Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ ПЕРЕПЕЛОВ И МУСКУСНЫХ УТОК IN VITRO.

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕМБРАННОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ ПЕРЕПЕЛОВ И МУСКУСНЫХ УТОК IN VITRO."

J'bltyb

He правах рукописи

ХАРИТОНОВ Максим Владимирович

Активность ферментов мембранного пищеварения перепелов и мускусных уток in vitro.

03.00. 13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК - 2004

Работа выполнена на кафедре нормальной и патологической физиологии животных Института ветеринарной медицины Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Ряби ков Анатолий Яковлевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дементьева Тамара Александровна

доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, Айзмаи Роман Игоревич

Ведущее учреждение: Дальневосточный государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится 29 июня 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.048.04 при ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» по адресу: 630039, Новосибирск-39, ул, Добролюбова, 160.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВГТС «Новосибирский государственный аграрный университет».

Автореферат разослан « 2С, » ^-с-сч-^т_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, профессор С.П. Князев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАВОТЫ

Актуальность тем ы. Птицеводство является одной из важнейших отраслей животноводства. Птицеводство обеспечивает население страны такими высокопитательны ми и диетическими продуктами, как яйцо и мясо, снабжает легкую промышленность пухом и пером, сельское хозяйство - органическими удобрениями. Птицеводство является важной сферой хозяйственной деятель-кости человека. В связи с этим сельскохозяйственные птицы заслуженно пользуются повышенным вниманием со стороны ученых разных специальностей.

Первый вид птиц, который определяется как объект исследования - это перепел. Перепело вод ст во в последнее время получает все более широкое распространение. Перепел обыкновенный (СоШпнх соШгтих) птица семейства фазановых, отряд куриных. Дтина 16-20 см. Живая масса 190-200 г. Перепелов разводят в домашних условиях и на крупных фермах ради диетического мяса и диетических яиц. Перепелиные яйца обладают целебными свойствами, поэтому их применяют при заболеваниях сердечно-сосудистой, дыхательной (в том числе при бронхиальной астме), пищеварительной, мочеполовой, нервной и других систем. В яйцах перепелов установлено наличие радиопротекторов, значительно снижающих развитие послелучевых процессов. Перепеловодство как отрасль промышленного птицеводства возникло в Японии в 50-х годах двадцатого столетия. Оно стало в Японии второй по величине отраслью итицсводства после куроводства, оно развито во Франции, Италии, Германии, Польше и других странах. В результате селекционной работы выведены яйценоские линии перепелов. В России перепеловодством занимаются специализированные хозяйства, птицефабрики и фермы в акционерных обществах, колхозах и совхозах. Перепела начинают нестись в 35-40-дневном возрасте и дают за год 250300 яиц. Яйцо весит 8-14 г, тушка 120-150 г. Яйца перепелов пригодны к длительному хранению. Одно яйцо перепела по энергетической ценности белка соответствует 2,5 куриным яйцам. Перепел - единственный вид птицы, включенный в профзмму исследования космоса. Перепела обладают резистентностью ко многим инфекционным заболеваниям, хотя в науке пока нет объяснений эюму феномену. В доступной нам литературе по псрепеловодству осасщаются главным образом вопросы технологии выращивания, содержания, кратности кормления, состава и вида кормов, яичной продуктивности. При этом подавляющее большинство работ, отражающих биологию перепелов, их продуктивность принадлежит японским исследователям.

Высокоэффективной отраслью мясного птицеводства является утководство. Утки по скорости роста, сохранности поголовья, оплате корма и некоторым другим хозяйственно-полезным признакам занимают в птицеводстве одно из первых мест. Достаточно сказать, что для производства 1кг утиного мяса затрачивается всего 3-4 кормовые единицы. Это почти в 2 раза меньше, чем для получения 1 кг свинины, и в 3 раза меньше, чем для получения 1 кг говядины. Утиное мясо очень калорийное, с прекрасными

з

Ц}£1АСХА

N9

дой утки-несушки можно получить о год 220-230 яиц к выраспггь Í-Í0-J50 утят общим весом 280-320 кг. Вес это говорит о том, что утководство является исключительно выгодной отраслью мясного птицеводства. Особое место среди разнообразных пород уток занимают в известной мере экзотичные для России мускусные утки (Catrina moschata).

Проблемы повышения продукт«вноси) птнны, улучшения качества продукции, проблемы в кормлении, содержании птицы, технологии производства продуктов птицеводства невозможно решить без знаний физиологии птицы, функций отдельных органов и систем. Успешно работать в птицеводстве можно только опираясь на объективные знания о области анатомии, биохимии, физиологии, особенностей роста, видовых и породных различий ппщы. Изучение многообразных функций организма сельскохозяйственной птицы с учетом биологических, морфологических, видовых особенностей является необходимым условием для« решения продовольственной проблемы, развития ветеринарной, зоотехнической и биологической науки.

В доступной нам литературе по физиологии птиц освещаются вопроси пищеварения, по главным образом секреции пищеварительных желез. У кур, в частности, изучены процессы полостного и пристеночного пищеварения. Что касается пристеночного пищеварения у мускусных уток и перепелов, то пока эти вопросы остались без внимания исследователей. Однако, без глубоких и всесторонних знаний процессов пищеварения и, в частности, пристеночного пищеварения, нельзя успешно решать проблемы, связанные с содержанием, кормлением, мясной и яичной продуктивностью названных птиц, диагностикой заболеваний и терапией больной птицы.

Учитывая все вышеизложенное, считаем, что изучение пристеночного (мембранного) пищеварения у мускусных уток и перепелов является актуальной задачей - физиологии. Номер государственной регистрации темы 01.2.00103074.

Цель работы. Шучить функциональные особенности мембранного (нри-стеночного) и полостного пищеварения у перепелов и мускусных уток в нормальных и экстремальных температурных условиях.

Задачи исследования:

1. Изучить активность амилазы, прогеазы и липазы у перепелов и мускусных уток в нормальных температурных условиях.

2. Выявить степень влияния гипотермии на активность амилазы, протеа-зы к липазы у перепелов и мускусных уток.

3. Выявить степень влияния гипертермии на активность амилазы, прогеазы и лнпазы у перелелоа н мускусных уток.

Научна» новизна. Научная ноанзна исследований заключается в том, что получены новые данные об особенностях течения мембранного (контактного) расшепленкя углеводов, белков н жиров при разных те.мнературных условиях у

перепелов к мускусных уток. Эти данные значительно дополняют сведения, имеющиеся п научной литературе по пищеварению у птиц. Обнаружена четкая закономерная зависимость процессов мембранного (пристеночного) расщенле-ння питательных веществ ог температурного фактора. Уточнен показатель оптимальной температуры, при которой наблюдается наивысшая активность ферментов мембранного пищеварения у перепелов и мускусных уток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическое значение работы важно в том, что данные, полученные с использованием современных методов исследовании и обработанные статистически, расширяют и углубляют наш и представления об активности ферментов мембранного пищеварения у перепелов и мускусных уток. Практическая значимость полученных результатов заключается в том предположении, что примерно также как «in vitro» ведут себя пищеварительные ферменты «in vivo», т.е. снижение активности фермситоп мембранного гидролиза при высокой температуре тела (гипертермия) или при снижении ее ниже физиологической нормы (гипотермия) является важным звеном в патогенезе различных заболеваний. Это напрямую связывает полученные результаты исследований с успешной диагностикой и терапией больных животных и птип, позволяет максимально эффективно и комплексно разрабатывать схему и тактику лечения при различных патологиях пищеварения.

Полученные результаты позволят более объективно оценивать взаимосвязь обменных процессов в организме птиц. Могут служить одной из основ повышения мясной и яичной продуктивности перепелов и уток, совершенствования условий кормления и содержания сельскохозяйственной птицы. Результаты исследований могут быть использованы при составлении справочных руководств по вопросам физиологии пищеварения у птиц, написании монографий, учебников, руководств и пособий по сравнительной физиологии домашних птиц.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Активность амилазы мембранного пищеварения у перепелов и мускусных уток при норм о гипо- и гипертермии;

2. Активность протсазы мембранного пищеварения у перепелов и мускусных уток при нормо-, nmo- и гипертермии;

3. Активность липазы мембранного пищеварения у перепелов и мускусных уток при нормо-, пшо- и гипертермии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИВМ ОмГАУ (2000, 2001, 2002, 2003); на заседании Омского отделения общества физиологов им. И.П. Павлова (ОмГМА, 2002); на заседаниях кафедры нормальной и патологической физиологии животных ИВМ ОмГАУ (1999, 2000, 2001,2002).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы. Объём к структура работы. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного текста и состоит лз введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована S3 рисунками, 9 таблицами. Список литературы включает 208 источников, в том числе 57 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследовании. Экспериментальная часть работы проводилась в научной лаборатории кафедры нормальной и патологической физиологии животных Института ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета с сентября 1999 года по май 2002 года в соответствии с утвержденным планом 11ИР ИВМ ОмГАУ.

Объектом исследования были взрослые клинически здоровые мускусные утки в возрасте 10-14 мес. и перепела в возрасте 6-9 мес. Для изучения активности ферментов в условиях нормотермии, гипотермии и гипертермии всё опытное поголовье было разделено на три группы. Мускусных уток по 10 голов в каждой группе, итого 30 голов. Перепелов по 30 голов в каждой группе, итого 90 голов. Экспериментальные группы мускусных уток и перепелов содержались раздельно. Условия кормления и содержания всех птиц были одинаковы.

В целях исследования предполагаемой функциональной активности ферментов мембранного пищеварения, выявления изменений её в зависимости от температурных условий были применены следующие методики:

•исследование активности амилазы по Smith В., Roe J. (1949), методика усовершенствованная A.M. Уголевым (1969);

-исследование активности протеазы по Ц.Ж. Батоеву (1971); -исследование активности линазы по Батоеву-Цы Ое кмитово й (1987). Эти методики были адаптированы нами для изучения активности ферментов мембранного пищеварения мускусных уток и перепелов. Отработка и освоение методик проводилась на голубях и курицах.

