Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление аллельных вариантов нуклеотидной последовательности CR523443 и их связи с признаком толщина скорлупы яйца у домашней курицы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Выявление аллельных вариантов нуклеотидной последовательности CR523443 и их связи с признаком толщина скорлупы яйца у домашней курицы"

на правах рукописи

БАРКОВА Ольга Юрьевна

ВЫЯВЛЕНИЕ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ СК523443 И ИХ СВЯЗИ С ПРИЗНАКОМ ТОЛЩИНА СКОРЛУПЫ ЯЙЦА У ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ

Специальность 03.02.07 - генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

1 9 МАЙ 2011

4847105

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации генома

Государственного научного учреждения Всероссийский научно исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель: доктор биологических наук А.А. Сазанов Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт

экспериментальной медицины СЗО РАМН

Защита состоится «...».......2011 г. в 11 часов на заседании диссертационного

совета Д 006.012.01 по защите докторских диссертаций в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии

по адресу: 196601, Санкт-Петербург - Пушкин, Московское шоссе 55-а. Факс: (812) 465 99 89

е.таП: spbvniigen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан «...»......2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

В.П.Терлецкий (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН) кандидат биологических наук Е.Г.Неронова (Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России)

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наибольшее значение для продуктивности сельскохозяйственных животных имеют количественные признаки, проявление которых контролируется генами, расположенными в QTL - локусах количественных признаков. Исследования QTL имеют значение как для общей генетики, одним из разделов которой является генетика количественных признаков, так и для практической селекции, поскольку позволяют маркировать хозяйственно ценные признаки и создавать системы для маркерной селекции.

В предшествующие годы нами проведен ряд экспериментов по позиционному клонированию района хромосомы 4 домашней курицы, содержащего QTL толщины скорлупы на 53 неделе жизни (ST53). Методом гибридологического анализа косегрегации микросателлитных ДНК-маркеров и количественных признаков определены маркеры интервалов генетической карты (районов хромосом), контролирующих QTL ST53. С использованием баз данных компьютерной сети Интернет показана локализация количественного признака ST53 в пределах интервала, ограниченного микросателлитными локусами MCW0114 и ADL0241. Определены координаты тринадцати клонов, имеющих гомологию последовательностей ДНК вставки с микросателлитными локусами MCW0114 и ADL0241. Проверка клонов на предмет наличия искомой последовательности методом ПЦР с использованием праймеров для микросателлитных локусов MCW0114 и ADL0241 позволила установить соответствие девяти ВАС-клонов локусу MCW0114 и четырех ВАС-клонов локусу ADL0241. Методом флуоресцентной гибридизации ДНК-ДНК in situ (FISH) установлена внутрихромосомная локализация ВАС-клонов, содержащих микросателлитные локусы. Установлено следующее положение микросателлитных маркеров локуса ST53 на GGA4 (хромосома курицы 4): MCW0114 - 17.834.202-17.834.699 п.и. и ADL0241 - 16.643.314-16.643.645 п.н. Полученный интервал величиной 1,2 млн.п.н. является критическим для признака ST53.

Идентифицировано 20 генов, являющихся позиционными кандидатами для признака ST53. У кур неспециализированной породы польская зеленоногая были выявлены достоверные (на уровне значимости 0,01) двукратные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой яйца по уровню экспрессии последовательности CR523443. Коэффициент корреляции между уровнем экспрессии этой последовательности и толщиной скорлупы составил 0,85 (Химанина и др. Сельскохозяйственная биология. 2008. №6. С. 40-43).

Представленная работа посвящена поиску аллель ных вариантов экспрессирующейся последовательности CR523443 и изучению их связи с толщиной скорлупы яйца у домашней курицы.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является выявление аллельных вариантов экспрессирующейся последовательности (EST) CR523443 и изучение связи отдельных аллелей этой EST с толщиной скорлупы яйца на 53-ей неделе жизни курицы-несушки.

Поставлены следующие задачи:

- ПЦР-амплификация регуляторной и кодирующей областей EST CR523443, экспрессия которой связана с толщиной скорлупы яйца

- выявление сайтов однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в пределах регуляторной и кодирующей областей EST CR523443, экспрессия которой связана с толщиной скорлупы яйца, путем секвенирования их последовательностей

- поиск сайтов связывания транскрипционных факторов в выявленных полиморфных районах

- анализ частот встречаемости аллелей выявленных полиморфных сайтов в группах кур с тонкой и толстой скорлупой яйца

- сравнение толщины скорлупы яйца в различных генотипических классах по выявленным полиморфным сайтам.

