Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АКТИВНОСТЬ, ЛОКАЛИЗАЦИЯ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ И ПРОДУКТИВНОСТИ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "АКТИВНОСТЬ, ЛОКАЛИЗАЦИЯ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ И ПРОДУКТИВНОСТИ"

с

АКАДЕМ №1 НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ ССР ИНСЯПУГ БОТАНИКИ им. Б. Л. КОМАРОВ А

На правах рукописи

ГАСАНОВА ГШЬИАРА ИЯТИМТ кыэы

УДК 677Л51.042

АКТИВНОСТЬ, ЛОКАЛИЗАЦИЯ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА АДЕКИЛАТиНКЛАЗЦ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦИ, ОТЛИЧАЩИХСЯ ПО адТОСИНТЕТИЧЕСНОЙ ФУНЩШ и продуктивное!«

03.00.12 - фкзиологнл растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на еоис панне ученой степени кандидата виологических наук

Баку - [909

Работа чыцолнана в лаборатории физиологии растений Научно-исследо вател ьс ко го Института Земледелия Госагропрома АэербаЛ- . дркансксй ССР.

Научный руко водитель:

доктор биологических наук, академик АН Дэерб.ССР Д. А.Алиев

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук И.М.Магомедов

кандидат биологических наук Н.М.Гудиев

Ведущая организация: Ииститут почвоведения и фотосинтеза АН СССР.

Защита состоится " ^ п а^у**^ 1909 Р, в " " часов на .заседании Специализированного совета К, 004.12,01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте ботаники ни.В.Л,Комарова АН Азербайджанской ССР по адресу: 370073, Баку, Натамд&ртекое шоссе, 40. :

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке .Института ботаники им.В.Л.Комарова АН АэерС.ССР.

Автореферат разослан " Л*<??/л 19Ш г.

Ученый секретарь

ОВДАИ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность■проблемы. В последнее время особое значение приобрели вопросы регуляции метаболизма фстосмнтезирукцюс организмов. Циклический аденоаин - з',5^-монофосфаг (цШ) представляет совой биологическую активную молекулу, участвует в регуляции целого ряде биохимических процессов как у прокартных, так * у ■ зукарнотных органиэиов. Одаако, у высших растений работа этой системы неучена слабо и функции ее кеуетановлены. Результаты последних работ (Яворская, Калинин» 1984; Вгвшгй , ,

193Ц Км>Ъоп а1.4 1980;0агП«аг*» е*вЦ[988) оседявт бояьоув уверенность в то», что система цЩф присутствует у высших растений и, по-видимому, играет существенную роль в регуляции хх метаболизма. Наиболее изучении* ферментом системы цАМФ у высших реет ений является фосфодиаствраэа' цШЬ ($ДЭ). Однако центральный фермент этой систему еденматцихяаза /АТЬ-пирофосфатянаэа С цикли-зупщая) № 4.6.1.1/ (АД) изучен очень Слабо» Это, отчасти, связано с низким количеством фе(ыента и с трудностью его обнаружения у выоших растений. Поэтому исследование АЦ листьев шенидо является весьма.актуальной задачей.' ' '

Це^ и,»апачи исследования. Шяьи данной работы являлось выявление активности АД лиетьев пшеницы, изучение ее внутриклеточной локализации и некоторое свойств* а также изменение активности в онтогенезе. Исходя из цели робот« были поставлены следующие задачи: ,

1. Подбирая «ятмалъные условия для проявления пейсуыальков активности фермента, исследовать субклеточное распределение и некоторые свойства АД листьев пшеница,

2. Для получения определенной информации о функции цАМФ исоледовать изменение АД активности у различных генотипов пвени-да в онтогенезе* а также влияние »кэогенного цШВ на активность ряда ферюнтов,

Научная новизна работы. Впервые в раэлюгных генотипах дае-ницы исследована АД активность. Изучены субклеточное распределение и некоторые свойства. Показано, что АЦ в ооновном^окаль-эована в хлоропластной мембранея характеризуется двумя значениями рН ептимумов, Установлено, что для АЦ лиотъев пяеницы характерна! атипичная зависимость скорости реакции от концентрации

*

субстрата (ЛТФ), т.е. зависимость ияое-г сигмоадальну» фориу. Э*с свидетельетeye» о том, что АЦ листьев пяеннца является регулл-«сршм фе {ментом.

Показано, что активность федоента зависит от гено типических особенностей паеницы, причем уровень активности высокорослык . низкоурожайных сортов больле, чех низкорослых высокоурожайных, Выявлено, что у scex генотипов наибольшая активность фермента проявляется в период рмсокоЯ фотосннтетичесиой деятельности растений.

Определение активности АД в различных генотипах оаеннда, выращенных в условиях достаточного снабжения минеральными элементами (на высоком агрофоке): и наоборот (на обычной фоне), показало, чю наибольшая активность фермента наб л сдается в условиях недостаточного обеспечения минеральный питанием.

Установлено, что среди различных ферментов не листьев пшеницы наиболее чувствительном, в отнсщенми эмогенного цАМФ, я&сдется КАД$-еависмм*я иалатдегндроген&эа (НАДО-УДТ) и НАД-ки-наза.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные углубляют наши знания о растительной АЦ и вносят определенный вклад в понимание механизмов функционирования системы' цАМФ у высших растения, ' .

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены Hat республиканской конференции "Растительность и пути регуляции ее жизнедеятельности** (Баку, I9tí6 г.Í; республиканской конференции молодых ученых и специалистов На тему "Интенсификация агропромышленного производства на современном этапе" (Баку, I9ÖS г.1; республиканской конференции молодых ученых, посвященной 70-летие BJ5KCH (Баку, 19ÖÖ г.); 1У Всесоюзной конференции молодых ученых (Дущино, I9SÜ г.); семинарах института Ботаники АН Азерб.ССР; сем«чарах Института земледелия Госarpo- : прсма Азерб.ССР.