Для исследования ферментативной активности в условиях нормотермии температура инкубации для мускусных уток составляла +41°С, перепелов +42°С. При исследовании активности ферментов в условиях гипотермии температура инкубации снижалась на 5°С. При исследовании в условиях гипертермии повышалась на 5°С. Как мы выяснили во время освоения и отработки методик, при интервале ±5°С наблюдаются наиболее характерные и закономерные изменения активности как полостных, так и мембранных ферментов.

В качестве биологического (ферментсодержащего) материала нами использовалась слизистая оболочка тонкой кишки птицы. Рабату с биологическим материалом проводили по методике В.И. Георгиевского (1976). УСой птицы проводили методом декантации. После убоя птицы необходимо провести

максимально полное обескроилиаание тушки. Степень обескровливания можно контролировать по энтеральным и брыжеечным сосудам. Если они переполнены кропыо и хорошо заметны мелкие капилляры, то такой материал непригоден для исследования, так как гемоглобин при постановке опыта начнёт диффундировать и раствор субстрата, изменяя его окраску и препятствуя получению точных результатов. Нужно иметь в янду, что все манипуляции с птицей после убоя следует производить быстро, так как и кишечнике сразу после смерти начинаются очень интенсивные аутолитичсские процессы. И даже небольшое промедление может привести к значительному снижению гидролитичес ко й активности ферментов полостного и мембранного пищеварения. Сразу после лс крыт и я брюшной полости иссекается тонкий кишечник и охлаждается под холодной проточной водой. Затем петли тонкой кишки расправляются, брыжейка и кишечный жир удаляются. Отрезки тонкой кишки длнной 15-20 см надеваются на стеклянную палочку, после чего рассекаются по длине стальным лезвием и принимают лентовидную форму. Далее нужно промыть слизистую оболочку от остатков химуса. Для этого следует использовать дистиллированную коду, охлажденную до температуры +2+4°С. Лучше избегать использования для этой цели проточной воды, так как она может содержать вещества, угнетающие активность ферментов и нарушать точность исследования.

В.И. Георгиевский рекомендует обрабатывать слизистую оболочку кишечника химически чистым ацетоном только в тех случаях, когда нет возможности сразу же провести исследование материала и необходима его фиксация. Нами же было замечено, что даже если между забором фсрментсодсржащего материала и непосредственно изучением его активности проходит немного времени, то всё равно следует проводить обработку ацетоном. Судя по всему, кроме консервирующего эффекта, ацетон устраняет воздействие на пищеварительные ферменты естественных ингибиторов, таким образом, сохраняя стабильность ферментативной активности. Но этот тезис нуждается в дополнительном обосновании.

Кусочки стенки тонкой кишки площадью 1 см2 опускаются в химически чистый ацетон на 10-15 сек периодически взбалтываются, затем ацетон сливается и материал несколько раз промывается прохладной дистиллированной водой, с целью удаления остатков ацетона. Кусочки тонкой кишки, таким образом, становятся готовыми для определения активности ферментов мембранного пищеварения.

Для параллельного исследования активности ферментов полостного пи- • щс парен ля используется экстракт слизистой оболочки тонкой кишки (В.И. Георгиевский, 1976). В пробирку наливается 12 мл теплого (1 +40+42°С) раствора Ришера. Подготавливаются 5 кусочков из стенки тонкой кишки площадью 1 см5 каждый и опускаются в пробирку. Слегка перемешав, ставят в термостат и инкубируют 10 минут лрн нормальной температуре тела птицы (мускусная утка 441 "С, перепел +42°С). Затем вынимают пробирку и извлекают кусочкн ки-

шечной стен кн. Экстракт отфильтровывается через ватный фильтр и используется для моделирования in vitro полостного пищеварения.

Считаем эту методику наиболее приемлемой, так как альтернативные способы получения экстракта (с 87%-ным раствором глицерина и др.) более громоздки и занимают значительно больше времени (экстрагирование длится 2 суток).

Результаты исследований

Относительная масса органов пищеварения к массе тела перепелов у самцов составила 13,35-14,80%, а у самок 18,71-21,30% (Р<0,05). Этот показатель несколько превосходит подобный у других птиц, что свидетельствует о большей интенсивности обменных процессов в организме перепелов.

При исследовании активности амилазы перепелов через 5 минут инкубации выяснилось, что доля полостного переваривания крахмала составила всего 8,56% из общего гидролиза на данный момент, тогда как мембранный гидролиз имел показатель в 91,44%. Это свидетельствует о том, что свободные ферменты почти в 11 раз медленнее включаются в процесс расщепления субстрата, чем ферменты, связанные со слизистой оболочкой тонкой кишки. При последующем инкубировании доля полостного переваривания увеличивалась при одновременном снижении мембранного расщепления. Так, через 10 минут инкубации полостной гидролиз составлял 20,88%, а мембранный 79,12%; через 15 минут соответственно 31,31% и 68,69%; через 20 минут — 42,48% и 57,S2%; через 25 минут —60,38% и 39,62%. В среднем, за весь период инкубации доля полостного гидролиза составляла 35,48%, а мембранного - 64,52% (Р<0,002). Это позволяет сделать вывод, что амилаза у перепелов — это фермент с преимущественным мембранным механизмом воздействия на субстрат.