Научная новизна работы. Получены последовательности 6 пар праймеров для амплификации последовательностей регуляторной и кодирующей областей EST CR523443, удовлетворяющих условиям секвенирования. Методом секвенирования регуляторной и кодирующей областей EST CR523443 выявлено 6 регуляторных сайтов однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в пределах данной последовательности, из них 5 - в регуляторной области (S2_l, S3_l, S3_2, S3_3 и S3_4) и 1 — в кодирующей (S6_l). Для всех обнаруженных SNP выявлены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов, что дает основания считать их rSNP - регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами. Методом ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров проведен анализ связи обнаруженных в представленной работе rSNP с толщиной скорлупы яйца у домашней курицы. Выявлены достоверные различия по частотам аллелей полиморфных сайтов ST2_1, ST3_1, ST3J2 и ST3_3 в группах кур породы

род-айленд с толстой и тонкой скорлупой яйца. При проведении попарного сравнения влияния rSNP на толщину скорлупы яйца обнаружен аддитивный эффект в случаях пар ST2_1/ST3_1, ST2_1/ST3_2, ST2_1/ST3_3, ST21/ST61, ST3_1/ST3_2, ST3_1/ST6_1, ST3_2/ST3_3, ST3_27ST6_1 и ST3_3/ST6_1.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты представленной к защите работы использованы при составлении банка данных нуклеотидных последовательностей (www.nlm.ncbi.nih.gov) в сети Интернет. Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре естествознания и географии Ленинградского государственного университета им. A.C. Пушкина в рамках курсов «Генетика с основами селекции» и «Молекулярная биология».

Апробация работы. Материалы работы были представлены на международной научной конференции «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных» (Санкт-Петербург, 2009), научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных» (Ярославль, 2009), конференции "Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России" (Сергиев Посад, 2009), международной конференции «Функциональная геномика в повышении качества продукции животноводства» (Варшава, 2009). Результаты периодически докладывались на семинарах отдела молекулярной генетики и биотехнологии ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН. Исследования проводили в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН по теме «Разработать систему молекулярно-генетических маркеров, обеспечивающих повышение эффективности селекции сельскохозяйственных животных» (номер государственной регистрации 01.200.118843).

Публикация результатов. Материалы, представленные в диссертации, были опубликованы в научных журналах «Достижение науки и техники АПК», «Animal Science Papers and Reports»" и "Генетика". Всего по теме работы опубликовано 4 печатные работы, из них 3 статьи и \ тезис.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц, 12 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Практические предложения» и «Список литературы». Список цитированной литературы насчитывает 10 русских и 122 иностранных названий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ПЦР-амплификация регуляторной и кодирующей областей EST CR523443.

2. Однонуклеотидные полиморфные сайты (SNP) в пределах экспрессирующейся последовательности CR523443.3. Сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов регуляторных SNP в пределах EST CR523443.

3. Частоты аллелей однонуклеотидных полиморфных сайтов в EST CR523443 в группах кур с толстой и тонкой скорлупой яиц.

4. Различия по толщине скорлупы яйца в генотипических классах по аллелям rSNP в EST CR523443.

5. Аддитивный эффект аллелей различных регуляторных SNP в EST CR523443 на толщину скорлупы яйца.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Материал и методы

Материал. Для секвенирования были использованы 6 образцов ДНК от шести кур породы польская зеленоногая куропатчатая (те же особи, что и для анализа экспрессии генов-кандидатов в работе Ю.А. Химаниной с соавторами (Сельскохозяйственная биология. 2008. №6. С. 40-43). Для генотипирования был использован 91 образец ДНК кур породы род-айленд из двух групп с толщиной скорлупы 389,9 ± 13,09 мкм (46 особей), и 315,7 ± 21,38 мкм (45 особей). Методы.

Выделение геномной ДНК

500 мг замороженной ткани яйцевода гомогенизировали. К полученному гомогенату добавляли 5 мл гомогенизирующего буфера (ЮмМ Трис, ЮмМ ЭДТА, рН=8.0) и 50 мкл раствора РНКазы А (1мг/мл), хорошо перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 30 минут. После инкубации к смеси добавляли еще 2,5 мл гомогенизирующего буфера и 10% SDS до 1% от общего объема смеси. Лизис проводили при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего к лизату добавляли 2М NaCl до конечной концентрации 0,2М и равный объем охлажденного фенола. Смесь лизата с фенолом интенсивно перемешивали в течение 10 минут и центрифугировали в течение 20 минут при 4000 об/мин. Затем очень аккуратно переносили верхнюю (водную) фазу в

б

новую пробирку и повторяли экстракцию фенолом еще 1-2 раза. После центрифугирования переносили водную фазу в новую пробирку, добавляли равный объем смеси 1 : 1 (по объему) фенола и хлороформа, интенсивно перемешивали в течение 10 минут и центрифугировали в течение 20 минут при 4000 об/мин. Водную фазу аккуратно переносили в новую пробирку, добавляли равный объем хлороформа, интенсивно перемешивали в течение 10 минут и центрифугировали в течение 20 минут при 4000 об/мин. После центрифугирования водную фазу переносили в новую пробирку, добавляли 0,1 объема ЗМ CH3COONa и 2,5 объема 96% этанола, мягко перемешивали и инкубировали при -20°С в течение 30 минут. Затем осаждали ДНК центрифугированием при 13000 об/мин в течение 15 минут, удаляли супернатант, осадок ополаскивали 70% этанолом и после 10-минутного центрифугирования при 13000 об/мин супернатант удаляли, а осадок подсушивали на воздухе и растворяли в 150 - 200 мкл дистиллированной воды.

Анализ in silico и подбор праймеров

Анализ in silico проводили с использованием баз данных полного сиквенса генома домашней курицы

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9031 и

http://www.ensembl.org/Gallus_gallus/). Подбор олигонуклеотидов-праймеров для секвенирования регуляторного и части кодирующего районов экспрессирующейся последовательности CRS23443 проводили на основании информации баз данных сети Интернет (www.nlm.ncbijiih.gov и www.ensembl.org) при помощи компьютерной программы PR1MER_3 (wwwgenome.wi.mit.edu). Специфичность и отсутствие возможной внутригеномной гомологии полученных последовательностей праймеров проводили при помощи пакета программ BLAST с варьирующими параметрами величины окна, допустимого процента идентичности пар оснований, фильтрации повторов. С целью подбора оптимальных длин и взаимного расположения фрагментов ДНК, предназначенных для секвенирования, было проанализировано 2 т.п.н. в направлении 5' от старт-кодона и 1,5 т.п.н. в пределах открытой рамки считывания. Получены последовательности 6 пар праймеров для амплификации последовательностей, удовлетворяющих условиям секвенирования (Таблица 1).

Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидов-праймеров для амплификации и секвенирования фрагментов регуляторной и кодирующей областей ЕБТ СЯ523443

Фрагмент Последовательности праймеров

ST53Seq_l FW: AGCAAAGGCAAGCTCGTAAG RV: TTTTCTGCTTTAGAAGTCCTGCTT

ST53Seq_2 FW: AGTTGCTGAGTACCTCAAACTACA RV: TTCCAAGGTAAAGACAGAAGTCG

ST53Seq_3 FW: TGTGAAATGTAAGGGGGTTG RV: AGCAGAACCTCCAAACTCCA

ST53Seq_4 FW: CTCAGGATGGTGGAGTTTGG RV: TGCGACAGGAATCCAATACA

ST53Seq_5 FW: TGGATTCCTGTCGCATTAGTC RV: GCAAACACCTCGATTGCTCT

ST53Seq_6 FW: GTGCTGAGTATGGGGTGCTT RV: TCAAGGCTTCAACGTCACTC

Амплификация ДНК при помощи ПЦР

Проведены эксперименты по ПЦР-амплификации 6 фрагментов регуляторной и кодирующей областей последовательности CR523443. Проведено по 6 реакций ПЦР на 6-ти биологических образцах в трех технических повторностях. Смесь для амплификации включала 240 нг ДНК-матрицы, буфер для реакции (20мМ Трис-HCl, pH 8.4, 50 мМ КС!), дезоксирибонуклетидтрифостаты (200мкМ каждого), 1.5 мМ MgCl2, 1.25 единицы iTaq полимеразы (Bio-Rad, США) и 10 пМ каждого праймера. Конечный объем реакционной смеси был равен 25 мкл. Амплификацию ДНК проводили с использованием амплификатора 1Q-5 (Bio-Rad, США). Реакцию проводили в следующем режиме: 95° С - 5 минут; 95° С - 30 секунд, 60° С 30 секунд, 72° С - 1 минута (30 циклов); 72° С - 7 минут; 7° С - хранение. После полимеразной цепной реакции производили переосажцение полученных фрагментов с помощью этанола и растворяли в дистиллированной воде до концентрации 10-20 нг/мкл.

Подготовка образцов для секвенирования.

Полимеразную цепную реакцию для секвенирования проводили в соответствие с рекомендациями производителя (Applied Biosystems, США). К препарату ДНК (25-40 нг) добавляли 1 мкл праймера (Таблица 2) (3 пМ), 8 мкл

Big Dye Terminator Sequencing Mix, деионизованную воду до 20 мкл и аккуратно перемешивали, после чего пробирки помещали в амплификатор IQ5 (Bio-Rad, США). Полимеразную цепную реакцию проводили в следующем режиме: 96° С - 1 минуту; 96° С - 10 секунд, 50° С - 5 секунд, 60° С - 4 минуты (25 циклов); 7° С - хранение. После полимеразной цепной реакции производили переосаждение полученных фрагментов с помощью этанола. Далее добавляли 20 мкл фирменного реактива Applied Biosystems - HiFiFormamide и денатурировали фрагменты ДНК при 95° С в течение 5 минут, после чего образцы инкубировали при -20° С в течение 5-10 минут.

Секвенирование ДНК

Электрофоретическое разделение полученных фрагментов и анализ их нуклеотидной последовательности проводили автоматически при помощи секвенатора ABI3130 (Applied Biosistems, США).

Выявление сайтов связывания транскрипционных факторов

Сайты связывания транскрипционных факторов выявляли при помощи программы TESS (http://www.cbil.upenn.edu) при условии полной комплементарности исследуемой последовательности и представленной в базе данных TRANSFAC v.6 (http://www.cbil.upenn.edu). Учитывали только те сайты связывания транскрипционных факторов, которые присутствовали в одном из аллельных вариантов SNP и отсутствовали в другом и имели вероятность связывания равную 90% или более, что является максимально строгим значением при задании условий поиска.

Генотипирование

Использованные в работе аплелеспецифические праймеры представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Последовательности аллелеспецифических олигонуклеотидов-праймеров для генотипирования кур по аллелям rSNP, обнаруженным в последовательности CR523443

rSNP Последовательности лраймеров

ST2_1 Up_T: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGT Up_C: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGC Dn: ACAGTCATGATGAGGAAACAGG

ST3_1 Up_G: GCGACTCACTCACTCATTTTG Up_A: GGCGACTCACTCACTCATTTTA Dn: AGCAGAACCTCCAAACTCCA

ST3J2 Up_T: TTGCTCTCATTAATTA ATGAGTTCA GT Up_C: TTGCTCTCATTAATTAATGAGTTCAGC Dn: AGAAGGAAGAGAGGTATCAACCAGT

ST3_3 Up_T: TGGTCACAGGTGCCTGTAAAT Up_C: TGGTCACAGGTGCCTGTAAAC Dn: CATCCTGAGGCACTGCATATT

ST3_4 Up_T: ATAGCCCAATCCTGCAGAATT Up_C: ATAGCCCAATCCTGCAGAATC Dn: AGCAGAACCTCCAAACTCCA

ST6_1 Up_T: TGAGCTTATGAATCTTGCAGTTTTT Up_C: TGAGCTTATGAATCTTGCAGTTTTC Dn: TCAACATTGTGGAAAGTAGATACAGA

Амплификацию ДНК при помощи ПЦР проводили с использованием амплификатора 1Q-5 (Bio-Rad, США) в следующем режиме: 95° С - 5 минут; 95° С - 30 секунд, 60° С 30 секунд, 72° С -1 минута (30 циклов); 72° С - 7 минут, 7° С - хранение. Полученные фрагменты ДНК разделяли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Статистическую обработку результатов

генотипирования проводили путем сравнения частот аллелей rSNP в группах с тонкой и толстой скорлупой при помощи критерия х2 и сравнения толщины скорлупы в различных генотипических классах при помощи критерия Сгьюдента.

2.2. Результаты

У каждой из шести кур неспециализированной породы польская зеленоногая с выраженными различиями по толщине скорлупы амгошфицировали шесть фрагментов регуляторной и кодирующей областей экспрессирующейся последовательности CR523443, оказывающей существенное влияние на количественный признак толщина скорлупы яйца домашней курицы. Секвенирование этих фрагментов позволило выявить 6 сайтов мононукпеотидного полиморфизма (БКР) в пределах последовательности СЯ523443, из них 5 - в регуляторной области (Б2_1, 831, 83_2, Б3_3 и Б3_4) и 1 — в кодирующей (86_1). Сайты связывания транскрипционных факторов шести обнаруженных были выявлены при помощи программы ТЕББ при условии полной комплементарное™ исследуемой последовательности и представленной в базе данных TRANSFAC

и максимально строгих по возможностям программы критериях отбора (Таблица 3).

Таблица 3. Сайты связывания транскрипционных факторов в БЫР регуляторной и кодирующих областях экспрессирукмцейся последовательности С11523443. Жирным шрифтом выделены полиморфные нуклеотиды.

SNP Последовательность Расстояние от стартового кодона ChEST985k21 (п.н.) Транскрипционные факторы

S2_l GATCAGC/TAGTAAA -958 АР4

S3J CATTTTA/GCTCTCA -190 F2F

S3J2 GTTCAGC/TGTGGTC -288 AML1

S3_3 TGTAAAC/TGCAGCA -267 POUR1F1

S3_4 CAGAATC/TGCACAG -236 EF1I

S6_l AGTTTTC/TGGGTGC +1920 MBF-1

Следует отметить, что во всех обнаруженных нами в данной работе были найдены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов, что дает основания считать, что эти полиморфные сайты, вероятно, являются гБКР -регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами.

Проведен анализ влияния гБМ? на толщину скорлупы яйца у домашней курицы методом ПЦР с использованием аллелеспецифических лраймеров (Таблица 2). Выявлены достоверные различия по частотам аллелей полиморфных сайтов БТ2_1, 8Т31, и БТЗ_2 в группах кур породы род-айленд с толстой и тонкой скорлупой яйца (Таблица 4).

Таблица 4. Встречаемость аллелей гБ№ в группах кур с тонкой и толстой скорлупой яйца. * - Р<0,05. ** - Р<0,01.

Группы кур rSNP

ST2 1* ST3 1** ST3 2* ST3 3 ST3 4 ST6 1

С Т А G С Т с Т С Т С Т

Тонкая скорлупа (315,7±21,38 22 68 30 60 64 26 32 58 43 47 49 41

мкм)

Толстая 35 65 21 77 60 38 39 63 41 45 42 52

скорлупа

(389,9±13,09

мкм)

Установлено, что толщина скорлупы яйца достоверно различается в генотипических классах по гБИР 8Т2_1,8ТЗ _1, БТЗ_2,8ТЗ_3 и 8Т6_1 (Таблица 5).

Таблица 5. Различия по толщине скорлупы яйца в генотипических классах. *-Р<0,05. **-Р<0,01.

8Т2 1

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 389±32,97 349,5±43,48** 350,7±38,43**

гёИР 8ТЗ 1

Генотип АА Аб се

Толщина скорлупы (мкм) 335,7±21,62 351,4±37,54 359,47±33,65*

гёЫР 8ТЗ 2

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 351,1±43,86 352,5±39,92 374,2±33,65*

ЙЫР 8ТЗ 3

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 335,3±12,99 363,39±40,68** 345,94±42,71

ЙОТ 8ТЗ 4

Генотип СС СТ ТТ

Толщина скорлупы (мкм) 342,5±51,06 352,6±39,05 357,1±43,98

гёЫР 8Т6 1

Генотип СС СТ ТТ

Толщина 342,6±41,35 366,7±32,58* 350,6±46,20

скорлупы (мкм) I___

Проведено попарное сравнение эффекта разных SNP, выявленных в регуляторной и кодирующей частях EST CR523443, оказывающей влияние на толщину скорлупы яйца у домашней курицы (Рисунки 1 - 4).

При попарном сравнении влияния rSNP S2_l и S3_l толщина скорлупы яиц у несушек, имеющих генотипы TTAG (356,7 мкм) достоверно отличалась от таковой у птиц генотипа ТТАА (Р<0,05). Сравнение влияния на изучаемый признак rSNP S2_l и S3_2 показало, что существуют достоверные различия между птицами с генотипами СТТТ (390,3 мкм) и СТСС (333 мкм), ТТСС (342,5 мкм), ТТСТ (354,7мкм) (Р<0,01). Несушки, имеющие генотип СССС (385,2 мкм) отличаются от птиц с генотипом СТСС (333 мкм) на уровне значимости Р<0,01, а от особей с генотипами СТСТ (344,1 мкм), ТТСС (342,5 мкм), ТТСТ (354,7 мкм) - на уровне значимости Р<0,05. Попарное сравнение влияния rSNP S2_l и S3_3 на толщину скорлупы яиц. У несушек, имеющих генотип ССТТ среднее значение толщины скорлупы яйца было равным 384,4 мкм, что достоверно отличается от такового у кур с генотипами СТТТ (333 мкм)( на уровне значимости Р<0,01), ТТСС (335,3 мкм) и ТТТТ (335,3 мкм) (Р<0,05). Сравнение толщины скорлупы яиц у особей, имеющих разны генотипы по SNP S2_l и S6_l показало, что несушки с генотипом СССС (398,5 мкм) достоверно отличаются от кур, имеющих генотипы СТСС (307,9 мкм), СТГТ (365,8 мкм), ТТСС (337,9 мкм), ТТСТ (358,1 мкм) и ТТТТ (325,8 мкм) на уровне значимости Р<0,01. Куры с генотипом СССТ (392,28 мкм) имели достоверно более толстую скорлупу яйца, чем особи, имеющие генотипы СТСС (307,9 мкм), ТТСС (337,9 мкм) (Р<0,01), а также ТТСТ (358,1 мкм) и ТТТТ (325,8 мкм) (Р<0,05). Наиболее неблагоприятным в отношении толщины скорлупы яйца оказался генотип СТСС. Птицы с таким генотипом имели самую тонкую скорлупу яиц- 307,9 мкм и достоверно отличались по данному признаку от несушек, имеющих генотипы СТСТ (382,5 мкм), СТТТ (365,8 мкм) (Р<0,01) и ТТСС (337,9 мкм). Дигетерозиготные куры СТСТ (382,5 мкм) имели достоверно более толстую скорлупу по сравнению с особями генотипа ТТСС (337,9 мкм) и ТТТТ (325,8 мкм) на уровне значимости Р<0,05. Сравнение влияния на изучаемый признак rSNP S3_l и S3_2 показало, что особи с генотипом AGTT (383,9 мкм) имеют достоверно более толстую скорлупу яиц по сравнению с курами генотипа AGCC (354,6 мкм) (Р<0,05). Несушки, имеющие генотип GGTT (383,9) также имели достоверно более толстую скорлупу яиц, чем птицы с генотипами AGCT (351,8 мкм) и GGCC (350,3 мкм) на уровне значимости Р<0,05. При сравнении влияния rSNP S3_l и S6_l на изучаемый признак нами были выявлены достоверные различия по толщине скорлупы яйца

между курами, имеющими генотипы GGCT (382,3 мкм) и А GTT (340 мкм), AGCC (327 мкм)(Р<0,05). Птицы генотипа GGCT достоверно отличались также от несушек с генотипом GGCC (334,5 мкм)(Р<0,01). В результате сравнения влияния на толщину скорлупы яйца rSNP S3_2 и S3_3 были обнаружены достоверные различия по данному признаку между курами, имеющими генотип ТТСТ (384,1 мкм) и особями генотипа СССТ (355,9 мкм), СТСТ (358,2 мкм) (Р<0,05), СТСС (335,3 мкм), ССТТ (344,9 мкм) (Р<0,01). Толщина скорлупы яиц у дигетерозигот СТСТ была достоверно больше таковой у кур с генотипом СТСС (Р<0,05). Попарное сравнение влияния rSNP S3_2 и S6_l на толщину скорлупы яиц. Достоверные различия по толщине скорлупы яйца выявлены при

сравнении кур с генотипами СССС (355,9 мкм) и ССТТ (315,1 мкм) (Р<0,05), I СТСС (300,1 мкм) (Р<0,01); СТСТ (362 мкм) и ССТТ (315,1 мкм), СТСС L

(Р<0,003) а также СССТ (373,4 мкм) и СТСС, ССТТ (Р<0,001). Сравнение влияния на изучаемый признак 83_3 и Я 61 показало, что существуют достоверные различия между птицами с генотипами СТТТ (373,4 мкм) и особями, имеющими генотипы СТСС (300,3 мкм), ТТСС (314,8 мкм), ТТТТ (316,5 мкм) (Р<0,001), СССТ (335,3 мкм) (Р<0,01). Особи с генотипом СССТ также достоверно отличаются от кур генотипа СТСС, ТТСС (Р<0,05) и СТСТ (374,3 мкм) (Р<0,01). Выявлены также достоверные различия между несушками, имеющими генотип СТСТ и ТТТТ, ТТСС (Р<0,001).

Рисунок 1. Влияние гаплотипов rSNP ST21 и ST6 1 на толщину скорлупы яйца.

1390 й 380-S370-|зео

|350 S 340 5 330 f 320' ¿3310 300

ST2_1 - генотип "■-CT

ST6_! - генотип

БТ 3_?. ГЕНОТИП

— - сс

вТ6_1 - генотип

Рисунок 2. Влияние гаплотипов rSNP 8Т3 2 и 8Т61 на толщину скорлупы яйца.

ЯТ2_1 - ГЕНОТИП — -СТ

вТ 3_ 2- генотип

Рисунок 3. Влияние гаплотипов 5Т21 и 8ТЗ_2 на толщину скорлупы яйца.

1 420

% 3901 380-

| это-

8 380л 350-| 340-| 330 320-

БТЗ_1 - генотип — -АС

дН 11 |,И-_

ссст тт

8Т6_1 —генотип

Рисунок 4. Влияние гаплотипов гЭКФ БТЗ ! и БТб ! на толщину скорлупы яиц.

23. Обсуждение

Экспрессирующаяся нуклеотвдная последовательность CR523443 имеет длину 2102 п.н. Она впервые была обнаружена в матричной РНК, выделенной из мышц взрослых птиц. Позднее эта последовательность была обнаружена в головном мозге, хрящевой ткани и в женских гениталиях (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene). Проведенный ранее анализ CR523443 с помощью компьютерной программы BLAST не выявил гомологичных последовательностей у других классов позвоночных животных (Химанина и др. Сельскохозяйственная биология. 2008. №6. С. 40-43).

В нашем исследовании мы амплифицировали шесть фрагментов регуляторной и кодирующей областей экспрессирующейся последовательности CR523443, оказывающей существенное влияние на количественный признак домашней курицы толщина скорлупы яйца на 53 неделе жизни несушки, у каждой из шести кур неспециализированной породы польская зеленоногая с выраженными различиями по толщине скорлупы. Секвенирование этих фрагментов позволило выявить 6 сайтов мононуклеотидного полиморфизма (SNP) в пределах последовательности CR523443, из них 5 - в регуляторной области (S2_l, S3_l, S3_2, S3_3 и S3_4) и 1 — в кодирующей (S6_l). Для консервативных последовательностей, содержащих SNP, нами выявлены сайты связывания транскрипционных факторов (Таблица 4). Так для 2-й пары праймеров нами выявлен сайт связывания факторов транскрипции АР4 расстояние -958 п.н. от стартового кодона. Для 3-й пары праймеров нами выявлено четыре сайта связывания транскрипционных факторов:

- сайт S3_l - выявлен F2F (АТТТТА) (только А-вариант) расстояние -190 п.н.

- сайт S3_2 - AMLla (TGTGGT) (только Т-вариант), расстояние от стартового кодона- 288 п.н

- сайт S3_3 - выявлены POURlFla (ТАААТ) (только Т-вариант) и YY1 АААТС (только Т-вариант), расстояние -267 п.н.

- сайт S3_4 был выявлен EF II ATTGCA (только Т-вариант) который известен у домашней курицы, расположенного -236 п.н. от стартового кодона гена CR523443 курицы.

Для 6-й пары праймеров - обнаружен один сайт связывания транскрипционного фактора MBF-1 (TTTTGG) (только Т-вариант), расстояние +1920 п.н. от стартового кодона. Следует отметить, что во всех полученных SNP были найдены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов, что дает основания

считать, что эти полиморфные сайты, вероятно, являются гБ№ -регуляторными однонуклеотидными полиморфными сайтами сайтами (Ропошагепко й а1., 2002). Интересно, что в нашей работе все аллельные варианты определяющие связывание с транскрипционными факторами -репрессорами были связаны с более низким уровнем экспрессии последовательности С11523443 и меньшей толщиной скорлупы. Аллели, определяющие связывание с транскрипционными факторами - активаторами, чаще всречались у особей с более высоким уровнем экспрессии СЯ523443 и большей толщиной скорлупы.

Использование ПЦР с аллелеспецифическими праймерами позволило установить наличие достоверных различий по частотам аллелей полиморфных сайтов БТ2_1, 8ТЗ_1, БТЗ_2 и БТЗ_Э в группах кур породы род-айленд с толстой и тонкой скорлупой яйца (Таблица 6). Это свидетельствует о возможной связи генотипов по этим полиморфным сайтам с изучаемым признаком. Установлено также, что толщина скорлупы достоверно различается в генотипических классах по гБТЯР БТ2_1, 8ТЗ_1, БТЗ_2, БТЗ_3 и БТ6_1 (Таблица 5). Причем, в случае БТ2_1 как гетерозиготные особи, так и гомозиготы по аплелю Т отличаются от особей дикого типа на уровне значимости 0,01. Для этого сайта выявлено также достоверное различие частот аллелей в группах с толстой и тонкой скорлупой яйца, что может быть интерпретировано как наибольшая связь гБЫР 8Т2_1 с проявлением изучаемого признака. Интересно, что в случаях БТЗ_3 и БТ6_1 гетерозиготы обладали значительно большей толщиной скорлупы, чем представители обоих гомозиготных генотипических классов (Таблица 5). А в случаях БТЗ_1 и БТЗ_2 влияние генотипа на изучаемый признак было обнаружено только у гомозигот по мутантному аллелю. Результаты попарного сравнения толщины скорлупы у кур с различными гаплотипами по выявленным нами позволили выявить

наиболее благоприятные и самые нежелательные гаплотипы для признака толщина скорлупы яйца. Так для пары БТ2_]/5ТЗ_1 наиболее благоприятным является гаплотип ТТАС и СТСв и нежелательным - ТТАА. Для пары 8Т2_1/8ТЗ_2 наиболее желательны гаплотипы СТТТ, СССС и ССТТ, а гаплотип СТСС - самый неблагоприятный. Для пары БОТ 8Т2_1/8ТЗ_3 гаплотипы ССТТ и СТСТ являются наиболее благоприятными, а гаплотипы СТТТ, ТТСС и ТТТТ - самые нежелательные. Для пары БЫР 8Т2_1/8Т6_1 самые неблагоприятные гаплотипы - это СТСС, ТТТТ и ТТСС. Наиболее желательные гаплотипы для сочетания данных 8ЫР СССС, СССТ и СТСТ. Для пары 8ТЗ_1/8ТЗ_2 самые благоприятные гаплотипы АСГТ, и ССТТ. Для пары 8ТЗ_1/8Т6_1 наиболее желательны гаплотипы вССТ и АвСТ, а вырианты йвСС и АСГТ являются наихудшими. Для пары БЫР 8ТЗ_2/8ТЗ_Э гаплотип ТТСТ самый

благоприятный, а гаплотип СТСС - самый нежелательный вариант. Для пары ST3_2/ST6_1 наиболее желательными является гаплотип СССТ, а гаплотипы ССТТ и СТСС - самые нежелательные. Для пары SNP ST3_3/ST6_1 наиболле благоприятным является гаплотипы СТСТ и СТТТ, а гаплотипы СТСС, ТТСС и ТТТТ нежелательны. Попарное сравнение влияния rSNP на толщину скорлупы яиц свидетельствует о наличии аддитивного эффекта в случаях пар ST2_1/ST3_1, ST2_1/ST3_2, ST2_1/ST3_3, ST2_1/ST6_1, ST3J/ST3J2, ST3_1/ST6_1, ST3_2/ST3_3, ST3_2/ST6_1 и ST3_3/ST6_1.

Учитывая наличие связи описанных полиморфных вариантов с толщиной скорлупы яйца у специализированной породы яичного направления род-айленд и неспециализированной локальной породы польская зеленоногая куропатчатая, которые имеют совершенно различное происхождение, можно сделать вывод о широкой распространенности и, возможно, универсальности данного явления. Кроме того, большинство промышленных кроссов получены на основе породы род-айленд, что определяет исключительное значение этой породы для птицеводства яичного направления.

Таким образом, выявленные различия позволяют говорить о возможности создания на базе полученных нами результатов системы генотипирования Gallus gallus по аллелям rSNP, оказывающих влияние на толщину скорлупы яйца. Оптимизация толщины скорлупы яйца имеет большое экономическое значение, поскольку может помочь уменьшить потери птицеводческой продукции при транспортировке. Применение системы молекулярно-генетических маркеров необходимо для получения новых линий и кроссов несушек с оптимизированной толщиной скорлупы.

Выводы

1. В пределах последовательности CR523443 выявлено 6 сайтов мононуклеотидного полиморфизма (SNP): 5 - в регуляторной области (S2_1, S3_l, S3_2, S3_3 и S3_4) и 1 — в кодирующей (S6_l).

2. Все полученные SNP являются, вероятно, регуляторными мононуклеотидными полиморфными сайтами (rSNP), поскольку для каждого из них выявлены сайты связывания транскрипционных факторов, присутствующие только в одном из аллельных вариантов.

3. В группах кур породы род-айленд с толстой (389,9 ± 13,09 мкм) и тонкой (315,7 ± 21,38 мкм) скорлупой яйца имеются достоверные различия по частотам аллелей полиморфных сайтов ST21, ST3_1, и ST3_2.

4. В этих же группах птиц существуют достоверные различия по толщине скорлупы яйца в генотипических классах по аллелям rSNP ST2_1, ST31, ST3 2, ST3_3 и ST6_1.

5. Попарное сравнение влияния rSNP на толщину скорлупы яиц свидетельствует о наличии аддитивного эффекта в случаях пар ST2_1/ST3_1, ST2_1/ST3_2, ST2_1/ST3_3, ST2_1/ST6_1, ST3_1/ST3_2, ST3_1/ST6_1, ST3_2/ST3_3, ST3_2/ST6_1 и ST3_3/ST6_1. Наибольшая толщина скорлупы наблюдалась у птиц с генотипом CT по ST2_1 и TT по ST3_2 (390,28 ± 8,19 мкм) Наименьшая толщина скорлупы отмечена у кур с генотипом CT по ST3_2 и СС по ST6_1 (300,3 ± 19,92 мкм ).

Практические предложения

Результаты представленной к защите работы рекомендуется использовать для создания систем молекулярных маркеров для маркерной селекции несушек с целью оптимизации толщины скорлупы. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе в высших учебных заведениях биологического, сельскохозяйственного и ветеринарного профилей.

Список публикаций по теме диссертации

В журналах и других изданиях, рекомендованных ВАК России:

1. Баркова, О.Ю. Мононуклеотидные полиморфные маркеры (SNP), связанные с признаком толщина скорлупы домашней курицы / О.Ю Баркова, Â.JI. Сазанова, И.Ю. Благовещенский, К.А. Фомичев, A.A. Сазанов // Достижения науки и техники АПК. - 2010. - № 4. - С. 64-65.

2. Sazanov, A. QTL in chicken: a look back and forward - a review / A. Sazanov, A. Sazanova, O. Barkova, K. Jaszczak //Animal Science Papers and Reports -2010. -V. 28.-№4.-P. 307-314.

3. О. Ю. Баркова, А. Л. Сазанова, И. Ю. Благовещенский, К. А. Фомичев, Т. Малевски, А. А. Сазанов. Создание системы генотипирования Gallus gallus по аллелям rSNP (регуляторных мононуклеотидных полиморфных сайтов), оказывающим влияние на толщину скорлупы яйца // Генетика. 2011. -Т. 47. -№2. С. -243-248.

В материалах научных конференций:

4.0.Iu. Barkova / QTL in chicken / A.A. Sazanov, A.L. Sazanova, O.Iu. Barkova, K. Jaszczak // Proceedings of conference "Functional genomics and its application in meat and milk quality". - 2009. - Jastrzebiec/Warsaw. - P. 68-78.

Подписано в печать 2011 г. Формат 60X84 1У16 Бумага офсетная. Объем 1 печ л. Тираж 100 экз. Заказ №

Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИМЭСХ