Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ экспрессии и выявление аллельных вариантов генов-кандидатов признака толщина скорлупы домашней курицы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ экспрессии и выявление аллельных вариантов генов-кандидатов признака толщина скорлупы домашней курицы"

на правах рукрйиси

БАРКОВА Ольга Юрьевна

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ И ВЫЯВЛЕНИЕ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ ПРИЗНАКА ТОЛЩИНА СКОРЛУПЫ ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ

Специальность 03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О МАР 2011

Санкт-Петербург. 2011

4840251

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации генома Государственного • научного учреждения Всероссийский научно исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор биологических наук А.А. Сазанов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.П.Терлецкий (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН)

кандидат биологических наук Е.Г.Неронова (Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России)

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт

экспериментальной медицины СЗО РАМН

Защита состоится «/¿» Q&, 2011 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 006.012.01 по защите докторских диссертаций в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии

по адресу: 196601, Санкт-Петербург - Пушкин, Московское шоссе 55-а. Факс:

(812)465 99 89

e.mail: spbvniigen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан .02^ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор ' Г.Н.Сердюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большинство хозяйственно ценных признаков домашних животных имеют сложный полигенный тип наследования и контролируются многими генами, расположенными в локусах QTL (quantitative trait loci). Изучение комплексной молекулярной архитектуры QTL представляет интерес с точки зрения общей генетики (Mackay, 2001). Кроме того, данные о QTL могут быть использованы в практическом животноводстве для селекции с помощью молекулярных маркеров (marker assisted selection, MAS) (Tankey, 1993; Georges et al., 1995; Phillips, 1999; Зиновьева, 2009).

В предшествующие годы нами проведен ряд экспериментов по позиционному клонированию двух районов хромосомы 4 домашней курицы, содержащие QTL толщины скорлупы на 53 неделе жизни (ST53). Методом гибридологического анализа косегрегацин микросателлитных ДНК-маркеров и количественных признаков определены маркеры интервалов генетической карты (районов хромосом), контролирующих QTL ST53. С использованием баз данных компьютерной сети Интернет показана локализация количественного признака ST53 в пределах интервала, ограниченного микросателлитными локусами MCW0114 и ADL0241. Определены координаты тринадцати клонов, имеющих гомологию последовательностей ДНК вставки с микросателлитными локусами MCW0114 и ADL0241. Проверка клонов на предмет наличия искомой последовательности методом ПЦР с использованием праймеров для микросателлитных локусов MCW0114 и ADL0241 позволила установить соответствие девяти ВАС-клонов локусу MCW0114 и четырех ВАС-клонов локусу ADL024I. Методом флуоресцентной гибридизации ДНК-ДНК in situ (FISH) установлена внутрихромосомная локализация ВАС-клонов, содержащих микросателлитные локусы. Установлено следующее положение микросателлитных маркеров локуса ST53 на GGA4(xpoMocoMa курицы 4): MCW0114 - 17.834.202-17.834.699 п.н. и ADLÖ241 - 16.643.314-16.643.645 п.н. Полученный интервал величиной 1,2 млн.п.н. является критическим для признака ST53.

Представленная работа посвящена анализу экспрессии и выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов количественного признака толщина скорлупы яйца домашней курицы.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является анализу экспрессии и выявлению аллельных вариантов генов-кандидатов количественного признака толщина скорлупы яйца на 53-ей неделе жизни (ST53) курицы-несушки.

Поставлены следующие задачи:

- изучение профилей экспрессии в тканях яйцевода 20-ти генов, являющихся позиционными кандидатами для количественного признака толщина скорлупы яйца на 53-ей неделе жизни (8Т53) курицы-несушки

- выявление корреляций экспрессии генов-кандидатов с толщиной скорлупы

- ПЦР-амплификация регуляторных и кодирующих последовательностей генов, экспрессия которых связана с толщиной скорлупы

- выявление сайтов мононуклеотидного полиморфизма (БИР) в пределах регуляторных и кодирующих последовательностей генов, экспрессия которых связана с толщиной скорлупы, путем секвенирования их последовательностей

- поиск сайтов связывания транскрипционных факторов в выявленных полиморфных районах

- анализ частот встречаемости аллелей выявленных полиморфных сайтов в группах с тонкой и толстой скорлупой

- сравнение толщины скорлупы в различных генотипических классах по выявленным полиморфным сайтам.