Что касается протеазы перепелов, то на протяжении всего периода инкубации она проявляет стабильность в соотношении полостного и мембранного пищеварения. Этот показатель составляет соответственно 17% и 83% (Р<0,002). Из этого четко видно, что при расщеплении протеинов гораздо большую долю занимает мембранный механизм переваривания.

Липаза через 5 минут инкубации субстрата in vitro показала долю полостного гидролиза 38,78%, мембранного - 61,22%. Через 10 минут инкубации соответственно - 43,47% и 56,53%; через 15 минут инкубации — 49,36% и 50,64%; через 20 минут - 49,52% и 50,48%; через 25 минут - 52,16% и 47,84%, В общем, за весь период инкубации, доля полостного гидролиза составляла 47,33%, а мембранного - 52,67% (Р<0,003). Следовательно, липаза также более активна при мембранном гидролизе, чем при полостном. Хотя это проявляется не так резко, как у амилазы, и тем более протеазы (табл. 1).

Нами была выяснена оптимальная концентрация субстратов для исследования активности ферментов мембранного пищеварения. Концентрация растворов субстратов в опытной пробе должна быть такова, чтобы результат на ФЭК локализовался на середине шкалы. Только в этом случае достигается высокая точность исследования и достоверность результатов. Для исследования актив-

кости амилазы перепелов применяется 1,2%-ный раствор химически чистого крахмала, протеазы - 0,9%-ный раствор очищенного казеина, липазы - 1 мкмоль/мл эмульсия растительного жира. Для исследования активности амилазы мускусных уток применяли 0,8%-ный раствор крахмала, протеазы — 0,8%-ный раствор очищенного казенна, липазы — 1 мкмоль/мл эмульсия растительного жира. Мы сравнили оптимальную концентрацию субстратов для перепелов к мускусных уток с таковой для млекопитающих животных (сведения полуденные из доступных литературных источим ко в). Уже по концентрации субстрата можно судить насколько активность пищеварительных ферментов перепелов выше по сравнению с другими птицами, и уж тем более с таковой у млекопитающих животных. Активность амилазы мускусных уток более чем в 8 раз превышает активность амилазы у млекопитающих, а перепелов — более чем в 12 раз. Активность протеазы мускусных уток по сравнению с млекопитающими животными выше о 7 раз, перепелов — в 9 раз. Уровень активности липазы мускусных уток и перепелов в сравнении с млекопитающими животными значительно не разниться, несмотря на то, что процент жиров в структуре рациона данных птиц гораздо ниже, чем в среднем у млекопитающих животных (у перепелов эю 30-40% ог общего количества жиров рациона млекопитающих на 1 кг веса животного, у мускусных уток ешС меньше - не более 25%).

При проведении исследования активности пищеварительной амилазы перепелов нами были выявлены некоторые ее! характерные особенности. Амилаза перепелов показала себя как фермент очень активный, динамично функционирующий, при нормотермии включающийся в процесс гидролиза крахмала с первых минут воздействия на субстрат. В начале расщепления крахмала при нормотермии мембранный гидролиз протекает в 3,8 раз интенсивнее полостного, к завершению времени инкубации эта цифра снизилась до 1,7. Таким образом, п холе опыта нами впервые были получены данные по активности пищеварительной амилазы перепелов о условиях нормотермии, как она изменяется во времени и какова она в сравнении с активностью амилазы других птиц и млекопитающих.

Очевидно, 'по характерные изменения гидрол I ггн ч ее кон активности амилазы (как и других ферментов) можно наблюдать начиная с первых минут инкубации. По сравнению с нормотермиеЙ, активность амилазы при гипотермии на протяжении всего периода инкубации снижена. С каждой последующей пробой снижение активности прогрессирует. Активность пищеварительной амилазы при гипертермии изменяется совсем иначе. Па начальных стадиях гидролиза она даже превышает таковую в условиях нормотермии. Но это превышение продолжается недолго, уже на 10-15 минуте активность амилазы в условиях гипертермии ниже, чем в условиях нормотермии. На графике активности это отображается перекрестом активности. Стоит отметить, что чем раньте от начала инкубации происходит перекрест активности на графике, тем более интенсивно у данной птицы протекает обмен веществ.

Время инГ) ба- Перепела Мускусные утки

цни, мин Амилаза, мг/ем'мин Протсаза, мт/см:мин Липаза, мкмоль/ см'мин Амилаза, мг/сы'шш _ Про те аза, мг/ем'мин Липаза, ыхыоль/ си2мнн

П М п М П М П М п М П М

5 2,34 9,00 1,41 5,24 0,61 2,42 1,45 6,08 1,01 3,35 0,29 1,54

¿0,07* ±0,72* ±0,06» ±0,31*** ±0,04* ±0,22* ±0,16*** ±0,55* ±0,06* ±0,13* ±0,02* ±0,08*

10 7,19 23,Л 4,17 13,56 2,30 6,60 6,68 13,98 3,78 8,00 0,97 2,79

±0,29» ±1,19* ±0,29* ±1,22*** ±0,18* ±0.39* ±0,27** ±0,70* ±0,04* ±0,48*' ±0,03* ±0,17*

15 19,43 43,94 11,27 24,47 5,54 12,46 14,74 33,73 8,42 18,49 2,92 8,18

±0,58* ±3,95*** ±0,79* ±2,45** ±0,39* ±0,99* ±0,88* ±1,01* ±0,25** ±1,11* ±0,09* ±0,33*

20 30,86 57,14 17,20 31,44 8,44 16,17 23,96 49,71 13,53 28,17 5,61 11,81

±1,23* ±3,99*** ±0,17» ±2,52* ** ±0,76* ±0,49** ±0,48** ±0,99* ±1,08*** ±0,85* ±0,26* ±1,06*

25 34,56 59,46 19,59 34,53 9,49 16,62 27,56 53,62 15,53 30,36 7,76 13,05

±2,76* ±2,97** ±1,76* ±0,69** ±0,38* ±0,99* ±2,48* ±2,68* ±0,47*** ±0,91** ±0,78* ±1,04* ♦

' -Р 2 0,05;" - Р <0,01; "* -Р <0,001 («есь и далее) П-полостное; М-мембранное.

Например, у водоплавающих птиц (мускусных уток) в период отсутствия яйцекладки перекрест активности может наблюдаться даже на 15-20 минуте инкубации. Но в итоге, ло окончании всей инкубации активность амилазы в условиях гипертермии почти всегда несколько выше, чем в условиях гипотермии.

Весьма характерная картина наблюдается на графике активности при восстановлении температурного режима после 25-й минуты инкубации. В этом случае па 30-35 минуте происходит второй перекрест активности. На этот раз кривая активности амилазы в условиях гипотермии, устремляясь вверх, пересекает кривую активности амилазы в условиях гипертермии, которая практически не изменяет своего направления.

Амилаза мускусных уток является довольно стабильным ферментом с высокой активностью (это объясняется высоким процентом углеводов в структуре рациона мускусных уток), которая развивается во времени поступательно, без заметных колебаний на графике в ту или иную сторону. Как и у других птиц, у мускусных уток гипотермия вызывает изменение активности пищеварительной амилазы в сторону снижения. Особенно это заметно на начальных этапах расщепления крахмала. По мере продолжения инкубации это снижение постепенно убывает, но тем не менее, по завершении процесса гидролиза (после 25-й минуты инкубации) итоговая общая активность значительно ниже при гипотермии, чем при нормотермии. И ещё среди особенностей активности амилазы у мускусных уток считаем важным упомянуть, что первый перекрест активности возникает немного позже, чем у перепелов. Особенно этот тезис актуален для полостного гидролиза.

Протеаза — важнейший пищеварительный фермент в организме птицы. Активность пищеварительной протеазы перепелов заметно превышает таковую у других птиц. Максимальную активность она показывает при температуре инкубации +42°С. С первых же минут инкубации при нормотермии активность протеазы мембранного пищеварения начинает равномерно нарастать, хота нужно заметить, что после 20 минут инкубации это нарастание уже не так интенсивно.

Чем напряжённее и интенсивнее обмен веществ в организме, тем более чутко он реагирует на различные факторы, изменяющие оптимальный режим его функционирования. Это положение мы наглядно подтвердили изменением активности пищеварительной протеазы в условиях гипотермии. Ток как протеаза перепелов в нормальных температурных условиях очень активна, то даже небольшое их изменение вызывает заметное снижение интенсивности процесса протеолиза. Динамика активности протеазы различна на одинаковых временных сегментах инкубации при нормотермии, гипотермии и гипертермии. Вообще протеаза в отличие, например, от амилазы, не обладает такой стабильной активностью, она вариабельна у животных одной группы и зависит от очень многих факторов.

Такая вариабельность активности протеазы полостного и мембранного пищеварения как у перепелов, так и у мускусных уток говорит о том, что про-

и

теаза в принципе является краГже чувствительным ферментом, она очень чутко реагирует лаже на незначительной интенсивности факторы, сдерживающие сё активность. Кстати, температурный фактор среди них чрезвычайно важен. Наибольшая активность пищеварительной прогеазы перепелов наблюдается на 1020 минутах инкубации. А затем она начинает снижаться. В условиях гипотермии и гипертермии таких резких всплесков активности фермента не наблюдается, активность прогеазы возрастает поступательно, незначительно, по очень ровно на веем протяжении инкубации. Значительное снижение активности про-теазы перепелов начинается после 20 минуты взаимодействия с субстратом. Причиной этого снижения активности, в том числе является и снижение концентрации субстрата в пробе в процессе инкубации.

Пищеварительная п роге аза мускусных уток, конечно несколько менее активна, чем у перепелов, но по сравнению с другими сельскохозяйственными птицами она вс5 же достаточно высока. Важная особенность - протсаза мускусных уток оказалась довольно лояльным к гипертермии ферментом. Изменения активности прогеазы в процессе инкубации (особенно при полостном пищеварении) протекает очень ровно, сложно сказать на каком временном отрезке наблюдаются явные всплески активности. Интенсивность процесса гидролиза протеина остаётся без особенных изменений на всём протяжении инкубации, разве что при мембранном пищеварении в условиях нормотермин на 15-20 минуте заметно некоторое повышение её. Перекрест активности при гнпергермии и нормотермин на графике наблюдается на 15 минуте (иногда ещй позже), что так же является характерной особенностью (табл. 2).

