Анализ экологических закономерностей наземных цианобактериально-водорослевых флор с использованием традиционных и молекулярно-генетических методов

Гайсина, Лира Альбертовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ экологических закономерностей наземных цианобактериально-водорослевых флор с использованием традиционных и молекулярно-генетических методов
ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Анализ экологических закономерностей наземных цианобактериально-водорослевых флор с использованием традиционных и молекулярно-генетических методов"

На правах рукописи

ООооол*'

ГАИСИНА ЛИРА АЛЬБЕРТОВНА

АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ НАЗЕМНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫХ ФЛОР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРАДИЦИОННЫХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

03.02.01 — ботаника

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 9 АВГ 2013

Уфа - 2013

005532345

Работа выполнена на кафедре ботаники, биоэкологии и ландшафтного проектирования Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный педагогический университет им. М.Акмуллы»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Кабиров Рустэм Расшатович

Официальные оппоненггы:

Дубовик Ирина Евгеньевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет», профессор кафедры ботаники

Домрачева Людмила Ивановна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Вятская государственная сельскохозяйственная академия», профессор кафедры биологии растений, селекции и семеноводства, микробиологии

Гончаров Андрей Анатольевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории низших растений, заместитель директора по научной деятельности

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного Центра Уральского отделения РАН

Защита состоится «26» сентября 2013 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» (БашГУ) по адресу: 450074, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332; факс (347) 273-67-78, e-mail: disbiobsu@mail.ru. Официальный сайт БашГУ: http://www.bashedu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БашГУ.

Автореферат разослан « -9 » ClBbl^CtTbCL- 2013 г.

Ученый секретарь Шарипова

диссертационного совета, д.б.н. •¿¿¿^-f Марина Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Эукариотические водоросли и цианобактерии относятся к числу организмов, которые наиболее широко распространены в наземных экосистемах и играют важную роль в их функционировании (Голлербах, Штина, 1969; Rindi et al., 2009). Существует огромное количество работ, посвященных изучению цианобактериально-водорослевых флор многих стран и территорий (Metting, 1981; Алексахина, Штина, 1984; Broady, 1996; Hoffmann et al., 2007; Neustupa, Skaloud, 2008; Кузяхметов, 2006; Budel et al., 2009; Мальцева, 2009). Однако большинство этих работ базируется только на морфологической концепции вида, без подтверждения точности идентификации методами электронной микроскопии и молекулярно-генетического анализа. С другой стороны, в филогенетических и таксономических исследованиях используется ограниченное число штаммов небольшого числа систематических групп. Это противоречие приводит к тому, что мы не имеем полного представления о существующем биоразнообразии и географическом распространении наземных водорослей и цианобактерии.

Сходная ситуация наблюдается и при изучении экологии наземных водорослей и цианобактерий. При исследовании влияния экстремальных факторов как в природных, так и в лабораторных условиях, видовая принадлежность организмов с использованием молекулярно-генетических методов устанавливается крайне редко, что значительно снижает ценность полученных результатов (Балезина, 1975; Chen et al., 2002; Wang et al., 2005; Gupta, Agrawal, 2006; Темралеева и др., 2011).

Целью исследования является выявление экологических закономерностей цианобактериально-водорослевых флор и устойчивости их наиболее распространенных представителей путем интеграции классических морфологических и современных молекулярно-генетических методов.

Задачи исследования:

1. На примере Южно-Уральского региона и некоторых экстремальных местообитаний провести оценку видового разнообразия флоры наземных водорослей и цианобактерий, используя фенотипические и молекулярно-генетические методы идентификации.

2. Оценить возможность использования кодирующих (18S рДНК эукариотических водорослей и 16S рДНК цианобактерий) и некодирующих спейсерных участков ДНК (ITS эукариотических водорослей и 16S-23S ITS цианобактерий) для изучения цианобактериально-водорослевых флор.

3. Для депонирования штаммов, выделенных из исследованных местообитаний, создать коллекцию наземных водорослей и цианобактерий при Башкирском государственном педагогическом университете им.М.Акмуллы.

4. Модифицировать методику оценки нормы реакции эукариотических водорослей и цианобактерий к экстремальным экологическим факторам и определить ее эффективность в аутэкологических экспериментах с использованием модельных видов.

5. Апробировать методику анализа маркерных последовательностей аутентичных и референтных штаммов для решения вопроса о географическом распространении наземных водорослей и цианобактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено влияние фактора зональности на экологические особенности наземных цианобактериально-водорослевых флор ЮжноУральского региона (ЮУР). Спейсерные участки ДНК (ITS у эукариотических водорослей и 16S-23S цианобактерий), в ряде случаев в сочетании с геном 18S рДНК, являются перспективными генетическими маркерами при исследовании альгофлоры различных территорий. Использование молекулярно-генетических методов имеет особую значимость при изучении цианобактериально-водорослевых флор экстремальных местообитаний.

2. Границы устойчивости морфологического статуса аутентичных и референтных штаммов ACKU 506-06 Bracteacoccus minor, ACKU 539-06 Chlorococcum infusionum, ACKU 531-06 Chlorella vulgaris, ACKU 559-06 Pseudococcomyxa simplex, UTEX 2351 Eustigmatos magnus, ACKU 608-06 Klebsormidium flaccidum, 3K Microcoleus vaginatus, № 1 Xanthonema exile к высоким положительным температурам составляют 44-50°С; к pH -3,5-11,5; хлориду меди - lxlO'MxlO"2 моль/л, хлориду никеля - lxlO^-lxlO"2 - моль/л, хлориду марганца 1хЮ"2-1 моль/л; NaCl - 0,1-1 моль/л, Na2C03 -0,005-0,05 моль/л.

3. Использование в аутэкологических экспериментах аутентичных и референтных штаммов с известными последовательностями по основным маркерньм генам позволяет оценивать границы распространения наземных водорослей и цианобактерий, а также экстраполировать результаты аутэкологических экспериментов на природные условия.

Научная новизна. Впервые изучена флора наземных водорослей и цианобактерий в ряде экстремальных местообитаний: Grand Staircase-Escalante National Monument (штат Юта, США), ледниках Ecology и Windy, расположенных вблизи острова Короля Георга в Антарктике, в окрестностях вулканов Мутновский и Горелый (Камчатка, Россия).

Описан новый род и вид водорослей Chloropyrula uraliensis Gaysina, Eliás, Nëmcovà & Skaloud (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), характеризующийся наличием в цитоплазме крупных скоплений микрофибрилл, продавливаемых к поверхности клетки через плазматическую мембрану. Подобные структуры были обнаружены у зеленых водорослей впервые.

Определены нуклеотидные последовательности гена 18S рДНК штаммов КТ9 Chloropyrula uraliensis (номер депонирования JX070625), CR2-4 Monodus sp. (НЕ586519), GSE 4G Choricysíis sp. (HE586518), которые депонированы в

международные базы данных.

Ряд таксонов впервые обнаружен на территории России и Республики Башкортостан (РБ): Hormoscilla pringsheimii Anagnostidis & Komárek (Cyanonacteria), Cystomonas cf síarrii (Trainor & Verses) Ettl & Gärtner, Desmodesmus armatus var. subalternans (Smith) Hegewald, Pseudostichococcus monallantoides Moewus (Chlorophyta) и другие.

1. Практическая значимость работы. В ходе выполнения исследований была создана коллекция ВСАС (Bashkortostan Collection of Algae and Cyanobacteria — Коллекция водорослей и цианобактерий Башкортостана), которая зарегистрирована в World Federation of Culture Collections (WFCC) (WDCM 1023) (http://www.wfcc.info/ccinfo/collection/by_id/1023). BCAC насчитывает 1220 штаммов, относящихся к 6 таксономическим группам: Cyanobacteria - 214, Chlorophyta - 815, Eustigmatophyceae - 61, Xanthophyceae -57, Streptophyta - 52, Bacillariophyceae - 21 вид.

Штаммы коллекции будут использоваться для проведения фундаментальных и прикладных исследований, в том числе как источники биологически активных субстанций для биотехнологии, фармакологии, медицины, получения препаратов для рекультивации земель и т.д.

Модифицированная методика определения границ устойчивости наземных водорослей и цианобактерий позволит отбирать штаммы, наиболее устойчивые к определенным экологическим факторам, с целью их дальнейшего использования в биотехнологии.

Результаты исследований используются при организации научно-исследовательской работы аспирантов и магистрантов Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы, а также при проведении практических занятий и чтении лекций по дисциплинам биологической и экологической направленности.

Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационные исследования были выполнены при поддержке грантов Академии Наук Республики Башкортостан № 19-123-05 и № В-119-06, Роснауки № 2.444.11.7289, Научного Фонда Чехии, Темплана БГПУ им.М.Акмуллы 2009-2013 гг., внутривузовских грантов БГПУ им. М.Акмуллы 2007-2011 гг.

Декларация личного участия. Научные достижения диссертации и выводы основываются на результатах собственных исследований автора в период с 1996 по 2012 гг., принимавшего непосредственное участие в отборе проб, выделении и идентификации штаммов, молекулярно-генетических исследованиях, постановке аутэкологических экспериментов, анализе данных. Часть исследований выполнена в соавторстве, что отражено в совместных публикациях.

Апробация работы. Результаты исследований были апробированы на 27 научных конференциях, наиболее важными из которых являются следующие: III международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, (2012), Biodiversity & Nature Conservation in the Middle& Central Asia, Ostrava, Czech Republic (2012), 53th conference of Czech Algological Society, Ostrava, Czech Republic (2012), 2012 year meeting of International Society for Evolutionary Protistology, Oslo, Norway (2012), II-IV Международные конференции «Актуальные проблемы современной альгологии», Украина (1999-2012), VI European Congress of Protistology, Berlin, Germany (2011), II Всероссийская научно-практическая конференция «Водоросли: проблемы таксономии,

экологии и использование в мониторинге», Сыктывкар (2009), 25-30 International Phycological Conferences, Poland, (2006-2011), V International Symposium on Biology and Taxonomy of Green Algae, Smolenice, Slovakia (2007), International Conference «Algae in terrestrial ecosystems», Kaniv, Ukraine (2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 65 работ, в том числе: 1 монография; 17 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для защиты докторских диссертаций; 6 статей в зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы и приложений (отдельный том). Работа изложена на 489 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 154 рисунка, в том числе 5 собственных иллюстраций. Приложения включают 83 таблицы, 45 собственных иллюстраций и составляют 108 страниц. В списке литературы 636 источников, в том числе 378 иностранных.

Место проведения работы. Работа выполнена на кафедре ботаники, биоэкологии и ландшафтного проектирования БГПУ им.МАкмуллы. Частично изучение альгофлоры национальных парков США проводилось на кафедре биологии Университета Джона Кэрролла (США), молекулярно-генетические исследования выполнялись на кафедре ботаники Карлова Университета в Праге и кафедре биологии и экологии Университета Остравы (Чехия).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному консультанту д.б.н, проф. P.P. Кабирову, д.б.н., проф. И.Ю. Костикову (Украина), д-ру Д. Джохансену (США), д-рам М. Элиашу, И. Неуступе, О. Струнецку, И. Немцовой, П. Шкалоуду, магистранту К. Прохазковой (Чехия), д-ру М. Олех (Польша), к.б.н., доц. Ш.Р. Абдуллину и Н.В. Сухановой, преподавателям, аспирантам и студентам кафедры ботаники, биоэкологии и ландшафтного проектирования БГПУ им.МАкмуллы.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕНИЯ ЭКОЛОГИИ И ГЕОГРАФИЧЕСКОГО РАСПРОСТРАНЕНИЯ НАЗЕМНЫХ

ВОДОРОСЛЕЙ И ЦИАНОБАКТЕРИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Рассматривается история изучения наземных водорослей и цианобактерий, а также современное состояние вопросов их экологии и географического распространения (Голлербах, Штана, 1969; Metting, 1981; Кузяхметов, 1996; Rindi et al., 2009; Hoffann et al., 2007; Neustupa, Skaloud, 2008; Büdel et al., 2009; Новаковская, Патова, 2012). Обсуждается проблема сопоставимости флористических данных и перспективы использования генетических маркеров и ДНК-штрихкодирования (Coleman, 2003; Lewis, Flechtner, 2004; Siegesmund, 2008; Friedl, Lorenz, 2012). Анализируются современные точки зрения на географическое распространение микроскопических водорослей и цианобактерий (Finlay, 2002; Finlay, Fenchel, 2004; Pröschold, Leliaert, 2007; Dvofäk, 2012). Обобщаются данные о географическом распространении видов-космополитов и убиквистов (Алексахина, Штина, 1984; Ettl, Gärtner, 1995; Коспков и др., 2001). Рассматриваются синэкологическое и аутэкологическое направления в альгологии, выделяются основные экологические факторы,

влияющие на наземные водоросли (Штина, Голлербах, 1976; Soufferau et al., 2010; Gigova et al., 2012). Обсуждается проблема объективности биоиндикационных оценок и ее зависимость от первичных аутэкологических данных, а также критерии, используемые для оценки влияния экологических факторов (Doculil, 2003; Баринова и др., 2006; Никитина, Шкундина, 2007; Berzano et al., 2012; Whitton, 2012).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Районы исследования. Исследования проводили на территории ЮУР: во всех зонах РБ согласно ботанико-географическому районированию: бореально-лесной, широколиственно-лесной, лесостепной, степной (Определитель высших растений.., 1988) и Брединском районе Челябинской области, граничащем с РБ на юго-западе.

Для изучения водорослей ряда экстремальных местообитаний образцы почвы были отобраны на следующих территориях: в национальных парках Grand Staircase-Escalante National Monument (штат Юта, США) и Great Smoky Mountains (штаты Теннеси - Северная Каролина, США), на острове Короля Георга (Антарктика), в солончаках Зауралья и на отвалах Сибайского филиала Учалинского горно-обогатительного комбината (Башкирия, Россия), возле вулканов Мутновский и Горелый (Камчатка, Россия).

Отбор проб и анализ почвенных образцов. Материалом для работы послужило изучение 312 проб почвы, микробиотаческих корочек, соскобов со скал, коры деревьев, отобранных по принятой в почвенной альгологии методике. Для выделения альгологически чистых культур использовали модификацию метода разбавления (Гайсина и др., 2008). Культуры водорослей и цианобактерий выращивали на питательной среде Болда с утроенным содержанием азота и на среде Бристоль (Сиренко и др., 1975). При изучении солончаков определяли рН почвы и сумму поглощенных оснований по Каппену-Гильковицу (ГОСТ 27821-88). Для изучения содержания валовых форм Си, Zn, Pb, Cd в почвах использовали метод атомно-абсорбционной спектроскопии с использованием прибора Contr-AA «Analytic». Определение водорослей проводили в одновидовых культурах, н, в некоторых случаях, на стеклах обрастания.

