Анализ эволюционной изменчивости гена COI и его использование для филогении и систематики таксонов с высоким видовым разнообразием на примере комаров-звонцов подсемейства Chironominae

Демин, Александр Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ эволюционной изменчивости гена COI и его использование для филогении и систематики таксонов с высоким видовым разнообразием на примере комаров-звонцов подсемейства Chironominae
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ эволюционной изменчивости гена COI и его использование для филогении и систематики таксонов с высоким видовым разнообразием на примере комаров-звонцов подсемейства Chironominae"

На правах рукописи

Демин Александр Геннадьевич

АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГЕНА COI И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ФИЛОГЕНИИ И СИСТЕМАТИКИ ТАКСОНОВ С ВЫСОКИМ ВИДОВЫМ РАЗНООБРАЗИЕМ НА ПРИМЕРЕ КОМАРОВ-ЗВОНЦОВ ПОДСЕМЕЙСТВА CHIRONOMINAE (CHIRONOMIDAE, DIPTERA)

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 CFH 2011

Москва-2011 г.

4855064

Работа выполнена на кафедре общей биологии, фармакогнозии и ботаники Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, г. Саратов

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Полуконова Наталья Владимировна ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития, г. Саратов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Ведущее учреждение:

Гордеев Михаил Иванович

ГОУ ВПО Московский государственный

областной университет, г. Москва

Макарченко Евгений Анатольевич Учреждение Российской академии наук Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток

Учреждение Российской академии наук Зоологический институт РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «. » октября 2011 г. в 1« часов на заседании объединенного диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: 8(499)1358962, электронный адрес: aspirantura@vigg.ru, адрес в Интернете: www.vigg.ru --

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан « 7"» сы/>7лУрЛ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Подсемейство Chironominae (Chironomidae. Díptera) представляет обширную группу комаров-звонцов, распространенных повсеместно, за исключением Антарктиды (Макарченко, Макарченко, 2006). Подсемейство представлено тремя трибами - Chironomini (не менее 69 родов), Tanytarsini (не менее 16 родов) и Pseudochironomini (не менее 5 родов) (Панкратова, 1983; Wiedercholm, 1983, 1986.1989; Coffman, Ferrington, 1996; Sœther, 2000; Макарченко, Макарченко, 2006; Cranston, Martin, 2007). Несмотря на многолетние исследования комаров-звонцов подсемейства Chironominae, ряд вопросов их систематики и эволюции до сих пор остается нерешенным. Это обусловлено высоким видовым разнообразием, различной степенью морфологической дифференциации родов, отсутствием кариотипических данных для видов многих родов, а также сложностью видовой идентификации большинства представителей Chironominae. До сих пор нет единой филогенетической схемы, описывающей родственные связи триб подсемейства.

Наиболее перспективным решением проблем систематики и эволюции насекомых представляется использование молекулярных филогенетических маркеров. Чаще всего для этих целей используются последовательности нуклеотидов высоко консервативных ядерных генов - I8SpDNA, EF-Ia, CAD и др., которые у комаров-звонцов известны только для единичных родов.

К данному моменту большие массивы информации накоплены по последовательности 5'-концевого фрагмента гена мтДНК цитохром С оксидазы I (СО/). Начиная с 2004 года, этот фрагмент гена COI широко применяется для штрихкодирования живых организмов (Ratnasingham, Hebert. 2007), к настоящему моменту удалось установить его последовательность более чем у 300 видов Chironominae (www.boldsystems.org). ДНК-последователыюсть COI обычно применяется для анализа родственных связей между популяциями и видами, по редко используется в исследованиях таксонов более высокого систематического ранга. Возможность и эффективность применения гена СО! для реконструкции филогенетических связей родов и триб в группах насекомых с высоким видовым разнообразием, таких как подсемейство Chironoiminae, до сих пор остается дискуссионной (Cranston et al., 2010; Ekrem, et al., 2010).

Цель работы - изучение эволюционной изменчивости гена СОI у видов комаров-звонцов из наиболее распространенных родов подсемейства Chironominae (Chironomidae, Díptera), а также установление возможностей его использования для уточнения филогении таксонов надродового уровня.

Были поставлены следующие задачи:

1. Установить ранее неописанные последовательности нуклеотидов 5'-концевого фрагмента гена COI у широко распространенных видов комаров-звонцов из родов Baeolendipes, Glyptotendipes, Xenochironomus, Endochironomus, Chironomus, Synendotendipes, Polypedilum, Stenochironomus, Cricotopus.

2. Выявить особенности эволюционной изменчивости 5'-концевого фрагмента гена СО1 в подсемействе Chironominae и определить границы его вариабельности у вида, рода, трибы и подсемейства.

3. С привлечением ранее опубликованных данных реконструировать структурную эволюцию нуклеотидной и аминокислотной последовательностей первой субъединицы цитохром С оксидазы комаров-звонцов подсемейства Chironominae.

4. Оценить информативность филогенетического сигнала, полученного при использовании 5-концевого фрагмента гена COI, с учетом уже существующих схем по другим генам, а также данных цитогенетики и морфологии рассматриваемых представителей Chironominae. Проанализировать возможность использования гена СО! для датировки времени дивергенции основных эволюционных линий подсемейства.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые установлена нуклеогидная последовательность 5'-концевого фрагмента гена COI протяженностью с 100 по 634 п.н. (всего 535 п.н.) у 14-ти видов: Baeotendipes noctivaga (JN016823-JN016825), Glyptotendipes imbecillis (JN016845), Glyptotendipes glaucus (JN016837), Glyptotendipes gripekoveni (JN016844), Glyptotendipes mancunianum (JN016842), Xenochironomus xenolabis (JN016835, JN016836), Chironomus curabilis (JN016810, JN016811), Chironomus usenicus (JN016806-JN016809), Endochironomus tendens (JN016838, JN016839), Endochironomus albipennis (JN016840), Synendotendipes kaluginae (JN016841), Polypedilum sordens (JN0I6847), Stenochironomus gibbus (JNO16848), Crícotopus glacialis (JN016846).

Впервые реконструирована схема эволюции нуклеотидной последовательности гена COI комаров-звонцов подсемейства Chironominae. Показано слабое влияние отбора на характер замещения нуклеотидов в гене COI у Chironominae, что позволяет рассматривать аминокислотную последовательность, кодируемую этим геном, в качестве филогенетического маркера при исследовании родственных связей таксонов, начиная с родового уровня. Определены границы изменчивости СОI у разных таксономических единиц комаров-звонцов подсемейства Chironominae - вида, рода, трибы и подсемейства.

Впервые приведена филогенетическая схема, отражающая родственную связь представителей комаров-звонцов трех триб подсемейства Chironominae. Показана и обоснована необходимость изменения существующей систематики подсемейства Chironominae. Впервые на молекулярном уровне продемонстрировано, что эволюционная линия Stenochironomus может претендовать на статус отдельного от Chironominae подсемейства.

Впервые проведена молекулярная датировка основных эволюционных событий в подсемействе Chironominae.

Научно-практическая значимость. I 1редставлена возможность использования штрихкодового гена мтДНК - СОI в макросистематике таксонов с высоким видовым разнообразием.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены па Международной научной конференции «Ломоносов», 2007; XIII съезде Русского энтомологического общества, 2007; IX конференции «Водные экосистемы, организмы, инновации - 9», 2007; XIII Международной школе-конференции молодых ученых «Биология внутренних вод», 2007; 68 научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского государственного медицинского университета «Молодые ученые -здравоохранению региона», 2007; XXI Любищевских чтениях «Современные проблемы эволюции», 2007; ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов Саратовского государственного университета, 2007 и 2008; Международной научной конференции «Хромосома 2009», 2009; XIV школе-конференции молодых учёных «Биология внутренних вод», 2010; V Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «KARYO V», 2010; IV всероссийском симпозиуме по амфибиотическим насекомым «Проблемы водной энтомологии России и сопредельных государств» СОГУ, 2010; Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке», 2011.

Декларация личного участия автора. В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором, а также совместно с Н.С. Мгоге (лаборатория экспериментальной эмбриологии ИБР РАН). Секвенирование проводилось совместно с Н.С. Мюге. Полученные результаты обсуждались автором совместно с научным руководителем, а так же с Е.В. Шайкевич (лаборатория сравнительной генетики животных, ИОГЕН РАН) и Н.С. Мюге. Суммарное личное участие автора составило 80%.

Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы и приложения. Работа изложена на 137 страницах, включает 24 рисунка и 17 таблиц, список цитируемой литературы включает 160 ссылок, из которых 100 на иностранном языке.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, включая 11 статей, из которых две в журналах, рекомендованных ВАК.

Положения, выносимые на защиту;

1. Филогенетический сигнал, получаемый с использованием аминокислотной последовательности, кодируемой 5'-концевым фрагментом широко ггрименяемого в настоящее время «баркодингового» гена COI, в пределах подсемейства Chironominae столь же информативен, как и сигнал, получаемый от последовательностей ядерных генов, используемых при филогенетическом анализе надродового уровня.

2. Использование аминокислотной последовательности, кодируемой 5'-концевым фрагментом гена COI, позволяет проводить

реконструкции родственных связей в подсемействах с высоким видовым разнообразием и давать оценку времени дивергенции таксонов, начиная с родового уровня.

3. С достоверностью > 75% пара видов принадлежит одному роду, если уровень аминокислотной изменчивости <1.7%; - одной трибе - от 1.7 до 4.0%; - разным трибам - от 4.6 до 6.1%; - разным подсемействам - >7.9. Полученные диапазоны могут быть использованы как таксономический критерий рода, трибы и подсемейства у Chironominae.

Благодарности. Искренне благодарю своего научного руководителя д.б.н. Н.В. Полуконову. Выражаю признательность к.б.н. Н.С. Мюге, к.б.н. Е.В. Шайкевич, д.б.н. В.В. Аникину и С. Мартину (Германия) за практические рекомендации, а также д.б.н. H.A. Дурновой за предоставленные образцы для исследования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материал. Использованы личинки IV возраста и имаго комаров-звонцов, собранные в 2007-2009 г.г. в Саратовской, Самарской и Воронежской областях, Краснодарском крае, Калмыкии и Казахстане (табл. 1). Всего было исследовано 35 особей, относящихся к 20 видам из 10 родов комаров-звонцов. При сборе использованы как стандартные гидробиологические и энтомологические методики (Шилова, 1976), так и собственные - с помощью предложенного имагоуловителя (Демина и др., 2009). Материал фиксировали: имаго в 70н этиловом спирте, личинок - в спиртоуксусиой смеси (Кикнадзе и др., 1991). Видовую идентификацию проводили с помощью морфологического и кариотипического методов (Панкратова, 1983; Шобанов, 1989; Кикнадзе и др., 1991; Полуконова, 2005; Макарченко, 2006).

Определена последовательность нуклеотидов 5'-концевого участка гена COI 35 особей, представляющих 20 видов из 10 родов комаров-звонцов (табл. 1).

В работе также использовано 146 нуклеотидных последовательностей гена СО/, относящихся к 125 видам 29 родов двукрылых (Díptera), депонированные в GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov), каталожные номера которых приведены на филограммах. Длина анализируемого фрагмента гена COI составила 535 п.н. (с 100 по 634). В филогенетических реконструкциях подсемейства Chironominae, основанных на гене COI, использованы сиквенсы 155 представителей, из которых 141 относилась к 133 видам 32 родов Chironominae. Лично было сделано 23 сиквенса 19 видов из 10 родов хирономид. В качестве внешней группы выбраны: представители двух родов наиболее близкого к Chironominae подсемейства Ortocladiinae (Saether, 2000) - Orthocladus (4 вида) и Cricotopus (6 видов); 2 вида Culicoid.es, принадлежащие наиболее близкому к Chironomidae семейству Ceratopogonidae (Bertone, 2008) и, эволюционно удаленный от хирономид, Ogcodes basalis (Acroceridae). Для реконструкции родственных связей видов

рода Chironomus использовалась последовательности фрагмента гена COI -длиной 595 п.н. (74-669) 33 особей 19 видов. Лично было установлено 13 последовательностей 7 видов из 2 родов. В качестве внешней группы взяты Baeotendipes sp., В. noctivaga (Chironomidae) и Drosophila angor (Drosophilidae).

Таблица 1

Материал, места сбора и каталожные номера СепВапк последовательностей гена С01 _комаров-звонцов__

Виды Места и даты сборов (обозначение популяции) Катал. № GenBank

Chironomus plumosas (Linnaeus, 1758) оз. Калач, Саратовской обл. 02.2007 г. (Novous) JN016829 JN016830

р. Дон, Воронежской обл., г. Воронеж, 07.2008 г. (Voron) JN016832

р. Дон, Воронежской обл., г Богучары, 07.2008 г. (Bouuchar) JN016833

р. Зап. Двина, Брянская обл., г. Брянск, 06.2009 г. (Brjansk) JN016834

р. Волга, Самарская обл., г. Тольятти, 06.2009 г. (Toi) JN016831

Ch. curabilis Beljanina, Loginova, Sigareva, 1990 р. Волга, Саратовская обл. п. Банновка; 07.2006 г. (Ban) JN016811

р. Волга, Саратовская обл. г. Балаково, 07.2006 г. (Bal) JN016810

Ch. usenicus Loginova et Beljanina, 1994 оз. Калач, Саратовской обл., 02. 2001, 02.2007 г. (Novous) JN016806 JN016807 JN016808 JN016809

Ch. balatonicus Devai, Wuelker, Scholl, 1983 оз. Калач, Саратовской обл., 02.2007 г. (Novous) JN016826

р. Дон, Воронежской обл., г. Воронеж, 07.2008 г. (Voron) JN016827

Ch. commutatus Kayl, I960 о. Сазанка, Саратовской обл., 07.2008 г. (Saz) JN016828

Ch. bernensis Klotzli, 1973 оз. г. Тольятти, Самарской обл. 07.2008 г. (Toi) JN016851

Baeotendipes noctivaga Kieffer, 1911 Аральское море, Казахстан, 08.2008 г. (Aral) JN016824 JN016825

о. Маныч, респ. Калмыкия, 02.2007 г. (Kalm) JN016823

Dicrotendipes nervosus Staeger, 1839 Волга, Саратовской обл., 07.2009 г.* (Volga); JN016849

р. Терешка, Саратовской обл., 07.2009 г.* (LjisGorji) JN016850

Endochironomus tendens (Fabricius, 1775) р. Терешка, Саратовской обл., (Tereshka) JN016838

р. Красавка, Саратовской обл., 07.2009 г.* (NAlexan) JN0I6839

E. albipennis Meigen, 1830 о. Сазанка, Саратовской обл., 07.2009 г.* (Saz) JN016840

Clyptotendipes barbipes Staeger, 1839 р. Узень, Саратовской обл., 08.2007 г. (Novous) JN016843

G. glaucus Meigen, 1804 р. Волга, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Engels) JN016837

' сбор и определение Н.А Дурновой

Окончание таблицы 1

Виды Места и даты сборов (обозначение популяции) Катал. № GenBank

G. gripekoveni (Kieffer, 1913) оз. г. Маркс, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Marks) JN016844

G. imbectiUs Walker, 1856 р. Волга, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Volg Uzm) JN016845

G. mancunianus Edwards, 1929 оз. г. Маркс, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Marks) JN016842

P. (Pentapedilum) sordens (Van der Wulp, J 874) р. Красавка, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Mih) IN016847

Stenochironomus gibbus (Fabricius, 1794) р. Терешка, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Tereshka) JN016848

Synendotendipes kaluginae Durnova, 2010 о. Холодное, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Holodn) JN016841

Xenochironomus xenolabis (Kieffer, 1916) р. Красавка, Саратовской обл., 07.2009 г. * (NAlexan) JN016836

р. Терешка, Саратовской обл., 07.2009 г. * (Tereshka) JN016835

Cricotopus glacialis Edwards, 1922 р. Волга, Саратовской обл., 07.2009 г.* (Volga) JN016846

Молекулярно-генетический анализ. Выделение тотальной ДНК проводилось набором Diatora'™ DNA Prep 100 «Изоген». Амплификация гена COI - набором GenePak@ PCR Core «Изоген» на термоциклере «Терцик».

ПЦР-амплификация: структура праймеров для амплификации гена COI: С011490 5'ggtcaacaaatcataaagatattgg3'; COI2198

5'taaacttcagggtgaccaaaaaatca3' (Folmer et al„ 1994). Условия ПЦР: I. 94° - Г; II 5 циклов: а) 94° - Г, b) 45° - 1.5', с) 72° - 1.5'; III. 35 циклов: а) 94° - Г, Ь) 50°- 1.5', с) 72° - Г; IV. 72° - 5'.

Детекция ПЦР-продуктов проводилась с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. В качестве буфера использовался стандартный трис-ацетатный буфер. Для элюции ПЦР-продуктов из геля применялся набор Diatomlm DNA Elution «Изоген». Определение первичной нуклеотидной последовательности гена проводилось на базе ВНИРО г. Москва на секвенаторе ABI 3100.

Математическая обработка полученных результатов. Для коррекции полученных последовательностей использовалась программа ChromasPro, множественное выравнивание проводилось в ClustalW, филогенетические построения методами Minimum Evolution (ME), Maximum Parsimony (MP) и UPGMA, Tajima-тест и транслирование ДНК-последовательностей - с использованием пакета программ Mega4, построение ML- и Bayes-дендрограммы с использованием программ PhyML 3,0 и MrBayes 3.1.2. Статистический анализ - в программах Statistica6 и Mega4. Анализ насыщения ДНК-последовательности мутациями проводился по Гриффитсу

* сбор и определение Н.А Дурновой

(Griffiths, 1997). Расчет времени дивергенции с применением модели релаксированных молекулярных часов выполнялся с использованием пакета программ BEAST vl.6.1. (параметры генерации деревьев закладывались с использованием программы BEAUTi vi.5.1; для построения деревьев использовалась программа BEAST vl.6.1; генерация результирующего хронограммы проводилась в программе TreeAnnotator vl.6.1). Филогенетические деревья визуализировались в программах MEGA4 и FigTree vi.3.1. Нуклеотидные построения проводились с применением эволюционных моделей: p-distance, Jukes Cantor, Tamura-Nej, Kimura 2-parameter и MCL и GTR. Использовались все положения кодона; только нуклеотиды в 1-ом и 2-ом положениях кодона; только нуклеотиды во 2-м положении кодона; только трансверсии в 1-м и 2-м положениях кодона, только несинонимичные замены, только транзиции в 1-м положении кодона, только трансверсии в 1-м положении кодона. В качестве эволюционных моделей замещения аминокислот применялись: JTT matrix, Dayhoff matrix, Equal Input, Poisson correction, p-distance. Оценка достоверности узлов выполнялась с использованием Bootstrap-теста (Felsenstein, 1985).

Калибровка молекулярных часов и оценка диапазона времени дивергенции проводилась с использованием данных о времени обособления семейств Chironomidae и Ceratopogonidae - 213 млн.л.н. (Bertone, 2008), и времени возникновения рода Sergentia - 38 млн. л.н. (Papoucheva et al., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Композиция и изменчивость COI и молекулярные границы таксонов комаров-звонцов подсемейства Chironominae

У 133 видов Chironominae на исследуемом участке гена COI - 535 п.н. (с 100 по 654) среднее соотношение оснований T/C/A/G составило 38.1 %/18.4%/27.9%/15.6%. Количество AT пар в 1.9±0.4 раза выше GC. Сдвиг нуклеотидного состава - не более 20%. Выявлено 254 (47.2%) вариабельных нуклеотидных сайтов. Среднее отношение транзиций к трансверсиям Ti/Tv составило 0.86. Состав фрагмента аминокислотной последовательности (178 а.к.), кодируемой геном COI, характеризовался присутствием 20 аминокислот. Отмечено повышенное содержание лейцина - 15.51% и пониженное - лизина и цистеина - по 0.01%. На участке аминокислотной последовательности количество вариабельных сайтов составило 52 (29.2%).

Реконструкция схем эволюции гена COI в подсемействе Chironominae

Были получены 25 схем эволюции последовательности нуклеотидов гена COL При использовании транзиций и трансверсий во всех положениях кодона, схемы, полученные разными методами, сильно отличались друг от друга, кластеры в которые группировались последовательности, были плохо дифференцированы, отсутствовало согласование между эволюцией последовательности нуклеотидов гена COI рассматриваемых видов комаров-звонцов и их систематическим положением. Причиной подобных

несогласований, было выявленное насыщение третьего положения кодона транзициями и достижение порога насыщения трансверсиями (рис. 1). Использование третьего положения кодона для описания эволюции последовательности нуклеотидов гена COI в подсемействе оказалось невозможным. Схемы, основанные на использовании первых двух положений кодона, более четко дифференцировали последовательности в кластеры и имели большее сходство друг с другом. Очевидно, при использовании первых двух положений кодона соотношение сигнал/шум повышалось. Комплексный анализ полученных схем позволил выявить основные эволюционные линии гена COI исследуемых комаров-звонцов.

Нуклеотидные реконструкции с высокой достоверностью позволяют сделать следующие заключения: эволюционные линии гена COI представителей подсемейств Chironominae и Orthocladiinae хорошо обособлены друг от друга. Внутри подсемейства Chironominae ДНК-последовательности представителей триб Chironomini и Tanytarsini формируют два хорошо дифференцированных кластера. ДНК-последовательности представителей трибы Pseudochironomini Pseudochironomus sp. и Riethia stictoptera не формируют самостоятельной эволюционной линии, а группируются вместе с ДНК-последовательностями представителей трибы Chironomini. ДНК-последовательность Stenochronomus gibbus формирует ветвь, обособленную от Chironomini и Tanytarsini.

0.250 г g 0.200 га _......,._._______ .,)Ч„М1.______

"7 а. од 50 .г ...............t-........_

Э 1 одоо

о, f~ 0,050

fk -^щм.....

Все нуклеотидные замены

0.450

^Гоо а ¡>4" -Ц

5 0,150

0 20 40 60 80 100 320 140 160 р-Все нуклеотидные замены О

Рис. 1. Графики насыщения ДНК-последовательности транзициями в 1-, 2-, 3-положениях кодона (А) и трансверсиями в 1-, 2-, 3- положениях кодона (Б)

Ti - транзишш, Tv - трансверсии. Цифрами 1. 2. .4 обозначено положение нуклеотида в кодоне.

Последовательности гена СОI трибы Chironomini разделяются на два кластера, в один из которых входят последовательности Endochironomus, Sergenlia, Pseudochironomus, Synendotendipes и Polypedilum, а в другой -последовательности остальных исследованных нами родов трибы (рис. 2). Однако связать эволюцию нуклеотидной последовательности COI с эволюцией целого ряда родов, таких как Chironomus, Stempillinella, Micropsectra, не представлялось возможным.

Chironomini

Pseudochironomíni

Tanytarsini

о x

О z: О

Z >

__ ORTHOCLADIINAE

-------------------- stenochironomus gibbus Tereshka

- Culicoides circumscriptus AF069248 СЕр)дторос0мЮАЕ Culicoides Imicola AF079975 -----Ogcodes basalis DQ631991 (ACROCERIDAE)

Рис. 2. Эволюционные линии гена СО! подсемейства Chironominae

Эволюционно значимые струкггурные изменения гена СО! у комаров-звонцов подсемейства СЫгопоттае

Полученные схемы эволюции гена СО/ комаров-звонцов указывают на существование четырех его эволюционных линий в подсемействе СЫгопоттае (рис. 2): первая линия соответствует родам трибы Тапу(агаш (=Тапу1агат), вторая - трибе РэеисЬсЫгопогтт (=Р5еиёосЫгопот4т-Riethia+Endochironomus+Synendotendipes+Po[ypedilum+Sergentia), третья -трибе Онгопогтиш (^Ьпопотт^епоМюпотиз-ЕпЛосШгопотш-Synendotendipes-Polypedílum+Riethia). Четвертая линия, соответствующая .ЧСепосксгопоти.ч, значительно обособлена от трех остальных и возможно представляет собой линию отдельного подсемейства.

Для выявления связи структурных изменений гена СО/ с эволюцией комаров-звонцов подсемейства СМгопогшпае, нами был выполнен поиск нуклеотидных сайтов, несинонимичные замены в которых были бы уникальны для каждой или нескольких из эволюционных линий. Так же в анализ для выявления в рассматриваемых сайтах предковых нуклеогидов

Chironominae, были включены эволюционные линии СО/, соответствующие Orthocladiinae и Ceratopogonídae+Acroctridae. Для поиска триплетов, в которых произошли такие замены, все рассматриваемые последовательности нуклеотидов гена COI были транслированы. Длина исследуемого участка аминокислотной последовательности, кодируемой геном СО/, составила 178 а.к. Выявлено 9 аминокислотных сайтов, соответствующих 9 триплетам или 11 нуклеотидным сайтам, в которых имелись несинонимичные замены, уникальные для рассматриваемой ветви или группы ветвей.

С использованием методов МЕ и МР была получена схема, отображающая преобразование последовательности COI только в вариабельных сайтах 9 выявленных триплетов (рис. 3).

ф.

A -^S&a,

9(Gg}

•• ОигожигшИ

- С'^гопогтигиП

- C'iironoinini4

- ОнгдоопигнЗ

- ChiroíXjmitub

- Pseucfcclniofl HbWKlochiron

-- P:¿i4HÍ0Chií0mWu><<

Psenctochwononwi3

- TanySíi'sin¡3

- TariytaisiHMj

- TanytarsuvG

- ranviarsin1' Taoytarstni?

Chironomtm

i Pseudochironomini

Tanytarsini

- Qrt^oclMunatvS

- Ort'\wclad«nae\ OrtncdaOtVrt&e'i CaíltOpOljOlllOcít

rr —í o

o 3 5" su

Ct>

Orthocladiinae

Рис. 19. Схема эволюции гена COI, основанная на сайтах, содержащих несинонимичные замены, уникальные для эволюционных линий комаров-звонцов подсемейства Chironominae

Цифрами указаны положения нуклеотидных сайтов отностительно старт-колона гена COI. латинскими буквами в скобках - соответствующие сайту нуклеотиды.

Для каждой из эволюционных линий найдены все варианты сочетания 9 триплетов в последовательности гена COI. В линии Chironomini таких вариантов выявлено 5. в линии Pseudochironomini - 4. в линии Tanytarsini - 5, в линии Orthocladiinae - 3, линии Ceratopogonidae+Acroceridae представлял один вариант. Схема подтвердила разделение последовательности нуклеотидов гена COI комаров-звонцов на 4 эволюционные линии, идентичные полученным ранее на основе всех 535 нуклеотидных сайтов. Каждую из эволюционных линий маркируют один или несколько сайтов с уникальными нуклеотидными заменами.

Для более детального анализа структурных преобразований выявленных сайтов была составлена схема их эволюции в пределах последовательности COI (рис. 4).

______________7________8_.......?

J ......J .......3........ 4..................... ....... _ 5_____________7________8_______

лил 1,11v.iMi Ov'IJ) v.'j, v.j №(1¡ Mil1-?) '-''".I V.,l[l) Thfl.it

Orthocladiinae _____—j

1......1 1 «. ..... S .

I............¡.......I-.

J fi 9

¡/'. гр;1: )->ыг.яi4":/,r .i i[i i1.rt.-,' м-зкл пул. :■,..'...'. з ir.:;', ; у.н i.-.,.•/,.-.n tiatii^l «-n.bir»'.?.!.''.'.'.'"'.!

(!I !.":)( v:¡i i '".Vi ! S-',;..' Ai^ij l, ihíüi

Stenochironomus

t.4,1! '*>,.'> '-t.: I.'i

1 . )...... > . < ......5 ..... « .. 7 I 9

!''o[i) ....... !,...'; I.M:'.I -ч.ч.>-J:..'¡

Tanytarsini

........... 7...... S...........5

' .-.-.i ■ . i

Proíii ;.."n ',■.-':. -.< ........ ? '-'iJ

Pseudochironomini

J _ _.....1_____i______5 -......-.......-í...-.. -..... '...........»-..- .. 9

¡;v'C4 I il'A:: hAG'r

Pro('l; ТЫН : Tría w;:; AUÍ1.2Í V" .1,21 V-; 1 i ValU) Thill)

Chironomini

Рис. 4. Эволюционные изменения 11 значимых нуклеотидных сайтов в последовательности гена COI комаров-звонцов подсемейства Chironominae

Горизонтальной жирной чертой показана последовательность нуклеотидов 11 сайтов. Над жирной чертой приведены номера нуклеотидных сайтов относительно первого положения старт-кодона и латинские буквы, обозначающие нуклеотид - (G) или несколько вариантов нуклеотидов (Т/С). Тонкой чертой подчеркнуты порядковые номера 9 триплетов. Номера и латинские буквы, отмеченные жирным выделением, обозначают уникальные нуклеотидные замены, свойственные только для последовательности COI конкретной эволюционной линии. Под жирной чертой, напротив порядковых номеров триплетов указаны соответствующие им аминокислоты. В скобках рядом с каждой аминокислотой указано положение вариабельного нуклеотида в кодоне. Цифрами 1, 2, 3 обозначены гипотетические предковые сочетания нуклеотидов рассматриваемых 11 сайтов: 1 - подсемейств Orthocladiinae и Chironominae, 2 - Chironominae и Stenochironomus gihbus, 3 - трех триб подсемейства Chironominae.

Из 11 рассмотренных нуклеотидных сайтов только в 7 (3% от 254 вариабельных сайтов) наблюдаемые несинонинимичные замены приводят к изменению класса аминокислоты и, соответственно, потенциально способны повлиять на пространственную организацию пептида. Такие изменения затрагивают всего 5 триплетов (10% от 52 вариабельных сайтов) из 9 отобранных и 178 рассматривавшихся первоначально:

1) 125 позиция - замена нуклеотида С на G (пролин - аланин) могла способствовать обособлению ветви Orthocladiinae от остальных хирономид;

2) 398, 399 позиции - замена нуклеотидов АЛ на GG (аспарагин -глицин) могла способствовать обособлению Orthocladiinae от общего с Chironominae предка. Замена нуклеотидов АА на GC (аспарагин - аланин) могла способствовать обособлению Stenochironomus от общего с остальными Chironominae предка. Позднее в эволюционной ветви Chironominae эта же замена или замена AG - GC (серии - аланин) могла привести к обособлению Chironomini от Pseudochironomini и Tanytarsini;

3) 410, 411 позиции - замена нуклеотидов GC на AG (аланин -серин) могла способствовать обособлению общего предка Stenochironomus и Chironominae от остальных хирономид;

4) 491 позиция - замена нуклеотида А на G (серин - аланин) могла привести к обособлению Stenochironomus от остальных хирономид;

5) 569 позиция - замена нуклеотида А на G (треонин - аланин) могла привести к обособлению общего предка Chironominae и Stenochironomus от Orthocladiinae.

Можно заключить, что именно перечисленные сайты на участке 5'-концевого фрагмента последовательности гена COI с 100 по 634 п.н. являются эволюционно значимыми, изменения в них не только маркируют эволюцию хирономид, но и потенциально способны привести к изменению в структуре и функциональных особенностях COI. В пределах рассматриваемого фрагмента гена COI в 97% вариабельных нуклеотидных сайтов наблюдаются эволюционно нейтральные замены.

Соответственно, в пределах аминокислотной последовательности, кодируемой фрагментом гена СО/, в 90% вариабельных аминокислотных сайтах наблюдаемые замены так же являются эволюционно нейтральными. Можно полагать, что эволюция аминокислотной последовательности, кодируемой 5'-концевым фрагментом гена COI, у комаров-звонцов в целом носит почти нейтральный характер, что делает возможным ее использование в качестве филогенетического маркера в пределах подсемейства Chironominae. Данное заключение подтверждается результатами Tajima-теста, не опровергающими равенство относительных скоростей эволюции аминокислотной последовательности COI во всех филогенетических линиях Chironominae.

Оценка аминокислотной и нуклеотидной изменчивости между парами видов одного рода, разных родов одной трибы, разных триб и разных подсемейств (рис. 5) показала, что вариабельность аминокислотной последовательности лучше отражает границы рода, трибы и подсемейства. С наибольшей достоверностью > 75%, выявляемой по межквартильному размаху, пара сравниваемых видов принадлежит одному роду, если уровень аминокислотной дивергенции <1.7%; - одной трибе в пределах от 1.7 до 4.0%; разным трибам в пределах от 4.6 до 6.3%; разным подсемействам >7.9. Полученные диапазоны могут быть использованы как таксономический критерий рода и трибы в подсемействе Chironominae.

24.0% 22.0% 20.0% 18.0% 16.0% 14.0% 12.0% 10.0% 8.0% 6.0% 4.0% 2.0% 0.0%

21.3 о

18.3Ö 15.1

й'.ск

L___

12.9

9J'-i

_19.6_ 16.6

18.2 !

1;7.0Л

15.5 с

15.9

14.0

11.4 7.4

4.0

2.9 .

2.7

1.7

0.6

13.6

8.6 6.3!

|s.1,', U.6

2.9

22.4

20.о]_

18.5 "1

15.9 12.1

¡9.7

9.1 7.9 6.1

1.1

1.7

Медиана

I__i 25%-75%

"Т Размах без выбр.

о Выбросы

Рис. 5. Нуклеотидная (А) и аминокислотная (Б) изменчивость СО! между парами видов комаров-звонцов различного таксономического ранга

I - виды одного рода (866 набл.); II - виды родов одной трибы (198 набл.); 111 -виды разных триб (180 набл.); IV - виды разных подсемейств (55 набл.).

Таким образом, для реконструкции эволюционных событий в подсемействе Chironominae возможно использовать схему, отображающую эволюцию аминокислотной последовательности, кодируемой 5'-концевым участком гена COI. Для проверки данного предположения нами были получены схемы эволюции аминокислотной последовательности, кодируемой геном COI, комаров-звонцов подсемейства Chironominae.

Молекулярная филогения и время днвергенции комаров-звонцов подсемейства Chironominae, основанные на аминокислотной последовательности, кодируемой геном COI

Из использованных дистантных методов (NJ, ME, UPGMA) наибольшую поддержку получила дендрограмма, построенная методом ME. В качестве модели замещения аминокислот использовался алгоритм Position correction. Из дискретных методов (MP, ML, Bayes), наибольшую поддержку получила топология Bayes-дендрограммы. Параметры Markov Chain Monte Carlo (MCMC): 1000000 генераций, отбор дерева проводился через каждые 100 генераций, эволюционная модель - JTT. Топология полученных дендрограмм в целом была идентичной, в основных узлах имела высокую поддержку и на уровне макросистематики (триб, подсемейств) подтверждалась результатами построений, основанных на нуклеотидной последовательности. Дендрограммы были представлены четкими кластерами, в целом, согласующимися с современными представлениями систематиков (Wiederholm et al., 1983-1989; Макарченко, 2006) о положении

родов и триб в подсемействе Chironominae. За базовую была принята топология МЕ-дендрограммы, далее именуемая филограммой (рис. 6 а, б), которая использовалась в дальнейшем для описания родственных связей Chironominae. Исследованные рода содержат более 50% видового разнообразия подсемейства, поэтому выполненные построения способны достаточно адекватно отразить филогенетическую структуру Chironominae.

Для установления возраста основных таксонов подсемейства Chironominae так же использовалась частичная аминокислотная последовательность (178 а.к.), кодируемая геном COL Для этого была получена хронограмма, отображавшая время дивергенции 53 представителей 28 родов подсемейства. Расчет времени дивергенции проводился с использованием модели байесовских некоррелированных логарифмически нормальных релаксированных молекулярных часов. Для генерации деревьев использовалась эволюционная модель JTT+I+G (с учетом 4 гамма-категорий) совместно с Yule-моделью процесса ветвления. Параметры МСМС: генерировали 10 миллионов марковских цепей, отбор деревьев проводился через каждую 1000 генераций. Результирующее дерево, далее называемое нами хронограммой (рис. 7), было построено на основе анализа 10000 полученных ранее деревьев за исключением первой 1000 как менее устойчивой. Тип результирующего дерева - «Maximum clade credibility». Диапазон времени дивергенции рассчитывался на основе 95% плотности апостериорного распределения. Возраст узлов хронограммы определяли по медианному значению диапазона времени дивергенции.

Схемы эволюции аминокислотной последовательности COI (рис. 6 а, б; 7) хорошо согласуются с данными об экологии, морфологии, цитогенетике и молекулярной генетике комаров-звонцов (Черновский, 1949; Шилова, 1976; Saether, 2000; Полуконова, 2005; Макарченко, Мараченко, 2006; Ekrem et al. 2007, 2010; Cranston et al. 2010; Дурнова, 2010).

Представители Chironominae и Ortocladiinae образуют обособленные кластеры, что согласуется с морфологической филограммой Сезера (Saether, 2000). Время формирования этих подсемейств - приблизительно 104 млн. л.н. (конец раннего мела) (рис. 7) совпадает с датировками Кренстона с соавторами (Cranston et al., 2010) - около 105 млн. л.н., основанными на ДНК-последовательностях ядерных генов (I8S, 2SS, CAD) и гене COI, а так же подтверждается палеонтологическими данными о появлении Chironominae в позднемеловых отложениях (Калугина, Жерихин, 1975).

- CWronomus heterodenlatus AF192199

- CMronomus cinflillalus AF192191

- Chironomus ciicumdatus AF192215

- Chironomus nepeanensis AF 192216 Chironomus bemensis Tol Chironomus maturus DQ648204 Chironomus novosibiricus AF 192197 Chironomus oppositus AF 110155 Chironomus balatonicus Nowus Chironomus acutiventris AF192200 Chironomus dúplex AF192210 Chironomus plumosus Voron Chironomus curabilis Bal Chironomua commuttatus Saz Chironomus sorodus AF 192198 Chironomus entis AF 192195 Chironomus tusanicus AF192196 Chironomus nuditarsis DQ910578 Chironomus suwai DQ648206 Chironomus jacksoni AF192207

- Chironomus pseudothummi AF192205

- Chironomus crassíforceps AF192212 -Ch. (lobochíronomus) dorsalrs 00643200

Einfektia sp. OQ648212 Chironomus tepperi AF192211 , Chironomus javenus DQ648203 -i" Chironomus lundus AF192203

- Camptochironomus tentans AF110158

- Camptochironomus pallfdiwttatus AF11016

- Benthalia dissidens 00648198 i Baeotendipes noctivaga A ral ' Baeotendipes noctivaga AraJ

У73 , Cryptochíronomus зр. DQ648210 —j Riethia stictoptera DQ648229 I PSEUDOCHiRONOMlNi

' Axarus sp. OQ648197 Gjyptotendipes imbeclWs VcAg Uzm Glyptoteodipes glaucas Engels GlyptotefKftpes gripeko^eni Maiks Glyptotendipes barbipes Uz

82/53

1A1

IA2

IA3

IA4

_ Glyptotendipes mancunianum Martes Kieflerulus breUbucca DO648215 Kiefferulus intertinctus DQ648219 Kieflerulus lortgitobus D0648220 Kiefferulus martini DQ648221 Goeküchironomus dewneyae DQ648214

Dicrofendipes nenosus УоЦза Dicroíendipes nervosus Ljisgoi)' Upinieíla sp. DQ648226 —I MicrocbiroDOmus sp. AY752664

I Cladoplema sp. AY752675 t

-Dicrotendipes pseudoconjunctus DQ648211

Xenochronomus xenolabis Natexsan Xenochironomus xenolabis DQ648230 Xanochronomus xenolabis Tereshka

Шс"-"~'11гопотиз tendeos Nal&xand lironomus tendeos Ijisflorji iojendipes kaluginae Holodn Ehdocbirooomus aibipenis Saz Polypedllum sordens Mlh

Polypedilum pterospilus GU565728

Pseudochironomus sp. DQ648228 í PSSUDOCHIROfOMíNl Polypedllum nubifer DQ648227 Polypedilum nubifer AY752679 Sargentía baueri AF116589

Sargentía affinis AF116588 Sergentia nebulosa AF116583

Sergentia baicaiensis AF116586

Sergentia flavodentara AF116584 Sergentia electa AF 116585

TANYTARSINI

Рис. 6. Фклограмма подсемейства Chironominae

а. Фрагмент филограммы, демонстрирующий положение родов трибы Chironommi Сиквенсы гена СОI подчеркнутых таксонов получены автором лично. В узлах приведены значения поддержки - Bayes/ME. Вертикальными линиями отмечены кластеры родов.