Научная новизна работы. Амплификация на матрице кДНК из тканей яйцевода позволила установить наличие экспрессии 12 из 20 возможных генов-кандидатов на уровне разрешения ПЦР в реальном времени. Методом ПЦР в реальном времени проведен анализ экспрессии 12-ти генов-кандидатов. Выявлены достоверные на уровне значимости 0,01 двукратные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой по уровню экспрессии последовательности С11523443. Коэффициент корреляции уровня экспрессии этого гена и толщины скорлупы составил 0,85. Выявлено 6 сайтов мононуклеотидного полиморфизма (8№) в пределах последовательности СЯ523443, из них 5 - в регуляторной области (82_1, 831, 83_2, Б3_3 и Б3_4) и 1 — в кодирующей (86_1). Для всех полученных Б>5Р выявлены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов, что дает основания считать их тБЫР - регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами. Методом ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров проведен анализ влияния обнаруженных гвМР на толщину скорлупы домашней курицы.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении баз данных по

генетическим и физическим картам хромосом КРС и сравнительным картам человека, мыши и КРС (www.thearkdb.org) и банка данных нуклеотидных последовательностей (www.nlm.ncbi.nih.gov) в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре естествознания и географии Ленинградского государственного университета им. A.C. Пушкина в рамках курсов «Генетика с основами селекции» и «Молекулярная биология».

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международной научной конференции «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных» (Санкт-Петербург, 2009), научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (Ярославль, 2009), конференции "Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России" (Сергиев Посад, 2009), международной конференции «Функциональная геномика в повышении качества продукции животноводства» (Варшава, 2009). Результаты периодически докладывались на семинарах отдела молекулярной генетики и биотехнологии ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН. Исследования проводили в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН по теме «Разработать систему молекулярно-генетических маркеров, обеспечивающих повышение эффективности селекции сельскохозяйственных животных» (номер государственной регистрации 01.200.118843).

Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации, были опубликованы в научных журналах «Достижение науки и техники АПК», «Animal Science Pampers and Reports»" и "Russian Journal of Genetics". Всего no теме работы опубликовано 4 печатные работы, из них 3 статьи и 1 тезис.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, включает 15 таблиц, 6 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Практические предложения» и «Список литературы». Список цитированной литеразуры насчитывает 8 русских и 108 иностранных названий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определены профили экспрессии в тканях яйцеводов 20 позиционных генов-кандидатов для количественного признака толщина яйца на 53-й недели жизни несушки. Между 1руппами кур с тонкой и толстой скорлупой у неспециализированной локальной породы польская зеленоногая куропатчатая выявили достоверные двукратные различия по уровню экспрессии последовательности CR523443 на уровне значимости 0,01. Существует положительная корреляция уровня экспрессии гена CR523443 и толщины скорлупы.

2. Проведена ПЦР-амшгафикация регуляторных и кодирующих последовательностей генов, экспрессия которых связана с толщиной скорлупы.

3. В пределах последовательности CR523443 выявили 6 сайтов мононуклеотидного полиморфизма (SNP), из них 5 - в регуляторной области (S2_l, S3_l, S3_2, S3_3 и S3_4) и 1 — в кодирующей (S6_l).

4. Во всех указанных выше SNP существуют сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов, т.е. все данные являются регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами (rSNP).

5.Проведен анализ частот встречаемости аллелей выявленных SNP в группах кур породы род-айленд с толстой (389.9 ±13.09 мкм) и тонкой (315.7 ± 21.38 мкм) скорлупой яйца. Между данными группами кур существуют достоверные различия по частотам аллелей полиморфных сайтов ST2_1, ST3_1, ST3_2 и ST3_3.

6. Проведено сравнение толщины скорлупы в различных генотипических классах по выявленным мононуклеотидным полиморфным сайтам. В данных группах кур выявлены достоверные различия по толщине скорлупы в генотипических классах по аллелям (rSNP) ST2_1, ST3_1, ST3_2, ST3_3 и ST6_1.