Идентификация водорослей и цианобактерий. Определение видов проводили с использованием микроскопа Axio Imager А2 с реализацией дифференциально-интерференционного контраста с камерой Axio Cam MRC при увеличении хЮОО с использованием масляной иммерсии. В ходе выполнения работы при определении водорослей и при анализе результатов аутэкологических экспериментов было изучено более 150 тысяч микрофотографий, выполненных при помощи программы Axio Vision 4.9.

Для получения зооспор использовали методики, описанные В.М.Андреевой (1988), с модификациями. Диатомовые водоросли изучали в живом состоянии и на слайдах, изготовленных путем кипячения проб почвы в азотной кислоте с последующим ополаскиванием и высушиванием.

В работе система таксонов высшего порядка приведена в соответствии с современными представлениями на систематику эукариот (Walker et al., 2011; Burki et al., 2012). Систематика цианобактерий приведена по сводкам И. Комарека и А. Анагностидиса (Anagnostidis, Komärek, 1985, 1988, 1990; Komärek, Anagnostidis, 1986, 1989, 1999, 2005), диатомовых водорослей - по К. Краммер и X. Ланге-Берталот (Krammer, Lange-Bertalot, 1986), остальных групп - по И. Костикову с соавторами (Костков и др., 2001). Кроме того, для видовой идентификации использовали следующие таксономические сводки и монографии: Андреева, 1998; Голлербах и др, 1953; Дедусенко-Щеголева, Голлербах, 1962; Матв1енко, Догадша, 1978; Ettl, 1978; Ettl, Gärtner, 1988, 1995; John at al., 2005; Komärek, Fott, 1983; Lokhorst, 1996; Geitler, 1932; Starmach, 1972; Wolowski, Hindak, 2005. Для уточнения названия водорослей использовали базу данных Algaebase (http://www.algaebase.org/).

При анализе экологических закономерностей наземных цианобактериалъно-водорослевых флор использовали элементы синтаксономического анализа в соответствии с подходом Браун-Бланке (Миркин, Наумова, 1998). Синоптические таблицы составляли с использованием шкалы постоянства: г- 0,1-5%; + - 6-10%; I -11-20%; II - 21-40%; III - 41-60%; IV - 61-80%; V - 81-100%.

Для изучения морфологии и ультраструктуры клеток Chloropyrula uraliensis использовали методы люминесцентной, конфокальной и трансмиссионной электронной микроскопии.

Методика проведения экспериментов. В качестве модельных видов были выбраны аутентичные и референтные штаммы водорослей и цианобактерий, наиболее распространенных в наземных экосистемах: ACKU 506-06 Bracteacoccus minor, ACKU 539-06 Chlorococcum infusionum, ACKU 53106 Chlorella vulgaris, ACKU 559-06 Pseudococcomyxa simplex, UTEX 2351 Eustigmatos magna (=Eustigmatos magnus), ACKU 608-06 Klebsormidium flaccidum, 3 К Microcoleus vaginatus, № 1 Xanthonema exile.

Концентрации токсикантов подбирали в предварительных экспериментах в диапазоне, позволяющем проследить изменение морфологии водорослей от нормального состояния до полной гибели. Эксперименты проводили в жидких питательных средах. Изучали влияние каждого фактора на размерные признаки водоросли (длину нитей и линейные размеры клеток) и биологический объем водорослей и цианобактерий. Во всех градациях факторов измеряли не менее 100 клеток, нитей или трихомов.

В экспериментах по влиянию высоких положительных температур суспензию водорослей или цианобактерий подвергали 20 минутной экспозиции при t=30-76°C с интервалом 2°С. При замораживании чашки Петри с исследуемыми культурами помещали в морозильник и выдерживали в течение 1, 5, 9 суток, просмотр проводили в первые сутки после замораживания и через 4 суток. При изучении влияния реакции среды исследовали pH от 2 до 13,5 с интервалом 0,5, контролем служила жидкая среда Болда с pH 6,5. NaCl испытывали в концентрациях 0,1-7 моль/л, Na2C03- 0,0001-5 моль/л; CuCl2 -1хЮ-,0-1 моль/л, NiCl2- 1х10-8-1 моль/л, MnCl2- lxlO"6-! моль/л. Гербициды и

удобрения испытывали в следующих концентрациях: триаллат и бетанал - 1x10" 8 -1х10"3 моль/л, хлорид калия -1х10"3-Зх10"', мочевину -2хЮ"3-1,7; суперфосфат 4х10"5-2хЮ"3 моль/л действующего вещества. Продолжительность экспериментов по влиянию температуры составляла 14 суток, экспериментов по влиянию pH и токсикантов - 7 суток.

Для вычисления биологического объема водорослей и цианобактерий (V) использовали формулы геометрических фигур, которые наиболее точно соответствовали форме их тела (Sun, Liu, 2003), полученные результаты обрабатывали при помощи регрессионного анализа. Кроме того, вычисляли значения средней арифметической и ее ошибки, медианы, стандартного отклонения и коэффициента вариации. Достоверность результатов исследований определяли с помощью критерия Стьюдента (Лакин, 1990). Статистическую обработку результатов проводили в программах StatSoft Statistica 8.0, MS Office 2007 Excel и Past 2.14.

Молекулярно-генетические методы. Молекулярно-генетические методы исследований использовались преимущественно при идентификации водорослей и цианобактерий экстремальных местообитаний, а также для определения представителей критических в таксономическом плане групп. Выделение геномной ДНК эукариотических водорослей проводили с использованием набора Spin Plant Mini (Invitek), для выделения ДНК цианобактерий использовали методику M. Yilmaz et al. (2009) в модификации О. Strunecky et al. (2011). Для амплификации кодирующих и некодирующих последовательностей рибосомального оперона использовали полимеразно-цепную реакцию (ПЦР). Продукты ПЦР определялись путем проведения электрофореза в 1% агарозном геле, по результатам анализа продуктов электрофореза ДНК очищали с использованием наборов GenElute PCR Clean-Up (Sigma-Aldrich) и QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen, Germany). Определение последовательностей проводили при помощи секвенаторов 3130 Genetic Analyzer и ABI 3100 (Applied Biosystems). Объединение последовательностей производили при помощи программы SeqAssem.

Анализ последовательностей с использованием базы данных NCBI. Последовательности ITS эукариотических водорослей и 16S-23S ITS цианобактерий сравнивали с последовательностями из базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information - NCBI или GenBank - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) при помощи программы BLAST. В большинстве случаев, когда последовательность изучаемого штамма имела сходство 99-100% с последовательностями из NCBI, делали вывод о принадлежности водоросли или цианобактерии к одному виду, если отмечалось сходство 97-98%, принималась принадлежность организмов к одному роду. При получении более низких уровней сходства или при недостаточном перекрывании последовательностей для идентификации применяли анализ последовательности для регионов 18S или 18S-ITS2 рДНК. Подобная идентификация применялась для определения филогенетического положения объекта и предполагала дальнейшее проведение для данного

организма молекулярно-филогенетического анализа с целью установления его таксономической новизны.

Филогенетический анализ и построение вторичной структуры ITS. Выравнивание последовательностей проводилось с использованием программы CLUSTAL_X (Thompson et al., 1997). Для построения филогенетических деревьев использовали метод максимального правдоподобия (Maximum Likelihood- ML) с использованием программы RAxML 7.0.4 на портале CIPRES (Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research) (http://www.phylo.org/ sub_sections/portaI/) с применением стратегии быстрого бутстрепа с последующим поиском ML в первоначальной базе данных с моделью замен GTR+G (Stamatakis et al., 2008). Для создания моделей вторичной структуры ITS использовали интерактивный сервер MFOLD 3.1, позволяющий конструировать варианты вторичной структуры РНК с учетом минимальной термодинамической энергии.

ГЛАВА 3. ЗОНАЛЬНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ

ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫХ ФЛОР В ЮЖНОУРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ

Наземные водоросли и цианобактерий бореально-лесной зоны.

Исследования проводились в трех районах: Караидельском районе липово-темнохвойных лесов Уфимского плато, Уралтаусском районе сосновых и березовых лесов низкогорий восточного склона Южного Урала, Зильмердакском районе широколиственно-темнохвойных лесов среднегорий части Южного Урала. Имеется ряд работ о фитопланктоне Павловского водохранилища (Полева, Шкундина, 2008, 2011), однако альгофлора территории, прилегающей к водохранилищу, практически не изучена.

При проведении исследований обнаружено 85 видов водорослей и цианобактерий: Cyanobacteria - 36, Chlorophyta - 30 (Chlorophyceae - 23, Trebouxiophyceae - 5, Ulvophyceae - 2), Bacillariophycea - 11, Streptophyta - 6, Xanthophyceae-1, Eustigmatophyceae - 1 вид. Основной особенностью флоры изученной территории было высокое видовое разнообразие цианобактерий. Наряду с широко распространенными видами, были обнаружены и редкие, например, Hormoscilla pringsheimii и Chlorogloeopsis cf. fritschii. В видовом составе зеленых водорослей преобладали формы, образующие слизь, представители семейства Scenedesmaceae и одноклеточные шаровидные водоросли. Диатомовые водоросли были представлены в основном широко распространенными видами, такими как Hantzschia abundans, Н. amphioxys, Н. amphioxys f. capitata, Luticola mutica, L. ventricosa, Pinnularia borealis.

Для уточнения видовой принадлежности ряда штаммов были проведены молекулярно-генетические исследования. При исследовании альгофлоры зоны было выделено 7 штаммов, по морфологическим признакам отнесенных к роду Scotiellopsis. Установлено, что последовательность участка ITS длиной 622 пн штамма Р13 Scotiellopsis sp. (рисунок 1, а), выделенного из поймы реки Салдыбаш, имела 99% сходство с последовательностями штаммов Itas 6/3 T-10W

Desmodesmus armatus var. subalternans (DQ417520) (Score=599, Identities=99%) и Pic 8/18 Desmodesmus armatus var. subalternans (Score=598, Identities=99%). Эти штаммы были выделены из пресноводных местообитаний в Национальном парке Итаска (Itasca State Park) (Миннесота, США). Высокая степень сходства последовательностей ITS этих штаммов, выделенных из географически отдаленных территорий, является свидетельством широкого распространения Desmodesmus armatus var. subalternans по всему миру. По результатам анализа участка ITS2 других штаммов Scotiellopsis их родовая принадлежность была подтверждена, однако было установлено, что они представляют четыре разные филогенетические линии, одна из которых относилась к виду Coelastrella terrestris (H.Reisigl) E.Hegewald & N.Hanagata. Штаммы, относящиеся к другим линиям, были определены как Scotiellopsis sp. 3, Scotiellopsis sp. 2, Scotiellopsis sp. 3.

Наземные водоросли и цианобактерии широколиственно-лесной зоны. Исследования проводились в северо-западной части Белебеевской возвышенности, в Бирско-Уфимском районе смешанных широколиственных лесов и в Красноусольском районе смешанных широколиственных лесов. В исследуемой зоне найдено 87 видов водорослей и цианобактерий: Cyanobacteria - 27, Chlorophyta - 46 (Chlorophyceae - 35, Trebouxiophyceae - 10, Ulvophyceae -1), Bacillariophyceae - 6, Xanthophyceae - 6, Streptophyta -1, Eustigmatophyceae -1 вид. Видовой состав альгофлоры был типичным для фитоценозов лесной зоны, что выражалось в преобладании зеленых одноклеточных водорослей из родов Chlamydomonas, Chlorococcum и незначительном развитии диатомовых водорослей (Голлербах, Штина, 1969; Алексахина, Штина, 1984). Цианобактерии были представлены меньшим числом видов, чем зеленые водоросли, среди этой группы доминировали рода Nostoc, Phormidium и Leptolyngbya. Необходимо отметить, что в предыдущих исследованиях, проводимых в зоне широколиственных лесов Башкирии, также отмечалось доминирование родов Nostoc (Дубовик и др., 2007). К интересным находкам следует отнести обнаружение видов Chlorogloea cf. purpurea, Chlorogloeopsis cf. fritschii, Leptolyngbya cf. «Albertano/KoväCik-red», Myxosarcina cf. tatrica. В составе диатомей преобладали виды-космополиты.

Был проведен молекулярно-генетический анализ двух штаммов, по морфологическим признакам определенных как КТ2 и КТЗ М. homosphaera (рисунок 1, б, в). Последовательности участков 18S рДНК имели 99% сходство с последовательностью штамма ASIB V38 Muriella terrestris J.B.Petrersen (номер депонирования АВ012845). Поскольку последовательности не были идентичными, мы определили эти штаммы как КТ2 Muriellasp.l и КТЗ Muriella sp.2.

Наземные водоросли и цианобактерии лесостепной зоны. Анализ флоры наземных водорослей и цианобактерий лесостепной зоны позволил выявить 94 вида: Cyanobacteria - 33, Chlorophyta - 46 (Chlorophyceae - 32, Trebouxiophyceae - 13, Ulvophyceae - 1), Bacillariophyceae - 8, Streptophyta - 3, Xanthophyceae - 3, Eustigmatophyceae- 1 вид. На исследованной территории наиболее широко были представлены зеленые водоросли. Наряду с широко

распространенными видами-космополитами Bracteacoccus minor и cf. Mychonastes homosphaera, были обнаружены и достаточно редкие Kentrosphaera minor и Cystomonas cf tuberculoid. В предыдущих исследованиях альгофлоры лесостепной зоны Башкирии также было обнаружено доминирование зеленых водорослей, причем наиболее распространенными были мелкие одноклеточные формы (Дубовик, 2000; Кузяхметов, 2006).

Цианобактерии характеризовались достаточно высоким видовым разнообразием, наиболее распространенными были Leptolyngbya foveolarum, L. voronichiniana, Nostocpunctiforme и Trichocoleus cf. hospitus. К числу интересных находок следует отнести цианобактерию Chroococcus varius.

Диатомовые водоросли были представлены видами-космополитами, к стрептофитовым водорослям относились Klesormidium flaccidum, К. cf dissectum и К. cf crenulatum. В состав желтозеленых водорослей входили виды Botrydiopsis cf.arhiza, Xanthonema cf. exile и Botrydium granulatum. Эустигматофитовые водоросли были представлены Eustigmatos magnus.

Исследования показали, что район Юрюзано-Айской холмисто-грядовой равнины характеризовался большим разнообразием и частотой встречаемости эукариотических водорослей и цианобактерий по сравнению с районом Прибельской лесостепи. Диатомеи, нитчатые зеленые, стрептофитовые и желтозеленые водоросли, характерные для лесных экосистем, сочетались со степными ксерофитами Microcoleus, Phormidium и Nostoc.

Наземные водоросли и цианобактерий степной зоны. На исследуемой территории обнаружено 57 видов цианобактерий и эукариотических водорослей: Cyanobacteria—23 вида, Bacillariophyceae-6, Chlorophyta-24 вида(СЫогорЬусеа -14, Trebouxiophyceae - 8, Ulvophyceae - 2), Streptophyta - 3 вида, Xanthophyceae — 1 вид. В видовом составе альгофлоры доминировали зеленые водоросли, причем среди этой группы преобладали формы, образующие слизь, либо шаровидные мелкоклеточные формы. Нитчатые формы зеленых водорослей были представлены Stichococcus sp.

Обнаруженные на исследуемой территории цианобактерии относились к широко распространенным нитчатым формам. Важной характеристикой изучаемой территории было широкое распространение родов Leptolyngbya и Nostoc. Род Nostoc и ранее часто обнаруживался в степных почвах Южного Урала (Кузяхметов, 2006). В степной зоне РБ и на прилегающих территориях Челябинской области были обнаружены микробиотические корочки, играющие важную роль в сохранении плодородия почвы и защите ее от эрозии (Johansen, 1983).

Диатомовые водоросли были представлены в основном широко распространенными видами из рода Hantzschia. Наиболее интересным в таксономическом плане был штамм Ya4 Myrmecia, который по своим морфологическим признакам можно было отнести к роду Myrmecia (рисунок 1, г). Водоросль образовывала очень крупные мешковидные клетки длиной до 45 мкм, с пенисто-ячеистой цитоплазмой, окруженные снаружи плотной слизистой оболочкой. Такие структуры не были описаны ни для одного известного ранее вида Myrmecia. Для уточнения видовой принадлежности была получена

последовательность участка ITS, которая была наиболее сходной с установленными последовательностями штаммов ASIB S234 Lobosphaera tirolensis (АВ006051) (Score=282, Identities=95%) и SAG 2007 Myrmecia incisa (AY762602) (Score=279, Identitie$~96%). Возможно, обнаруженный нами штамм представляет либо новый вид, либо вид, не исследованный при помощи молекулярно-генетических методов.

Рисунок 1 - Наземные водоросли, выделенные на территории ЮУР, с подтвержденной родовой и видовой принадлежностью: а - Р13 Desmodesmus armatus var, mbalternans; б - KT2 Muriella sp. 1; в - KT3 Muriella sp. 2; г - Ya4 Myrmecia sp. Шкала - 10 цт

Таким образом, видовой состав альгофлоры степной зоны Башкирского Зауралья отражал экологические особенности степных экосистем, выражающиеся в доминировании нитчатых цианобактерий и зеленых водорослей-убиквистов.

Сравнение особенностей цианобактернильно-водорослевых флор Южно-Уральского региона. Исследования позволили установить влияние фактора зональности на экологические особенности наземных цианобактериально-водорослевых флор ЮУР, Установлено, что число видов водорослей и цианобактерий возрастало от бореально-лесной к лесостепной зонам и затем уменьшалось к степной зоне. Однако число видов на пробу от бореально-лесной зоны к степной уменьшалось (таблица 1). Возможно, характер этих изменений связан с уменьшением влажности местообитаний.

Исследования показали, что ряд такеонов встречается во всех исследованных зонах ЮУР, т.е. являются сквозными видами. К ним относятся представители нитчатых цианобактерий Leptolyngbya voronichiniana, L. foveolartm, Microcoleus vaginatus. Phormidium breve, зеленые водоросли Gloeotillopsis sarcinoidea, Bracteacoccus minor, Scotiellopsis mbescens,

Klebsormidium flaccidum, диатомовая водоросль Hantzschia amphioxys (таблица

I)-

Следует отметить, что во всех зонах ЮУР достаточно часто встречались представители родов Chlamydomonas и Chlorococcum, однако из-за чрезвычайной сложности их определения по морфологическим признакам они в основном определялись до рода (как Chlamydomonas spA, Chlamydomonas sp.2 и т.д.), вследствие чего вошли в группу редких видов по шкале постоянства.

Установленное нами широкое распространение Microcoleus vaginaíus, Leptolyngbya foveolarum, Phormidium breve, Bracteacoccus minor, Hantzschia amphioxys соответствует результатам предыдущих исследований цианобактериально-водорослевых флор как ЮУР (Кузяхметов, 2006; Дубовик и др., 2007), так и других регионов России (Алексахина, Штина, 1984; Штина и др., 1984; Новаковская, Патова, 2012) и территорий зарубежных государств (Шалару, 1995; Костиков и др., 2001; Komárek, Anagnostidis, 2005; Мальцева, 2009; Skaloud, 2009).

В то же время, практически повсеместная представленность видов Gloeotillopsis sarcinoidea, Leptolyngbya voronichiniana, Scotiellopsis rubescens была впервые отмечена для ЮУР. В этом регионе впервые было изучено распространение вида Hantzschia abundans, выделенного из вида Н. amphioxys на основании морфологических отличий (Lange-Bertalot, 1993). Исследования показали, что оба этих вида широко распространены в изученных экосистемах.

Установлено, что цианобактерии Trichormus variabilis и Cylindrospermum michailovskoense является диагностическими видами для лесных и лесостепных зон ЮУР (таблица 1).

К дифференцирующим видам бореально-лесной зоны ЮУР относились Nostoc cf. punctiforme, Luticola mutica, Eustigmatos magnus. Это также виды-космополиты, которые, однако, предпочитают влажные местообитания.

Для зоны широколиственных лесов было характерно широкое распространение цианобактерии Trichocoleus cf. hospitus, который был впервые обнаружен не только на территории ЮУР, но и России в целом.

Другие виды, встречающиеся только в этой зоне, характеризовались как редкие. В основном это были представители родов Chlorococcum и Tetracystis, широко распространенные в лесных экосистемах (Koctíkob и др., 2001; Hoffmann et al., 2007; Патова, Новаковская, 2012) (таблица 1). В этой зоне был обнаружен новый род и вид Chloropyrula uraliensis Gaysina et al. (Trebouxiophyceae) (Gaysina et al., 2013).

К дифференцирующим видам зоны широколиственных лесов и зоны лесостепи относились Chlorosarcinopsis gelatinosa, Dictyococcus varians и Spongiochloris cf. minor, которые достаточно распространены в наземных экосистемах (Koctíkob и др., 2001) (таблица 1).

Цианобактериально-водорослевые флоры лесостепной зоны ЮУР характеризовались распространением видов, характерных для лесных экосистем (представители родов Chlorella и Lobochlamys).

Таблица 1 - Сравнение цианобактериально-водорослевых флор Южно_Уральского региона (таблица сокращена)_

_________ Зона Таксон —-—----- Южно-Уральский регион

БЛ1 UIJI2 ЛС3 C4

Число видов 85 87 94 57

Число проб 17 21 29 18

Число видов на пробу 5,00 4,14 3,24 3,16

Leptolyngbya voronichiniana Anagnostidis & Komärek II IV III III

Leptolyngbya foveolarum (Rabenhorst ex Gomont) Anagnostidis & Komärek III II III II

Microcoleus vaginatus (Vaucher) Gomont ex Gomont III I II III

Gloeotilopsis sarcinoidea (Groover & Bold) Friedl II II II II

Bracteacoccus minor (Chodat) Petrovä III II II +

Hantzschia amphioxys (Ehrenberg) Grunow II II II I

Scotiellopsis rubescens Vinatzer II II + II

Phormidium breve (Kützing ex Gomont) Anagnostidis et Komärek II + I II

Trichormus variabilis (Kützing ex Bornet & Flahault) Komärek & Anagnostidis II I II

Cylindrospermum michailovskoënse Elenkin I I II

Nostoc cf. punctiforme Kützing (Hariot) IV II II II

Luticola mutica (Kützing) Mann III r + +

Hantzschia amphioxys f. capitata O.Müller III r r +

Eustigmatos magnus (J.B.Peretsen) Hibberd III r +

Trichocoleus cf. hospitus (Hansgirg ex Gomont) Anagnostidis + IV II II

Tetracystis dissociata Brown et Bold +

Elliptochloris bilobata Tschermak-Woess r

Chlorococcum echinozygotum Starr r

Chlorosarcinopsis gelatinös a Chantanachat & Bold I II

Dictyococcus varions Gerneck + +

Spongiochloris cf. minor Chantanachat & Bold r r

Halochlorella rubescens P.J.L.Dangeard +

Scotiellopsis levicostata (Gollerbach) Puncocharova & Kaiina +

Chlorella cf. vulgaris f.globosa V. Andreeva +

Lobochlamys cf. culleus (Ettl) Pröschold et al. r

Elliptochloris subsphaerica (Reisigl) Watanabe + II

Phormidium ambiguum Gomont ex Gomont + +

Chlorella mirabilis V.M.Andreyeva r +

Kentrosphaera minor Borzi r +

Pseudophormidium hollerbachianum (Elenkin) Anagnostidis II II II IV

Nostoc cf. commune Vaucher ex Bornet & Flahault II

Diplosphaera cf. chodatii Bialosuknia I

Interfilum terricola (Petersen) Mikhailyuk et al. | +

Примечание. 1— бореально-лесная зона; 2 - широколиственно-лесная зона; 3 — лесостепная зона; 4 — степная зона.

Кроме того, в этой зоне были встречены виды, встречающиеся в экстремальных местообитаниях (Halochîorella rubescens, Scotiellopsis levicostata) (таблица 1).

Исследования показали, что некоторые виды характеризуются приуроченностью к лесостепным и степным зонам, к ним относились Elliptochloris subsphaerica, Phormidium ambiguum, Chlorella mirabilis, Kentrosphaera minor (таблица 1).

Степная зона отличалась широким распространением цианобактерии Pseudophormidium hollerbachianum. Кроме того, здесь были обнаружены Nostoc cf. commune, Diplosphaera cf. chodatii, Interfilum terrícola, I. massjuldae (таблица 1).

Исследования показали, что ряд таксонов встречается во всех исследованных зонах ЮУР, однако в каждой зоне были обнаружены дифференцирующие виды, характеризующие экологические особенности зоны.

ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫХ ФЛОР ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ МЕСТООБИТАНИЙ

К числу экстремальных факторов, оказывающих воздействие на наземные водоросли и цианобактерии, относятся высокие и низкие температуры, реакция среды, засоление и тяжелые металлы. Для проведения исследований были выбраны местообитания, в которых можно было проследить влияние одного из этих факторов на особенности цианобакгериально-водорослевых флор.

Местообитания с экстремально высокой температурой — Grand Staircase-Escalante National Monument (штат Юта, США). Grand Staircase-Escalante National Monument (GSENM) является одной из крупнейших парковых территорий в западной части Соединенных Штатов. Территория парка имеет уникальную стратиграфию, которая обусловлена засушливым климатом, практически полным отсутствием эрозии, скудностью высшей растительности (Doelling et al., 2000) и древними скалами, образовавшимися в меловой период (Zanno, Sampson, 2005; Eaton, 2006; Roberts et al., 2005). В ходе исследования уникальных сообщества мокрых скал GSENM было обнаружено 28 видов эукариотических водорослей: Chlorophyta - 23 (Chlorophyceae - 17, Trebouxiophyceae - 6), Streptophyta -1, Xanthophyceae - 2, Eustigmatophyceae- 2. Точность определения 20 штаммов, относящихся к 18 видам, была подтверждена путем секвенирования гена 18S рДНК и участка ITS. Установлено, что наиболее широко были распространены представители семейства Scenedesmaceae из родов Desmodesmus и Scenedesmus. Большинство этих видов потеряло типичные морфологические признаки, присущие этой группе (наличие ценобиев и разнообразных выростов клеток), как, например, Desmodesmus cf. armatus (рисунок 2, а), поэтому без использования молекулярно-генетических методов определение эти видов было бы весьма затруднительно.

Точность определения видов Соссотуха sp., Cosmarium cf. subtumidum, Micractinium sp. (рисунок 2, 6), Monoraphidium sp. (рисунок 2, в), Mychonastes jurisii (рисунок 2, г), Diplosphaera cf. shodatii, Stichococcus cf. minutus,

Síigeoclonium sp., Oedogonium sp., Eustigmaíos magnus, Monodus sp. также была подтверждена молекулярно-генетическими методами.

Штамм 7S Mychonastes sp. на основании морфологических признаков (мелкие размеры, отсутствие пиреноида, способность образовывать группы клеток) можно было отнести к роду Mychonastes, однако идентификация водоросли до вида была крайне затруднительна. Сравнение последовательности участка ITS2 длиной 548 пн с последовательностями из NCBI показало, что наиболее близкой была последовательность ССАР 260/1 Mychonastes jurisii (GQ477038) (Score=512, Identities=99%), что позволило нам определить этот штамм как Mychonastes jurisii. В то же время, сравнение последовательности гена 18S рДНК Mychonastes jurisii длиной 1180 показало одинаковое сходство с 6 штаммами: аутентичным штаммом SAG 249-2 Muriella decolor (JN968587), штаммами Itas 9/21 S-3w Pseudodictyosphaerium sp. (AY543064), Itas 9/21 14-8w Pseudodictyosphaerium sp. (AY543066), Itas 9/21 14-4w Pseudodictyosphaerium sp.(AY543065), Tow 6/3 P-lw Mychonastes sp. (AY197637), JL 1/12-12 Mychonastes sp. (AY195978) (Score=1107, Identities=98%). Pseudodictyosphaerium в настоящее время рассматривается как синоним Mychonastes (Krienitz et al., 2011). Эти результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения родов Muriella и Mychonastes с точки зрения их таксономии.

Обнаруженные виды можно разделить на три экологические группы: типично наземные виды — Chloroidium saccharophilum, Eustigmatos magnus, Stichococcus cf. minutus, Coccomyxa sp., Diplosphaera cf. chodatii; пресноводные виды, которые могут расти в аэрофильных условиях — Oedogonium sp., Pediastrum integrum, Síigeoclonium sp., Oocystis cf.marsonii; пресноводные виды й роды, которые ранее рассматривались как типично планктонные — Mychonastes jurisii, Oonephris obesa, Micractinium sp., Nautococcus cf. mamillatus, Monoraphidium sp., Desmodesmus cf. armatus, Desmodesmus cf. lefevrei.

Таким образом, изучение эукариотических водорослей мокрых скал парка GSENM еще раз показало, что во многих случаях определение водорослей только на основании морфологических признаков приводит к ошибкам идентификации. Кроме того, обнаружение в субаэрофильных условиях целого ряда планктонных видов является свидетельством ограниченности знаний об экологии и географическом распространении наземных водорослей.

Местообитания с экстремально низкой температурой - Антарктика. Антарктика относится к числу наиболее суровых местообитаний на нашей планете с экстремально низкими температурами и резко выраженными сезонными изменения уровня солнечной радиации (Mock, Thomas, 2008).

В ходе изучения флоры наземных водорослей и цианобактерий острова Короля Георга было обнаружено 36 видов наземных водорослей и цианобактерий: Cyanobacteria - 8, Chlorophyta - 26 (Chlorophyceae - 11, Trebouxiophyceae — 15), Streptophyta — 1 и Eustigmatophyceae — 1. В основном были встречены виды, характерные для Антарктики: Sphaerocystis oleífera, Coccomyxa cf. cúrvala, Coenochloris signiensis.

Рисунок 2 - Эукариотические водоросли мокрых скал GSENM: a-Desmodesmus cf. armalus; б -Micractinium sp.; в - Monoraphidium sp.; г -Mychonastes jurisii. Шкала - 10 цш

Особый интерес представляет находка Emtigmatos magnus, который был обнаружен в Антарктике впервые. Кроме того, были найдены виды, обнаруженные в результате предыдущих исследований этого региона, В основном это виды и рода-космополиты, широко распространенные по всему миру: Nos toc, Bracteacoccus, Diplosphaera, Pseudococcomyxa (Broady, 1996), Scotiellopsis (Cavacini, 2001), Khbsormidium flaccidum (Elster et al., 2008).

Сравнение последовательностей некодирующего участка ITS штаммов 21-2010 M homosphaera, WBN 12 Chlorella sp., WBN 17 Chlorella sp. с NCBI показало их абсолютную идентичность и сходство со штаммом AICB 424 Nannochhris sp. (JQ922411) (Score=414, Identities-86%). Родство этих штаммов с родом Narmochloris подтвердилось в результате анализа последовательности гена 18S рДНК 2-1-2010 M homosphaera длиной 1171 пн, наиболее сходной со штаммами JL 4-6 Nannochhris sp. (AY195983) (Score=1070, ldentities=98%) и Ant-1 Nannochhris sp. (EF440182) (Score=1059, Identities=98%), выделенного в Антарктике. Эти штаммы были определены как Narmochloris sp. 1.

Родство с родом Nannochhris было установлено и для штамма WBN03 Mhornosphaem. ITS последовательность этого штамма длиной 956 пн была также схожа с ITS последовательностью штамма AICB 424 Narmochloris sp. (JQ922411) (Score=499, ldetmties=85%), последовательность гена 18S длиной 1133 пн была наиболее близкой штамму Nannochhris bacillaris, выделенного в озере Накатуна (Lake Nakaturm) в префектуре Нагано (номер депонирования АВ080300) (Score=1020, Identities=97%). Последовательность участка ITS штамма WBN9 M. homosphaera длиной 1051 пн также имела максимальное сходство со штаммом AICB 424 Nannochhris sp. (JQ92241 Г) (Score=413, Identities=83%), последовательность гена 18S длиной 1158 пн была наиболее

близкой Nannochloris bacillaris (AB080300) (Score=1051, Identities=98%). Штаммы WBN03 M. homosphaera и WBN9 M. homosphaera были определены как Nannochloris sp. 2 и Nannochloris sp. 3 соответственно.

Последовательность гена 18S рДНК штамма WBN 7 М. homosphaera имела 98% сходство со штаммами AS 2-4 Muriella sp. AS 2-4 (Score=1062) (AY195969) и ASIB V38 Muriella terrestris (Score=1059) (AB012845). Исходя из полученных результатов, этот штамм был определен как Muriella sp.

Другим интересным изолятом был штамм, предварительно определенный нами как Bracteacoccus sp. (штамм l-1-Green big), последовательность участка ITS которого длиной 1180 пн Bracteacoccus sp. была практически идентична последовательности штамма KF-2012c Broady 420 (JQ281843) (Score=1104, Identities=98%). Впоследствии штамм Bracteacoccus sp. KF-2012c Broady 420 был отнесен к вновь описанному виду Bracteacoccus bullatus Fuííková, Flechtner & Lewis (Fucíková et al., 2013), поэтому штамм 1-1-Green big Bracteacoccus sp. был определен как Bracteacoccus bullatus.

Следует подчеркнуть, что молекулярно-генетический анализ четырех штаммов, определенных нами как M. homosphaera по морфологическим признакам, показал, что ни один из этих штаммов не относится к этому виду и даже роду. Это обстоятельство еще раз подтверждает важность использования молекулярно-генетического анализа, особенно для таксонов с очень простой морфологической организацией.

Местообитания с низкими значениями реакции среды -Национальный парк Great Smoky Mountains (штаты Теннеси - Северная Каролина, США). Национальный парк Грейт Смоки Маунтинз (Great Smoky Mountains National Park - GSMNP) является биосферным заповедником, расположенным в горах Аппалачи, протянувшихся вдоль границы штатов Теннеси - Северная Каролина (США). Почвы исследованной территории были очень кислыми - от 3,5 до 5,8. Таким образом, изучение флоры наземных водорослей и цианобактерий GSMNP позволяет не только оценить биоразнообразие парка, но и сделать вывод об экологии видов, выдерживающих значительную кислотность.

В ходе исследования альгфлоры парка было обнаружено 45 видов водорослей и цианобактерий: Cyanobacteria - 3, Chlorophyta - 29 (Chlorophyceae

- 15, Trebouxiophyceae - 13, Ulvophyceae- 1), Streptophyta - 4, Bacillariophyceae

- 3, Xanthopyceae - 3, Dinophyta, Euglenophyta, Eustigmatophyceae - по 1 виду. Большая часть найденных видов относились к одноклеточным коккоидным формам. Найдено 20 новых таксонов для парка, включая виды Botrydiopsis cf. arhiza, Bracteacoccus medionucleatus, Chlorolobion lunulatum, Euglena mutabilis, Fernandiella alpina, Heterococcus sp. (рисунок 3, a), Myrmecia biatorellae, M. incisa, Pseudococcomyxa simplex, Stichococcus minor и другие. К числу наиболее часто встречающихся видов относились Stichococcus bacillaris, Klebsormidium flaccidum, Bracteacoccus minor и Pseudococcomyxa simplex (Khaybullina et al., 2010).

Флора наземных водорослей и цианобактерий GSMNP имела черты, типичные для сообществ лесных экосистем: небольшое разнообразие

цианобактерий и преобладание одноклеточных коккоидных водорослей классов Chlorophyceae и Trebouxiophyceae. Очень низкое число видов цианобактерий может объясняться низкими значениями pH.

Несколько таксонов, обнаруженных в лесных почвах GSMNP, часто доминировали в лесных почвах других частей мира: Chlorella cf. vulgaris, Bracteacoccus minor, Stichococcus cf. bacillaris, St. minor, Botrydiopsis cf. arhiza, Eustigmatos magnus (рисунок 3, в) и H. amphioxys (Koctíkob и др., 2001). Присутствие родов Chlorella, Klebsormidium и Xanthonema (рисунок 3, б) также является типичной чертой флоры лесных экосистем. Однако нами был обнаружен ряд видов, которые отражали экологию местообитания. Так, например, Rufusiella insignis (рисунок 3, д) и Eunotia exigua, являются индикаторами низких уровней pH и сильного увлажнения. Euglena mutabilis (рисунок 3, г) часто фиксируется в ручьях, загрязненных кислыми шахтными водами. Другой особенностью апьгофлоры GSMNP является наличие большого числа видов семейства Trebouxiophyceae. Эти водоросли известны как фикобионты многих лишайников. Обнаружение этих видов может быть связано с широким распространением лишайников на коре деревьев на почве и коре деревьев в парке.

Рисунок 3 - Эукариотические водоросли GSMNP: а - Heterococcus sp.; б -Xanthonema bristolianum; в - Eustigmatos cf. magnus; г - Euglena mutabilis-, д -Rufusiella insigni. Шкала - 10 (im (Khaybullina et al., 2010)

Таким образом, видовой состав флоры наземных водорослей и цианобактерий GSMNP имел черты, присущие лесным экосистемам и отражал приспособленность к существованию в условиях низкого уровня рН и высокой степени увлажнения почвы (Khaybullina et al., 2010).

Солончаки - Башкирское Зауралье (Россия). В ходе изучения видового состава наземных водорослей и цианобактерий солончаков Зауралья было выявлено 86 видов: Cyanobacteria - 33, Chlorophyta - 25 (Chiorophyceae - 18, Trebouxiophyceae - 7), Bacillariophyceae - 21, Xanthophyceae - 5, Streptophyta - 1, Eustigmatophyceae - 1 вид. На основании анализа встречаемости видов были выделены экологические группы видов с различной жизненной стратегией по отношению к засолению: облигатные олигогалобы (единичные экземпляры, угнетенные, не типичные для солончаков) - Dictyochloris fragrans, cf. Mychonastes homosphaera, Luticola cohniv, факультативные олигогалобы (не типичны для солончаков, но хорошо себя чувствуют при засолении) -Phormidium jadinianum, Leptolyngbya foveolarum; факультативные галофилы (редки в незаселенных местах) — Phormidium paulsenianum, Phormidium breve\ облигатные галофилы (только в солончаках - индикаторы засоления) - Amphora delicatissima (Хайбуллина, Гайсина, 2008).

Среди штаммов, выделенных в ходе изучения флоры солончаков Предуралья, одним из наиболее критических в таксономическом отношении является род Stichococcus. Для более точного определения штамма S4] Stichococcus sp. было проведено секвенирование генов 18S рДНК и участка ITS. Результаты показали, что как для последовательностей участка ITS, так и гена 18S рДНК, наиболее близким был штамм ССАР 379/3 Stichococcus mirabilis. Однако, несмотря на родство этих штаммов, они значительно отличались друг от друга по морфологии. Штамм S41 Stichococcus bacillaris имел большое сходство с другими штаммами Stichococcus bacillaris, например SAG 335-3 (рисунок 4, а, б). _______

Рисунок 4 - Морфологические особенности штаммов «Stichococcus»■. а - SAG 335-3 Stichococcus bacillaris-, б - S41 Stichococcus bacillaris. Шкала - 10 Jim

Для более точного определения штамма S41 Stichococcus bacillaris была построена модель вторичной структуры некодирующей последовательности ITS2, которая была сравнена со вторичными структурами участка ITS2 представителей рода Stichococcus и близкородственных групп. Анализ показал, что исследуемый штамм имеет такую же структуру петли Н2 во вторичной

структуре участка 1Т82, как и штамм АСКи 644 Ряеийовйскососсш топааапМйеь Ь.Моелуш (рисунок 5).

20 го

/Ч V/ /Л Ч

V/ / \

Т-А Т-А

С-в н с-а и

10—С-С.....30 10 —С-в— 30

Т-0 т-э

с-в о-а

т т н т т н

о-в с-э

с-о с-в

в-с в-с

т-с-т-^ т-в-т-сз

5' 3' 5' 3'

Рисунок 5 - Вторичная структура петли Н2 аутентичного штамма АСКи 644 РнеисЬэьпскососсж топаМаЫогйез Ь.Моелуш (слева) и штамма 841 БНсЪососсия

ЬасШапя (справа)

Сравнение последовательностей участка 1Т82 штаммов выявило одну замену в вариабельных одноцепочечных областях центральной петли 1Т82, которая не является существенной. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что штамм 841 & ЪасШапв по последовательности и вторичной структуре второй спирали 1Т82 идентичен аутентичному штамму Р. топа11апШс1ез. Это первая находка вида Р. топаПапШс1ез на территории России.

При исследовании флоры водорослей и цианобактерий засоленных почв Башкирского Зауралья было установлено доминирование в видовом составе нитчатых цианобактерий и мелкоклеточных диатомей, а также снижение роли зеленых водорослей (Хайбуллина, Гайсина, 2008).

Местообитания, загрязненные тяжелыми металлами - отвалы Сибайского филиала Учалинского горно-обогатительного комбината. В ходе изучения альгофлоры местообитания обнаружен 51 вид водорослей и цианобактерий: СуапоЬайепа - 12, СЫогорЬ^а - 26 (СЫогорЬусеае - 14, ТгеЬоихюрИусеае -11, ТЛуорЬусеае - 1), ВасШапорЬусеае - 8, Я^еризрЬуга - 4 и ХапЙюрЬусеае — 1. В пробах с отвалов возрастом 1-1,5 года было выявлено 11 видов водорослей и цианобактерий. Типичными видами были нитчатые или образующие слизь цианобактерии. Эти отвалы представляли собой самую раннюю стадию зарастания практически безжизненного субстрата, характеризующегося превышением предельно допустимых концентраций (ЦДК) по содержанию подвижных форм меди и кадмия, а также регионального геохимического фона по меди, кадмию, свинцу и цинку.

В пробах с отвалов возрастом 15-20 лет отмечалось увеличение числа видов всех таксономических групп до 22. Токсичность отвалов с возрастом уменьшалась, однако во всех пробах отмечалось превышение ПДК и регионального геохимического фона по содержанию кадмия и свинца. Было зафиксировано появление широко распространенных видов, однако встречались и такие редкие представители альгофлоры, как HormosäUa pringsheimii и Cystomonas cf. strarii. Скорее всего, это первые находки этих видов на территории России. Особый интерес вызывает обнаружение K.mucosum, образующего мощную слизь.

На отвалах возрастом 30-40 лет субстрат сохранял свою токсичность. Было обнаружено 45 видов цианобактерий и эукариотических водорослей. Так же, как и на 15-20-летннх отвалах, появлялись как широко распространенные виды, так и довольно редкие для наземных местообитаний Cyanothece aeruginosa и Deasonia sp. К интересным находкам следует отнести и Inlerfilum massjukiae. На отвалах возрастом 15-20 и 30-40 лет наблюдалось формирование микробиотических корочек, играющих важную роль в зарастании отвалов вскрышных пород.

В исследованном местообитании в основном были обнаружены таксоны, характерные для отвалов и других промышленно загрязненных территорий. Однако также найдены и воды, широкое распространение которых оказалось неожиданностью. К их числу следует отнести цианобактерию Trichocoleus cf. hospitus с очень тонкими бесцветными трихомами, Этот вид широко распространен в наземных экосистемах, однако его роль в альгогруппировках крайне недооценена. К этой же группе «недооцененных» таксонов можно отнести Leptolyngbya voronichiniam, а также CMorosarcinopsis gelatinosa.

В ходе изучения водорослей отвалов был выделен штамм Dumps 5(2) Scotiellopsis, который по морфологии можно было отнеста к семейству Scenedesmaceae, однако точное определение водоросли только по морфологическим признакам было затруднительно, Последовательность участка ITS штамма Dumps 5(2) Scotiellopsis длиной 669 пн. была наиболее сходной с последовательностями трех штаммов Scenedesmus obliquas (--Acutodemus obliquas) (Score-646, Identities-99%): CCAP 279/46 (FR865738), CCAP 276/49 (FR865726), CCAP 276/2 (FR863715). Высокая степень сходства (Score=643, Identities=99%) была установлена также еще с двумя штаммами Scenedesmus obliquas (CCAP 276/7 FR865737 и ССАР276/ЗВ FR863719) и штаммом EU729732 Scenedesmus sp. Это обстоятельство позволило нам определить Dumps 5(2) Scotiellopsis как Acutodesmus cf. obliquas. Следует отметить, что штаммы с наиболее близкими последовательностями участка ITS были выделены из разнообразных пресноводных местообитаний в Европе, Южной Америке и Африке. Данные молекулярно-генетического анализа подтверждают сведения о широком географическом распространении Acutodesmus obliquas в пресноводных местообитаниях по всему миру (Komárek, Fott, 1983), однако в почве этот вид встречается единично (Царенко, 1990). На основании анализа морфологии и молекулярно-генетических методов были также определены штаммы Dumps 6 Chlorella sp., Dumps 7Myrmecia sp., Dumps 5 (2) Deasonia sp.,

Dumps 5 Cystomonas sp., Dumps 3 (2) Hormoscilla pringsheimii, Dumps 4 cf. Micractinium sp.

Таким образом, видовой состав апьгогруппировок отвалов Сибайского филиала Учалииского горно-обогатительного комбината был представлен в основном нитчатыми цианобактериями, коккоидными эукариотическими водорослями, формами водорослей, образующими слизь, и отражал различные стадии восстановления субстрата.

Водоросли вулканических выбросов - Камчатка. В результате исследования альгофлоры вулканов Мутновский и Горелый было обнаружено 20 видов водорослей и цианобактерий: Cyanobacteria — 4, Chlorophyta - 14 (Chlorophyceae - 9, Trebouxiophyceae - 5), Streptophyta - 1 и Eustigmatophyceae -1. Обнаруженные виды можно разделить на следующие группы: космополиты Leptolyngbya foveolarum, Klebsormidium flaccidum, Trichocoleus cf hospitus, Eustigmatos magnus, Chlorella sp., Pseudococcomyxa sp., Bracteacoccus sp.; виды, устойчивые к экстремальным факторам — Scotiellopsis levicoslata и Parietochloris cf. cohaerens, типичные для вулканических выбросов; Fischerella cf major, распространенная в местообитаниях с высокой кислотностью; эукариотические водоросли, обладающие мощной слизью и цианобактерии со слизистыми чехлами — CMamydocapsa cf. lobata, Neocystis sp., Calothrix cf brevissima.

В литературе имеются сведения о том, что при зарастании вулканических выбросов первопоселенцами являются одноклеточные зеленые водоросли, заносимые с пылью (Штина, 1991). Однако наши исследования показали, что на самых ранних стадиях сукцессии появляются также нитчатые зеленые водоросли и цианобактерии, а также считающимися неустойчивыми к экстремальным факторам представители класса Eustigmatophyceae. Идентификация штаммов К 10-5 Leptosira sp., К9 Myrmecia sp., Kl Neocystis sp., K2 Neocystis sp. была подтверждена путем секвенирования гена 18S рДНК и участка ITS.

Сравнение особенностей цианобактериально-водорослевых флор экстремальных местообитаний. Установлено, что ряд видов и родов водорослей обнаруживается практически во всех типах экстремальных местообитаний, которые можно отнести к числу видов космополитов и убиквистов.

Результаты изучения цианобактериально-водорослевых флор показали, что наши знания об экологии и географическом распространении этих организмов крайне ограничены. При исследовании классические методы исследования следует дополнять молекулярно-генетическими подходами. Это особенно актуально для мало изученных и экстремальных местообитаний, в которых многие водоросли и цианобактерии теряют типичную морфологию.

ГЛАВА 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НА ЦИАНОБАКТЕРИИ И ВОДОРОСЛИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

В результате анализа данных литературы и собственных исследований цианобактериально-водорослевых флор на территорию ЮУР и в ряде

экстремальных местообитаний было установлено, что ряд таксонов характеризовался практически повсеместной встречаемостью: Bracteacoccus minor, Pseudococcomyxa simplex, Eustigmatos magnus, Klebsormidium flaccidum, Xanthonema exile, представители родов Chlorella (типовой вид Chlorella vulgaris), Chlorococcum (типовой вид Chlorococcum infusionum) и Microcoleus vaginatus. В этой связи, особый интерес представляло изучение устойчивости этих видов к экстремальным экологическим факторам в лабораторных условиях.

При исследовании влияния положительных и отрицательных температур, pH, засоления, солей тяжелых металлов, гербицидов и удобрений на аутентичные и референтные штаммы исследуемых видов было проведено 69 экспериментов.

Границы устойчивости морфологического статуса видов к экстремальным экологическим факторам представлены в таблице 2. Показано, что устойчивость к высоким положительным температурам колебалась в пределах 44-50°С. Наиболее чувствительным видом был К. flaccidum, сохранявшим морфологию до температуры 44°С, наиболее устойчивым оказался В. minor, выдерживающий нагревание до 50°С. Остальные виды сохраняли свою морфологию до 46-48°С.

Замораживание оказывало воздействие на все виды, кроме В. minor и М. vaginatus. Морфологические изменения выражались в грануляции цитоплазмы и изменении окраски хлоропластов (таблица 2).

Исследованные виды различались по чувствительности к изменению pH. Если в кислом диапазоне пограничным значением, после которого начинались морфологические изменения, были 3,5-4, то в щелочном интервале предельными значениями были 8-11,5. Наиболее толерантными к изменению pH были Ch. vulgaris, P. simplex и К. flaccidum, наименее устойчивой-X. exile (таблица 2).

Таблица 2 - Сравнение воздействия экологических факторов на исследуемые

—^Фактор Вид tnon tfftp pH NaCl Na2C03 CuCh NiCh MnCk

В. minor 50° - 4-10 0,5 0,05 lxlO"2 lxlO"3 1

Ch. infusionum 46° + 4-9,5 0,5 0,05 lxlO"3 1x10"* 1

Ch. vulgaris 46° + 4-11,5 1 0,01 1x10° lxlO"3 1

P. simplex 46° + 4-11,5 0,1 0,01 1x10° lxlO'3 lxlO'1

E. magnus 46° + 3,5-11 0,2 0,005 lxlO"3 lxlO"4 1

X. exile 46° + 4-8 0,2 0,01 lxlO"7 lxlO'3 lxlO"1

К. flaccidum 44° + 4,5-11 0,35 0,05 lxlO"3 lxlO"2 1x10"'

M. vaginatus 48° - 4-11 0,35 0,005 lxlO"3 lxlO"4 lxlO'2

Примечание. В таблице указаны значения факторов, при которых фиксируются минимальные изменения; 1,гол - высокие положительные температуры; ^ - замораживание; знаком «-» обозначено отсутствие воздействия, знаком «+» обозначено наличие воздействия; концентрации токсикантов приведены в моль/л.

Анализ устойчивости водорослей и цианобактерий к засолению показал, что карбонат натрия был токсичнее хлорида натрия для всех видов. Толерантность к NaCI была в пределах 0,1-1 моль/л. Наиболее устойчивой была СЛ. vulgaris, наименее устойчивой - P. simplex. Изученные виды выдерживали внесение соды без изменения морфологического статуса в концентрациях 0,0050,05 моль/л, наибольшую устойчивость проявили В. minor, Ch. infusionum и К. flaccidum, наименьшую — Е. magnus и М. vaginatus.

Среди исследованных хлоридов тяжелых металлов (меди, никеля и марганца) более токсичными оказались хлориды меди и никеля. При внесении хлорида меди изученные виды сохраняли свою морфологию при концентрациях 1х10~7-1х10~2 моль/л, наиболее устойчивым был В. minor, наиболее чувствительной — X. exile (Гайсина, Хайбуллина, 2007). Наибольшую резистентность к хлориду никеля показал К. flaccidum, выдерживающий концентрации до 1хЮ'2 моль/л, наименее устойчивыми были Ch. infusionum, Е. magnus, М. vaginatus, морфология которых сохранялась до концентрации lxlO"4 моль/л включительно. Устойчивость к хлориду марганца колебалась в пределах от 1хЮ'2 моль/л для М. vaginatus до 1 моль/л для В. minor, Ch. infusionum, Ch. vulgaris и E. magnus.

При изучении влияния гербицидов бетанала, триаллата и минеральных удобрений мочевины, суперфосфата, хлорида калия на морфологические признаки штамма № 1 Xanthonema exile был установлен следующий ряд токсичности: бетанал > триаллат > хлорид калия > суперфосфат > мочевина. Концентрации триаллата 10*3 и бетанала 10"5—10"3 моль/л вызывали грануляцию цитоплазмы, обесцвечивание и полное разрушение клеток водоросли. Концентрации суперфосфата 2х 10°, хлорида калия Зх 10"1 и мочевины 1,7 моль/л вызывали полное разрушение клеток (Гайсина и др., 2010).

Эксперименты позволили выявить несколько типов изменения биологического объема водорослей и цианобактерий при воздействии экологических факторов: линейное уменьшение биологического объема, линейное увеличение биологического объема, полиномиальное уменьшение объема клеток с последующим увеличением, полиномиальное увеличение объема клеток с последующим уменьшением, отсутствие влияния.

ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ВОДОРОСЛЕЙ

Результаты проведенных исследований показали преимущества использования современных молекулярно-генетических методов при исследовании географического распространения и экологии водорослей.

1. Повышение качества идентификации видов. В ходе изучения флоры наземных водорослей и цианобактерий в естественных местообитаниях на территории ЮУР и в ряде экстремальных местообитаний было обнаружено 356 видов и внутривидовых совокупностей водорослей и цианобактерий: Cyanobacteria - 81, Chlorophyta — 211 (Chlorophyceae — 130, Trebouxiophyceae -

78, Ulvophyceae—3), Bacillariophyceae-30, Streptophyta-14, Xanthophyceae -15, Eustigmatophyceae-3, Euglenophya- l.Dinopthyta-1. Точность определения 121 штамма эукариотических водорослей и 2 штаммов цианобактерий, относящихся к 56 видам, была подтверждена молекулярно-генетическими исследованиями: для 121 штамма водорослей были получены последовательности некодирующего участка ITS, для 15 штаммов, наряду с последовательностями участка ITS, были определены последовательности гена 18S рДНК; 2 штамма цианобактерий были секвенированы по участкам 16S-23S ITS и 16S рДНК.

Проведенные исследования позволили выявить ряд таксонов, для определения которых использование молекулярно-генетических маркеров является необходимым условием: род Pseudostichococcus, морфологически сходный с родом Stichococcus; род Mychonastes, представители которого похожи на водоросли родов Muriella, Nannochloris, Micractinium. Нами были получены данные, подтверждающие результаты предыдущих исследований о существовании морфологически идентичного комплекса видов Microcoleus vaginatus - Phormidium autumnale (Strunecky et al., 2010; Hasler et al., 2012).

Необходимо отметить, что в настоящее время в мировых базах данных имеется ограниченное число последовательностей кодирующих и некодирующих участков рДНК водорослей, что является свидетельством крайней недостаточности использования молекулярно-генетических методов при изучении биоразнообразия этих групп организмов. Например, нам не удалось найти в NCBI последовательностей для таких родов и видов как Deasonia, Cystomonas, Boîrydiopsis arhiza, Hormoscilla pritigsheimu и многих других.

2. Описание новых таксонов водорослей. Сочетание традиционных морфологических подходов с методами молекулярно-генетического анализа позволяет не только точно определять уже известные виды, но и описывать новые таксоны. В качестве одного из примеров можно привести обнаружение нами нового рода и вида Chloropyrula uraliensis Gaysina, Eliââ, Nëmcovâ & Skaloud (Trebouxiophyceae, Chlorophyta).

В ходе изучения флоры водорослей ЮУР был выделен штамм, обладающий уникальными морфологическими характеристиками, отличающими его от других известных видов водорослей. Секвенирование участка гена 18S рДНК показало, что этот штамм занимает обособленное филогенетическое положение внутри класса Trebouxiophyceae. Детальное изучение штамма позволило обнаружить уникальные особенности ультраструктуры, позволившие нам описать его как новый род и вид Chloropyrula uraliensis (Gaysina et al., 2013).

Особенности морфологии С. uraliensis. Водоросль характеризовалась следующим комплексом морфологических признаков: клетки одиночные или объединены в псевдонитчатые, более или менее случайные группы клеток; одноядерные; яйцевидные, грушевидные, шаровидные, эллипсоидные или редко неправильной формы (рисунок 6, а-г). Хлоропласт пристенный с несколькими долями, без пиреноида, края хлоропласта волнистые или разделены на пальцевидные доли (рисунок 6, и, к). Бесполое размножение автоспорами и

двужгутиковыми зооспорами (рисунок 6, д-ж), половое размножение не наблюдалось. В старых культурах (возрастом 2-6 месяцев) клетки становятся желтоватыми и очень гранулированными (рисунок 6, з). Характерной особенностью водоросли являются грушевидные клетки, наблюдаемые преимущественно на агаризованных средах. Название рода водоросли происходит от слов сМогов - «зеленый» с греческого, и руги1а - «грушевидная» с латинского и отражает морфологию грушевидных клеток, часто наблюдаемых в культуре, название вида «га//е/ик отражает место обнаружении вида -территория Урала (зона широколиственных лесов возле села Красноусольский, 53° 55' 42.24" N. 56° 31' 22.58" Е) (вауэта й а1„ 2013).

Рисунок 6 - СМогоруЫа игсйШгж gen. е1 зр, псу., морфология клеток под световым и конфокальным микроскопом: а - колония молодых клеток в жидкой среде; б - зрелые шаровидные клетки в жидкой среде; в - колония клеток на агаризованней среде; г - грушевидные клетки на агаризованной среде; д -зооспорангий с зооспорами; е - зооспоры; ж - автоспорангий с автоепорами; з -старые клетки; и - хлорошшсты в молодых клетках с пальцевидными выростами; к - хлоропласта в зрелых клетках с волнистыми краями и впадинами. Шкала- 10 цт (Оаушт е! а!., 2013)

Особенности ультраструктуры вегетативных клеток С, игаНепт. Молодые автоспоры окружены материнской оболочкой (рисунок 7, а). Вновь

образованная клеточная стенка состоит из трех слоев: внутреннего электронно-плотного, среднего более светлого, и внешнего, образованного плотно расположенными микрофибриллами (рисунок 7, г, ж). Ядро центральное, окружено цитоплазмой и крупным пристенным хлоропластом с несколькими долями. Цитоплазма содержит вакуоли с электронно-прозрачным содержимым. Запасной полисахарид (полиглюкан) хранится в хлоропласте в форме зерен крахмала (рисунок 7, б). На поперечном сечении клеток пиреноид не обнаружен. Наиболее интересной особенностью ультраструктуры является наличие крупных микрофибриллярных сгустков (МФС), расположенных на периферии клеток и часто прижатых к хлоропласту (рисунок 7, б, в). При детальном рассмотрении эти структуры можно увидеть и на фотографиях, выполненных при помощи световой микроскопии (рисунок 6, б). На фотографиях, выполненных при помощи конфокального микроскопа, они выглядят как округлые впадины на поверхности хлоропластов (рисунок 6, к). МФС 1,5-2,5 мкм в диаметре, матрикс сгустков имеет более темную окраску в центре, участки на периферии имеют более светлую окраску (рисунок 7, в). Сгустки состоят из микрофибрилл диаметром 2-4 нм. Нам удалось проследить «раскручивание» МФС вблизи плазматической мембраны с образованием пучков из 3-5 микрофибрилл (рисунок 7, д-ж). Мы предполагаем, что пучки будут продавливаться к поверхности клетки через плазматическую мембрану. Для определения природы МФС клетки были окрашены при помощи красителя Calcofluor white, вступающего в неспецифическую реакцию с различными полисахаридами (Herth, Schnepf, 1980). Как клеточные стенки, так и сгустки окрасились (рисунок 7, з-л) (Gaysina et al., 2013).

Филогенетическое положение C.uraliensis. Секвенирование гена 18S рДНК C.uraliensis выявило отсутствие интронов. Сравнение последовательности С. uraliensis с последовательностями из GenBank показало ее наибольшее сходство с последовательностями водорослей из класса Trebouxiophyceae, причем последовательности Leptosira obovata, L. terrestris и Parietochloris alveolaris были наиболее схожими (96% сходства). Принадлежность С. uraliensis к классу Trebouxiophyceae была подтверждена филогенетическим анализом, включающим большое число последовательностей водорослей из этого семейства, а также последовательностей водорослей из других классов «настоящих» зеленых водорослей Chlorophyceae, Ulvophyceae, Chlorodendrophyceae. На филогенетическом дереве, обобщающем полученные результаты (рисунок 8), последовательность С. uraliensis располагается в кладе с большой статистической поддержкой (ML бутстреп поддержка 93%, байесовская постериорная вероятность 1.00) вместе с последовательностями родов Leptosira.

Однако различия между Leptosira spp. и С. uraliensis были настолько значительными, что позволило нам описать С. uraliensis в качестве отдельного рода. Таким образом, установленные нами морфологические и ультраструктурные особенности С. uraliensis вместе с обособленным филогенетическим положением по гену 18S рДНК позволяет нам описать этот род и вид как новый для науки (Gaysina et al., 2013).

Рисунок 7 - Chloropyrula uraliensis gen. et sp. nov., ультраструктура и характеристики клеточной стенки: а - молодые автоспоры, окруженные материнской клеточной стенкой (mew), микрофибриллярный сгусток, или МФС (mfc); б - зрелые клетки, хлоропласт (ch), ядро (пи), зерна крахмала (stg), вакуоли (va); в - МФС; г - детали строения трехслойной клеточной стенки, митохондрия (т); д-ж - разматывание МФС; д - пучки микрофибрилл (mf); е -детали строения МФС; ж - детали не размотанных пучков микрофибрилл (mf), наружная клеточная стенка (ocw) сформирована микрофибриллами; з, и -эпифлюоресцентная микроскопия высушенных клеток, окрашенных 1 % Calcofluor white; к - окрашенные клетки в светлом поле микроскопа; л -флуоресцентная микроскопия клеток. Шкалы: а, б, д - 1 цт; в, г, е, ж - 0,5 |_im; з-л - 10 цт (Gaysina et al., 2013).

- 0.01 substitutions/site

-EU105208 XylocblortS irregularis CAUP H 7802 JX070625 Chloropyrula urallensis CAUP H 8401 100/1 00 IZ68696 ¿-epfos/re erumpens UTEX 979

-:-' Z68695 Leptoslra obovata SAG 445-1

¡Z2B973 Leptosira lerrestris SAG 463-3

-JQ920360 Neocystis brevis CAUP D 802

54/./-X74000 "Chlorella" mirabilis Andreyeva 748-I

•AF278743 RapNdonema sempervirens

U05039 Tetraselmis convolutae -AB183610 Ollmannsiellopsis geminate MBIC10525

-A8110440 Pseodocharacium americanum UTEX 2112

-AY278217 Ulothrix zonata UTEX 745

-M32703 Chlamydotnonas reinhardtil DQ078295 Oedogonium subptaglostomum ■AY779858 Hydrodictyon reliculatum strain CBS 4J83125_C/)eeiope///s orbicularis 174 Microthamnion ku ■M62999 Coieochlamys perforata

Chiorodendrophyceae -Ulvophyceae

Chlorophyceae

Microthamniales I

-AF387151 Geminelte minor GR-36

Chloropyrula urallensis gen. et sp. nov -

Elliptochioris subsphaerice CCAP 264-3 >275461 Slichococcus jenerensis strain D 4 J311638 Stichococcus mirabilis CCAP 379/3

FJ896222 Pseudomarvania aerophyllca CAUP H 7301

iF 189076 Prasiola mexicana Cr24 -AF387148 Planctonema sp. M110-1

—AF228688 Oocystis solilaria SAG 83.80

9 Protoihoca wlckeritamii Pore 1283 —AB012845 Murlells tonestris ASiB V38 AB162910 Chlorella vulgaris N!ES-227 98/7.PPr—-AB080300 Nonnocbloris bocilleris

AF278744 Koliella splculiformis ■AF516675 Chlorella 8p. BC4-VF9

-EF688289 Elliptochioris bilobata var. corllcola CAUP H7103 ■AY762603 Coccomyxe pringsheimH SAG 69.80

-AJ581913 Bolryococcus braunii CCAP 807/1 •AB109544 Choricystis minor OL2-1 —AY762602 Lobosphaera indsa SAG 2007

—Z21551 Trebouxla Impressa UTEX 892 ■228971 Myrmecia biatorellae UTEX 907

-AB080310 Astarochloiis eric11 AM C-593 ■AF387155 Radlofllum conjunctlvum GR-2

-247207 Dictyochloropsis reticulata CCHU 5616 •FR693368 Apatococcus lobatus ROS 7/3 ■AJ306536 HKoliella" corcontica SAG 24.84

•AJ439401 Viridiella fridericiana strain 237 73991 Watanabea reniformis SAG 211-9b

Qj/j qq ---AB058310 Chtoroidium saccharophllum MBIC10092

Choricystis/Botryococcus clade

□

Trebouxiales j Watanabea clade

- EU346910 Kalinella bambusicola CAUP H 7901

-X73997 Heterochlorella luteoviridis SAG 21i-2a

Рисунок 8 - Филогенетическое положение Chloropyrula uraliensis gen. et sp. nov. по данным последовательностей гена 18S рДНК. Филогенетическое дерево построено с использованием модели ML методом RAxML (GTR+r+I). Цифры показывают уровень бутстреп поддержки RAxML поиска / Байесовская постериорная возможность (показаны

уровни > 50/0.95) (Gaysina et al., 2013)

3. Возможность экстраполяции результатов лабораторных экспериментов на природные условия. Использование в экспериментах аутентичных и референтных штаммов с известными последовательностями позволяет использовать информацию, содержащуюся в мировых базах данных, например NCBI. В этой базе имеется информация о последовательностях по основным генетическим маркерам, в том числе 18S рДНК и последовательностям некодирующих участков (ITS). Используя алгоритм BLAST, можно найти наиболее сходные последовательности. Для каждой последовательности указывается сведения о публикации, в которой были представлены результаты исследования, информация о штаммах и местообитаниях, откуда эти штаммы были выделены.

Таким образом, зная последовательность штамма (для аутентичных штаммов информация о последовательностях обычно имеется в NCBI), можно определить, в каких местообитаниях был обнаружен идентичный (или очень похожий) генотип.

При анализе данных следует учитывать, что последовательности генов 18S рДНК и участок ITS у эукариотических водорослей, 16S и участок 16S-23S ITS цианобактерий дают разную информацию: если гены 18S и 16S рДНК позволяют судить о филогенетическом положении организма, то последовательности участка ITS позволяют определять видовую принадлежность (Boyer et al., 2001; Friedl, Lorenz, 2012). При необходимости, для аутентичных штаммов можно найти информацию и по другим маркерам, например, rbcL, и провести соответствующий анализ.

Исходя из результатов изучения флористических особенностей и географического распространения наземных водорослей и цианобактерий, была установлена практически повсеместная встречаемость ряда видов, в том числе модельных, используемых в аутэкологических экспериментах.

Мы решили проверить, насколько данные о распространении модельных видов по флористическим данным согласуются с нуклеотидными последовательностями, представленными в международных базах данных. Для этого последовательности аутентичных и референтах штаммов были сравнены с последовательностями из GenBank. Анализ показал, в GenBank депонированы несколько последовательностей, имеющих 99-100% сходство с последовательностью гена 18S рДНК штамма UTEX 66 Bracteacoccus minor (субкультура штамма ACKU 506-06). Кроме того, эти штаммы идентичны по последовательности участка ITS2, что позволяет сделать вывод об их принадлежности к виду В.minor. В аутэкологических экспериментах было установлено, что среди исследованных модельных видов ACKU 501-06 Bracteacoccus minor был наиболее устойчивым к влиянию высоких положительных температур и хлорида натрия. Генетически сходные штаммы B.minor были выделены из почвы пустыни Негев, где в июле температура почвы днем может достигать 90° С (Дембицкий и др., 2001), и из почвы морского пляжа в Румынии с высокой степенью засоления.

Таким образом, существует определенная корреляция между результатами лабораторных экспериментов и данными об экологических особенностях

природных популяций В.minor. Для получения более объективных результатов необходимо проведение молекулярно-генетического анализа с использованием большого числа штаммов В. minor, выделенных из разнообразных местообитаний по всему миру.

Анализ последовательностей гена 18S рДНК, имеющих 99-100% сходство с последовательностью аутентичного штамма ACKU 531-06 Chlorella vulgaris, показал, что штаммы высокой степенью сходства были обнаружены в пресноводных экосистемах по всему миру: в Европе, Северной и Южной Америке, Азии. Такие же результаты были получены при анализе последовательности некодирующего участка ITS. Однако среди 23 штаммов, имеющих высокую степень сходства последовательностей, только один был выделен из наземных местообитаний. В то же время, в настоящее время трудно найти работу, посвященную изучению флоры почвенных или наземных водорослей и цианобактерий, в которой бы не был приведен вид Chlorella vulgaris.

Нам не удалось найти информацию о последовательностях аутентичного штамма ACKU 539-06 Chlorococcum infusionum в NCBI.

Для аутентичного штамма ACKU 559-06 Pseudococcomyxa simplex (FN298926) в GenBank депонирована только одна последовательность, имеющая 99% сходство по последовательности гена 18S рДНК - последовательность штамма CAUP H 102 P. simplex (НЕ586504).

Нами было проведено изучение разнообразия комплекса Eustigmatos/ Vischeria и его морфологических и молекулярно-генетических перспектив с использованием 97 штаммов: 22 штамма были получены из коллекций водорослей, в том числе и штамм ССМР 387=UTEX 2351 Eustigmatos magnus, 75 изолятов были выделены из различных местообитаний по всему миру, включая пустыни юго-запада США, пустыню Атакаму, Камчатку и Антарктику. Были получены последовательности участка ITS2, которые были использованы для построения филогенетического дерева. Установлено, что внутри комплекса Eustigmatos/Vischeria существует большое число так называемых «криптических» (скрытых) видов, распространение которых не подчиняется каким-либо географическим закономерностям. ССМР 387 Emagnus располагался в одной кладе со штаммом PR 1-17 E.magnus, выделенным с территории Башкирского государственного заповедника, а также штаммом ME 14 E.magnus, выделенным с территории Чехии. Полученные данные свидетельствуют о том, что генетически сходные популяции вида Emagnus обитают на территории Новой Зеландии (откуда был выделен штамм ССМР 387), Чехии и России, что может указывать на широкое распространении данного генотипа.

Наши исследования показали, что применение молекулярно-генетических методов позволяет проводить изучение флоры, географии и экологии наземных водорослей и цианобактерий на более высоком качественном уровне: описывать новые таксоны, проводить точную идентификацию и экстраполировать результаты аутэкологических экспериментов на природные условия.

выводы

1. В ходе изучения флоры наземных водорослей и цианобактерий ЮжноУральского региона и в ряде экстремальных местообитаний было обнаружено 356 видов и внутривидовых совокупностей водорослей и цианобактерий: Cyanobacteria - 81, Chlorophyta - 211 (Chlorophyceae - 130, Trebouxiophyceae -78, Ulvophyceae —3), Bacillariophyceae-30, Xanthophyceae-15, Streptophyta—14, Eustigmatophyceae-3, Euglenophya-1, Dinopthyta— 1. Точность определения 121 штамма, относящегося к 56 видам, была подтверждена молекулярно-генетическими методами. Ряд таксонов наземных водорослей и цианобактерий впервые обнаружен на территории Башкирии и России: Pseudostichococcus monallantoides, Desmodesmus armatus var. subalternans, Hormoscilla pringsheimii, Cystomortas cf. starii и другие. Установлено влияние фактора зональности на экологические особенности наземных цианобактериально-водорослевых флор Южно-Уральского региона: число видов возрастало от бореально-лесной к лесостепной зонам и затем уменьшалось к степной зоне, однако число видов на пробу от бореалыю-лесной зоны к степной уменьшалось. Использование приемов молекулярного анализа является критическим моментом при изучении флоры водорослей экстремальных местообитаний.

2. Использование методов молекулярно-генетического анализа является одним из необходимых условий изучения не только современной филогении и таксономии наземных водорослей и цианобактерий, но и исследования альгофлоры различных территорий. Спейсерные участки ДНК (ITS у эукариотических водорослей и 16S-23S цианобактерий), в ряде случаев в сочетании с геном 18S рДНК, являются наиболее перспективными маркерами, позволяющими достаточно точно определять видовую принадлежность организмов. Выявлены комплексы морфологически сходных видов, точная идентификация которых практически невозможна без использования методов молекулярно-генетического анализа: Pseudostichococcus — Stichococcus, Mychonastes — Muriella — Nannochloris — Micractinium.

3. Благодаря интеграции морфологических, молекулярно-генетических методов с подходами конфокальной и электронной микроскопии был описан новый род и вид водорослей Chloropyrula uraliensis Gaysina, EliâS, Nëmcovâ & Skaloud (Trebouxiophyceae, Chlorophyta), представляющий собой новую филогенетическую линию, родственную роду Leptosira, с уникальными морфологическими и цитологическими признаками.

4. В ходе изучения флоры исследованных территорий создана коллекция ВСАС (Bashkortostan Collection of Algae and Cyanobacteria — Коллекция водорослей и цианобактерий Башкортостана), которая зарегистрирована в World Federation of Culture Collections (WFCC) (WDCM 1023) (http://www.wfcc.info/ccinfo/collection/by_id/1023). ВСАС насчитывает 1220 штаммов, относящихся к 6 таксономическим группам: Cyanobacteria - 214, Chlorophyta - 815, Eustigmatophyceae — 61, Xanthophyceae — 57, Streptophyta — 52, Bacillariophyceae — 21 вид.

5. Границы устойчивости морфологического статуса референтных штаммов ACKU 506-06 Bracteacoccus minor, ACKU 539-06 Chlorococcum infusionum, ACKU 531-06 Chlorella vulgaris, ACKU 559-06 Pseudococcomyxa simplex, UTEX 2351 Eustigmatos magnus, ACKU 608-06 Klebsormidium flaccidum, 3K Microcoleus vaginatus, Xanthonema exile к высоким положительным температурам составляют 44-50°С; к pH -3,5-11,5; хлориду меди - Ixl0"7-lxl0"2 моль/л, хлориду никеля - 1x10^-1x10"2 - моль/л, хлориду марганца 1хЮ"2-1 моль/л; NaCl - 0,1-1 моль/л, Na2C03 -0,005-0,05 моль/л.

6. При изучении влияния гербицидов бетанала, триаллата и минеральных удобрений мочевины, суперфосфата, хлорида калия на морфологические признаки штамма № 1 Xanthonema exile был установлен следующий ряд токсичности: бетанал > триаллат > хлорид калия > суперфосфат > мочевина. Концентрации триаллата 10'3 и бетанала 10"5—10 3 моль/л вызывали грануляцию цитоплазмы, обесцвечивание и полное разрушение клеток водоросли. Концентрации суперфосфата 2х10"3, хлорида калия 3* 10"' и мочевины 1,7 моль/л вызывали полное разрушение клеток.

7. Показано, что использование в аутэкологических экспериментах референтных штаммов с известными последовательностями по основным маркерным генам позволяет оценивать границы распространения наземных водорослей и цианобактерий, а также экстраполировать эти результаты на природные условия.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Монографии

1. Гайсина Л.А., Фазлутдинова А.И., Кабиров P.P. Популяционная альгология. Уфа: Гилем, 2008. 143 с.

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для защиты

докторских диссертаций

1. Gaysina L., Nemcová Y., Skaloud P., Sevcíková Т., Eliás M. Chloropyrula uraliensis gen. et sp. nov., a new green coccoid alga (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) isolated from soil in South Urals // Journal of Systematics and Evolution. 2013. Vol.51. Issue 4. P. 476-484.

2. Бакиева Г.Р, Хайбуллина JI.C., Гайсина JLA., Кабиров P.P. Эколого-флористический анализ почвенных водорослей и цианобактерий гор рифового происхождения Тра-Тау и Юряк-Тау (Россия) // Почвоведение. 2012. № 9. С. 974982.

3.Кабиров P.P., Гайсина Л.А., Сафиуллина Л.М. Использование универсальных критериев для оценки экологического состояния почвенных альгоценозов // Экология. 2010. № 4. С. 266-270.

4. Khaybullina L.A., Gaysina L.A., Johansen J.R., Krautova M. Examination of the terrestrial algae of the Great Smoky National Park, USA // Fottea. 2010. 10 (2). P. 201-215.

5. Гайсина Л.А., Абузарова Л.Х., Бакиева Г.Р. Оценка токсического воздействия гербицидов на почвенную водоросль Xanthonema exile (Klebs) Silva (Xanthophyta) // Агрохимия. 2010. № 2. C.67-73.

6. Gaisina L.A., Kabirov R.R. Morphometric variability of Xanthonema exile (Klebs) Silva (Xanthophyta) from Bashkir Pre-Ural Region (Russia) // International Journal of Algae. 2006. Vol.8 (1). P. 32-42.

7. Кабиров P.P., Гайсина JI.A. Показатели продуктивности почвенных водорослей в наземных экосистемах Н Почвоведение. 2009. № 12. С. 14751480.

8. Хайбуллина JI.C., Гайсина JI.A. Влияние засоления на состав и морфологические особенности почвенных водорослей // Почвоведение. 2008. № 2. С. 241-247.

9. Гайсина Л.А, Хайбуллина JI.C. Влияние тяжелых металлов на морфологию почвенной водоросли Xanthonema exile (Klebs) Silva (Xanthophyta) // Почвоведение. 2007. №3.C. 343-347.

10. Гайсина JI.A. Воздействие экстремальных температур на Xanthonema exile (Klebs) Silva (Xanthophyta) // Экология. 2006. № з.с. 236-240.

П.Суханова Н.В., Фазлутдинова А.И., Гайсина JI.A., Богданова A.B. Флора почвенных водорослей и цианобактерий г. Нефтекамск // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Т.13. № 5 (2). 2011. С. 115-117.

12. Бакиева Г.Р., Гайсина Л.А., Сафиуллина JI.M., Пурина Е.С. Анализ особенностей пространственной организации альгоценозов лесных экосистем Южно-Уральского государственного природного заповедника (ЮУГЗ) // Вестник Оренбургского университета. 2009. № 6. С. 56-59.

13. Богданова A.B., Гайсина JI.A., Фазлутдинова А.И., Суханова Н.В. Флора почвенных водорослей и цианобактерий техногенно-засоленных территорий Башкирского Предуралья // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Т. 12. № 1 (4). 2010. № 3. С. 989-992.

14. Гайсина JI.A. Научная иллюстрация и ее роль в современной биологии // Аграрная Россия. Специальный выпуск. 2009. С.З.

15. Сафиуллина JI.M., Бакиева Г.Р., Гайсина JI.A. Влияние тяжелых металлов на Eustigmatos magnus (B.Petersen) Hibberd (Eustigmatophyta) // Аграрная Россия. Специальный выпуск. 2009. С. 58.

16. Гайсина Л.А., Бакиева Г.Р, Мухаметова Г.М. Использование Xanthonema exile (Klebs) Silva (Xanthophyta) при оценке токсичности снега и воды. Вестник Оренбургского государственного университета. Проблемы экологии Южного Урала. Часть 1. Выпуск 75. 2007. С. 70-72.

17. Абузарова JI.X., Гайсина Л.А. Влияние гербицидов на морфологию почвенной азотфиксирующей синезеленой водоросли Cylindrospermum michailovskoense Elenk. (Cyanobacteria). Вестник Оренбургского государственного университета. Проблемы экологии Южного Урала. Часть 1. Выпуск 75. 2007. С. 13-16.

Статьи в зарубежных изданиях

1. Гайсина JI.A., Сафиуллин С.Ю., Бакиева Г.Р., Исламова А.И., Мансурова А.Р. Предварительное исследование почвенных водорослей и цианобактерий в степной зоне Башкирского Зауралья // Проблемы биогеохимии и геохимической экологии. 2011. № 3 (17). С. 72-77.

2. Патова Е.Н., Новаковская И.В., Костиков И.Ю., Гайсина Л.А. II Всероссийская научно-практическая конференция «Водоросли: проблемы таксономии, экологии и использование в мониторинге» // Альгология. 2010. Т.20. № 1. С. 122-127.

3. Костиков И.Ю., Новаковская И.В., Гайсина Л.А., Сафиуллина Л.М., Темралеева А.Д., Бачура Ю.М. Международная мини-школа по идентификации почвенных и аэрофитных водорослей-эвкариот // Альгология. 2010. Т.20. № 1. С. 128-129.

4. Gaysina L.A., Purina E.S., Safiullina L.M., Bakieva G.R. Resistance of Klebsormidium flaccidum (Ktttzing) Silva, Mattox & Blackwell (Streptophyta) to heavy metals // NBU Journal of Plant Science. 2009. Vol. 3. P. 39-41.

5. Кабиров P.P., Гайсина Л.А., Суханова H.B., Фазлутдинова А.И., Сугачкова Е.В., Богданова А.В. Памяти Лилии Салаватовны Хайбуллиной // Альгология. 2008. Т.18. № 2. С. 222-223.

6. Абузарова Л.Х., Гайсина Л.А., Сафиуллина Л.М., Бакиева Г.Р. Изменение морфологии Cylindrospermum michailoskoense (Cyanoprokaryota) при воздействии минеральных удобрений // Вестник Одесского Национального Университета (биология). 2008. Том 13. Выпуск 4. С. 55-60.

Статьи в региональных изданиях и сборниках трудов

1. Гайсина Л.А., Кабиров P.P. Изучение природных популяций желтозеленой водоросли Xanthonema exile (Klebs) Silva (Xanthophyceae, Chrysophyta) в условиях Башкирского Предуралья // Ученые записки: Сборник научных статей кафедры ботаники БГТГУ. Выпуск 1 / под ред. Р.Р.Кабирова. Уфа: Изд-во БГТГУ, 2005. С.40-60.

2. Суханова Н.В., Фазлутдинова А.И., Гайсина Л.А., Хайбуллина Л.С., Сугачкова Е.В, Богданова А.В., Шмелев Н.А. Основные направления альгологических исследований на кафедре ботаники Башгоспедуниверситета. Экологические проблемы современности. Межвуз. сб. научн. трудов. Часть 1.

Уфа, 2001 С. 95-102.

3. Гайсина Л.А. Вариабельность морфологических признаков природных популяций Heterothrix exilis (Klebs) Pasch. (Xanthophyta). Фауна и флора Республики Башкортостан: проблемы их изучения и охраны / Материалы докладов научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения доктора биологических наук Сергея Васильевича Кирикова. Уфа, 1999. С. 126131. , ...

4. Гайсина Л.А. Влияние температуры на морфологию Heterothrix exilis (Klebs) Pasch (Xanthophyta). Современные экологические проблемы (межвузовский сборник трудов). Уфа, 1998. С. 48-52.

Работы, опубликованные в материалах международных конференций

1. Gaysina L.A., Bohunicka М„ Johansen J.R., Fucikova К., EliaS М. А study of green, yellow-green and eustigmatophyte algae of the wet walls, seep walls and hanging gardens in Grand Staircase-Escalante National Monument (Utah, USA) applying polyphasic approach // IV International Conference «Advances in modern phycology». Book of Abstracts. 23-25 May, 2012. Kyiv, Ukraine. Kyiv, 2012. P. 356-357.

2. Gaysina L.A., Safiullin S.Yu., SukhanovaN.V., Mansurova A.R., Bogdanova A.V., Fazlutdinova A.I., Kabirov R.R., Bakieva G.R., Johansen J.R., Elias M. Algae and cyanobacteria of the copper and sulfur mine spoils (Sibay, Russia) // «Biodiversity & Nature Conservation in the Middle & Central Asia». Abstracts of 1st International Biological conference. Ostrava, Czech Republic. 6lh-8,h September, 2012. P. 9-10.

3. Prochazkova K., Gaysina L., Pichrtova M., Lukesova A., Elias M. Reassessing the diversity and taxonomy of the eustigmatophyte algae of the genera Vischeria Pascher and Eustigmatos Hibberd //VI European Congress of Protistology. Special focus: Concepts in Protistology. Final Programme and Abstracts. 25-29 My, 2011, Berlin, Germany. 2011. P. 103. http:// www.ecop201 l.org

4. Bakieva G.R., Gaysina L.A., Sukhanova N.V., Fazlutdinova A., Safiullina L.M., Mansurova A.R. Cyanobacteria of coniferous forests of Bashkir State Natural Reserve (South Ural, Russia) / 30th International Conference of the Polish Phycologycal Society. The past, present, future of phycological research. Its signification for man and environment protection. Book of Abstracts. Wroclaw-Pawlowice, Poland. 19-2151 May, 2011. P. 49-50.

5. Bakieva G.R., Gaysina L.A., Abdullin Sh.R., Safiullina L.M., Fazlutdinova A. Spatial structure of algal flora in forest soils from South Ural State Natural Reserve (Russia) // XXVIII International Phycological Conference. Book of Abstracts. Szczecin-Cieszyno Drawskie, Poland. 21-24th of June, 2009. P. 59-60.

6. Abdullin S., Gaysina L., Bakieva G. Water habitat Cyanobacteria and algae from some caves of Russia // XXVII International Phycological Conference. Book of abstract. L6dz- Spala, Poland. 12-15 June 2008. P. 33-34.