Chironomini Pseudochironomini

Tanytarsus edwardi D0393875

Tanytarsus tieliomesonyclios GU073192

Tanytarsus miriforceps GU073207

- Tanytarsus allicis GU073196

- Tanytarsus elisabethae AM084263 - Tanytarsus inaequaiis GU073206

i-Tanytarsus hercmanni GU073204

П-Tanytarsus valgensis GU073221

4 --Tanytarsus wirttvi GU073223

'— i Tanytarsus telmaticus GU073220 I—J Tanytarsus mendax AM084269 • Tanytarsus dendyi GU073200

- Tanytarsus acuteatus GU073194

- Stempetlinella cilians EF58541S Stempellinélla edwardsi EF585418 Stempellinella boltoni EF585410 SfempeHinella truncata EF585431 Stempellínella coronata EF585417 Stempellineila saltuum EF585427 Stempellínella brevas EF585413 ■ StempeUinella fimbriate EF585421 ' Stempellinella tamaseptima EF585428 ■ Cladotanytarsus sp. DQ393864

-Cladotanytarsus sp. DQ393863

' Cladotanytarsus bilinear)? DQ393888 Cladotanytarsus auslralomannus DQ393882

Tanytarsus hjulorum AM08426S

Neozavrelia cuneipennis AM 180934 - Tanytarsus gracilentus GU073202 anytarsus inextentus 00393870 Tanytarsus bavbitarsis D0393880

_1 Paratanytarsus Kathleenae DQ3938B9

_i 1 Paratanytarsus austriacus GÜ073185

j j i Paratanytarsus gnmmii AY752669 -J ' Paratanytarsus dissimilis AM398752

j -Tanytarsus inextentus DQ393851

i-Tanylarsus semibarbitarsus DQ393868

Micropsectra seguyi AM398727 Micropsectra roseiventris AM398721 Micropsectra recuneta FN796510 Micropsectra oberaarensis AM398735 Micropsectra kurobemacuiata AM398700 Micropsectra borealis FN796499 Micropsectra pallidula AM398712 Micropsectra Iogani AM398705 Parapsectra mendli AM398738

4 Micropsectra atrofasciata FN796497 Micropsectra sofiae AM39873I Micropsectra iacustris FN796501 Krenopsectra acuta FN796496 Micropsectra radialis GU073179 Parapsectra uliginosa FN796516

Tanytarsus bispinosus DQ393857 Tanytarsus luctuosus AM084267

НА

ilBi

НБ2

НБз

Tanytarsus aterrimus AM084262 — Micropsectra jurtci AM398698

-Rheotanytarsus pentapoda AM398766

Rheotany tarsus sp. AM3987S7 Parapsectra nana AM398739 Viryatanytarsus aboensis AM398773 Virgatanytarsus aboensis AM398774 Virgatanytarsus aboensis AM398772 Micropsectra insignilobus GU073169 Micropsectra attenuate AM398688 Micropsectra appendica AM398685 Micropsectra schrankelae AM398725 Micropsectra pollta AM398717 Micropsectra lindrothi FN796505 Micropsectra contracta AM398693 Micropsectra pbaretrophora AM398715 Micropsectra notescens AM398711

IIB4

ПБ

Рис. 6. Филограмма подсемейства СЫгопоттае

б. Фрагмент филограммы, демонстрирующий положение родов трибы Тапу1агат В узлах приведены значения поддержки - Вауез/МЕ. Вертикальными линиями отмечены кластеры родов.

Stenochironomus формирует ветвь, уклоняющуюся от Chironominae и Ortocladiinae, что совпадает с нашей реконструкцией, основанной на ДНК-последовательности гена COII (Дурнова и др., 2011, в печати). По морфологическим и кариотипическим признакам виды Stenochironomus сильно отличаются от других представителей Chironominae (Панкратова, 1983). Особенностью организации их политенных хромосом является слабая степень политении (Дурнова, 2010), характерная для примитивных подсемейств комаров-звонцов, таких, как Tanypodinae (Белянина, 1983).

Рода триб Chironomini и Tanytarsini заметно отличаются как по морфологии, так и особенностям экологии (Шилова, 1976), в связи с чем, их разделение в самостоятельные ветви, произошедшее около 85 млн. л.н. (6 а, б; 7), выглядит вполне предсказуемым.

Ветви триб Chironomini и Pseudochironomini разделились примерно 66 млн. л.н., что подтверждается проведенной Кренстоном с соавторами (Cranston, et al., 2010) оценкой времени дивергенции эволюционных линий Riethia sp. (Chironomini) и Polypedilum prasiogaster (Pseudochironomini), составляющей около 62 млн. л.н.

Chironomus, Einfeldia, Camptochironomus, Benthalia и Baeotendipes формируют монофилетическую ветвь в составе трибы Chironomini. Представители данных родов очень сходны по морфологии личинок, куколок и имаго (Шилова, 1976; Панкратова, 1983), их политенные хромосомы обладают гомологией, образуя общие цитологические комплексы (Шобанов и др., 1996), что не свойственно другим родам Chironomini. Эволюционная близость данных родов, показанная нами на основе гена COI, вполне согласуется с мнениями ряда авторов. Так, ранее обсуждалось выделение этих родов в отдельную подтрибу (Полуконова, 2005) или их включение в качестве подродов в состав рода Chironomus (Martin, 2010).

Обособление таких широко распространенных родов трибы Chironomini, как Chironomus, Baeotendipes, Dicrotendipes, Glyptotendipes, по нашему мнению, происходило не ранее 25-30 млн. л.н. Формирование водных энтомофаун современного типа, по данным Калугиной и Жерихина (1976), началось 24 млн. л.н. и проходило на фоне ускоренного эвтрофирования водоемов.

Xenochironomus xenolabis, обособившийся примерно 37 млн. л.н., представляет эволюционную линию, уклоняющуюся от других видов Chironomini, что согласуется со способом питания и образом жизни его личинок, паразитирующих внутри пресноводных губок (Панкратова, 1983), в отличие от остальных хирономид-фильтраторов и, реже, факультативных хищников.

ст2н1аПк_АН9.и91

5 Ь«ШС11<и

Оцгоиоми>1е*_ АГ192210 Еп)Ге14'а_«р. 12

2д7г Ваео(<ц<Кр« ИОСНУИ

« АЫ

Свич>»0сЗш<и10инн_р»ШЛ«Мя1и< ЛП10165 4 ОУГ~ СЯ уу < <_ Ь ягЬ ¿|И 5_ 1Гг

1!,

225 2<Ю 175 15« 12? НХ> "5 Я) :5 0

ТРИАС | ЮГА 1 МЕЛ | И.АЛкОГЦП |||ГОГШ

^1.0- Я^с1|иа_И1с1о}><е1 я_ООб48229

Сп-р»ос1игопо1ИШ_*р-_ВОб45210 2 51Г ^Ссг«с1иг«»опии_|р._АУ?526б4 СЬ Лор1ета_ АУ75 26 ? 5 Ьраи«и*_$[>._&0643226

\<||Ос1р 01101111 к ХаиЯнЬч* Ыя1сХ5Д1 ХяюсЬгопочик тспрЬЬп;

ЫшУтас 11<>Кч?п Е» <1 о с}щ 01 ю и ш» (<пИсп< Ыя1иян<1 Р$еи<)ос|1вопо111Ч5_$р._РС>648228

РоКцсМци ;оп1с1и Ро^-риИ1И||_пнЫГс А У7 ' 26 Хег|е»йа_Ъа'|са1с1Ь1$_АР11658(5

Тюлу! ?т«х_СиО"'3 221

51етрсПд1«йя_Гш|Ь1Ш>_115Х54:!! $«етреПшеПл_Ьгел«_ЕР58541 З 5(стреПи)еЗл_Ьо|1о1и_ЕР585410

*и5йа1с>т»пси5_00}93КЯ2 Р мгМтуиия ри I и I 152669 Р«г*а«>1лн1И_Ы! ¿с<п*« _1Х>л 9.' ХХ9 Рят^>«с(г*_11Ь'§шо*а_ГЬГ 796.46 Р*тр5(с(г»_п«1*_АЛи98 739 Ии>«*11у(!и як_А1.139$767 Мкгор$ес1гя я|>|>е1|<1»с*_АМ398685 М) сгор«« с £и_1и1 Л о|1ц_РЫ ?96 5 0 5 З-*»1- Мкг»р$«;Ья_р.>Ь1я_АШ98717 Р я гярБ с сЬя _11 ни сШ _ АЛ В98 738

?.Ьсго)>«сиа_5оГ1а«_АМЗ98731

И1» оГа|П1яг$и«^ еп» яр о На_ А М .3 <> X 76Л М1« ор 5<сГга_»П мш ¡М а_АШ 98б&'8 О11!юсЬЛ|«_ш§1)1и«_И086Я79 Ои110сЫш!._ю(1*с1а_ВОКбЯ78 СпсЫори« й ) 83

С«1со»ори* Уо1?»

Зипос1111опо11пк ¿ЬЬн; Т<ге<Ц<я

£5_сисщи 8 С11р (г ПЛ924 X О йс <>¡<1 с $_01 цс о1а_АР0799 ? 5 Ое«о<1е5_Ь»чл1в_О0бЗ 1991

О X

я о

н >

¡я

сл

Рис. 7. Хронограмма подсемейства СЫгопоттае, основанная на аминокислотой последовательности, кодируемой геном СО/

Пояснения к рис. 7. Сиквенсы гена С01 подчеркнутых таксонов получены автором лично. В узлах хронограммы арабскими цифрами обозначено среднее значение времени дивергенции млн. л., серыми линиями - диапазон времени дивергенции. На шкале обозначено время в млн. л. и геологические периоды. I - Orthocladiinae; П -Ceratopogonidae; III - Acroceridae. 1 - время дивергенции семейств Chironomidae и Ceratopogonidae по Бертоне (Bertone, 2008); 2 - время дивергенции рода Sergentia по Папушевой с соавторами (Papoucheva et al., 2003); 3 - среднее значение и диапазон времени дивергенции подсемейств Orthocladiinae и Chironominae по Кренстоиу с соавторами (Cranston et al., 2010); 4 - среднее значение и диапазон времени дивергенции Riethia sp. и Polypedilum prasiogaster по Кренстону с соавторами (Cranston et al., 2010).

Виды Endochironomus, Synendotendipes, Sergentia, Polypedilum, Pseudochironomus образуют обособленную ветвь, занимающую промежуточное положение между исследованными нами представителями триб Chironomini и Tanytarsini. Узкие вентроментальные пластинки личинки Pseudochironomus (Макарченко, Макарченко, 2006) наличие макротрихий на крыльях имаго у видов Polypedilum и Sergentia, сходных с Tanytarsini (Goetghebuer, 1937), так же указывает на промежуточное эволюционное положение видов этих родов между двумя трибами.

Представители Tanytarsus кластеризуются с видами других родов -Cladotanytarsus, Paratanytarsus, Micropsectra, что свидетельствует о полифилетнчности рода Tanytarsus, на которую указывал Черновский (1949), рассматривавший три ныне отдельных рода: Corynocera, Cladotanytarsus, Paratanytarsus как подрода рода Tanytarsus.

Топология филограммы подсемейства, полученная нами на основании анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых участком гена COI, в основном хорошо согласуется с результатами исследования видов Micropsectra и близких родов Krenopsectra, Parapsectra и Paratanytarsus с использованием трех митохондриальных (/65, COI и С01Г) и двух ядерных (CAD и Ef-Ia) генов, проведенного Экремом и соавторами (Ekrem et al., 2010). В этой работе, также как и у нас, подтверждается парафилетичность рода Micropsectra по отношению к Krenopsectra acuta и 5 видам Parapsectra. Монофилетичность рода Paratanytarsus выявляется только при включении в анализ высоко консервативного ядерного гена CAD, в то время, как использование ДНК-последовательности СО! не позволяет выделить этот род в отдельный кластер (Ekrem et al., 2010). В этом случае филогенетический сигнал, полученный нами с использованием аминокислотной последовательности, кодируемой геном COI, оказывается столь же информативным как сигнал, получаемый от последовательности ядерного гена CAD, что подтверждает обоснованность использования аминокислотной последовательности широко применяемого в настоящее время «баркодингового гена» - COI при филогенетическом анализе надродового уровня.

Применение ДНК-последовательности гена СО! для анализа таксонов родового уровня с высоким видовым разнообразием, на примере

СЫгопотт

ДНК-дендрограмма, описывающая родственные связи исследованных видов СЫгопотт из групп видов-двойников (р1итозиз, оЬи^епз и 1асипагшз), группы близкородственных видов тиЗкагаэ и хорошо морфологически различающихся видов из цитокомплексов Литгш, рзешЗоШитгш, [асипапиэ, соттгйайиз, таШгш была получена методом иРСМА с использованием эволюционной модели МСЬ (рис. 8).

.Ch.usenlcus Novoüs yCh.plumosus Novous J Ch.usenicus Novous n Novous

ICfí.usenicus Novous

p Ch.p turnaseis DQ91Ó556 •Л-СИ.plumosus OQ91CS57 l Ch.plumosus DQ910555 Ch.curabilis Ban Ch.cufabilis gal Ch.nuditarsis 00910S78 Ch.nudílarete DQ910572 Ch.nuditarste DQ910571 Ch.entis AF192195 Ch.agiIfs2AF192190 Ch.muratensis AF192194

Ch-balatonigus VorQn Ch.annularius AF192189 Ch.bern&ns'rs Tol Ch.commutatus Sa2 Ch.helerodentatus AF192199 Ch-acutiventris AF19 2200 Ch.maturus DQ548204 Ch.whítselj DQ648208 Ch.luridus AF192203 Ch.pseudothummlAF! 92205 Ch.dorsalksAF 192206 Ch.thumml píger AF1922Q2 Baeotendipes sp. OQ&48199 Baeotendípes noctivaga Кз<я> DrosophHa angor DQ471570

группа plumosus

цитокомплекс thummi

группаlacunarius

группа obtusidens цитокомплекс thummi цитокомплекс maturus

цитокомплекс thummi

цитокомплекс pseudotummí

Рис. 8. ДНК-дендрограмма родственных связей Chironomus, построенная по гену

COI

Сиквенсы гена COI подчеркнутых таксонов получены автором лично. Арабскими цифрами обозначены значения бутстреп-поддержки в узлах дендрограммы, римскими -кластеры видов, квадратными скобками обозначены группы видов и цитокомплексы.

Полученные данные в целом свидетельствуют о наличии положительной корреляции между эволюционными ветвями ДНК-последовательности COI и такими несистематическими единицами, как цитологические комплексы (рис. 8), что подтверждает возможность использования COI для реконструкции филогении и уточнения систематики в таксономических группах с высоким видовым разнообразием. Цитокомплекс thummi, по-видимому, является базовым для всех других цитокомплексов. Виды thummi-комплекса встречаются во всех эволюционных линиях рассматриваемой дендрограммы.

Виды-двойники группы plumosus и близкородственные виды - СИ. curabilis и Ch. nuditarsis на дендрограмме имеют общую эволюционную

линию. Полученные результаты позволяют рассматривать группу plumosus в более широком понимании с включением в ее состав не только морфологических видов-двойников, но и близких по цитогенетическим и молекулярно-генетическим показателям видов.

Таким образом, генетические дистанции, рассчитанные с использованием ДНК-последователыюсти СО!, позволяют проводить ревизию существующих нетаксономических группировок видов в пределах рода, выделяемых по признакам кариотипа или морфологии.

Выводы:

1. Впервые установлена последовательность нуклеотидов 5'-концевого фрагмента гена COI протяженностью с 100 по 634 п.и. у 14 видов комаров-звонцов: Baeotendipes noctivaga, Glypiotendipes imbecillis, Glyptotendipes glaucas, Glyptotendipes gripekoveni, Glyptotendipes mancunianum, Xenochironomus xenolabis, Chironomus curabilis, Chironomus usenicus, Endochironomus tendens, Endochironomus albipennis, Synendotendipes kaluginae, Polypedilum sordens, Stenochironomus gibbus, Cricotopus glacialis.

2. Выявлены особенности эволюционной изменчивости 5'-концевого фрагмента гена СОI в подсемействе Chironominae. Показано, что в 97% вариабельных нуклеотидиых сайтов этого гена наблюдаются эволюционно нейтральные замены. Установлено, что уровень аминокислотной изменчивости лучше нуклеотидной отображает молекулярные границы рода, грибы и подсемейства.

3. Реконструирована схема эволюции нуклеотидной и аминокислотной последовательностей первой субъединицы цитохром С оксидазы комаров-звонцов подсемейства Chironominae. Показано существование четырех эволюционных линий гена COI, соответствующих трибам Tanytarsini (=Tanytarsini), Pseudochironomini (=Pseudochironomini - Riethia + Endochironomus+Synendotendipes+Polypedilum+Sergentia) и Chironomini (=Chironomini - Stenochironomus-Endochironomus-Synendotendipes-Sergentia -Polypedilum+Riethia). Четвертая линия, соответствующая Stenochironomus, значительно обособлена от трех остальных и возможно представляет собой линию отдельного подсемейства.

4. Дана оценка информативности филогенетического сигнала, полученного при использовании нуклеотидной и аминокислотной последовательностей первой субъединицы цитохром С оксидазы у Chironominae. Показано, что использование аминокислотной последовательности позволяет точнее нуклеотидной дифференцировать друг от друга виды разных родов и определять положение таксонов надродового уровня.

5. На основе анализа эволюционной изменчивости аминокислотной последовательности, кодируемой геном COI, дана датировка эволюционных событий и получена хронограмма подсемейства Chironominae. Показано, что дивергенция Stenochironomus gibbus происходила вместе с предковой формой

Chironominae и Orthocladiinae приблизительно 135 млн. л.н. в начале мелового периода; время дивергенции трибы Tanytarsini от Chironomini и Pseudochironomini составляет около 85 млн. л.н., а грибы Chironomini от Pseudochironomini - около 66 млн. л.н.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Демин А.Г., Полуконова Н.В. Изученность нуклеотидных последовательностей ядерных и митохондриальных генов хирономид (Chironomidae, Diptera) и основные подходы их использования в эволюционном анализе // сб. науч. тр. XXI Любищевских чтений «Современные проблемы эволюции». Ульяновск: Ульяновский гос. пед. ун. 2007. С. 157-168.

2. Полуконова Н.В., Ермохин М.В., Воронин М.Ю., Демин А.Г., Катаева И.В., Фёдорова И.А., Козлов М.С. Биологический мониторинг водных экосистем на основе анализа сообществ, популяций, кариотипа и мтДНК хирономид (Chironomidae, Diptera) // Изв. Сарат. ун-та. Сер. биол. 2007. С. 71-78.

3. Полуконова Н.В., Демин А.Г., Катаева И.В., Федорова И.А. Анализ сообществ, популяций и генома хирономид (Diptera) в биомониторинге гидроэкосистем // Тез. 9-й конф. (сессии стендовых сообщений) «Водные экосистемы, организмы, инновации». МГУ, 26 октября 2007. М.: МГУ. 2007. С. 43.

4. Демин А.Г., Полуконова Н.В. Изменчивость митохондриального гена СОХ I у европейских видов Chironomus и Camptochironomus (Chironomidae, Diptera) // Тез. XHI Междунар. шк.-конф. молодых учёных «Биология внутренних вод». Ин-т. биол. внутр. вод РАН, 23-26 октября 2007 г. Борок. 2007. С. 57.

5. Демин А.Г., Полуконова Н.В. Изменчивость митохондриального гена СОХ i у европейских видов Chironomus и Camptochironomus (Chironomidae, Diptera) // сб. науч. тр. XIII Междунар. шк.-конф. молодых учёных «Биология внутренних вод». (Ин-т. биол. внутр. вод РАН, 23-26 октября 2007 г.). Борок. С. 64-69.

6. Полуконова Н.В., Мюге Н.С., Демин А.Г., Воронин М.Ю. Сравнение морфологических и цитогенетических методов с молекулярно-генетическими при построении филогении комаров-звонцов (Chironomidae, Diptera) Il Проблемы и перспективы общей энтомологии. Тез. докладов XIII съезда Рус. энтомол. о-ва. Краснодар, 9-15 сентября 2007 г. Краснодар.: АРС. 2007. С. 107.

7. Демин А.Г. Популяционная и межвидовая изменчивость вариабельных локусов ядерного гена globin 2b у Chironomus и Camptochironomus (Chironomidae, Diptera) // Тезисы Междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва, 11-14 апреля 2007 г. М.: МГУ. 2007. С. 42.

8. Демин А.Г., Полуконова Н.В. Новые данные по молекулярной филогении комаров-звонцов (Chironomidae, Nematocera) подсемейства Chironominae на основе генов мтДНК II Ставрополь.: АГРУС. 2008. С. 248253.

9. Демин А.Г., Полуконова Н.В. Оценка времени дивергенции комаров-звонцов рода Chironomus (Díptera) на основе гипотезы «молекулярных часов» // Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье: сб. науч. тр. Саратов: изд-во Сарат. ун-та. 2008. №7. С. 8-13.

10. Полуконова Н.В., Демин А.Г., Шайкевич Е.В., Мюге Н.С. Сравнение Chironomus usenicus и Ch. curabilis с видами группы plumosus (Díptera) по гену митохондриалъной днк СО! и рисунку дисков политенных хромосом // Генетика. 2009. Т. 45, №8. С. 1-7. Polukonova N.V., Djomin A.G., Mugue N.S., Shaikevich E.V. Comparison of Chironomus usenicus and Chironomus curabilis with Species of the Group plumosus (Díptera) Inferred from the Mitochondrial DNA Gene COI and Polytene Chromosomes Banding Pattem H Russian tournai of Genetics. 2009. Vol. 45, № 8. P. 899-905.

И. Демина И.В., Ермохин М.В., Демин А.Г. Имагоуловитель для количественного вылета гетеротонных насекомых на границе «земля-воздух» в стоячих водоемах // Поволж. экол. журн. 2009. №1. С. 65 - 68.

12. Демнн А.Г. Новые данные о молекулярной филогении комаров-звонцов (Chironomidae, Nematocera) // Материалы ежегод. науч. конф. студентов и аспирантов СГУ. Изд-во Сарат. ун-та. 2009. С. 13 - 14.

13. Полуконова Н.В., Демина И.В., Демин А.Г., Кармоков М.Х., Федорова И.А. Возможности и перспективы использования комаров-звонцов (Chironomidae, Diptera) при комплексном подходе в биологическом мониторинге водных экосистем и токсикологических исследования // Материалы IV всероссийского симпозиума по амфибиотическим насекомым и X трихоптерологического симпозиума «Проблемы водной энтомологии России и сопредельных государств». Владикавказ.: СОГУ. 2010. С. 69-73.

14. Полуконова Н.В., Демин А.Г. Результаты комплексного анализа видов Chironomus группы obtusidens (Diptera, Nematocera) на основе морфологии, кариотипа и молекулярно-генетических данных. Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье: Сб. науч. тр. Саратов.: Изд-во Сарат. ун-та. №8. 2010. С. 8-13.

15. Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Демин А.Г. Направленная эволюция личинок хирономид (Diptera) на основе анализа политенных хромосом и частичной аминокислотной последовательности первой субъединицы цитохром С оксидазы (СО!) // Тез. V междунар. науч. конф. по кариосистематике беспозвоночных животных «Karyo V». Новосибирск, 16-20 августа 2010 г. Новосибирск. 2010. С. 42.

16. Демин А.Г., Полуконова Н.В., Мюге Н.С. Молекулярная филогения комаров-звонцов подсемейства Chironominae по данным анализа цитохром С оксидазы 1 (СО!) И Биология внутренних вод: тез. докладов XIV

Шк.-конф. молодых ученых (Ин-т. биол. внутр. вод РАН, 26-30 октября 2010 г.). Борок. 2010. С. 18.

17. Полуконова Н.В., Демин А.Г. Систематика комаров-звонцов подсемейства Chironominae (Diptera) в свете данных об эволюции их аминокислотной последовательности первой субъединицы цитохром С оксидазы (COI) II Материалы Междунар. науч. конф. «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке». Санкт-Петербург, 16-20 мая 2011 г. Санкт-Петербург. 2011. С. 130.

18. Демин А.Г., Полуконова Н.В., Мюге Н.С. Молекулярная филогения и время дивергенции комаров-звонцов (Chironomidae, Nematocera, Diptera) на основе частичной последовательности гена первой субъединицы цитохром с оксидазы (COI) // Генетика. 2011. Т.47, №10. С. 31-43. Demin A.G., Polukonova N.V., Mugue N.S. Molecular Phylogeny and the Time of Divergence of Minges (Chironomidae, Nematocera, Diptera) Inferred from a Partial Nucleotide Sequence of the Cytochrome Oxidase 1 Gene (COI) II Russian Journal of Genetics. 2011, Vol. 47, № 10. P. 1168-1180.

Автореферат Демина Александра Геннадьевича «АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГЕНА COI И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ФИЛОГЕНИИ И СИСТЕМАТИКИ ТАКСОНОВ С ВЫСОКИМ ВИДОВЫМ РАЗНООБРАЗИЕМ НА ПРИМЕРЕ КОМАРОВ-ЗВОНЦОВ ПОДСЕМЕЙСТВА CHIRONOMINAE (CHIRONOMIDAE, DIPTERA)»

Подписано к печати 23.05.11. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура «Тайме». Усл.печ. л. 1,16 (1,25). Тираж 100. Заказ № 2653.

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Техно-Декор» 410012, г. Саратов, ул. Московская 160.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Демин, Александр Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ГЕН мтДНК ЦИТОХРОМ С ОКСИДАЗА 1 (COI) В СОВРЕМЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ СИСТЕМАТИКИ И ФИЛОГЕНИИ НАСЕКОМЫХ

1.1. Применение гена COI мтДНК в молекулярно-генетических исследованиях насекомых

1.2. История и современные представления о систематике и филогении комаров-звонцов подсемейства Chironominae (Chironomidae, Díptera)

1.3. Использование молекулярно-генетических данных в филогении и систематике Chironominae

1.4. Применение гипотезы молекулярных часов для расчета времени дивергенции

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материал

2.2. Методы исследования

2.2.1. Сбор и определение хирономид

2.2.2. Цитогенетический анализ

2.2.3. Молекулярно-генетический анализ

Глава 3. НУКЛЕОТИДНАЯ И АМИНОКИСЛОТНАЯ

КОМПОЗИЦИЯ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПЕРВОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ ЦИТОХРОМ С ОКСИДАЗЫ КОМАРОВ-ЗВОНЦОВ ПОДСЕМЕЙСТВА CHIRONOMINAE

3.1. Нуклеотидная и аминокислотная композиция первой субъединицы цитохром С оксидазы

3.2. Уровень нуклеотидной и аминокислотной изменчивости в подсемействе Chironominae

Глава 4. ЭВОШОЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА COI КОМАРОВ-ЗВОНЦОВ ПОДСЕМЕЙСТВА

CHIRONOMINAE

4.1. Реконструкция схем эволюции последовательности нуклеотидов гена COI

4.1.1. Транзиции и трансверсии во всех положениях кодона

4.1.2. Транзиции и трансверсии в первом и втором положениях кодона

4.1.3. Транзиции в первом положении кодона

4.1.4. Транзиции и трансверсии во втором положении кодона

4.1.5. Несинонимичные замены

4.1.6. Трансверсии в первом положении, трансверсии в первом и втором положениях кодона

4.2. Эволюционные линии гена COI

4.3. Эволюционно значимые структурные изменения гена

COI у комаров-звонцов подсемейства Chironominae

Глава 5. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ И ВРЕМЯ ДИВЕРГЕНЦИИ КОМАРОВ-ЗВОНЦОВ ПОДСЕМЕЙСТВА CHIRONOMINAE

5.1. Реконструкции, основанные на аминокислотной последовательности, кодируемой 5'-концевым фрагментом гена COI

5.2. Эволюционная история триб подсемейства на основе молекулярных данных

5.2.1. Положение Chironominae и Stenochironomus в семействе Chironomidae

5.2.2. Положение триб в подсемействе Chironominae

5.2.3. Структура трибы Chironomini и оценка времени дивергенции родов

5.2.4. Структура трибы Tanytarsini и оценка времени дивергенции родов

5.3. Применение ДНК-последовательности гена COI для анализа таксонов родового уровня с высоким видовым разнообразием, на примере Chironomus

5.3.1. Нуклеотидная композиция гена COI в роде Chironomus

5.3.2. Уровень нуклеотидной изменчивости между представителями разных видовых группировок

5.3.3. Реконструкция родственных связей видов из группировок несистематического ранга

5.3.4. Филогенетические отношения видов Chironomus в группе plumosus

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ эволюционной изменчивости гена COI и его использование для филогении и систематики таксонов с высоким видовым разнообразием на примере комаров-звонцов подсемейства Chironominae"

Актуальность проблемы. Подсемейство Chironominae (Chironomidae, Díptera) представляет обширную группу комаров-звонцов, распространенных повсеместно, за исключением Антарктиды (Макарченко, Макарченко, 2006). Оно представлено тремя трибами — Chironomini (не менее 69 родов), Tanytarsini (не менее 16 родов) и Pseudochironomini (не менее 5 родов) (Панкратова, 1983; Wiedercholm, 1983, 1986, 1989; Coffinan, Ferrington, 1996; Ssether, 2000; Макарченко, Макарченко, 2006; Cranston, Martin, 2007). Несмотря на ' многолетние исследования комаров-звонцов подсемейства Chironominae, ряд вопросов их систематики и эволюции до сих пор остается1 нерешенным. Это обусловлено высоким видовым разнообразием, различной степенью морфологической дифференциации родов, отсутствием кариотипических данных для видов многих родов, а также сложностью видовой идентификации большинства представителей Chironominae. До сих пор нет единой филогенетической схемы эволюционных связей триб подсемейства.

Наиболее перспективным решением проблем систематики, и эволюции насекомых представляется использование молекулярных филогенетических маркеров. Чаще всего для этих целей используются ДНК-последовательности высоко консервативных ядерных генов - 18S pDNA, EF-la, CAD и др., которые у комаров-звонцов известны только для единичных родов.

Первая попытка установления эволюционных связей нуклеотидных последовательностей генов COI и цитохром b (Cytb) мтДНК комаров-звонцов

Chironomus и Kiefferulus, Sergentia, Polypedilum, Axarus принадлежала

Гурьеву (2002). Однако из-за малого количества использованных им родов

5 из 90 в подсемействе, полученная филогенетическая схема' не могла объективно отразить родственные связи. Кроме того, положение 21 вида 9 родов трибы Chironomini отражено в построениях, основанных на нуклеотидной последовательности межгенных спейсерных участков ITS-1 и 4

ITS-2 рДНК (Sharma, 2007). Схема, построенная с использованием нуклеотидной последовательности гена COI и содержащая представителей ряда родов трибы Tanytarsini, получена Экремом с соавторами (Ekrem et al., 2007). Однако данную схему нельзя было использовать для анализа филогении родов, так как в задачи авторов входило только описание связей между популяциями видов. Позднее Экремом с соавторами (Ekrem et al., 2010) была получена схема, демонстрирующая эволюционные связи видов пяти родов трибы Tanytarsini, основанная на использовании двух ядерных генов FE -la и CAD и генов мтДНК - COI, СОЛ, 16S. Другие работы касались анализа внутриродовых отношений (Макаревич и др., 2000; Guryev et al., 2001; Papoucheva et al., 2003; Pfenninger et al., 2007).

К данному моменту большие массивы информации накоплены по последовательности фрагмента 5'-концевой области гена мтДНК цитохром С оксидазы I (COI): Начиная с 2004 года, этот фрагмент гена COI широко применяется для штрихкодирования (Ratnasingham, Hebert, 2007), к настоящему моменту удалось установить его последовательность более чем у 300 видов Ghironominae (www.boldsystems.org). ДНК-последовательность данного гена обычно применяется для анализа родственных связей между популяциями и видами, но редко используется при исследованиях таксонов более высокого систематического ранга. Возможность и эффективность применения гена СО/для реконструкции филогенетических связей родов и триб в группах насекомых с высоким видовым разнообразием, таких как подсемейство Chironoiminae, до сих пор остается дискуссионной (Cranston et al., 2010; Ekrem, et al., 2010>

Цель работы — изучение эволюционной изменчивости гена COI у видов комаров-звонцов из наиболее распространенных родов подсемейства Chironominae (Chironomidae, Díptera), а также установление возможностей его использования для уточнения филогении таксонов надродового уровня.

Были поставлены следующие задачи:

1. Установить ранее неописанные последовательности нуклеотидов 5-концевого фрагмента гена COI у широко распространенных видов комаров-звонцов из родов Baeotendipes, Glyptotendipes, Xenochironomus, Endochironomus, Chironomus, Synendotendipes, Polypedilum, Stenochironomus, Cricotopus.

2. Выявить особенности эволюционной изменчивости 5'-концевого фрагмента гена COI в подсемействе Chironominae и определить границы его вариабельности у вида, рода, трибы и подсемейства.,

4. Оценить информативность филогенетического сигнала, полученного при использовании 5-концевого фрагмента гена COI, с учетом уже существующих схем по другим генам, а также данных цитогенетики и морфологии рассматриваемых представителей Chironominae. Проанализировать возможность использования гена COI для датировки времени дивергенции основных эволюционных линий подсемейства.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые установлена нуклеотидная последовательность 5'-концевого фрагмента гена COI протяженностью с 100 по 634 п.н. (всего 535 п.н.) у 14-ти видов: Baeotendipes noctivaga (JN016823-JN016825), Glyptotendipes imbecillis (JNO16845), Glyptotendipes glaucus (JN016837), Glyptotendipes gripekoveni (JNO16844), Glyptotendipes mancunianum (JNO16842), Xenochironomus xenolabis (JN016835," JN016836), Chironomus curabilis (JN016810, JN016811), Chironomus usenicus (JNO16806-JN016809), Endochironomus tendens (JNO16838, JN016839), Endochironomus albipennis (JN016840), Synendotendipes kaluginae (JNO16841), Polypedilum sordens (JNO16847), Stenochironomus gibbus

JNO16848), Cricotopus glacialis (JN016846). i

Впервые реконструирована схема эволюции нуклеотидной последовательности гена COI комаров-звонцов подсемейства Chironominae. Показано слабое влияние отбора на характер замещения нукпеотидов в гене COI у Chironominae, что позволяет рассматривать аминокислотную последовательность, кодируемую этим геном, в качестве филогенетического маркера при исследовании родственных связей таксонов, начиная с родового уровня. Определены границы изменчивости COI у разных таксономических единиц комаров-звонцов подсемейства Chironominae — вида, рода, трибы, и подсемейства.

1 Впервые проведена молекулярная датировка основных эволюционных событий в подсемействе Chironominae.

Научно-практическая значимость. Представлена возможность использования штрихкодового гена мтДНК - COI в макросистематике таксонов с высоким видовым разнообразием.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на

Международной научной конференции «Ломоносов», 2007; ХШ съезде

Русского энтомологического общества, 2007; IX конференции «Водные экосистемы, организмы, инновации — 9», 2007; ХШ Международной школеконференции молодых учёных «Биология внутренних вод», 2007; 68 научнопрактической конференции студентов и молодых ученых Саратовского государственного медицинского университета «Молодые ученые — здравоохранению региона», 2007; XXI Любищевских чтениях «Современные проблемы эволюции», 2007; ежегодных научных конференциях студентов и 7 аспирантов Саратовского государственного университета, 2007 и 2008; Международной научной конференции «Хромосома 2009», 2009; XIV школе-конференции молодых учёных «Биология внутренних вод», 2010; V Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «КАКУО V», 2010; IV всероссийском симпозиуме по амфибиотическим насекомым «Проблемы водной энтомологии России и сопредельных государств» СОГУ, 2010; Международной научной конференции «Фундаментальные проблемы энтомологии в XXI веке», 2011. г

Декларация личного участия автора. В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором, а также совместно с Н.С. Мюге (лаборатория экспериментальной эмбриологии ИБР РАН). Секвенирование проводилось совместно с Н.С. Мюге. Полученные результаты обсуждались автором совместно с научным руководителем, а так же с Е.В. Шайкевич (лаборатория сравнительной генетики животных, ИОГЕН РАН) и Н.С. Мюге. Суммарное личное участие автора составило 80%.

Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы и приложения. Работа изложена на 137 страницах, включает 24 рисунока и 17 таблиц, список цитируемой литературы включает 160 ссылок, из которых 100 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Демин, Александр Геннадьевич

выводы

1. Впервые установлена последовательность нуклеотидов 5'-концевого фрагмента гена COI протяженностью с 100 по 634 п.н. у 14 видов комаров-звонцов: Baeotendipes noctivaga, Glyptotendipes imbecillis, Glyptotendipes glaucus, Glyptotendipes gripekoveni, Glyptotendipes mancunianum, Xenochironomus xenolabis, Chironomus curabilis, Chironomus usenicus, Endochironomus tendens, Endochironomus albipennis, Synendotendipes kaluginae, Polypedilum sordens, Stenochironomus gibbus, Cricotopus glacialis.

2. Выявлены особенности эволюционной изменчивости 5-концевого фрагмента гена COI в подсемействе Chironominae. Показано, что в 97% вариабельных нуклеотидных сайтов этого гена наблюдаются эволюционно нейтральные замены. Установлено, что уровень аминокислотной изменчивости лучше нуклеотидной отображает молекулярные границы рода, трибы и подсемейства.

3. Реконструирована схема эволюции нуклеотидной и аминокислотной последовательностей первой субъединицы цитохром С оксидазы комаров-звонцов подсемейства Chironominae. Показано существование четырех эволюционных линий гена COI, соответствующих трибам Tanytarsini (=Tanytarsini), Pseudochironomini (=Pseudochironomini - Riethia + Endochironomus+Synendotendipes+Polypedilum+Sergentia) и Chironomini (—СЫтопоттт-Stenochironomus—Endochironomus-Synendotendipes-Sergentia -Polypedilum+Riethiá). Четвертая линия, соответствующая Stenochironomus, значительно обособлена от трех остальных и возможно представляет собой линию отдельного подсемейства.

Chironominae. Показано, что использование аминокислотной последовательности позволяет точнее нуклеотидной дифференцировать друг

119 от друга виды разных родов и определять положение таксонов надродового уровня.

5. На основе анализа эволюционной изменчивости аминокислотной последовательности, кодируемой геном СО/, дана датировка эволюционных событий и получена хронограмма подсемейства Chironominae. Показано, что дивергенция Stenochironomus gibbus происходила вместе с предковой формой Chironominae и Orthocladiinae приблизительно 135 млн. л.н. в начале мелового периода; время дивергенции трибы Tanytarsini от Chironomini и Pseudochironomini составляет около 85 млн. л.н., а трибы Chironomini от Pseudochironomini - около 66 млн. л.н.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск приемлемых молекулярных филогенетических маркеров для реконструкции эволюционной истории в таксонах насекомых высокого систематического ранга (подсемейства, трибы) представляется актуальным вопросом их современной таксономии (Cranston et al., 2010). Проблемой, препятствующей развитию данного направления, служит высокое видовое разнообразие насекомых. Так, в состав подсемейств комаров-звонов обычно входит от нескольких сотен до нескольких тысяч видов, многие из которых имеют спорное таксономическое положение. В то время, как структура большинства ядерных генов, традиционно используемых в макросистематике насекомых, пока установлена лишь для очень немногих видов. На данный момент, у комаров-звонцов структура наиболее часто используемого в ДНК-систематике ядерного гена J8S рДНК установлена лишь для 1% видов (www.ncbi.nlm.nih.gov). Этого недостаточно для проведения полноценной ч молекулярной реконструкции и построения схем, адекватной отображающих эволюцию комаров-звонцов.

Наиболее перспективным для реконструкции родственных связей представляется использование в качестве маркера гена COI. В настоящее время в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) содержатся сведения о 2826571 нуклеотидных последовательностях различных генов и некодирующих областей ДНК, принадлежащих 2121757 видам насекомых. Из них, на долю гена COI приходится 451564 последовательности (1/4 от общего числа), установленные для 439808 видов. Возросший в последнее время интерес к изучению этого гена связан не только с уникальными особенностями его наследования и эволюции (Huang et al., 2008), но и с началом реализации проекта «Barcoding Of Life» (Ratnasingham, Hebert, 2007), предполагающего ДНК-штрихкодирование всех живых организмов на основе последовательности гена COI.

Основной проблемой при использовании гена COI в макросистематике является высокая вариабельность его нуклеотидной последовательности, затрудняющая анализ родственных связей эволюционно удаленных таксонов. Кроме, того относительно небольшой размер обычно устанавливаемой нуклеотидной последовательности гена COI — (500 — 650 п.о.) отрицательно сказывается при реконструкции родственных связей большого количества , эволюционно близких таксонов, так как повышается вероятность их ошибочного сближения. Тем не менее, использование гена COI могло бы i «с ' позволить уже сегодня получить предварительные схемы молекулярной: эволюции большинства проблемных в таксономическом отношении групп насекомых. Поиск способов , применения гена COI для реконструкции филогении таксонов с высоким, видовым разнообразием представляется нам одной из наиболее важных задач как молекулярно-генетической макросистематики в целом, так и в частности систематики комаров-звонцов подсемейства Chironominae.

В нашем исследовании было показано, что существенно увеличить , информативность получаемого филогенетического сигнала, получаемого при использовании в реконструкции эволюционной истории ряда родов подсемейства Chironominae маркера COI позволяет транслирование его нуклеотидной последовательности в аминокислотную. Полученный нами сигнал сопоставим по информативности с сигналом, получаемым на основе последовательности ядерного гена CAD, что подтверждает обоснованность использования аминокислотной последовательности, кодируемой геном COI при филогенетическом анализе надродового уровня.

На основе проведенных реконструкций, нами предложены уточнения в существующую систематику подсемейства Chironominae. Подсемейство Chironominae делится на три трибы: Tanytarsini (= Tanytarsini), Pseudochironomini (= Pseudochironomini, за исключением Riethia, + Endochironomus, Synendotendipes, Polypedilum, Sergentia) и Chironomini (=

Chironomini, за исключением Stenochîronomus, Endochironomus, Synendotendipes, Polypedilum, Sergentia + Riethia).

В состав трибы Tanytarsini входят представители родов: Tanytarsus, Cladotanytarsus, Paratanytarsus, Micropsectra (парафилетический род), Virgotanytarsus, Reotanytarsus, Parapsectra (полифилетический род); а также Stempellinella.

В состав трибы Pseudochironomini входят рода: Pseudochironomus, Endochironomus, Synendotendipes, Polypedilum, Sergentia и Stictochironomus.

В состав трибы Chironomini входят рода: Chironomus, Einfeldia, Camptochironomus, Benthalia, Baeotendipes, Cryptochironomus, Axarus, Glyptotendipes, Kiefferulus, Goeldichironomus, Lipiniella, Microchironomus, Cladopelma, Xenochironomus, Dicrotendipes и Riethia. Следует отметить, что по молекулярно-генетическим данным, согласующимся также и с данными других авторов (Шилова, Шобанов, 1996; Шобанов и др., 1996; Полуконова, 2005; Martin, 2010) по морфологии и цитогенетическим признакам, в составе данной трибы можно выделить группу близких родов, претендующих на N статус подтрибы: Chironomus, Einfeldia, Camptochironomus, Benthalia, Baeotendipes.

По молекулярно-генетическим данным Stenochironomus выходит не только за пределы трибы Chironomini, но и подсемейства Chironominae.

В свете полученных нами данных о времени дивергенции рода Chironomus повсеместное распространение его видов не согласуется с У принятой «Викариантной» моделью их расселения (Hooker, 1860; Brundin, 1966).

Низкий уровень нуклеотидных различий между близкородственными видами в сравнении с видами-двойниками может указывать на разные пути видообразования в группах таких видов, что в целом согласуется с высказанным ранее мнении об аллопатрическом видообразовании близкородственных видов и симпатрическом - видов-двойников (Полуконова, 2005).

Проведенные нами исследования подтвердили потенциальную возможность использования аминокислотной последовательности первой субъединицы цитохром С оксидазы для установлении времени дивергенции таксонов надродового уровня. Полученные датировки хорошо согласуются как с палеонтологическими данными, так и с данными основанными на использовании нуклеотидной последовательности высококонсервативных ядерных генов. Так, на полученной нами с использованием аминокислотной последовательности, кодируемой геном СОР, хронограмме представители Chironominae и Ortocladiinae образуют хорошо обособленные эволюционные линии. Время их обособления составляет приблизительно 104 млн. л.н., что соответствует концу раннего мела. Такие данные согласуются с палеонтологическими свидетельствами о появлении Chironominae в позднемеловых отложениях (Калугина, Жерихин, 1975), а так же с датировками Кренстона и коллег (Cranston et al., 2010), основанными на анализе трех ядерных генов (I8S, 28S, CAD) и гена COI.

Разделение представителей эволюционных линий Chironomini и Pseudochironomini произошло по нашим данным примерно 66 млн.л.н. Такие данные согласуются с проведенной Кренстоном и коллегами (Cranston et al., 2010) оценкой времени дивергенции двух видов комаров-звонцов, представляющих эти линий — Polypedilum prasiogaster и Riethia sp., составляющей приблизительно 62 млн. л.н.

Таким образом, использование гена COI позволяет приблизиться к решению целого комплекса вопросов систематики и филогении таксонов с высоким видовым разнообразием таких, например, как разработка более совершенной систематики, установление молекулярных границ нетаксономических групп видов, родов и триб, а так же поиск предковых эволюционных линий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демин, Александр Геннадьевич, Саратов

1. Абрамсон Н.И. Молекулярные маркеры, филогения и поиск критерия разграничения видов // Труды Зоологического института РАН. Приложение № 1.2009. С. 185-198.

2. Абрамсон Н.И. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы // Вестник ВОГиС. 2007. Т. 11, № 2. С. 307-331.

3. Анбиндер Е.М. Кариология и эволюция ластоногих. М.: Наука, 1980. 152 с.

4. Банникова А.А. Молекулярные маркеры и современная^ филогенетика млекопитющих // Журнал общей»биологии. 2004. Т. 65, № 4. С. 278-305.

5. Белянина С.И. Кариотипический анализ хирономид (Chironomidae, Díptera) фауны СССР: Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1983. 39 с. •

6. Белянина С.И., Сигарева Л.Е., Логинова (Полуконова) Н.В. Новый вид рода Chironomus Meig. (Díptera, Chironomidae) Chironomus curabilis sp. n. // Зоол. журн. 1990. Т. 69, № 5. С. 60-70.

7. Гундерина Л.И., Кикнадзе И.И. Дивергенция кариофондов видов-двойников группы plumosus (Díptera, Chironomidae) // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 339-347.

8. Гундерина Л.И., Кикнадзе И.И., Истомина А.Г., Батлер М. Географическая дифференциация геномной ДНК Chironomus plumosus (Díptera^ Chironomidae) в природных популяциях Голаркгики // Генетика. 2009. Т. 45, № 1. С. 64-72.

9. Гурьев В.П. Молекулярная филогения рода Chironomus (Díptera, Nematocera): Автореф. дис. канд. биол. наук. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 2002. 17 с.

10. Гурьев В.П., Блинов А.Г. Филогенетические взаимоотношения голарктических популяций Chironomus entis и Chironomus plumosus с учетом возможной горизонтальной передачи митохондриальных генов // Генетика. 2002. Т. 38, №3. С. 310-315.

11. Демина И.В., Ермохин М.В., Демин А.Г. Имагоуловитель для количественного вылета гетеротопных насекомых на границе «земля-воздух» в стоячих водоемах // Поволжский экологический журнал. 2009. № 1. С. 6568.

12. Дурнова H.A. Цитогенетические особенности Stenochironomus gibbus F. (Diptera, Chironomidae) // Цитология. 2010. Т. 52, № 7. С. 76-80.

13. Дурнова H.A., Демин А.Г., Полуконова Н.В., Мюге Н.С. Время возникновения фитофилии у хирономид подсемейств Chironominae и Orthocladiinae: молекулярный анализ (COI, COII) // Энтомологическое обозрение. 2011., в печати.

14. Еськов К.Ю. О макробиогеографических закономерностях филогенеза Экосистемные перестройки и эволюция биосферы. М.: Недра, 1994. С. 199-205.

15. Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура. Новосибирск.: Наука, 1992. 479 с.

16. Зорина О.В. Фауна, систематика и распространение комаров-звонцовтрибы Chironomini (Díptera, Chironomidae) юга российского Дальнего Востока: Автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток.: БПИ ДВО, 2002. 23 с.

17. Ильяшук Е.А., Ильяшук Б.П. Реконструкция исторического прошлого по палеокомплексам хирономид из донных отложений // Антропогенные модификации экосистемы озера Имандра / Под ред. Т.И1 Моисеенко. М.: Наука, 2002. С. 257-283.

18. Еськов К.Ю. О макробиогеографических закономерностях филогенеза Экосистемные перестройки и эволюция биосферы. М.: Недра, 1994. С. 199-205.

19. Калугина Н.С. О некоторых возрастных изменениях в строении и биологии личинок хирономид (Díptera, Chironomidae) // Тр. ВГБО. 1959. Т. 9. С. 85-107.

20. Калугина Н.С. Сравнение фауны хирономид (Díptera, Chironomidae) трех прудов с разной степенью загрязненности бытовыми стоками // Докл. Моск. об-ва испыт. природы. 1971. С. 39-40.

21. Калугина Н.С., Жерихин В.В. Изменения лимнофауны насекомых в мезозое и кайнозое и их экологическая интерпретация // История озер позднего палеозоя и раннего мезозоя: Тез. докл. IV Всес. симпозиума по истории озер. JL: СПГУ, 1975. С. 55-61.

22. Кикнадзе И.И. Функциональная организация хромосом. JT.: Изд. Наука, 1972.211 с.

23. Кикнадзе И.И., Блинов А.Г., Колесников H.H. Молекулярно-цитологическая организация генома хирономид // Структурно-функциональная организация генома / Ред. В.К. Шумный. Новосибирск.: Наука, 1989. С. 4-58.

24. Кикнадзе И.И., Голыпша В.В., Истомина А.Г., Гундерина Л.И. Закономерности хромосомного полиморфизма при дивергенции популяций и видов у хирономид (Chironomidae, Díptera) // Сибирский экологический журн. 2004. Т. 11, № 5. С. 635-651.

25. Кикнадзе И.И., Голыгина И.И., Истомина А.Г. К вопросу о картировании» хромосомных плеч С и D у комара-звонца Chironomus balatonicus Н Цитология. 1996. Т. 38, № 7. С. 674-679.

26. Кикнадзе И.И., Гундерина Л.И., Батлер М.Дж., Вюлкер В.Г., Мартин Дж. Хромосомы и континенты // Вестник ВОГиС, 2007. Том 11, № 2. С. 332-352.

27. Кикнадзе И.И., Истомина А.Г., Гундерина Л.И. и др. Кариофонды хирономид криолитозоны Якутии: Триба Chironomini // Новосибирск.: Наука. Сибирская издательская фирма РАН, 1996. 166 с.

28. Кикнадзе И.И., Шилова А.И., Керкис И.Е. и др. Кариотипы и морфология личинок трибы Chironomini. Атлас. Новосибирск: Наука, 1991. 113 с.

29. Киселев Л.Л., Свердлов Е.Д., Карпов В.Л. К пятидесятилетию' открытия структуры ДНК // Вестник Российской Академии Наук. 2003. Т. 73, №6. С. 496-513.

30. Логинова Н.В. (Полуконова), Белянина С.И. Новый вид Chironomus из группы plumosus Chironomus usenicus, sp. п. // Зоол. журн. 1994. Т. 73, № 11. С. 93-105.

31. Макаревич И.Ф., Березиков E.Bî, Гурьев В.П., Блинов А.Г. Молекулярная филогения рода Chironomus, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей-двух ядерных генов, ssplóO и глобина 2Ъ II Молекулярная биология. 2000. Т. 34, № 4. С. 701-707.

32. Макарченко Е.А. Личинки хирономид (Diptera, Chironomidae) водоемов Чукотского полуострова // Пресноводная фауна Чукотского полуострова. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1976. С. 57-63.

33. Макарченко Е.А., Макарченко М.А. Хирономиды. // Определитель насекомых Дальнего Востока России. — Т. 6. Двукрылые и блохи. Ч. 4 / Под общ. ред. П. А. Лера. Владивосток: Дальнаука, 2006. 936 с.

34. Макарченко Е.А., Макарченко М.А. Хирономиды. // Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий. — Т.4. — Высшие насекомые. Двукрылые / Под ред. С .Я. Цалолихина. СПб.: Изд. зоол. инст., 1999. С. 210-295, 670-857.

35. Мейен C.B. Основы палеоботаники. М.: Недра, 1987.403 с.

36. Мотыль Chironomus plumosus (Diptera, Chironomidae) / Под ред. Н.Ю. Соколовой. M.: Наука, 1983. 309 с.124

37. Павлинов И .Я. «Новая филогенетика»: источники и составные части // Эволюционные факторы формирования разнообразия животного мира. М.: Т-во научных изданий КМК, 2005. С. 15-29.

38. Панкратова В.Я. Личинки и куколки подсемейства Chironominae J фауны,СССР (Díptera, Chironomidae). Л.: Наука, 1983. 296 с.

39. Петрова Н.А. Хромосомный полиморфизм и микроэволюция у 5 хирономид и мошек // Кариосистематика беспозвоночных животных II. ! СПб., 1993. С. 46-49.

40. Полуконова Н.В., Белянина С.И. О возможности гибридогенеза в видообразовании комара-звонца Chironomus usenicus. Loginova et Beljanina (Chironomidae, Díptera) // Генетика. 2002. Т. 38, №12. С. 1635-1640.

41. Полуконова Н.В. ' Морфологическая и хромосомная дифференциация ' комаров-звонцов (Chironomidae, Díptera) в процессе видообразования: Дисс.докт. биол. наук. Саратов, 2005. 564 с.

42. Полуконова Н.В. Сравнительный морфологический анализ комаров-звонцов Chironomus curabilis и Ch. nuditarsis (Chironomidae, Díptera)

43. Преимагинальные стадии // Зоол. журн. 2005а. Т. 84, № 3. С. 367-370.

44. Полуконова Н.В. Сравнительный морфологический анализ комаров-звонцов Chironomus curabilis и Ch nuditarsis (Chironomidae, Díptera)1.. Самцы и самки комаров // Зоол. журн. 20056. Т. 84, № 3. С. 371-376.

45. Полуконова Н.В. Филогенетические связи близкородственных видов Chironomus (Chironomidae, Díptera) // Тр. Рус. энтомол. Об-ва. СПб. 20036. Т. 74. С. 71-80.

46. Полуконова Н.В. Филогенетические связи видов Chironomus с набором хромосом 2п=6 — С. commuttatus и С. nudiventris (Diptera, Chironomidae) // Новые данные по хирономидологии. Борок: ИБВВ РАН, 2003а. С. 34-41.

47. Полуконова Н.В., Белянина С.И., Михайлова П.В., Голыгина В.В. Сравнительный анализ кариотипов и кариофондов комаров-звонцов125

48. Chironomus nuditarsis и Ch. curabilis (Chironomidae, Díptera) // Зоол. журн. 2005. Т. 84, № 2. С. 195-206.

49. Сингер М., Берг П. Гены и Геномы: в 2-х т. Т.2. М.: Мир, 1998.391 с.49; Ченцов Ю.С. Общая цитология. 3-е изд. М.:МГУ, 1995. 384 с.

50. Черновский А.А. Определитель личинок комаров семейства Tendipetidae. М., Л.: АН СССР, 1949:182 с.

51. Шилова А.И. О сезонных формах Microtendipes pedellus de Geer (Díptera, Chironomidae)//Биол. внутр. вод. 1973. № 18. С. 39-41.

52. Шилова А.И. Семейство* Chironomidae (Tendipedidae) — комары-звонцы. Определитель насекомых европейской части СССР. JL: Наука, 1969. Т. 5, № 1.С. 163-201. .

53. Шилова А.И. Хирономиды Рыбинского водохранилища. Л.: Наука, 1976. 25 i с.

54. Шилова А.И., Шобанов Н.А. Каталог хирономид рода Chironomus Meigen 1803 (Díptera, Chironomidae) России и бывших республик СССР // Экология, эволюция и систематика хирономид. Тольятти, Борок.: ИБВВ и ИЭВБ РАН, 1996. С. 28-43.

55. Шобанов Н.А. Кариофонд Chironomus plumosus (L.) (Díptera, Chironomidae) 1. Стандартизация дисков политенных хромосом в системе Максимовой // Цитология. 1994. Т. 36, № 1. С. 117-122:

56. Шобанов Н.А. Морфологическая дифференциация видов Chironomus группы plumosus (Díptera, Chironomidae). Личинки // Биология,систематика и функциональная морфология пресноводных животных. JL: Наука, 1989. С. 250-279.

57. Шобанов Н.А. Род Chironomus Meigen (Díptera, Chironomidae. Систематика, биология, эволюция: Автореф. дис. док. биол. наук. СПб.: Наука, 2000. С. 1-52.

58. Шобанов Н.А., Демин С.Ю. Chironomus agilis — новый вид из группы plumosus (Díptera, Chironomidae) // Зоол. журн. 1988. Т. 76, № 10. С. 1489—1497.

59. Шобанов Н.А., Зотов С.Д. Цитогенетические аспекты филогении рода Chironomus Meigen (Díptera, Chironomidae) // Энтомол. обозр. 2001. Т. 80, № 1.С. 180-193.

60. Avise J. C. Molecular markers, naturaL history and. evolution. New York.: Chapman and Hall, 1994. 511 p.

61. Brundin L. Chironomiden und andere Bodentiere der sudschwedischen Urgebirgsseen. Report from the Institute of Freshwater Research. Drottningholm. 1949. Vol. 30. 914 p.

62. Coffman W.P., Ferrington L.C. Chironomidae // In Merrit R.W., Cummins K.W. (eds.) An introduction to aquatic insects of North America, 3rd ed. Dubuque, Iowa.: Kendall/Hunt Publishing, 1996. P. 635-754.

63. Cranston P., Hardy N., Morse G., Pusledni L.K., Mc Cluen S.R When molecules and morphology concur: the «Gondwanan» midges (Diptera:

64. Chironomidae) // Systematic Entomology. 2010. Vol. 35, № 4. P. 636-648;t

65. Cranston P.S., Dillon M., Pinder L.C.V., Reiss, F.R. Keys and diagnoses of the adult males of the subfamily Chironominae (Diptera, Chironomidae) // Entomologica Scandinavica Supplement. 1989. Vol. 34. P. 353502.

66. Cranston P.S., Martin J. — Family Chironomidae: Электронный документ. 2007. P. 252-274. (http://hbs.bishopmuseum.org/aocat/pdßf26chiro.pdQ. Проверено 20.11.2010.

67. Desalle R., Freedman Т., Prager E. M., Wilson A.C. Tempo and mode of sequence evolution in mitochondrial DNA of Hawaiian Drosophila II Molecular Evolution. 1987. Vol. 26. P. 157-164.

68. Desmyter S., Gosselin M. COI sequence variability between Chrysomyinae of forensic interest // Forensic Sei. Int. Genet. 2009. Vol. 3, № 2. P. 89-95.

69. Eck R.V., Dayhoff M.O. Atlas of Protein Sequence and Structure. National Biomedical Research Foundation, Silver Springs, Maryland, 1966.283 p.

70. Ekrem Т., Willassen E., Stur E. Phylogenetic utility of five genes for dipteran phylogeny: a test case in the Chironomidae leads to generic synonymies. // Mol. Phylogenet. Evol. 2010. Vol. 57, № 2. P. 561-571.

71. Ekrem T., Willassen E., Stur E. A comprehensive DNA sequence library is essential for identification with DNA barcodes // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2007. № 43. P. 530-542. .

72. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evolution. 1985. Vol. 39. P. 783-791.

73. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1994. Vol. 3, № 5. P: 294299.

74. Goetghebuer M. Tendipedidae Tendipedinae // Lindner. Die Fliegen der palaearktischen Region. 1937. Bd. 107. S. 1-49.

75. Griffiths C. Correlation of functional domains and rates of nucleotide substitution in Cytochrome b // Mol. Phylogenet. Evol. 1997. Vol. 7. P. 352-365:

76. Guryev V., Makarevich I., Blinov A., Martin J. Phylogeny of the genus Chironomus (Diptera) inferred from DNA sequences of mitochondrial cytochrome b and cytochrome oxidase I // Molecular Biology and Evolution. 2001. Vol. 19. P. 9-21.

77. Hoeh W.R., Stewart D.T., Sutherland B.W., Zouros E. Multiple origins of gender-associated mitochondrial DNA lineages in bivalves (Mollusca: Bivalvia) // Evolution. 1996. Vol. 50. P. 2276-2286.

78. Hooker J. D. On the origin and distribution of species: Introductory essay to the Flora of Tasmania // American Journal of Science and Arts. 1860. Vol. 29. P. 1-25,305—326.

79. Hou Z., Fu J., Li S. A molecular phylogeny of the genus Gammarus (Crustacea: Amphipoda) based on mitochondrial and nuclear gene sequences // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2007. Vol. 45. P. 596-611.

80. Huang D., Meier R., Todd P.A., Chou L.M. Slow Mitochondrial COI Sequence Evolution at the Base of the Metazoan Tree and Its Implica. // Molecular

81. Evolution. 2008. Vol. 66, № 2. P. 167-174.129

82. Jackie H., Almeida J.C., Galler R. et al. Constant and variable parts in the Balbiani ring 2 repeat unit and the translation termination region // EMBO Journal. 1982. Vol. 1, № 7. P. 883-888.

83. Jamnongluk W., Baimai V., Kittayapong P. Molecular phylogeny of tephritid finit flies in the Bactrocera tau complex using the mitochondrial GOI sequences // Genome. 2003. Vol. 46. P. 112-118.

84. Jones D.T., Taylor W.R, Thornton J.M. Hie rapid generation- of mutation data matrices from protein sequences // Computer Applications in the Biosciences. 1992. Vol. 8. P. 275-282.

85. Jukes Т.Н., Cantor C.R. Evolution of protein molecules. In Munro HN, editor, Mammalian Protein Metabolism. New York.: Academic Press, 1969. P. 21-132.

86. Kimura M. A. simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // Journal of Molecular Evolution. 1980. Vol. 16. P. 111-120.

87. Kimura M. Evolutionary rate at the molecular level // Nature. 1968. T. 217. P. 624-626.

88. Knowlton N., Weigt L.A., Solorzano L.A. et al. Divergence in proteins, mitochondrial DNA, and reproductive compatibility across the Isthmus of Panama// Science. 1993. Vol. 260. P. 1629-1632.

89. Krzeminski W., Jarzembowski E. Anne triassica, n. sp., the oldest representative of Ghironomidae // Polskie Pismo Entomologiczne. 1999. № 68. P. 445-449.

90. Langton P.H. A key to pupal exuviae of West Palaearctic Chironomidae / P.H. Langton. Huntingdon, England, 1991. 386 p.

91. Li W.H. Molecular Evolution. Sunderland.: Sinauer Associates, 1997. -145 p.

92. Lindeberg B. Sibling delimitation in the Tanytarsus lestagei aggregate (Díptera, Chironomidae) I I Annales Zoologici Fennici. 1967. № 4. S. 45-85.

93. Lynch P.E., Jarrell A. Method for Calibrating Molecular Clocks and Its Application to Animal Mitochondrial DNA // Genetics. 1993. Vol. 135. P. 1197-1208.

94. Mann H.B., Whitney D.R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other // Annals of Mathematical Statistics. 1947. Vol. 18. P. 50-60.

95. Mark I., Greenslade S.P., Hogg I. D. and Sunnucks P. Southern Hemisphere Springtails: Could Any Have Survived Glaciation of Antarctica? // Molecular Biology and Evolution. 2006. Vol. 23, № 5. P. 874-882.

96. Martin I. The cytology and larval morphology of the Victorian representatives of the subgenus Kiefferulus of the genus Chironomus (Díptera, Nematocera) I I Aust. J. Zool. 1963. Vol. 11. P. 301-322.

97. Martin J., Guryev V., Blinov A. Population variability in Chironomus (iCamptochironomus) species (Díptera, Nematocera) with a Holarctic distribution: evidence of mitochondrial gene flow // Insect Molecular Biology. 2002. Vol. 11, № 5. P. 387-397.

98. Martin J., Wülker W., Sublette J.E. Evolutionary cytology in the genus Chironomus Meigen // Stud. Nat. Sci. 1974. Vol. 1, № 12. P. 112.131

99. Michailova P.V. The polytene chromosomes and their significance to the systematic and phylogeny of the family Chironomidae, Diptera // Acta Zool. Fenn. 1989. № 186. 107 p.

100. Molbo D., Machado C.A., Sevenster J.G. et al. Cryptic species of fig-pollinating wasps: Implications for the evolution of the fig-wasp mutualism, sex allocation, and precision of adaptation // PNAS. 2003. Vol. 100, № 10. P. 58675872.

101. Nagaraja K., Nagaraju J., Ranganath H.A. Molecular phylogeny of the nasuta subgroup of Drosophila based on 12S rRNA, 16S rRNA and COI mitochondrial genes, RAPD and ISSR polymorphisms // Genes. 2004. Vol. 79, №5. P. 293-299.

102. Nei M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York.: Oxford University Press, 2000.333 p.

103. Papoucheva E., Proviz V., Lambkin« C.et al. Phylogeny of the endemic Baikalian Sergentia (Chironomidae, Diptera) // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2003. Vol. 29. P. 120-125

104. Papusheva E., Gruhl M.C., Berezikov E. at al. The Evolution of SINEs and LINEs in the Genus Chironomus (Diptera) // Molecular Evolution. 2004. Vol. 58. P. 269-279.

105. Pfenninger M., Nowak C., Kley G. et al. Utility of DNA taxonomy and barcoding for the inference of larval community structure in morphologically cryptic Chironomus (Diptera) species // Molecular Ecology. 2007. Vol. 16. P. 1957-1968.

106. Pinder L.C.V., Reiss F. The larvae of Chironominae (Diptera, Chironomidae) of the Holarctic region — Keys and diagnoses // Entomol. Scand. 1983, №19. P. 293-435.

107. Powell J.R. Interspecific citoplasmatic gene flow in the absence of nuclear gene flow: evedense from Drosophila II Proc. Natl. Acad. USA. 1983; Vol. 18, №7. P. 492-495.

108. Ratnasingham S., Hebert P.D.N. BOLD : The Barcode of Life Data System^(www.barcodinglife.org),// Molecular Ecology Notes. 20071 №7. P. 355364 ' ' ■

109. Russo C.A., Takezaki N., Nei M. Molecular phylogeny and divergence .times of drosophilidspecies // Molecular Biology and Evolution. 1995: Vol. 12, № 3. P. 391-404.

110. Rzhetsky A., Nei MIA simple method for estimating and testing minimum evolution trees // Molecular Biology and Evolution; 1992. Vol. 9. P. 945-967: •

111. Saether O.A. A review of the genus Limnophyes Eaton firon the Holarctic and Afrotropical regions (Diptera, Chironomidae, Orthocladiinae) // Ent. scand. 1990. Suppl. 35. P. 1-139.

112. Saether O.A. Phylogeny of the subfamilies of Chironomidae (Diptera) // Systematic Entomology. 2000: Vol. 25, № 3. P. 393-403.

113. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution; 1987. Vol. 4. P. 406-425.

114. Satta Y., Takanahata N. Evolution of Drosophila mitochondrial DNA and the history of the melanogaster subgroup // Genetics. 1990. Vol. 87. P. 95589562.

115. Schonl I., Gandolfi A., Masso E. et al. Persistence of asexuality through mixed reproduction in Eucypris virens (Crustacea, Ostracoda) // Heredity. 2000. Vol. 84. P. 161-169.

116. Schwarz R., Dayhoff M. Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff M, editor, Atlas of protein sequences. National Biomedical Research Foundation. 1979. P. 353-358.

117. Sharley D.J., Pettigrove V., Parsons Y.M. Molecular identification of Chironomus spp. (Diptera) for biomonitoring of aquatic ecosystems I I Australian» Journal* of Entomology. 2004. №43. S. 359-365.

118. Sharma M. Molecular identification of chironomid species based on its-1 and its-2 regions of rDNA. A thesis^ submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science. Wright State University, 2007. -P. 51.

119. Sneath P.H.A., Sokal R.R: Numerical Taxonomy. San Francisco.: Freeman, 1973. 573 p.

120. Sperling F.A., Anderson G.S., Hickey D.A. A DNA-based approach to the identification of insect species used for postmortem interval estimation // Forensic Sci. 1994. Vol. 39, № 2. P. 418-427.

121. Tajima F. Simple methods for testing molecular clock hypothesis // Genetics. 1993. Vol. 135. P. 599-607.

122. Tajima F., Nei M. Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences // Molecular Biology and Evolution. 1984. Vol; 1. P. 269285.

123. Takezaki N., Rzhetsky A., Nei M. Phylogenetic test of the molecular clock and linearized trees // Molecular Biology and Evolution. 2004. Vol. 12. P. 823-833.

124. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular Biology and Evolution. 1993. Vol. 10. P. 512-526.

125. Tamura K., Nei M., Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method // Proceedings of the National

126. Academy of Sciences (USA). 2004. Vol. 101. P. 11030-11035.

127. Vardal H.} Bjorlo A., Saether O. A. Afrotropical Polypedilum subgenus Tripodura, with a review of the subgenus (Diptera: Chironomidae) // Zoologica Scripta. 2002. Vol. 31. P. 331-402.

128. Walker I.R., Mathewes R.W. Chironomidae Diptera and postglacial climate change at Marion Lake, British Colombia, Canada // Quaternary Research. 1987. Vol. 27. P. 89-102.

129. Wallace A.R. The geographical distribution of animals with a study of the relations of living and extinct fauna as elucidating the past changes of the earth's surface. -L.: Macmillan, 1876. Vol. 1. 503 p.; Vol. 2. 607 p.

130. Wheat C.W., Vogel H., Wittstock U. et al. The genetic basis of a plant-insect coevolutionary key innovation // PNAS. 2007. Vol. 104, № 51. P. 20427-20431.

131. Wiederholm T. (Ed.). Chironomidae of the Holarctic region. Keys and diagnoses. Part 1. Larvae // Ent. Scand. 1983. Suppl. 19. 457 p.

132. Wiederholm T. (Ed.). Chironomidae of the Holarctic region. Keys and diagnoses. Part 2. Puppe//Ent. Scand. 1986. Suppl. 6. 501 p.

133. Wiederholm T. (Ed.). Chironomidae of the Holarctic region. Keys and diagnoses. Part 3. Imago // Ent. Scand. 1989. Suppl. 11. 464 p.

134. Wilson A.C., Cann R.L., Carr S:M. et al. Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics // Biological Journal of the Linnean Society. 1985. Vol. 26. P. 375—400.

135. Wilson R.J., Goodman J.L., Strelets V.B. FlyBase: integration andimprovements to query tools // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36. P. 588-593.135

136. Wolstenholme D.R., Clary D.O. Sequence evolution of Drosophila mitochondrial DNA // Genetics. 1985. Vol. 109. P. 725-744.

Информация о работе

Демин, Александр Геннадьевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Анализ эволюционной изменчивости гена COI и его использование для филогении и систематики таксонов с высоким видовым разнообразием на примере комаров-звонцов подсемейства Chironominae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы