Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ влияния нефтяного загрязнения и биопрепаратов на почвенные цианобактериально-водорослевые ценозы и сообщества микромицетов

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ влияния нефтяного загрязнения и биопрепаратов на почвенные цианобактериально-водорослевые ценозы и сообщества микромицетов"

005009692

На правах рукописи

ЯКУПОВА АЛЬФИРА БУРЕБАЙЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ II БИОПРЕПАРАТОВ НА ПОЧВЕННЫЕ ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ И СООБЩЕСТВА МИКРОМИЦЕТОВ

03.02.01 - ботаника 03.02.08 - экология (биологические науки)

2 6 ЯН В 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2012

005009692

Работа выполнена на кафедрах ботаники и биохимии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Дубовик Ирина Евгеньевна; доктор биологических наук, профессор Киреева Наиля Ахняфовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кабиров Рустам Расшатович; доктор биологических наук, старший научный сотрудник Терехова Вера Александровна

Ведущая организация:

Вятская государственная сельскохозяйственная академия (г. Киров)

Защита диссертации состоится «16» февраля 2012 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.013.11 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» по адресу: 450076, г. Уфа, ул. 3. Валвди, 32, биологический факультет, ауд. 332. Официальный сайг: http://www.bashedii.ru Факс (347)273-67-78; disbiobsu@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Автореферат разослан «13» января 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

д.б.н., проф.

М.Ю. Шарипова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Загрязнение почв нефтью обусловливает нарушение экологического равновесия, проявляющееся в изменении структуры почвенных микробоценозов, интенсивности и направленности почвообразовательных процессов. Для прогнозирования экологического состояния нарушенных ландшафтов необходима системная информация обо всех компонентах почвенной биоты, в частности, о специфике фототрофного микробного сообщества и микробиоты в целом (Ашихмина и др., 2006). Известно, что фототрофные микроорганизмы (водоросли и цианопрокариоты) и микроскопические грибы (микромицеты), занимающие полярное положение в трофических сетях, могут наиболее адекватно отражать своеобразие протекающих микробиологических процессов в почве и характеризуют ее продукционный и деструкционный потенциал (Домрачева и др., 2006). В последние годы используются и разрабатываются методики биоиндикации почв по составу цианобактериалыю-водорослевых ценозов (ЦВЦ) (Домрачева, Дабах, 2004; Дубовик и др., 2005; Ашихмина и др., 2006; Домрачева и др., 2006; Дубовик и др., 2007; Киреева и др., 2009 и др.). Однако, исследований, в которых одновременно проводилось определение состояния цианобактериалыю-водорослевых ценозов и микромицетов, практически нет.

Использование микробных препаратов является одним из наиболее экономически и экологически целесообразных методов рекультивации нефтезагрязненных почв (Алехин и др., 1998; Габбасова, 2001; Лизунов, 2002; Saäek et al., 2003; van der Gast et al., 2003). При искусственном внедрении микробных комплексов в почвы, с таким многокомпонентным загрязнителем как нефть, всегда существует вероятность образования вторичных персистентных и токсичных соединений (Плешакова и др., 2007). Для испытания экологической безопасности микробных препаратов и для оценки эффективности биоаугментации необходимы критерии, которые позволили бы сравнивать разные почвы с различными концентрациями загрязнителей и разными методами рекультивации. В качестве таких критериев могут быть использованы качественная и количественная характеристики ЦВЦ и сообществ микромицетов.

Цель диссертационной работы - сравнить влияние нефтяного загрязнения и биопрепаратов на цианопрокариотно-водорослевые ценозы и сообщества микромицетов серой лесной почвы Республики Башкортостан и торфяно-глеевой почвы Республики Коми.

Основные задачи исследований:

1. Определить видовой состав цианопрокариотно-водорослевых ценозов серой лесной (Республика Башкортостан) и торфяно-глеевой (Республика Коми) почв, провести их таксономический и экологический анализ. Провести количественный учет цианопрокариот и водорослей сравниваемых почв.

2. Изучить влияние нефтяного загрязнения и биорекультивации на качественные и количественные параметры ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой почв.

3. Изучить и сравнить структурные и количественные изменения в сообществе микроскопических грибов серой лесной почвы Республики Башкортостан и торфяно-глеевой почвы Республики Коми.

4. Показать изменения в сообществе почвенных микромицетов при нефтяном загрязнении и внесении различных биопрепаратов для рекультивации серой лесной и торфяно-глеевой почв.

5. Сравнить влияние нефтяного загрязнения и биорекультивации на ЦВЦ и сообщества микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв на основе показателя биологической активности почвы (БАП).

Научная новизна работы. Впервые проведено детальное изучение влияния препаратов Ленойл, Азолен, Белвитамил, Универсал и Елена на показатели цианобакгериально-водорослевых ценозов и сообществ микромицетов загрязненных нефтью серой лесной и торфяно-глеевой почв. Установлены сходные тенденции изменений автотрофного и гетеротрофного блоков почвенных микробных сообществ под влиянием этих факторов. Показана возможность использования количественной характеристики ЦВЦ и сообществ микромицетов для оценки эффективности рекультивационных мероприятий.

Пра1стическая значимость. Данные о ЦВЦ и сообществах микромицетов в почвах, испытывающих влияние нефтяного загрязнения, могут быть использованы для организации биологического мониторинга и оценки эффективности биорекультивационных мероприятий, а также при изучении курсов систематики низших растений, экологии, почвенной альгологии, микологии,

микробиологии, биологии почв на биологических факультетах государственных и педагогических университетов.

Личное участие автора. Автором проведены аналитический обзор литературы, получена основная часть фактических данных и проведена их интерпретация, планирование экспериментов выполнено совместно с научными руководителями.

Обоснованность выводов и достоверность результатов работы обеспечены большим объемом лабораторных и полевых экспериментов и применением современных математических методов обработки полученных результатов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на Международных и Всероссийских конференциях и съездах «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2008); «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Пупшно, 2008); «Проблемы биоэколопш и пути их решения» (Саранск, 2008); «XII Съезд ВБО» (Петрозаводск, 2008); «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2008); «Проблемы современной альгологии» (Уфа, 2008); «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2009); «Проблемы экологии в современном мире» (Тамбов, 2009); «Экология бпосистем: проблемы изучения индикации и прогнозирования» (Астрахань, 2009); «Эколого-биологические проблемы Сибири и сопредельных территорий» (Нижневартовск, 2009); «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию» (Казань, 2009); «Студент и наука» (Уфа, 2009); «Водоросли и цнапобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах» (Киров, 2010); «Проблемы и перспективы изучения естественных п антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов» (Стерлитамак, 2010); «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2010; Казань, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 6 статен в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит го введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 245 источников, в том числе 63 на иностранных языках, и приложения. Работа содержит 142 страницы текста, иллюстрирована 16 рисунками и включает 33 таблицы.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь и поддержку научным руководителям д.б.н., проф. И.Е. Дубовик и д.б.н., проф. H.A. Киреевой, к.б.н. М.Д. Бакаевой, к.б.п. Г.Ф. Рафиковой, к.б.н. A.C. Григориади, к.б.н. И.П. Климнной за активное участие в обсуждении результатов и помощь в определении микроскопических грибов, д.б.н. О.Н. Логинову, к.б.н. Т.С. Онеговой и к.б.н. М.Ю. Маркаровой за любезно предоставленные биопрепараты, а также всем коллегам и соавторам публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Влияние загрязнения нефтью и ремедиации различными биопрепаратами на цианопрокариоты, водоросли, микроминеты н некоторые показатели биологической активности почв (обзор литературы) ЦВЦ - совокупность автотрофных микроорганизмов, обитающих в почве. С ЦВЦ связан широкий круг микробиоты, состоящей из бактерий, микромицегов и представителей мпкрофауны (Голлербах, Шпша, 1969; Кабиров, 1995; Дубовик, 2005; Кузяхметов, 2006; Панкратова, 2010 и др.).

Техногенные загрязнения приводят к деформации почвенных ЦВЦ (унификации видового состава, снижению численности живых клегок и биомассы) и сообществ микроскопических грибов (упрощение структуры сообществ, изменению численности пропагул, биомассы мицелия) при однократном воздействии и к их сукцессии при пролонгированном действии токсикантов (Домрачева, Кондакова, 2006; Новаковская, Патова, 2007; Марфешша, 2005; Апшхмина и др., 2006; Терехова, 2007; Freystein at all, 2008 и др.). Действие нефти на ЦВЦ и микромицеты во многом зависит от ее концешращш в среде и времени экспозиции (Зимошша, 1998; Кузяхметов, 2003; Рафикова, 2009; Хайбуллина и др., 2010), а также типа почв (Шпша, Некрасова, 1988; Дубовик, 2000; Рахмагудлина, Дубовпк, 2007; Домрачева и др., 2007). Актуальной является своевременная оценка состояния автотрофных и гетеротрофных почвенных микроорганизмов для разработки приемов сохранения разнообразия почвенной биоты наземных экосистем (de Hoog et al., 2000; Savilahti et al., 2001;

Жданова и др., 2002; Марфешша, 2005; Рафикова и др., 2007; Терехова, 2007; Хабибулшша, 2009 и

др-)-

Глава 2. Объекты и методы исследований

Исходным материалом для работы послужили результаты лабораторных исследований, проведенных в 2006-2011 годах на двух типах почв: серой лесной почве Республики Башкортостан (территория Арланского месторождения Краснокамского района) и торфяно-глеевой почве Республики Коми (территория Южно-Ошского нефтяного месторождения Усинского района). Изучались характеристики ЦВЦ и комплекса микромицетов в условиях нефтяного загрязнения почв и при биоремедиацни.

Для рекультиващш почв были использованы биопрепараты Азолен, Елена, Ленойл, любезно предоставленные д.б.н., проф. О.Н. Логиновым (ИБ УНЦ РАН, г. Уфа), Универсал, предоставленный с.н.с., к.б.н. М.Ю. Маркаровой (ИБ Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар) и Белвитамил -предоставленный к.б.п. Т.С. Онеговой (ООО «Башгеопроект», г. Уфа). Характеристика препаратов подробно описана в диссертации. Азолен, Универсал и Елена были применены как для серой лесной, так и торфяно-глеевой почвы, Ленойл и Белвитамил - только для серой лесной почвы.

Для изучения почвенных ЦВЦ использовали метод чашечных н водных культур со стеклами обрастания (Штина, Голлербах, 1976; Кузяхметов, Дубовик, 2001). Идентификацию видов проводили по известным определителям (Голлербах и др., 1953; Кондратьева, 1968; Матвиенко, Догадина, 1978; Кузяхметов и др., 1995; Андреева, 1998; Мшшбаев и др., 2003) и статьям периодических изданий. Номенклатура и классификация таксонов Cyanoprokaryota дана по современным определителям (Komarek, Anagnostidis, 1986, 1989, 1998; Anagnostidis, Komarek, 1988; Anagnostidis, 2001). Видовые названия водорослей уточнялись по пополняемым спискам опубликованных видов в базе данных «Algaebase» (vvww.algaebase.org). Состав экобиоморф (жизненные формы) ЦВЦ определялся по классификации Э.А. Штиной (Штина, Голлербах, 1976; Штина и др., 1981; Алексахина, Штина, 1984). Количественный учет почвенных водорослей проводился методом культурального подсчета по таблице Мак-Креди, составленной на основании методов вариационной статистики (Аникиев, Лукомская,1983; Кузяхметов и др., 2001). Биомасса водорослей расчитывалась объемно-расчетным методом (Кузяхметов, Дубовик, 2001).

Определение численности микроскопических грибов, их видового состава проводились в соответствии с общепринятыми методами (Методы...,1991). Учёт длины мицелия грибов проводился методом мембранных фильтров в модификации Дёмкиной и Мирчинк (Методы ..., 1991). Для идентификации видов микромицетов использовались определители (Литвинов, 1967; Билай, 1977; Егорова, 1986; Билай, Коваль, 1988; Ramirez, 1982; Raper, Fennel, 1965; Raper, Thorn, 1968; Watanabe, 2000; de Hoog et al-, 2000). Видовые названия грибов уточнялись по пополняемым спискам опубликованных видов в базе данных «Index fungorum» (www.indexfiiugorum.org). Индекс микологической безопасности Im определялся по O.E. Марфеншюй (2005). Содержание остаточных нефтепродуктов в почве определялось горячей экстракцией метаденхлоридом (McGill, Rowell, 1980).

В качестве обобщенного показателя влияния загрязнения на микробные ценозы был предложен коэффициент биологической активности почвы (БАЛ) = (ИТФ1 + ИТФ2)/2 (Кабиров, 2009), где ИТФ1 - индекс токсичности для почвенных водорослей; ИТФ2 - для микроскопических грибов (регистрируемые тест-функции выражены в логарифме численности). При величине БАЛ равной или больше 1, биологическая активность почвы сохраняется или возрастает, а при БАЛ < 1 она снижается.

Статистическая обработка данных осуществлялась с применением пакетов прикладных программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2007. При оценке статистической достоверности использовался t-критерий Стыодента.

Глава 3. Сравнительный анализ состава ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой почв Сравнение состава ЦВЦ серой лесной ц торфяно-глеевой почв. Фоновые (ненарушенные) серая лесная и торфяно-глеевая почвы характеризовались полночленностью ЦВЦ и наличием следующих таксономических групп: цианопрокариоты (Cyanoprokaryota), зеленые (Chlorophyta), желтозеленые (Xanthophyta), диатомовые (Bacillariophyta) водоросли. Было идентифицировано 67 видовых и внутривидовых таксонов цианопрокариот и водорослей в серой лесной почве и 79 - в торфяно-глеевой, относящихся к 5 классам (Cyanophyceae, Chlorophyceae, Xanthococcophyceae,

Xanthotrichophyceae, Pennatophyceae) (табл. 1). Ведущая роль в почвенных ЦВЦ принадлежала двум отделам: Chlorophyta (52,2%/60,8%) (серая лесная/торфяно-глеевая) и Cyanoprokaryota (23,8%/17,2%). Наименьшим числом видов представлены Xanthophyta (16,5%/16,4%) и Bacillariophyta (7,5%/5,1%). Наибольшим числом таксонов представлены порядки Chlorococcales - 12/20 видов и разновидностей (в серой лесной/в торфяно-глеевой), Nostocales - 6/6, Chlamydomonadales - 6/11, Chlorosarcinales -6/7, Oscillatoriales - по 5 видов водорослей (табл. 2).

В состав ведущих по числу видов, разновидностей и форм, шести семейств входило 33/50 (серая лесная/торфяно-глеевая) видовых и внутривидовых таксонов (49,3%/63,3% от их общего числа), остальные содержали менее 7 видов водорослей. На остальные 18 семейств приходилось 26/29 таксонов (38,8%/36,7%), к одновидовым относились 8 семейств, как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почве. Расположение ведущих по числу видовых и внутривидовых таксонов родов почвенных шанонрокариот и водорослей (табл. 3) показало, что 3 рода из 50/57 включают 22,3%/29,1% (в серой лесной/в торфяно-глеевой почве). Двенадцать родов в исследованных ЦВЦ явились двувидовыми. Остальные роды были представлены одним видом как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почве. Спектр жизненных форм ЦВЦ фоновой серой лесной почвы был описан формулой ^¡CgHuhydrtCFsXsBsP^FiMi и Ch1sCi3Xshydr6CF}H4B4P3NFiMi - для торфяно-глеевой почвы (табл.1).

Таблица 1

Таксономическая структура, пропорции флоры циапопрокариот и водорослей обоих

типов почв*

Отдел Число Пропорции флоры

Классов о X ч « а. ё В ж V 2 <и и Родов Видов, в/вид. такс. Вид/ сем Род/ сем Вид/ род

Cyanoprokaryota 1/1 3/3 9/8 12/10 16/14 1,7/1,8 1,3/1,2 1,3/1,4

Chlorophyta 1/1 4/4 9/9 26/35 35/48 3,8/5,3 2,8/3,8 1,3/1,4

Xanthophyta 2/2 3/3 5/5 9/10 11/13 2,2/2,6 1,8/2,0 1,2/1,3

Bacillariophyta 1/1 1/1 2/2 3/2 5/4 2,5/2,0 1,5/1,0 1,6/2,0

Всего 5/5 11/11 25/24 50/57 67/79 2,7/3,3 2,0/2,4 1,3/1,4

* здесь и далее в числителе приведены значения по серой лесной/в знаменателе - торфяно-глеевой почве

Таблица 2

Ведущие по числу видовых и внутривидовых таксонов семейства в ЦВЦ обоих типов

почв

Семейство Число таксонов % от общего числа таксонов Ранги семейств Число родов

Chlorococcaceae 12/20 17,9/25,3 1/2 7/12

Pleurochloridaceae 6/7 8,9/8,8 2/1 5/5

Chlamydomonadaceae 6/11 8,9/13,9 3/3 1/1

Nostocaceae 5/5 7,4/6,3 4/4 2/2

Chlorellaceae 4/4 5,9/5,1 5/5 3/3

Phormidiaceae 3/3 4,4/3,8 6/6 2/2

Всего 33/55 49,3/633 6/6 20/25

Ведущее положение занимает СА-форма, которая представлена одноклеточными зелеными (представители родов Chlorococcum, Bracteacoccus, Chlorella, Pseudococcomyxa и др.), колониальными (виды родов Chlorosarcina, Соссотуха и частично жёлтозелёными водорослями -Pleurochloris magna, Botrydiopsis eriensis).

Рис. 1. Численность цпянопрокариот и водорослей серой лесной и торфяно-глеевой почв, n*10J

клеток/г

Рис.2. Изменение биомассы цнанопрокаряот и водорослей в серой лесной почве при загрязнении нефтью и внесешш различных биопрепаратов через 90 сут, мг/г

Таким образом, изученные почвы характеризовались достаточно высоким сходством в таксономической и экологической структурах ЦВЦ (коэффициент Съеренсена - 83%). Изучение количественных показателей ЦВЦ разных типов почв показало, что в торфяно-глеевой почве число живых клеток и биомасса цианопрокариот и водорослей незначительно превышает таковые показатели в серой лесной (рис. 1, 2).

Сравнение состава ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой почв при загрязнении нефтью. Исследование загрязненных почв показало, что под действием нефти происходит перестройка или гибель ЦВЦ (Кабиров, Минибаев, 1982; Киреева и др., 2003; Дубовик, 2003, 2007). Нами показано, что степень воздействия нефти как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почве зависела от концентрации нефти и срока отбора проб. Так, на третьи сутки при 1% загрязнении число видов водорослей уменьшилось до 18 и 25, а при 4% - до 2 и 6 в серой лесной и торфяно-глеевой почвах соответственно. В опытах с высокой концентрацией загрязнителя (8%) полностью исчезли представители отделов Xanthophyta и Bacillariophyta.

В серой лесной почве на стекле обрастания в чашечной культуре встречен Nostoc linckia (Cyanoprokaryota), в водной - Chlorococcum infusionum (Chlorophyta). В отличие от серой лесной, в слабозагрязненной (1%) торфяно-глеевой почве доминировали только представители рода Chlamydomonas: Chlamydomonas lobulata, С. kokonas, С. elliptica, С. auguste. Эти виды типичны для северных районов (Алексахина, Штина, 1986; Зимонина, 1998). Они также оставались толерантными

к загрязнению нефтью в концентрации 4%. В серой лесной почве кроме хламидомонад, устойчивыми к 4%-му загрязнению нефтью отмечены представители рода КоНос. Ранее неоднократно указывалось на способность видов этого рода становиться доминантом ЦВЦ (Киреева и др., 2007; Дубовик, 2005, 2007; Кондакова, Домрачева, 2007; Фокина, 2008). Одноклеточный представитель отдела СЫогоркуШ - СЫогососсит т/тюпит оказался сквозным видом, встреченным во всех вариантах опыта. Наиболее чувствительными к нефтяному загрязнению оказались представители диатомей.

Через 90 сут, во всех вариантах опыта с загрязнением почвы нефтью, наблюдалось увеличение видового разнообразия цианопрокариот и водорослей: при 1% загрязнении происходило практически полное восстановление ЦВЦ как серой лесной, так и торфяно-глеевой почв (доминантный комплекс включал представителей различных систематических групп), при 4% - частичное. Представители желтозеленых водорослей обоих типов почв оказались менее устойчивыми к нефтяному загрязнению. Так, при 4%-ном загрязнении нефтью они не обнаруживались даже через 90 сут. Воздействие нефти на ЦВЦ заключалось не только в выпадении одних видов из сообщества и подавлении других, но и в задержке развития всего сообщества.

Выявлена ярко выраженная зависимость численности клеток цианопрокариот и водорослей от нефтяного загрязнения как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почве. Так, при загрязнении нефтью в концентрации 1% и 4% происходило снижение численности клеток и биомассы водорослей в 3,5/1,7 и 4/1,5 (серая лесная/торфяно-глеевая) раза соответственно уже на третьи сутки инкубации (рис. 1,2). В целом, количественные показатели ЦВЦ изученных почв отличались незначительно.

Сравнение реакций состава ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой почв при рекультивации различными биопрепаратами. Исследование влияния различных препаратов на ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой незагрязненных почв показало их неоднозначное влияние на видовое разнообразие цианобактерий и водорослей (табл. 3). Эти организмы находятся в поверхностных слоях почвы и потому быстро реагировали на внесение испытуемых веществ, показывая при этом неодинаковую реакцию различных групп па разные препараты. На третьи сутки при 1%-ном и 4%-ном загрязнении нефтью, прп использовании биопрепаратов, упрощение спектра жизненных форм как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почве вызывали Елена (обнаружено всего 3 жизненные формы), Азолен (4 формы) и Универсал (5).

Таблица 3

Число видов пиапопрокарпот и водорослей в различных вариантах _ опыта через 90 сут (ед.)__

Дозы нефти (% масс.) . _ 0 1 1 .. 4

Серая лесная почва

Контроль 31 28 17

Азолен 31 24 22

Универсал 31 25 22

Елена 31 24 19

Торфяно-глеевая почва

Контроль 36 20 13

Азолен 36 20 19

Универсал 36 20 18

Елена 36 18 17

Необходимо отметить, что на 90 суг происходило полное восстановление видового разнообразия ЦВЦ при всех испытанных препаратах обоих типов почв (табл.3). Отмечается, что численность клеток ЦВЦ, как и спектр экобиоморф практически не отличались от контрольного варианта, а количественные культуральные показатели в 2 раза и более превышали фоновые (рис. 1) как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почвах. Стимулирующий эффект проявился в восстановлении видового разнообразия ЦВЦ в обоих типах почв. Это, в первую очередь, связано с уменьшением содержания остаточных нефтепродуктов в почвах и снижением токсичности поллютанта.

Биопрепарат Азолен в исследованных почвах способствовал обогащению азотсодержащими веществами, что, в свою очередь, улучшало азотный режим почвы и благоприятно сказывалось на развитии аборигенной микробиоты и, как следствие, почвенных цианопрокариот и водорослей.

Так, в опытах с Азоленом (1%+А; 4%+А) наблюдалось увеличение видового разнообразия некоторых зеленых и желтозеленых водорослей. Использование Азолена оказалось наиболее эффективным к концу срока инкубации при всех испытанных концентрациях нефти (кроме 8%). Внесение данного препарата вызывало восстановление биоразнообразия циапопрокариот и водорослей всех отделов в серой лесной и торфяпо-глеевой почвах.

Рекультивация биопрепаратом Елена торфяно-глеевой почвы через 90 сут оказалась эффективной как при низких (1%), так и в средних (4%) дозах поллютанта в обоих типах почв. К концу срока инкубации наблюдалось полное восстановление ЦВЦ.

Внесение Универсала также нивелировало действие нефти на ЦВЦ через 90 сут экспозиции. В вариантах опытов с низкой дозой загрязнителя (1%) в торфяно-глеевой почве доминировали Chlamydomonas globosa, Chl. gloeogama, Chl. atactogama, Bumilleriopsis peterseniana, Botrydiopsis eriensis. В вариантах опытов со средней степенью загрязнения (4%) идентифшшрова1шых видов стало меньше, доминирующее положение заняли представители рода Chlorococcum в серой лесной и Chlamydomonas - в торфяно-глеевой почве.

Рекультивация обоих типов почв, загрязненных нефтью в концентрации 8% не привела к восстановлению видового разнообразия ЦВЦ во все сроки отбора проб. Очевидно, для восстановления видового состава водорослей необходима повторная обработка биопрепаратами или более длительное время детоксикации поллютанта.

При проведении эксперимента для сравнения видового состава ЦВЦ для всех вариантов был рассчитан коэффициент общности Сьеренсена. Так, в контроле через 90 сут не произошло изменений флоры водорослей (К = 100%) как серой лесной, так и торфяно-глеевой почве, хотя наблюдалась перестройка доминантного комплекса. При загрязнении почвы нефтью (1% и 4%) наблюдалось снижение значения коэффициента. Индекс Шеннона показал наибольшее разнообразие в фоновой (незагрязненной) почве: 2,8/2,6 в серой лесной и торфяно-глеевой почвах соответственно. С увеличением концентрации поллютанта значения индекса Шеннона в ЦВЦ снижались и составляло 2,1/2,5 при 1%-ном и 0,8/0,7 при 4%-ном загрязнении в серой лесной и торфяно-глеевой почвах соответственно.