публикации. По материалам диссертация спубликовано Б работ. Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, окепаримвитальноа части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, работа изложена на Iii страницах машинописного текста и ссдеркит 6 таблиц, Xf> рисунков. Список литера-

0£!4ЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АктуальностьттрсДдеми. В последнее время особое значение приобрели вопросы регуляция хетаСолизиа фотосинтезярувщи* организмов. Циклический аденоэин - 3,5~ыонофосфат (цШФ) представляет собой биологическую активную молекулу, участвует в регуляции целого ряда биохимических процессов как у прокариотгоя, так и у * эукаряотных организмов. Однако, у выслкх растений работа этой системы иаучена слабо и функции ее не установлены. Результаты последних работ (Яворская» Калинин».1904; , ,

193Ц Нвоггоп е* а1.4 1980;Сагг1еах«е «»1^983) вселяют большую уверенность в том, что система цШ присутствует у высших растений и, по-видимому* играет «умственную роль в регуляфш их метаболизма. Н^более изучегшш ферментом системы у шсших растений являетсяфосфодиавтераэа' цЙИ.(ФДЭ). Однако центральный фермент этой систем аденилатцикяаэа /АТФ-пирофосфатляаэа (цккли* зухвцая) № 4.6.1.1/ (АД) изучен очень слабо. Это, отчаоти, связано с низким количеством ферсемта и с трудностью его обнаружения у высших растений. Поэтому исследование АД листьев пшениц* является весьма актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Цел$ю данной работы являлось выявление активности АЦ листьев пшеницы, изучение ее внутриклеточной локализации к Некоторых свойств« а также изменение активности в онтогенезе; Исходя из цели работы выли поставлены следующие задачи:

1. Подбирая оптимальные условия для проявления максимальной активности фермента; исследовать субклеточное распределение и некоторые овойства АЦ листьев пшеницы,

2. Для получения определенной информации о функции цАМ исследовать изменение АЦ активности у различных генотипов пшеницы в онтогенезе» & также,влияние екзогеннсго цАЫФ на активность ряда ферментов.

Научная новизна работы; Впервые в различных.генотипах тле- . ницы исследована АД активность. Изучены субклеточное распределение и некоторые свойства. Показано, что АД1в основном>локад1.-зована в хлорсплаетной мембране» характеризуется двумя значениями рН оптимуыов. Установлено, что Для АД листьев пшеницы характерна атипичная зависимость скорости реакцииот концентрации

"г

субстрата (АТФ), т.е. зависимость имеет сигыовдальную форду. Этс свидетельствует о том, что АЦ листке в пшеницы я&иехв* регум-

IDJtUM фврМбНТО*.

Показано, что активность фермента зависит от генотипическкх особенностей пшеницы, причем уровень активности высокорослых низкоурожайных ворпов больае, чем низкорослых высокоурожайных. Выявлено, что у всех генотипов наибольшая активность фермента, проявляется » период высокой'фотосинтетической деятельности растения.

Определение активности АЦ в различных генотип« пшеницы, выращенных в условиях достаточного снабжения мкнервлы&мм элементами (на. высоком агрофоне) и наоборот (на обычном фоне), показало, чхо наибольшая активность фермента наблюдается в условлях но достаточного обеспечения минеральным питание«.

Устаиомено, что о ради различных фегыент о в из лметьев пшеницы наиболее чуаствительшли, в отношении экзогенного является НАДО-еависим»* иал&тдегндреген&аа (НЛДМ1ДГ) и НАД-ки-наза.

Практическая ценность работы. Полученные ь работе данные угяуйадвт наши знания о растительной АЦ и.вносят определенный вклад в понимание механизмов функционирования системы- цАМФ у высших растений.

AnpoC&ipw работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на; республикам код конференции "Растительность и пути регуляции ее жизнедеятельности" (Баку, 19Ъ6 г.); республиканской конференции .методах ученьос к специалистов на тему "Интенсификация агропромышленного производства на современном этапе" (Баку, 1Ш6 г.); республиканской конференции молодых ученых, посвященной 70-летм ВШИ! (Баку, 1958 г.); ГУ БсесссзноЯ конференции моледнх ученых .(Пущине, 19Ь8 г.); семинарах института Ботаники ЛИ Аэерб.ССР; сеьч-чарах Института земледелия Гос&гро- -прсма Азерб.ССР,

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем работы. Диссертация, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, ааключенил, рыродов и с»иска ;ртируеиой литературы. Работа изложена на ПЭ Страницах машинописного те«ста я содержит В таблиц, 16 рисунков. Список литере-

rjrpj включает SI отечественных, 165 иностранных публикаций.

.- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растения пшеницы сорта Севиндо, выращивали в ф&кторостаткых условиях {температура днем Е2-26°С, ночьо 17-19°С, продолжительность фотопериода 16 час.) при ос вощении лшинесцентншк лампами белого цвета ЛБ-40 на среде Кнопа,-В экспериментах попользовали листья 7-в дневных растений.

Также нами ис польз о ваныраэ личные генотипы пшекиф| выращенные на экспериментальной базе Азерб.НИИЗемледели«, расположенно й на Апюеронскеи полуострове. Выбранные copra пшениц* различаются по происхождению, высоте растений, урожайности, белковости зерна, отзывчивости на удобрения и другим биологическим и хозяйственны* показателям. Нами подобраны характерные сорта Севиндж, Сарм бугда, Аээыатли, Гарагьдалгг-г, Капвм-бээгэ , 0вИачик-65 и Trltl^uM ararablcu» ' Севиндж относится к W-сокорослой (150-180 см) экстенсивной группе} урожайность - 27' -33 ц/Га« Аэаматли - низкорослый (60-70 си) интенсивного типа« высокоурожайный,- 60 ц/Га, в отдельны» годи до 76 цЛ*а. Асе сорта выращивали на двух фонах минерального питания; обычном (без удобрений! и высоком агрофсне - при оптимальной режиме питания, которые внесены у сорта Севиндо - М qq* Аэаматли - Nj^q на фоне Pj20%0* нормы фосфоршх и калийных удобрений и 20& азотных внесены перед посевом, остальная часть азотных удобрений в виде подкорми ранней весной и фазе кущения (6СЙ) и ко-лоюения (20Í),

Получение.бесклеточного Сегментного препарата. Листья гомогенизировали механическим дезинтегратором 1С» -302 (Польша) в течении 40 сек в 0,04/í трис-HCI буфере, рН 7,0, еоре{иищем 0,4м сахароза, 3 (¿I М«30д , 2 tót дктиотрейтол СДГГ) и 0.2& полиринилпирралидон (ПВП). На каждый грамм листьев добавляли 5-10 мл буфера, Гомогенат отжимали через четырех^лойную марлг и подвергали разделению на субклеточные фракции дифференциальны* центрифугированием. Фракции ядра, митохондрий и хлороплас-тов в дальнейшем очищен в ультрацентрифуге в градиенте плотности сахарозы.

Получение ннтактних хлоропласта в. Дяя полученкд кнтактных хлоро пластов, хлоропластные фракции, полученные после центрифугирования при IOOOg , подвергли центрифугировании в градиенте плотности сахарозы на ультрацентрифуге Вес вит L-5 - 60(ША), роторе SW - 65, лри Й-OOOg и 4°С температуре в течение 20 мин. Полученные фракционированные отдельные зоны хлорепластов, отсасывали с помо1цыз шпрнцй, собирали в отдельные пробирки, разбавляли до конечной концентрации сахарозы 0,5М и просматривали под микроскопом.

Получение мембран хлоропластов. Интактные хлоропласт« ре-суспендировалн в 0,04 М трис-HCI буфере, рй 7,0, содержащем 3 мМ

KgS04 ,2 vM ДГГ, разделяли на две части и центрифугировали при 10000 в в течение 15 мин. Одну часть осадка ресуспендиро-вали в н*~цнтратн0м буфере, рН 5,5, содержащем 3 мМ Mgso^ , 2 u.M ^СГГТ, а другу» 6 трис-HCI буфере, рН 6,3, содержащем 3 нМ

U«S04,2 Ш ДТТ озвучивали, в дезинтеграторе УЗДН-2т (ССОР) в течение 3 мин. В начале осаждали неразрушенные хлоропласта при 1000 в , а затем разрушенные .фрагменты мембран хл оропладтов. Разрушенные фрагменты мембран хлоропластев, в дальнейшем подвергли центрифугирование в градиенте плотности сахарозы,"

В качестве критерия чистоты фракции мембран хлоропластов, кроме микроскопического контроля, также использовали соотношение величин хлорофилл/белок (Филлипова, 1967), которое увеличивается во фракциях мембран по сравнения« целыми клетками.

Активность АН определяли радиометричевкдаГметедом по окороо-ти образования а,С-3',Б»АН1 из 14С-АК. Состав реакционной смеси дяя определения активности АЦ при общем объеме' 100 мкл еледукци й: 0,04 М трмс-HCl!буфер, рВ 8,3 и На-цитратный буфер, рН 5,6, с одержащие:HgSO^ ( IS&l? )-5,0 мЫ, ИаР -25 *Ц, креатинфосфат -15 mU, кредтинфосфоккназа - 0,5 мг/мл, 'ATÍ-0,55 мМ, 14С-ЛМ--0,35 мкмории (0,15 мМ), 6t ок 3-4 мг/мл.

Наделение нуклеотидов при определении активности АЦ проводили на силуфоловшс плаотннках ( siluíoi . -264 "ка»а1вг "> ЧССР) i,в системе растворителей н-бутанол! ацетон] 25% нн^ в соотношении 8:2:2. -

Активность НШ-МДГ (Романова, 1980) и НА/1-киназк ( Feter , Distar, 19Й6) определяли Спектрофотометричесетм методом по скорости уменьшения ОП340.

Содвр-шие хлорофилла-определяли как описано в вина и др., 1976),.

Определение белка проводили по методу Лоури ( 1951), а также по Бредфорду ( Bradford , 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ЮС ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор оптимальных условий для проявления максимальной активности АЦ листьев паенкцы .

■ Следует отметить, что основные задачи анализа АЦ заключайте* в идентификации и количественном определении продуктов. ФДЭ печ^н всегда яылвтел »ягряаяятедеы АЦ лродухтов и гидролмзяру-ет продукт действия цикл азы, т.е.'цАН® и затрудняет определение активности. Поэтому, при определений активности АЦ необходимо избегать помех со стороны ФДЭ. В подобных работах в животнши и бактериальными объектами кофеин и теофкллкн используется в качестве потенциальных ингибиторов ФДЭ, однако, ЙДО' растений е не полной мере ингибируетси данными Метилксантинаыи, в частности, теофиляином (Яворская,'Калинин, 1934).

Определение ФДЭ-активноети в.гомогенате листьев пшеницы показало, что в исходном Гомогенате и в СуперИатанте, после центрифугирования при 900g уровень активности ФДЭ был крайне низок. Этот факт объясняется тем; что грубые растительные гомоге-наты пшеницы Сбладают мощньыи гфиродт«и ингибиторами фермента, в частности содержат белковые и небелковые ингибиторы ФДЭ (Игуменов, Думлер, 1979; Игуменов, Этикгоф, 1900). Кроне того, как показали исследования» фракции мейбрак хлоропластев, обладающие АЦ активность», не проявляют ФДЭ активность, о чем подробно будет идти речь в следующем разделе. Поэтому; перед нами не стояла задача избежать помех со стороны ФДЭ* Однако, мы проверяли действие кофеина-ингибитора ФДЭ животных и бактерий на, активность АЦ листьев пшеницы. Результаты показали, что кофеин в концентрациях I - JQ Ш существенно не влиял на активность АЦ.

Второй загрязняющий фермент, который препятствует точности определения АЦ - ото АМаэа, которая конкурирует с првдыду-

кн.: С Черного wry et al.

цим за ATi субстрат. Известно, что АТ5аза у большинства растений локализована а хлсрсшластнсЯ мембране, Для предупреждения действия ATÍá3t¡ мы применяли ATi-реГбнирируюЕцпо систему, а именно креатинфосфат-крелтинфссфокиказу, включая 5 *М креатинфосфата и 0,5 ur/мл крсатинфосфокиназы.

Известно, что АД из гетеротрофнъпс организмов, а также фото» трофной бактерии R. rubrum , стимулируется Иа* , Однако, Ив Г не стимулирует АЦ грибов ( Martin , 19сЛ) и оказывает нкгибя-pymqee действие на АЦ большинства прокариотов {Rickenberg . 1974). Изучение влияния Ks? на активность АД листьев пшеницы показало, что подобно ферменту из гетеротрофных организмов х фототрофкой бактерии R. rubrum , АД гшзющы, для проявления активности, требует наличия NaT в реакционной снеси* При отсутствии На? , ферментативная активность не обнаруживается, (рисЛ), Этич'свойством АД листьев пшеницы напоминает подобные ферменты из высших растений! кукурузы ( p«denko «i al., 1983) к корнеплода сахарной свеклы (Выскребенцова, Иванов, 1901). Однако, в отличие от АЦ пшеницы, фермент из листьев кукурузы в отсутствии (Тар проявляет достаточную активность.

Следует отметить, что механизм активации АД К<4» даже для тканей животнмх полностью не выяснен. Имеются основания считать, что проявляет свое действие на АЦ через К -белок ( Roas *t al. , 1978). '

Одним из условий, для проявления АД активности, является присутствие гомогенизации сульфгадрилвос-отанавливаюцего агента -ДГТ и другого агента поливинил-пиррадидона (ПБЛ), Результаты исследований показали, что фе{ыент требует для стабилизации овоей активности еульфгидрильные группы, и . в отсутствии »того агента» наблюдается уменьшение АД

t,

а х

X. i

ад •

гь

Рис.1. Влияния ЯаГ на активность АЦ, выделенной из различных генотипов пшеницы: I) Kansas -£3323; 2) Гарагылчыг-2; 3) Се-виндк

активности.

Как известно, растительные клетки, в той числе пшеницы, богаты фенолъными соединениям*, имеющими в своем составе в достаточном количестве фенолькые гндрокеильные группы. Эти гидрок-сильные группы образуют связь с ферментами и инактнвирувт их. Поотоиу при выделении фермента мы хспольэовалн ПВП, для предотвращения действия фенолькых соединений на АД. Результаты показали, что в отсутствии ПШ ускоряется инактивация фермента.

Одним из факторов елияощих на активность фермента является рН среды, в которой он находится. Результаты показали, что АД листьев тениф в гоыогенате характеризуется двум* значениями, рН опттумов; 5,5 и 6,3. Около нейтральных значений рН фермент проявляет наименьшую активность.

После установления оптимальных условий, первоначально активность АЦ была определена а надоеадомной жидкости, после центрифугирования бес клеточного препарата (800 к). АЦ в гомогенате листьев пвеиицц проявляет активность, которая составляет 77,6 пмоль цАН4/мин ыг белка. Эта величина сопоставима с величиной * полученной для АЦ кэ проростков кукурузы в гоыогенате, которая составляет 65 пмоль цШФ/мин мг (в отсутствии КьР > (г«^«пко а1., 1933). Низкая активность АД объясняется тем, что этот фермент является регулятора«, а не бжосинтетическим.

Обнаружено, что удельная активность фермента резко уменьшается при хранении его при 2°С. Однако, фермент сохраняет своп активность в течение 6-6 дней при хранении его в замороженном состоянии (-И°С) или в жидком азоте.

Субклеточное распределение АЦ листьев пшеницы

Для изучения субклеточного распределения АЦ листьев пшеницы исходный гомогенат разделяли на ряд фракций, как описано в разделе "Материалы и методы исследования" и определяли активность АЦ в »тих фракциях. [{окученные результаты представлены в табл.Г,

Как видно из табл,1, АЦ активность,в основном, обнаруживается в мембранах хлоропластов. Промывка мембран хлоропластов • трие-НС1 буфером, содержащем 10 мЫ ЭДГД» не влияла на АЦ актив-

Л,'

T&dJt.I. Субклеточном распределения АД листьев пшеницы

• Фракции Общий белок, мг Общая ' актив- -кость, пмоль цШ? ' ' кип ■ Удельная активность

пмоль цАМФ/ мин на мг белка; пмоль цАМФ/ мин на мг хлорофнл.

X. Исходный го- 51,9 4025,0 . 77,4 3050

моген&т

г. Ядро 2,оа 82,1 40,03 -

3. Мембрана хло- 12,8 Е793,0 21Э, t 2315

ропласт ов

4. Стром-i хлоро- 13,04 Не обнаружена

ялистов :

5. Митохондрия 3,46 Не обнаружена

6. Раствооимая

-фракция . 20,0 Не обнаружена

ность фракции, Обращает внимание, тот факт,, что рассчитываемая, на ыг хлорофилла активность фермента в неходком гомогенате, сопоставима с активность» АД, определенном во фракции мембраны хлоропласте в. Всё эти данные, свидетельствуют о томчто АД листьев пшеницы локализована' в хлоропластах,;рде она связана с мембранной фракцией. „_

Известно, чтов клетках животных игривов АД, в основном,, локализована в плазматической мембране (Martin ' ,1981; Roaa a« el», i960), У гетеротрофных, а также в фототрофник бактериях R, rubrum и КЬ. paiuetrl» АЦ обнаружена как во.фракции мембран, так и V растворимой ,фазе (Гулиев и др., 1970;Вгвль, 1969; Jde , 1969). Что касается локализации АЦ выоакх растений, то как показывают последние исследования, АЦ высших растений также, в ооноыюм, локализована во фракциях мембран. Исключение составляет АЦ из корнай люцерны, которая, по мнении авторов С Carrioarte et al*, I9Ü6), является растворимш ферментом, Ньютон с сотр.( Brown | Newton ,1961) показали, что активность. АЦ в прорветках фасоли обнаруживается в хлоропластной мембране. Место нахождение АЦ в хдоропластах также описано в

другой раб^е ( Ти , 1979). Показано, что фермент локализован в хлоропласта* кукуруаы. Однако имеются работы, указывающие на локализации АЦ у высших растений также в плазматической (Выскре-бенцова, Иванов, 1981) и ядерной мембране ( М11сЪ , а гее «г , 1974). .

Некоторые свойства АЦ мембран хлоро пластов

На рис.2 показана кривая зависимости АЦ мембран хлоропластов от рН среды. Как видно из рис. 2, максимальная активность фермента проявляется при кислых - (4,5 - 6,0) и щелочных (7,5 - 9,0) значениях рН.

200

Ч

т.

I

»100 ■ «

О

§

4 6 8 10"

РН

Кривая с двумя пиками выявлена также, ВыСкребенцовой е сотр. (Выскребенцова, Иванов, 1981) при исследовании АЦ мембран ксрне-плода сахарной свехлы. Однако, в отличие от хлороплаотной АЦ, . второй максимум у АЦ коркеплода сахарной свеклы проявлялся при нейтральных значениях рН - 6,5 - 7,3, Интересно, что другой фермент обмена цАМФ - ФДЭ из кукурузы тоже характеризуется двумя значениями рН тотимумов (Феденко и др., 1989),

АЦ, выделенные из тканей живо«ая К бактерий,проявляет максимальную активность в пределах рН 7,0 - В,0 и рН 7,0. - Ю соответственно. АЦ грмбов Н,огаааа и 8, сег«»1о1а» * , наоборот, проявляют максимальную активность в пределах рН 5,5 - 6,3. Таким образом, АЦ пшеницы, проявлением максимальной активности в кислых зонах, напоминает ферменты грибов, а в щелочных зонах, ферменты животных и бактерий.

Известно, что при одсненни характера действия любого фермента, одним из Еажнейиих моментов является его отношение к тому или иному иону. АЦ высших растений, в отношении действия двухвалентных ионов, практически не исследована. Изучение зависимости активности ЛЦ от ионов двухвалентных металлов, при рвут значениях рй оптимумов показало, что в обоих случаях максимальная активность фермента проявляется только в присутствии Мк2* . На2* может заменить Ы«г+ для проявления максимальной активности при щелочных значениях рН реакционной среды, Са2* не оказывал существенного влияния на активность фер»ента. и 2аг* по-

давляет активность Хлоропластной АД,

Табл.2. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность АЦ мембран хлоропластоа'

Me2* . (MU) Активность АЦ пмоль цАМФ/мкн мг белка

рН 5,5 рН 8.3

70 43

Ивг+ 5 10 200 218, 130 148

lin2* 5 ГО ПО 110 120 150

Са2+ 5 10 ' 88 70 61 .

Те2* 5 ХО 65 25 20 15

гпг+ 5 10 67 25 27 10

Ингибированиз особенно сильно выражено при рН 8,3 (табл.2).

Если обратиться к литературным данным ( Rail et el. ,1957; Нова , Gllmnn , I960; Та» , Euberman , 1970; Takal et U. , 1974), то мвмбраносвязанная АЦ различных тканей животных и бактерий для своей активности требуют наличия Kg2+ .Из ряда катионов, таких как Нпг+ • Со2* , Саг* . Zn2+, Сиг+ и Т.Д. только кп2+ может заменить Эти катионы, взаимодей-

ствуя со свободной АТО, образует комплекс Ме-ATS, который является кетиннъм субстратом АЦ реакции. АЦ, которая для своей активности требует присутствия щг+, а не Kg2+ , является

растворимой формой фермента из сперматозоидов крысы { вгаип t Hods , 1975) «человека ( j&n et al. , 1981), а также мем-браносвяэакнкЯ феркент нэ ж.четок н.агааяа С Flawla , 1972), S.cerevleiai* (Londeaborough ■ ., Kumlaan , 1972) м

H, rouric ( Pall , 1981),

АЦ, выделенная нэ корнеплода сахарной свеклы, подобно ферментам, исследовании* нами, требует для проявления максимальной активности Не2* н и 11пг+ С&вкребенцова, Иванов, 1931).

Обращает внимание тот факт, что в случае когда концентрация Ме^1* равна нуле, фермент проявляет некоторую активность, . т.е. свободная ЛИ также может быть субстратом АЦ павяицы.

. Исследована зависимость активноетн Мембраноешэанной АЦ от

концентрации иона tig'

2+

при двух pH олтимумах. Как видно из

рис.Э для проявления максимальной активности фермента, концен-

трации х&г+ в реакционной смеем должны быть не менее 4 иМ.

Рис.3. Зависимость активности мембран хлоропласт©» от,, концентрации при значениях рй оптимума; I - активность в кислоЯ области СрН 5,5»; 2 - активность в щелочной облает» (рН 8,3)

Ш

Исследована устойчивость АЦ листьев пшеницы к нагревании при двух значениях рН опткмумов (рис.4). Установлено, что нагревание до 30°С приводило к некоторой активации фермента, а нагревание до 35°С к частичной потере активности фермента. После нагревания до 50°С происходила полная инактивация фермента. Следует отметить, что Ац из большинства организмов имеет температурный олткмум при 25-30°С ( Martin , 1931} Walker at «1,, I9B3i Howiet Ct al, , 1976). Интересно, что «ДЭ пшеницы в отличие ет АЦ является терм оставил ьньы белком (Игуменов, Этингоф,

1980).

Изучена также зависимость скорости АД реакции of концентрации АТФ при двух значениях рН оптимумев в присутствии 3 ыМ Mg , Как видно из рио,5» для АЦ листьев пшеницы в условиях нашего »ксперимента характерна атипичная зависимость скорости реакции

Vi. 3*

100

Рио.4. Зависимость А11>&кти внести ОТ температу-

Г: активности в кислой области (jii 5,ЕА 2- активность в щелочной области в,Э)

20 ЭО 40

Температуре,°С

Рио.5.' Зависимость скорости АЦ-реагцин от концентрации ЛТФ Г- активность в кислой области (рНЬ,5) 2 - активность в щелочной области (рН-8,3)

1 2 3 4

Ата, м

от концентрации субстрата, т.е.. зависимость имеет смгмокдальную форму. Это свидетельствует о том, что АЦ листьев пшеницы является регуляторным ферментом. Следует отметить, что вавиеююстъ

активности АЦ от концентрации субстрата для фермента кукурузы тоже имеет ситоидальнув форму ( radaoko *t el. , 1963),

Изменение ХЦ активности » онтогенезе различных генотипов пшеницы

Вопрос о связи цШ,и других компонентов АЦ-сиетены в физиологически« ссстоянмемрастмтельных клеток изучен очень одабо. Учитывая важность «тих сведений, для понимания физиологической рол« цЦФ, иссяедовиио изменение АЦ активное** в онтогенезе -различных генотипов пдеяицы, отлищпдихся по фотосинтеткчесгим признакам и урожайности. '''■■*

..Как показали исследования, все изученные сорта пшеницы обладают АЦ активностью; Интересна, что высокорослые низкоурожайные сорта Сары бугда" и Севинди nq сравнению снизкоросдшк высокоурожайны»» сортами обладают мсоко* АЦ актяшостыь (табл.3). ■

Тайл.З. Активность АЦ в различных генотипах пяекжцы

Сорта Активность АЦ, пыоль цАМФ/мин на м? белка

I. Сары бугда (высокорос- 130

лый, низкоурожайный)

2. Севиндж (высокорослый, 140

низкоурожайный)

З.Тг1Л1ош ararablcw 123

(высокорослы^ низкоуро-

жайный)

4, Гарагъичыг-2 (низкорос- а?

лый, выо окоурокайный)

5, Аааыатли (низкорослый, 90

высокоурожайный)

Исследовано изменение АЦ активности у различных генотипов пшеницы, в разных фазах ее роста и в онтогенезе флагового листа.

Дм исследования выбрали сорта Севмндж и Азаматли, выращенные в условиях достаточного снабжения минеральными элементами и наоборот. Поскольку АЦ листьев пшеницы характеризуется двумя максимальней значениями рН оптимумов, то во всех опытах определение активности фермента проводили при рН 6,6 и 6,3.

Изучение изменения АД активности от фазы роста показало, что по мере изменения роста растений увеличивается АД активность по фазе ноловекия-цветения, После колошения-цветения активность фермента постепенно уменьшается до конца вегетации (табл.4).

Нами исследовано также изменение активности АД листьев пшеницы в процессе развития флаговых листьев. В результате этих исследований выявлено, что полностью сформировавшиеся флаговые листья пшеницы сорта Севяндж по сравно юла с сортом Азаматли обладает большей АД активностью..В ходе формирования флаговых листьев активность АЦ у обоих сортов увеличивается и достигает овоего максимума в 14-17 дневном возрасте, затем'уменьаается ' (рис.6), т.е. наибольшая активность проявляется в период высокой фотосинтетической деятельности растений. Велк обратиться к литературным даннш (Алиев и др., 1988; Гулнев и др,,1985; Наэибе-кова и др., 1985), то видно, что изменения АЦ активности во флаговом листе твениде, а также при различных фазах ее роста, коррелируетея такими физиологическими процессами, как интенсивность фотосинтеза, фотохимическая активность хлоропластов, активностью главных ферментов цихмКальвина, которые участвуют в ассимиляции со2 • Локализация АЦ листьев пшеницы в хлоропласт ах и вышеуказанные данные, полученные нами,.позволяют предположить , что цАМФ, ро-видшому играет важную роль в ыетаболи-тических процессах растений, в том числе,в фотосинтезе.

Также определена активность АЦ в различных генотипах пыени-цы, выращенных в условиях достаточного снабжения минеральными элементами (на высоком агрг^оне) и наоборот (на обычном фоне). Обращает внимание тот факт, что наибольшая активность фермента у обоих сортов наблюдается в условиях с недостаточным минеральным питанием [рис,6 и табл.4).

Известно, что цАН! у гетеротрофных организмов, как у про-кариотньос, так и у эукариоттос, в основном, играет роль сигналов о наступлении трудностей у определенных клеток к органов, Т.е. подобные явления могут иметь место и у высших растений.

Табл.4. Изменение АД активности листьев пшеницы ь различные фазы ее роста

Фазы роста Активность АЦ, пмоль цШ/на I г сырого веса в минуту

Севиндк Аэаматли

■ I П '1 П

А В А В А В А В

I. Трубкование 329,0 ! 366,0 167,6 Г39,0 294,0 132,0 100,0 ' 27,64

2. Кололенке 344,0 352,0 305,0. 278,0 427,0 165,3 372,5 125,0

3, Цветение 636,2 453,0 424,5 389,2 500,7 308.6 448,6 215,6

4. Молочная спелость 528,0 281,4 364,4 • 301,5 391.3 140,0 251,7 122,9

I -> активность в кисло И области (рН 5,3) П * активность в щелочной области (рН 6,3) А - пвешща выращена на оОьпно» фоне В - зшелица выращена на высоком агрофоне

' ■ ■ ' ■■ ■ '-

8 16 24

дни, май

Рис (6. Измените активности АЦ при развитии флагового листа у сортов-Севиндж (А) и Аэаматяя (Б):

I, 3 - пвенпцы выращены на обычном фоне 2,4 - тпекицы рырацвны ка высоком агрофоке

I. 2 - активность в кислой области (рй 5,5) Э, 4 - активность в »елочной области (рН 0,3)

При наступлении неблагоприятных условий (дефицит минеральны* вле-мвитов), дня регуляции ряда метаболитичвскюс процессов, увеличивается активность АЦ и(соответственно»увеличивается яонцентра-ция в клетках листьев пшеницы. Далее, включается серия последовательных реакций« благодаря чему дотнчко устраняетея вмнхкюц»« трудности»

Таким образом, полученные нами данные указывает на то, что, ао-8ид^»оыу, цШЗ у высяхх растений мс*ет играть важную роль в

- I? - -

различных ыет&болитичеоких процессах.

Влияние цАМФ на активность НАДО-ЫДГи НАД-киназы, выделенные из хлоропллотов пшенкде

Поскольку, в ходе изменения АД аггивноетх в онтогенезе имеется корреляция с изменениями активности фотоемнтетичесхкх ферментов, интерес>ш оказался вопрос-влияния цАМФ на активность ряда ферментов, С атой цель»,нами было исследовано влияния »к-зогенного ц№ на активность ферментов, таких как РДО- и ФШ карбоксклазы, карбоангидразы, мал&тдегндрогеназц, а также аспар-таталаиюшмикотрансфераэы, глутаматпируваттратаминаэы, глутаыат-океалоацетаттрансам иназы, ШД-кииаэи, выделенные из листьев пшеницы, сорта Овиачик-65 и Севиндж,

Как .видно ИЗ табл.5. Среди различньЖ ферментов из пиениф!,

наиболее чу зет вительншк е отношении являются НАДЬ-МДГ и НАЛ-киназа. Результаты влияния.цАМФ да активность . НАД^-ИД* и

Табл.5. Влияние цАЫ4 на активность ферментов, выделенные ■ из экстрактов листьев пшеницы

Ферменты - . -цАМб '' +цАМФ

I. Глу т ан атпиру ватт рамс амин аз а 100 НО

2. Глутаматоксаяоацетаттрансаминаза ■ -*- 250

3. Аспартаталанинаминотрансфераза 157

4, НАДМ«алат дегидрог енаоа 270

5". Н АДс-малат дегидроге: 1аза 143

б. НАЛ-киназа ■ -Л- 53

7. 4Ш-карбО кс и лаз а 137

8, РДЬ-карбо кс клаза 145

9. Карбоангидраза 141

НАД-киназы, выделенной на хлероплаетов ■пшеницы, даны в табл.6. Из табл. видно, что под влиянием цАМФ активность НАДМ(ДГ увеличивается, в то же время активность НАД-киназы, наоборот, уменьшается. Подобные изменения не обнаруживается, в случае, когда

Табл.б. Влияние цАМФ на активность НАД&-ЫДГ и НАД-киназа хлорспластов пшеницы

сорта ферменты -цШ +Ш -ц №

НАДО-ЫДГ 1,00 4,ТО* 1,00

Овиачик-65

НАД-кннаэа - 1,00 0,30 1,00

НАДО-МДГ 1,00 4,00 1,00

Севиндж

НАД-киназа 1,00 0,25 1,00

к - степень изменения активности ферментов по сравнение с контролем

якмто цМЮ прюмняетея АМФ, Это свидетельствует о том, что обнаруженное аффекты возникают благодаря только цАМФ. Следует ' отметить, что влияние цДМФ на активность НАДО-МДГ и НДЛ-киназы можно обнаружить в случае поврежденных хлора пластов. В интакт-ных хлоропласта», полученных после центрифугирования на градиенте плотности сахарозы, подобные изменения под влиянием цАМФ не обнаруживаются. Это, по-видимому, ввязано с тем, что цАМФ не может проникнуть через внешние мембраны внутрь хлороплаетов.

Время для стимуляции НАДО-МДГ, определенное нами, оказалось 30 мин. Продление времени премнкубации-до одного часа не привело к дополнительному изменению. Обращает внимание и тот факт, что при активации НАД5-МДГ, под влиянием uAííí, наблюдается определенный лаг-период (рюЛ). В отличие от НАДО-ВДГ, изменение в активноети НАД-кинааы,под влиянием цАЫФ, наблюдается даже при Б мин. преини-убадаи. Дальнейюее увеличение времени . преинкубацим приводит к устранению ингмбирушцего действия на активность НАД-кинаэы, что, по-видимому, может быть «вязано с работой ФДЭ. Полученные данные показывают, что в механизме влияния цАМФ на активность этих двух ферментов имеются определенные расхождения.

По дакньы Давана и Наляка ( Shawana , Hailk , 1960) в

** зсо

О 200

г ТОО

-«!

Рис .7. Зависимость активное-ти НАда-завиеимой МДГ (I) я 11АД-кинааы (2) от времени прединкубаци*

дат1™ ^

10 20 30 4С 50 СО Бремя, мии

пыльце сосны, в период опыления, сильно увеличивается активность НАД1-МДГ под влиянием дАМФ. Авторы на основании полученных данных^приили к выводу, что увеличение ферментативной активности происходит на уровне биосинтеза белка. Недавно, аналогичные данные получили Лоренс и Салсгивер С Ьопитепв* • ва!ев1т«г , 1964) в тканях гет!еротрофнмх организмов. Он» пс-к&эалк^ что активность МДП из клеток скелетной мыта» крысы увеличивается под влиянием цАМФ, причем активация происходит благодаря вновь синтезированному ферменту*

Чтобы,получнть,определенную информацию о механизме влияния цАМФ на активность НАДЬ-НДГ иНАД-ккнааы, преинкубациюхлоро-плаетоэ проводил» в присутствия цАЫФ и пуромицина (Ю-5!!)» Оказалось, что влияние цАМФ на активность НАДг-МДГ полностью устраняется в присутствии пуромицина (табл.7),

Табл.7. Влияние цАМФна активность хлороштстньЛ НАД$-НДГ и НАД-кинаэы в присутствии и отсутствии пуроыкцкна

фермент контроль . чцШ -цАМФ

. —пурокицина ♦пурсмицина

НАДО-МДГ 1,00 4,60* 1,25*

НАД-ккнаэа 1,00 0,35 0,39

х - степень изменения активности ферментов по сравнен» О кон-

тролем.

Известно, что пуромицин является ингибитором биосинтеза белка на уровне трансляции и может применяться как у вукариотов, так и у прокариотов. Следовательно, на основании получении данных можно сделать вывод о тем« что подобно МДГ. в пыльце сосны и скелетной мышце крысы,влияние цАМ$ на активность хлоропластной НАД?-ИД1, исследуемой нами паемицы« может происходить на уровне биосинтеза белка. Как видно иэ табл.*?, в отличие от НАД5-КДГ, аффект цАКФ на НАД-киназу .не снимается действием пуромйцкна. Можно предположить, что, по-видимому, влияние цАМФ на активность НАД-киназы происходит на уровне самого фермента.

Поскольку, под воздействием. ц/Ш изменяется активность НАД&-эавиеимой МДГ. вследствие чего происходит превращение НАДИ в НАда+, то, интересно было бы узнать, могут ли зтй нукла-отиды, каким-то образом влиять на активность АЦ мембран хлоропластов. На рис,6 показано влияние как разных концентраций НАД5Я и НАД5* в отдельности, так и соотношении НАДОН/НАДО* на активность АЦ мембран хлоропластов. Как видно из рис.8, при

Й?**^,. . ( 3 ) на активное тьАЦ

—мембран хлоропластов

0,2 • 0,4 С,О

ОВД® и НАД**", мИ) 1,0

увеличении концентрации ШДОН, а таете соотношения НАдаН/НАД6+» увеличивается активность фермента. Увеличение кол^ент рации НАда> приводит к Прекращении стимуляции АЦ активности. Эти дан* ныв свидетельству»* О том, что активность АЦ мембран хлоропластов может находиться под контролем соотношения концентраций НАДЖ/НАД**

300

w

' ^ 200 Й

ё 100

- S

. вывода

1. В результате исследований выявлено, что ткани листьев ляеки-Ш вбладапт АЦ активностью, Установлено, что формант, г основном, локализован в хлороплаотноя мам б ране.

2. Изучены некоторые свойства АЦ мембран хлоропластов. Показано, что АЦ листьев паеницы характеризуется двумя значениями рН . спткмум ов и является терыолаДильнъы фе pi ант ом. Активность фермента максимальна в Прюутствии ион* . На2* может заменить Mg2+ пр» щелочных значениях рН-и ккгкбируется . ионом Ра2* ж Zti?*.

3. Установлено, что для' АЦ листьев пшеницы характер« атипичная зависимость скорости реакции « концентрации субстрата (АТФ), т.е. зависимость имеет сигмоидальнуи форму с коэффициентом Хклла 1,&5. Это свидетельствует о том, что АЦ листьев ггаени-

. цы является регуляторнм* ферментом,

.4. Показано, что активность фермента зависит от генотипических особенностей пшеницы,' причем уровень активности у высокорослых низкоурожайных сортов больше, чём низкорослых высокоурожайных. ■-..'.'

5. Исследовано изменение АЦ активности у различных генотипов пшеницы в разных фазах ее роста и в процессе развития флаговых листьев. В результате вткх исследований, выявлено, что . наибольшая активность фе [мента проявляется в период высокой фотосмнтетичесхой деятельности растений.

6. Определение активности АЦ в различна генотипах шекшда, выращенных в условиях достаточного емфмккя миадрмыаеге . влементами (на высоком агрофоне) и наоборот (на обычном фо» не},показали, что наибольшая активность фермента наблюдается в условиях с недостаточна минералыш питанием. Можно предполагать, что,по-видимому, у всех организмов, независимо от юс классификацдо и отдаленности по еволюцки.цАДОмо-жет функционироваться как бы сигналом "голода? прм неблагоприятных условиях.

Установлено, что среда различных ферментов из листьев пленк-цк наиболее чувствительными в отношении цАЫР является НАДФ-эависимая малатдегидрогеназа и НАД-кинаэа. Показано, что

ымйя цАМФ на активность КАД$-зависиыоЙ малаТдегмдрогенаэи может происходить на уровне биосинтеза белка; а на НАД-кйна-зи на уровне самого фермента;

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Е1укуров Ш.А., Галанова Г.И. Влияние цАМФ на активность ма-датдегкдрогинааы проростков пшеницы. В сб.: "растительность и пути регуляции ее жизнедеятельности". Баку, 1986, ст.87 - 2. Гаеанова Г.И., Шукуров Ш.А. Изменение аденклатциклаэной активности в онтогенезе различных генотипов пшентр. В сб.: "Интенсификация агропромышленного Производства на оовремен-' ном этапе", Баку, 1998, ст.84

3. Гасанова Г.И., Шукуров Ш.А. Субклеточное распределение и некоторое свойства аденилатциклаэы листьев пшеницы. В сб.: "Тезисы докладов 1У конференции молодых ученых" . Пущино, 1968,

4. Иукуров Ш.А., Гасанова Г.И. Локализация и некоторые свойства аденилатциклаэы листьев пшеницы. В Сб.: "Тезчин докладов республиканской конференции молодых ученых, посвященной 70-лети» ВПКСМ". Баку, 1988; ст.ЗО

Шукуров Ш.А., Гасанова Г.И. Активмоеть аденилатциклаэы листьев пиеницы. - Изв.АН Азерб.ССР. 1989, # I.

ЛЬЫ L.'JЧЛ11 ССР A^A.'Ö./JilCU

Ь.Л.МЬАЮЬА ЛяЫ-Л ¡JUTAiilKA liPCTHTÏTï

' Элл fi зу асы пггугупда

■ *

tiöCcHOÜA MfJUJAKí í'JrTHi-AT I'LibLÍ

>дК.;У;7.151.042

то синтетик фуньсизасьна es» наисуд'ищыгииа кара ([орглэиэл бугда генотшиюрмнии аденялат-тоиклаза aKTHiywjH, локалкзасиjaou se öb"sh >.аясалври.

0ó.00.i2 - битки ¡¡из поло к nj асы "

опил Оки ja ел млн;; намиз ели алш.ишк дюрвчэсини алмаг y'íyh тэгдш олун-ijyui лис сертас tija шинин

Ь Т О I- ¿ L iî Р Л T L '

J AJÍLi - 10tirJ,