Как показхчн паши исследования, липаза перепел on н мускусных уток вообще является очень стабильным ферментом. При нормотермин существует очень немного факторов (химических, физических, биологических н др.), способных существенно нзменкть активность пищеварительной лнгшы в ту или иную сторону. То есть температурный фактор является важнейшим для нормального функционирования липазы, развития её максимальной активности. Как нами было замечено при постановке опытов, активность липазы мембранного пищеварения перепелов к мускусных уток может коррелировать с концентрацией субстрата, а также со степенью его эмульгированное™. Что также не противоречит общим положениям ферментологии. Па начальных этапах липо-литического процесса мембранный гидролиз у перепелов протекает п 3,9 раза интенсивнее полостного, а в завершении контакта липазы с субстратом - всего лишь в 1,8 роза.

Гипотермия значительно снижает активность пищеварительной липазы перепелов. Это заметно уже на самых ранних этапах гидролиза линнлов. Возможно, при снижении температуры инкубации происходит укрупнение эмуль-.гированных частиц субстрата, что также тормозит лииолиз in vitro. Это очень важно для организма перепелов, так как процент жиров в структуре их рациона выше по сравнению с другими сельскохозяйственными птицами. Это одна из

Перепела Муску сные утки

Время

югху бацни, мил Амилаза, мг/ск'мни Протеаза, мг/см'мин Липаза, мкмоль/ СМ3МШ1 Амилаю, МГ/СМ*Ы1Ш Протеаза, мг/см2мнн Липам, мкмоль/ СМ3МШ1

П М П м П М П М , II М п М

с 0,65 2,62 0,40 1,65 0,20 0,69 0,38 2,51 0,27 1,39 0,09 0,34

э .±0,01' ±0,16» ±0,004** ±0,08* ±0,004* ±0,06* ±0,02* ±0,18* ±0,01 ±0,11* ±0,007 ±0,02*

10 2,82 9,65 1,77 5,68 0,85 2,79 4,27 11,06 2,31 6,19 0,58 1,84

±0,11* ±0,19* £0,04* ±0,17* ±0,03** ±0,14* ±0,34* ±0,33* ±0,18 ±0,31* ±0,03* ±0,13**

15 6,77 15,83 3,75 9,57 1,91 4,84 6,41 15,44 3,68 8,75 1,73 3,89

±0,07'» ±1,27* ±0,15* ±0,48' ±0,04** ±0,10» ±0,26* ±0,93» ±0,07 ±0,53* ±0,07** ±0,23»

20 13,01 26,57 6,60 16,08 3,41 7,46 10,63 28,21 5,80 16,08 2,57 5,00

±0,91* ±1,06* ±0,26» ±1,29* ±0,09** ±0,29* ±0,96* ±1,69» ±0,41 ±0,48* ±0,08*» ±0,40*

25 ' 13,10 33,98 10,38 20,30 4,99 9,92 16,54 39,94 9,38 ' 22,57 3,56 7,72

±1,45» ±1,02* ±0,73** ±0,61* ±0,27* ±0,69* ±0,83* ±0,47» ±0,75 ±1,58* ±0,21»* ±0,54*

биологических особенностей дайной птицы. В природе, кроме растительной пищи перепела активно поедают животные корма (насекомых, личинок, червей

и т.д.), которые богаты липидами. Липаза перепелов па гипертермию реагирует очень характерно. На начальных этапах л и политического процесса прн гипертермии наблюдается даже некоторое повышение активности липазы (результат превышает нормотермню на 5 минуте инкубации почти в 2 раза). 11о затем оно прекращается и далее активность только снижается. В итоге, за всё время инкубации липолиз при гипертермии заметно ниже, чем при нормотер-мии, но значительно выше, чем при гипотермии. Липаза перепелов достаточно активна как при полостном, так и при мембранном расщеплении, но эта активность очень неравномерна во времени.

Например в течение первых 5-10 минут контакта с субстратом она совсем незначительна. Вероятнее всего на этом этапе гидролиза жиро» ешЕ не успела полностью произойти эмульгацня субстрата, что препятствует развитию максимальной активности липазы. Перекрсст активности при нормогермни и гипертермии возникает на 10 минуте инкубации (иногда ещё раньше), что также свидетельствует о высокой интенсивности липолиза в организме перепелов.

Если сравнивать между собой гипотермию и гипертермию, то активность липазы при гипертермии до 10-15 минуты повышается интенсивно, а затем начинает постепенно снижаться. Тогда как активность липазы прн гипотермии наоборот, до 10-15 минуты остаётся примерно на одном уровне и очень невысока, а затем начинает довольно активно увеличиваться и может » некоторых случаях приближаться к результатам гипертермии. На графике они находятся примерно на одном уровне.

Активность липазы мускусных уток как при полостном, так и при мембранном пищеварении, в сравнении с другими видами птиц, очень незначительна. Этим в достаточной мере объясняется очень низкий процент жира в структуре рациона (в естественных условиях утки являются исключительно травоядной птицей, питаются вегетативными частями растений, которые содержат незначительное количество жира). На начальном этапе переваривания липидов у мускусных уток мембранный гидролиз протекает в 5,3 раза интенсивнее полостного, а в завершении этого процесса — всего в 1,7 раза. Прн гипотермии у мускусных уток активность липазы снижается значительно. Мы считаем, что это и следствие укрупнения эмульгированных жировых частиц (физический фактор), и непосредственное снижение дееспособности липазы прн попадании её вне рамок температурного оптимума (биологический фактор).

Гипертермия (табл. 3) также отрицательно влияет на липолитическую активность у мускусных уток, но это наблюдается только на более поздних этапах расщепления жиров (в нашем случае не ранее 10 минут контакта фермента с субстратом). Вследствие этого кривая активности пищеварительной липазы мускусных уток имеет свои особенности. На графиках кривые активности липазы при нормотермии и гипертермии практически идентичны, находятся в единой плоскости, иногда (особенно на начальных этапах расщепления) они

Время инкубации, мин ' Перепела Мускусные утки

Амилаза, мг/смгмин Проказа, мг/см'мкн Липаза, мкмоль/ см'мии Амилаза, мг/см'мин Прогсаза, м г/с Лин Липаза, мкиоль/ см'мм г

п М II М п М П М П М П М

е 4,49 11,63 2,58 6,61 1,27 3,85 4,15 9,43 2,53 5,52 0,36 1.45

э ±0,13** ±0,24** ±0,18* ±0,39** ±0,09* ±0,23* ±0,25» ±0,57* ±0,21* ±0,39* ±0,03 ±0,12*

10 7,81 25,46 4,51 14,49 2,61 7,30 9,54 18,26 5,23 10,37 1,03 2,67

±0,55" ±2,04** ±0,14** ±1,02** ±0,11» ±0,07* ±0,67* ±1,09* ±0,31* ±0,41* ±0,08* ±0,03*

15 15,49 31,61 8,80 18,10 4,29 8,91 14,73 28,20 8,57 16,13 3,61 7,78

±1,08** ±2,53* ад* ±0,59* ±0,30* ±0,36* ±0,59* ±2,26* ±0,17** ±0,65* ±0,27* ±0,47**

20 17,35 36,18 9,63 20,29 4,65 10,11 20,50 42,49 11,64 23,86 5,24 11,08

±1,39* ±1,09*» ±0,77* ±1,83* ±0,33 ±0,40* ±1ДЗ* ±2,12* ±0,12** ±0,95** ±0,10* ±0,56**

25 17,98 38,01 10,18 21,48 5,06 10,54 22,53 45,00 12,72 24,82 6,91 11,87

±0,94 ±2,28* ±0,61 ±0,86 ±0,25 ±0,95* ±0,90 ±3,17* ±1,02* ±1,24* ±0,07** ±0,47**

абсолютно совпадают. Перекрест активности наблюдается на 15-20 минуте инкубации, а в некоторых случаях может вовсе отсутствовать (хотя это бывает редко, на конечных этапах гидролиза разница всё таки очевидна).

ВЫВОДЫ

1. Относительная масса органов пищеварения к массе тела перепелов у самцов составляет 13,35-14,80%, а у самок 18,71-21,30% (Р<0,05). Этот показатель коррелирует непосредственно с продуктивностью сельскохозяйственных птиц, поэтому он очень важен..У перепелов относительная масса органов пищеварения превосходит таковую у других птиц.

2. Оптимальная концентрация субстратов для исследования активности ферментов мембранной) пищеварения у перепелов и мускусных уток гораздо выше,- чем у других птиц, и тем более у млекопитающих животных. Это также косвенно свидетельствует о большей шгтенсивности обменных процессов в организме данных птиц.

3. Амилаза у перепелов — это фермент с преимущественно мембранным механизмом действия. В среднем, за весь период инкубации доля полостного гидролиза составила 35,48%, а мембранного 64,52% (Р<0,002). Хотя это соотношение в процессе инкубации значительно изменялось.

4. При расщеплении протеинов гораздо большую долю занимает мембранный механизм переваривания. Доля полостного пищеварения всего 17%, мембранного - 83% (Р<0,002), Причём на протяжении всего периода инкубации это соотношение проявляло стабильность и значительно не изменялось.

5. Липаза также более активна при мембранном гидролизе, чем при полостном. Хотя это проявляется не так резко, как у амилазы, и тем более прогсазы. В общем, за весь период инкубации, доля полостного гидролиза составляла 47,33%, мембранного—52,67% (Р<0,003).

6. Амилаза перепелов — фермент очень активный, динамично функционирующий, при пормотермин включающийся в процесс гидролиза углеводов с первых минут воздействия ыа субстрат. Амилаза мускусных уток несколько менее активна, чем у перепелов, но также стабильно развивает свою активность, поступательно, без заметных колебаний. Гипотермия и гипертермия снижают активность амилазы, но у перепелов и мускусных уток это происходит неодинаково.

7. Активность пищеварительной протеазы перепелов заметно превышает таковую у мускусных уток и других птиц. Максимальную активность протеаза перепелов показывает при температуре инкубации +42°С. Даже небольшое изменение температурных условий инкубации вызывает ощутимое снижение интенсивности процесса протеолиза. То есть протеаза - фермент чрезвычайно чувствительный к температурному и другим факторам, она вариабельна у животных одной труппы. Протеаза мускусных уток чуть более устойчива к колебаниям температурного фактора, чем таковая у перепелов.

Липаза перепелов достаточно активна и является очень стабильным ферментом. В нормальных температурных условиях существует очень немного факторов, способных существенно изменить активность пищеварительной липазы. Гипотермию переносит несколько хуже, чем гипертермию. Липаза мускусных уток малоактивный фермент, что объясняется особенностями обмена всществ и физиологии пищеварения данной птицы. Процент жиров о структуре рациона мускусных уток гораздо ниже, чем у других птиц.

9. Гипотермия снижает активность исследуемых нами ферментов (амилаза, протеаза, липаза) на всём протяжении инкубации. Гипертермия является также негативным фактором, но влияет на активность ферментов особенно. На первых этапах гидролиза она способна даже повышать активность. Но затем, это кратковременное повышение сменяется угнетением активности. На графике это проявляется перекрестом активности, когда кривая гипертермии, устремляясь вниз, пересекает кривую пормогермни. Чем более интенсивен процесс обмена всществ в организме, тем перекрест активности возникает раньше, и наоборот.

10. После 25 минут инкубации в условиях гипотермии и гипертермии, попав в условия температурного оптимума, пищеварительные ферменты перепелов к мускусных уток ведут себя очень своеобразно. После гипертермии все ферменты не восстанавливают своей лишнеской активности. Исключение может составлять лишь липаза, но и эта активность ничтожно мала (не более 57%). После гипотермии ферменты, попав н условия норм о герм и и, начинают восстанавливать свою активность. Тем не менее, в данном случае активность практически никогда не достигает активности ферментов, изначально действовавших в условиях нормотермии: амилаза не более 85-88%, протеаза — не более 60-65%, липаза — 50%. Таким образом, изменения активности при гипертермии является необратимым, в отличие от гипотермии, при которой активность ферментов может восстанавливаться.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные сведения позволяют более объективно и достоверно оценивать взаимосвязь обменных процессов в организме перепелов и мускусных уток. Знание изменений активности ферментов при гипотермии и гипертермии дают возможность более глубоко познать патогенез заболеваний (инфекционных и незаразных), для которых зги явления характерны.

Результаты исследований могут быть использованы при составлении справочных руководств по вопросам физиологии пищеварения у птиц, написании монографий, учебников, пособий для преподавания сравнительной физиологии в ВУЗах биологического, ветеринарного, и сельскохозяйственного профиля.

Ввиду выявленных особенностей анатомии желудочно-кишечного тракта н физиологии пищеварения перепелов, проявляющихся наличием слепых кишок и способностью активно переваривать клетчатку, рекомендуем предпрн-

ятиям, занимающимся разведением перепелов на промышленной основе, повышать содержание клетчатки в рационе перепелов на 18-20%. Более целесообразно это осуществлять частичной заменой пшеницы на дерть ячменную.

В общем, полученные сведения носят фундаментальный характер. Модифицированные, усовершенствованные и адаптированные для перепелов и мускусных уток методики могут применяться в научных целях для изучения влияния различных факторов (физических, химических, биологических) на активность ферментов мембранного пищеварения. Многие из этих факторов на данный момент изучены недостаточно.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Харитонов М.В. Амилолитическая активность амилазы при мембранном пищеварении у перепелов / М.В. Харитонов // Механизмы функционирования висцеральных систем: Материалы международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения А.М. Уголева. -Санкт-Петербург, 2001. -С.385-386.

2. Рябиков Л.Я. Возрастные колебания концентрации общего белка в сыворотке крови кур, уток и перепелов / АЛ. Рябиков, А.Л. Выставной, М.В. Харитонов и др. // Тезисы докладов XVIII съезда физиологического общества им. ИЛ. Павлова. -Казань, 200I.-C.4I9.

3. Рябиков АЛ. Активность амилазы, лротеазы и липазы в полостном и мембранном пищеварении у перепелов / А.Я. Рябиков, АЛ. Выставной, М.В. Харитонов н др. И Материалы IV съезда физиологов Сибири. -Новосибирск, 2002.-С.246.

4. Харитонов М.В. Активность ферментов полостного н мембранного пищеварения мускусных уток н перепелов в условиях гипо-, нормо- и гипертермии / М.В. Харитонов, АЛ. Рябнков Н Роль ветеринарного образования в подготовке специалистов агропромышленного комплекса. -Омск, 2003.-С.268-270.

Подписано к печати 11.05.2004 г. Формат 60x84/16. Объем 1 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 321. Бумага офсетная. Печать офсетная

Типография АОмО

f/Чг