Изучение количественных параметров ЦВЦ при ремедиации нефтезагрязненной серой лесной почвы, как п торфяно-глеевой, различными способами показало, что внесение всех препаратов оказывало стимулирующее воздействие на численность живых клеток и биомассу цианопрокариот и водорослей при загрязнении почвы нефтью в низких (1%) и средних (4%) дозах на 90 сут эксперимента. Эффективность использования Азолена в обоих типах почв возрастала с увеличением концентрации загрязнителя через 90 сут инкубации. Так, в этих вариантах опыта отмечено, что численность клеток цианопрокариот и водорослей в почвах были намного выше по сравнепию с контрольным вариантом.

Аналогичным образом происходили изменения количественных показателей и при внесении Универсала. Рекультивация биопрепаратом Елена оказывала положительное влияние как на численность, так и на биомассу исследуемых организмов на протяжении всего времени проведения эксперимента. По увеличению эффективности к количественным показателям ЦВЦ почв можно расставить биопрепараты в следующем порядке: Елена<Универсал<Азолен. Препарат Елена оказался несколько менее эффективным при средних дозах загрязнения: через 90 суг не произошло полного восстановления видового разнообразия ЦВЦ.

Все изученные препараты оказались практически одинаково эффективными, что позволяет рекомендовать их для проведения рекультивационных мероприятий в обоих типах почв.

Глава 4. Сравнительный анализ сообществ микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв

Сравнение сообществ микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв при загрязнении нефтью. Комплексы микромицетов фоновых (незагрязненных) почв разных типов не проявляли или проявляли минимальное сходство между собой. В фоновой серой лесной почве доминирующим видом был Pénicillium glabrum, который явился довольно устойчивым и к действию нефти. В фоновой торфяно-глеевой почве доминирующими явились Ckrysosporium раппогит, Pénicillium decumbens и светлоокрашенная форма мицелия. Однако, при длительном загрязнении комплекс микромицетов торфяно-глеевой почвы сближался по составу с комплексом микромицетов

исследованной серой лесной почвы. При этом видами, общими как для серой лесной, так и для торфяно-глеевой почв быт Aspergillus fumigatus, A.niger, Pénicillium canescens, P.funiculosum и Mucor hiemalis, которые становились по данным ряда авторов (Марфенина, 1995; Киреева и др., 2003; Рафикова, 2009) устойчивыми к неблагоприятным условиям и загрязнению нефтью (табл. 4).

Таблица 4

Доминирующие и типично частые виды микромицетов, выделенные из серой лесной и

торфяно-глеевой почв при нефтяном загрязнении

Типы почв Фоновая (незагрязненная) почва Нефгезагрязненная почва

Серая лесная Penicillium corylophylum, P. fimiculosum, P. velutinum, P. glabrum, P. simplicissimum, Talaromyces flavus, *Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Mucor sp. Aspergillus repens, *A. niger, Penicillium chrysogemon var. chrysogenum, P. madriti, P. canescens, P.funiculosum, *Mucor hiemalis.

Торфяно-глеевая Chrysosporium pannorum, Penicillium decumbens, Trichoderma hamatum, Oidiodendron flamm, Sphaerostilbella aureonitens, Mortierella sp., *Trichoderma viride. Aspergillus Candidus, *A. niger, * A.fumigatus, *A. oryzae, *Penicillium velutinum, Paecilomyces variotii, Mucor hiemalis, Trichoderma simpodianum, Cylindrocarpon destructants.bttv./lviviw. indexfim eorum. ore/Names/Sv nSDecies.asE2.RecordlD=24S517

* здесь и далее звездочкой отмечены фитотоксичные виды микроскопических грибов.

Развитие микроскопических грибов в исследованной торфяно-глеевой почве подавлялось нефтью при более низкой концентрации, чем в серой лесной почве. Это позволяет говорить о том, что микобиота торфяно-глеевой почвы была более чувствительной по отношению к данному поллютапту. Загрязнение серой лесной и торфяно-глеевой почв в условиях лабораторного эксперимента нефтью при низких концешрациях (1%) нефти стимулировало развитое микроскопических грибов на начальных этапах инкубации. Увеличение концентрации поллютанта до 4 и 8% приводило к угнетению их развития в обоих типах почв. Известно, что микромицеш обладают неодинаковой устойчивостью к токсическому действию нефти и способностью к ее утилизации, что может приводить к изменению количественного соотношения видов грибов в нефтезагрязненной почве. Нефтяное загрязнение серой лесной и торфяно-глеевой почв оказывало существенное влияние на структуру микробного комплекса и приводило к изменению видового состава микромицетов. С увеличением концентрации нефти как в торфяно-глеевой, так и в серой лесной почвах разнообразие микромицетов снижалось пропорционально увеличению концентрации нефти, что свидетельствует об упрощении видовой структуры комплекса микромицетов. Однако, при загрязнении торфяно-глеевой почвы высокими концентрациями поллютанта (8%) наблюдалось увеличение этого показателя за счет возрастания частоты встречаемости фитотоксичных видов Aspergillus niger, A.fumigatus, A. oryzae, Paecilomyces variotii, Penicillium canescens и Mucor hiemalis, вероятно, устойчивых к данному типу загрязнения или способных использовать углеводороды нефти в качестве энергетического субстрата

Определение численности микромицетов показало, что торфяно-глеевая почва содержит существенно больше пропагул, чем серая лесная. В почвах изучаемых типов этот показатель реагировал на загрязнение нефти по-разному. Если в торфяно-глеевой почве концентрация нефти 4% снижала численность грибов по сравнению с фоном, то в серой лесной почве нефть стимулировала их рост. Очевидно, полученный результат свидетельствует о большей уязвимости почв северных регионов по отношению к техногенным загрязнениям. Свежее нефтяное загрязнение как серой лесной, так и торфяно-глеевой почвы вызывало увеличение длины гиф и биомассы грибного мицелия. Расхождение между содержанием мицелия в почве и количеством грибных зачатков свидетельствует о том, что в серой лесной почве при концентрации нефти вьппе 1%, а в торфяно-глеевой при средней концентрации нефти (4%) происходил сдвиг биоморфологической структуры популяций микромицетов в сторону развивающегося мицелия. Этот процесс характерен для ранних стадий микробной сукцессии (рис. 3).

4 -,

С торфяно-глеевая 3 сут га торфяно-глеевая 90 сут

Рис. 3. Влияние загрязнения нефтью и рекультивации бнофунгицпдом Елена серой лссиов и торфяно-глеевой почв на длину мицелия микромицетов (м/г)

I Внесение различных биопрепаратов как в серую лесную, так и в торфяно-глеевую почву изменяло структуру сообществ микроскопических грибов. Так в исследуемых образцах серой лесной почвы, в , отличие от торфяно-глеевой, биопрепарат Азолен увеличивал численность микромицетов, I появлялись новые виды (P. velutinum, P. frequentans).

I Сравнение сообществ микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв при

рекультивации различными биопрепаратами. В рекультивированной торфяно-глеевой почве, в I отличие от серой лесной, типичными становились виды Aspergillus fumigatus, Paecilomyces variotii, \ Mucor sp., Trichoderma hamatum, которые встречались практически во всех образцах торфяно-глеевой почвы с внесением биопрепарата. Внесение Азолена в незагрязненную серую лесную почву приводило к появлению ряда нетипичных видов - Pénicillium lilacino-echinulatum, P.Ugnorum, P.restrictum, изменению встречаемости типичных представителей - Trichoderma koningii, T.viride, Pénicillium adametzii, P.variabile. Пять видов микромицетов обнаружено во всех вариантах опыта -I Aspergillus fumigatus, A.niger, Paecilomyces victoriae, Pénicillium simplicissimum и Mucor hiemalis. I Применение Азолена способствовало некоторому снижению плотности Aspergillus fumigatus в рекультивируемой почве и увеличению частоты встречаемости Paecilomyces victoriae. Pénicillium ' simplicissimum преобладал и в образцах рекультивируемых вариантов, что, очевидно, может [ свидетельствовать о его относительной устойчивости к углеводородам нефти (табл. 5).

Использование для рекультивации нефтезагрязненных почв биопрепарата Елена способствовало снижению численности микромицетов как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почве. Длина мицелия в серой лесной почве с биопрепаратом за период наблюдений варьировала от 0,09 яри низкой (1%) концентрации нефти до 0,38 в почве со средней (4%) концентрацией нефти, в торфяно-глеевой почве - от 0,81 м/г в сильнозагрязненной (8%) почве до 4,32 м/г в чистой почве. : Биопрепарат Елена, обладающий фунгицидными свойствами, подавлял развитие таких видов микромицетов как Paecilomyces victoriae, Mucor hiemalis. В загрязненных нефтью почвах с биопрепаратом кроме того исчезали Trichoderma koningii и T. viride. Из указанных микромицетов Mucor hiemalis относится к потенциально патогенным видам грибов группы BSL-1, способным вызывать локализованные микозы человека, a Trichoderma koningii является оппортунистическим и фитотоксичным видом. Считающийся эвритопным Pénicillium canescens обнаруживался лишь при невысоких концентрациях загрязнителя как случайный вид в торфяно-глеевой почве. Внесение биопрепарата в нефтезагрязненную торфяно-глеевую почву (с 4% и 8% загрязнением) способствовало появлению Clonostachys rosea f. catenulata и Trichoderma hamatum, что может быть связано с возникновением в рекультивируемой почве более благоприятных для их развития условий, возможно за счет снижения конкуренции с другими видами микромицетов, которые угнетались микроорганизмами биопрепарата Типичными частыми в серой лесной почве были Pénicillium

сапеясет, Тггскойегта \iride (табл. 5). В сильнозагрязненной (8%) серой лесной почве доминировал Р. тайгШ, обработка Универсалом приводила к смене доминирующих видов микромицетов.

Таблица 5

Доминирующие и типично частые виды микромицетов, выделенные из серой лесной и

торфяно-глеевой почв при рекультивации различными биопрепаратами

Типы почв Почва, обработанная Универсалом Почва, обработанная Азоленом Почва, обработанная Еленой

Серая лесная Pénicillium lanosum, Phialophora sp., * Aspergillus niger, Paecilomyces variotii. Pénicillium velutinum, P.frequentans, P.simplicissimum. Pénicillium canescens, *Trichoderma viride.

Торфяно-глеевая *Aspergillus fiimigatus, Pénicillium citrinum, Paecilomyces lilacinus. *Aspergillus fumigatus, Paecilomyces variotii, Mucor sp., Trichoderma sp. Clonostachys rosea f. catenulata, Pénicillium citreo-viride, P. simplicissimum.

Универсал значительно увеличивал численность микромицетов в серой лесной почве, как за счет случайных видов P. canescens, P. glabrum, P. velutinum и Phialophora sp., так и фиготоксичньк Aspergillus niger, Paecilomyces variotii (рис.4). При его использовании увеличивалось видовое богатство микромицетов в рекультивируемой почве. Так, в вариантах опытов с низкой дозой нефти I появился Aspergillus fumigatus, в варианте с высокой - Paecilomyces lilacinus в торфяно-глеевой ночве. , В вариантах опыта с использованием биопрепарата Универсал в серой лесной почве при загрязнении I нефтью численность микромицетов достоверно превышала значения, как в фоновой, так и в вефтезагрязненной нерекультивируемой почве.

Рис.4. Влияние внесения различных биопрепаратов (Азолен, Универсал, Елена) на численность микромицетов изученных почв, п*103 пропагул/г

Среди условно патогенных для человека, патогенных для растений и выделяющих токсины видов, общих для исследованных торфяно-глеевой и серой лесной почв, было обнаружено немного. Это виды, проявляющие фитотоксические и оппортунистические свойства, Aspergillus fitmigatus и Aspergillus niger. Однако тенденция к накоплению в нефтезагрязненных почвах микромицетов перечисленных выше групп прослеживалась достаточно четко.

Наибольшее сходство микобиоты рекультивируемой серой лесной почвы с использованием биопрепарата Елена почв наблюдалось между собой, чем с загрязненными аналогами. Микобиота контрольной почвы проявляла большее сходство с загрязненными почвами, чем с ^ рекультивируемыми. Это, вероятно, объясняется ингибированием развития фитопатогенных грибов, которые развивались и в фоновой почве.

. При сравнении между собой вариантов торфяно-глеевой почвы, в отличие от серой лесной, загрязненных возрастающими концентрациями нефти видно, что применение биопрепарата Елена | приводит к увеличению их сходства (4%вефтв+Елена-1%яефти+Епена=0,60; 4%нефти+£лено-8%нефти+£ленгг=0,52). Очевидно, полученный результат отражает положительные изменения, происходящие в видовом составе микобиоты нефтезагрязненной почвы под влиянием биофунгипида Елена.

1 Расчет индекса Шеннона показал, что применение биопрепарата Универсал не изменяло ' разнообразия грибов в варианте с низкой (1%) концентрацией нефти и приводило к его увеличению в контроле и вариантах с более высокими концентрациями поллютанта (4 и 8%). Азолен же способствовал увеличению разнообразия при внесении в почву с низкой дозой (1%) поллютанта. В вариантах с высокими (8%) дозами нефта происходило незначительное снижение данного показателя (рис.5). ________

0% 1% 4% 8%

□ нерекультмвированная почва и почва с внесением Универсала а почва с внесением Азолена и Почва с внесением Елены

Рис.5. Влияние внесения биопрепаратов на разнообразие микромицетов в серой лесной почве

Таким образом, для комплексов микроскопических грибов исследованных нефтезагрязненньи торфяно-глеевой и серой лесной почв была характерна разная динамика численности микромицетов. Сходство выражалось в появлении общих типичных видов, накоплении условно патогенных для растений и человека и токсинообразующих грибов.

1 Выявление в исследуемых почвах значительных запасов микробной биомассы позволяет считать, что ЦВЦ и сообщество микромицетов играют существенную роль в процессах биотической 1 саморегуляции почвы. Однако на степень развития организмов оказывает влияние не только тип ' почвы и характер растительного опада, но и степень загрязнения ксенобиотиками (Апшхмина др., I 2006; Киреева и др., 2006; Дубовик, 2007). Грибная биота является более стабильным и ¡! консервативным компонентом почвенной микробиоты, чем ЦВЦ. Скорость ответной реакции I грибной биомассы на изменение экологических условий более выражена, чем у цианопрокариот и водорослей. Показано, что грибная биомасса значительно превышала биомассу цианопрокариот и водорослей в торфяно-глеевой почве (рис.6). Аналогичная картина наблюдалась и в серой лесной почве. Сопоставление результатов, полученных методом посева и прямым микроскопированием, I позволяет предположить, что основная масса грибов в серой лесной и торфяно-глеевой почвах | находится в виде мицелия. Споры занимают меньшую долю в биоморфологической структуре популяций микромицетов. Внесение нефти в почву вызывало увеличение длины и биомассы грибного мицелия.

I Использование интегрального показателя БАП позволяет получить представление об

обобщенной реакции микробиоты почвенной экосистемы на нефтяное загрязнение и более достоверные результаты об эффективности препаратов, используемых при биоремедиации. Так, если через 3 суток после загрязнения в вариантах с концентрацией нефти 1%, 4% и 8% величина БАП I соответственно составляла 0,74; 0,61 и 0,53 относительных единиц, то через 90 суток величина БАП

составила соответственно 0,99; 0,91 и 0,39. Следует отметить, что при сравнительно невысоких концентрациях нефти биологическая активность почвы постепенно восстанавливалась.

^^ШШШШШШШШШШИ IIIJiM

уЧЧЧЛ"1""'"""1""1"1""""

пшпшшшши

0,5 1 1,5

о Водоросли а Грибы

Рис. 6. Изменение биомассы почвенных цианопрокариот и водорослей (мг/г) и микромицетов (мг/г) торфяно-глеевой почвы при загрязнении нефтью

Универсал

0,»9

0,84 1,21.

контроль 0.96 eeilieiiSl?

: 1% нефти нефти » 8°/с нефти

Рис. 7. Значения БАП через 90 сут после постановки эксперимента

При внесении в почву исследованных биопрепаратов в вариантах с 1% начальной концентрации нефти величина БАП возрастала во все сроки эксперимента. Так, величина БАЛ при ( 1% концентрации нефти составляла через 3 сут 0,85. В вариантах с добавлением Азолена - 1,1; j Универсала - 0,77; Елены - 0,60. Через 90 сут результаты эксперимента выглядели следующим образом: нефть - 0,99; с Азоленом - 1,2; Универсалом - 0,84; Еленой - 0,99. Следовательно, при невысокой степени загрязнения нефтью внесение исследуемых биопрепаратов стимулирует' биологическую активность почвы (рис. 7).

ВЫВОДЫ

1. В ЦВЦ фоновых (ненарушенных) серой лесной (Республика Башкортостан) и торфяно-глеевой (Республика Коми) почв было обнаружено 67/79 видовых и внутривидовых таксонов1 цианопрокариот и водорослей соответственно, относящихся к 4/4 отделам, 5/5 классам, 11/11 порядкам, 25/24 семействам, 50/57 родам. Изученные почвы характеризовались довольно большим сходством в таксономической и экологической структурах ЦВЦ (коэффициент Съеренсена составил 83%). Установлено, что основную долю в ЦВЦ составляли представители отдела Chlorophyta. Ведущими в спектре экобиоморф являлись Ch- и С-формы. В торфяно-глеевой почве численность живых клеток и биомасса цианопрокариот и водорослей незначительно превышает таковые показатели в серой лесной.