7. Проведено попарное сравнение эффекта разных SNP, выявленных в регуляторной и кодирующей частях гена CR523443, оказывающего влияние на толщину скорлупы яйца. Наблюдали аддитивный эффект аллелей SNP в сочетаниях ST2_1/ST3_1, ST2_1/ST3_2, ST2_1/ST3_3, ST2_1/ST6_1, ST3_1/ST3_2, ST3_1/ST6_1, ST3_2/ST3_3, ST3_2/ST6_1 и ST3_3/ST6_1.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы

Материал. Для приготовления матричной РНК и кДНК было использовано по пять птиц с высоким (STH) и низким (STL) значением признака ST53 из пород RIR (род-айленд) и G1P (польская зеленоногая куропатчатая). Средние значения и стандартные отклонения признака ST53 в группах были следующие: RIR STH = 378.4 ± 3.65 мкм, RIR STL = 227.8 ± 8.99 мкм, G1P STH = 372.4 ± 2.07 мкм, G1P STL = 248.6 ± 16.62 мкм. Изоляция яйцеводов была проведена на 5-ые сутки после измерения при помощи микрометра толщины скорлупы трех последовательных яиц на 53-ей недели жизни несушки. Для выделения матричной РНК использовали свежие яйцеводы кур с формирующейся скорлупой яйца непосредственно после измерения ST53,

Для секвенирования были использованы 6 образцов ДНК от шести кур породы польская зеленоногая куропатчатая (те же особи, что и для анализа экспрессии генов-кандидатов). Для генотипирования был использован 91 образец ДНК кур породы род-айленд из двух групп с толщиной скорлупы 389.9 ± 13.09 мкм (46 особей), и 315.7~± 21.38 мкм (45 особей), любезно предоставленный проф. Гальперн И.Л. (ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии). Методы.

Анализ экспрессии. Нижнюю часть яйцевода (uterus) выявляли по наличию яйца с формирующейся скорлупой и аккуратно вырезали. От 50 до 100 мг ткани от каждой особи было использовано для выделения мРНК при помощи TRIZol реагента (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) в полном соответствии с рекомендациями производителя. Синтез однонитевой кДНК проводили при помощи набора Enhanced Avian Reverse Transcriptase PCR Kit (Sigma-Aldrich, St Louis, МО), тщательно следуя указаниям производителя. Смесь для амплификации включала: 2 мкл продукта обратной транскрипции, 10 мкл реагента SYBR Green JumpStart Taq Ready Mix Capillary Formulation (Sigma-Aldrich, St Louis, МО) и no 2 мкл 5 mM раствора каждого праймера (таблица 1) в конечном объеме достигая 20 мкл. Условия ПЦР были следующие: начальная денатурация - 5 минут при 95° С, затем следовали 40 циклов амплификации (10 секунд при 95° С, 10 секунд при 55° С и, наконец, 15 секунд при 72° С). ПЦР проводили при посредстве термоцшслера LightCycler (Roche, Basel, Switzerland). Анализ кривой плавления проводили на интервале от 65° С до 95° С для. проверки специфичности амплификации. Ген домашней курицы GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) идентификационный номер NM_204305; последовательности праймеров:

GAPDHfw, CCTCTCTGGCAAAGTCCAAG;

GAPDHrv, CATCTGCCCATTTGATGTTG) был использован в качестве реферативного. Для вычисления относительных количеств амплифицируемых последовательностей был использован метод 2ЛАС1. Расчеты проводили при помощи программы Excel 2003 (Microsoft, Seattle, WA). Анализ in silico и подбор праймеров

Анализ in silico проводили с использованием баз данных полного сиквенса генома домашней курины

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9031 и

http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/). Для выявления кодирующих последовательностей внутри контигов и их сравнения с известными генами других организмов использовали пакет компьютерных программ BLAST. Подбор олигонуклеотидов-праймеров для секвенирования регуляторного и части кодирующего районов экспрессирующейся последовательности ChEST985k21 проводили на основании информации баз данных сети Интернет (www.nlm.ncbi.nih.gov и www.ensembl.org) при помощи компьютерной программы PRIMER_3 (wwwgenome.wi.mit.edu). Проверку специфичности и отсутствия возможной внутригеномной гомологии полученных последовательностей праймеров проводили при помощи пакета программ BLAST с варьирующими параметрами величины окна, допустимого процента идентичности пар оснований, фильтрации повторов. С целью подбора оптимальных длин и взаимного расположения фрагментов ДНК, предназначенных для секвенирования, было проанализировано 2 т.п.н. в направлении 5' от старт-кодона и 1,5 т.п.н. в пределах открытой рамки считывания. Получены последовательности 6 пар праймеров для амплификации последовательностей, удовлетворяющих условиям секвенирования (Таблица 2). Амплификация ДНК при помощи ПЦР

Проведены эксперименты по ПЦР-амплификации 6 фрагментов регуляторной и кодирующей областей последовательности ChEST985k21. Проведено по 6 реакций ПЦР на 6-ти биологических образцах в трех технических повторностях.

Смесь для амплификации включала 240 нг ДНК-матрицы, буфер для реакции (20мМ Трис-HCl, рН 8.4, 50 Мм КС1), дезоксирибонуклетидтрифостаты (200мкМ каждого), 1.5 мМ MgCl2) 1.25 единицы iTaq полимеразы (Bio-Rad, США) и 100 нМ каждого праймера. Конечный объем реакционной смеси был равен 25 мкл.

Амплификацию ДНК проводили с использованием амплификатора IQ-5 (Bio-Rad, США). Реакцию проводили в следующем режиме:

95° С - 5 минут; 95° С -.30 секунд, 60° С 30 секунд, 72° С - 1 минута (30 циклов); 72° С - 7 минут; 7° С -хранение. После полимеразной цепной реакции производили переосаждение полученных фрагментов с помощью этанола и растворяли в дистиллированной воде до концентрации 10-20 нг/мкл Подготовка образцов для секвенирования

Полимеразную реакцию для секвенирования проводили в соответствие с рекомендациями производителя (Applied Biosystems, США). К препарату ДНК (25-40 нг) добавляли 1 мкл праймера (Таблица 2) (3 пМ), 8 мкл Big Dye Terminator Sequencing Mix, деионизованную воду до 20 мкл и аккуратно перемешивали. После чего пробирки помещали в амплификатор 1Q5. Полимеразную цепную реакцию проводили в следующем режиме: 96° С - 1 минуту; 96° С - 10 секунд, 50° С - 5 секунд, 60° С - 4 минута (25 циклов); 7° С - хранение.

После полимеразной цепной реакции производили переосаждение полученных фрагментов с помощью этанола. Далее добавляли 20 мкл фирменного реактива Applied Biosystems - ffiFiFormamide и денатурировали фрагменты ДНК при 95° С в течение 5 минут, после чего образцы инкубировали при -20° С в течение 5-10 минут. СеквенированиеДНК

Элекгрофоретическое разделение полученных фрагментов и анализ их нуклеотидной последовательности проводили автоматически при помощи секвенатора ABI 3130 (Applied Biosistem, США). Выявление сайтов связывания транскрипционных факторов

Сайты связывания транскрипционных факторов выявляли ори помощи программы TESS (http://www.cbil.upenn.edu) при условии полной комплементарности исследуемой последовательности и представленной в базе данных TRANSFAC v.6 (http://www.cbil.upenn.edu). Учитывали только те сайты связывания транскрипционных факторов, которые присутствовали в одном из аллельных вариантов SNP и отсутствовали в другом и имели вероятность связывания равную 90% или более, что является максимально строгим значением при задании условий поиска.

Генотипирование

Использованные в работе аллелеспецифические праймеры представлены в Таблице 5. Амплификацию ДНК при помощи ПЦР проводили с использованием амшшфикатора IQ-5 (Bio-Rad, США) в следующем режиме: 95° С - 5 минут; 95° С - 30 секунд, 60° С 30 секунд, 72° С - 1 минута (30 циклов);

72° С - 7 минут; 7° С - хранение.

Полученные фрагменты ДНК разделяли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле..

Статистическую обработку результатов генотипирования проводили путем сравнения частот аллелей гБИР в группах с тонкой и толстой скорлупой при помощи критерия и сравнения толщины скорлупы в различных генотипических классах при помощи критерия Стьюдента.

Таблица 1. Праймеры и условия ПЦР для анализа экспрессии генов-кандидатов.

Ау - прямой; гу« обратный__

Идентификационный номер Последовательности праймеров ТСС) Длина (П.Н.)

ХМ 420335 5 '-ОАСАОСАОССАТССАААОТА-З' пг 5' -ССГГСОТОТОАТАСОТ(3<ЗТО-3 * 60 143

Ш0548 ^^ 5'-ОТОААСОТТАШСТССТСАА-3' пг 5 ^ОТТЮСТССТГАССЮСАСАТ-З' 60 119

01390814 5'-ААС ААТАОбССТСАСССТТО -3' пг 5 '-ССАТАТАТССАССССССТТТ-З' 60 120

01523443 (СЬЕ8Т985к21) ЙУ 5'-САТСТСГС(КГГСШТГ<ПТС -3' гу 5'-ААТГССТГС(ЮААССАСАА0 -3' • 59 115

ХМ_420348 йу 5 '-САССТССС АААААСТСЮТТС-З» ГУ 5'-АОАТСАСГССТСТГССАССАТ-3' 59 142

>1М_001031126 ЛУ 5'-(ГСА<ГСАСАААОАСгСАОАШ-3' ГУ 5'-ТСаТТАСК:СТСАОТ<ХАССТ-3' 59 103

ХМ_420350 ЙУ 5'-ААСОАССТООАОАА(ЗСАОАА -3' гу 5'-АСАТСАТОССТОААССАТСА-3' 59 149

ХМ_420351 йу 5'-ОСТОСТОТССОТСОТО-3' ГУ 5'-СССТАСАО(ЗСС<ЗСТСТС-3' 59 135

ХМ_420352 ВУ 5 '-СТТСТСТСОАОСТССОАОТС-З' ГУ 5^0А0СТ0САТССАА0ТСАСАА-3' 60 101

ХМ_420353 ЯУ 5 '-АОАТСЮАОТТСССГСАААОС -3' ГУ 5'- ТСТССГСТССОАААСАТСАС-З' 59 142

ХМ_420354 5'-ТОСГСТССАААСААААТСЮА-3' ГУ 5' -САОТТТСООТСААТОССТТТ-З' 60 143

КМ_205361 ^ 5^СОАТСАСАОТСОТШТтТС-3' ГУ б'-СТСТСАССССЮШТТТОАСТ-З' 60 105

>1М_205295 АУ 5 '-ТССОТСТААТОАОСАССТОА-З' ГУ 5'-АССААС АвС АААОТССАСАО-З' 60 111

ХМ_420355 ^ 5'-СССТСТТСССТТС АССТСТА-3' ГУ 5 '-АТССААССАОАТОТСАССАА-З' 60 115

ХМ_42035б 5'-ТСАСАТСТЮААТСОТОСАА -3' ГУ З'-АОТССССОАТАОТСТСТСОА-З' 59 101

ХМ_420357 5'.СТСАСССаАСТСПТССАа-3' ГУ 5'-СТОСС(КЮААСТОТАОТССТ-3' 58 106

ХМ_420358 5'-A(ЛTГGGGCACXГAGCATTAC-3, IV 5'-ССОСАОТСШАТОТГАААОТ-3' 60 129

ХМ_420359 ЙУ 5'-ОАООАТОАетСОТСОАОАОС -3' ГУ б'-АССТасаАТААСТССТСТСС-З' 59 111

ХМ_420360 ^ б'-ОТТОГГГОСОТГССАТТСТО-З' ГУ 5'-ТОТТСАССААТСАССТССАТ-3' 59 110

ХМ_420361 5' -СЮАОААС АйС АС0К7ГСАСТТ-3' ГУ 5ЧКЗССАТСА<КЗАААСАОААОА-3' 60 142

Таблица 2. Последовательности олигонуклеотидоэ-праймеров для амплификации и секвенирования фрагментов регуляторной и кодирующей областей гена 00523443 :_

Фрагмент Последовательности праймеров

8Т538ея_1 FW: АСЗСАААСКЗСААССТСОТААО 11У: ТТТТСТССТТТАОААвТССТСгСТТ

8Т538есз_2 ЯФ: АОТТССШАОТАССТСАААСТАСА ЯУ: ТТССААШТАААОАСАОААСТСа

ТОТОАААТСТААОССШТГО ЯУ: АвСАОААССГССАААСТССА

8Т538е^4 FW: СТСАООАТСОТСОАОТТТШ ЮГ: ТССОАСАООААТССААТАСА

8Т53Бец_5 FW: ТСОАТТССТСТСССАТТАСТС ЯУ: ОСАААСАССТССАТТССТСТ

8Т538ед_6 Р1^: ОТССТОАСТАТСОШТОСТТ ЯУ: ТСААООСТТСААСОТСАСТС

Результаты

Пробная амплификация на матрице кДНК из тканей яйцевода позволила установить наличие экспрессии 12 из 20 возможных генов-кандидатов на уровне разрешения ПЦР в реальном времени (до 40 циклов на матрице 100 нг). Методом ПЦР в реальном времени проведен анализ экспрессии 12-ти генов-кандидатов (Таблица 3). Статистически достоверных различий в экспрессии между двумя группами с толстой и тонкой скорлупой, а также заметной корреляции уровня экспрессии с БТ53 в группе род-айлендов не обнаружено. По всей видимости, это объясняется снижением гетерозиготности в результате стабилизирующего отбора по качеству яйца, которому подвергалась эта порода яичного направления. В группе неспециализированной польской зеленоногой выявлены достоверные на уровне значимости 0,01 двукратные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой по уровню экспрессии последовательности СЛ523443 (Таблица 3). Коэффициент корреляции уровня экспрессии этого гена и толщины скорлупы составил 0,85.

Таблица 3. Результаты анализа экспрессии генов-кандидатов толщины скорлупы ___

Идентифика щгонный номер Описание Род-айленд Польская зеленоногая

отношение средних значений коэффициент корреляции отношение средних значений коэффициент корреляции

Ш0548 Ген ассоциированного с лизосомами мембранного гликопротеина 1.12 -0,04 0,80 0,26

СЮ90814 Анонимный кДНКклоа СЬБТ974Ь18 131 -0,14 0,75 0,26

(Ж523443 Анонимный кДНКклон СЬ8Т985к21 1,34 -0,25 0,49* 0,85*

№Л_001031 126 Ген митогея- активируемой цротеик-кинвзы4 0,49 -0,18 0,85 0,28

(МАР4К4)

ХМ420350 Гомология гену предсказанного белка Р1Л0178 1Д -0,47 1,20 0,31

ХМ__420354 Гомология гену предсказанного белка 2610030Н06Шк 0,74 0,38 0,70 0,41

КМ_205361 Ген мелатошшового рецептора Ме1-1с (МТМШС) 1,1 -0,13 1,42 -0,07

NN1,205295 Ген белка 2А группы высокой мобильности (Н\Ю2а) 1,35 -0,40 1,39 -0,11

ХМ_420356 Гомология гену миотутулярин-подобного белка I (МТШ.1) 0,76 0,14 0,96 0,35

ХМ_420357 Гомология гену миотутулярина (МТМ1) 0,70 0,17 0,99 0,06

ХМ_420359 Гомология гену предсказанного белка ЬОС91966 1,34 0,36 1,24 -0,05

ХМ420360 Гомология гену белка А семейства со сходными последовательное тями 11 (РАМПА) 0,30 -0,26 0,72 0,28

* - Р < 0,01

У каждой из шести кур неспециализированной породы польская зеленоногая с выраженными различиями по толщине скорлупы амплифицировали шесть фрагментов регуляторной и кодирующей областей

экспрессирующейся последовательности СИЕ8Т985к21 (идентификационный номер СЯ523443), оказывающей существенное влияние на количественный признак толщина скорлупы домашней курицы. Секвенирование этих фрагментов позволило выявить 6 сайтов мононуклеотидного полиморфизма (БЫР) в пределах последовательности СЬЕЗТ985к21, из них 5 - в регуляторной области (Б2_1, 83_1, 83_2, Б3_3 и Б3_4) и 1 — в кодирующей (86_1) (Таблица 4). Сайты связывания транскрипционных факторов шести обнаруженных БЫР были выявлены при помощи программы ТЕББ при условии полной комплементарности исследуемой последовательности и представленной в базе данных та/ШвРАС у.6 и максимально строгих по возможностям программы критериях отбора. Следует отметить, что во всех полученных Б ИР были найдены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов, что дает основания считать эти полиморфные сайты гБМ5 - регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами (Таблица 4).

Проведен анализ влияния гБ]МР на толщину скорлупы домашней курицы методом ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров (Таблица 5). Выявлены достоверные различия по частотам аллелей полиморфных сайтов 8Т2_1, 8ТЗ_1, БТЗ_2 и БТЗ_3 в группах кур породы род-айленд с толстой и тонкой скорлупой яйца (Таблица 6). Установлено, что толщина скорлупы достоверно различается в генотипических классах по гБТМР 8Т2_1, БТЗ_1, 8ТЗ_2, 8ТЭ_3 и БТ6_1 (Таблица 7).

Таблица 4. Сайты связывания транскрипционных факторов в БКР регуляторной и кодирующих областях экспрессирующейся последовательности С11523443. Жирным шрифтом выделены полиморфные нуклеотиды.

SNP Последовательность Расстояние от стартового кодона ChEST985k21 (п.н.) Транскрипционные факторы

S2_l GATCAGYAGTAAA -958 АР4

S3_l CATTTTRCTCTCA -190 F2F

S3_2 GTTCAGYGTGGTC -288 AML1

S3_3 TGTAAAYGCAGCA -267 POUR1F1

S3_4 CAGAATYGCACAG -236 EFII

S6_l AGTTTTYGGGTGC +1920 MBF-1

Таблица 5. Последовательности аллелеспецифических олигонуклеотидов-праймеров для генотипирования кур по аллелям г8М\ обнаруженным в последовательности С11523443

гБИР Последовательности праймеров

ЯТ2_1 ир_Т: СТССТСАОТОТСТТАОТСТСАТСАаТ ир_С: СТОСТСАОТОТСТТАСТСТСАТСАСС Бп: АСАСТСАТСАТОАСОАААСАСО

8ТЗ_1 ир_в: ОСОАСТСАСТСАСТСАТТТТС иР_А: СССОАСТСАСТСАСТСАПТТА Бп: АССАОААССТССАААСТССА

8ТЗ_2 ир_Т: ТТССТСТСАТТААТТААТаАОТТСАОТ ир_С: ТТССТСТСАТТААТТААШАОТТСАОС Бп: АОААООААОАОАССГАТСААССАОТ

БТЗ_3 1)р_Т: ТСОТСАСАСОТСССТСТАААТ ир_С: ТССТСАСАООТСССТСТАААС Ва: САТССТСАСОСАСТССАТАТТ

БТЗ_4 ир_Т: АТАССССААТССШСАОААТТ ир~С: АТАОСССААТССГССАОААТС опГассаоаасстссааастсса

8Т6_1 ир_Т: тоаосттатоаатсттссаоттттт ир_С: тоассттатоаатсттссаоттттс Бп: ТСААСАГтТООАААОТАОАТАСАСА

Таблица 6. Встречаемость аллелей тБЫР в группах с тонкой и толстой скорлупой. * - Р<0,05. ** - Р<0,01.

Группы кур

гБМ»

БТ2 1*

8ТЗ ^

БТЗ 2*

БТЗ 3

БТЗ 4

БТ6 1

Тонкая скорлупа (315,7±21,38 мкм)_

22

68

30

60

64

26

32

58

43

47

49

Толстая скорлупа (389,9±13,09 мкм)_

35

65

21

77

60

38

39

63

41

45

42

Таблица 7. Различия по толщине скорлупы яйца в генотипических классах. *-Р<0,05. **-Р<0,01.

гБИР БТ2 1

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 389±32,97 349,5±43,48** 350,7±38,43**

гБИР БТЗ 1

Генотип АА Ав

Толщина скорлупы (мкм) 335,7^21,62 351,4*37,54 359,47±33,65*

БТЗ 2

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 351,1±43,86 352,5±39,92 374,2±33,65*

г8М> БТЗ 3

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 335,3±12,99 363,39±40,68** 345,94±42,71

гБЫР БТЗ 4

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 342,5*51,06 352,6±39,05 357,1±43,98

гБИР БТ6 1

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 342,6±41,35 366,7±32,58* 350,6±46,20

Обсуждение

Последовательность CR523443 длиной 2102 пар оснований, представляющая собой клон полностью секвенированной комплементарной ДНК ChEST985k21 домашней курицы, впервые была найдена в матричной РНК, экстрагированной из мышц взрослых птиц, и затем обнаружена в мозге, хрящевой ткани и в женских гениталиях (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene). Анализ CR523443 с помощью компьютерной программы BLAST не выявил гомологичных последовательностей у других позвоночных животных.

Использование ПЦР с аллелеспецифическими праймерами позволило установить наличие достоверных различий по частотам аллелей полиморфных сайтов ST2_1, ST3__1, ST3_2 и ST3_3 в группах кур породы род-айленд с толстой и тонкой скорлупой яйца (Таблица 6). Это свидетельствует о возможной связи генотипов по этим полиморфным сайтам с изучаемым признаком. Установлено также, что толщина скорлупы достоверно различается в генотипических классах по rSNP ST2_1, ST3_1, ST3_2, ST3_3 и ST6_1 (Таблица 6). Причем, в случае ST2_1 как гетерозиготные особи так и гомозиготы по аллелю Т отличаются от особей дикого типа на уровне значимости 0,01. Для этого сайта выявлено также достоверное различие частот аллелей в группах с толстой и тонкой скорлупой яйца, что может быть интерпретировано как наибольшая связь rSNP ST2_1 с проявлением изучаемого признака. Интересно, что в случаях ST3_3 и ST6_1 гетерозиготы обладали значительно большей толщиной скорлупы, чем представители обоих гомозиготных генотипических классов (Таблица 6). А в случаях ST3_1 и ST32 влияние генотипа на изучаемый признак было обнаружено только у гомозигот по мутантной аллели.

Учитывая наличие связи описанных полиморфных вариантов с толщиной скорлупы у специализированной породы яичного направления род-айленд и неспециализированной локальной породы польская зеленоногая куропатчатая, которые имеют совершенно различное происхождение, можно сделать вывод о широкой распространенности и, возможно, универсальности данного явления. Кроме того, большинство промышленных кроссов получены на основе породы род-айленд, что определяет исключительное значение этой породы для птицеводства яичного направления.

Таким образом, выявленные различия позволяют говорить о создании системы генотипирования Gallus gallus по аллелям rSNP, вероятно оказывающих влияние на толщину скорлупу яйца. Оптимизация толщины скорлупы яйца имеет большое экономическое значение, поскольку может помочь уменьшить потери птицеводческой продукции при транспортировке. Предполагается применение системы молекулярно-генетических маркеров для

получения новых линий и кроссов несушек с оптимизированной толщиной скорлупы.

Выводы

1. Группы кур породы польская зеленоногая куропатчатая, имеющих тонкую и толстую скорлупу яиц, достоверно различаются по уровню экспрессии последовательности СЛ523443 (Р<0,01). Коэффициент корреляции уровня экспрессии гена С11523443 и толщины скорлупы составляет 0,85.

2. В пределах последовательности СЛ523443 присутствуют 6 сайтов мононуклеотидного полиморфизма (БКР): 5 - в регуляторной области (Б2_1, 831, Б3_2, Б3_3 и 83_4) и 1 — в кодирующей (86_1).

3. Все полученные БМ» являются регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами (гБИР), поскольку для каждого из них выявлены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов.

4. В 1руппах кур породы род-айленд с толстой (389.9 ± 13.09 мкм) и тонкой (315.7 ± 21.38 мкм) скорлупой яйца имеются достоверные различия по частотам аллелей полиморфных сайтов 8Т2_1,8ТЗ_1,8ТЗ_2 и 8ТЗ_3.

5. В этих же группах птиц существуют достоверные различия по толщине скорлупы в генотипических классах по аллелям гБ1ЧР БТ2_1, 8ТЗ_1, БТЗ_2, 8ТЗ_Э и 8Т6_1.

6. Попарное сравнение влияния ЛИР на толщину скорлупы яиц свидетельствует о наличии аддитивного эффекта в случаях пар 8Т2_1/8ТЗ_1, 8Т2_1/8ТЗ_2, 8Т2_1/8ТЗ_3, 8Т2_1/8Т6_1, 8ТЗ_1/8ТЗ_2, 8ТЗ_1/8Т6_1, 8ТЗ_2/8ТЗ_3,8ТЗ_2/8Т6_1 и 8ТЗ_3/8Т6_1.

Практические предложения

Результаты представленной к защите работы рекомендуется использовать в качестве систем молекулярных маркеров для маркерной селекции несушек с целью оптимизации толщины скорлупы. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе в высших учебных заведениях биологического, сельскохозяйственного и ветеринарного профилей.

Список публикаций по теме диссертации

В журналах и других изданиях, рекомендованных ВАК России:

1. Баркова, О.Ю. Мононуклеотидные полиморфные маркеры (SNP), связанные с -признаком толщина скорлупы домашней курицы / О.Ю Баркова, АЛ. Сазанова, И.Ю. Благовещенский, К.А. Фомичев, А.А. Сазанов // Достижения науки и техники АПК. - 2010. - № 4. - С. 64-65.

2. Sazanov, A. QTL in chicken: a look back and forward - a review / A. Sazanov, A. Sazanova, 0. Barkova, K. Jaszczak //Animal Science Papers and Reports -2010. -V. 28. - № 4. - P. 307-314.

3. Barkova, O.U. / Design of a system for genotyping of Gallus gallus based on the rSNP (regulatory single nucleotide polymorphism) alleles affecting the egg shell thickness / O.U. Barkova, A.L. Sazanova, I.U. Blagoveshenskiy, K.A. Fomichov, T. Malewski, A.A. Sazanov // Russian Journal of Genetics. - 2011. - V. 47. - №. 2, - P. 216-220.

В материалах научных конференций:

4. O.Iu. Barkova / QTL in chicken / A.A. Sazanov, A.L. Sazanova, O.Iu. Barkova, K. Jaszczak // Proceedings of conference "Functional genomics and its application in meat and milk quality". - 2009. - Jastrzebiec/Warsaw. - P. 68-78.

Подписано в печать 7.02.2011 г. Формат 60X84 1/16 Бумага офсетная. Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 22

Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИМЭСХ