Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ фото- и термоиндуцированных структурно-функциональных изменений супероксиддисмутазы и каталазы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ фото- и термоиндуцированных структурно-функциональных изменений супероксиддисмутазы и каталазы"

Р Б (Ьбронежский государственный университет

'Г.'"''!

На правах рукописи

БАШАРИНА Ольга Владимировна

АНАЛИЗ ФОТО- И ТЕРМОИНДУЦИРОВАННЫХ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЫ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж - 1995

Работа выполнена в Воронежском государственном университете.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Артюхов В. Г.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Холмогоров В.Е., доктор биологических наук, профессор Рощупкин Д. И.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. В. Палладина

АН Украины

Защита диссертации состоится 31 мая 1995 года вчас. на заседании Диссертационного Совета К 063.48.14 при Воронежском государс твенном университете по адресу: 394693, г.Воронеж, Университетске площадь, 1.

С диссертацией можно ознакомиться е зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан апреля 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук, доцент

— Ковалева Т. А.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Изучение закономерностей действия физико-химических факторов на биологические системы различного уровня организации является одной из центральных проблем биофизики, биохимии и молекулярной биологии.

Супероксиддисмутаза (К.Ф.1.15.1.11) и каталаза (К.Ф.1.11.1.6) представляют собой специфические антиоксидантные ферменты. Супероксиддисмутаза (СОД) осуществляет в клетках аэробных организмов функцию регуляции уровня супероксидных анион-радикалов кислорода, каталаза является синергистом СОД в клетке, разрушая продукт супероксид-дисмутазной реакции - пероксид водорода. Выяснению структуры и механизмов функционирования супероксиддисмутазы и каталазы посвящено значительное количество работ (С.ТапТоМ et а1., 1962; СТ. МсСопЗ, Т.РПйоуЮй, 1969; В.Кее1е et а1., 1971; Б. К.Саундерс, 1978; Н.В.Гуляева и соавт., 1989).

УФ-свет и температура являются естественными экологическими факторами, постоянно действующими на биосистемы. Возросший в последнее время интерес к исследованию биологического действия УФ-излуче-ния связан с проблемами нарушения целостности озонового слся вследствие производственной деятельности человека. Актуальность проблема диктует необходимость глубокого и целенаправленного изучения биологических эффектов действия УФ-света на молекулярном уровне для выяснения ключевых механизмов, лекащих в основе его деструктивного, мутагенного, а также лечебного и профилактического действия на живые организмы.

Однако, на наш взгляд, совершенно недостаточно раскрыты вопросы о взаимосвязи между структурными превращениями молекул СОД и каталазы и проявлением их каталитической активности при модификации такими факторами среды, как УФ-свет и температура.

Адаптация к изменяющимся условиям внешней среды обеспечивает самосохранение и самосодержание живой системы. Однако молекулярные механизмы адаптации, лежащие в основе макробиологических эффектов, во многом остаются нерешенными. Именно белковым системам принадлежит ведущая роль в регуляции функционирования организмов. Изучение адаптивных процессов на биофизическом и биохимическом уровнях позволит выявить наиболее общие закономерности функционирования биосистем.

Решение указанной проблемы имеет важное значение для медицины. В настоящее время в хирургических, акушерско-гинекологических и те-

рапевтических клиниках используется метод аутотрансфузии УФ-облучен-ной крови (АУФОК) (К.А.Самойлова, И.Г.Дуткевич, 1986; В.Е.Холмогоров и соавт., 1988; И. И. ¡Куликова, 1992), но молекулярные механизмы его действия раскрыты еще не полностью, что ограничивет применение этого метода при терапии ряда заболеваний. В связи с этим представлялось важным проанализировать изменение активности одного из основных ферментов антиоксидантной системы организма - СОД - после проведения АУФОК.

В литературе имеется большое количество данных о локализации отдельных ферментов и ферментных систем в клетке (F.M.Clarke, С-. J. Masters, 1973; Б.И.Курганов, 1986; П.Фридрих. 1986; Г.Л.Ермаков, 1993). Изучение ферментов без учета их взаимодействия с различными субклеточными структурами и, в частности, с мембранами, не позволяет всесторонне исследовать возможные механизмы регуляции их активности. Плазматическая мембрана включает в себя системы, ответственные за течение процессов свободно-радикального окисления, поэтому естественно предположить, что ферменты антиоксидантной системы In vivo могут находится в комплексе с мембранами.

Исходя из вышеизложенного, наш проведены комплексные исследования структурно-функциональных свойств супероксиддисмутазы и ката-лазы, модифицированных воздействием УФ-света и темпратуры в условиях различного микроокружения.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы явилось изучение взаимосвязи между структурными изменениями, возникающими при действии УФ-света и температуры в различных условиях микроокружения в молекулах супероксиддисмутазы и каталазы, с проявлением их молекулами функциональной активности.

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование воздействия УФ-излучения (240-390 км) в диапазоне доз (1,5-45,3)-102 Дж/м2 на функциональные и некоторые физико-химические свойства супероксиддисмутазы.

2. Изучение влияния температуры в интервале 2080 °С на структурно-функциональные свойства супероксиддисмутазы и каталазы с целью выявления сущности процессов термоденатурации молекул этих ферментов.

3. Изучение природы взаимодействия и возможной локализации- супероксиддисмутазы на эритроцитарной мембране.

4. Исследование ферментативной активности супероксиддисмутазы и каталазы в комплексе с эритроцитарными мембранами и их компонентами.

5. Исследование фотопротекторных свойств СОД и каталазы по отношению к эритроцитарной клетке.

Научная новизна.

Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу взаимосвязи между структурным состоянием и каталитической активностью супероксиддисмутазы и каталазы. Впервые изучено влияние УФ-света на структурно-функциональные свойства СОД, выявлен эффект ее фотоактивации при действии определенных доз УФ-излучения.

Установлено, что тепловая денатурация супероксиддисмутазы и каталазы является сложным процессом, протекающим в несколько последовательных стадий, которым соответствует определенное структурное состояние белковой молекулы. Изучены кинетические закономерности термоинактивации макромолекул указаных ферментов.

Показано, что взаимодействие супероксиддисмутазы с эритроцитарной мембраной носит электростатический характер. Обнаружено, что локализация супероксиддисмутазы и каталазы на эритроцитарной мембране сопровождается повышением их функциональной активности.

Разработаны схемы УФ- и термоиндуцированных превращений молекул супероксиддисмутазы и схема процессов термоденатурации молекул каталазы.

Практическая значимость.

Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях фотохимических превращений субъединичных белков.

Фото- и термоиндуцированные перестройки СОД и каталазы 'необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизма адаптации живых систем к действию данных экологических факторов.

Предложенная схема реакций, приводящих к повышению активности супероксиддисмутазы, может быть полезна для понимания молекулярных процессов, лежащих в основе лечебного эффекта метода АУФОК.

Эксперименты с участием ферментов-фотопротекторов позволяют разработать основы защиты эритроцитарных клеток от повреждающего действия УФ-излучения.

Полученные результаты следует принимать во внимание при решении вопросов, связанных с локализацией в клетке отдельных ферментов и ферментных систем. Обратимая адсорбция ферментов на структурных компонентах клеток является одним из механизмов изменения их активности, что может быть использовано для регуляции процессов клеточного метаболизма.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной конференции "Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза" (Сыктывкар,1991); VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991); IX Украинской школе-семинаре "Спектроскопия молекул и кристаллов" (Харьков, 1993); Межреспубликанских научно-практических конференциях "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем малых рек" (Краснодар, 1992) и "Актуальные вопросы экологии и охраны природы степных экосистем и сопредельных территорий" (Краснодар, 1994); Научных сессиях Воронежского госуниверситета (Воронеж, 1990, 1994, 1995).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 7 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Эффект УФ-активации супероксиддисмутазы при действии УФ-из-лучения в интервале доз (4, 5*15,1) ■ 102 Дж/м2 является результатом процессов разворачивания белковой глобулы. Фоточувствительность СОД определяется структурным состоянием молекулы фермента.

2. Необратимой тепловой денатурации молекул супероксиддисмутазы и каталазы предшествуют обратимые конформационные изменения, характеризующиеся последовательным сворачиванием и разворачиванием белковых молекул.

3. Взаимодействие супероксиддисмутазы с эритроцитарными мембранами носит электростатический характер.

4. Ассоциация супероксиддисмутазы и каталазы с эритроцитарными мембранами и их компонентами при значениях рН среды 5,0 и 7,4 приводит к повышению функциональной активности изучаемых ферментов.

' 5. Схемы УФ- и термопревращений супероксиддисмутазы, термоденатурации молекул каталазы.

- 7 -

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа включает/%?страниц машинописного текста, .¿¿'таблиц, ^рисунков. Состоит из введения, семи глав, заключения и выводов. Список литературы содержит/•ЁЁ2""работ, из них ^отечественных и зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЫ

В главе представлен обзор основных работ, посвященных анализу структуры, физико-химических свойств и биологической роли супероксид-дисмутазы и каталазы.

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Рассматриваются основные современные представления, касающиеся вопросов влияния температуры на структурно-функциональные свойства ферментов, а также молекулярных механизмов действия УФ-излучения на простые и сложные белки.

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали буферные растворы (рН 5,5-11,5) Си,гп-супероксиддисмутазы из эритроцитов быка в различных концентрациях (3-10"э моль/л, 3-Ю"8 моль/л, 3- 10~6 моль/л, 3-10"5 моль/л); водные и буферные (рН 6,7) растворы каталазы из печени быка (Олайн-ский завод химреактивов) в концентрациях 5-1СГ6 моль/л и 1,2-10"6 моль/л.

В опытах использовали препараты теней эритроцитов человека различного состава, полученные из свежей донорской крови, а также кровь больных, проходящих сеансы АУФОК-терапии.

Ферментативную активность супероксиддисмутазы определяли спект-рофотометрически при 540 нм; используемый нами метод основан на способности СОД конкурировать с красителем нитросиним тетразолием за супероксидные анионы, образующиеся при фотоокислении рибофлавина (С. 0. Вес11аиагкагпр. 1972; В.П.Чумаков, Л. Ф. Осинская, 1979).Спектро-фотометрический метод определения активности каталазы основан на способности фермента высокоэффективно катализировать реакцию разложения пероксида водорода на воду и кислород (А.ТакесЗа е1;.а1., 1983).

Электронные спектры поглощения ферментов регистрировали на спектрофотометре СФ-46.

Гель-хроматографию растворов каталазы и супероксиддисмутазы проводили по методу Г.Детермана (1970). В экспериментах использовали гель-хроматографические колонки: размером 500x15 мм, упакованной се-фадексом G-20D (Ппе) и уравновешенную 0,01 моль/л фосфатным буфером, рН 6,7; размером 400x20 мм, упакованную сефадексом G-150 (fine) • -соответственно для хроматографирования растворов каталазы и СОД. Для расчета молекулярных масс УФ- и термомодифицированных ферментов определяли их объемы выхода из колонки и по линейной зависимости объемов выхода белков-метчиков от логарифма 'их молекулярных масс находили указанные величины.

Мембранные препараты эритроцитов человека получали методом ги-поосмотического гемолиза клеток (J.T.Dodge et al., 1963). Для выделения "тритоновых" мембран эритроцитов использовали методику, описанную М.ЫаКао et al. (1989). Содержание белка в эритроцитарных мембранах определяли по методу O.H.Lowry (1951).

Для регистрации спектров флуоресценции зонда 1-анилинонафта-лин-8-сульфоната (АНС) в присутствии мембран эритроцитов, суперок-сиддисмутазы и их комплексов использовали установку, изготовленную на кафедре биофизики Воронежского университета (Г. А.Вашанов, 1993).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили на ЭВМ типа IBM PC/AT с помощью пакета прикладных статистических программ "Statgraphlcs".

ГЛАВА 4.ВЛИЯНИЕ УФ-СВЕТА И рН-СРЕДЫ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МОЛЕКУЛ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ

После облучения растворов СОД УФ-светом нами выявлено повышение супероксидцисмутазной активности фермента при действии определенных доз.УФ-излучения.

Изучение зависимости активности СОД от дозы облучения (рис.1) показало, что при значениях рН, оптимальных для проявления фермента-титивной активности СОД, воздействие УФ-света приводит к повышению активности фермента во всем исследуемом диапазоне доз. В то же время характер дозовой зависимости при рН 6,3 и рН 11,5 (т. е. значениях рН, экстремальных для проявления функциональной активности СОД) отражает наложение двух противоположных фотоиндуцированных процессов - активации реакции дисмутации анион-радикалов кислорода супероксиддисму-тазой в интервале доз (4,5+15,1)■10г Дж/м2 при рН 6,3 и

(l,5*22,6)•Ю2 Дж/м2 при рН 11,5, и ингибирования этой реакции при облучении фермента дозами (30,2*60,1)•10г Дж/м2.

Сравнивая зависимости активности нативного и УФ-модифицирован-ного белка от рН, можно заметить, что эффект фотоактивации тем выше, чем ниже исходная активность СОД, обусловленная соответствующей концентрацией в растворе водородных ионов (рис.2). Эти данные показывают, что максимальная фоточувствительность фермента наблюдается при экстремальных для проявления его активности значениях рН.

Обнаруженная фотоактивация СОД'может быть обусловлена конформа-ционными изменениями ее макромолекул, в связи с чем были исследованы спектральные характеристики необлученного и УФ-модифицированного белка при рН 9,0 и 11,5. Выявлено, что УФ-облучение вызывает повышение оптической плотности в спектре поглощения фермента; при рН 11,5 полоса поглощения с Хтах = 259 нм становится более отчетливой по сравнению с наблюдаемой полосой в спектре необлученного фермента. Изменения спектральных характеристик белка при УФ-облучении обусловлены, по-видимому, его кснформанионными перестройками. Поэтому в дальнейшем нами были изучены гель-хроматографические свойства нативного и УФ-облученного фермента.

Установлено, что в изучаемом растворе СОД находится как в виде димерных молекул, так и в мономеркой форме; воздействие УФ света вызывает увеличение кажущейся молекулярной массы фермента при рН 10,8. (Табл. 1). Таким образом, эффект фотоакгивации СОД обусловлен конфор-мационными изменениями, связанными, по-видимому, о разворачиванием молекулы фермента.