2. Как нефтяное загрязнение, так и приемы рекультивации, унифицируют видовой состав ЦВЦ обоих типов почв сразу после их внесения. Однако, к концу времени постановки опыта при низких и средних значениях нефти (1 и 4%), изученные организмы адаптируются. Происходит полное

восстановление ЦВЦ до фоновых значений как в серой лесной, так и в торфяно-глеевой почвах. Выявлены общие для изученных типов почв виды шшюпрокариот и водорослей, устойчивые к нефтяному загрязнению - Nostoc linckia, Chlorococcum mjusionum, Chlamydomoms globosa, Chi. gloeogama, Chl. ataclogama, Botrydiopsis eriensis. Увеличите концентрации поллютанта (8%) ведет к полной гибели ЦВЦ обоих типов почв и рекультивация при высоких дозах загрязнителя не приводила к пх восстановлению.

3. Серая лесная почва характеризовалась большей численностью пропагул микромтщетов, в отличие от торфяно-глеевой. Из образцов фоновой (незагрязненной) почвы было выделено 49/73 вида микроскопических грибов, 19/39 из которых отнесены к типичным (серая лесная/торфяно-глеевая). В фоновых образцах почвы были обнаружены 2/3 типичных вида, относимых к условно патогенным, в загрязненных - до 5/7 видов в серой лесной и торфяно-глеевой почвах соответственно. Максимальное значение индекса безопасности для серой лесной почвы составляло 5,8 при средних уровнях загрязнения, а в торфяно-глеевой - 25,3 при высоких.

4. Загрязнение нефтью в концентрациях 1-8% в серой лесной почве Республики Башкортостан и торфяно-глеевой почве Республики Коми приводит к изменению структуры грибных комплексов и уменьшению их видового разнообразия. Выявлены общие для изученных типов почв виды микромштетов устойчивые к нефтяному загрязнению - Aspergillus fumigatus, A.niger, Pénicillium funiculosum и Mucor hiemalis. Показано, что длительное нефтяное загрязнение приводит к увеличению сходства между комплексами мнкромицетов изученных типов почв.

5. При загрязнении нефтью общая биологическая активность почвы снижалась с 1,0 до 0,74 уже на 3 сут после внесения поллютанта. При этом степень подавления биологической активности зависела от концентрации нефти и времени, прошедшего с момента попадания ее в почву. Исследованные биопрепараты Азолен, Универсал и Елена оказались эффективными для ЦВЦ обоих типов почв при низких и средних концентрациях поллютанта через 90 сут инкубации и микромштетов - при всех концентрациях во все сроки экспозиции.

Список РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ЛАК

1. Киреева Н.А., Климина И.П., Григориади А.С., Якупова А.Б. Микромицеты как биодеструкторы углеводородов и потенциальные возбудители микозов в нефтезагрязненных регионах // Проблемы медицинской микологии, 2009. №2. С. 79-80.

2. Водопьянов В В., Киреева Н.А., Григориади А.С., Якупова А.Б. Влияние нефтяного загрязнения почвы на ризосферную микробиоту и моделирование процессов биодеградации // Вестник Оренбургского государственного университета, 2009. №6. С. 545-547.

3. Киреева Н.А., Григориади А.С., Щемелинина Т.Н., Гареева А.Р., Якупова А.Б. Оценка эффективности биоремедиащга нефтезагрязненных почв с использованием бакпрепарата Универсал // Вестник Оренбургского государственного университета, 2009. №10. С. 454-455.

4. Киреева Н.А., Рафикова Г.Ф., Галимзянова Н.Ф., Логинов О.Н., Григориади А.С., Якупова А.Б. Влияние биофунпщида Елена на комплексы мнкромицетов нефтезагрязненных почв различных типов при биоремедиации //Микология и фитопатология, 2010. Т. 44. Выпуск 1. С. 53-62.

5. Киреева Н.А., Дубовик И.Е., Якупова А.Б. Влияние различных способов биоремедиации на альгоценозы нефтезагрязненных почв // Почвоведение, 2011. №11. С. 1375-1385.

6. Григориади А.С., Якупова А.Б., Амирова А.Р., Ерохина НИ. Микологическая оценка почвы, загрязненной отходами производств нефтеперерабатывающей промышленности // Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2011. Т. 13. № 5(2). С. 155-157.

Статьи и материалы в других изданиях

7. Киреева Н.А., Дубовик И.Е., Мрясова А.Б. Видовое разнообразие водорослей нефтезагрязненной и рекультивируемой почв // Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий. Матер. IV Междунар. конф. Оренбург, 200S. Вып.7. С. 304-305.

8. Киреева Н.А., Рафикова Г.Ф., Мрясова А.Б., Дубовик И.Е. Влияние нефтяного загрязнения и биоремедиации почвы на видовое разнообразие микроскопических грибов и водорослей // Принципы и способы сохранения биоразнообразия. Матер. Ш Всеросс. науч. конф. Йошкар-Ола - Пущино, 2008. С. 339340.

9. Рафикова Г.Ф., Киреева Н.А., Мрясова А.Б. Комплексы микроскопических грибов в серых лесных и торфяно-глеевых нефтезагрязненных почвах // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века. Матер. ХП съезда РБО. Петрозаводск, 2008. Ч. 2. С. 145 -147.

10. Григориади A.C., Рафикова Г.Ф., Якупова А.Б. Изменение структуры комплекса микромицетов при рекультивации нефтезагрязненных почв с использованием целлюлозосодержащих субстратов // Актуальные аспекты современной микробиологии. Тезисы докладов Междун. конф. Москва, 2008. С. 14-15.

11. Григориади A.C., Якупова А.Б., Шпилева У.Ю. Оценка токсичности нефтезатрязненной почвы с помощью фито- и зоотестов // Экология России и сопредельных территорий. Матер. JOII междунар. конф. Новосибирск, 2008. С 183-184.

12. Климина И.П., Якупова А.Б. Состав эпифитных и почвенных фототрофных микроорганизмов в условиях промышленного загрязнения // Актуальные аспекты современной микробиологии. Тезисы докл. М., 2008. С. 25-26.

13. Якупова А.Б., Климина И.П. Мониторинг нефтезагрязненных экосистем по характеристике альгоценозов II Экология России и сопредельных территорий. Матер. ХШ Междунар. конф. Новосибирск, 2008. С. 33-34.

14. Киреева H.A., Рафикова Г.Ф., Григориади A.C., Якупова А.Б. Оценка влияния биоудобрения Азолен на нефтезагрязненные почвы по биологическим параметрам // Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития. Матер. Всерос. научно-пракг. конф. Киров, 2008. Ч. 2. С. 182-185.

15. Киреева H.A., Дубовик И.Е., Якупова А.Б. Влияние различных способов биоремедиации на альгоценозы нефтезагрязненных почв // Проблемы современной альгологии. Матер. Всеросс. школы-семинара. Уфа: РИЦ БашГУ, 2008. С. 57-60.

16. Якупова А.Б., Климина И.П. Оценка влияния нефтяного загрязнения на почвенные и эпифитные фототрофные микроорганизмы экосистемы // Аграрная Россия, 2009. №S. С. 75.

17. Григориади A.C., Якупова А.Б. Микробиологические методы восстановления нефтезагрязненных почв // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии. Матер. I междунар. научн. конф. Донецк, 2009. Т.1. С. 303-304.

18. Киреева H.A., Рафикова Г.Ф., Григориади A.C., Якупова А.Б. Применение биопрепаратов для сохранения биоразнообразия водорослей и микроскопических грибов в нефтезагрязненных почвах // Проблемы экологии в современном мире. Матер. VI Междунар. конф. Тамбов, 2009. С. 86-92.

19. Климина И.П., Григориади A.C., Якупова А.Б. Альгомикологическая характеристика объектов окружающей среды на территории нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности // Экология биосистем: проблемы изучения индикации и прогнозирования. Матер. П междунар. научно-пракг. конф. Астрахань, 2009. С. 136-138.

20. Киреева H.A., Дубовик И.Е., Климина И.П., Григориади A.C., Якупова А.Б. Использование показателей альгомикологического комплекса для биоиндикации городских экосистем, загрязненных выбросами нефтехимических предприятий // Эколого-биологические проблемы Сибири и сопредельных территорий. Матер. I Междунар. научно-пракг. конф. Нижневартовск, 2009. С. 156-163.

21. Киреева H.A., Рафикова Г.Ф., Григориади A.C., Якупова А.Б. Оценка эффективности различных методов биоремедиации нефтезагрязненной почвы по биологическим показателям // Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию. Матер. Всеросс. научно-пракг. конф. Казань, 2009. С. 214218.

22. Григориади A.C., Рафикова Г.Ф., Якупова А.Б. Влияние нефтяного загрязнения и рекультивации на микробное биоразнообразие почвы // Экологический сборник 2: Труды молодых ученых Поволжья. Тольятти: ИЭВБ РАН, 2009. С. 40-43.

23. Киреева H.A., Дубовик И.Е., Якупова А.Б., Григориади A.C. Реакция цианобакгерий и водорослей нефтезагрязненных почв на внесение биопрепаратов при рекультивации // Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах. Матер. Междунар. научно-практ. конф. Киров, 2010. С. 154158.

24. Климина И.П., Григориади A.C., Якупова А.Б., Киреева H.A. Влияние нефтяного загрязнения почвы и рекультивации на характеристики альгомикологического комплекса // Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов. Матер. Всеросс. конф. Стерлитамак, 2010. С. 165-168.

25. Климина И.П., Григориади A.C., Киреева H.A., Якупова А.Б. Альгомикологическая оценка почв и сопутствующих сред, загрязненных выбросами нефтехимических производств // Перспективы развития и проблемы современной ботаники. Матер. II(IV) Всеросс. научно-практич. конф. Новосибирск, 2010. С. 181183.

26. Kireeva N.A., Dubovik I.E., Yakupova A.B. The influence of different bioremediation methods on the algae cenoses of oil-polluted soils // Eurasian Soil Science, 2011. vol. 44. № 11. P.P. 1260-1268.

27. Дубовик И.Е., Якупова А.Б., Киреева H.A., Григориади A.C. Изменение видового разнообразия водорослей в условиях техногенного загрязнения // Вопросы общей ботаники. Сборник трудов П Междунар. конф. Казань: Изд-во К(П)ФУ, 2011. С. 35-37.

Подписано в печать 11.01.12 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 583. Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Якупова, Альфира Буребайевна, Уфа

61 12-3/658

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Башкирский государственный

университет»

На правах рукописи ЯКУПОВА АЛЬФИРА БУРЕБАЙЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ И БИОПРЕПАРАТОВ НА ПОЧВЕННЫЕ ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ И СООБЩЕСТВА МИКРОМИЦЕТОВ

Специальности 03.02.01 - ботаника 03.02.08 - экология (биологические науки)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор И.Е. Дубовик; доктор биологических наук, профессор Н.А. Киреева

УФА-2012

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

А - биопрепарат Азолен

Е - биопрепарат Елена

Л - биопрепарат Леногт

Б - биопрепарат Белвитамш

У - биопрепарат Универсал

К - контроль (фоновая почва)

КОЕ - колониеобразующая единица

УОМ - углеводородокисляющие микроорганизмы

ИБ - Институт биологии

РБ - Республика Башкортостан

УНЦ РАН - Уфимский научный центр Российской Академии Наук ЦВЦ - цианопрокариотно-водорослевые ценозы

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................9

ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ И СООБЩЕСТВА МИКРОМИЦЕТОВ АНТРОПОГЕННОНАРУШЕННЫХ ПОЧВ.........................9

1.1. Характеристика почвенных цианобактериально-водорослевых ценозов в условиях техногенеза...............................................................................................9

1.2. Характеристика почвенных микромицетов в условиях техногенеза.........16

1.3. Взаимодействие автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов.........26

1.4. Биоиндикация и биотестирование антропогенного загрязнения почв. Альгоиндикация.....................................................................................................29

1.5. Методы биоремедиации нефтезагрязненных почв......................................34

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................40

2.1. Характеристика районов исследования........................................................40

2.1.1. Арланское месторождение Республики Башкортостан.........................40

2.1.2. Южно-Ошское месторождение Республики Коми................................42

2.2. Условия проведения опытов..........................................................................45

2.2.1. Лабораторные исследования....................................................................45

2.2.2. Характеристика биопрепаратов, используемых в работе.....................47

2.3. Методы исследований.....................................................................................49

2.3.1. Методика отбора почвенных проб...........................................................49

2.3.2. Методы учета и идентификации микроорганизмов..............................49

2.3.3. Методы оценки представленности и значимости видов в комплексах микромицетов......................................................................................................50

2.3.4. Оценка разнообразия и сходства комплексов микромицетов..............51

2.3.5. Методы оценки комплексной микологической опасности...................52

2.3.6. Определение длины гиф мицелия............................................................52

2.3.7. Выявление видового состава почвенных водорослей...........................53

2.3.8. Определение содержания остаточных углеводородов..........................55

2.3.9. Статистическая обработка результатов..................................................55

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СОСТАВА ЦВЦ СЕРОЙ ЛЕСНОЙ И ТОРФЯНО-ГЛЕЕВОЙ ПОЧВ..................................................................................56

3.1. Сравнение состава ЦВЦ серой лесной почвы Республики Башкортостан и торфяно-глеевой почвы Республики Коми..........................................................56

3.2. Сравнение состава ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой почв при загрязнении нефтью...............................................................................................61

3.3. Сравнение состава ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой почв при рекультивации различными биопрепаратами.....................................................64

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СООБЩЕСТВ МИКРОМИЦЕТОВ

СЕРОЙ ЛЕСНОЙ И ТОРФЯНО-ГЛЕЕВОЙ ПОЧВ...............................................73

4.1. Сравнение влияния нефтяного загрязнения на сообщества микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв.................................................................73

4.1.1. Влияние нефтяного загрязнения и биоремедиации препаратом Белвитамил на сообщество микромицетов серой лесной почвы.....................80

4.1.2. Влияние нефтяного загрязнения и биоремедиации препаратом Ленойл на сообщество микромицетов серой лесной почвы...........................................83

4.1.3. Сравнение влияния нефтяного загрязнения и биоремедиации препаратом Универсал на сообщества микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв............................................................................................86

4.1.4. Сравнение влияния нефтяного загрязнения и биоремедиации препаратом Азолен на сообщества микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв............................................................................................................93

4.1.5. Сравнение влияния нефтяного загрязнения и биоремедиации препаратом Елена на сообщества микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв..........................................................................................................104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................111

ВЫВОДЫ.................................................................................................................124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................126

ПРИЛОЖЕНИЕ.......................................................................................................151

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Проблема охраны почв в Республике Башкортостан приобретает все большее значение в связи с ухудшающимся состоянием окружающей среды, увеличением площади земель, загрязненных нефтью. Загрязнение почв обусловливает нарушение экологического равновесия, проявляющееся в изменении структуры биоценозов, интенсивности и направленности почвообразовательных процессов. Биотесты, используемые для оценки токсичности техногенно нарушенных почв обычно состоят из одного (Udo, Payemi, 1975; Жеребцов, 1984; Вассеридр., 1989; Кавеленова, 1999, 2001; Соромотин, 2001; Винник, 2005) или группы таксономически близких видов организмов (Артемьева, Штина, 1985; Bierkens et al., 1998; Латыпова и др., 1999; Juvonen et al., 2000). Для прогнозирования экологического состояния нарушенных ландшафтов необходима системная информация о всех компонентах почвенной биоты, в частности, о специфике фототрофного микробного сообщества и микробиоты в целом (Ашихмина и др., 2006). Известно, что фототрофные микроорганизмы (водоросли и цианопрокариоты) и микроскопические грибы (микромицеты) занимают полярное положение в трофических сетях, могут наиболее адекватно отражать своеобразие протекающих микробиологических процессов почвы, характеризуя её продукционный и деструкционный потенциал (Домрачева и др., 2006). В последние годы используются и разрабатываются методики биоиндикации почв по характеристике цианобактериально-водорослевых ценозов (ЦВЦ) (Домрачева, Дабах, 2004; Дубовик и др., 2005; Ашихмина и др., 2006; Домрачева и др., 2006; Дубовик и др., 2007; Киреева и др., 2009 и др.). Однако, исследований, в которых одновременно проводилось определение запасов цианобактериально-водорослевой и микобиомассы, практически нет.

Использование микробных препаратов является одним из наиболее экономически и экологически целесообразных методов рекультивации нефтезагрязненных почв (Алехин и др., 1998; Габбасова, 2001; Лизунов, 2002; Sasek et al., 2003; van der Gast et al., 2003). Однако при искусственном

внедрении микробных комплексов в почвы с таким многокомпонентным загрязнителем как нефть, в ходе рекультивации всегда существует вероятность образования персистентных и токсичных соединений (Плешакова и др., 2007). Для испытания экологической безопасности микробных препаратов и для оценки эффективности биоаугментации необходим критерий, который позволил бы сравнивать почвы с различными концентрациями загрязнения и методами рекультивации. В качестве такого критерия могут быть использованы качественная и количественная характеристики ЦВЦ и сообществ микромицетов.

Цель диссертационной работы - сравнить влияние нефтяного загрязнения и биопрепаратов на цианопрокариотно-водорослевые ценозы и сообщества микромицетов серой лесной почвы Республики Башкортостан и торфяно-глеевой почвы Республики Коми.

Основные задачи исследований:

1. Определить видовой состав цианопрокариотно-водорослевых ценозов серой лесной (Республика Башкортостан) и торфяно-глеевой (Республика Коми) почв, провести их таксономический и экологический анализ. Провести количественный учет цианопрокариот и водорослей сравниваемых почв.

2. Изучить влияние нефтяного загрязнения и биорекультивации на качественные и количественные параметры ЦВЦ серой лесной и торфяно-глеевой почв.

3. Изучить и сравнить структурные и количественные изменения в сообществе микроскопических грибов серой лесной почвы Республики Башкортостан и торфяно-глеевой почвы Республики Коми.

4. Показать изменения в сообществе почвенных микромицетов при нефтяном загрязнении и внесении различных биопрепаратов для рекультивации серой лесной и торфяно-глеевой почв.

5. Сравнить влияние нефтяного загрязнения и биорекультивации на ЦВЦ и сообщества микромицетов серой лесной и торфяно-глеевой почв на основе показателя биологической активности почвы (БАП).

Научная новизна работы. Впервые проведено детальное изучение влияния препаратов Ленойл, Азолен, Белвитамил, Универсал и Елена на показатели цианобактериально-водорослевых ценозов и сообществ микромицетов загрязненных нефтью серой лесной и торфяно-глеевой почв. Установлены сходные тенденции изменений автотрофного и гетеротрофного блоков почвенных микробных сообществ под влиянием этих факторов. Показана возможность использования количественной характеристики ЦВЦ и сообществ микромицетов для оценки эффективности рекультивационных мероприятий.

Практическая значимость. Данные о ЦВЦ и сообществах микромицетов в почвах, испытывающих влияние нефтяного загрязнения, могут быть использованы для организации биологического мониторинга и оценки эффективности биорекультивационных мероприятий, а также при изучении курсов систематики низших растений, экологии, почвенной альгологии, микологии, микробиологии, биологии почв на биологических факультетах государственных и педагогических университетов.

Личное участие автора. Автором проведены аналитический обзор литературы, получена основная часть фактических данных и проведена их интерпретация, планирование экспериментов выполнено совместно с научными руководителями.

Обоснованность выводов и достоверность результатов работы

обеспечены большим объемом лабораторных и полевых экспериментов и применением современных математических методов обработки полученных результатов.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на Международных и Всероссийских конференциях и съездах «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2008); «Принципы и способы сохранения биоразнообразия» (Пущино, 2008); «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008); «XII Съезд ВБО» (Петрозаводск, 2008); «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); «Проблемы региональной экологии в

условиях устойчивого развития» (Киров, 2008); «Проблемы современной альгологии» (Уфа, 2008); «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2009); «Проблемы экологии в современном мире» (Тамбов, 2009); «Экология биосистем: проблемы изучения индикации и прогнозирования» (Астрахань, 2009); «Эколого-биологические проблемы Сибири и сопредельных территорий» (Нижневартовск, 2009); «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию» (Казань, 2009); «Студент и наука» (Уфа, 2009); «Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах» (Киров, 2010); «Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов» (Стерлитамак, 2010); «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2010; Казань, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 245 источников, в том числе 63 на иностранных языках, и приложения. Работа содержит 142 страницы основного текста, иллюстрирована 16 рисунками и включает 33 таблицы.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь и поддержку научным руководителям д.б.н., проф. И.Е. Дубовик и д.б.н., проф. H.A. Киреевой, к.б.н. М.Д. Бакаевой, к.б.н. Г.Ф. Рафиковой, к.б.н. A.C. Григориади, к.б.н. И.П. Климиной за активное участие в обсуждении результатов и помощь в определении микроскопических грибов, д.б.н. О.Н. Логинову, к.б.н. Т.С. Онеговой и к.б.н. М.Ю. Маркаровой за любезно предоставленные биопрепараты, а также всем коллегам и соавторам публикаций.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ЦИАНОБАКТЕРИАЛБНО-ВОДОРОСЛЕВЫЕ ЦЕНОЗЫ И СООБЩЕСТВА МИКРОМИЦЕТОВ АНТРОПОГЕННОНАРУШЕННЫХ

ПОЧВ

1.1. Характеристика почвенных цианобактериально-водорослевых

ценозов в условиях техногенеза

Цианобактериально-водорослевые ценозы - совокупность микроорганизмов, обитающих в почве, которые включают водоросли и цианобактерии (основа пищевых цепей «пастбищных» и детритных), а также широкий круг микробиоты, состоящей из бактерий, микромицетов и представителей микрофауны (Кузяхметов, 2006).

Почвенные цианобактерии и водоросли являются обязательным компонентом наземных экосистем (Голлербах, Штина, 1969; Кабиров, 1995; Дубовик, 2005; Панкратова, 2010 и др.). Они составляют активную автотрофную часть микробиоты, связанную сложными взаимодействиями, как со всеми ее гетеротрофными компонентами, так и с собственно почвой и высшими растениями, и принимают разнообразное участие в биологической жизни почв. Велика роль этих компонентов в накоплении и трансформации органического вещества, способствующего созданию почвенного плодородия. Особенности ЦВЦ служат дополнительной характеристикой почвы и дают возможность заметить начинающиеся изменения, в том числе антропогенные. Перестройка ЦВЦ, обеднение его состава, а также изменение качественных и количественных характеристик может служить показателем стойкого загрязнения почвы фитотоксическими веществами (Кондакова, Домрачева, 2007).

Численность цианобактерий и водорослей в разных местообитаниях колеблется от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток в 1 грамме почвы в зависимости от условий обитания. В отличие от численности биомасса цианобактерий и водорослей редко достигает больших значений. Синтез и трансформация органического вещества этих организмов является

очень динамичным процессом. Биомасса способна обновляться в течение 35 суток, поэтому реальный вклад водорослей в первичную продукцию экосистемы в сотни и тысячи раз больше величины биомассы (Кабиров и др., 2008).

Почвенные цианопрокариоты и водоросли первыми поселяются на безжизненных субстратах: скальных поверхностях высокогорий, промышленных отвалах, на территориях подвергнувшихся катастрофическим воздействиям (извержениям вулканов, атомным взрывам, пожарам и т.п.) и тем самым облегчают расселение других организмов. В то же время, водоросли последними из растений «отступают» под давлением неблагоприятных факторов природного и антропогенного происхождения. В этих условиях гибель ЦВЦ приводит к разрушению всего биоценоза (Кабиров и др., 2008).

Развиваясь на поверхности и в толще почвы, цианопрокариоты и водоросли оказывают влияние на ее физико-химические свойства. Они синтезируют и выделяют в окружающую среду разнообразные вещества, изменяют рН почвенного раствора, улучшают водный режим и аэрацию почвы, препятствуют ее эрозии, влияют на солевой баланс и состав микроорганизмов в почве. Многие виды цианобактерий способны к азотфиксации (Панкратова, 1979; Дубовик и др., 2007; Фокина, 2008).

Поток поллютантов, попадающих в почву в последние годы, не прекращается и не уменьшается. Техногенное загрязнение - это источник тяжелых металлов, нефти, органических загрязнителей искусственного происхождения. При агрогенном загрязнении в почве накапливаются агрохимикаты и токсины микробного происхождения. Все это неизбежно приводит к деформации почвенных ЦВЦ (унификация видов, снижению численности клеток и биомассы) при однократном воздействии и к их эволюции при пролонгированном поступлении токсикантов (Домрачева, Кондакова, 2006; Новаковская, Патова, 2007; Кузяхметов, 2007), например, тяжелых металлов (Pb, Cd, Cu) (Панкратова и др., 1996; Тамралеева и др., 2009;

Кондакова и др., 2006; Домрачева и др., 2007; Зыкова, Фокина, 2010), влияния ультрафиолетовой радиации (Karsten et al., 2005), пирофосфата натрия (Кондакова, Олькова, 2007), гербицидов бетанала, триаллата и минеральных удобрений (KXjPC)NM) (Гайсина и др., 2010).

Действие нефти на ЦВЦ во многом зависит от ее концентрации в среде, времени экспозиции (на свежих разливах видов цианопрок