Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга крыс в отногенезе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активность основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга крыс в отногенезе"

¡=¡5 о»

2 7 т «

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

. На правах рукописи

ЩЕТИНИНА Наталья Викторовна

АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ КАРБОКСИПЕПТИДАЗ В ТКАНЯХ И ОТДЕЛАХ МОЗГА КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена на кафедре химии Пензенского государственного педагогического университета имени В.Г. Белинского

Научный руководитель:

кандидат биологических, наук, доцент М.Т. Генгин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.В. Арутюнян кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Т. А. Гойло

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Защита состоится " /О" -ЫЛОМ^Я 199 У года в ^Су часов на заседании диссертационного совета К 063.57.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского университета.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Коваленко Р.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Индивидуальное развитие организма, его биохимические механизмы, молекулярные механизмы дифференциации и пролиферации тканей являются одной из наиболее интересных проблем современной биологии. Особый интерес представляет изучение молекулярных механизмов развития нервной и гуморальной систем. Важная роль в функционировании этих систем принадлежит нейропептидам, которые выполняют функции нейромедиаторов, нейромодуляторов и гормонов. Нейропептиды вовлекаются в регуляцию практически всех физиологических и патологических процессов, протекающих в организме, в том числе в регуляцию пролиферации нервной ткани, регуляцию половой функции и полового поведения. Уровень биологически активных пептидов во многом определяется основными карбоксипептидазами (КП) - пептид-гидролазами, отщепляющими остатки аргинина и лизина с С-конца пептидов. Основные КП (КПН (КФ 3.4.17.10) и КГШ (КФ 3.4.17.3)) вовлекаются в конечную стацию образования биологически активных пептидов из неактивных предшественников, а некоторые - и в начальную стадию инактивации некоторых биологически активных пептидов. Лизосомальная КПВ (ЛКПВ, КФ 3.4.18.1) участвует во внутриклеточном расщеплении белков. Функции неравно обнаруженной фешшметилсульфонилфторид-ингибируемой КП (ФМСФ-ингибируемой КП) не изучены.

Таким образом, КПН, ЮПИ, ЛКПВ и ФМСФ-ингибируемая КП имеют сходную субстратную специфичность, но отличаются по субклеточной локализации и биологической роли. Представляет интерес сравнительный анализ возрастных изменений активности исследуемых ферментов, который может способствовать выяснению роли протеолитических ферментов в ме-<анизмах функционирования нейропептидов и их роли в онтогенезе, а также изучению биологической роли ФМСФ-ингибируемой КП.

Целью настоящей работы был сравнительный анализ онтогенетических «менений и половых отличий активности основных КП (ФМСФ-•шгибируемой КП, КПН, КПК и ЛКПВ) в различных тканях и отделах моз-ча крыс. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследование тканевого и регионального распределения активности РМСФ-ингибируемой КП.

2. Сравнение тканевого и регионального распределения активности основных КП.

3. Изучение возрастных изменений активности основных КП у самцов срыс.

4. Сравнение распределения активности основных КП у самцов и самок в период полового созревания.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено тканевое и региональное распределение ФМСФ-ингибируемой КП у взрослых животных разных видов: крысы, кошки и ежа европейского (ЕШКАСЕШ ЕТЛЮРАЕШ), а также онтогенетические' изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП, ЛКПВ и КПИ. Показано, что активность основных карбоксипептидаз в мозге и тканях животных зависит от возраста. Обнаружены половые отличия активности КПН, ЛКПВ и ФМСФ-ингибируемой КП. Полученные в работе данные представляют интерес для понимания развития и функционирования системы нейропептидов и ферментов их обмена в постнатальный период жизни животных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности тканевого и регионального распределения ФМСФ-ингибируемой КП у взрослых крысы, кошки и ежа европейского.

2. Сравнение тканевого и регионального распределения активности КПН, ЛКПВ и ФМСФ-ингибируемой КП у взрослых крыс самцов.

3. Особенности возрастных изменений активности КПН, ЛКПВ, ФМСФ-ингибируемой КП и КПИ у крыс.

4. Особенности изменения активности основных КП у самцов и самок крыс в период полового созревания.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международной зимней школе молодых ученых по нейробиологии "Современные достижения в изучении метаболизма мозга" (Санкт-Петербург, 1995), 8 Международном Конгрессе Чешского и Словацкого Нейрохимического Общества (Мартин, Словакия, 1996), итоговых научных конференциях ПГПУ (1995, 1996).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, вывода. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами и 14 рисунками. Список литературы содержит 260 наименований на русском и иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили головной мозг и периферические ткани крыс (самцов и самок) в возрасте 0, 10, 20, 30, 60, 90, 120 суток после рождения, половозрелых котов весом 2,5-3,5 кг и половозрелых ежей.

Активность ферментов определяли флюориметрическим методом (Flicker, Snyder, 1983): КПН - с использованием гуанидиноэтилмеркаптоян-гарной кислоты (ГЭМЯК) и дансил-фен-ала-арг в качестве субстрата; ЛКПВ - с использованием ЭДТА и дитиотреигола в присутствии ГЭМЯК (Lipperheide, Otto, 1986), субстрат - дансил-фен-ала-арг; ФМСФ-ингибируемой КП - с использованием ФМСФ и субстрата дансил-фен-лей-арг (Вернигора и соавт., 1995).

Активность KEIN определяли с использованием гиппурил-арг в качестве субстрата (Erdos и соавт., 1964). Концентрацию белка определяли ме-годом Лоури.

Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) ("STSC Inc.", США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Силу влияния (г)2) факторов на результативные признаки рассчигьюали только в случае достоверности критерия Фишера методом Плохинского. Принадлежность возрастных подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с томощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) ("STSC Inc.", США)).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 .Сравнение регионального и тканевого распределения активности основных КП у самцов крыс.

Максимальная активность КПН обнаруживается в гипофизе (табл. I). В отделах мозга активность КПН примерно на порядок ниже, чем в гипофизе, ^иболее высокая активность фермента в мозге обнаруживается в четверохолмии и гипоталамусе. В семенниках и надпочечниках активность КПН соответственно в 1,5-2 и в 2-3 раза меньше, чем в отделах мозга; в почках, течени и селезенке наблюдаются лишь следы активности фермента. Наибольшая активность КПН обнаруживается в отделах мозга и тканях с ¡ысоким уровнем нейропептидов, и не обнаруживается в периферических чсанях, не связанных с биосинтезом нейропептидов, что может служить юдтверждением вовлечения КПН в процессинг нейропептидов.

Наибольшая активность ЛКПВ обнаружена в почках (табл. 1). Ткани и »тделы мозга по убыванию активности фермента можно расположить в слегшем порядке: надпочечники, селезенка, печень, семенники, большие по-[ушария, гипофиз, гиппокамп, обонятельные луковицы, гипоталамус, триатум, мозжечок, четверохолмие. Полученные результаты согласуются с штенсивностью обмена белка в соответствующих тканях (Палладии и со-J3T., 1972).

Активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена во всех отделах мозга и в большинстве тканей крыс (табл. I). В почках взрослых крыс активность фермента находится на пределе чувствительности метода определения. Наибольшая активность фермента отмечается в надпочечниках, примерно на 40% ниже - в гипофизе, в печени и селезенке ниже, чем в гипофизе примерно на 65-70%. В семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП примерно в 2,5 раза ниже, чем в надпочечниках. В отделах мозга активность фермента примерно в 2-3 раза ниже, чем в гипофизе. Наиболее высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП в мозге обнаруживается в обонятельных луковицах, наиболее низкая - в четверохолмии и гиппокампе.

Таблица 1. Активность основных карбоксипептидаз в мозге и других органах крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М+т, п=5-г6)

Орган, отдел мозга ФМСФ-ин- КПН Лизосомаль

гибируемая наяКПВ

КП

Mim Mim Mim

Гипофиз 0,52+0,02 2,1810,19 0,0710,02

Надпочечники 0,86±0,05 0,1010,01 0,1510,01

Почки следы следы 0,2210,03

Печень 0,1б±0,01 следы 0,1010,01

Селезёнка 0,19±0,02 следы 0,1610,01

Семенники 0,3510,02 0,15+0,01 0,0910,01

Отделы мозга:

Обонятельные луковицы 0,25±0,02 0,28+0,02 0,0710,00

Четверохолмие 0,17±0,01 0,32+0,02 0,0310,00

Мозжечок 0,21+0,01 0,2310,01 0,0510,01

Гипоталамус 0,23±0,01 0,3010,01 0,0510,01

Гиппокамп 0,17+0,02 0,27+0,01 0,0710,01

Стриатум 0,22±0,02 0,2310,02 0,05+0,01

Большие полушария 0,24±0,01 0,2710,01 0,0910,01

Высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП наблюдается не только в отделах мозга и тканях с высокой активностью КПН, но в тех тканях, в которых обнаруживается активность ЛКПВ (печень, селезенка, семенники). Вероятно, в этих тканях ФМСФ-ингабируемая КП может принимать участие не только в процессинге нейропептидов, но и в инактивации биологически активных пептидов, в процессах катаболизма белка. В гипофизе активность фермента значительно выше, чем в отделах центральной нервной системы. Поскольку в гипофизе синтезируются пептидные гормоны, вероятно, ФМСФ-ингибируемая КП может участвовать в процессинге предшественников этих гормонов.

Исходя из сравнения распределения ФМСФ-ингибируемой КП с таковой КПН и ЛКПВ, можно предположить вовлечение ФМСФ-ингибируемой КП в процессинг нейропептидов, и, возможно, в катаболизм белков.

У разных видов животных (кошка, белая крыса, еж европейский) распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП в головном мозге и периферических тканях сходно, но уровень активности фермента у них различен.

Наибольшая активность ФМСФ-ингибируемой КП у всех видов наблюдается в гипофизе, надпочечниках, семенниках. Активность фермента в гипофизе кошки примерно в 2 раза выше, чем у ежа и почти в 4 раза, чем у крысы. В семенниках активность фермента у кошки выше примерно в 3,5 раза, чем у ежа, и в 10 раз, чем у крыш. В надпочечниках активность ФМСФ-ингибируемой КП у кошки только на 25-30% выше, чем у других животных, причем активность фермента у крысы выше, чем у ежа европейского. Во всех отделах мозга и тканях активность фермента у кошки выше, чем у крысы и ежа.

В периферических псанях изучаемых видов животных активность ФМСФ-ингибируемой КП выше, чем в отделах мозга. Колебания активности ФМСФ-ингибируемой КП у крысы менее выражены, чем у ежа европейского или кошки.

Активность фермента в белом и сером веществе спинного мозга кошки примерно в 1,5 раза ниже, чем в белом и сером веществе головного мозга.

2.Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга самцов крыс разного возраста.

Во вссх исследованных отделах мозга и тканях активность КПН изменяется с возрастом (достоверность критерия Фишера р < 0,01, в печени, селезенке и семенниках р < 0,05). В обонятельных луковицах, четверохолмии, мозжечке, гиппокампе, стриатуме и надпочечниках (рис. 1) активность КПН

ГИПОФИЗ

е" 2 § * 1

лД

О 10

20 30 60 00 120 возраст, сут

ГИПОТАЛАМУС

10 20 30 60 возраст, сут

90 120

0

О

0,5 0,4 0,3 0,2 0.1 О

СТРИАТУМ

10 20 30 60 90 120 возраст, сут

ЧЕТВЕРОХОЛМИЕ

10 20 30 60 90 120 возраст, сут

О

ГИППОКАМП

10 20 30 60 90 120 >озраст,сут

БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ

0,6

о

0,4

ю

£ 0,2

0

10 20 30 60 90 120 возраст, сут

О

МОЗЖЕЧОК

О 10 20 30 60 80 120 возрэгт, сут

ОБОНЯТЕЛЬНЫЕ ЛУКОВИЦЫ 0,8

I 0,4 * 0,2 О

О 10 20 30 60 90 120 возраст, сут

Продолжение на стр. 7

I *

НАДПОЧЕЧНИКИ

2,5 2 1,5 1

0,5 О

й С 2

«С. JC ,1Г X

10 20 30 60 всораст, сут

30 120

СЕМЕННИКИ

я 1,5 х

i 1 1

$ 3 л о

I л °'5

LiLflJl

О 10 20 30 во 90 120 возраст, сут

3

ПОЧКИ

0.6 0,4

10 20 30 60 90 120 возраст, сут

ПЕЧЕНЬ

0,4 0,2

jjjlfllj

О 10 20 30 60 90 120 возраст, сут

0.6

О

О

л 0,5

| Я 0,4

I 1 0,3

а? 0,2

I 3 0,1

х О

СЕЛЕЗЕНКА

Л

iflilMI ilfflil

ii

О 10 20 30 60 90 120 возраст, сут

i з

1 з

"з и

KilN, СЫВОРОТКА

/

10 20 30 60 SO 120 возраст, сут

О

t^i КПН \ | ФМСФ-ингибируеная КП I-1 ЛКПВ ЕЗ KQN

Рис. 1. Активность основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга гамцов крыс разного возраста (нмоль дансил-фен-ала (в случае КПН и ЛКПВ), дансил-фен-лей (в случае ФМСФ-ингибируемой КП) и аргинина (в :лучае ЮГЩ), образовавшихся за 1 мин инкубации на 1 мг белка, М±а, 1=5*6).

Примечание: в гипофизе и стриатуме на РО активность ферментов не эпределяли.

повышалась с постнатального дня (Р) 0 к РЗО, затем несколько снижалась к Р90 и достигала максимального значения к Р120. В больших полушариях, гипоталамусе, почках, селезенке активность фермента плавно повышалась от Р0 к Р120. В семенниках новорожденных крыс наблюдалась достаточно высокая активность КПН, которая снижалась к Р10, затем повышалась и к РЗО была максимальной. Во всех изучаемых отделах и тканях, за исключением печени и семенников максимальная активность КПН наблюдалась у 120-дневных животных, а минимальная - у новорожденных.

Поскольку активность фермента в большинстве случаев с возрастом повышается, что согласуется с литературными данными об увеличении содержания ряда нейропептидов (Вауоп и соавт., 1979) и преобладании зрелых форм нейропептидов над их предшественниками в онтогенезе (McMillian и соавт., 1993), можно предположить, что возрастные изменения активности КПН связаны с изменением уровня нейропептидов.

Более выраженное влияние возраста на активность КПН в мозге по сравнению с периферическими тканями, может быть обусловлено тем, что КПН вовлекается в процессинг нейропептидов преимущественно в мозге. В периферических тканях сходную функцию могут выполнять другие ферменты, например, ФМСФ-ингибируемая КП,

Активность ЛКПВ изменяется у животных в процессе взросления (достоверность критерия Фишера р < 0,01, в почках - р < 0,05). Исключение составляют надпочечники и селезенка, в которых наблюдается высокая активность фермента, не зависящая от возраста.

На РО в мозге крыс, за исключением гипоталамуса, активность ЛКПВ примерно в 4-6 раз ниже, чем в периферических тканях (рис. 1). К Р10 она снижается и до Р60 остается примерно на одном уровне. К Р60 активность ЛКПВ возрастает и достигает максимального значения на Р90. В гипоталамусе на Р0 активность фермента ниже чувствительности метода определения, сохраняется на том же уровне до Р90 и повышается к Р120. В гипофизе активность фермента остается примерно на одном уровне с Р10 по Р90 и увеличивается к Р120. Самая высокая активность ЛКПВ в почках и семенниках наблюдается на Р0, плавно снижается к Р20 и почти не изменяется до Р120. В печени активность ЛКПВ на Р0 наиболее низкая, небольшое повышение ее активности по сравнению с исходной обнаруживается на РЗО и Р120. В промежутках от Р0 к Р20 и от Р60 к Р120 активность фермента изменяется незначительно.

Наибольшая активность ЛКПВ наблюдается у новорожденных крыс, у

взрослых, животных активность фермента постепенно снижается до минимального значения. Возможно, высокая активность фермента связана с интенсивным синтезом и распадом белка, скорость которого значительно выше у пренатальных и неонаталъных животных (Палладии и соавт., 1972, Lajtha и соавт., 1979, Блок и соавт., 1983). Некоторые авторы полагают, что повышенный уровень лизосомальных ферментов у новорожденных животных носит адаптивный характер, связанный с резким изменением внешней среды (переход к внеутробной жизни, смена характера питания - от плацентарного к питанию молоком матери) (Покровский, Тутельян, 1976).

Установлено, что активность ФМСФ-ингибируемой КП изменяется с возрастом животных во всех изучаемых отделах и тканях самцов крыс (достоверность критерия Фишера р < 0,001, в гипофизе и селезенке р < 0,05).

В обонятельных луковицах, мозжечке, гиппокампе, надпочечниках на Р0 обнаруживается наибольшая активность фермента, которая снижается к Р60-Р90 и затем вновь повышается к Р120 (рис. 1). Активность ФМСФ-ингибируемой КП в гипофизе с Р10 до Р20 почти не изменяется, снижается на РЗО и вновь повышается к Р120, достигая максимального значения. В почках, печени и семенниках у новорожденных крыс обнаруживается высокая активность фермента, которая затем снижается в почках и печени к Р10, в семенниках - к РЗО, далее не изменяется и остается примерно на одном уровне до Р120, в селезенке динамика изменений активности фермента сходна с таковой в мозге. На Р90 во всех изучаемых отделах мозга и тканях наблюдается минимальная активность фермента.

В четверохолмии, гипоталамусе, стриатуме, больших полушариях динамика изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП и КПН во многом сходна. В этих отделах наблюдается повышение- уровня активности фермента от Р0 к Р20, затем некоторое снижение к Р90 и повышение до максимального уровня к Р120. Исходя из этого, можно предположить, что ФМСФ-ингибируемая КП, как и КПН, вовлекается в процессинг предшественников нейропептидов.

Отличия динамики изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП в мозге от таковой в периферических тканях могут быть связаны участием фермента в мозге и в периферических тканях разных процессах, например, в мозге вовлекаться в процессинг, а в тканях - в деградацию нейропептидов, или участвовать в мозге в обмене одних пептидов, а в тканях - других. Возможно также существование нескольких форм фермента, различающихся тканевой и региональной локализацией или разных ферментов с близкими физико-химическими свойствами. Высказанное предположение подтверж-

дается сходством динамики изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП и ЛКПВ в периферических тканях, в которых активность ферментов плавно снижается с возрастом.

- Активность КГМ зависит от возраста (достоверность критерия Фишера р < 0,001). С Р0 обнаруживалось небольшое повышение активности КГШ к РЗО (рис. 1). К Р90-Р120 активность фермента плавно снижалась.

З.Изучение активности основных карбоксипептидаз в мозге и тканях самцов и самок крыс в период полового созревания.

Обнаружены отличия мевду самками и самцами по активности КПН, ЛКПВ, ФМСФ-ингибируемой КП в разные периоды онтогенеза (рис. 2).

В период, предшествующий половому созреванию, на РЗО активность КПН в мозге и периферических тканях самок достоверно отличаются от активности фермента у самцов в гипоталамусе, больших полушариях и обонятельных луковицах (рис. 2). К Р60 отличия сохраняются в гипоталамусе и больших полушариях, и обнаруживаются, кроме того, в гипофизе, почках, печени, селезенке и половых железах. Начиная с Р90 различий между самками и самцами становится меньше. Отличия сохраняются только в печени, селезенке, половых железах и появляются в гиппокампе. К Р120 отличия в активности КПН у самок и самцов в почках и половых железах сохраняются. Таким образом, наибольшие различия в активности КПН между самками и самцами наблюдаются непосредственно в период полового созревания.

Активность ЛКПВ у самок и самцов, также как и в случае КПН, в большей степени различается на Р60 (рис. 2). На РЗО различия между самками и самцами отмечаются только мозжечке, печени, селезенке и половых железах. К Р60 достоверные отличия у самок и самцов обнаруживаются во всех отделах мозга, гипофизе, печени и половых железах. На Р90 активность ЛКПВ в тканях и отделах мозга у самок и самцов различается в меньшей степени, отличия сохраняются лишь в надпочечниках, печени, селезенке и половых железах. У зрелых животных (Р120) вновь появляются достоверные отличия активности ЛКПВ между самками и самцами в гипофизе, четверохолмии, гиппокампе. Таким образом, максимальные половые отличия ЛКПВ выявляются в пубертатный период и у полностью зрелых крыс

На РЗО активность ФМСФ-ингибируемой КП самок достоверно отличается от таковой у самцов в гипофизе, обонятельных луковицах, почках и половых железах (рис. 2). К Р60 отличия активности фермента между

самками и самцами сохраняются в гипофизе, обонятельных луковицах, и обнаруживаются еще в гипоталамусе, стриатуме и гиппокампе. Наибольшие половые отличия в активности ФМСФ-ингибируемой КП появляются к окончанию полового созревания и у зрелых животных. На Р90 отличия активности ФМСФ-ингибируемой КП у самок и самцов обнаружены в гипофизе, обонятельных луковицах, четверохолмии, мозжечке, гиппокампе, больших полушариях, печени, селезенке и половых железах. На Р120 достоверные различия между самками и самцами выявлены в гипофизе, надпочечниках, половых железах и во всех отделах мозга. Наибольшие различия между самцами и самками по активности ФМСФ-ингибируемой КП проявляются у созревающих и полностью зрелых животных.

В период с РЗО по Р120 различий между самками и самцами в активности ЮГШ не обнаружено (рис. 2).

Активность изучаемых ферментов (КПН, ЛКПВ и ФМСФ- ингибируе-мой КП) у самок в период полового созревания меньше зависит от возраста, тем у самцов. Влияние возраста (достоверность критерия Фишера р < 0.05) за активность этих ферментов обнаружено лишь в некоторых отделах мозга а тканях. В случае КПН возрастные изменения активности у самок наблюдаются в гипоталамусе, гиппокампе, надпочечниках и половых железах. Активность ЛКПВ у самок в период полового созревания изменяется в ги-тофизе, обонятельных луковицах, надпочечниках и печени. Возрастные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП у самок в этот период шявлены только в гипоталамусе, мозжечке и селезенке. Активность КПЫ в :ыворотке крови самок в период полового созревания от возраста не ¡ависит.

Изменения активности КПН и ФМСФ-ингибируемой КП в период по-ювого созревания у самцов и самок сходны, тогда как активность ЛКПВ в 1ТОТ период у самцов и самок изменяется по-разному (рис. I и 2). Возможно >то связано с различиями биологических функций этих ферментов (участие I катаболизме белка, процессинге нейропептидов и пептидных гормонов)

Пол животных оказывает меньшее влияние на активность изучаемых зерментов, чем возраст. Достоверное влияние пола на активность КПН, 1КПВ и ФМСФ-ингибируемой КП обнаружено в половых железах (р < |,001) ив некоторых периферических тканях.

Установлено, что яичники продуцируют многие нейропептиды (Хип,

4

а з

5 2

ю * * 1 о

ГИПОФИЗ

¡.Л, tn.Ll.lyi

30

60 80 120 возраст, сут

0,6 0,4 0,2 О

ГИПОТАЛАМУС

ШшА

30 60 90 возраст, сут

120

0,4 \ 0,3 ^ 0,2 * 0,1 О

СТРИАТУМ

30

60 80 возраст, сут

0,6 0,4 0,2 О

ЧЕТВЕРОХОЛМИЕ

ккМ,

30

60 во возраст, сут

120

0.6 0,4

0,2

ГИППОКАМП

60 90 возраст, сут

БОЛЬШИЕ ПОЛУШАРИЯ

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

30

60 80 возраст, сут

120

0 0,5 | 8 <>•*

1 I 0,3

е® о,2 1 * 0,1 1 0

МОЗЖЕЧОК

30

60 90 возраст,еут

120

ОБОНЯТЕЛЬНЫЕ ЛУКОВИЦЫ 0,5 0,4 0,3

к °'2 5 0,1

— § 10,4 ** * А "й[

МММ 1ч11ММ1;

30

60 90 возраст, сут

Продолжение на стр. 13

I 1,

2 1,5 1

0,5 0

НАДПОЧЕЧНИКИ

х. ас

„1, , ВТ

30

60 90 возраст,сут

120

ПОЧКИ

0,25 г 0,2 0,15 0,1 0,05 О

30 60 90 возраст, сут

120

1 0,6 I Я 0,4

I I 03

0,2 1 * 0,1 1 О

ПЕЧЕНЬ

А1

30

во 30

возраст, сут

120

0,4 I 0,3

I 0.2

4 0,1

СЕЛЕЗЕНКА

Г1 П » I * 1Л1 • I

X

а 1 , т

эо

60 90 возраст, сут

120

кпн ФМСФ-ингибируемая КП

лкпв езз кпи

'ис. 2. Активность основжх карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга амок крыс в период полового созревания (нмоль дансил-фен-ала (в случае СПН и ЛКПВ), дансил-фен-лей (в случае ФМСФ-ингибируемой КП) и ар-инина (в случае КПЫ), образовавшихся за 1 мин инкубации на 1 мг белка, 4±сг, п=5-гб, звездочками показаны отличия от самцов, * - р<0,05, ** -<0,01,***- р<0,001).

I

*

Флинт, 1987). Лгоосомальные ферменты принимают участие в циклической деструкции фолликулов на определенном этапе полового цикла самок (Покровский, Тутельян, 1976). Возможно, вовлекаясь в процессинг нейро-пептидов или деградацию белков, КПН, ФМСФ-ингибируемая КП и ЛКПВ могут участвовать в формировании половых различий.

Активность ФМСФ-ингибируемой КП более существенно зависит от пола животных и от взаимодействия пола и возраста, чем активность КПН и ЛКПВ. Возможно, ФМСФ-ингибируемая КП в большей степени, чем КПН вовлекается в обмен нейропептидов, регулирующих половую функцию.

Таким образом установлено, что активность КПН, ЛКПВ, ФМСФ-ингибируемой КП и КПЫ зависит от возраста. Изменения активности ферментов, выполняющих разные функции, (КПН и ЛКПВ) различны. Сходство динамики изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП и КПН может быть связано с вовлечением обоих ферментов в сходные процессы. Между самцами и самками в период полового развития обнаружены достоверные отличия по активности КПН, ЛКПВ и ФМСФ-ингибируемой КП. Полученные результаты позволяют предположить, что изучаемые ферменты играют важную роль в онтогенезе и половом созревании в частности.

ВЫВОДЫ

1. Наибольшая активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в надпочечниках, гипофизе и семенниках. Активность фермента в отделах мозга с высоким содержанием тел нейронов выше, чем в проводящих путях, но ниже, чем в периферических тканях. Региональное и тканевое распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП у животных разных видов сходно, но уровень активности у разных видов млекопитающих отличается. Региональное распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП в мозге крыс сходно с таковым для КПН и не совпадает с распределением ЛКПВ.

2. Активность ЛКПВ в периферических тканях примерно в 2-3 раза выше, чем в мозге. В мозге наиболее высокая активность ЛКПВ обнаружена в отделах с интенсивным обменом белка (большие полушария, обонятельные луковицы, мозжечок), что согласуется с представлением об участии ЛКПВ в деградации белка.

3. Обнаружено, что активность изучаемых ферментов в мозге и тканях

зависит от возраста животных. Активность КПН в мозге и тканях, как правило, повышалась с возрастом, при этом наименьшая активность КПН обнаружена на РО, наибольшая - на РЗО и PI 20. Динамика возрастных изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП в мозге коррелирует с динамикой изменений активности КПН, в тканях - с динамикой изменений ЛКПВ. Активность JOIN в сыворотке крови повышалась к Р20-Р30, а затем ■ снижалась* k PI 20.

4. Обнаружены половые отличия активности КПН, ЛКПВ и ФМСФ-янгибируемой КП,'у самок активность ферментов, как правило, выше, чем у :амцов. В случае КПК различий между самцами и самками не обнаружено. Наибольшие половые отличия КПН, ЛКПВ и ФМСФ-ингибируемой КП тблюдались преимущественно в период полового созревания.

5. Влияние возраста на активность КПН, ЛКПВ и ФМСФ-адгибируемой КП в мозге и тканях самцов более выражено, чем у самок. Динамика возрастных изменений активности ферментов у животных >азного пола в большинстве случаев совпадает.

6. Активность ФМСФ-ингибируемой КП у крыс в период полового юзревания более существенно зависит от взаимодействия пола и возраста, 1ем активность КПН, ЛКПВ и ЮЖ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин H.H., Щетинина Н.В. Ак-ивность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в ыворотке крови крыс с различной устойчивостью к эмоциональному трессу // Фгоиол. журн.- 1994.- 80, N 4.- С. 23-26.

2. Генгин М.Т., Вернигора А.Н., Никишин H.H., Щетинина Н.В. Ак-ивность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в ыворотке крови крыс в норме и при эмоциональном стрессе Н Укр. 'иохим. журн.- 1994.- 66, N 2.- С. 116-119.

3. Вернигора А.Н., Никишин H.H., Генгин М.Т., Щетинина Н.В. Ак-ивность растворимой и мембраносвязанной форм карбоксипептидазы Н в тделах головного мозга крыс при эмоциональном стрессе // Укр. иохим. журн.- 1995.- 67, N 1.- С. 52-56.

4. Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Исследования актив-ости основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипеп-

тидаз у крыс разного возраста// Биохимия.- 1996.- 61, N10.- С. 1848-1856.

5. Вернигора А.Н., Щетинина Н.В., Генгин М.Т. Активность PMSF-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях и отделах головного мозга ежа европейского (ERINACEUS EUROPAEUS) И Укр. биохим. ж.- 1996.- 68, N5.-С. 118-121.

6. Chtchetinina N.V. Enzymes of neuropeptide metabolism: a system with common regulation? // Тез. докл. международной зимней школы молодых ученых по нейробиологии "Современные достижения в изучении метаболизма мозга" (Санкт-Петербург, 1995).- Нейрохимия.- 1995.- 12,N 2.- С. 76.

7. Chtchetinina N., Vemigora A., Gengin М. Developmental changes of the basic carboxypeptidases in rat ¡1 Proc. 8-th Int. Congress Czech Slovak Neurochemical Society.- Slovakia, Martin, September 4-7,1996.- P.130.