Таблица 1

Величины кажущихся молекулярных масс необлученной и УФ-модифицированной СОД

Молекулярная масса необлученной СОД, кДа Молекулярная масса облученной СОД, кДа Р

31.1 ± 0,6 33,8 + 0,6 < 0,01

16,6 ± 0,3 17,9 ±0,2 < 0,01

14,5 ± 0,3 15, 1 ± 0, 4 < 0,05

Примечание: доза облучения составляла 4, 5-Ю2 Дж/м2.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СОД

Действие температуры на стабильность СОД изучали, инкубируя ее буферные растворы при различных значениях температуры (20*85 °С), а

50 -10' Дж/м'

Рис. 1. Зависимость изменения активности СОД от дозы облучения при рН 6,3 (1), 9,0 (2) и 11,5 (3). За 100 % принята активность необлученного фермента.

Рис. 2. Зависимости функциональной активности необлучен-ной СОД (1) и эффекта ее фотоактивации (2) от рН среды. Доза облучения - 4,5-10г Дж/м!.

затем определяя активность СОД при комнатной температуре. В результате проведенных экспериментов показано, что фермент стабилен при нагревании в течение 40 мин в температурном интервале 20-70 °С; нагревание растворов белка до более высоких значений температуры приводит к резкому падению активности СОД (рис.3). Зависимость стабильности фермента от температуры по критерию его функциональной активности характеризуется двухфазным графиком Аррениуса с изломом при 70°С. Причину изломов на графике можно объяснить, исходя из теории термодинамической смены фаз, постулирующей переход системы в разные состояния по обе стороны от некоторой критической температуры, соответствующей точке излома - температуры перехода.

Кинетические прямые термоинактиЕации СОД представлены на рис.4. Процесс ее инактивации описывается уравнением реакции первого порядка. Рассчитанная величина энергии активации процесса денатурации СОД при температурах, превышающих критическую, составила 155,5 кДж/моль, что совпадает со значениями этого параметра для белков, термоинактивация которых связана с конформационными изменениями белковой части молекулы, обусловленными разрывом водородных связей; при температуре ниже 70 0С энергия активации равна 14,8 кДк/моль.

Дальнейшие эксперименты были посвящены изучению оптических свойств растворов супероксиддисмутазы, подвергнутой воздействию повышенных температур. Видно (рис.5), что ступенчатое повышение температуры до 40 0С вызывает повышение светопоглощения в области белкового компонента фермента. При нагревании до 55 0 С выявляется понижение оптической плотности, при этом более отчетливо проявляется максимум поглощения при 264 нм. Начиная с 70 °С, отмечается рост оптической плотности и исчезновение максимумов поглощения, характерных для нативной формы фермента.

При нагревании до 70 0 С отмечено увеличение кажущейся молекулярной массы фермента, профиль элюции СОД характеризуется наличием пиков, соответствующих мономерной форме белка (16,3 и 18,3 кДа) и отсутствием фракции, содержащей димерные молекулы.

На основании полученных экспериментальных данных можно констатировать, что обратимые термоиндуцированные конформационные изменения молекулы СОД характеризуются последовательным разворачиванием (разрыхлением) и сворачиванием (сжатием) белковой глобулы, чем и обусловлено волнообразное изменение оптической плотности в температурном интервале 20-60 °С; при нагревании до 70 °С и выше происходит разворачивание белковой глобулы, равновесие в растворе смещается в сторону мономеров СОД.

А, ЛА-

РИС. 3. Влияние температуры (1) и последующего действия УФ-света (2) на стабильность СОД. Доза УФ-облучения - 4,5-10* Дж/м2.

13А/А.

Рис. 4. Кинетические прямые термоинактивации СОД при 65 (1), 67 (2), 70 (3), 72 (4), 75 (5), 80 (6), 85 °С(7).

Показано, что эффект фотоактивации наблюдается и при действии УФ-света на предварительно нагретые растворы фермента (рис.3).

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ РАСТВОРОВ КАТАЛАЗЫ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ В ДИАПАЗОНЕ 20-60 °С

Исследована температурная зависимость функциональной активности каталазы; указанная зависимость характеризуется выходом на плато в области температур 20-35 °С, максимальная активность фермента выявляется при 40 0С; в интервале температур 45-60 °С наблюдается резкое падение активности молекул гемопротеида-.

График Аррениуса для каталазы в интервале температур 20-40 0 С имеет вогнутую форму с изломом при 35 °С , в диапазоне 40-60 °С -излом при 45 0С {рис.6). Наличие подобных изломов на аррениусовс-кой зависимости для ферментативных реакций объясняют рядом причин. Возможно, с повышением температуры происходит переход активного центра белковой молекулы в узком температурном интервале в другое информационное состояние со сменой активационных параметров реакции. Величины энергии активации термоиндуцированных превращений каталазы приведены в табл.2.

Таблица 2

Величины энергии активации каталазной реакции

Температурный интервал, °С Энергия активации. кДж/моль

20 - 35 35 - 45 45 - 60 1.51 -11.74 49. эе

Изменение знака величины энергии активации и константы инактивации ферментативной реакции свидетельствует о том, что модификация молекул каталазы при инкубации ее растворов носит не однонаправленный характер.

Для проверки выдвинутого предположения нами были проведены исследования спектральных и гель-хроматографичеких свойств растворов каталазы при их нагревании.

При анализе спектральных свойств гембелка, подвергнутого термомодификации в интервале температур 20-45 °С, было выявлено, что воздействие тепла вызывает изменения спектров поглощения, носящие вол-

А

Рис. 5. Влияниие нагревания на величину оптической плотности при 259 нм раствора СОД (3-Ю 5 моль/л).

1д А

Рис. 6. Зависимость активности катапазы от температуры в координатах Аррениуса.

вдобразный характер (рис.7), что указывает на конформационные изменения белковой глобулы. При нагревании растворов каталазы в диапазоне 50+60 °С наблюдается монотонное повышение оптической плотности гембелка и исчезновение максимумов поглощения, характерных для на-тивной формы фермента. Нагревание опытных образцов до 35 °С и выше приводит к сдвигу максимума поглощения при 270 нм в более коротковолновую область (268 нм), что свидетельствует об изменении микроокружения хромофоров белка, то есть ароматических аминокислот.

В табл. 3 приведены величины кажущихся молекулярных масс каталазы после нагревания ее растворов.

Таблица 3

Изменение величин кажущейся молекулярной массы каталазы после нагревания ее растворов в течение 40 мин

Температура, °С Молекулярная масса, кДа

20 160 ± 1

25 160 ± 1*

30 178 1 2

35 188 ± 4

37 182 ± 8

40 229 + 5

45 240 + 3

50 248 ± 8

55 276 ± 6

60 296 ± 10

Примечание: * - отличия от контроля (20 °С) статистически недостоверны.

При нагревании до 35 0 С наблюдается увеличение кажущейся молекулярной массы фермента. При 40 0 С каталаза имеет молекулярную массу, близкую к таковой для интактного фермента, то есть молекулярная масса гемопротеида находится в тех пределах, которые приняты для тетрамерной формы каталазы. Учитывая спектральные и функциональные свойства каталазы, можно высказать предположение о том, что именно в этих условиях молекула гембелка находится в форме тетрамера и имеет "оптимальную" конформацию для осуществления функциональных свойств. Дальнейшее нагревание (45+60 °С) приводит к возрастанию кажущейся молекулярной массы каталазы, что может быть объяснено разворачиванием белковой глобулы.

Таким образом, предположения о характере структурных модификаций каталазы, сделанные на основании анализа ее функциональной ак-

тивности, нашли подтверждение при исследовании гель-хроматографичес-ких и спектральных свойств фермента. Наличие плато на кривой зависимости активности каталазы от температуры объясняется разрыхлением и сжатием белковой молекулы, не затрагивающими структуру и, по-видимому, микроокружение активного центра фермента. Резкое снижение функциональных свойств каталазы в диапазоне температур 45 - 60 0 С определяется необратимыми денатурационными изменениями молекулы.

ГЛАВА 7. ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУПЕ-РОКСИДДИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЬ! ПРИ ИХ ИНКУБАЦИИ С ЭРИТРОЦИТАРНЫМИ МЕМБРАНАМИ

Становится очевидным, что особенности субклеточной архитектуры должны определенным образом влиять на регуляцию клеточного метаболизма, и что изучение свойств ферментов без учета их взаимодействия с мембранными структурами не позволяет сделать адекватного заключения о возможных механизмах регуляции их активности (Т.В.Есакова, М.В.Иванов, 1992; Г.Л.Ермаков, 1993).

Одним из видов доказательств связывания белка с мембраной является изменение его функциональной активности, поэтому в данной серии экспериментов были изучены функциональные свойства СОД и каталазы при инкубации их с мембранами эритроцитов в различных условиях.

Показано, что инкубация СОД с эритроцитарными мембранами приводит к повышению активности фермента. При значениях рН 5,0 и 7,4 степень активации составляет соответственно 41 и 17 %, при сдвиге рН в щелочную сторону степень активации СОД снижается, при рН 8,4 статистически достоверных изменений активности фермента не выявлено.

Обнаружено, что инкубация каталазы (рН 7,4) с мембранами эритроцитов приводит к повышению активности данного фермента, степень активации составляет 13 %.

Для определения возможной локализации СОД на эритроцитарной мембране нами был использован метод флуоресцентных зондов. При взаимодействий зонда АНС-8 с мембраной отмечается повышение интенсивности флуоресценции, причем в кислой среде зтот параметр возрастает в большей степени - соответственно в 4,3 и 3,2 раза при рН 3,7 и 7,4, что свидетельствует об электростатической природе взаимодействия красителя с мембраной. Выявлен также сдвиг максимума флуоресценции в более' коротковолновую область при комплексировании АНС с мембраной при рН 3,7. Анализ опубликованных работ показывает, что сдвиг максимума флуоресценции в сторону более коротких длин волн характерен для

А

Рис. 7. Величины оптических плотностей растворов катапазы, подвергнутых действию температур в интервала 20 - 60 "С. ЕП23 - при 270 им; К"**?* - при 402 им - при 610 нм.

1

700

600

500 400

300

200

100

12 3 4

Рис. 8. Значения интенсивности флуоресценции в максимуме испускания А НС при рН 3,7)

1 - контроль ( буферный раствор АНС),

2 - А НС + СОД,

3 - АНС + мембраны,

4 - АНС + СОД + мембраны.

поведения АНС в неполярных растворителях, а также для его комплекси-рования с гидрофобными группами белков (Н.К.Наградова, Р.А.Асриянц, 1971; J.-L.Olive et al., 1973). Таким образом, в плазматической мембране часть молекул АНС связана с белками, а часть - с липидами (Ю.А. Владимиров, Г.Е.Добрецов, 1980; В.Г.Омельяненко и соавт., 1989; М.А. Наквасина, 1994)

Спектр флуоресценции АНС в присутствии СОД не отличается от спектра красителя в буферном растворе при рН 7,4; в то не время отмечается возрастание интенсивности флуоресценции зонда в комплексе с ферментом при рН 3,7 (рис.8), изменения положения максимума флуоресценции зонда не выявлено. Полученные результаты позволяют предположить, что в образование комплекса АНС-СОД вносят преимущественный вклад электростатические взаимодействия: при значении рН 3,7, то есть ниже изоэлектрической точки СОД, положительно заряженные группы белка взаимодействуют с отрицательным зарядом сульфитной группы красителя. Отмечено повышение интенсивности флуоресценции зонда в тройном комплексе СОД-мембрана эритроцита-АНС при рН 3,7 (рис.8), причем этот эффект нельзя объяснить простым суммированием интенсивности флуоресценции систем СОД-АНС и АНС-мембрана. Статистически достоверных отличий значений интенсивности и максимума флуоресценции АНС с мембраной и комплекса АНС-СОД-мембрана при рН 7,4 не обнаружено.

Следовательно, взаимодействие СОД с эритроцитарной мембраной осуществляется за счет сил электростатической природы; изменение люминесцентных свойств 1,8-АНС служит доказательством ассоциации СОД с мембранными компонентами, что и обусловливает модификацию функциональных свойств фермента при его инкубации с мембранами. По всей вероятности, в клетке существует равновесие между свободной и связанной с мембранными структурами формами СОД, которое контролируется такими внутриклеточными параметрами, как рН, различными клеточными метаболитами. Обратимая адсорбция ферментов ка структурных компонентах клетки является одним из механизмов регуляции их каталитической активности (Б.И.Курганов, 1986).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. С помощью методов спектрофотометрии, гель-хроматографии, флуоресцентных зондов и определения каталитической активности ферментов изучены УФ- и термоиндуцированные превращения молекул су-пероксиддисмутазы и каталазы в условиях различного микроокружения.

При изучении влияния УФ-облучения на структуру и функции СОД обнаружено, что УФ-свет в интервале длин волн 240-390 нм и диапазоне

доз (4,5*15,1)•10й Дж/м2 индуцирует фотоактивацию фермента. Степень фотоактивации определяется структурным состоянием белковой молекулы: супероксиддисмутаза наиболее фотолабильна при значениях рН среды, экстремальных для проявления ее функциональной активности, то есть при рН 6,3 и 11,5, а также в случае предварительной инкубации ее растворов при повышенных температурах.

Под влиянием УФ-излучения происходят конформашонные превращения молекулы СОД, что находит отражение в изменении функциональных, оптических и гель-хроматографических свойств фотомодифицированного фермента.

(1,5*22, 6} • Ю2 Дж/мг

Исходное структурное состояние молекулы супероксиддисмутазы

УФ-свет преимущественно в области поглощения фенидаланина (и 260 нм)

модификация спектральных и

— — ----~TQrDclSn—~-------

гв СОД

гель-хроматогращических своист-

(30.2*45.3)- Ю2 Дж/м?

структурные перестрои- стоуктурные перестройки ки, связанные с разбора- ' денатурационного чиванием бел|овсй глобулы характера

фотоактивация фотоинактивация

супероксиддисмутазы супероксиддисмутазы

Рис.9. Схема фотопроцессов, протекающих в молекулах супероксиддисмутазы при рН 11,5.

Нами показано, что наблюдаемые при воздействии УФ-света изменения структурно-функциональных свойств супероксиддисмутазы при рН 11,5 являются результатом разворачивания белковой глобулы (рис.9); особенности фотохимических превращений СОД при рН 9, 0 во всем исследуемом диапазоне доз проявляются в фотоактивации фермента.

Анализ экспериментальных данных позволил нам предложить схему процессов, приводящих к структурным перестройкам и термоинактивации супероксиддисмутазы и каталазы (рис.10, 11). В соответствии с этими схемами тепловая денатурация СОД и каталазы осуществляется, по крайней мере, в две последовательно протекающие стадии. Необратимым нарушениям структуры молекулы фермента, обусловленным ее разворачиванием и разрушением четвертичной структуры, на второй, более быстрой стадии, предшествуют волнообразные конформационные изменения, связанные с разрыхлением и сжатием белковой глобулы и носящие обратимый характер.

Еакт = 14,8±0, 3 кДж/моль

1 = 20-70 °С

Обратимые конформационные изменения молекулы: последовательное разворачивание и сжатие белковс

= 155,5±3,7 кДж/моль

эи глобулы t = 70-80 °С

Необратимые структурные перестройки: разворачивание молекулы.

потеря функциональных свойств СОД

Рис.10. Схема термоиндударованных превращений димерной формы молекулы супероксиддисмутазы.

Тримерная форма каталазы (160±1 кДа)„с,активностью

А = 2

Еакт = I-5 КДж/моль

18 ед.

t = 20-35 °С

Изменения конформации:

разворачивание йпсжатие молекулы а ~ ¿> ¿¿и ед.

Еакт = "И, 7 КДЖ/МОЛЬ

1 = 35-45 °С

Тетрамерная форма ХЪЩ кДа) с максимальной активностью А = 2,62 ед при 40 °с

Еакт = 50 кДж/моль

Ъ = 45-60 °С

Необратимые перестройки

снижение фе^менрдивной активности

Рис.11. Схема процессов, обусловливающих термоинактивацию каталазы.

Ассоциация супероксиддисмутазы с эритроцитарными мембранами различного состава приводит к повышению функциональной активности фермента. Эффект активации усиливается при сдвиге рН среды с 7,4 до 5, 0. Этот факт, а также данные, полученные с помощью метода флуорес-

центных зондов, свидетельствуют в пользу представления об электростатической природе взаимодействий между ферментом и компонентами мембраны. По-видимому, процесс образования комплекса СОД с мембраной и, следовательно, активность фермента могут регулироваться путем изменения количества сорбированного фермента при изменении его микроокружения, в частности, при изменении концентрации водородных ионов.

Повышение активности при инкубации с мембранами отмечено такие для другого фермента антиоксидантной защиты - каталазы.

■ ВЫВОДЫ.

1. Установлено, что воздействие УФ-света (240-390 нм) в определенных дозах ((4,5-15,1 ) • ю2' Дж/М2 при pH 6,3, (1, 5-45, 3) • 102 Дж/м2 при pH 9, 0 и (1,5+22,6)•102 Дж/м2 при pH 11,5) приводит к повышению активности супероксиддисмутазы; при более высоких дозах УФ-свет индуцирует инактивацию фермента.

2. Показано, что УФ-облучение (4,5-1Q2 Дж/м2) вызывает увеличение кажущейся молекулярной массы супероксиддисмутазы при pH 10,8 и не оказывает влияния на гель-хроматографические свойства белка при pH 9,0.

3. Установлено, что процесс тепловой денатурации супероксиддисмутазы осуществляется в две последовательно протекающие стадии, характеризующиеся значениями энергии активации соответственно 14, 8 и 155,5 кДя/моль в температурных интервалах 20-70 °с и 70-85 °С.

4. При температурах 20-60 °С происходят обратимые информационные изменения молекулы супероксиддисмутазы, связанные с последовательным разворачиванием и сворачиванием белковой глобулы.

5. При 70-80 0 С происходит необратимая структурная перестройка молекулы белка, сопровождающаяся увеличением ее кажущейся молекулярной массы, обусловленным, по-видимому, разворачиванием белковой молекулы; равновесие в растворе при этом смещается в сторону мономеров супероксиддисмутазы.

6. Молекулы супероксиддисмутазы, подвергнутые воздействию повышенных температур (30-80 °С), проявляют большую фотолабильность (доза УФ-света - 4,5-Ю2 Дж/м2); причем максимальной фоточувствительностью харктеризуется фермент, модифицированный при 80 °С. Отмечено снижение величин энергии активации и констант скорости реакции термоинактивации для УФ-модифицированного белка.

7. Показано, что предварительное УФ-облучение в дозе 4,5-102

Дж/м2 приводит к повышению термостабильности молекул супероксиддисмутазы.

8. С помощью методов изучения функциональной активности катала-зы, гель-хроматографии и спектрофотометрии установлено, что термомодификация гемопротеида в температурном диапазоне 20+45 °С не затрагивает структуру активного центра фермента и связана с волнообразными изменениями объема белковой молекулы. Потеря каталазой ферментативной активности при 45+60 °С определяется необратимыми структурными изменениями каталазы, .связанными с разворачиванием белковой глобулы.

9. Зависимость активности каталазы от температуры в координатах Аррениуса характеризуется наличием изломов при 35 и 45 °С, что подтверждает представление о многостадийности процесса тепловой денатурации фермента.

10. С помощью метода флуоресцентных зондов показано, что взаимодействие супероксиддисмутазы с. эритроцитарной мембраной носит электростатический характер.

И. Выявлено, что ассоциация супероксиддисмутазы с мембранами при рН 5,0 и 7,4 и тритоновыми тенями эритроцитов при рН 5,0 приводит к повышению ее функциональной активности. Взаимодействие каталазы с эритроцитарными мембранами при рН 7,4 также приводит к активации фермента.

12. Показано, что фотоиндуцированный гемолиз эритроцитов человека значительно ингибируется при добавлении к их облучаемой взвеси растворов супероксиддисмутазы и-каталазы. Фотопротекторные свойства ферментов-антиоксидантов проявляются в большей степени в случае их предварительной инкубации с эритроцитарными клетками.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Гусинская В.В., Наквасина М.А. Применение спектральных методов для выявления структурно-функциональных нарушений белковых систем //VII Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров: Тез. докладов Всесоюзн. конф. - Харьков, 1-4 октября, 1991. - С.10-11.

2. Башарина О.В., Артюхов В.Г. Исследование функциональных изменений супероксиддисмутазы, индуцированных УФ светом при различных значениях рН //Кислотно-основной и температурный гомеостаз: Тез. докладов Всесоюзной конф. - Сыктывкар, 1991. - С.12.

3. Чурикова В.В., Владимирова И.Н., Башарина 0.В., Наквасина

М.А., Пенской К.П., Вашанов Г.А., Артюхов В.Г. Использование ЭВМ для анализа структурно-функциональных изменений ферментов //Экологическое образование и компьютеризация ботанических дисциплин: Тез. докладов совещания зав. кафедрами ботаники университетов РСФСР. - Воронеж, 1991. - С.32-33.

4. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Владимирова И.Н., Чурикова В.В. Функциональная активность, фотохимические свойства и синтез некоторых компонентов системы актиоксидантной защиты //Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем малых рек. - Краснодар, 1992. -4.1. - С. 31-32.

5. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Филипцов Ф. А. Активация молекул супероксиддисмутазы под влиянием ультрафиолетового облучения //Биофизика. - 1992. - Т.37, вып. 1. - С. 13-16.

6. Башарина О.В., Наквасина М.А., Гусинская В.В., Артюхов В.Г. Исследование спектральным методом взаимодействия белков крови с биомембранами //Спектроскопия молекул и кристаллов: Тез. докладов XI Украинской школы-семинара. - Харьков, 10-16 мая, 1993.- С.188.

7. Наквасина М.А., Башарина О.В., Артюхов В.Г. Определение функциональной активности супероксиддисмутазы и лактатдегидрогеназы при УФ-облучении их растворов //Состояние и проблемы экосистем Ус-манского бора. - Воронеж, 1993. - Вып.З. - С.137-143.

8. Артюхов В.Г., Башарина О.В. Обратимые термоиндуцированные структурные переходы молекул ферментов как начальный этап их денату-рационных превращений //Актуальные вопросы экологии и охраны природы степных экосистем и сопредельных территорий: Материалы межреспубликанской научно-практической конф. - Краснодар, 1994. -2ч.

С.338-343.

9. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А., Гусинская В.В., Наквасина М.А. Физико-химические основы световой и термической адаптации белковых (ферментных) систем как механизм поддержания устойчивости организмов к экологическим факторам //Состояние и проблемы экосистем Усманского бора. - Воронеж, 1994. - Вып.4. - С.5-13.

10. Башарина О.В. Влияние температуры и УФ-света на структурно-функциональные свойства супероксиддисмутазы //Успехи физиол. наук. - 1994. - Т. 25, N3. - С. 54.

11. Артюхов В.Г., Башарина О.В., Вашанов Г.А., Жуликова И.И., Наквасина М.А. Анализ структурно-функциональных изменений сложных белков крови доноров и больных, людей после УФ-облучения //Вестн. Санкт-Петербургского ун-та. - 1994. - Серия 4, вып.1. - С.130.

12. Вашанов Г.А., Артюхов В.Г., Наквасина М.А., Путинцева О.В., Башарина О.В., Кузнечикова Е.В. Функциональные свойства некоторых сложных белков, УФ-облученных в свободном состоянии и в составе крови //Состояние и проблемы экосистем Среднего Подонья. - Воронеж, 1995. - С.17-24.

13. Башарина О.В., Артюхов В.Г., Измалкова И.Е. Фотозащитный эффект супероксиддисмутазы и каталазы по отношению к зритриЦитарпЫм мембранам //Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов: Материалы Международного симпозиума,- Воронеж, 1995.

Заказ 161 от 27.4.95 г. Тир. 100 экз. Формат 60 X 90 1/1б. ОСьем I п.л. Офсетная лаборатория В1У.