация процессов дают возможность проведения полного спектра анализа генетической информации за короткие сроки.

1.2. Степень проработанности проблемы. Расхождение в нуклеотид-ных последовательностях ВЛКРС, поражающего крупный рогатый скот различных регионов мира, составляет менее 6% для генов pol и env, что свидетельствует о высокой степени консерватизма генома вируса, обусловленной, по-видимому, высокой точностью обратной транскрипции {N.Gillet et al, 2007). Вместе с тем, использование тест-систем на основе гена env приводит к

гораздо большему получению ложноотрицательных результатов исследования по сравнению с серологической диагностикой методом РИД (А.П. Лиманский и др.,2001). Поэтому нуклеотидные последовательности провирусной ДНК гена pol ВЖРС вызывают большой интерес исследователей с точки зрения разработки ПЦР тест-систем для диагностики индуцированной BJ1KPC инфекции.

В Российской федерации были разработаны тест-системы с использованием праймеров, комплементарных фрагментам гена pol BJIKPC (H.A. Мальцева, 2002) на уровне лабораторных образцов, не применяющиеся для практических целей. На ограниченном материале изучен полиморфизм гена pol, кодирующего вирусные ферменты - обратную транскриптазу и интегразу и предложена классификация вариантов ВЖРС по гену pol (М.Н. Рузина, 2012).

1.3. Цель исследований - оптимизировать молекулярно-генетическую диагностику индуцированной ВЖРС инфекции.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать тест-систему с использованием нуклеотидных последовательностей гена pol ВЖРС для молекулярно-генетической диагностики лейкоза методом ПЦР.

2. Оценить универсальность разработанной тест-системы для выявления генетических вариантов BJIKPC, распространенных на территории РФ.

3. Изучить полиморфизм участка провирусной ДНК, амплифицируемого разработанной тест-системой, изолятов вируса, циркулирующих в различных регионах РФ.

4. Изучить возможность диагностики ВЖРС инфекции у телят в возрасте до 6 мес. на фоне колостральных AT и апробировать методику исследования сборных проб крови животных методом ПЦР. Определить место диагностических исследований методом ПЦР в системе профилактических и оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота.

5. Изучить возможность, пути и факторы межвидовой передачи индуцированной BJIKPC инфекции при заражении гетерологичного вида животных -кроликов.

1.4. Научная новизна.

Разработана тест-система для молекулярно-генетической диагностики

лейкоза крупного рогатого скота на основе гена pol ВЖРС. Определена нуклеотидная последовательность целевого участка гена pol изолятов провируса ВЖРС из различных регионов РФ и оценены их филогенетические отношения с изолятами из других стран.

Изучено выявление участков ДНК основных провирусных генов {tax/rex, gag, pol, em) методом ПЦР в динамике при воспроизведении в эксперименте индуцированной ВЖРС инфекции у кроликов.

Подтверждено, что кролики являются чувствительным лабораторным видом животных при внутривенном и пероральном заражении, а молоко инфицированных коров содержит ВЖРС.

1.5. Теоретическая и практическая значимость.

Сконструирована и испытана ПЦР тест-система для диагностики лейкоза

крупного рогатого скота. Для контроля работы праймеров и определения чувствительности тест-системы методом клонирования создан положительный контрольный образец. Определена чувствительность разработанной ПЦР тест-системы. Показана диагностическая универсальность разработанной ПЦР тест-системы при исследовании проб крови животных из различных регионов РФ.

Получен патент N 2445370 «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции».

Предложена схема диагностики ВЖРС-инфекции с применением ПЦР у молодых животных от 0 до 18 месяцев при проведении оздоровительных и профилактических мероприятий в неблагополучных по лейкозу хозяйствах. С целью сокращения экономических затрат и трудоемкости процесса в данную схему включена методика А^Г-минипул-геноскринирования крови, рекомендованная ВОЗ для обеспечения инфекционной безопасности донорской крови.

Депонировано в коллекцию GenBank (NCBI) 9 нуклеотидных последовательностей целевого фрагмента провирусного гена pol ВЖРС с регистрационными номерами: Jg400140-Jg400144, Jß400146-Jg400148, yg429586.

1.6. Личный вклад соискателя. Формулирование целей и задач выполнено совместно с научным руководителем. Лично диссертантом подобраны методы исследования, проведены все исследования и анализ результатов, изложенных в диссертации. Соавторами осуществлялись консультативно-методическая помощь, постановка эксперимента по воспроизведению ВЖРС-

инфекции на кроликах и в некоторых случаях предоставление технической базы для выполнения работы. Диссертация написана лично автором с использованием собственных результатов.

1.7. Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы на основе инновационных достижений» (Россия, Новочеркасск, 16-17.07.2009), Международной научно-практической конференции «Мониторинг, прогнозирование, диагностика и профилактика инфекционных заболеваний с применением методов эпизоотологии, молекулярной биологии и биотехнологии» (Украина, Феодосия, 1417.09.2009), Международной конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвященной 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (Россия, Москва, 26-27.04.2011).

1.8. Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 6 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.9. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. По результатам проведенных исследований в рамках диссертационной работы: разработана ПЦР тест-система для диагностики ВЛКРС инфекции с использованием генно-инженерной конструкции - рекомбинантного положительного контрольного образца; определена нуклеотидная последовательность участков гена pol изолятов провируса, установлены их филогенетические отношения; проведено выявление различных участков провирусного генома ВЛКРС методом ПЦР в рамках экспериментального воспроизведения лейкоза крупного рогатого скота на кроликах, апробирована методика ПЦР исследования сборных проб крови крупного рогатого скота, что соответствует формуле и областям исследований согласно п. 1,9,11, перечисленным в паспорте научной специальности -03.01.06.

1.10. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 175 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собствен-

ные исследования (материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований), выводы, практические предложения, список использованной литературы (который включает 331 источник, в том числе 271 зарубежного автора), приложение. Диссертация содержит 27 таблиц, иллюстрирована 24 рисунками.

1.11. Внедрение результатов исследований. Результаты исследований положены в основу: «Методических наставлений по выявлению ДНК провиру-са лейкоза крупного рогатого скота методом ПНР и пробоподготовке полученного генетического материала с целью дальнейшего определения нуклеотидной последовательности методом секвенирования», рассмотренных и одобренных на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30.09.2010), утв. академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 09.02.2011; патента ÍV 2445370 «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции».

1.12. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка высокоспецифичных праймеров для амплификации фрагмента провирусного гена pol BJIKPC методом ПНР с электрофоретической детекцией.

2. Изучение специфичности и чувствительности тест-системы с использованием разработанных праймеров.

3. Проведение филогенетического анализа изолятов ВЛКРС с различным географическим происхождением.

4. Выявление участков различных провирусных генов в динамике развития инфекционного процесса.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы. Биологический материал. В работе использовали образцы цельной крови, сыворотки крови (20460 пробы) и ДНК (1944 пробы), выделенные из цельной крови животных; из культурального штамма ВЛКРС -FLK-BLV\ вектор pTZ57R, бактериальный штамм E.coli - TG-l:supE thi-lA(lac-proAB)A(mcrB-hsdSM)5(rK- mK-) [F' traD36 proAB lacIqAZM15] в составе набора для клонирования InsTAcloneTM PCR Cloning Kit ("MBI Fermentas", Литва). Всего исследовано животных: крупного рогатого скота - 4181, кроликов - 23.

2.2. Методы. Реакцию иммунодиффузии в геле агара (РИД) проводили согласно «Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота», утвержденным департаментом ветеринарии МСХ РФ от 23.08.2000 с использованием коммерческого набора производства ФГУП «Курская биофабрика фирма «Биок».

Иммуноферментный анализ проводили с использованием коммерческого диагностического набора производства ФГУП «Курская биофабрика фирма «Биок» согласно инструкции производителя.

Выделение ДНК проводили с использованием коммерческих наборов реагентов «Рибо-преп» (преципитация НК изопропанолом), «ДНК-сорб-В» (осаждение НК на сорбенте) (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкциям производителя.

При выборе местоположения олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагмента провирусного гена pol BJIKPC были использованы нуклеотидные последовательности, представленные в банке данных GenBank (США). Выравнивание последовательностей с целью выявления консервативных областей гена pol BJIKPC проводили с использованием программного обеспечения Vector NTI v. 11 (США). Д ля оценки структуры праймеров (проверка качества, термодинамический анализ) использовали программное обеспечение OLIGO v.4.0 (W.Rychlik, 1989). Праймеры проверяли на наличие гомологии со всеми известными штаммами BJIKPC, которые присутствуют в банке данных GenBank, и отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека с помощью программы BLAST интернет ресурса NCBI. Синтез олигонуклеотидов проводили в ООО НПФ «ЛИТЕХ» или ЗАО «Синтол».

Полимеразная цепная реакция. Идентификацию фрагмента провирусного гена pol ВЖРС методом ПЦР, проводили с использованием разработанных нами праймеров PF2/PR2 на программируемом термоциклере «Терцик» в одноразовых пластиковых пробирках объемом 0,5 мл. Состав реакционной смеси объемом 25 мкл: 5 мкл раствора ДНК, 5х ПЦР буфер, ЗмМ MgCl2, 2,5 мМ каждого дНТФ, по 10 пмоль каждого праймера, 5 ед. полимеразы Taq, бидистиллированную воду. Параметры реакции амплификации: денатурация ДНК при 95°С - 3 мин; затем в 35 циклов - денатурация ДНК при 94°С - 20 сек, отжиг праймеров при 62°С - 30 сек, элонгация цепи при 72°С - 1 мин; оконча-

тельная инкубация при 72°С - 3 мин. При проведении «nested» ПЦР использовали праймеры для амплификации участка гена env ВЖРС: OBLV1А-6А {out, внешние), OBLV3-5 (in, внутренние), согласно протоколу из руководства МЭБ (2008) в нашей модификации; e«v5032, e«v5099, env5521r, env5608r согласно протоколу, описанному D. Beier, 2001 в нашей модификации.

Продукты ПЦР анализировали методом электрофоретического разделения в 1,5 или 2% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием (EtBr) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Секвенирование. Для элюции и очистки продуктов амплификации ДНК из агарозного геля использовали набор реагентов «Diatom DNA Elution» (ООО «Лаборатория «Изоген», Россия) согласно инструкции производителя, а также метод фенольной экстракции с преципитацией НК этанолом (Т. Маниатис и др., 1984). Секвенирование ДНК проводили с применением набора BigDye Terminator, v3.1. Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно протоколу производителя. В сиквенсовой реакции использовали праймеры PF2/PR2, амплификатор Palm Cycler (Corbett Research, Австралия). Электрофо-ретическое разделение в ПААГ меченных фрагментов ДНК осуществляли в автоматическом секвенаторе Applied BioSystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) по инструкции производителя.

Этапы разработки праймеров, проверку специфичности тест-системы при анализе ДНК различных вирусов и секвенирование образцов ДНК осуществляли на базе лаборатории «Биофизика» ГНУ ВНИИВВиМ (г. Покров), зав. лаб., д.б.н., проф. С.Ж. Цыбанов. В дальнейшем секвенирование образцов ДНК проводили в ЗАО «Синтол».

Молекулярное клонирование. Процедуру клонирования и скрининг колоний для идентификации клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, осуществляли согласно инструкции производителя к набору для клонирования InsTAchneTM PCR Cloning Kit ("MBI Fermentas", Литва). Выделение плазмид-ной ДНК из культуры клеток Е. Coli проводили с помощью коммерческого набора EndoFree Plasmid Maxi Kit («Qiagen», Германия) по инструкции производителя. Элюцию и очистку ДНК проводили сорбционным методом с использованием набора DNA extraction kit ("MBI Fermentas", Литва). Для верификации результатов конструирования гибридной плазмиды проводили

секвенирование участков ДНК, полученных в результате молекулярного клонирования.

Клонирование фрагмента ДНК проводилось на базе лаборатории генетики бактерий ФГУП Государственного НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика», г. Москва) совместно с к.б.н., с.н.с. Мануховым И.В.

Филогенетический анализ выполняли с помощью пакета программы Mega v.3.1 (S.Kumara, K.Tamura, M.Nei, 2004): дендрограммы построены дистанционными методами присоединения соседей (NJ), минимума эволюции (ME) с использованием алгоритмов дистанций, модели Kimura, бутстрэп-анализа (100 и 1000 случайных выборок).

Апробацию методики (ВОЗ) NAT-минипул-геноскринирование крови для исследования крупного рогатого скота на лейкоз проводили согласно протоколу, изложенному в научно-методическом сборнике авторов С. Бур и др., 2003 с некоторыми модификациями.

Статистические методы. Обработку результатов метода лимитирующих разведений при расчете концентрации ДНК-мишени производили с помощью компьютерной программы QUALITY (С. Taswell, 1981; A. G. Rodrigo etal, 1997).

При использовании компьютерной программы Microsoft® Office Excel 2003 (©Microsoft Corporation, USA) проводились обработка, анализ информации и создание компьютерных баз данных (кБД).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выбор специфичных олигонуклеотидных праймеров для ПЦР.

На основе информации, представленной в электронной БД GenBank (США), создана собственная кБД нуклеотидных последовательностей изолятов ВЛКРС, выбраны референс-последовательность - К02120 (N. Sagata et al, 1985) и наиболее консервативные нуклеотидные области гена pol. Характеристика праймеров приведена в Таблице 1.

При оценке специфичности установлено, что все варианты праймеров гомологичны последовательностям известных штаммов ВЛКРС и не проявляют гомологии с существующими нуклеотидными последовательностями неродственных вирусов, а также генома КРС и человека.

Анализ рассчитанных термодинамических характеристик позволил определить наиболее оптимальные сочетания прямых и обратных праймеров для проведения эффективной амплификации, в результате чего были подобраны следующие системы праймеров: РР1/РШ, РРЗ/РК2, РР2/РЯ2.

Таблица 1.

Характеристика олигонуклеотидных праймеров

Название Направление 5'-3' последовательность Длина праймера, п.о. Т плавления,°С GC состав, % количество палиндромных участков

PF1 прямой gaa асс ааа tgg cgc ctg gag g 22 70 59,1

PR1 обратный ctc ccc tga tcc gat tcc tgc 21 68 61,9

PF2 прямой tga acg gac aaa tgg act get с 22 66 50

PR2 обратный ctc tcc teg ctc tct gtc gg 20 66 65

PF3 прямой gcc ctt gga aga cct taa tea с 22 66 50

PF4 прямой gaa egg аса aat gga ctg ct 20 60 50

PF5 прямой gat gaa egg аса aat gga ct 20 58 45

PR3 обратный tct cac tct cct cgc tct ct 20 62 55

PR4 обратный act ctc ctc get ctc tgt egg с 22 72 63,6

3.2. Оптимизация условий проведения ПЦР. Анализировали образцы ДНК, выделенные из цельной крови серопозитивных животных и контрольный образец ДНК культурального штамма РЬК-ВЬУ.

Время отжига и Тотж для праймеров подбирали эмпирически, изменяя Т^ от 60°С до 64°С, с шагом в 1°С.

Эффективность ПЦР оценивали при следующих условиях: концентрации М%С1г от 1,5 до 5 мМ; концентрации дНТФ от 5 до 20 мМ; концентрация каждого из используемых праймеров 5, 6, 7, 10, 20, 30 пмоль/мкл; количества специфичной матрицы - от 5 до 10 мкл. На основании анализа результатов проведенных экспериментов были подобраны следующие оптимальные концентрации составляющих компонентов реакционной смеси в общем объеме 25 мкл: по 10 пмоль прямого и обратного праймера, 3 мМ MgC^г, 10 мМ каждого дНТФ, 5 ед. 7я<?-полимеразы, 5 мкл экстрагированной ДНК.

Детекцию продуктов ПЦР анализа проводили в 2% агарозном геле мето-

дом электрофореза.

В результате серий экспериментов с использованием систем праймеров PF1/PR1, PF3/PR2 не во всех полевых и контрольных пробах ДНК наблюдался искомый фрагмент. В большинстве случаев не удалось избавиться от присутствия неспецифических продуктов реакции. Скорее всего, это связано с амплификацией достаточно длинных фрагментов ДНК. Была отобрана система праймеров PF2/PR2, позволяющая амплифицировать фрагмент длиной 438 п.о. Праймеры PF2/PR2 подобраны по оптимальным термодинамическим показателям и проявляли 100% комплементарность к исследуемой диагностической мишени у разных штаммов BJIKPC, представленных в БД GenBank. Во всех экспериментах были получены ожидаемые продукты амплификации ДНК провируса лейкоза КРС размером 438 п.о., что свидетельствовало о воспроизводимости результатов.

3.3. Сравнение методик подготовки образцов ДНК для последующей амплификации. По результатам проведенного ПЦР анализа было выявлено, что наиболее эффективно амплицифируются образцы ДНК, выделенные с помощью методики преципитации НК изопропанолом в отличие от сорбцион-ного метода.

3.4. Получение положительного контрольного образца. Для оценки чувствительности разработанной тест-системы был сконструирован рекомби-нантный ПКО на основе ДНК, выделенной из используемого культурального штамма ВЖРС (FLK-BLV) - ПКО ДНК BJIKPC. Амплификацию целевого участка гена pol BJIKPC для встраивания в pTZ57R вектор проводили с помощью разработанных праймеров PF2/PR2.

В результате молекулярного клонирования получена генно-инженерная конструкция — плазмида pBLVpol, содержащая фрагмент гена pol BJIKPC, предназначенная для использования в качестве ПКО в ПЦР, с помощью чего контролируется работа праймеров, разработанных на данный фрагмент провирусного генома, и прохождение реакции амплификации.

3.5. Чувствительность ПЦР с праймерами PF2/PR2 определяли методом 10-кратных и 5-кратных пограничных разведений ПКО ДНК ВЖРС с известной концентрацией. Полученные результаты ПЦР обрабатывали при помощи программы QUALITY. Для граничных 10х и 5х разведений чувстви-

тельность составила, соответственно 1,1х104 м.к./мл (55 м.к./ПЦР) и 1,17х104 м.к./мл (58,5 м.к./ПЦР).

3.6. Для оценки специфичности метода использовали полевые образцы, содержащие провирусную ДНК вирусов артрита-энцефалита коз и овец (САЕУ), иммунодефицита КРС (В1У) (работу с ВIV проводили на базе кафедры биологии ГОУ ВПО МГУПБ, зав. каф., проф. Валихов А.Ф.); музейные штаммы микроорганизмов из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ (г. Покров): Висна К-796, Маэди М-88, артрита-энцефалита коз Тверской 756-63; а также образцы ДНК, выделенные из крови интактных и серонегативных коров. При анализе данных образцов в ПЦР положительных реакций не выявляли.

3.7. Испытания ПЦР с праймерами РР2/РК2 в неблагополучных по лейкозу хозяйствах. Эпизоотическая ситуация и плановые диагностические исследования по лейкозу в хозяйстве N1 Московской области были следующими: 1) при начальном исследовании методом РИД дойного стада инфицирован-ность составляла более 80%, в дальнейшем взрослое поголовье серологическим исследованиям не подвергали; 2) методом РИД исследовали молодых животных в возрасте 6,12 месяцев и перед осеменением и в период 6-7-ой стельности. В связи с отсутствием свободных скотомест оздоровительные противолей-козные мероприятия в данном хозяйстве не проводились.

Учитывая высокий уровень инфицированности в данном хозяйстве, все внимание было уделено выращиванию здорового молодняка. Однако инфици-рованность молодых животных в течение 2001-2009 гг. также была значительной и не проявляла тенденции к снижению. Апробацию ПЦР тест-системы с праймерами РГ2/РЯ2 проводили в сравнении с результатами серологических (РИД, ИФА) исследований.

При исследовании в 2010 г. 1019 проб сыворотки крови животных в возрасте 6-18 месяцев методом РИД было выявлено 142 (13,9%) серопозитивных животных. Второе исследование этой возрастной группы (но без учёта движения поголовья) в количестве 935 животных проводили через 3 месяца и обнаружили 85 (9,1%) серопозитивных животных. В итоге, при проведении двукратного исследования 1954 проб сыворотки крови методом РИД было выявлено 227 вирусоносителей.

В ИФА исследовали 662 пробы сыворотки крови. Совпадение результатов

(РИД7ИФА+; РИД7ИФА") отмечали в 560 (84,6%), несовпадение (РИДТИФА"; РИД7ИФА+) - в 102 (15,5%) случаев. Только 3 РИД+ пробы прореагировали отрицательно в ИФА (0,5%). По результатам ИФА было выявлено 190 (28,7%) положительных проб, тогда как по результатам РИД - только 94 (14,2%) пробы, что на 14,5% или в два раза больше.

Сравнительные исследования чувствительности и специфичности методик РИД, ИФА и ПЦР проводили на двух группах животных численностью 56 и 60 голов, отобранных их числа отрицательных по результатам предыдущих исследований в РИД спустя 1,5-2 и 0,5 месяца из массивов 1019 и 935 голов, соответственно. В первой группе из 56 животных было выявлено 3 (5,4%) РИД* и дополнительно 2 (3,8%) ИФА+ пробы. Серонегативных животных исследовали методом ПНР. Вирусоносителей среди них не выявили. Во второй группе из 60 животных было выявлено 1 (1,7%) РИД* и дополнительно 3 (5%) ИФА+ животных. Среди остальных серонегативных животных выявлен 1 (1,8%) вирусоноситель (ПЦР*). Таким образом, методом РИД было выявлено большинство ВЛКРС инфицированных животных. Комплексные исследования методами ИФА и ПЦР позволили дополнительно выявить еще 5,6% вирусоносителей. Учитывая короткие интервалы между проведенными исследованиями, выявленный процент вирусоносителей представляет собой значительную величину.

В 2009 году проведены исследования животных в возрасте до 6 мес. и до 2-х лет методом ПЦР. В 17 (17,3%) случаях из 98 у животных в возрасте от 14 дней до 6 месяцев и в 26 (23,6%) случаях из 110 у животных в возрасте до 2-х лет была выявлена ДНК провируса ВЖРС.

Таким образом, в хозяйстве М установлена высокая степень перинатальной передачи ВЛКРС и тенденция к дальнейшему повышению уровня инфици-рованности при совместном содержании инфицированных и свободных от ВЛКРС животных.

В хозяйстве N2 Калужской области за период с 2009 по 2011 гг. были проанализированы в динамике 3 возрастные группы исследуемых животных.

Исследование методом ПЦР телят в возрасте от 19 дней до 4 месяцев (I группа) с инфицированностью дойного стада 20% показало, что 3 потомка серопозитивных матерей из 34 (8,8%) были инфицированы ВЖРС.

Вторую группу составляли животные в возрасте от 6 месяцев до 2-х лет в количестве 447 голов. Уровень инфицированности в этой группе животных составил в среднем 8,6 %, что примерно в 2-2,3 раза ниже относительно уровня инфицированности в III группе.

В третью группу, представляющую собой дойное стадо, включены животные в возрасте от 2-х лет в количестве 583 голов. При исследовании дойного стада были выявлены 23 коровы стабильно отрицательные по результатам РИД. На протяжении всего срока наблюдения эти животные при исследовании в РИД оставались серонегативными. Представляло интерес выяснение причин отсутствия антител против BJIKPC у животных старше 9 лет, находящихся в стаде с высоким уровнем инфицированности ВЖРС. При исследовании методом ИФА у 7 из 23 животных были выявлены антитела, но в ПЦР с праймерами на участки генов gag, tax-rex получены отрицательные результаты. Это не позволило нам определить генетическую структуру провируса у этих животных. Вместе с тем, не исключено, что такой иммунный ответ был обусловлен не особенностями возбудителя, а индивидуальной реакцией организмов коров на ВЖРС. На основании исследования в ПЦР ДНК ВЖРС от других животных из этого стада был проведен филогенетический анализ выделенных изолятов ВЖРС: 10/6320_KALUGA, 10/2229 KALUGA JJQ40Q\46), 09/8381 KALUGAJJQ400141) (см. п. 3.8.).

3.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом автоматического секвенирования проводили на 40 образцах ДНК, выделенных из цельной крови серопозитивных коров голштинской, красной степной, черно-пестрой, калмыцкой пород в возрасте старше 5 лет стойлового и беспривязного содержания из животноводческих хозяйств из ряда регионов РФ и Украины.

Анализ филогенетических отношений исследованных изолятов ВЖРС показал, что они принадлежат к большой группе, к которой отнесены штаммы из Аргентины (^^257515), Австралии (D00647), Японии (Я02120), США (EF600696), Бразилии (£>0288979, £>0288980, £>£288977), и отличаются от штаммов Ml0987 (США), S83529 (Северная Италия) и также ЛЛ)33818, МЛЮ1414 (США), составляющих отдельные клады. Внутри своей ветви к одной группе отнесены изоляты 10/2137 MOSCOW, 09/2692 TULAJJQ400140), 09/2611

TULA, 12/1968 ROSTOV, 11/4909 UKRAINE, K+ FLK-BLV и референсные штаммы AF251515, £>£>288979, £>£>288980, £>£>288977, #02120, £F600696, D00647, ко второй - остальные 34 исследуемых изолятов и один референсный штамм-Ml6017.

Изоляты 09/2677 7T/L4 и 09/2692 r£/L4_(JÖ400140) идентичны с бразильским изолятом DQ288979 (100%), и проявляют наибольшее сходство с японским Ä02120 (99,4%) и американским EF600696 (99,7%) штаммами. Изоляты 10/2137 MOSCOW, 11/4909 UKRAINE, 12/1968 ROSTOV имеют высокую степень родства (98,5-99%) с аргентинским штаммом AF257515. В данном случае по полученным результатам можно предположить о происхождении инфицирования скота.

Обнаружено пять групп идентичных между собой исследуемых изолятов: 1) 09/7 RYAZANJ<J0400144), 09/7Е KALUGAJSQm\A2), 10/6320 KALUGA_ (J2429586), 10/2396 ALTAY; 2) 09/5164 ROSWVJJQ400141), 10/5b KALMIKIYA, 10/2d KALMIKIYA-, 3) 10/30 ALT AY, 10/2606 ALT AY, 10/5233 MOSCOW, 10/5882 UKRAINE, 10/4474 UKRAINE; 4) 10/931 VOLOGDA, \№k KALMIKIYA, 10/15sh KALMIKIYA, 10/2229 KALUGA JJQ4m46), 10/5/ ALT AY, 11/3523 ROSTOV, 10/8679 UKRAINE, 10/8719 UKRAINE-, 5) 10/17« MOSCOW, 10/2k KALMIKIYA, 10/809 VOLOGDA, 09/14 RYAZAN_(JQ4Q0143), 10/57U UKRAINE, 10/5989 UKRAINE.

По результатам сравнительного анализа последовательностей исследуемых изолятов BJIKPC и референсных последовательностей обнаружены устойчивые замены: нуклеиновых кислот - транзиции, трансверсии; аминокислот -10 видов.

Выявлена идентичность последовательностей в случае с образцом К+ FLK-BLV, который использовали в ПЦР в качестве положительного контрольного образца (ПКО ДНК BJIKPC), и £F600696 - культуральный американский штамм BJIKPC. Этот факт свидетельствует о возможности использования метода секвенирования как подтверждающей техники после проведения ПЦР.

Определение нуклеотидной последовательности ВЖРС может помочь в выяснении источника инфицирования животных. В данном случае установление близкородственных отношений изолятов 10/5Й KALMIKIYA, 10/2 d KALMIKIYA и 09/5164 ROSTOVJJQ4№\4\) подтверждается действительно

имевшим место фактом ввоза скота из Ростовской области на территорию республики Калмыкия, что, вероятно, и послужило источником инфекции. Так, только в 1981г. из Ростовской области было ввезено 479 коров и 46 быков производителей красно-степной породы и 215 коров калмыцкой породы (согласно годовому отчету МСХ КАССР, рук. В.Б. Манджиев, 1982). При этом следует отметить, что в других районах республики, где не было контакта местного скота с инфицированными животными, он остается здоровым.

По результатам проведенного филогенетического анализа в коллекцию БД GenBank депонировано 9 нуклеотидных последовательностей фрагмента провирусного гена pol ВЛКРС, которым присвоены следующие регистрационные номера: Jg400140-Jß400144, У£>400146-Л2400148, Jß429586.

3.9. Адаптация методики (ВОЗ) УУЛГ-минипул-геноскринирования крови к исследованию крупного рогатого скота на лейкоз. При высоком уровне инфицированное™ ВЖРС в хозяйстве единственным методом оздоровления является выращивание здорового молодняка и постепенная замена им взрослых инфицированных животных.

Для снижения затрат на проведение исследований в ПЦР молодняка КРС нами была апробирована методика ВОЗ NA Г-минипул-геноскринирования донорской крови (A.A. Ёлов и др., 2006; С. Бур и др., 2003). Испытания проводились на основе ПЦР анализа объединенных образцов крови животных с использованием систем праймеров, комплементарных участкам различных генов ВЖРС.

Для апробации методики ВОЗ был проведен модельный эксперимент. Отобраны 100 серонегативных животных, у 3 из которых по результатам ПЦР выявлена ДНК провируса, что соответствует минимальной частоте внутриутробного инфицирования телят - потомков инфицированных матерей. Каждой пробе крови был присвоен уникальный индивидуальный номер (Табл.2). Приготовлен пул из 100 проб, содержащий по 10 мкл крови от каждого животного. При проведении ПЦР был получен положительный результат со всеми системами праймеров. Далее были приготовлены 20 подпулов (объединяли по 10 проб по горизонтали и вертикали), которые анализировали методом ПЦР. Провирусная ДНК ВЖРС выявлена в подпулах Н по горизонтали и под номерами 5,6,7 по вертикали (Табл.2). На пересечении строки и столбцов это

соответствует порядковым номерам животных - 75,76,77.

Дополнительные исследования в ПНР индивидуальных проб крови подтвердили наличие в них ДНК провируса. При последующем плановом обследовании молодняка (через 6 мес.) методом РИД данные животные проявляли себя уже как серопозитивные.

Таблица 2.

Схема приготовления пулов крови

1 2 3 4 1ШШ Л 8 9 10

А 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

В п 12 13 14 1 5 6 '7 18 19 20

С 21 22 23 24 2 5 •6 !7 28 29 30

й 31 32 33 34 3 5 16 ?7 38 39 40

Е 41 42 43 44 4 5 <6 ?7 48 49 50

Б 51 52 53 54 5 ->6 >7 58 59 60

в 61 62 63 64 6 5 '6 >7 68 69 70

71 72 73 74 Я'/Л 78 79 80

I 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90

] 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100

Таким образом, вместо исследования 100 индивидуальных проб был проведен анализ всего 21 пробы и при высокой чувствительности выявления инфицированных животных было достигнуто значительное сокращение экономических затрат и трудоемкости процесса.

В качестве практического выхода на данном этапе работы предлагается схема проведения диагностических исследований индуцированной ВЛКРС инфекции у молодых животных от 0 до 18 месяцев в несколько этапов в рамках выполнения профилактических мероприятий в неблагополучных по лейкозу хозяйствах. В случае тестирования большого количества образцов крови сбор проб крови может проходить в течение некоторого промежутка времени. В этом случае пробы крови необходимо закладывать в морозильную камеру при температуре не выше минус 16°С до накопления достаточного количества проб (от 50 до 100) для приготовления объединенных проб крови. При проведении индивидуальных исследований телят следует использовать стандартную технику ПЦР анализа. В возрасте 6,12,18 месяцев начальное серологическое исследование животных проводить методом РИД. Далее РИД" животных

исследовать методом ИФА. Затем серонегативных животных исследовать с помощью ПЦР анализа объединенных проб крови. Всех животных с положительными результатами РИД, ИФА, ПЦР переводить в группу инфицированных и изолировать от здорового поголовья. Таким образом, можно в более короткие сроки создавать группы свободного от ВЖРС инфекции поголовья с целью дальнейшего формирования здорового дойного стада.

3.10. Изучение экспериментальной передачи ВЛКРС кроликам и особенностей инфекционного процесса у этого вида животных. В связи с опасностью заражения ВЛКРС людей при частых контактах и/или употребления в пищу молока и мяса от инфицированных животных нами была изучена возможность преодоления вирусом межвидовых барьеров, пути и факторы передачи.

В качестве лабораторной модели для экспериментального воспроизведения инфекции ВЛКРС использовались кролики, поскольку ранее было установлено, что они являются достаточно чувствительным к данному вирусу видом животных (М.И. Гулюкин, Н.В. Замараева, 1996).

Постановка опыта осуществлялась на 23 кроликах, подобранных по принципу аналогов и разделенных на 4 группы (Табл.3): I) Каждый кролик получал по 50 мл молока от больной лейкозом коровы два раза в день в течение 30 дней; II) Каждый кролик получал по 50 мл молока с добавлением 5 мл цельной крови от коровы-донора два раза в день в течение 30 дней; III) Каждому кролику вводили внутривенно однократно по 1 мл крови от больной лейкозом коровы; IV) Контрольная группа, в которой каждый кролик получал по 50 мл молока от здорового животного два раза в день в течение 30 дней.

Эксперимент проводили на базе ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии (г. Новочеркасск, Ростовская область) и с участием сотрудников данного института.

В течение всего периода наблюдений кролики контрольной группы оставались свободными от провируса или АТ против ВЛКРС.

Таблица 3.

Схема опыта по экспериментальному заражению кроликов BJIKPC

Группы животных N животных Заражающая доза лимфоцитов Фактор передачи Путь заражения Сроки исследования, (сутки от начала эксперимента)

Опыт 1 1,2 Д 4,5,6 и.о. молоко алиментарный 7;14;21;30;60; 90;120; 150;180; 210;240; 270; 300

2 1.23,4,5,6 2.86х1010 молоко, кровь алиментарный

3 1,2,3,4,5,6 1.91x10' кровь внутривенный

Контроль 4 1,2,3,4,5 50 мл молока два раза в день от свободной от лейкоза коровы в течение 30 дней

Кролики I опытной группы на протяжении всего эксперимента были се-ронегативными. Амплификацию участка провирусного гена tax-rex выявили у 4 животных, начиная с 180 суток; участков генов pol и env — у всех 6 животных, но не постоянно; участка гена gag — у 5 животных однократно в поздние сроки наблюдения, начиная с 210-х суток.

Во П группе AT были обнаружены у трех животных, начиная с 30-60-х суток. У одного животного с 60-х суток наблюдали стабильно положительную реакцию до окончания срока эксперимента, у 2-х других серопозитивных животных были выявлены один и два серонегативных результата, соответственно. Амплификацию участка провирусного гена tax-rex наблюдали у 3 кроли-ков, начиная с 30-х суток; участка гена pol - у всех 6 животных, начиная с 7-х суток, при этом на электрофореграмме специфическая полоса имела слабую интенсивность, что вероятно объясняется низким содержанием провирусной ДНК в крови; участка гена env - у всех 6 кроликов, начиная с 21-х суток; участка гена gag - у 5 животных, начиная с 7-х суток. На протяжении 3,5 месяцев фрагмент гена gag не был выявлен ни у одного животного.

В Ш группе на начальном этапе опыта в течение 1,5 месяцев у большинства животных выявляли неспецифические реакции в РИД. Специфические AT обнаружены у всех животных на протяжении всего срока наблюдения, начиная с 21-30 суток, при этом для 3 кроликов характерной особенностью было чередование стабильной и сильной положительной реакции на протяжении нескольких сроков наблюдения с отрицательной или слабой реакцией на протяжении одного или двух сроков, что обусловлено повторением следующих

событий: интенсивной выработки AT в условиях значительной вирусной нагрузки с последующей быстрой их элиминацией в составе комплекса АГ-АТ. По результатам ПЦР провирусная ДНК обнаружена у всех животных всеми системами праймеров с разными интервалами, начиная с 14-х суток.

Наиболее раннее выявление продуктов амплификации в ПЦР отмечено на 7-е, а AT против ВЖРС - на 21-е сутки от начала эксперимента. Для каждого кролика в опыте хотя бы однократно был получен положительный результат одним из диагностических тестов. Это доказывает факт воспроизведения ВЖРС инфекции на гетерологичном виде животных, в данном случае, кроликах.

3.11. Анализ массива информации и формирование компьютерных баз данных (кБД). На основании имеющихся в лаборатории лейкозологии ВИЭВ данных по серологическому мониторингу КРС в двух крупных животноводческих хозяйствах Московской и Калужской областей была обработана, проанализирована и сведена в кБД информация по результатам серологической диагностики животных за периоды: 2001-2009 г. в случае хозяйства N1 Московской области (с 2001 по 2006 г. использовали данные сотрудников лаборатории, в дальнейшем анализировали результаты, полученные с нашим участием); 2009-2011 г. в случае хозяйства N2 Калужской области. При проведении филогенетического анализа участка провирусного гена pol изолятов ВЖРС создана кБД по охарактеризованным последовательностям ДНК ВЖРС.

На сегодняшний день все сформированные таким образом кБД остаются актуальными и дают возможность оперативного использования полученных результатов исследований в соответствии с определенными научными целями и задачами.

4. Выводы

1. Разработана методика ПЦР с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров PF2/PR2 для выявления фрагмента ДНК гена pol ВЖРС, обладающая высокими диагностическими чувствительностью и специфичностью. Аналитическая чувствительность составила 1,17x104 м.к./мл или 58,5 м.к./ПЦР.

2. Проведена оценка универсальности разработанной тест-системы, которая

дает возможность выявлять ДНК провируса изолятов ВЛКРС, циркулирующих на удаленных друг от друга территориях в масштабе всей страны и за ее пределами.

3. Филогенетический анализ изолятов ВЛКРС, циркулирующих в разных регионах РФ и Украины показал, что все изоляты гомологичны между собой и принадлежат к одной группе, которая включает также штаммы ВЖРС из Японии, Австралии, Аргентины, США и Бразилии, независимо от географического положения, породной принадлежности и условий содержания животных.

4. Тест-система позволяет выявлять ДНК провируса у телят-вирусоносителей на фоне колостральных антител. При проведении профилактических мероприятий в неблагополучных хозяйствах дополнительно к исследованиям животных методом РИД с помощью методов ИФА и ПЦР выявлено 5,6% вирусоносителей, что подтверждает необходимость применения комплексного подхода при постановке диагноза.

5. Апробирована методика ПЦР исследования сборных проб крови крупного рогатого скота, обеспечивающая при высокой чувствительности выявления инфицированных животных сокращение экономических затрат и трудоемкости процесса более чем в 4 раза.

6. Подтверждено воспроизведение ВЖРС-инфекции в эксперименте на кроликах, что предполагает способность вируса к преодолению межвидовых барьеров и подтверждает возможность использования кроликов как чувствительной лабораторной модели.

7. Изучены два пути передачи ВЖРС инфекции кроликам - алиментарный и внутривенный, что подтверждено результатами методов РИД и ПЦР. Факторами передачи являются при алиментарном пути - молоко и кровь, при внутривенном - кровь. Показано, что молоко содержит инфекционный ВЛКРС. В динамике развития инфекционного процесса выявлены участки различных провирусных генов возбудителя.

5. Практические предложения На основании результатов диссертации:

1. Разработаны методические наставления по выявлению ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР и пробоподготовке полученного генетического материала с целью дальнейшего определения нуклеотидной

последовательности методом секвенирования (утверждены академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии А.М. Смирновым 09.02.2011).

2. Депонировано в коллекцию Международного генетического банка GenBank NCBI 9 нуклеотидных последовательностей фрагмента провирусного гена pol ВЖРС, которым присвоены следующие регистрационные номера: •/0400140-yß400144, Jß400146-./g400148, Jg429586.

3. Получен патент N 2445370 «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции»,

4. Предлагается схема проведения диагностических исследований индуцированной ВЖРС инфекции у телят от 0 до 18 месяцев в рамках выполнения профилактических мероприятий в неблагополучных по лейкозу хозяйствах с применением ПЦР анализа как индивидуальных, так и сборных проб крови.

6. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Проблемы и перспективы применения ПЦР в диагностике лейкоза крупного рогатого скота/ Н.Г.Козырева, Н.Ф. Ломакина, Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин // Ветеринария и Кормление. - 2009. - N.3. - С.8-11.

2. Вариабельность гена env провируса лейкоза КРС, циркулирующего в Ростовской области/ М.И. Гулюкин, Н.Ф. Ломакина, Н.Г. Козырева, Л.А. Иванова, А.И. Клименко, A.B. Коваленко // Повышение продуктивности с/х животных и птицы на основе инновационных достижений: мат. всерос. науч.-практ. конф. - Новочеркасск,2009. - С.22-26.

3. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для вьмвления вируса лейкоза КРС / М.И. Гулюкин, Н.Г. Козырева, Н.Ф. Ломакина, Л.А. Иванова, C.B. Лопунов // Мониторинг, прогнозирование, диагностика и профилактика инфекционных заболеваний животных с применением методов эпизоотологии, молекулярной биологии и биотехнологии: мат. междунар. науч.-практ. конф. -Феодосия, 2009. - С.145-150.

4. Применение и сравнение коммерческих тест-систем отечественного производства для обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР / Н.Г. Козырева, Н.Ф. Ломакина, Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин // Труды ВИЭВ. - 2009. - Т.75. - С. 345-352.

5. Оптимизация ПЦР для выявления ДНК провируса лейкоза КРС с использова-

нием сконструированных праймеров, комплементарных участку провирусного гена pol / Н.Г. Козырева, JI.A. Иванова, М.И. Гулюкин, Д.В. Колбасов, С.Ж. Цыбанов, И.М. Калабеков, A.C. Малоголовкин // Ветеринария и Кормление. -2011.-N1.-С. 16-17.

6. Козырева Н.Г. Испытания методики ПЦР для детекции ДНК провируса лейкоза КРС / Н.Г. Козырева, Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин // Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел: мат. междунар. науч.-пракг. конф. - Москва, 2011. - С.51-53.

7. Филогенетический анализ участка гена pol изолятов провируса лейкоза КРС, обнаруженных у животных из различных хозяйств регионов Российской Федерации / Н.Г. Козырева, М.И. Гулюкин, Л.А. Иванова, A.C. Малоголовкин, А.И. Клименко, В.В. Разумовская // Доклады Российской Академии е.- х. наук. -2011. -N.6. - С. 48-51.

8. Козырева Н.Г. Изучение чувствительности и специфичности методики ПЦР для выявления ДНК провируса лейкоза КРС в биологическом материале / Н.Г. Козырева // Ветеринарная патология. - 2012. - N.2. - С. 123-126.

9. Совершенствование ПЦР диагностики инфекции, индуцируемой вирусом лейкоза крупного рогатого скота / Н.Г. Козырева, М.И. Гулюкин, Л.А. Иванова, А.И. Клименко // Научное обеспечение инновационного развития отечественного - животноводства: мат. всерос. науч.-практ. конф. - Новочеркасск, 2011.-С.З-11.

10. Генотипирование изолятов ВЛКРС, распространенных на территории республики Калмыкия / М.И. Гулюкин, Н.Г. Козырева, О.Б. Генджиева, Л.А. Иванова // Ветеринария Кубани. - 2012. - N.4. - С.4-7.

11. Козырева Н.Г. Совершенствование диагностики ВЖРС инфекции у телят / Н.Г. Козырева, Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин // Ветеринария и Кормление. -2013. -N1.- С. 16-17.

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печать 25.02.2013 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74, 778-45-60