Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака"

На правах рукописи

Пострнгань Богдан Нилович

Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2009

1 о ЛЕК 2009

003488090

Работа выполнена в Учреждении Российской Академик наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор

Шакирова Фарида Миннихановна

Институт биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН

Кандидат биологических наук

Самигуллин Тагир Халафович

Отдел эволюционной биохимии НИИ физико-

химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН (СИФИБР СО РАН).

Защита состоится » '^CCc&'bj^R 200г. в «ffi» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАЩУфа, пр. Октября, 71) и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.htrnl e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «2Л » о fl-% 200.5г.

диссертационного совета

Ученый секретарь

Бикбулатова С.М.

Актуальность работы. Одной из наиболее актуальных проблем нескольких последних десятилетий является неизбежно нарастающее техногенное загрязнение окружающей среды, в частности, тяжелыми металлами. В этой связи, во всём мире уделяется значительное внимание проблеме устойчивости растений к тяжелым металлам, поскольку они являются опасными экотоксикантами. В настоящий момент используют механические, химические и биологические способы очистки загрязненных территорий. Однако общепринятые технологии рекультивации земель требуют больших капиталовложений, и могут сопровождаться возникновением нежелательных побочных эффектов (Raskin, Ensley, 2000; Mulligan et al., 2001; Alkorta et al., 2004; Ghosh, Singh, 2005; Van Slycken et al., 2009). В связи с этим, для очистки и стабилизации загрязненных участков довольно привлекательным выглядит применение растений для так называемой "фиторемедиации" (Pilon-Smits, 2005). При этом стоимость всего комплекса мероприятий по очистке снижается, а какой-либо дополнительный ущерб окружающей среде отсутствует. В природе существуют естественные растения-аккумуляторы, которые способны накапливать тяжелые металлы в высоких концентрациях. Однако, чаще всего, они растут медленно и имеют низкую биомассу. В последнее время разрабатываются различные подходы, обеспечивающие повышение эффективности фиторемедиационных мероприятий путем увеличения скорости роста и накопления биомассы растений-гипераккумуляторов, в основном, при помощи генно-инженерных приемов, таких как, например, введение генов, кодирующих признаки, характерные для растений-гипераккумуляторов (Nagata at al., 2009). Одним из таких признаков является способность к синтезу металл-связывающих пептидов -так называемых фитохелатинов с общей структурой (y-GluCys)nGly, где п = 2—11, (Clemens et al., 1999; Vatamaniuk et al., 2000). При создании растений, пригодных для использования в фиторемедиации, видится перспективным использование регуляторных элементов генов фитохелатинсинтаз, их кодирующей части, а также синтетических "псевдофитохелатиновых" генов,

непосредственно кодирующих фитохелатины с несколько измененной структурой, характеризующейся отсутствием у-связи глутамина в силу матричной природы их синтеза.

Цели н задачи исследования. Целью данного исследования явилось создание модельных трансгенных растений табака, несущих полноразмерный и делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, псевдофитохелатиновый ген и изучение экспрессии этих конструкций в трансгенных растениях.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать эффективные методы оценки экспрессии эукариотических генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ в присутствии РНКазы Н.

2. Создать на основе клонированной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса генно-инженерные конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z с маркерным геном GUS под контролем клонированного промотора.

3. Путем агробактериальной трансформации создать трансгенные растения табака, несущие промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса, определить ее границы делеционным анализом и провести количественную оценку транскрипционной активности промотора фитохелатинсинтазы риса.

4. Сконструировать олигонуклеотиды для создания минтетического псевдофитохелатинового гена с последующим клонированием его в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1.

5. Создать трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген, и оценить сравнительную устойчивость таких растений к тяжелым металлам.

Научная новизна. Разработаны, и на примере гена фитохелатинсинтазы риса опробованы, два новых подхода к определению и оценке экспрессии безынтронных эукариотических генов, применимых также для анализа

экспрессии генов, для которых отсутствует точная информация об интронах. Впервые созданы трансгенные растения табака, несущие генетическую конструкцию на основе промотора фитохелатинсинтазы риса и его делеционного варианта в рамках системы гетерологической экспрессии, в которых промоторная область одного вида растения функционирует в другом. Проведен количественный анализ экспрессии промотора фитохелатинсинтазы и его делеционного варианта в трансгенных растениях табака. Сконструированы олигонуклеотиды, на основе которых создан псевдофитохелатиновый ген, кодирующий фитохелатины матричного синтеза или псевдофитохелатины с последовательностью аминокислот Ме1(а-01иСуз)401у. Созданы трансгенные растения, продуцирующие псевдофитохелатины, повышающие устойчивость растений к тяжелым металлам. Проведена оценка устойчивости к кадмию трансгенных растений табака, экспрессирующих псевдофитохелатины.

Практическая значимость. Создание трансгенных растений, способных накапливать без ущерба для своего развития значительные количества тяжелых металлов, связанных псевдофитохелатинами, и таким образом способствовать их выведению из почвы, позволит осуществлять очистку загрязнённых территорий, где уровень неорганических экотоксикантов особенно высок. Исследование промотора фитохелатинсинтазы риса служит отправным этапом для создания трансгенных растений в тех случаях, когда необходима не конститутивная, а индуцибельная экспрессия, например при возможной токсичности псевдофитохелатинов с большим числом повторяющихся мотивов (а-01иСу5)п

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006), на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007), молодежной научной школе-

конференции «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2008).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 23 рисунка и 2 диаграммы, и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 161 источник.

Конкурсная поддержка работы. Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ 1003.2006.4, НШ-649.2008.4 и Государственного контракта 02.740.11.0290 Федеральной целевой программы Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследований был выбран рис Oryza sativa ввиду относительной легкости манипуляуций с его небольшим геномом, кроме того, он почти полностью секвенирован. Эксперименты проводились с промотором гена фитохелатинсинтазы риса и искусственно сконструированным псевдофитохелатиновым геном. В работе использованы следующие методы. Выделение ДНК из растительного, материала осуществляли фенольно-детергентым методом (Graham, 1978); выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного и мягкого лизиса с некоторыми модификациями, РНК выделяли тризоловым методом. Количество и качество выделенных препаратов проверяли аналитическим электрофорезом в агарозных и полиакриламидных гелях. Рестрикционное расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. ПЦР «по конечной точке» проводили в ДНК-амплификаторе производства компании «ДНК-технология» с использованием Taq-

полимеразы. Для клонирования продуктов амплификации промотора фитохелатинсинтазы риса использовали фагмидные вектора pGEM-T и pAL-ТА. Экспрессионные конструкции на основе промотора гена фитохелатинсинтазы риса создавались в бинарном векторе pCAMBIA 1291Z; псевдофитохелатинового гена - в векторе pCAMBIA 1305.1. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе «ABl PRISM 310 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, США). В ходе трансформации генно-инженерных конструкций использовались компетентные клетки E.coli и A.lumefaciens. Экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса оценивали при помощи технологии циклирующей пробы и ОТ-ПЦР с FRET эффектом на платформе «УФА» в присутствии РНКазы Н. Регистрацию флоуресценции проводили в ДНК амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ (Bio-Rad, США). Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Horsch et al., 1985). Визуально активность ß-глюкуронидазы (GUS) определяли гистохимически. Флуориметрическое определение активности (GUS) в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ пакета Lasergene фирмы «DNASTAR, Inc.» (США).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Оценка активности промотора гена фитохелатинсинтазы риса.

Поскольку целью работы было изучение способности к индукции тяжелыми металлами промотора фитохелатинсинтазы риса, его индуцибельности и пригодности для фиторемедиации, была поставлена задача исследовать его активность в естественных условиях стресса, обусловленного воздействием тяжелых металлов на нетрансгенные растения риса Oryza sativa сорта Лиман. Для экспериментов использовались недельные проростки, которые обрабатывались кадмием (0,02 г/л, 0,002 г/л) в течение одного часа. С целью создания комплексной и оптимальной системы

оценки экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса (которая может быть применена и для прочих эукариотических генов) нами разработано два независимых подхода, основанных на эффекте гашения флуоресценции и эффекте переноса флуоресцентной резонансной энергии (FRET) (рис. 1).

Tth, РНКюаН

I Отжиг второго лршмера Т1Ъ полимерам

: Низкотемпературная V денатурация (75-80'С)

Отжит 1-го тракмера, Tth полимерам, регистрация FRET

А Б

Рис. 1. Схема определения экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса при помощи технологии циклирующей пробы (А) и механизм протекания ПЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии между донорным (РАМ) и акцепторным (ЯОХ) красителями на платформе «УФА» (Б).

Первый подход предполагал применение технологии циклирующей пробы (ТЦП) с расщеплением химерных ДНК-РНК-ДНК зондов, отжегшихся на кДНК-матрице при помощи фермента - рибонуклеазы Н в изотермических условиях в режиме реального времени (рис.1 А).

Для определения экспрессии гена фитохелатинсинтазы был также применен второй метод - ПЦР-РВ на платформе "УФА" (Чемерис с соавт., 2005) со сближенным расположением праймеров, образующих короткие ампликоны (рис. 1 Б). Принципиальным моментом здесь также является использование термостабильной РНКазы Н, которая в первом цикле разрушает исходную цепь РНК и делает построенную на ней кДНК

v««f

пригодном для отжига второго праймера, минуя стадию высокотемпературной денатурации. В дальнейшем денатурация коротких ампликонов производится при минимально достаточной для этого температуре, полностью исключая тем самым вклад геномной ДНК (рис. 2).

■ ,иг'

у

<Л 100 110

1ааязгэ4эб»ю

РСЯ Ап^еЛт, V. Сус^*»

А Б

Рис. 2. Результаты амплификации ПЦР-РВ по определению экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса.

А - Накопление флуоресцентного сигнала в ходе ТЦП-определения. 1,2- образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,02г/л; 3,4- образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,002 г/л; 5,6- необработанные растения.

Б - ПЦР-РВ с РКЕТ-эффектом. 1 - контрольные растения, без обработки кадмием, 2,3- образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,02г/л; 4, 5 - образцы, обработанные кадмием в концентрации 0,002 г/л; 6 - отрицательный контроль.

Преимущество первого метода заключалось в том, что процесс идет в изотермическом режиме, этим обуславливается уменьшение скорости дезактивации ферментов и увеличение скорости анализа за счет того, что не происходит затрат времени на циклические изменения температур в реакционном блоке. Однако при всем удобстве и универсальности данного подхода у него имеется существенный недостаток - невысокая чувствительность при низкой концентрации кДНК матрицы, и, несмотря на отсутствие стадий изменения температур, относительно большая длительность процесса.

Второй метод характеризуется повышенной чувствительностью даже при низких концентрациях кДНК матрицы, но здесь необходимым этапом является построение кривых плавления. Вместе с тем, в данных

экспериментах не стояла задача количественного определения уровня экспрессии этого гена, и анализ носил качественный характер. Обе методики давали схожие результаты, при этом наглядно прослеживался индуцибельный характер активности фитохелатинсинтазного гена при воздействии кадмием.

Клонирование и ееквенирование промотора фитохелатинсинтазы риса.

В соответствии с поставленными задачами в результате поиска по базе данных ОепВапк была найдена полная последовательность гена фитохелатинсинтазы риса. Была идентифицирована предполагаемая промоторная зона, располагающаяся между концом предыдущего гена и началом кодирующей части гена фитохелатинсинтазы, суммарная длина которой составила 900 п.н. К данной промоторной области были подобраны соответствующие праймеры, и продукты амплификации были клонированы в векторе рвЕМ-Т и затем секвенированы (рис. 3).

SequenceNsme «P0S= 118

-Vi I*

{ЕЗШии ^Consensus ISequere 1ктсгстстяиясштм(ишяви£иииксиипим(с«а1с1ят11я1я(сг«и»

18» 1S5 M 211 m m № Ш 2iS 2?«

рмв ti« Шф» 1м1истпяаиишп/ши^с^шця4сс115атй«сс(ш1стяпшп«пйсик( ШГИСтПЯНЯСЕЮПЮ7ИШЯСЖШ№ИШИПИ«СС«Ж1ЯП4ЯТЯИККИОТ

А Б

Рис. 3. Результаты клонирования и секвенирования предполагаемой промоторной области фитохелатинсинтазы риса.

А. Электрофоретический анализ плазмид, предположительно несущих вставку промотора фитохелатинсинтазного гена. 1 - контроль (плазмида pGEM-T, не содержащая вставок); 2, 3, 4 - ДНК рекомбинантных колоний E.coli.

Б. Фрагмент последовательности клонированной промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса в сравнении с последовательностью данного участка генома риса, приведенной в базе данных GenBank.

Из рисунка 3 Б следует, что клонированная и секвенированная промоторная область гена фитохелатинсинтазы гомологична с последовательностью, приведенной в базе данных GenBank.

Создание жспрессионной конструкции на основе промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

Для изучения работы клонированной промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса использовали специально разработанную фирмой Cambia (Австралия) векторную систему, предназначенную для оценки активности промоторов в трансгенных растениях pCAMBIA 1291Z. Полилинкер этого вектора содержит недостаточно сайтов рестрикции, необходимых для клонирования в него исследуемой промоторной области из вектора pGEM-T, поэтому промоторную последовательность предварительно субклонировапи в вектор pAL-TA, имеющий более удобный для работы полилинкер. Поиск клонов, содержащих вставку промоторной области, проводили при помощи агарозного гель-электрофореза и ПЦР. Наличие вставки промоторной последовательности в выбранных клонах после электрофоретического анализа было подтверждено амплификацией и рестрикцией, в ходе которой по сайту EcoRI выщеплялся фрагмент, соответствующий длине промоторной области гена фитохелатинсинтазы (Рис. 4).

Рис. 4. Рестрикционный анализ клонов, содержащих промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса в векторе рСАМВ1А12912. 1 - маркер, амплификат промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса 2, 3 - ДНК исследуемых клонов после рестрикции ЕсоЯ1.

Затем вектор pCAMBIAI291Z, несущий промоторную область гена фитохелатинсинтазы, был клонирован в агробактерии Agrobacterium lumefaciens штамма AGLO. В полученной генетической конструкции под контролем промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса находился маркерный ген GUS, по экспрессии которого возможно судить об индукции данной промоторной области.

Создание трансгенных растений табака, несущих промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса, и ее экспрессия в них.

Для оценки работы промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса требуется создание серии трансгенных модельных растений, содержащих эту последовательность в составе векторной конструкции. Таким требованиям удовлетворяют растения табака Nicotiana tabaccum линии SRI, предназначенные специально для генно-инженерных целей. После агробактериальной трансформации листовых пластинок табака нами проводилась селекция полученных эксплантов, с использованием среды, содержащей антибиотик гигромицин, а затем в этих эксплантах на четвертой неделе селекции была визуально гистохимически выявлена активность маркерного гена GUS в генетической конструкции при индукции 200 и 300 мкМ кадмия (рис.5).

-1 I

контроль 200 мкМ Сё2+ 300 мкМ Сс12+

Рис. 5. Гистохимический анализ Си8-активноети эксплантов табака, обработанных кадмием.

Для количественных спектрофотометрических и флуорометрических измерений использовались растения месячного возраста. При этом фенотипически схожие растения делились на две группы, одна группа растений обрабатывалась Сс12+ в концентрации 200 мкМ, другая - 400 мкМ. Для каждой группы имелись контрольные растения без обработки. Обработку растений кадмием проводили в течение 6 суток. Из опытных и контрольных растений был выделен тотальный белок, в котором проводилось измерение содержания (З-глюкуронидазы с помощью субстрата 4-М1Ю (4-метилумбеллиферил-р-0-глюкуронид) по флуоресценции продукта реакции 4-Ми (4-метилумбеллиферон). Измерения проводили на спектрофлуориметре после 0,5 и 1 часа работы фермента. Результаты были выражены в пкмоль 4-Ми мин 'мг 1 белка (рис. 6).

0,5

время.ч

Рис. 6. Зависимость величины экспрессии промотора фитохелатинсинтазы риса от концентрации индуктора Cd2+ с учетом времени ферментативного действия, Р> 0,95.

Конститутивная активность маркерного гена GUS в контрольных образцах была низкой и составляла при 200 мМ Cd2+ - 23 и 40 пкмоль 4-MU мин 'мг"' через 30 и 60 минут, соответственно, и при 400 мМ Cd2+ - 38 и 41 пкмоль 4-MU мин"'мг', что свидетельствует об индуцибельном характере работы промоторной области фитохелатинсинтазы риса в трансгенных

растениях табака. При этом, хотя и наблюдались различия при разных концентрациях индуктора, они были невелики, что можно объяснить особенностями функционирования данного промотора или несущественным увеличением его активности при очень больших концентрациях индуктора, как в эксперименте с 400 мкМ Cd2+. При этой концентрации практически не наблюдалось различий и по времени ферментативного действия. Но при воздействии 200 мкМ Cd2+, некоторое увеличение активности промотора происходит и в заданных промежутках времени. Такой эффект предположительно должен проявиться заметнее, при снижении концентрации индуктора, однако для данной работы были выбраны такие концентрации кадмия, при которых априори обязательно имела бы место уверенная индукция в случае принципиального наличия таковой для анализируемой генетической системы.

Такой характер индукции промотора фитохелатинсинтазы был подтвержден и на уровне РНК, постановкой ПЦР-РВ с переносом резонансной энергии флуоресценции с использованием праймеров, фланкирующих единственный интрон гена GUS, и несущих флуоресцентные метки FAM и ROX (рис. 7).

8 «

г * 6 8 Ш 12

Рис. 7. ПЦР-РВ с переносом флуоресцентной резонансной энергии.

1 - отрицательный контроль

2 - контрольные образцы растений (без обработки) 3, 4 - образцы, обработанные 200 мкМ Cd +

5,6- образцы, обработанные 400 мкМ Cd2+.

В основе полученных результатов могут лежать ряд причин, например, особенности активности данного промотора в исследуемых растениях, которые зависят от геномного окружения сайта встраивания. Немаловажную роль играет первоначальная затравочная активность промотора, когда в клетке содержится некоторое количество РНК, что ускоряет реакцию растения на воздействие тяжелыми металлами, но эта активность не является конститутивной, ввиду того, что по достижении определенной концентрации РНК постоянная (базовая) работа промотора прекращается, и он становится практически полностью индуцибельным. Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволяют сделать вывод, что регуляторные элементы промотора находятся в пределах этой последовательности размером 900 п.н., и их выявление требует создания трансгенных растений, несущих делеционные варианты промотора.

Создание делеционного варианта промотора фитохелатинсинтазы риса и его экспрессия в трансгенных растениях табака.

Наиболее простым, надежным и удобным способом создания делеционного варианта является использование эндонуклеаз рестрикции и выщепление с их помощью небольших последовательностей от концов промоторной последовательности. Нас интересовали сайты узнавания уникальных гексануклеотидных рестриктаз, с непременным условием их наличия в полилинкере вектора pCAMBIA1291Z. Этим требованиям удовлетворяла рестриктаза PslI, при действии которой от 5'-конца промоторной области вырезался фрагмент размером 189 п.н., с образованием последовательности, несущей предполагаемую промоторную область длиной 711 п.н. Затем генетическая конструкция, содержащая делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, была перенесена в агробактерии штамма AGLO с последующей трансформацией листовых пластинок табака. После получения и селекции серии трансгенных растений табака был произведен сравнительный гистохимический анализ растений, несущих генетическую конструкцию до положения -900п.н. промоторной

последовательности и с делеционными вариантами до положения -711п.н. (рис. 8). В результате эксперимента растения, несущие делеционный вариант промотора фитохелатинсинтазы, также окрашивались, как и в случае с последовательностью -900п.н. Предположительно, удаление на 5'-конце фрагмента размером 189 п.н. могло не затронуть важных элементов промоторной области гена фитохелатинсинтазы, поскольку эта последовательность, согласно базе данных GenBank, начиналась непосредственно от предыдущего гена.

П1Я

[III

контроль 200 мкМ 400 мкМ

Рис. 8. Сравнительный гистохимический анализ активности гена глюкуронидазы в трансгенных растениях табака, несущих полную (А), и делеционную (Б) последовательность промотора фитохелатинсинтазы.

На основании данного предположения, экспрессионная активность делеционного варианта промотора фитохелатинсинтазы риса была также измерена флуориметрически по экспрессии маркерного гена GUS, как описано выше для полноразмерного промотора. Сравнительные результаты по экспрессии полной последовательности промотора и его делеционного варианта представлены на рис. 9. -711п.н. делеционный вариант промотора фитохелатинсинтазы риса показал аналогичные его полноразмерному

аналогу параметры в зависимости от времени воздействия и концентрации кадмия при обработке. Однако «сила промотора» была даже несколько выше, что, скорее всего, объясняется удалением при создании делеционного варианта «балластных» последовательностей, несущественных для проявления активности истинного промотора.

вреш, ч

и контроль, ОнкМ Cd2+ Q контроль делециожьй

Ом<М Cd2+ Ш 200 п*М Cd2+ й 200 м<М Cd2+ делеьуожьй Ш400 wkM Cd2+ 0 400мкМ Cd2+ делета+ьй

Рис. 9. Сравнение активности «полноразмерной» и делеционной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса по активности репортерного гена GUS.

Конструирование, клонирование и экспрессия

псевдофитохелатинового гена.

Природные фитохелатины, продуцируемые растениями, имеют общую структуру (y-GluCys)n-Gly, что говорит о их нематричной природе, благодаря наличию у-связи и, таким образом, они не являются первичными генными продуктами, а синтезируются ферментативным путем. Кроме того, известно, что в фитохелатинах основную нагрузку по связыванию тяжелых металлов выполняют повторяющиеся мотивы (GluCys) через комплексообразование. Проведенный анализ литературы показал, что не имеется каких-либо серьезных препятствий для создания и функционирования в растениях таких генов, а также для существования самих псевдофитохелатинов с обобщенной формулой Met(a-GluCys)nGly (где п - количество повторяющихся мотивов (GluCys). Так, нами выбор был остановлен на варианте псевдофитохелатина со следующей

последовательностью аминокислот: Met(a-GluCys)4Gly, и с учетом частот встречаемости тех или иных кодонов в растениях была воссоздана его нуклеотидная последовательность. Для конструирования и клонирования этого гена были синтезированы соответствующие комплементарные друг другу олигонуклеотидные блоки протяженностью по 64 нуклеотида каждый. В состав формирующегося таким образом двуцепочечного фрагмента ДНК, помимо 10-ти кодирующих триплетов, входил также терминирующий кодон TAG. Последовательности олигонуклеотидов с целью направленного клонирования в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1 по сайтам узнавания рестрикционных эндонуклеаз Ncol и Pmll были составлены таким образом, что при их отжиге и формировании двуцепочечной молекулы на 5'-конце возникал выступающий "липкий" конец CATG, а другой конец был "тупой"., В этом векторе экспрессия псевдофитохелатинового гена должна происходить под управлением вирусного конститутивного 35S промотора вместо маркерного гена GUS. На рис. 10 представлены результаты электрофоретического анализа ДНК полученных клонов.

Рис. 10. Электрофореграмма ДНК клонов, предположительно несущих вставку псевдофитохелатинового гена. 1 - маркер, вектор рСАМВ1А 1305.1, 2-9 - образцы, взятые для дальнейшего анализа.

В ДНК выбранных клонов наличие вставки псевдофитохелатинового гена выявляли при помощи ПЦР с праймерами, ограничивающими как саму вставку, так и прилегающие к вставке участки вектора.

Создание трансгенных растений, несущих псевдофитохелатиновый ген и его экспрессия в них.

После подтверждения наличия целевой вставки, плазмидами из выбранных клонов были трансформированы агробактерии штамма AGLO. Затем была проведена трансфекция листовых пластинок табака. В этом случае детекция трансгенных растений была затруднена в связи с отсутствием маркерного гена GUS и велась длительное время на среде с антибиотиком гигромицином. Кроме того, наличие псевдофитохелатинового гена, встроенного в геном растений, проверялось амплификацией с хромосомной ДНК предположительно трансгенных и контрольных растений с тем же комплектом праймеров, как и при определении содержания вставки этого гена в бактериальных клонах (рис. 11).

147 и.н__

108 u.U.-

(¡7 ti.il.-

Рис. 11. Электрофоретический анализ наличия в трансгенных растениях псевдофитохелатинового гена с использованием фланкирующих его праймеров.

1 - маркер, плазмида рВкезспрг, обработанная рестриктазой НраП, 1 - отрицательный контроль, ДНК нетрансгеннного табака, 3 - ДНК предположительно трансгенного растения, не содержащего искомого гена,

4, 5 - трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген.

Для оценки уровня экспрессии псевдофитохелатинового гена в растениях табака, листовые пластинки выращивали на среде, содержащей различные концентрации кадмия. Были выбраны концентрации в 100, 200, 300, 400 мкМ С(12\ Эксперимент проводили в течение месяца, в каждой группе с заданной концентрацией имелись опытные и контрольные растения.

Нами была произведена оценка реакции растений на сам псевдофитохелатин в виде пептида (постоянные высокие концентрации его предположительно могли быть токсичными для растения), их выживаемости в условиях жесткого и экстремального токсического стресса, вызванного воздействием тяжелых металлов, а также особенности роста и развития. Наиболее значимые результаты были получены в эксперименте с 200 мкМ кадмия. На рис. 12 видно, что рост контрольных растений заметно подавлен (слева), тогда как у трансгенных начинается рост и дифференцировка (справа).

Рис. 12. Воздействие кадмия (200 мкМ) на контрольные и трансгенные растения.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов могут свидетельствовать о том, что в исследуемых модельных трансгенных растениях табака заметно повышалась устойчивость к кадмию, благодаря активно функционирующему псевдофитохелатиновому гену, находящегося под контролем вирусного конститутивного промотора 358.

контроль трансгенные растения

Выводы

1. Показана эффективность методов оценки экспрессии эукариотических генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ в присутствии РНКазы Н при определении индукции промотора фитохелатинсинтазы риса в растениях Oryza sativa.

2. На основе клонированной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса созданы экспрессируемые конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z, в которых под контролем данного промотора находится маркерный ген ß-глюкуронидазы GUS.

3. Созданы трансгенные растения табака, несущие промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и показано, что регуляторные элементы находятся в пределах исследуемой промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса, при этом транскрипционная активность промотора носит индуцибельный характер при воздействии различных концентраций кадмия.

4. Обнаружено, что трансгенные растения табака, содержащие делеционный вариант промоторной последовательности до положения -711 п.н. от старт-кодона гена фитохелатинсинтазы риса, содержат достаточные для транскрипции регуляторные элементы.

5. Созданы генно-инженерные конструкции на основе бинарного вектора pCAMBIA 1305.1, содержащие псевдофитохелатиновый ген.

6. Показано, что полученные трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген, кодирующий пептид Met(G!uCys)4GIy, обладают повышенной устойчивостью к действию тяжелых металлов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Постригань Б.Н. Клонирование промотора и кодирующей части гена фитохелатинсинтазы риса Oryza sativa II Материалы конференции молодых ученых «Ломоносов». Т. IV - М.: Изд-во МГУ, 2006.

2. Постригань Б.H., Князев A.B., Чемерис A.B. Индукция промотора фитохелатинсинтазы риса и экспрессия псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака и перспективы их применения для фиторемедиации загрязненных тяжелыми металлами почв // Аграрная Россия. - 2009. - спец. выпуск. - С. 129-130.

3. Гарафутдинов P.P., Никоноров Ю.М., Чемерис Д.А., Постригань Б.Н., Чубукова О.В., Талипов Р.Ф., Вахитов В.А., Чемерис A.B. Новые способы генерации сигнала флуоресценции при анализе однонуклеотидных замен с помощью химерных гибридизационных зондов в реальном времени // Биоорганическая химия. - 2009. - Т.35, № 5. - С. 665-673.

4. Постригань Б.Н., Яхин О.И. Применение ПЦР-РВ, основанной на эффекте FRET, на платформе "УФА" для детекции экспрессии эукариотических генов // Мат. школы-конференции «Биомика-наука XXI века». - Уфа - 2007.

5. Матниязов Р.Т., Князев A.B., Чемерис Д.А., Постригань Б.Н., Чемерис A.B. Надежное подтверждение произошедшего трансгеноза при получении трансгенных растений с помощью агробактериальной трансформации Н Материалы Школы-семинара молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии "Биомика-наука XXI века", г. Уфа, 2007., С.89-91.

6. Матниязов Р.Т., Гималов Ф.Р., Чемерис Д.А., Никоноров Ю.М., Вахитов В.А., Чемерис A.B., Магданов Э.Г., Постригань Б.Н., Князев A.B. Способ детекции в режиме реального времени специфичных фрагментов РНК с помощью полимеразной цепной реакции без применения ДНКазы II Заявка на патент РФ № 2007138956 с приоритетом от 22 октября 2007 г.

при Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», ----_—заказ № 217, тираж 100, печать л. 2,0, 450054, пр. Октября, 71

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Постригань, Богдан Нилович

Список условных обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. История открытия, биосинтез, структура и функции фитохел атинов.

1.1. Механизмы ответа растений на воздействие тяжелых металлов.

1.1.1. Органические кислоты и аминокислоты.

1.1.2. Металл - связывающие пептиды.

1.2. Открытие и краткая характеристика металлотионеинов.

1.2.1. Структура металлотионеинов.

1.2.2. Консервативность аминокислотной последовательности металлотионеинов.

1.2.3. Кластеры металлов и их структура.

1.3. Структура и биосинтез фитохелатинов.

1.4. Физиологические функции фитохелатинов.

1.4.1. Участие фитохелатинов в поддержании гомеостаза.

1.4.2. Участие в детоксикации кадмия с образованием комплексов, устойчивость растений к кадмию.

1.5. Индуцируемая экспрессия фитохелатинсинтаз растений на генном уровне.

1.6 Эксперименты по созданию синтетических псевдофитохелатиновых генов.

Глава 2. Фиторемедиация, фитоэкстракция и фитомайнинг.

ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Реактивы и материалы.

3.1. Объекты исследований, бактериальные штаммы, плазмиды и фагмидные векторы.

3.2. Реактивы и материалы.

3.3. Составы использованных стандартных растворов.

Глава 4. Методы исследований.

4.1. Выделение и очистка ДНК растений.

4.2. Выделение и очистка РНК растений.

4.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

4.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

4.5. Ферментативное фосфорилирование олигонуклеотидов.

4.6. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирую щих условиях.

4.7. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирую щих условиях.

4.8. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей.

4.9. Подготовка компетентных клеток E.coli.

4.10. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной

4.11. Трансформация Agrobacterium tumefaciens плазмидными конструкциями.

4.12. Автоматическое секвенирование ДНК.

4.13. Синтез к ДНК.

4.14. Полимеразная цепная реакция.

4.15. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

4.16. Технология циклирующей пробы.

4.17. Приготовление компетентных клеток E.coli и

Agrobacterium tumefaciens.

4.18. Электропорация компетентных клеток E.coli и

Agrobacterium tumefaciens.

4.19. Агробактериальная трансформация листовых пластинок табака.

4.20. Выделение тотального белка из растений.

4.21. Флюорометрическое определение активности репортерного гена GUS.

4.22. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

Часть 3. Результаты и обсуждение.

Глава 5. Клонирование и экспрессия в трансгенных растениях промоторной гена фитохелатинсинтазы риса Oryza sativa.

5.1. Оценка экспрессии промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

5.2. Клонирование и секвенирование промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

5.3. Создание экспрессионной конструкции на основе промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.

5.4. Создание трансгенных растений табака, несущих промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и ее экспрессия в них.

5.5. Создание делеционного варианта промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса и его экспрессия в трансгенных растениях табака.

Глава 6. Конструирование, клонирование и экспрессия псевдофитохелатинового гена.

6.1. Конструирование и клонирование псевдофитохелатинового гена.

6.2. Создание трансгенных растений, несущих псевдофитохелатиновый ген и его экспрессия в них.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака"

Актуальность работы. Одной из наиболее актуальных проблем нескольких последних десятилетий является неизбежно нарастающее техногенное загрязнение окружающей среды, в частности, тяжелыми металлами, в число которых входят ртуть, кадмий, свинец, цинк, медь и некоторые другие. Попадая различными путями в атмосферу и почву в повышенных концентрациях, они поступают сначала в растения, а затем с продуктами питания, в организм человека и животных (Wei, Zhou, 2008). Загрязнение плодородного слоя почвы тяжелыми металлами представляет собой серьезную проблему, поскольку такие металлы, как цинк, свинец и особенно кадмий обычно присутствуют в минеральных удобрениях, из-за чего с каждым годом растет их содержание в почве и увеличиваются площади загрязненных ими земель (Vassilev at al., 2002).

На протяжении многих лет во всём мире уделяется значительное внимание проблеме устойчивости растений к тяжелым металлам, поскольку они являются опасными экотоксикантами, что вызывает повышенный интерес к выяснению механизмов устойчивости растений к тяжелым металлам. Хотя в природе постоянно происходит естественная самоочистка загрязненных территорий, скорость данного процесса и его качество уже не позволяют полностью утилизировать токсичные отходы. Участки почв, загрязненные тяжелыми металлами, часто утрачивают растительность, что приводит к их эрозии и позволяет металлам распространяться с воздушными потоками, что расширяет площади загрязнений. В настоящее время используются механические, химические и биологические способы очистки загрязненных территорий. Однако общепринятые технологии рекультивации земель требуют больших капиталовложений и могут сопровождаться возникновением нежелательных побочных эффектов. Более того, эти технологии разрушают структуру почв и приводят к ее биологической инактивации (Raskin, Ensley, 2000; Mulligan et al., 2001;

Alkorta et al., 2004; Ghosh, Singh, 2005; Van Slycken et al., 2009). Большинство этих методов нельзя использовать для очистки территорий, где плодородие почв имеет большое значение (Chaney et al., 2007).

В связи с этим, для очистки и стабилизации загрязненных участков наиболее привлекательным выглядит применение растений, или так называемая "фиторемедиация" (Pilon-Smits, 2005; Stearns et al., 2007; Memon A.R., Schroder P., 2009). При этом стоимость всего комплекса мероприятий по очистке снижается, а какой-либо дополнительный ущерб окружающей среде отсутствует. Фиторемедиация не только способствует удалению из почвы загрязнителей, но и препятствует процессу выщелачивания почв, что приводит к улучшению, или, по крайней мере, к сохранению их структуры, повышению плодородия и сохранению возможности переработки загрязняющих веществ. Данный способ может использоваться для очистки больших территорий, где метод экскавации не приемлем, а также для очистки подземных и сточных вод. Однако на сверхзагрязненных территориях он ограничивается устойчивостью самих растений, применяемых при очистке (Witters at al., 2009). Проблема устойчивости растений к тяжелым металлам- имеет как теоретическое, так и практическое значение. Существуют естественные растения-аккумуляторы, которые могут накапливать тяжелые металлы в высоких концентрациях. Однако, чаще всего, они растут медленно и имеют низкую биомассу (Whiting et al., 2004). В последнее время разрабатываются различные подходы, обеспечивающие повышение эффективности фиторемедиационных мероприятий путем увеличения- скорости роста и биомассы^ растений-гипераккумуляторов, в? основном, при помощи генно-инженерных; приемов, таких как введение генов, кодирующих- признаки,;

I 1 1 ~ t характерные для< растений-гипераккумуляторов (Nagata at al.,' 2009). Одним из таких свойств является синтез металл-связывающих пептидов. Изучение механизма работы соответствующих- генов и создание трансгенных растений, способных накапливать без ущерба для своего развития значительные количества тяжелых металлов, и, таким образом, способствовать их выведению из почвы, позволит осуществлять очистку загрязнённых территорий, где уровень неорганических экотоксикантов особенно высок (Tong et al., 2004). За связывание тяжелых металлов в растениях отвечают, помимо прочих механизмов, специализированное семейство генов, кодирующих ферменты глутамилцистеинилдипептидил-транспептидазы (фитохелатинсинтазы), при помощи которых происходит нематричный синтез металл-связывающих пептидов-фитохелатинов с общей структурой [y-Glu(Cys)]n-Gly, где п = 2—11 (Clemens et al., 1999; Vatamaniuk et al., 2000). При создании растений, пригодных для использования в фиторемедиации, видится перспективным использование регуляторных элементов генов фитохелатинсинтаз, их кодирующей части, а также синтетических "псевдофитохелатиновых" генов, непосредственно кодирующих фитохелатины с несколько измененной структурой, характеризующейся отсутствием у-пептидной связи глутамина в силу матричной природы их синтеза.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования явилось создание модельных трансгенных растений табака, несущих полноразмерный и делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, псевдофитохелатиновый ген и изучение экспрессии данных конструкций в трансгенных растениях.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать эффективные методы оценки экспрессии эукариотических генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ* в присутствии РНКазы Н.

2. Создать на основе клонированной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса генно-инженерные конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z с маркерным геном (3-глюкуронидазы GUS под контролем клонированного промотора.

3. Путем агробактериальной трансформации создать трансгенные растения табака, несущие промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и определить ее границы.

4. Провести количественную оценку транскрипционной активности промотора фитохелатинсинтазы риса.

5. Сконструировать олигонуклеотиды для создания псевдофитохелатинового гена с последующим клонированием его в бинарном векторе pCAMBIA 1305.1.

6. Создать трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген, и оценить сравнительную устойчивость таких растений к тяжелым металлам.

Научная новизна. Разработаны и на примере гена фитохелатинсинтазы риса опробованы два новых подхода к определению и оценке экспрессии безынтронных эукариотических генов, применимых также для анализа экспрессии генов, для которых отсутствует точная информация об интронах. Впервые созданы трансгенные растения табака, несущие генетическую конструкцию на основе промотора фитохелатинсинтазы риса и его делеционного варианта в рамках системы гетерологической экспрессии, в которых промоторная область одного вида растения функционирует в другом. Проведен количественный анализ экспрессии промотора фитохелатинсинтазы и его делеционного варианта в трансгенных растениях табака. Сконструированы олигонуклеотиды, на основе которых создан псевдофитохелатиновый ген, кодирующий фитохелатины матричного синтеза или псевдофитохелатины с последовательностью аминокислот Met(a-GluCys)4Gly. Созданы трансгенные растения, продуцирующие псевдофитохелатины, повышающие устойчивость растений к тяжелым металлам. Проведена оценка устойчивости к кадмию трансгенных растений табака, экспрессирующих псевдофитохелатины.

Практическая значимость. Создание трансгенных растений, способных накапливать без ущерба для своего развития значительные количества тяжелых металлов, связанных псевдофитохелатинами, и, таким образом, способствовать их выведению из почвы, позволит осуществлять очистку загрязнённых территорий, где уровень неорганических экотоксикантов особенно высок. Исследование промотора фитохелатинсинтазы риса служит отправным этапом для создания трансгенных растений в тех случаях, когда необходима не конститутивная, а индуцибельная экспрессия, например при возможной токсичности псевдофитохелатинов с большим числом повторяющихся мотивов (а-GluCys)n.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006), на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007), молодежной научной школе-конференции «Современные методы и подходы в биологии и экологии» (Уфа, 2008).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 24 рисунка и 2 диаграммы. Состоит из, введения, обзора литературы (Часть 1), описания методов исследования (Часть 2), результатов исследования и их обсуждения (Часть 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 161 источник.

Конкурсная-поддержка работы: Исследования выполнены в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ НШ 1003.2006.4, НШ-649.2008.4 и Государственного контракта 02.740.11.0290

Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Постригань, Богдан Нилович

Выводы

1. Показана эффективность методов оценки экспрессии эукариотических генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦР-РВ в присутствии РНКазы Н при определении индукции промотора фитохелатинсинтазы риса в растениях Oryza sativa.

2. На основе клонированной последовательности промотора фитохелатинсинтазы риса созданы экспрессируемые конструкции в векторе pCAMBIA 1291Z, в которых под контролем данного промотора находится маркерный ген (3-глюкуронидазы GUS.

3. Созданы трансгенные растения табака, несущие промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и показано, что регуляторные элементы находятся в пределах исследуемой промоторной последовательности гена фитохелатинсинтазы риса и активность промотора носит индуцибельный характер при воздействии различных концентраций кадмия.

4. Обнаружено, что трансгенные растения табака, содержащие делеционный вариант промоторной последовательности до положения -711 п.н. от старт-кодона гена фитохелатинсинтазы риса содержат достаточные для транскрипции регуляторные элементы

5. Показано, что полученные трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген, кодирующий пептид Met(GluCys)4Gly, обладают повышенной устойчивостью к действию тяжелых металлов.

Заключение

Для обезвреживания ядовитых органических веществ, попадающих в окружающую среду с отходами химических предприятий, уже давно и довольно успешно используют различные микроорганизмы. Однако они не способны удалять из почвы и воды вредные для здоровья тяжелые металлы - например, мышьяк, кадмий, медь, ртуть, селен, свинец, а также радиоактивные изотопы стронция, цезия, урана и другие радионуклиды. В связи с этим, остро стоит вопрос очистки загрязненных тяжелыми металлами территорий. В настоящее время для этого используются дорогостоящие, малоэффективные технологии, основанные на механическом удалении таких загрязнителей и химической обработке почв. Однако, для зеленых растений характерен процесс извлечения из окружающей среды и концентрирования в своих тканях различных элементов, кроме того, растительную массу не составляет особого труда собрать и сжечь, а образовавшийся пепел захоронить, или использовать как вторичное сырье.

Фиторемедиация, или использование растений для очистки окружающей среды, стала эффективным и экономически выгодным методом борьбы с загрязнением только после того, как обнаружили растения-гипераккумуляторы тяжелых металлов, способные накапливать в своих листьях до 5% никеля, цинка или меди в пересчете на сухой вес - то есть в десятки раз больше, чем обычные растения. Биологическое значение этого феномена еще до конца не раскрыто: можно, например, предположить, что высокое* содержание токсичных элементов защищает растения от вредителей и делает их более устойчивыми к болезням. Устойчивость к воздействию- тяжелых металлов у гипераккумуляторов обусловлена биосинтезом такими растениями специальных металл-связывающих веществ различной природы, в основном коротких пептидов, синтезируемых ферментативным путем - фитохелатинов.

Использование гипераккумуляторов для очистки почвы и воды предложено еще в начале 80-х годов. Однако, биомасса этих растений невелика, кроме того, не была разработана технология их выращивания. Ключевую позицию в этом вопросе заняла генная инженерия, при помощи которой можно перенести гены, кодирующие металл - связывающие пептиды гипераккумуляторов в растения, производящие большие количества биомассы, и обладающие значительным потенциалом для экспрессии таких конструкций. Помимо исследований с генами фитохелатинсинтаз проводились работы по созданию синтетических генов, кодирующих аналогичные фитохелатинам пептиды, способные синтезироваться матричным путем на рибосомах. Экспрессия этих генов показана в прокариотах, главным образом E.coli, с целью оценки возможности использования таких микроорганизмов в биоремедиации загрязненных сточных вод.

Перед нами стояла задача исследовать свойства промотора фитохелатинсинтазы риса для оценки перспективы, его использования в качестве промотора псевдофитохелатинового гена, в экспериментах по фиторемедиации. С этой целью промоторная последовательность фитохелатинсинтазы риса была клонирована в бинарный вектор pCAMBIA 1291Z, в котором под ее контролем находился маркерный ген р-глюкуронидазы GUS. Затем, в трансформированых полученными конструкциями растениях табака была исследована активность промотора гена фитохелатинсинтазы. В ходе исследований было показано, что промоторная область гена фитохелатинсинтазы риса обладает такими полезными качествами, как индуцибельность при действии кадмия в различных- его концентрациях и сравнительно высокая «промоторная сила».

Дальнейшей задачей по изучению экспрессионных свойств промоторной области явилось более точное определение расположения в-ней регуляторных элементов, обеспечивающих ее активность. Для этого от промоторной области с 5'-конца была удалена последовательность размером 189 п.н. до положения -711 п.н. и создана серия трансгенных растений табака, несущих образовавшийся делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, в которых под его контролем находился маркерный ген GUS. В результате оказалось, что регуляторные элементы лежат в пределах этой оставшейся после произведенной делеции последовательности, помимо этого «промоторная сила» этого участка была даже несколько выше, чем у полноразмерной промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса. Таким образом, можно заключить, что данная промоторная область удовлетворяет необходимым условиям по созданию генетических конструкций, которые в трансгенных модельных растениях табака будут пригодны для использования в экспериментах по фиторемедиации.

В результате проведенных экспериментов был создан синтетический псевдофитохелатиновый ген, кодирующий аналог фитохелатина с формулой Met(GluCys)4Gly, и синтезирующийся матричным путем. Генно-инженерная конструкция в векторе pCAMBIA 1305.1 на основе этого гена под управлением вирусного конститутивного промотора 35S обуславливала повышенную устойчивость несущих ее трансгенных растений табака при воздействии кадмия. В перспективе, следующим этапом исследований будет создание трансгенных растений табака, несущих псевдофитохелатиновый ген под контролем промотора гена фитохелатинсинтазы риса с ожидаемой индуцибельной экспрессией такой генетической конструкции при воздействии тяжелых металлов. Этот вариант экспрессии предпочтительнее в силу возможной токсичности для самого растения большого количества нарабатываемых псевдофитохелатинов при конститутивной экспрессии, особенно в случае наличия в ожидаемых конструкциях псевдофитохелатинового гена с различным числом повторяющихся мотивов (GluCys).

Создание генно-инженерными методами растенийгипераккумуляторов тяжелых металлов, пригодных для очистки загрязненных территорий представляет значительный практический интерес, с учетом того, что доля генетически модифицированных растений, используемых в сельском хозяйстве, постепенно растет. Такой подход имеет ряд преимуществ, поскольку он прост, не требует значительных затрат денежных средств и времени по сравнению с классическими методами механической и химической ремедиации. Помимо этого, такие растения, в перспективе, могут успешно применяться при фитоэкстракции накопленных в их биомассе тяжелых или даже драгоценных металлов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Постригань, Богдан Нилович, Уфа

1. Серегин И.В. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадия у высших растений // Успехи биологической химии. 2001. - Т.41. - С. 281300.

2. Assun9ao A.G., Martins P.D., De Folter S., Vooijs R., Schat H., Aarts M.G. Elevated expression of metal transporter genes in three accessions of the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // Plant, Cell and Environment. -2001.-V. 24.-P. 217-226.

3. Assunijao A.G., Peiper В., Vromans J., Lindhout P., Aarts M.G., Schat H. Construction of a genetic linkage map of Thlaspi caerulescens and quantitative trait loci analysis of zinc accumulation 11 New Phytologist. 2006. - V. 170. - P. 21-32.

4. Beck A., Lendzian K., Oven M., Christmann A., Grill E. Phytochelatin synthase catalyzes key step in turnover of glutathione conjugates // Phytochemistry. 2003. - V. 62. - P. 423-431.

5. Bae W., Mehra R.K. Metal-binding characteristics of a phytochelatin analog (Glu-Cys)2Gly // J. Inorg. Biochem. 1997. - V. 68. - P. 201-210.

6. Baker A.J.M., McGrath S.P., Reeves R.D., Smith J.A.C. Metal hyperaccumulator plants // A review of the ecology and physiology of abiological resource for phytoremediation of metal-polluted soils. 2000. - P. 85107.

7. Banuelos G.S. Phyto-products may be essential for sustainability and implementation of phytoremediation // Environ. Pollut. 2006. - V. 144. - P. 1923.

8. Blakeley S.D., Robaglia Ch., Brzezinski R., Thirion J.P. Induction of low molecular weight cadmium-binding compound in soybean roots // J. Exp. Bot. 1986. Vol. 37. P. 956—964.

9. Blum R., Beck A., Korte A., Stengel A., Letzel Т., Lendzian K., Grill E. Function of phytochelatin synthase in catabolism of glutathioneconjugates // Plant J. 2007. - V. 49. - P. 740-749.

10. Bartolf M., Brennan E., Price C.A. Partial Characterization of a Cadmium-binding Protein from the Roots of Cadmium-treated Tomato. // Plant Physiol. 1980. Vol. 66. P. 438—441.

11. Callahan D.L., Baker A.J., Kolev S.D., Wedd A.G. Metal ion ligands in hyperaccumulating plants // J. Biol. Inorg. Chem. 2006. - V. 11. - P. 2-12.

12. Cazale A.C., Clemens S. Arabidopsis thaliana expresses a second functional phytochelatin synthase // FEBS Letters. 2001. - V. 507. - P. 215219.

13. Chaney R.L., Angle J.S., Mcintosh M.S., Reeves R.D., Li Y.M., Brewer E.P., et al. Using hyperaccumulator plants to phytoextract soil Ni and Cd // Zeitschrift fur Naturforschung. 2005. - V. 60. - P. 190-198.

14. Chaney R.L., Angle J.S., Broadhurst C.L., Peters C.A., Tappero R.V., Sparks D.L. Improved Understanding of Hyperaccumulation Yields Commercial Phytoextraction and Phytomining Technologies // J. Environ. Qual. 2007. - V. 36.-P. 1429-1443.

15. Chen J., Goldsbrough P.B. Increased activity of g-glutamylcysteine synthetase in tomato cells selected for cadmium tolerance // Plant Physiol. -1994.-V. 106.-P. 233-239.

16. Chen S., Wilson D. B. Construction and characterization of Escherichia coli genetically engineered for bioremediation of Hg2 contaminated environments // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - V. 63. - P. 2442-2445.

17. Chen J., Zhou J., Goldsbrough P.B. Characterization of phytochelatin synthase from tomato // 1997. Physiol Plant V. 101. - P. 165-172.

18. Clemens S., Kim E.J., Neumann D., Schroeder J.I. Tolerance to toxic metals by a gene family of phytochelatin synthases from plants and yeast. // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 3325—3333.

19. Clemens S., Schroeder J., Degenkolb T. 2001 Caenorhabditis elegans expresses a functional phytochelatin synthase // Eur. J. Biochem. V. 268. - P. 3640-3643.

20. Clemens S. Evolution and function of phytochelatin synthases. // 2006.-J. Plant Physiol.-V. 163.-P. 319-332.

21. Cobbett C.N., May M.J., Howden R., Rolls B. The glutathione-deficient, cadmium-sensitive mutant, cad2-1, of Arabidopsis thaliana is deficient in y-glutamylcysteine synthetase. // Plant J. 1998. Vol. 16. P. 73—78.

22. Cobbett C.S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification. // Plant Physiol. 2000. - V. 123. - P. 825-832.

23. Cobbett C.S. Phytochelatin biosynthesis and function in heavy-metal detoxification // Curr. Opin. Plant. Biol. 2000. - V. 3. - P. 211-216.

24. Cobbett C., Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis // Annu Rev Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2002-V. 53.-P. 159-182.

25. Cunningham S.D., Berti W.R., Huang J.W.W. Phytoremediation of contaminated soils // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13. - P. 393-397.

26. Danuta M.A. Overexpression of phytochelatin synthase in tobacco: distinctive effects of AtPCS 1 and CePCS genes on plant response to cadmium // Journal of Experimental Botany. 2008. - V. 59, N 8. - P. 2205-2219

27. Dameron C.T., Winge D.R. Peptide-mediated formation of quantum semiconductors // Trends Biotechnol. 1990. - V. 8, N 1. - P. 3-6.

28. Delhaize E., Jackson P.J., Lujan L.D., Robinson N.J. Poly(gamma-glutamylcysteinyl)glycine Synthesis in Datura innoxia and Binding with Cadmium : Role in Cadmium Tolerance // Plant Physiol. 1989. Vol. 89. P. 700— 706.

29. Deniau A.X., Peiper В., Ten Bookum W.M., Lindhout P., Aarts M.G., Schat H. QTL analysis of cadmium and zinc accumulation in the heavy metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // Theoretical and Applied Genetics. -2006.-V. 113.-P. 907-920.

30. Dietz A.C., Schnoor J.L. Advances in phytoremediation // Environ. Health Perspect.-2001.-V. 109.-P. 163-168.

31. Eapen S., Singh S., D'Souza S.F. Advances in development of transgenic plants for remediation of xenobiotic pollutants // Biotechnol. Adv. -2007.-V. 25.-P. 442-451.

32. Ernst W.H.O. Phytochelatins in Cadmium-Sensitive and Cadmium-Tolerant Silene vulgaris // Plant Physiol. 1994. Vol. 104. P. 255—261.

33. Ernst W.H.O. // Biomarkers: A Prag matic Basis for Remediation of Severe Pollution in Eastern Europe / Ed: Peakall D.B., Walker C.H., Migula P. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 1999. - P. 135—151.

34. Gadd G.M., White C. Microbial treatment of metal pollution: a working biotechnology? // Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 353-359.

35. Gairola C.G., Wagner G.J., Diana J.N. Tobacco, Cd and health // Journal of Smoking-Related Disorders. 1992. - V. 3. - P. 3-6.

36. Gasic K., Korban S.S. Expression of arabidopsis phytochelatin synthase in indian mustard (brassica juncea) plants enhances tolerance for Cd and Zn // Planta. 2007. - V. 225. - V. 1277-1285.

37. Ghosh M., Singh S.P. A review on phytoremediation of heavy metals and utilization of its byproducts // Appl. Ecol. Environ. Res. 2005. — V. 3. - P. 1-18.

38. Raskin I., Ensley B.D. Phytoremediation of toxic metals: using plants to clean up the environment // Wiley, New York. 2000.

39. Gries G.E., Wagner G.J. Association of nickel versus transport of cadmium and calcium in tonoplast vesicles of oat roots // Planta. 1998. Vol. 204. P. 390—396.

40. Grill E., Winnacker E.L., Zenk M.H. Phytochelatins: the principal heavy-metal complexing peptides of higher plants // Science. 1985. — V. 230. -P. 674-676.

41. Grill E., Gekeler W.K., Winnacker E.L., Zenk M.H. Homo-phytochelatins are heavy metal-binding peptides of homo-glutathione containing Fabales. //FEBS. Lett. 1986. Vol. 205. P. 47—50.

42. Grill E., Winnacker E.L., Zenk M.H. Phytochelatins, a class of heavy-metal-binding peptides from plants, are functionally analogous to metallothioneins //Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. Vol. 84. P. 439—443.

43. Grill E., Loffler S., Winnacker E.L., Zenk M.N. Phytochelatins, a, class of heavy metal-binding peptides from plants, are functionally analogous to metallothioneins//Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 6838—6842.

44. Grotz N., Guerinot M.L. Molecular aspects of Cu, Fe and Zn homeostasis in plants // Biochim. Biophys. Acta. 2006. -V. 1763. -P. 595.

45. Ha S.B., Smith A.P., Howden R., Dietrich W.M., Bugg S., O'Connell M.J., Goldsbrough P.B., Cobbett C.S. Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe // Plant Cell. 1999. -V. 11.-P. 1153-1163.

46. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // J. Exp. Bot. 2002. - V. 53. - P. 1-11.

47. Hayashi Y., Nakagawa C.W., Muton N., Isobe V., Goto T. Two pathways in the biosynthesis of cadystins (gamma EC)nG in the cell-free system of the fission yeast. // Biochem. Cell Biol. 1991. Vol. 69. - P. 115—121.

48. Hell R., Bergmann L. Glutamylcysteine synthetase in higher plants: catalytic properties and subcellular localization // Planta 1990. Vol. 180. - P. 603—612.

49. Horsh R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.C., Fraley R.T. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. 1985.-V. 227.-P. 1229-1231.

50. Howden R., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive mutants of Arabidopsis thaliana //Plant Physiol. 1992.- V.99. - P. 100-107.

51. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.S., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive, cadi mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient // Plant Physiol. 1995. - Vol. 107. - P. 1059—1066.

52. Juang R.H., McCue K.F., Ow D.W. wo purine biosynthetic enzymes that are required for cadmium tolerance in Schizosaccharomyces pombe utilize cysteine sulfinate in vitro // Arch. Biochem. Biophys. 1993. - Vol. 304. - P. 392-—401.

53. Kagi JHR. Overview of metallothionein // Methods Enzymol. 1991. -V. 205.-P. 613-626.

54. Kim J.H., Lee S. Overexpression of Arabidopsis phytochelatin synthase (AtPCSl) does not change the maximum capacity for non-protein thiol production induced by cadmium // J. of Plant Biology. 2007. - V. 502. - P. 220-223.

55. Klapheck S., Fliegner W., Zimmer I. Hydroxymethyl-phytochelatins (gamma-glutamylcysteine)n-serine. are metal-induced peptides of the Poaceae. // Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P. 1325—1332.

56. Kobayashi R., Yoshimura E. Differences in the binding modes of phytochelatin to cadmium and zinc ions // Biol. Trace Elem. Res. 2006. - V. 114.-P. 313-318.

57. Kotrba P., Doleckova L., de Lorenzo V., Ruml T. Enhanced bioaccumulation of heavy metal ions by bacterial cells due to surface display of short metal binding peptides // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 1092-1098.

58. Krotz R.M., Evangelou B.P., Wagner G.J. Relationships between Cadmium, Zinc, Cd-Peptide, and Organic Acid in Tobacco Suspension Cells. // Plant Physiol. 1989. - V. 91. - P. 780—787.

59. Kuboi Т., Noguchi A., Yazaki J. Relationship between tolerance and accumulation characteristics of cadmium in higher plants // Plant Soil. 1987. -V. 104. - P. 275—280.

60. Kubota H.5 Sato K.5 Yamada Т., Maitani T. Phytochelatin homologs induced in hairy roots of horseradish. // Phytochemistry. 2000. - V. 53. - P. 239—245.

61. Lasat M.M. Phytoextraction of toxic metals: A review of biological mechanisms//J. Environ.,Qual. -2002. V. 31.-P. 109-120.

62. Lee S., Moon J.S., Ко T.S., Petros D., Goldsbrough P.B., Korban S.S. Overexpression of Arabidopsis phytochelatin synthase paradoxically leads tohypersensitivity to cadmium stress // Plant Physiology. 2003. - V. 131. - P. 656-663.

63. Leoffler S., Hochberger A., Grill E., Winnaacker E.L., Zenk M.H. Termination of the phytochelatin synthase reaction through sequestration of heavy metals by the reaction product // FEBS Lett. 1989. - V. 258. - P. 42-46.

64. Li Z.S., Szczypka M., Lu Y.P., Thiele D.J., Rea P.A. The yeast cadmium factor protein (YCF1) is a vacuolar glutathione S-conjugate pump. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 6509—6517.

65. Li Z.S., Lu Y.P., Zhen R.G., Szczypka M., Thiele D.J., Rea P.A. A new pathway for vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae: YCF1 -catalyzed transport of bis(glutathionato)cadmium // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. - Y. 94.-P. 42—47.

66. Liang Zhu Y., Pilon-Smits E.A.H., Tarun A.S., Weber S.U., Jouanin L., Terry N. Overexpression of Glutathione Synthetase in Indian Mustard Enhances Cadmium Accumulation and Tolerance // Plant Physiol. 1999. V. 121.-P. 1169—1177.

67. Li Y., Dhankher O.P., Carreira L., Lee D., Chen A., Schroeder J.I., Balish R.S.,

68. Mattison P.L. Metal biosorbents / In P. L. Mattison (ed.) Bioremediation of metals // Cognis, Santa Rosa, Calif. 1992.

69. May M.J., Leaver C.J. Arabidopsis thaliana gamma-glutamylcysteine synthetase is structurally unrelated to mammalian, yeast, and Escherichia coli homologs //Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - V. 91. - P. 10059—10063.

70. May M.J., Vernoux Т., Sanchez-Fernandez R., Van Montagu M., Inze D. Evidence for posttranscriptional activation of gamma-glutamylcysteine synthetase during plant stress responses // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - P. 12049—12054.

71. May M.J., Vernoux Т., Leaver C., Van Montague M., Inze D. Glutathione homeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant development // J. Exp. Bot. 1998. - V. 49. - P. 649-667.

72. Mazen A.M. A., El Maghraby O.M.O. Accumulation of cadmium, lead and strontium, and a role of calcium oxalate in water jacinth tolerance // Biol. Plant. 1997/98. - V. 40. - P. 411—417.

73. Mazess R., Barden H. Bone density in premenopausal woman; effect of age, dietary intake, physical activity, smoking and birth control pills // American Journal of Clinical Nutrition. 1991. - V. 53. - P. 132-142.

74. McGrath S.P., Zhao F.J., Lombi E. Phytoremediation of metals, metalloids, and radionuclides // Adv. Agron. 2002. - V. 75. - P. 1-56.

75. McGrath S.P., Lombi E., Gray C.W., Caille N., Dunham S.J., Zhao F.J. Field evaluation of Cd and Zn phytoextraction potential by the hyperaccumulators Thlaspi caerulescens and Arabidopsis halleri // Environmental Pollution. 2006. - V. 141.-P. 115-125.

76. Meagher R.B. Overexpression of phytochelatin synthase in Arabidopsis leads to enhanced arsenic tolerance and cadmium hypersensitivity // Plant and Cell Physiology. 2004. - V. 45. - P. 1787 - 1797.

77. Meagher R.B., Heaton A.C.P. Strategies for the engineered phytoremediation of toxic element pollution: Mercury and arsenic // J: Ind. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 32. - P. 502-513.

78. Mejare M., Bulow L. Metal-binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals // Trends Biotechnol. -2001.-V. 19.-P. 67-73.

79. Memon AR, Aktoprakligil D, Ozdemir A, ve Vertii A (2000) Heavy metal accumulation and detoxification mechanisms in plants. Turk J Bot 25:111— 121

80. Memon A.R., Schroder P. Implications of metal accumulation mechanisms to phytoremediation // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2009. - V. 16, N2.-P. 162-175.

81. Meister A, Anderson ME (1983) Glutathione. Annu Rev Biochem 52:711-760

82. Meuwly P., Thibault P., Schwan A.L., Rauser W.E. Three families of thiol peptides are induced by cadmium in maize // Plant J. 1995. - V. 7. - P. 391—400.

83. Meuwly P., Thibault P., Rauser W.E. gamma-Glutamylcysteinylglutamic acid~a new homologue of glutathione in maize seedlings exposed to cadmium. // FEBS Lett. 1993. - V. 336. - P. 472—476.

84. Milner M J., Leon V. Kochian Investigating Heavy-metal Hyperaccumulation using Thlaspi caerulescens as a Model System // Annals of Botany.-2008.-V. 102,N 1.-P. 3-13.

85. Mulligan C.N., Yong R.N., Gibbs B.F. Remediation technologies for metal-contaminated soils and groundwater: an evaluation. Eng. Geol. 2001. -V. 60.-P. 193-207.

86. Nagata Т., Nakamura A., Akizawa Т., Pan-Hou H. Genetic engineering of transgenic tobacco for enhanced uptake and bioaccumulation of mercury II Biol. Pharm. Bull. 2009. - V. 32, N 9. - P. 1491-1495.

87. Nishizono H., Ichikawa H., Suzuki S., Ishii F. // Plant Soil. 1987. -V. 101.-P. 15—20.

88. Nriagu J.О., Pacyna J.M. Quantitative assessment of worldwide contamination of air, water and soils by trace metals // Nature. 1988. - V. 333. -P. 134-139.

89. Ortiz D.F., Kreppel L., Speiser D.M., Scheel G., McDonald G., Ow D.W. Heavy metal tolerance in the fission yeast requires an ATP-binding cassette-type vacuolar membrane transporter // EMBO J. 1992. - V. 11. - P. 3491—3499.

90. Ortiz D.F., Ruscitti Т., McCue K.F., Ow D.W. Transport of metal-binding peptides by HMT1, a fission yeast ABC-type vacuolar membrane protein // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 4721—4728.

91. Oven M., Page J.E., Zenk M.H., Kutchan T.M. Molecular characterization of the homo-phytochelatin synthase of soybean Glycine max. Relation to phytochelatin synthase // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 47474754.

92. Padmavathiamma PK, Li LY (2007) Phytoremediation technology: hyper accumulation of metals in plants. Water Air Soil Pollut 184:105-126

93. Pollard A.J., Powell K.D., Harper F.A., Smith J.A.C. The genetic basis of metal hyperaccumulation in plants // Crit. Rev. Plant Sci. 2002. - V. 21. -P. 539-566.

94. Pilon-Smits E.A.H. Phytoremediation.// Ann. Rev. Plant Biol. 2005. -V. 56.-P. 15-39.

95. Rai U.N., Tripathi R.D., Gupta M., Chandra P. Induction of phytochelatins in Hydrilla verticillata (l.f.) royle under cadmium stress // J. Environ. Sci. Health. 1996. - V. 30. - P. 2007—2026.

96. Rauser W.E. Compartmental Efflux Analysis and Removal of Extracellular Cadmium from Roots // Plant physiol. 1987. - V. 51. - P. 171— 175.

97. Rauser W.E. Phytochelatins // Annu. Rev. Biochem. 1990. - V.59. -P. 61-86.

98. Rauser W.E., Schupp R., Rennenberg H. Cysteine, gamma-Glutamylcysteine, and Glutathione Levels in Maize Seedlings : Distribution and Translocation in Normal and Cadmium-Exposed Plants // Plant Physiol. 1991. -Vol. 97. - P. 128—138.

99. Rauser W.E. Phytochelatins and related peptides. Structure, biosynthesis, and function // Plant Physiol. 1995. - V. 109. - P. 1141—1149.

100. Rauser W.E., Meuwly P. Retention of cadmium in roots of maize seedlings. Role of complexation by phytochelatins and related thiol peptides. // Plant Physiol. 1995. - V. 109. - P. 195—202.

101. Rauser W. E. Structure and function of metal chelators produced by plants: the case for organic acids, amino acids, phytin, and metallothioneins. // Cell Biochem. Biophys. 1999. - V. 31. - P. 19—48.

102. Reese R.N., Wagner G.J. Properties of tobacco (Nicotiana tabacum) cadmium-binding peptide(s). Unique non-metallothionein cadmium ligands. // Biochem. J. 1987. - V. 241. - P. 641—647.

103. Reese R.N., White C.A., Winge D.R. Cadmium-Sulfide Crystallites in Cd-(gammaEC)(n)G Peptide Complexes from Tomato // Plant Physiol. 1992. -V. 98. - P. 225—229.

104. Reeves R.D. The hyperaccumulation of nickel by serpentine plants. 1992. P. 253-277. / In Baker A.J.M. et al. (ed.). Th e vegetation of Ultramafi с (Serpentine) soils. Intercept Ltd., Andover, Hampshire, UK.

105. Ritter J.A., Bibler J.P. Removal of mercury from waste water: large scale performance of an ion exchange process // Water Sci. Technol. 1992. V. 25.-P. 165-172.

106. Robinson N.J., Tommey A.M., Kuske C., Jackson P.J. Plant metallothioneins // Biochem. J. 1993. - V. 295. - P. 1—10.

107. Robinson N.J., Wilson J.R., Turner J.S., Fordham-Skelton A.P., Groom Q.J. // Plant Root-From Cells to Systems / Ed: H.M. Anderson et al. Kluwer Academic Publishers. Netherlands. 1997. - P. 117—130.

108. Robinson В., Fernandez J-E., Madejon Т., Murillo J.M., Green S., Clothier B. Phytoextraction: an assessment of biogeochemical and economic viability // Plant Soil. 2003. - V. 249. - P. 117-125.

109. Ruegsegger A., Schmutz D., Brunold C. Regulation of Glutathione Synthesis by Cadmium in Pisum sativum L // Plant Physiol. 1990. - V. 93. - P. 1579—1584.

110. Ruegsegger A., Brunold C. Effect of Cadmium on gamma-Glutamylcysteine Synthesis in Maize Seedlings. // Plant Physiol. 1992. - V. 99. -P. 428—433.

111. Ryan J.A., Pahren H.R., Lucas J.B. Controlling cadmium in the human food chain: a review and rationale based on health effects // Environmental Research. 1982. - V. 28. - P. 251-302.

112. Salt D.E., Blaylok M., Nanda Kumar P.B.A., Dushenkov V., Ensley B.D., Chet I., et al. Phytoremediation: a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants // Biotechnology. 1995. - V. 13. - P. 468^474.

113. Salt D.E., Rauser W.E. MgATP-Dependent Transport of Phytochelatins Across the Tonoplast of Oat Roots. // Plant Physiol. 1995. - V. 107.-P. 1293—1301.

114. Salt D.E., Wagner G.J. Cadmium transport across tonoplast of vesicles from oat roots. Evidence for a Cd2+/H+ antiport activity. // J. Biol. Chem. -1993. V. 268. - P. 12297—12302.

115. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants. // Environ. Exp. Bot. 1999. - V. 41. - P. 105—130.

116. Scheller H.V., Huang В., Hatch E., Goldssbrough P.B. Phytochelatin Synthesis and Glutathione Levels in Response to Heavy Metals in Tomato Cells. //Plant Physiol. 1987. - V. 85. - P. 1031—1035.

117. Semane В., Cuypers A., Smeets K., Van Belleghem F., Horemans N., Schat H., Vangronsveld J. Cadmium responses in Arabidopsis thaliana:glutathione metabolism and antioxidative defence system // Physiologia Plantarum. 2007. - V. 129.-P. 519-528.

118. Speiser D.M., Abrahamson S.L., Banuelos G., Ow D.W. Brassica juncea produces a phytochelatin-cadmium-sulfide complex. // Plant Physiol. -1992.-V. 99.-P. 817—821.

119. Speiser D.M., Ortiz D.F., Kreppel L., Scheel G., McDonald G., Ow D.W. Heavy metal tolerance in the fission yeast requires an ATP-binding cassette-type vacuolar membrane transporter // Mol. Cell Biol. 1992. - V. 12. -P. 5301—5310.

120. Stafford D.W., Bieber D. Concentration of DNA solutions by extraction with 2-butanol // Biochim Biophys Acta. 1975. - V. 378, N 1. - P. 18-21.

121. Stearns J.C., Shah S., Glick B.R. Increasing plant tolerance to metals in the environment / In: Willey N (ed) Methods in biotechnology. Phytoremediation. Methods and review // Humana, New Jersey. 2007. - V. 23. -P. 15-26.

122. Steffens J.C., Hunt D.F., Williams B.J. Accumulation of non-protein metal binding polypeptides (-glutamyl-cysteinyl)n-glycine in selected cadmium-resistant tomato cells. // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 13879—13882.

123. Tennstedt P., Peisker D., Bottcher C., Trampczynska A., Clemens S. Phytochelatin Synthesis Is Essential for the Detoxification of Excess Zinc and Contributes Significantly to the Accumulation of Zinc // Plant Physiol. 2009. -V. 149.-P. 938-948.

124. Tong Y.P., Kneer R., Zhu Y.G. Vacuolar compartmentalization: a second generation approach to engineering plants for phytoremediation // Trends Plant Sci. 2004. - V. 9. - P. 7-9.

125. Vassilev A., Schwitzguebel J-P., Thewys Т., van der Lelie D., Vangronsveld J. The use of plants for remediation of metal contaminated soils // ScientificWorldJournal. 2004. - V. 4. - P. 9-34.

126. Vassilev A., Vangronsveld J., Yordanov I. Cadmium phytoextraction: present state, biological backgrounds and research needs // Bulg. J. Plant Physiol. 2002. - V. 28. - P.68-95.

127. Vatamaniuk O.K., Mari S., Lu Y.P., Rea P.A. AtPCSI, a phytochelatin synthase from Arabidopsis: isolation and in vitro reconstitution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 6. - P. 7110-7115.

128. Vatamaniuk O.K., Mari S., Lu Y.P., Rea P.A. Mechanism of heavy metal ion activation of phytochelatin (PC) synthase // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275.-P. 31451-31459.

129. Vatamaniuk O.K., Bucher E.A., Ward J.T., Rea P.A. A new pathway for heavy metal detoxification in animals: phytochelatin synthase is required for cadmium tolerance in Caenorhabditis elegans // J. Biol. Chem. 2001. — V. 276. -P. 20817-20820.

130. Vestergaard M., Matsumoto S., Nishikori S., Shiraki K., Hirata K., Takagi M. Chelation of Cadmium Ions by Phytochelatin Synthase: Role of the Cystein-rich C-Terminal // analytical sciences. 2008. - V. 24. - P. 277-281.

131. Vogeli-Lange R., Wagner G.J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves: implication of a transport function for cadmiumbinding peptides // Plant Physiol. 1990. - V. 92. - P. 1086-1093.

132. Wagner G.J. Accumulation of cadmium in crop plants and its consequences to human health // Adv. Agron. 1993. - V. 51. - P. 173-212.

133. Wei S., Zhou Q. Trace elements in agro-ecosystems / In: Prasad MNV (ed) Trace elements as contaminants and nutrients—consequences in ecosystems and human health // Wiley, New Jersey, USA. 2008. - P. 55-80.