7. Johansen J.R., Khaibullina L.S., Gaisina L.A. Some Chlorophyta species from the forest soils of Great Smoky Mountains National Park // V International Symposium on Biology and Taxonomy of Green Algae. Programme & Abstracts. 2007. Smolenice-Castle, Slovakia. June 25-29,2007. Bratislava, 2007. P. 33.

8. Gaysina L., Purina E. Study on Klebsormidium flaccidum (KUtzing) Silva et al. (Streptophyta) resistance to extreme ecological factors // V International Symposium on Biology and Taxonomy of Green Algae. Programme & Abstracts. 2007. Smolenice-Castle, Slovakia. June 25-29,2007. Bratislava, 2007. P. 26.

9. Gaysina L., Krautova M., Johansen J.R., Khaybullina L. Algae of wet walls and seeps at Grand Staircase-Escalante National Monument, Utah, USA. // «Algae in ecological quality of water assessment». XXVI International Phycological Conference. Lublin- Nalfczow, Poland, 2007. P. 15.

10. Gaisina L.A., Safiullina L.M., Khaibullina L.S. Eustigmatos magnus (B.Peter.) Hibb. (Eustigmatophyta) resistance to high temperatures // Algae and their changes over time. Proceedings of the 25th International Phycological Conference. Poznan-Lagow-Stubice, Poland. 16-19 May, 2006. P. 74.

11. Gaisina L.A., Safiullina L.M. Influence of high temperature on morphology and biology of Eustigmatos magnus (B.Petersen) Hibberd (Eustigmatophyta) //Algae in terrestrial ecosystems International Conference. Programme & Abstracts. Kaniv Nature Reserve, Kaniv, Ukraine, September 27-30, 2005. Ed. by I. Kostikov. Nizhyn, 2005. P. 30.

ГАЙСИНА ЛИРА АЛЬБЕРТОВНА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 06.08.13. Формат 60x84 1/16. Бумага «Снегурочка». Гарнитура «TшlesNewRoman»; Тираж 100 экз. Заказ № й-Я.

Отпечатано в Копировальном салоне «A3».

450000, г. Уфа, ул. ЛенинаДб. Тел.: (347) 294-44-66, e-mail: a3-rb@mail.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Гайсина, Лира Альбертовна, Уфа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. М.АКМУЛЛЫ»

05201351412 На пРавахРУкописи

ГАЙСИНА ЛИРА АЛЬБЕРТОВНА

Том 1

03.02.01 - ботаника

Дисертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Кабиров Рустэм Расшатович

УФА-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Том 1

Введение.........................................................................................................................5

Глава 1. Современное состояние изучения экологии и географического распространения наземных водорослей и цианобактерий (обзор литературы).... 11

1.1. Понятие о наземных водорослях...................................................................11

1.2. История изучения наземных водорослей и цианобактерий.......................18

1.3. Проблема сопоставимости флористических данных при решении вопросов экологии и географии наземных водорослей........................................19

1.4. Основные подходы к изучению экологии водорослей...............................47

Глава 2. Материалы и методы....................................................................................64

2.1. Характеристика районов исследования........................................................64

2.2. Методика проведения исследований............................................................76

Глава 3. Зональные закономерности формирования цианобактериально-водорослевых флор в Южно-Уральском регионе....................................................92

3.1. Наземные водоросли и цианобактерии бореально-лесной зоны...............94

3.2. Наземные водоросли и цианобактерии широколиственно-лесной зоны..98

3.3. Наземные водоросли и цианобактерий лесостепной зоны.......................100

3.4. Наземные водоросли и цианобактерий степной зоны..............................105

3.5. Сравнение особенностей цианобактериально-водорослевых флор Южно-Уральского региона....................................................................................109

Глава 4. Особенности цианобактериально-водорослевых флор экстремальных местообитаний...........................................................................................................116

4.1. Местообитания с экстремально высокой температурой - Grand Staircase-Escalante National Monument (штат Юта, США).................................116

4.2. Местообитания с экстремально низкой температурой (Антарктика).....123

4.3. Местообитания с низкими значениями реакции среды -Национальный парк Great Smoky Mountains (штаты Теннеси - Северная Каролина, США).....................................................................................................128

4.4. Солончаки - Башкирское Зауралье (Башкирия, Россия)..........................134

4.5. Местообитания, загрязненные тяжелыми металлами - отвалы Сибайского филиала Учалинского горно-обогатительного комбината...........141

4.6. Водоросли вулканических выбросов - Камчатка......................................153

4.7. Сравнение особенностей цианобактериально-водорослевых флор экстремальных местообитаний.............................................................................157

Глава 5. Экспериментальный анализ влияния на цианобактерии и водоросли экстремальных экологических факторов................................................................159

5.1. Высокие температуры...................................................................................159

5.2. Замораживание..............................................................................................176

5.3. Реакция среды................................................................................................193

5.4. Засоление.......................................................................................................211

5.5. Тяжелые металлы..........................................................................................245

5.6. Гербициды......................................................................................................288

5.7. Удобрения......................................................................................................291

5.8. Границы устойчивости и типы реакции исследованных видов при воздействии экстремальных экологических факторов.......................................295

Глава 6. Использование молекулярно-генетических методов для анализа экологических закономерностей распространения цианобактерий и водорослей..................................................................................................................300

6.1. Результаты изучения флоры наземных водорослей..................................300

6.2. Интеграция морфологических и молекулярно-генетических методов

при описании новых таксонов водорослей..........................................................304

6.3. Преимущества использования в аутэкологических экспериментах референтных штаммов...........................................................................................313

6.4. Прикладные аспекты проведенных исследований....................................319

Выводы........................................................................................................................321

Литература..................................................................................................................324

Том 2

Приложение А - Список наземных водорослей и цианобактерий,

обнаруженных в исследованных местообитаниях.................................................3

Приложение Б - Влияние экстремальных экологических факторов на

размерные признаки наземных водорослей и цианобактерий............................43

Приложение В - Агрохимическая характеристика проб.........................................77

Приложение Г - Описание проб, из которых были выделены культуры

водорослей и цианобактерий..................................................................................78

Приложение Д - Список праймеров..........................................................................94

Приложение Е - Штаммы Acutodesmus, наиболее сходные со штаммом

Dumps 5(2) Acutodesmus obliquus...........................................................................96

Приложение Ж — Эукариотические водоросли и цианобактерии

Национального парка Great Smoky Mountains......................................................101

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Эукариотические водоросли и цианобактерии относятся к числу организмов, которые наиболее широко распространены в наземных экосистемах и играют важную роль в их функционировании (Голлербах, Штина, 1969; Rindi et al., 2009). Существует огромное количество работ, посвященных изучению цианобактериально-водорослевых флор многих стран и территорий (Metting, 1981 ; Алексахина, Штина, 1984; Broady, 1996; Hoffmann et al., 2007; Neustupa, Skaloud, 2008; Кузяхметов, 2006; Biidel et al., 2009; Мальцева, 2009). Однако большинство этих работ базируется только на морфологической концепции вида, без подтверждения точности идентификации методами электронной микроскопии и молекулярно-генетического анализа. С другой стороны, в филогенетических и таксономических исследованиях используется ограниченное число штаммов небольшого числа систематических групп. Это противоречие приводит к тому, что мы не имеем полного представления о существующем биоразнообразии и географическом распространении наземных водорослей и цианобактерий.

Задачи исследования:

На примере Южно-Уральского региона и некоторых экстремальных местообитаний провести оценку видового разнообразия флоры наземных

водорослей и цианобактерий, используя фенотипические и молекулярно-генетические методы идентификации.

Оценить возможность использования кодирующих (18S рДНК эукариотических водорослей и 16S рДНК цианобактерий) и некодирующих спейсерных участков ДНК (ITS эукариотических водорослей и 16S-23S ITS цианобактерий) для изучения цианобактериально-водорослевых флор.

Для депонирования штаммов, выделенных из исследованных местообитаний, создать коллекцию наземных водорослей и цианобактерий при Башкирском государственном педагогическом университете им.М.Акмуллы.

Модифицировать методику оценки нормы реакции эукариотических водорослей и цианобактерий к экстремальным экологическим факторам и определить ее эффективность в аутэкологических экспериментах с использованием модельных видов.

Апробировать методику анализа маркерных последовательностей аутентичных и референтных штаммов для решения вопроса о географическом распространении наземных водорослей и цианобактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

Установлено влияние фактора зональности на экологические особенности наземных цианобактериально-водорослевых флор Южно-Уральского региона (ЮУР). Спейсерные участки ДНК (ITS у эукариотических водорослей и 16S-23S цианобактерий), в ряде случаев в сочетании с геном 18S рДНК, являются перспективными генетическими маркерами при исследовании альгофлоры различных территорий. Использование молекулярно-генетических методов имеет особую значимость при изучении цианобактериально-водорослевых флор экстремальных местообитаний.

Границы устойчивости морфологического статуса аутентичных и референтных штаммов ACKU 506-06 Bracteacoccus minor, ACKU 539-06 Chlorococcum infusionum, ACKU 531-06 Chlorella vulgaris, ACKU 559-06 Pseudococcomyxa simplex, UTEX 2351 Eustigmatos magnus, ACKU 608-06 Klebsormidium flaccidum, 3K Microcoleus vaginatus, № 1 Xanthonema exile к высоким

положительным температурам составляют 44-50°С; к pH -3,5-11,5; хлориду меди -1х10"7-1х10-2 моль/л, хлориду никеля - 1х10"4-1><10~2 - моль/л, хлориду марганца 1хЮ"2-1 моль/л; NaCl - 0,1-1 моль/л, Na2C03 -0,005-0,05 моль/л.

Использование в аутэкологических экспериментах аутентичных и референтных штаммов с известными последовательностями по основным маркерным генам позволяет оценивать границы распространения наземных водорослей и цианобактерий, а также экстраполировать результаты аутэкологических экспериментов на природные условия.

Определены нуклеотидные последовательности гена 18S рДНК штаммов КТ9 Chloropyrula uraliensis (номер депонирования JX070625), CR2-4 Monodus sp. (НЕ586519), GSE 4G Choricystis sp. (HE586518), которые депонированы в международные базы данных.

Ряд таксонов впервые обнаружен на территории России и Республики Башкортостан (РБ): Hormoscilla pringsheimii Anagnostidis & Komárek (Cyanonacteria), Cystomonas cf. starrii (Trainor & Verses) Ettl & Gärtner, Desmodesmus armatus var. subalternans (Smith) Hegewald, Pseudostichococcus monallantoides Моеwus (Chlorophyta) и другие.

Практическая значимость работы. В ходе выполнения исследований была создана коллекция ВСАС (Bashkortostan Collection of Algae and Cyanobacteria -Коллекция водорослей и цианобактерий Башкортостана), которая

зарегистрирована в World Federation of Culture Collections (WFCC) (WDCM 1023) (http://www.wfcc.info/ccinfo/collection/by_id/1023). BCAC насчитывает 1220 штаммов, относящихся к 6 таксономическим группам: Cyanobacteria - 214, Chlorophyta - 815, Eustigmatophyceae - 61, Xanthophyceae - 57, Streptophyta - 52, Bacillariophyceae - 21 вид.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 65 работ, в том числе: 1 монография; 17 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для защиты докторских диссертаций; 5 статей в зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы и приложений (отдельный том). Работа изложена на 489 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 154 рисунка, в том числе 5 собственных иллюстраций. Приложения включают 83 таблицы, 45 собственных, иллюстраций и составляют 108 страниц. В списке литературы 636 источников, в том числе 378 иностранных.

Место проведения работы. Работа выполнена на кафедре ботаники, биоэкологии и ландшафтного проектирования БГПУ им.М.Акмуллы. Частично изучение альгофлоры национальных парков США проводилось на кафедре биологии Университета Джона Кэрролла (США), молекулярно-генетические исследования выполнялись на кафедре ботаники Карлова Университета в Праге и кафедре биологии и экологии Университета Остравы (Чехия).

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИЗУЧЕНИЯ ЭКОЛОГИИ И ГЕОГРАФИЧЕСКОГО РАСПРОСТРАНЕНИЯ НАЗЕМНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ И ЦИАНОБАКТЕРИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Понятие о наземных водорослях

Микроскопические водоросли и цианобактерии населяют практически все наземные местообитания на нашей планете (Metting, 1981), включая самые экстремальные, например, пустыни (Flechtner, 2007), снега Антарктики (Broady, 1996), слои атмосферы на высоте 2 км (Sharma et al., 2007). Наземные водоросли характеризуются мелкими размерами от 5 до 50 мкм и очень простой морфологией (Rindi et al., 2009).

Согласно современным представлениям (Cavalier-Smith, 2002; Baldauf, 2008; Keeling, 2010; Walker et al., 2011; Burki et al., 2012; Friedl, Lorenz, 2012) водоросли вневодных местообитаний объединяют представителей как прокариот, так и основных филогенетических линий эукариот, представленных в таблице 1. Представители других групп в наземных местообитаниях встречаются эпизодически.

Таблица 1 — Основные группы эукариотических водорослей и цианобактерий согласно последним представлениям (по Friedl, Lorenz, 2012, с изменениями и __сокращениями) _

Таксономическая Группа более низкого Класс

группа высшего порядка порядка или отдел

Cyanobacteria

Archaeplastida Chlorophyta Chlorophyceae

Trebouxiophyceae

Ulvophyceae

Streptophyta

Excavates Euglenophyta Euglenophyceae

Chromalveolates Stramenopils Bacillariophyceae

Xanthophyceae

Eustigmatophyceae

Alveolates Dinophyta Dinophyceae

В литературе существует множество определений понятия «наземные водоросли». В своей монографии М.М. Голлербах и Э.А. Штина (1969) отмечали,

что первую попытку определения группировок почвенных водорослей сделал F. Фрич (Fritsch, 1922). Термином «почвенные водоросли» («terrestrial algae») автор обозначал водоросли, населяющие почву, однако внутри этой группы он выделял «поверхностные сообщества» («surface community») и «подпочвенные сообщества» («subterranean community») (рисунок 1).

Рисунок 1 - Классификация почвенных

Информация о работе

Гайсина, Лира Альбертовна
доктора биологических наук
Уфа, 2013
ВАК 03.02.01

Диссертация

Анализ экологических закономерностей наземных цианобактериально-водорослевых флор с использованием традиционных и молекулярно-генетических методов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы